CN108546669A - 耐盐耐冷氨氧化细菌的生产方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种耐盐耐冷氨氧化细菌的生产方法及应用。其特征是首先筛选出高效氨氧化细菌，然后对氨氧化细菌进行耐盐驯化得到耐盐氨氧化细菌；进一步再对上述耐盐氨氧化细菌进行耐冷性驯化，得到耐盐耐冷氨氧化细菌。本发明首次提出的耐盐耐冷氨氧化细菌的生产方法其优点在于：操作简单、成本低，培养出的耐盐耐冷氨氧化细菌，不但能应用于自然水体中，且能规模化生产耐盐耐冷氨氧化细菌。该细菌能同时克服普通氨氧化细菌对盐度高和温度低环境的敏感，在温度为10℃，盐度为30‰的环境下，25天后，氨氮浓度从3.6mg/L降低至0.25mg/L。

Description

耐盐耐冷氨氧化细菌的生产方法及应用

本申请为2015100864643《一种耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法和应用》的分案申请，申请日为2015年2月17日。

技术领域

本发明属于水污染治理技术，具体涉及一种耐盐耐冷氨氧化细菌的生产方法及应用。

背景技术

氨氮过高是水体富营养化的主要因素之一，是水污染控制的主要指标。目前国内外针对氨氮的去除方法主要包括物理方法、化学方法和生物方法。物理方法只能实现污染物在空间上的位移，不能实现彻底的去除；化学方法快速有效，但由于引进化学药剂，处理不当会对水体构成二次污染；生物方法利用微生物的代谢将氨氮转化为氮气，实现污染物的去除，同时不会对环境构成二次污染，被广泛的认可。生物方法较物理方法和化学方法相比最大的特点是处理成本低，处理效果好，不会造成二次污染。

已有发明专利“一种处理氨氮废水的方法”（CN102001721A），该方法是在微波场辐照氨氮废水和活性炭的混合液进行脱除氨氮，虽然该方法去除效率高，但只改变了氨氮的存在形态而没有彻底去除，尤其是该方法不适用于自然地表水体。

研究已表明，利用微生物降解水体中的氨氮受到诸如盐度、温度等环境条件的影响，造成降解效率的降低。河口湿地水体中盐度介于淡水和海水之间，通常高于10‰，被认为是高盐度水体。水体中盐度过高会破坏微生物细胞的渗透压，破坏微生物的酶系统。同时，低温环境会影响微生物酶的活性和繁殖速率，抑制对氨氮的去除。目前文献报道氨氧化细菌的最适生长温度为30℃-35℃，对于北方寒冷地区，特别是诸如辽河湿地这样的面积广阔的自然湿地，其严酷的低温条件会严重影响氨氧化细菌对氨氮的降解。

虽然目前已有专利（CN102268386A）筛选出一株降解效果好的氨氧化细菌，在温度为30℃的实验室培养条件下，该菌株的氨氧化效率可达90%，但是该方法筛选出的氨氧化细菌的最佳温度高，因此不能在低温环境具有较好的去除效果；另有“一种耐低温硝化细菌的筛选方法”(CN102286390A)的发明专利，通过该方法筛选出的氨氧化细菌（专利中称亚硝酸细菌）虽然能够在温度为10℃-15℃的条件下保持其硝化效果，但该方法筛选出的氨氧化细菌却是无法适应高盐度环境。更值得指出的是，以上成果也仅仅限于实验室中，而未有付诸于现场大面积水域的实地实施，尤其是诸如辽河湿地这样的面积广阔的高盐度、低温环境的自然湿地，因此，耐盐耐冷氨氧化细菌菌剂的工业生产，对解决高盐低温环境氨氮降解具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐盐耐冷氨氧化细菌的生产方法及应用，以克服现有技术存在的问题。

本发明考虑到位于我国北方的辽河口湿地，常年处于低温状态，与此同时，河口湿地生态系统是一个咸淡水交汇，盐度偏高，生态环境敏感的复杂生态系统。然而，利用已有的传统物理、化学和生物方法无法达到较好的修复效果，且治理成本高。因此本发明从现场湿地沉积物中筛选、驯化的耐盐耐冷氨氧化细菌来处理辽河水体中的氨氮，不但处理效果好、费用低，而且因地制宜，不会对原有的生态环境构成潜在的威胁。

