CN109956563A - 一种高效好氧反硝化聚磷菌固定化小球的制备方法及其应用 - Google Patents
一种高效好氧反硝化聚磷菌固定化小球的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高效好氧反硝化聚磷菌固定化小球的制备方法及其应用。采用高效好氧反硝化聚磷菌,菌株命名为Acinetobacter sp.,属于不动杆菌属,保藏编号为:CGMCC No.17456;挑选斜面保存好的好氧反硝化聚磷菌接种于液体LB培养基中,摇床培养得到菌悬液;然后用海藻酸钠溶液包埋获得固定化小球。本发明产品固定化小球按照20‑60g/l的投加量投加于生活污水中进行脱氮除磷处理,脱氮率均超过80%,除磷率均超过90%。本发明的固定化小球包埋的对象为单一菌株,包埋材料仅为海藻酸钠;无需硝化液回流,能够实现同步脱氮除磷,且具有较高的处理效果,操作过程简单、生产成本低、易于推广。
Description
技术领域
本发明属于废水处理技术领域,尤其涉及包埋单一菌体的固定化小球对废水进行同步脱氮除磷技术。
背景技术
随着国内外对水体污染日益严重问题的关注和高度重视,国家和地方颁布实施了新的水污染物排放标准,污水处理厂的出水指标控制越来越严格,尤其是总磷和总氮。而我国现有污水处理厂普遍执行《城镇污水处理厂污染物排放标准》 (GB18918-2002)一级A标准,意味着必须提高废水处理工艺的脱氮除磷效果,即提标改造以达到新的废水排放标准是绝大多数污水处理厂的迫切需求。
目前现有的污水处理脱氮工艺大多采用传统的活性污泥法,总氮的去除多数通过微生物的氨化、硝化和反硝化过程来实现,这种技术意味着脱氮工艺必须分开实现,硝化液也需要回流,工艺复杂且运行费用高,同时在调试运行反应器时由于流动性及菌的悬浮状态导致优势菌难以保留,极易随流体流出,使得调试运行难度大,周期长;总磷则大多采用传统的化学絮凝沉淀法,其成本高且存在二次污染的问题。
现有脱氮除磷工艺的效果并不十分理想,出水很难达到总氮、总磷的新排放标准,必须对传统的技术进行升级。
好氧反硝化聚磷菌是一类兼有脱氮和除磷特性的微生物,它们能在好氧条件下以硝酸盐和氧气作为电子受体进行同步反硝化(脱氮)和过量吸磷(除磷)过程。这类菌能成功解决传统工艺中脱氮和除磷两过程在时间和空间上难以统一的问题,并且硝化液无需回流,无需化学絮凝沉淀除磷,可实现脱氮除磷的同步进行。
微生物固定化技术是指以一种限制微生物自由移动的方法来将活的微生物局限在一特定的空间区域中,借此可使该微生物所展现出的流体动力学特征不同于周围环境中的其他微生物,并且能保持该微生物的催化活性而使其可以被重复地使用。将该技术应用于污水处理中,用以固定具有高效处理能力的菌株如好氧反硝化聚磷菌等,不但可以解决功能菌的难以培养、浓度低、难以成为优势菌等问题,而且反应器启动快、处理效率高、抗冲击力强、载体小球易于泥水分离。
目前,关于固定化微生物应用于污水脱氮除磷方面的专利有研究包埋藻类的,如专利CN103013974A为包埋单一藻类,能够同步脱氮除磷,先利用活性炭进行水华鱼腥藻的吸附,再利用聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液进行包埋,经过8h凝胶固化后获得固定化颗粒,该包埋颗粒在温度为25℃、光照为50001ux、处理污水量与接入颗粒质量比为15:1的条件下,在饥饿处理3天后,对取至某畜禽废水污水处理厂,经CASS曝气池处理后的出水进行处理,5d后其总氮由56.21mg/l降低至11.58mg/l,总磷由18.80mg/l降低为0.918mg/l;专利CN101259983A为包埋组合藻类,能够同步脱氮除磷,利用卡拉胶、海藻酸钙、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺等材料包埋对氮磷具有强吸收能力的衣藻、小球藻等绿藻制作固定化藻菌,将其投入固定藻处理装置(流化床)中,四周设有日光灯,对经过厌氧好氧处理后的生活污水进行处理,进入流化床的氨氮由5mg/l降低至0.1mg/l,磷由1mg/l降低至0.3mg/l。在包埋藻类应用于污水的脱氮除磷上,由于藻类是自养型生物,需要光照条件和低碳环境,故限制了其在污水处理厂的提标改造中的应用。
