CN111961612A - 一种应用于治理水产养殖尾水的异养硝化-好氧反硝化细菌的筛选及脱氮性能评估方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种应用于治理水产养殖尾水的异养硝化‑好氧反硝化细菌的筛选及脱氮性能评估方法，采用贫营养培养基逐步驯化养殖水体细菌，富集在贫营养条件下降解水体氮营养盐的异养硝化‑好氧反硝化细菌，对驯化后的生物絮团内的细菌菌群采用梯度稀释和平板划线法分离和纯化，最后分别利用氨氮和硝酸盐氮为唯一氮源的贫营养培养基对获得的细菌菌株的异养硝化和好氧反硝化能力进行评估，筛选得到同时具有高效异养硝化和好氧反硝化的菌株，将该菌株应用于养殖尾水处理，以有效解决养殖尾水氮污染物浓度过高对养殖鱼类的毒害和养殖尾水排放造成的周围水体富营养化问题。

Description

一种应用于治理水产养殖尾水的异养硝化-好氧反硝化细菌 的筛选及脱氮性能评估方法

技术领域

本发明属于池塘养殖的水处理技术领域，具体涉及一种应用于治理水产养殖尾水的异养硝化-好氧反硝化细菌的筛选及其脱氮性能评估方法。

背景技术

随着水产养殖业的发展，养殖密度的提高及高蛋白养殖饲料的大规模使用，养殖尾水的含氮化合物排放可能导致周围湖泊水体富营养化，引起人们的关注。氨氮是鱼类的主要含氮排泄物，传统的生物脱氮通过自养的硝化细菌和异养的反硝化细菌，将氨氮在好氧条件转化为硝酸盐，再在厌氧条件转化为氮气排出系统。

传统生物脱氮的硝化和反硝化过程由于对有机碳和溶氧的需求条件不同，使生物脱氮过程需要在不同的反应器或者不同的反应阶段进行，从而极大的提高了养殖尾水处理设备要求和处理复杂度，提高了污水处理成本。

与生活污水和工厂污水不同，养殖尾水营养盐浓度较低，需要分离耐受贫营养的异养硝化-好氧反硝化细菌才能有效处理养殖尾水。现有技术中也分离出了异养硝化-好氧反硝化细菌，但是其采用高营养的培养基进行分离、筛选，而且分离出的异养硝化-好氧反硝化细菌处理污水后的氨氮浓度明显偏高，最低的处理后的氨氮浓度都大于6mg/L，高于渔业用水氨氮浓度要求(GB 11607-89)，现有技术中筛选采用的其它营养盐浓度均显著高于渔业水体环境，获得的菌株不适合处理贫营养的养殖尾水，而且处理的效果，脱氮的能力都不太理想。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种应用于治理水产养殖尾水的异养硝化-好氧反硝化细菌的筛选及其脱氮性能评估方法，分离出适用于治理水产养殖尾水的异养硝化-好氧反硝化菌株，消除背景技术中传统生物脱氮细菌的不利因素，从而建立清洁的水产养殖模式。

本发明提供的技术方案：一种应用于治理水产养殖尾水的异养硝化-好氧反硝化细菌的筛选及其脱氮性能评估方法，包括如下步骤：

(1)将养殖尾水加入含有富集培养基的微生物富集装置中进行富集驯化，富集装置24h增氧并搅拌培养液，驯化过程中每隔两天将微生物富集装置静置，将上清液移除，重新添加富集培养基，测定移除上清液中氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮浓度，计算总无机氮浓度为氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮浓度之和，当连续进行3个循环总无机氮移除效率达到90％以上，完成异养硝化-好氧反硝化细菌富集；

所述富集培养基的组成配比为：CH₃COONa 0.1g/L，NH₄Cl 0.02g/L，KH₂PO₄ 0.02g/L，MgSO₄·7H2O 0.01g/L，CaCl₂ 0.01g/L，微量元素2mL/L；

(2)向富集培养基添加琼脂制成固体培养基，将富集的微生物菌液按10倍梯度进行稀释，用平板划线法进行分离纯化，重复挑取单克隆进行平板划线，获得纯化细菌；

(3)将纯化细菌接种在富集培养基，摇床培育后获得纯菌的细胞悬浮液，不同菌株的细胞悬浮液接种在10mg/L氨氮、200mg/L有机碳源的异养硝化培养基中，置于摇床培养后，测定氨氮浓度，评估细菌的异养硝化能力，