一种耐盐耐冷氨氧化细菌的生产方法，首先筛选出耐盐高效氨氧化细菌，然后对氨氧化细菌进行耐盐驯化得到耐盐氨氧化细菌；进一步再对上述耐盐氨氧化细菌进行耐冷性驯化，得到耐盐耐冷氨氧化细菌。

所述高效氨氧化细菌的筛选方法具体包括如下步骤：

（1）富集培养：称取干重10g-20g的沉积物，加入到一个盛有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天后吸取10mL至另一个富集培养基中，于上述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化细菌的浓度，最终得到氨氧化细菌富集液；上述富集培养基为：(NH₄)₂SO₄ 5.5g，CaCO₃ 5.5g，NaCl2.0g，MgSO₄0.5g，K₂HPO₄1.5g，MnSO₄0.01g，FeSO₄0.02g，蒸馏水1000mL，5%Na₂CO₃调节pH=8.0，121℃灭菌30min；

（2）纯化分离：将上述氨氧化菌富集液按10^-1-10^-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于28℃-30℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种氨氧化细菌，上述培养基为：NH₄SO₄2g，NaH₂PO₄0.25g，MgSO₄·7 H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，K₂HPO₄0.75g，NaCl0.01g，CaCO₃5g，琼脂20g蒸馏水1000mL，5%Na₂CO₃调节pH=7.2，121℃灭菌30min；

上述氨氧化细菌的耐盐和耐冷性驯化方法，包括如下步骤：

将上述分离得到多株纯种氨氧化细菌挑取到一个富集培养基中于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天，分别得到单菌株富集液。待上述各单菌株富集液进入对数增长期时，以各单菌株富集液与富集培养基5%的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的氨氧化细菌即为耐盐氨氧化细菌；

之后进行耐冷性驯化：即将上述筛选出的耐盐氨氧化细菌以富集液与富集培养基5%的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min-180r/min的条件下震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的氨氧化细菌即得到耐盐耐冷氨氧化细菌。

上述耐盐氨氧化细菌即可应用于高盐条件下的氨氮污染水体净化。

显然，本发明首次提出的耐盐耐冷氨氧化细菌的生产方法，操作简单、成本低。培养出的耐盐耐冷氨氧化细菌，不但能应用于自然水体中，且能实现规模化生产耐盐耐冷氨氧化细菌。该细菌能同时克服普通氨氧化细菌对盐度高和温度低环境的敏感，达到高盐低温条件下高效去除水体中氨氮。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

对某河流受污较严重区域进行采样，通过检测氨氮浓度达3.6mg/L，控制盐度为10‰，采用耐盐耐冷氨氧化细菌的生产方法筛选出的耐盐耐冷氨氧化细菌在温度为10℃的条件下对水体中的氨氮进行静态处理，包括步骤如下：

首先，筛选出高效氨氧化细菌：称取干重10g的沉积物，加入到一个盛有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，于200r/min，30℃的条件下震荡培养数天后吸取10mL至另一个富集培养基中，于上述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化菌的浓度，最终得到氨氧化细菌富集液；为保证筛选出的细菌为氨氧化细菌，取一定量上述氨氧化细菌富集液于白瓷板上与一定量Griess试剂混合，若生成紫红色络合物即完成检测；为得到单一的菌落，将上述氨氧化菌富集液按10^-1-10^-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于30℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为单一形态的单一菌，得到纯种氨氧化细菌。

然后，对氨氧化细菌的耐盐耐冷性驯化：将上述纯种氨氧化细菌挑取到一个富集培养基中于200r/min，30℃的条件下震荡培养数天培养，得到单菌株富集液。待菌株进入对数增长期（上述单菌株富集液吸光度OD600≈0.6）时，以5%的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于上述条件震荡培养数天，筛选出耐盐氨氧化细菌；再将上述筛选出的耐盐氨氧化细菌以5%的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150-180r/min的条件下震荡培养数天，筛选出耐盐耐冷氨氧化细菌，经鉴定为Ochrobactrum.sp。

静态试验：取受污染的河水于反应器中，将菌剂以5%的比例投加到受污水体中，在温度为10℃，盐度为30‰的环境下进行静态去除实验，每5天进行一次氨氮浓度的测定。经过25天实验，氨氮浓度降低至0.25mg/L。