在包埋细菌应用于污水脱氮除磷方面,专利CN102392011为包埋单一细菌,仅能够脱氮,其将筛选获得的好氧反硝化菌株与海藻酸钠-聚乙烯醇混合溶液混合均匀,滴入4%氯化钙溶液中交联固化11-13h获得固定化小球,经过11-13h的曝气活化后投加于人工湿地模拟柱中进行模拟废水的脱氮研究,系统经过36h处理后,硝态氮去除率达到98%(初始浓度80mg/l);专利CN108359663A为包埋单一细菌,仅能够除磷,其利用γ-聚谷氨酸/壳寡糖水凝胶、聚乙烯醇、海藻酸钠等复合包埋载体固定经活性炭吸附的聚磷菌,按照小球投加量100g/l废水的比例将其投加于富磷废水中,5d后污水的中的磷浓度由5mg/l降低为0.828mg/l,去除率为83.44%;专利CN106381275A为包埋组合细菌,能够脱氮除磷,其将沼泽红假单胞菌、芽孢杆菌、硫化细菌、硝化细菌、反硝化细菌制成菌剂后利用海藻酸钠- 聚乙烯醇混合溶液进行包埋,固定交联24h得到小球,投加于养殖废水中,36h 后总磷由0.26mg/l降低为0.02mg/l,氨氮由0.5mg/l降低为0.02mg/l;专利 CN105734042A为包埋组合细菌,能够脱氮除磷,其将海藻酸钠、聚乙烯醇与除磷菌粉和脱氮菌粉混合,利用蠕动泵将其滴入含有纳米二氧化钛(使其具有光催化特性)的硼酸氯化钙溶液中进行钙化,24h后得到固定化脱氮颗粒,用于处理模拟生活废水,经过12h的光照、振荡处理后氨氮去除率超过80%(初始浓度20mg/l),总磷去除率超过70%(初始浓度10mg/l)。可见,目前还没有包埋单一好氧反硝化聚磷细菌菌株应用于污水同步脱氮除磷方面的专利。
而针对不同的微生物,包埋材料也不尽相同,如前所述专利CN101259983A 中利用卡拉胶、海藻酸钙、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺等材料对衣藻、小球藻等绿藻进行以制作固定化藻菌;专利CN108359663A中利用γ-聚谷氨酸/壳寡糖水凝胶、聚乙烯醇、海藻酸钠等复合包埋载体固定经活性炭吸附的聚磷菌等。同时包埋材料的不同也直接影响了包埋固定化过程的时间等,如专利CN101786763A利用冷冻 -解冻过程得到平板状固定细胞,其所耗费时间长且操作过程复杂;又如专利 CN102392011将筛选获得的好氧反硝化菌株包埋与海藻酸钠-聚乙烯醇混合溶液中,滴入4%氯化钙溶液中需要交联固化11-13h;专利CN109231492A以海藻酸钠沸石、海藻酸钠和聚乙烯醇为固定化载体包埋红螺菌、硝化细菌和枯草芽孢杆菌,需要搅拌固定化2h后得到的固定化复合微生物,等等。
可见,目前仍未有专利涉及包埋具有高效同步脱氮除磷能力的单一细菌菌株,也未出现相关包埋材料简单、包埋时间快捷的包埋技术,并且其脱氮除磷效率一般。因此,研究包埋固定化高效好氧反硝化聚磷菌,并用其高效的脱氮除磷能力进行污水的处理具有显著的现实意义。
与本专利固定化小球的制作与应用最相近的实验方案为专利《一种提高人工湿地脱氮效率的固定化细菌制备方法及应用》(CN102392011A)、专利《一种聚磷菌固定化小球及其应用》(CN108359663A)及《一种光催化型固定化脱氮除磷颗粒的制备方法》(CN105734042A),其具体实验方案如下。
(1)专利《一种提高人工湿地脱氮效率的固定化细菌制备方法及应用》(CN102392011A)
1)从增氧型复合垂直流人工湿地中筛选出好氧反硝化菌株,在恒温28℃的培养箱中进行菌株的筛选培养;
所述培养基组成是:琼脂20g,硝酸钾1g,磷酸二氢钾1g,六水氯化亚铁0.5g,七水氯化钙0.2g,七水硫酸镁1g,琥珀酸钠8.5g,溴瑞香草酚兰试剂 1mL;蒸馏水1000mL,用1mol/L-1氢氧化钠调节pH至7.0-7.3;
2)好氧反硝化细菌的菌悬液的制备:
挑选1-2环斜面保存的好氧反硝化细菌,加入到经过高温高压:121℃,105-110kPa灭菌的富集培养基中,在30℃下曝气培养5天,得到菌液,将得到的菌液离心,弃去上清液,用0.9%w/v生理盐水离心洗涤2-3次,再用0.9%w/v生理盐水稀释到500ml左右(菌体:生理盐水=20:250v/v),混合均匀,4℃贮藏备用;
所述培养基组成是:双蒸水750mL,硝酸钾2g,磷酸二氢钾1g,磷酸氢二钾 1g,硫酸镁0.2g,柠檬酸钠5g,微量盐溶液2mL;
3)固定化好氧反硝化菌:
①用海藻酸钠-聚乙烯醇包埋获得的固定化好氧反硝化菌:
5%w/v聚乙烯醇和5%w/v海藻酸钠的混合溶液60mL,微波加热,使其完全混合,高温高压灭菌:121℃,105-110kPa,冷却至室温,与80mL好氧反硝化菌悬液充分混合;将此混合液用注射器挤入到4%w/v氯化钙溶液中,冰浴,边滴边搅拌,使其形成直径为2mm的小球;将形成的小球放置于4℃冰箱中交联固化11-13h,用无菌水清洗小球,再放入饱和硼酸溶液中,于4℃冰箱中交联固化11-13h,用生理盐水洗涤2-3次备用。
②用海藻酸钠和聚乙烯醇分别包埋所获得的好氧反硝化菌:
海藻酸钠固定法:称取4g海藻酸钠溶解到60mL的0.9%w/v的生理盐水中,高温高压:121℃,105-110kPa灭菌,冷却至室温,与80mL好氧反硝化细菌悬浮液充分混合,滴入4%w/v氯化钙溶液中,冰浴,边滴边搅拌,使其形成直径为2mm 的小球;将形成的小球放置于4℃冰箱中交联固化22-25h,用生理盐水洗涤2-3 次备用。
聚乙烯醇固定法:配制60mL 10%w/v的聚乙烯醇溶液,高温高压:121℃, 105-110kPa灭菌,冷却到室温,与80mL好氧反硝化菌悬液充分混合,滴入饱和硼酸溶液中,冰浴,边滴边搅拌,使其形成直径为2mm的小球;将形成的小球放置于4℃冰箱中交联固化22-25h后,用生理盐水洗涤2-3次备用。
5)活化固定化小球:
将制备步骤3中所制得的好氧反硝化细菌固定化小球从冰箱中取出,用双蒸水或者0.9%w/v的生理盐水洗涤3-4次,然后浸泡在0.9%w/v的生理盐水中,曝气11-13h以活化固定化小球。
6)将所得固定化小球投加于人工湿地模拟柱中处理废水时,经过36h,该人工湿地模拟柱系统中的废水在固定化小球及附着于陶粒上其他菌体的共同作用后硝态氮的去除率均达到98%(硝态氮初始浓度为80mg/l)。
(2)专利《一种聚磷菌固定化小球及其应用》(CN108359663A)
1)菌悬液的制备:将聚磷菌接种于富集培养基中,摇床培养,得到对数生长期的菌体,离心,弃去上清液,将菌体用0.9%的生理盐水洗涤,反复离心4-5 次,加入与菌液等体积的生理盐水稀释,得菌悬液;
富集培养基为牛肉膏蛋白胨培养基,具体组成为:牛肉膏5g/l,蛋白胨10g/l,氯化钠5g/l,余量为蒸馏水。
2)活性炭吸附:将菌悬液与活性炭室温混合吸附30min,得活性炭吸附菌悬液混合液;
3)γ-聚谷氨酸/壳寡糖水凝胶的制备:将γ-聚谷氨酸、透明质酸及壳寡糖加至去离子水中,85℃加热至完全溶解,冷却至28-32℃,加入交联剂室温不断搅拌交联5min,得γ-聚谷氨酸/壳寡糖水凝胶。其中γ-聚谷氨酸、透明质酸、壳寡糖和去离子水的用量比为5-7g:0.3-0.5g:0.4-0.6g:100mL;交联剂为1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-N-羟基琥珀酰亚胺;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-N-羟基琥珀酰亚胺和去离子水的用量比为1.8-2g: 1-1.4g:100mL。
4)复合包埋载体水溶液的制备:将聚乙烯醇和海藻酸钠加至去离子水中,高温灭菌并使其完全溶解,冷却到28-32℃,得聚乙烯醇/海藻酸钠水溶液;将聚乙烯醇/海藻酸钠水溶液与γ-聚谷氨酸/壳寡糖水凝胶混合均匀,得复合包埋载体水溶液;其中聚乙烯醇、海藻酸钠、γ-聚谷氨酸/壳寡糖水凝胶和去离子水的用量比为10-14g:3-5g:8-12mL:90mL。
5)聚磷菌固定化小球的制备:将活性炭吸附菌悬液混合液和复合包埋载体水溶液混合,搅拌均匀,-5℃-5℃条件下用注射器滴加至不断搅拌的氯化钙/饱和硼酸溶液中,形成直径3-4mm的小球,4℃固定交联24h后,用生理盐水冲洗4-5 次,4℃低温保存,得聚磷菌固定化小球。其中氯化钙/饱和硼酸溶液中氯化钙浓度为3%-5%;活性炭吸附菌悬液混合液与复合包埋载体水溶液的体积比为1:1。
6)聚磷菌固定化小球在富磷废水处理中的应用
按照聚磷菌固定化小球的接种量为100g/l;将其投加于模拟富磷废水中,在 30℃、转速150r/min压摇床上培养5d,每隔1d检测其磷浓度并计算聚磷率。初始磷浓度为5mg/l的水样中,5d后聚磷率达到83.44%,初始磷浓度为10mg/l的水样, 5d后聚磷率为63.01%。
(3)专利《一种光催化型固定化脱氮除磷颗粒的制备方法》(CN105734042A)