(4)将不同菌株的细胞悬浮液接种在20mg/L硝态氮、400mg/L有机碳源的好氧反硝化培养基中，置于摇床培养后，测定硝酸盐氮浓度，评估细菌的好氧反硝化能力；

(5)筛选出步骤(3)和步骤(4)中异养硝化能力和好氧反硝化能力最优的菌株并进行鉴定。

进一步的，所述微量元素的组成配比为：EDTA:50g/L，ZnSO₄:2.2g/L，CaCl₂:5.5g/L，MnCl₂·4H₂O:5.06g/L，FeSO₄·7H₂O:5g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂.4H₂O:1.1g/L，CuSO₄.5H₂O:1.57g/L，CoCl₂.6H₂O:1.61g/L。

进一步的，所述步骤(3)中异养硝化培养基的组成配比为：CH₃COONa 0.68g/L，NH₄Cl 0.06g/L，KH₂PO₄ 0.02g/L，MgSO₄·7H2O 0.01g/L，CaCl₂ 0.01g/L，微量元素2mL/L。

进一步的，所述步骤(4)中好氧反硝化培养基的组成配比为：CH₃COONa 1.37g/L，KNO₃ 0.144g/L，KH₂PO₄ 0.02g/L，MgSO₄·7H2O 0.01g/L，CaCl₂ 0.01g/L，微量元素2mL/L。

进一步的，所述微生物富集装置包括培养瓶，所述培养瓶中设有气体扩散器，所述气体扩散器与进气橡胶管连接，所述进气橡胶管的另一端与增氧机连接，所述培养瓶内插入有进出水管，所述进出水管的另一端连接有蠕动泵。

进一步的，所述进气橡胶管与增氧机之间还设有气体流量计，所述进出水管上设有出气孔。

进一步的，所述微生物富集装置还包括橡胶管夹子。

进一步的，所述的异养硝化-好氧反硝化细菌用于处理贫营养的养殖尾水。

所述筛选方法分离出的异养硝化-好氧反硝化细菌添加碳源后按照10L/亩直接全池泼洒处理贫营养的养殖尾水。

将异养硝化-好氧反硝化细菌用海藻酸钠胶体进行包埋，制成固定化载体，用聚乙烯网袋盛装后，加入高分子固体碳源，按照50kg载体/亩的比例悬挂于养殖水体中，处理贫营养的养殖尾水。

进一步的，对于室内养殖系统，将包埋有该菌种的载体置于养殖尾水处理池中，加入高分子固体碳源，通过曝气降低养殖尾水氮污染物，载体质量/曝气池容积(kg/L)为1：10。

本筛选条件的氨氮和硝态氮浓度远低于现有技术中采用的条件，从而使筛选出的细菌适合低浓度氨氮和硝酸盐氮的处理。

本发明分离出的异养硝化-好氧反硝化细菌为单一菌株可以在同一条件下同步进行异养硝化和好氧反硝化，异养细菌生长速率高，可以缩短处理时间，且能够同步移除氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮。本发明分离出的异养硝化-好氧反硝化细菌适用于治理水产养殖尾水，有效解决养殖尾水氮污染物浓度过高对养殖鱼类的毒害和养殖尾水排放造成的周围水体富营养化问题，而且其脱氮性能显著高于现有的其他菌株，对治理水产养殖尾水产生了非常好的效果。

附图说明

图1是本发明的微生物富集装置的示意图；

图中：1-增氧机，2-气体流量计，3-进气橡胶管，4-进出水管，5-蠕动泵，6-橡胶管夹子，7-出气孔，8-培养瓶，9-气体扩散器；

图2是DM02菌株的系统发育树；

图3是DM02菌株napA功能基因PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳图；

图4是不同碳源对DM02菌株硝酸盐移除(A)和细胞生长(B)的影响；

图5是pH对菌株DM02氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮移除和生长影响；

图6是碳氮比率对菌株DM02脱氮性能和生长性能的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：

该实施例的养殖水体为生物絮团养殖系统中的水体，具体富集分离方法为：

步骤一，从应用生物絮团技术的水产养殖缸中取养殖水体，将所取养殖水体在室温下与含有富集培养基的培养瓶中调控富集装置中的气体流量计使培养瓶中溶氧大于5mg/L，驯化5天后得到富含好氧条件下脱氮细菌的生物絮团。