实施例2

对某湿地表层水体进行采样，通过检测氨氮浓度达4.4mg/L，控制盐度为25‰，采用耐盐耐冷氨氧化细菌的生产方法筛选出的耐盐耐冷氨氧化细菌在温度为10℃的条件下对水体中的氨氮进行动态处理，包括步骤如下：

首先，筛选出高效氨氧化细菌：称取干重15g的沉积物，加入到一个盛有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，于150r/min，28℃的条件下震荡培养数天后吸取10mL至另一个富集培养基中，于上述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化菌的浓度，最终得到氨氧化细菌富集液；为保证筛选出的细菌为氨氧化细菌，取一定量上述氨氧化细菌富集液于白瓷板上与一定量Griess试剂混合，若生成紫红色络合物即完成检测；为得到单一的菌落，将上述氨氧化菌富集液按10^-1-10^-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于30℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为单一形态的单一菌，得到纯种氨氧化细菌。

然后，对氨氧化细菌的耐盐耐冷性驯化：将上述纯种氨氧化细菌挑取到一个富集培养基中于150r/min，28℃的条件下震荡培养数天培养，得到单菌株富集液。待菌株进入对数增长期（上述单菌株富集液吸光度OD600≈0.6）时，以5%的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于上述条件震荡培养数天，筛选出耐盐氨氧化细菌；再将上述筛选出的耐盐氨氧化细菌以5%的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150-180r/min的条件下震荡培养数天，筛选出耐盐耐冷氨氧化细菌，经鉴定为Aquamicrobium.sp。

动态试验：取某湿地水体于反应器中，将菌剂以10%的比例投加于反应器中，在温度为15℃，盐度为20‰的条件下进行动态去除实验，每5天进行一次氨氮浓度的测定，氨氮的浓度降低至0.49mg/L左右。

Claims (4)

1.耐盐耐冷氨氧化细菌的生产方法，其特征是首先筛选出高效氨氧化细菌，然后对氨氧化细菌进行耐盐驯化得到耐盐氨氧化细菌；进一步再对上述耐盐氨氧化细菌进行耐冷性驯化，即得耐盐性耐冷氨氧化细菌；

所述高效氨氧化细菌的筛选方法，包括如下步骤：

（1）富集培养：称取干重10g-20g的沉积物，加入到一个盛有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天后吸取10mL至另一个富集培养基中，于上述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化细菌的浓度，最终得到氨氧化细菌富集液；上述富集培养基为：(NH₄)₂SO₄ 5.5g，CaCO₃ 5.5g，NaCl2.0g，MgSO₄ 0.5g，K₂HPO₄ 1.5g，MnSO₄ 0.01g，FeSO₄ 0.02g，蒸馏水1000mL，5%Na₂CO₃调节pH=8.0，121℃灭菌30min；

（2）纯化分离：将上述氨氧化菌富集液按10^-1-10^-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于28℃-30℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种氨氧化细菌，上述培养基为：NH₄SO₄ 2g，NaH₂PO₄ 0.25g，MgSO₄·7 H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，K₂HPO₄0.75g，NaCl 0.01g，CaCO₃ 5g，琼脂 20g蒸馏水1000mL，5%Na₂CO₃调节pH=7.2，121℃灭菌30min；

上述氨氧化细菌的耐盐性耐冷驯化方法，包括如下步骤：

首先耐盐性驯化：将上述分离得到多株纯种氨氧化细菌挑取到一个富集培养基中于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天，分别得到单菌株富集液；待上述各单菌株富集液进入对数增长期时，以各单菌株富集液与富集培养基5%的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的氨氧化细菌即为耐盐氨氧化细菌；

之后进行耐冷性驯化：即将上述筛选出的耐盐氨氧化细菌以富集液与富集培养基5%的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min-180r/min的条件下震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的氨氧化细菌即为耐盐耐冷氨氧化细菌。

2.权利要求1的方法得到的耐盐耐冷氨氧化细菌应用于高盐条件下的氨氮污染水体净化。

3.权利要求1的方法得到的耐盐耐冷氨氧化细菌应用于低温条件下的氨氮污染水体净化。

4.权利要求1的方法得到的耐盐氨氧化细菌应用于低温高盐条件下的氨氮污染水体净化。