1)耐盐性脱氮除磷菌的筛选与培养:
取自然风干后的海水养殖场底泥,分别接种到高盐富磷液体培养基和高盐富氮液体培养基中,用恒温振荡摇床控制温度35℃,以100~120r/min的转速培养 48h后,从高盐富磷液体培养基和高盐富氮液体培养基中分别取出占培养基体积 10%~20%的混合液,分别加到上述高盐富磷和富氮的液体培养基中,并分别提高磷和氮的投加量(每次的增加量较上次的含量增加25wt%~50wt%),再培养48h,依此类推,通过三代的驯化,培养出嗜磷菌和嗜氮菌,再通过稀释涂布法,分别分离出脱氮菌和除磷菌,通过富集培养将分离出来的菌株进行扩增,再通过离心、洗脱和干燥,分别得到除磷菌粉和脱氮菌粉。
高盐富磷液体培养基配方为:2.5g/l乙酸钠、0.125g/l磷酸氢二钾、0.25g/l 硫酸镁、0.1g/l氯化钙、1g/l硫酸氨和25g/l氯化钠;所述的高盐富氮液体培养基配方为:2.5g/l柠檬酸钠、0.5g/l磷酸氢二钾、0.5g/l磷酸二氢钾、0.1g/l 硫酸镁、25g/l氯化钠和1g/l氯化铵;这两种培养基都经过高压灭菌。
2)含氮纳米二氧化钛的制备
将乙醇、乙酸和钛酸四丁酯按体积比为85~91:4~6:5~9混合,得到溶液A;将乙醇、1wt%尿素和水按体积比为85~90:4~5:6~10混合,得到溶液B;将溶液A缓慢滴入溶液B中,溶液A与溶液B的体积比为4~6:1,在30℃下让其陈化至形成凝胶,通过烘干、煅烧(烘干温度为105~110℃,烘干时间为5~8h;煅烧温度为600℃~800℃,煅烧时间为2~3h)形成掺杂氮的纳米二氧化钛;
3)光催化型固定化脱氮除磷颗粒的制备
将海藻酸钠和聚乙烯醇于90~100℃水浴锅中加热搅拌,待其完全溶解后,冷却至室温,添加步骤1)得到的除磷菌粉和脱氮菌粉中的一种或两种,搅拌 10min,形成混合液C;将硼酸、氯化钙和步骤2)所制备的掺杂氮的纳米二氧化钛进行混合,形成混合液D;在制作光催化型固定化脱氮除磷颗粒的装置系统中,将混合液C通过蠕动泵缓缓输到装置(a)中,在蠕动泵的推动力下,混合液C缓慢滴入到装有混合液D的装置(b)中,并不断用磁力搅拌转子进行搅拌,经过钙化反应(时间为24h~48h)后,制得粒径大小为3mm~5mm的光催化型固定化脱氮除磷颗粒。
4)光催化型固定化脱氮除磷颗粒的应用
分别称取上述所制备出来的固定化颗粒2g,投入到100mL模拟废水中,模拟废水初始参数为:氨氮:20mg/l,总磷:10mg/l,COD:300mg/l,盐度:0.3%,将其在光照条件下放置于恒温振荡器内,控制温度35℃,以120r/min的转速进行培养,12h后脱氮率均超过80%,除磷率均超过70%。
在已有的发明专利中,固定化微生物进行污水脱氮除磷专利有包埋藻类的,如专利CN101259983A和CN103013974A,但因藻类是自养型生物,应用于污水脱氮除磷需要光照条件和低碳环境,限制了其在污水处理厂的提标改造中的应用。
固定化微生物进行污水脱氮除磷专利有包埋细菌的,如专利CN102392011A 和CN108359663A为包埋单一细菌,仅能够脱氮或除磷,不能够实现同步脱氮除磷,如分别投加两种菌体小球进行脱氮除磷时,其运行条件不一致,增加了制作小球和污水系统运行成本。
专利CN106381275A和CN105734042A为包埋组合细菌,能够实现同步脱氮除磷,CN106381275A通过利用海藻酸钠-聚乙烯醇混合溶液包埋由沼泽红假单胞菌、芽孢杆菌、硫化细菌、硝化细菌、反硝化细菌制成的菌剂,经过24h的交联固化后,投加于养殖废水中,36h后总磷由0.26mg/l降低为0.02mg/l,氨氮由0.5mg/l 降低为0.02mg/l,可见其处理效果很一般;专利CN105734042A通过利用海藻酸钠 -聚乙烯醇包埋除磷菌粉和脱氮菌,并通过蠕动泵将其滴入含有纳米二氧化钛(使其具有光催化特性)的硼酸氯化钙溶液中进行钙化,24h后得到固定化脱氮颗粒将其投加于模拟生活废水,经过12h的光照、振荡处理后氨氮去除率为80%(初始浓度20mg/l),总磷去除率超过70%(初始浓度10mg/l),可见其脱氮除磷效果一般,而且需要光照,影响了其在污水处理厂的提标改造中的应用。
发明内容