培养驯化过程中每隔24h，停止曝气30min，更换富集培养基；所述的富集培养基的配方为：

CH₃COONa：0.1g/L

NH₄Cl:0.02g/L

KH₂PO₄:0.02g/L

MgSO₄·7H2O:0.01g/L

CaCl₂:0.01g/L

微量元素：2mL

所述微量元素配方为：

EDTA:50g/L

ZnSO₄:2.2g/L

CaCl₂:5.5g/L

MnCl₂·4H₂O:5.06g/L

FeSO₄·7H₂O:5g/L

(NH₄)₆Mo₇O₂.4H₂O:1.1g/L

CuSO₄.5H₂O:1.57g/L

CoCl₂.6H₂O:1.61g/L

驯化的目的是使适应贫营养环境的异养硝化-好氧反硝化细菌富集，采用上述方法驯化5d后可以完成生物絮团驯化，停止曝气后絮团迅速沉降，用蠕动泵从出水管将上清液排出，将新鲜的富集培养基加入培养瓶，测定移除上清液中氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮浓度，氨氮测定使用中华人民共和国国家环境保护标准(HJ 535-2009)，亚硝酸盐测定使用中华人民共和国国家标准(GB 7493-87)，硝酸盐氮测定使用中华人民共和国环境保护行业标准(HJ/T 346-2007)进行测定。计算总无机氮浓度为氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮浓度之和，从第3个循环开始连续3个循环总无机氮移除效率达到90％以上，完成了异养硝化-好氧反硝化细菌富集。

步骤二，向富集培养基中添加2％琼脂，121℃灭菌21min后待培养基冷却至60℃左右，在超净台中倒入无菌培养皿，制成固体培养基平板，将富集的絮团用无菌水按10倍梯度进行6个梯度的稀释后，用接种环使用平板划线法接种在固体培养基上，培养皿置于30℃恒温培养箱培养48h后，选择菌落稀疏，含有单一菌落的平板，根据各个菌落的形态特征，挑取不同菌落再次进行平板划线并编号，重复3次，获得21株纯化细菌。

步骤三，对分离的21株纯化细菌分别进行异养硝化和好氧反硝化能力评估，将纯化细菌接种在富集培养基，30℃，150rpm摇床培育12h后获得纯菌的细胞悬浮液，不同菌株的细胞悬浮液按1:100的体积比接种在100mL含有10mg/L氨氮、200mg/L有机碳源的异养硝化培养基中，置于摇床30℃，150rpm培养24h，评估21株细菌的异养硝化能力，将不同菌株的细胞悬浮液按1:100的体积比接种在100mL含有20mg/L、硝态氮400mg/L有机碳源的好氧反硝化培养基中，置于摇床30℃，150rpm培养24h评估21株细菌的好氧反硝化能力。

表1纯化异养硝化-好氧反硝化细菌的异养硝化能力和好氧反硝化能力

所述异养硝化培养基是调整富集培养基中NH₄Cl质量浓度为0.06g/L，CH₃COONa质量浓度为0.68g/L使初始氨氮浓度为10mg/L，有机碳为200mg/L。

所述好氧反硝化培养基是替换富集培养基中NH₄Cl为KNO₃，调整KNO₃质量浓度为0.144g/L，CH₃COONa质量浓度为1.37g/L，使初始硝酸盐氮浓度为20mg/L，有机碳浓度为400mg/L。

对获得的纯化细菌异养硝化和好氧反硝化进行综合比较，选择同时具有优异氨氮和亚硝酸盐氮降解能力的菌株，平板划线后，使用LB培养基培养12h，吸取1ml富含菌株的培养液，添加30％甘油后-80℃条件进行菌种保藏。