鉴于现有技术的以上不足,本发明的目的是提供一种高效好氧反硝化聚磷菌固定化小球的制备技术及其应用,一方面提供具有高效同步脱氮除磷效率的单一菌种,为固定化技术提供有利的微生物材料,为污水处理实现同步脱氮除磷提供可能;另一方面提供一种固定化时间短、操作方便的固定化技术,并且处理过程具有小球投加量小、处理效果好的特点,以便为目前污水的生物脱氮除磷工艺的升级提供一定帮助,以克服现有技术的不足。
本发明是通过如下的技术方案实现的:
(1)一种高效好氧反硝化聚磷菌固定化小球的制备方法,其步骤如下:
①分离筛选获得包埋菌株
从污水处理厂曝气池污泥中筛选出的一株具有高效脱氮除磷效果的好氧反硝化聚磷菌SWB-26,其特征在于:菌株命名为Acinetobacter sp.,属于不动杆菌属,已于2019年03月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCCNo.17456,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
②好氧反硝化聚磷菌的菌悬液制备
挑选1-2环斜面保存的好氧反硝化聚磷菌SWB-26,接种于新鲜灭菌后的液体 LB培养基中,于150r/min、28℃下培养12h,将培养液置于转速为4000r/min下离心15min,倾去上清液,用生理盐水离心洗涤2-3次,再用生理盐水稀释至OD600 值为0.5左右,于4℃贮藏备用;
液体LB培养基:蛋白胨10g/l,氯化钠5g/l,酵母膏10g/l,pH 7.0-7.2。
③用海藻酸钠包埋获得固定化小球
配制4%w/v海藻酸钠溶液,高温高压灭菌20min,冷却至室温,按照菌悬液与海藻酸钠溶液体积比为1:3的比例将二者充分混合,利用注射器将其滴入4%w/v 氯化钙溶液中,边滴边搅拌,使其形成直径为2-3mm的小球;放置于4℃冰箱中交联固化1h,用生理盐水洗涤2-3次后获得目标产物高效好氧反硝化聚磷菌固定化小球。
(2)采用如上方法获得的高效好氧反硝化聚磷菌固定化小球在生活污水中的应用。高效好氧反硝化聚磷菌固定化小球在生活污水中的投放量为20-60g/l。
采用本发明的技术方案,即通过从污水处理厂的曝气池活性污泥中分离筛选得到一株高效好氧反硝化聚磷菌,应用微生物固定化技术,利用海藻酸钠将其包埋固定化为小球,限制其自由移动,进而投加于生活污水中进行脱氮除磷处理,可实现利用单一菌株同步脱氮除磷,而且高效、低成本,并能在一定程度上简化、优化脱氮除磷工艺、提高了处理效率。本发明产品固定化小球按照20-60g/l的投加量投加于生活污水中进行脱氮除磷处理,脱氮率均超过80%,除磷率均超过90%。本发明的固定化小球包埋的对象为单一菌株,包埋材料仅为海藻酸钠;无需硝化液回流,能够实现同步脱氮除磷,且具有较高的处理效果,操作过程简单、生产成本低、易于推广。
附图说明
图1为本发明实施例不同固定化材料下小球的性能表,其中,注:a.SA为海藻酸钠;PVA为聚乙烯醇;AC为活性炭。b.成球性:0-10分,10分表示成球非常好,小球圆润,无拖尾现象;0分表示成球难以成球,且存在拖尾等现象;c.耐碎度: 0-10分,10分表示小球不易碎,挤压不易变形,具有一定弹性,0分表示小球极易碎裂,挤压等易变形破碎,该指标的判断来源于对小球的感官判断及小球连续摇床培养3d的破碎情况。
图2为本发明实施例不同浓度海藻酸钠包埋下的小球的耐碎性及脱氮除磷率表。
图3为本发明实施例不同投加量下的小球脱氮除磷率表。
图4本发明实施例固定化小球在生活污水中处理的应用效果图表。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
一、好氧反硝化聚磷菌株的分离筛选及鉴定
通过富集培养、稀释涂布平板法、平板划线法等从生活污水处理厂的曝气池活性污泥中分离筛选得到初筛菌株;将其点接于溴百里酚蓝(BTB)培养基上,于28℃下培养至长出明显的菌落,选择具有蓝白斑培养现象的菌株(说明其具有反硝化能力),同时将菌株接种于LB液体培养基中缺氧培养12h后进行Albert异染颗粒染色,有黑色聚磷颗粒物质的菌株说明其具有聚磷作用;结合蓝白斑筛选结果将菌株接种保藏于LB斜面培养基上,4℃保存备用。
所述过程所使用的培养基如下:
反硝化富集培养基(/L):琥珀酸钠2.84g;NaNO3 10mMol;KH2PO4 1.36g; (NH4)2SO4,0.27g;酵母提取物1g;MgSO4·7H2O 0.19g;微量元素溶液1mL,去离子水1000mL,Ph=7.2。