所述LB培养基配方为：

胰蛋白胨：10g/L

酵母提取物：5g/L，

NaCl：10g/L

使用5M NaOH调节pH至7.0,121℃灭菌21min。

菌株的鉴定

将菌株用LB培养基中，置于摇床30℃，150rpm培育12h后，在超净台用移液枪将2mLDM02细胞悬浮液移入2mL无菌离心管，用封口膜密封后送至测序公司进行细菌16S测序，将测序结果上传至NCBI Genbank数据库，获得序列号MT540002.1，使用NCBI网站的Blast工具与NCBI数据库中细菌进行比对，DM02菌株与Pseudomonas sp.LMB-4(Genbank序列号：KR080709.1)有100％相似性，使用MEGA X软件将DM02和NCBI数据库的细菌序列进行系统发育树图绘制，DM02的系统发育树如图2所示，该菌株为假单胞菌属，将DM02命名为Pseudomonas sp.DM02。

菌株好氧反硝化功能鉴定

使用土壤DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书的方法提取DM02LB悬浮液中的细菌总DNA，使用好氧反硝化相关功能基因

napA1F(5’-TCTGGACCATGGGCTTCAACCA-3’)，

napA2R(5’-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3’)

进行PCR扩增，以不添加DM02 DNA模板为空白对照，成果扩增876bp目标条带，证明DM02菌株有进行好氧反硝化相关的功能基因。PCR结果如说明书附图3所示。

图4是不同碳源对DM02菌株硝酸盐移除(A)和细胞生长(B)的影响，实验结果表明蔗糖和葡萄糖是DM02菌株移除硝酸盐的优质碳源，所有碳源在28h硝酸盐移除效率都达到94％以上，对于低营养的模拟养殖尾水，最终硝酸盐浓度小于1mg/L，柠檬酸三钠、乙醇和醋酸钠可以100％移除硝酸盐氮。

图5是pH对菌株DM02氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮移除和生长影响。养殖水体pH一般中性范围内，研究表明pH对菌株DM02影响较为明显，pH 6有利于菌株DM02生长，但不利于其对氨氮的移除，pH中性偏碱性均具有良好的氨氮移除性能；pH在5-8范围内均可以有效移除硝酸盐；pH在6-8范围内均可以有效移除亚硝酸盐。

图6是碳氮比率对菌株DM02脱氮性能和生长性能的影响。菌株DM02对氨氮、硝态氮和亚硝态氮移除的最佳碳氮比率分别为8、12和12，对于氨氮提高碳氮比至10以上会减慢其氨氮移除速率；对于硝态氮和亚硝态氮，提高碳氮比至14不会减慢其脱氮速率；在氨氮、硝态氮和亚硝态氮移除过程中，碳氮比率与细胞生长终浓度成正比。

具体应用

将该菌株菌液添加碳源后按照10L/亩直接全池泼洒，处理养殖尾水；

将该细菌用海藻酸钠等胶体进行包埋，制成固定化载体，用聚乙烯网袋盛装后，加入高分子固体碳源(聚-β-羟丁酸等)悬挂于养殖水体中，50kg载体/亩，细菌载体长期存在，根据碳源消耗情况添加固体碳源；

对于室内养殖系统，将包埋有该菌种的载体置于养殖尾水处理池中，加入高分子固体碳源(聚-β-羟丁酸等)，通过曝气即可降低养殖尾水氮污染物，载体质量/曝气池容积(kg/L)为1：10。

本发明分离出的异养硝化-好氧反硝化细菌治理贫营养的养殖尾水的效果显著，其氨氮移除速率显著高于现有的其他菌株，在养殖尾水的治理方面应用效果好。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种应用于治理水产养殖尾水的异养硝化-好氧反硝化细菌的筛选及脱氮性能评估方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

(1)将养殖尾水加入含有富集培养基的微生物富集装置中进行富集驯化，富集装置24h增氧并搅拌培养液，驯化过程中每隔两天将微生物富集装置静置，将上清液移除，重新添加富集培养基，测定移除上清液中氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮浓度，计算总无机氮浓度为氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮浓度之和，当连续进行3个循环总无机氮移除效率达到90％以上，完成异养硝化-好氧反硝化细菌富集；

所述富集培养基的组成配比为：CH₃COONa 0.1g/L，NH₄Cl 0.02g/L，KH₂PO₄ 0.02g/L，MgSO₄·7H2O 0.01g/L，CaCl₂ 0.01g/L，微量元素2mL/L；