②溴百里酚蓝(BTB)培养基(/L):天冬酰胺1g;KNO3 1g;KH2PO4,1g; FeCl2·6H2O0.05g;CaCl2·2H2O 0.2g;MgSO4·7H2O 1g;BTB(1%量溶解于乙醇)1ml;琼脂20g;去离子水1000mL,pH 7.0~7.3。
③LB培养基(/L):酵母浸膏10g,蛋白胨10g,NaCl 5g,双蒸水1000mL, pH7.0~7.2;固态培养基中添加琼脂20g。
将分离筛选得到的高效好氧反硝化聚磷菌株SWB-26进行基因组DNA的提取、 PCR扩增和测序后,将测序所得的菌株序列提交到NCBI上进行blast检索,发现其与Acinetobacter sp.CGMCC 6052(KC422446.1)菌株的同源性为100%,确定该菌株为不动杆菌属,命名Acinetobacter sp.。
二、固定化材料的筛选
1、菌悬液的制备
挑选1-2环斜面保存的好氧反硝化聚磷菌SWB-26,接种于新鲜灭菌后的液体 LB培养基中,于150r/min、28℃下培养12h,将培养液置于转速为4000r/min下离心15min,倾去上清液,用生理盐水离心洗涤2-3次,再用生理盐水稀释至OD600 值为0.5左右,于4℃贮藏备用;
液体LB培养基:蛋白胨10g/l,氯化钠5g/l,酵母膏10g/l,pH 7.0-7.2。
2、固定化材料的筛选
(1)小球的制备
①用海藻酸钠-聚乙烯醇固定获得固定化小球
4.5%w/v聚乙烯醇和1%w/v海藻酸钠的混合溶液60mL,90℃恒温水浴加热搅拌溶解,高温高压灭菌:121℃,105-110kPa,冷却至室温,与20mL菌悬液充分混合;将此混合液用注射器挤入到4%w/v氯化钙-饱和硼酸溶液中,边滴边搅拌,使其形成直径为2-3mm的小球;放置于4℃冰箱中交联固化1h,用生理盐水洗涤2-3 次备用。
②用海藻酸钠-聚乙烯醇-活性炭固定获得固定化小球
4.5%w/v聚乙烯醇和1%w/v海藻酸钠的混合溶液60mL,90℃恒温水浴加热搅拌溶解,将其与装有2g活性炭的小烧杯一起进行高温高压灭菌:121℃,105-110kPa,待其冷却至室温;将20mL菌悬液加入装有活性炭的小烧杯中,于4℃冰箱中吸附4h后与聚乙烯醇-海藻酸钠溶液混合均匀,将混合液用注射器挤入到4%w/v氯化钙 -饱和硼酸溶液中,边滴边搅拌,使其形成直径为2-3mm的小球;放置于4℃冰箱中交联固化1h,用生理盐水洗涤2-3次备用。
③用海藻酸钠固定获得固定化小球
配制3%w/v海藻酸钠溶液,高温高压灭菌20min,冷却至室温,按照菌悬液与海藻酸钠溶液体积比为1:3的比例将二者充分混合,利用注射器将其滴入4%w/v 氯化钙溶液中,边滴边搅拌,使其形成直径为2-3mm的小球;放置于4℃冰箱中交联固化1h,用生理盐水洗涤2-3次备用。
④用海藻酸钠-活性炭固定获得固定化小球
称量适量经研磨过筛后的活性炭于小烧杯中,用报纸封紧烧杯口;配制3%w/v 海藻酸钠溶液,将二者置于高温高压下灭菌20min,冷却至室温。按照菌悬液:活性炭=10ml:1g的比例,将菌悬液加入盛有灭菌的活性炭小烧杯中,于4℃下静置吸附4h,按照菌悬液与海藻酸钠溶液体积比为1:3的比例将二者充分混合,利用注射器将其滴入交联溶液中,边滴边搅拌,使其形成直径为2-3mm的小球;放置于4℃冰箱中交联固化1h,用生理盐水洗涤2-3次备用。
⑤用聚乙烯醇固定获得固定化小球
配制10%w/v聚乙烯醇溶液,高温高压灭菌20min,冷却至室温,按照菌悬液与聚乙烯醇溶液体积比为1:3的比例将二者充分混合,利用注射器将其滴入饱和硼酸溶液中,边滴边搅拌,使其形成直径为2-3mm的小球;放置于4℃冰箱中交联固化1h,用生理盐水洗涤2-3次备用。
⑥用聚乙烯醇-活性炭固定获得固定化小球
称量适量经研磨过筛后的活性炭于小烧杯中,用报纸封紧烧杯口;配制 10%w/v聚乙烯醇溶液,将二者置于高温高压下灭菌20min,冷却至室温。按照菌悬液:活性炭=10ml:1g的比例,将菌悬液加入盛有灭菌的活性炭小烧杯中,于4℃下静置吸附4h,按照菌悬液与聚乙烯醇溶液体积比为1:3的比例将二者充分混合,利用注射器将其滴入饱和硼酸溶液中,边滴边搅拌,使其形成直径为2-3mm的小球;放置于4℃冰箱中交联固化1h,用生理盐水洗涤2-3次备用。
(2)小球脱氮除磷效果测试
反硝化富磷培养基(/L):CH3COONa.3H2O 3.23g;KH2PO4 50mg;NH4Cl 250mg;MgSO4.7H2O,91.26mg;CaCl2 19.39mg;KNO3 100mg;微量元素溶液2mL; ph=7.0-7.2。
按照40g/l的投加量分别称取以上制备好的小球各2g,投加于装有50ml新鲜灭菌的富磷反硝化培养基锥形瓶中,置于28℃、150r/min的摇床中培养24h,培养结束后离心15min(转速4000r/min),取上清液测定其TN、TP浓度,并通过测定空白培养基的TN、TP浓度计算脱氮率与除磷率。同时往各个锥形瓶中添加无菌水使其体积达到50ml,将其置于摇床中继续培养3天,每24h观察各个小球的破碎情况。
各个小球的成球性、易碎度、脱氮除磷率结果如图1所示。
由图1可知,在固定化材料SA-PVA、SA-PVA-AC、PVA、PVA-AC组合下小球的成球性、耐碎度都不理想。利用聚乙烯醇固定菌株时,难以成球,未成形的小球容易黏连在一块,同时其所需要的固定时间比较长,因此排除PVA、PVA-AC这两种固定化材料组合。SA-PVA、SA-PVA-AC组合的成球性相对较好,也具有较好的脱氮除磷效率,但是其耐碎度不如SA包埋下的小球,此两类小球经过1d的摇床培养就出现碎末现象,2d后几乎难以再找到一颗完整的小球,而SA包埋下的小球经过3d的摇床培养仍未出现碎末现象。因此不考虑SA-PVA及SA-PVA-AC这两种固定材料组合。其次,活性炭具有吸附作用,能在一定程度上提高小球的除磷效果,但由于其固态性质,导致小球容易出现活性炭泄漏现象,并且随着摇床培养时间的延长,其泄漏现象更加严重。此外,由于包埋活性炭与否对脱氮除磷效果并未产生较大影响,故不采用含活性炭的包埋方式。海藻酸钠包埋的小球,能够有效包埋微生物细胞,并且能够保持较高的微生物活性,具有活性高、吸附量大、机械强度好等特点,因此在综合考虑小球的重复使用性及实际应用前景的基础上最终选择SA(即海藻酸钠)作为固定化材料。
三、海藻酸钠的最佳包埋浓度
1、菌悬液的制备
实验方案与步骤二中菌悬液的制备相同。
2、最佳包埋材料浓度
分别配制浓度为1%、2%、3%、4%、5%w/v的海藻酸钠溶液各50ml,于高温高压灭菌20min,冷却至室温;按照菌悬液与海藻酸钠溶液体积比为1:3的比例将二者充分混合,利用注射器将其滴入4%w/v氯化钙溶液中,边滴边搅拌,得到直径为2-3mm的固定化小球;将其置于4℃冰箱中交联固化1h,用无菌生理盐水洗涤2-3 次备用。
按照40g/l的投加量,分别称取以上制备好的小球各2g,投加于装有50ml分别称取以上制备好的小球各2g,投加于装有50ml新鲜灭菌的步骤二中所述的反硝化富磷培养基锥形瓶中,置于28℃、150r/min的摇床中培养24h,培养结束后离心15min(转速4000r/min),取上清液测定其TN、TP浓度,并测定空白培养基的 TN、TP浓度以计算脱氮率与除磷率。同时往各个锥形瓶中添加超纯水使其体积达到50ml,之后将其置于摇床中继续培养,观察各个小球的破碎情况,结果如图2。
由图2数据可见,随着海藻酸钠浓度的提高,小球的耐碎度越好,小球越不易破碎、破裂,说明浓度越高,小球内部的结构更加紧密,其抵抗外界压力等的能力越好。在其化学性能上,当浓度小于4%w/v时,小球的脱氮除磷率大致随着浓度的增大也提高,当浓度为4%w/v时脱氮除磷率达到最高,分别为84.21%, 98.08%,但是5%w/v时其脱氮除磷率则有小幅度的降低,这说明若小球内部结构紧密性越好,可能不易于物质的扩散传递,因而海藻酸钠浓度越高,其脱氮除磷率可能会降低。综上,可以认为4%w/v的海藻酸钠溶液是最佳的包埋溶液浓度。
3、最佳小球投加量
按照20g/l、40g/l、60g/l和80g/l的投加量,分别称取海藻酸钠溶液浓度为4%w/v包埋下的小球1g、2g、3g、4g,投加于装有50ml新鲜灭菌的步骤二中所述的富磷反硝化培养基锥形瓶中,置于28℃、150r/min的摇床中培养24h,培养结束后离心15min(转速4000r/min),取上清液测定其TN、TP浓度,并测定空白培养基的TN、TP浓度以计算脱氮率与除磷率,具体结果如图3。
由图3可知,随着投加量的增加,脱氮除磷率也有所提高,当投加量为3g时,脱氮率达到85.87%,除磷率为99.14%;投加量为4g时其脱氮除磷率也较高,脱氮率达到85%,除磷率98%以上,但略低于投加量为3g的水样,相同体积的待处理水样,若小球投加量较大则会影响其溶解氧等,同时综合成本节约等实际问题,认为最佳小球投加量为60g/l。