(2)向富集培养基添加琼脂制成固体培养基，将富集的微生物菌液按10倍梯度进行稀释，用平板划线法进行分离纯化，重复挑取单克隆进行平板划线，获得纯化细菌；

(3)将纯化细菌接种在富集培养基，摇床培育后获得纯菌的细胞悬浮液，不同菌株的细胞悬浮液接种在10mg/L氨氮、200mg/L有机碳源的异养硝化培养基中，置于摇床培养后，测定氨氮浓度，评估细菌的异养硝化能力，

(4)将不同菌株的细胞悬浮液接种在20mg/L硝态氮、400mg/L有机碳源的好氧反硝化培养基中，置于摇床培养后，测定硝酸盐氮浓度，评估细菌的好氧反硝化能力；

(5)筛选出步骤(3)和步骤(4)中异养硝化能力和好氧反硝化能力最优的菌株并进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的应用于治理水产养殖尾水的异养硝化-好氧反硝化细菌的筛选及脱氮性能评估方法，其特征在于：所述微量元素的组成配比为：EDTA:50g/L，ZnSO₄:2.2g/L，CaCl₂:5.5g/L，MnCl₂·4H₂O:5.06g/L，FeSO₄·7H₂O:5g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂.4H₂O:1.1g/L，CuSO₄.5H₂O:1.57g/L，CoCl₂.6H₂O:1.61g/L。

3.根据权利要求2所述的应用于治理水产养殖尾水的异养硝化-好氧反硝化细菌的筛选及脱氮性能评估方法，其特征在于：所述步骤(3)中异养硝化培养基的组成配比为：CH₃COONa 0.68g/L，NH₄Cl 0.06g/L，KH₂PO₄ 0.02g/L，MgSO₄·7H2O 0.01g/L，CaCl₂ 0.01g/L，微量元素2mL/L。

4.根据权利要求2所述的应用于治理水产养殖尾水的异养硝化-好氧反硝化细菌的筛选及脱氮性能评估方法，其特征在于：所述步骤(4)中好氧反硝化培养基的组成配比为：CH₃COONa 1.37g/L，KNO₃ 0.144g/L，KH₂PO₄ 0.02g/L，MgSO₄·7H2O 0.01g/L，CaCl₂0.01g/L，微量元素2mL/L。

5.根据权利要求1所述的应用于治理水产养殖尾水的异养硝化-好氧反硝化细菌的筛选及脱氮性能评估方法，其特征在于：所述微生物富集装置包括培养瓶，所述培养瓶中设有气体扩散器，所述气体扩散器与进气橡胶管连接，所述进气橡胶管的另一端与增氧机连接，所述培养瓶内插入有进出水管，所述进出水管的另一端连接有蠕动泵。

6.根据权利要求5所述的应用于治理水产养殖尾水的异养硝化-好氧反硝化细菌的筛选及脱氮性能评估方法，其特征在于：所述进气橡胶管与增氧机之间还设有气体流量计，所述进出水管上设有出气孔。

7.根据权利要求5所述的应用于治理水产养殖尾水的异养硝化-好氧反硝化细菌的筛选及脱氮性能评估方法，其特征在于：所述微生物富集装置还包括橡胶管夹子。

8.根据权利要求1所述方法筛选得到的异养硝化-好氧反硝化细菌的应用，其特征在于：所述异养硝化-好氧反硝化细菌添加碳源后按照10L/亩直接全池泼洒处理贫营养的养殖尾水。

9.根据权利要求1所述方法筛选得到的异养硝化-好氧反硝化细菌的应用，其特征在于：将异养硝化-好氧反硝化细菌用海藻酸钠胶体进行包埋，制成固定化载体，用聚乙烯网袋盛装后，加入高分子固体碳源，按照50kg载体/亩的比例悬挂于养殖水体中，处理贫营养的养殖尾水。

10.根据权利要求9所述方法筛选得到的异养硝化-好氧反硝化细菌的应用，其特征在于：对于室内养殖系统，将包埋有该菌种的载体置于养殖尾水处理池中，加入高分子固体碳源，通过曝气降低养殖尾水氮污染物，载体质量/曝气池容积(kg/L)为1：10。

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