生活污水处理应用实施例
取四川郫县合作镇污水处理厂截流井后的污水进行脱氮除磷试验,具体步骤如下:
(1)按照20g/l的投加量称量海藻酸钠溶液浓度为4%w/v包埋下的小球1g,共2份,分别投入装有50mL原污水的锥形瓶中作为固定化小球样,同时设置2个空白对照样品(不添加小球),实验组号为①。
(2)由于该生活污水的总氮、总磷含量较低,为体现菌株及固定化小球的高效脱氮除磷性能,故设置一组高氮磷污水处理实验组(编号②),即在污水中添加KNO3使污水中的TN浓度达到60mg/l左右,添加K2HPO4使TP浓度达到11mg/l 左右,结合高氮磷污水的高负荷情况,按照60g/l投加量称量小球3g,共2份,分别投入装有50mL高氮磷污水的锥形瓶中作为固定化小球样,并设置2个空白对照样品(不添加小球)。
将上述两组样品置于28℃、150r/min的摇床中培养24h,培养结束后离心 15min(转速4000r/min),取上清液测定其TN、TP浓度,并测定空白培养基的TN、 TP浓度以计算脱氮率与除磷率,具体结果如下图4。
由于污水自身存在一定的微生物,故具有一定的自净能力,但也较为局限。在未添加小球的空白对照样①②中,经过24h处理后,总氮去除率分别为6.71%、 8.83%,总磷去除率分别为27.41%、33.92%,去除效率比较低。在投加了固定化小球的水样中,总氮由35.93mg/l、56.59mg/l分别降低至6.69mg/l、8.94mg/l, 去除率达到81.37%、84.21%,总磷由3.98mg/l、11.12mg/l分别降低至0.16mg/l、 0.07mg/l,去除率达到95.85%、99.37%,两项指标均达到了最新颁布的《四川省岷江、沱江流域水污染物排放标准》(DB51/2311-2016)等地方标准中对于出水水质的要求,TP≤0.3mg/l,TN≤10mg/l。
在实际生活污水中,不同地区、不同时段,氮和磷的含量呈现变化,通过设置较低和高氮磷污水处理实验组,可以表明,当生活污水的氮磷含量的波动时,本发明产品固定化小球的投放量为20-60mg/l均可实现较高的脱氮除磷效果。
本发明的技术方案主要包括一株好氧反硝化菌株的分离筛选、固定化小球的制备及应用。由于菌株的一般性与特殊性,其分离筛选鉴定过程与常规的微生物分离、纯化、筛选、鉴定过程相似,但菌株具有特殊性以及处理效果的优异。在固定化小球的制备上,运用海藻酸钠包埋、氯化钙交联,这是一种常规的包埋技术,但是本专利中涉及的海藻酸钠的浓度、交联时间等是独特的,以及包埋对象也是特殊的,其综合作用获得的结果可达到较为优秀的效果。
Claims (2)
1.一种高效好氧反硝化聚磷菌固定化小球的制备方法,其步骤如下:
①分离筛选获得包埋菌株
从污水处理厂曝气池污泥中筛选出的一株具有高效脱氮除磷效果的好氧反硝化聚磷菌SWB-26,其特征在于:菌株命名为Acinetobacter sp.,属于不动杆菌属,已于2019年03月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCCNo.17456;
②好氧反硝化聚磷菌的菌悬液制备
挑选1-2环斜面保存的好氧反硝化聚磷菌SWB-26,接种于新鲜灭菌后的液体LB培养基中,于150r/min、28℃下培养12h,将培养液置于转速为4000r/min下离心15min,倾去上清液,用生理盐水离心洗涤2-3次,再用生理盐水稀释至OD600值为0.5左右,于4℃贮藏备用;
液体LB培养基:蛋白胨10g/l,氯化钠5g/l,酵母膏10g/l,pH7.0-7.2;
③用海藻酸钠包埋获得固定化小球
配制4%w/v海藻酸钠溶液,高温高压灭菌20min,冷却至室温,按照菌悬液与海藻酸钠溶液体积比为1:3的比例将二者充分混合,利用注射器将其滴入4%w/v氯化钙溶液中,边滴边搅拌,使其形成直径为2-3mm的小球;放置于4℃冰箱中交联固化1h,用生理盐水洗涤2-3次后获得目标产物高效好氧反硝化聚磷菌固定化小球。
2.采用权利要求1所述方法获得的高效好氧反硝化聚磷菌固定化小球在生活污水处理中的应用,其特征在于,高效好氧反硝化聚磷菌固定化小球在生活污水中的投加量为20-60g/l。
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