CN101338292A - 固定化耐冷菌的制备方法 - Google Patents

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徐贞贞
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Abstract

固定化耐冷菌的制备方法，它涉及一种耐冷菌的制备方法。本发明解决了现有技术分离出的菌体在低温时生长缓慢、处理污水中的有机污染物去除率低的问题。本发明方法如下：一、菌种的培养和驯化；二、耐冷菌的筛选；三、耐冷菌的固定。本发明的固定化耐冷菌在低温环境下对COD的去除率比中温菌高出63.67％，同时固定化耐冷菌在中温环境下对COD去除率比固定化耐冷菌在低温环境条件下的COD去除率高出6.02％。本发明的固定化耐冷菌在冬季对污水的COD平均去除率为85.79％，全年COD去除率平均值为86.66％，本发明的固定化耐冷菌没有因为在冬季温度较低而失去活性。

Description

固定化耐冷菌的制备方法
技术领域
本发明涉及一种耐冷菌的制备方法。
背景技术
我国北方地区冬季漫长、气温低，导致了微生物的活性降低，因此冬季污水生物处理的效果很差，这主要是由于温度的降低对活性污泥的吸附性能、沉降性能、微生物生长发育、种群组成及曝气池中氧转移效率有显著的影响。
目前已有报道从低温环境中分离到对污水中石油烃类、氯酚类、芳香烃类、脂肪类和表面活性剂等有机物和含硫含氮气体以及硫酸盐具有生物降解能力的耐冷菌体。但此种耐冷菌体相比于中温条件在低温时生长缓慢，世代时间长，直接投加此种冷适应微生物用于去除低温生活污水中的有机污染物，菌种易于流失，运行25-40天便需要二次投加，增加了运行成本。因此寻求一种在低温时活性相对较高的特殊菌群并对其数量进行强化，是解决冬季污水处理的根本方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术分离出的菌体在低温时生长缓慢、处理污水中的有机污染物去除率低的问题，提供了一种固定化耐冷菌的制备方法。本发明固定化耐冷菌的制备方法如下：一、菌种的培养和驯化：将冬季污水处理系统的曝气池中的污泥放入温度为15℃的低温生化培养箱中，通入由生活污水与模拟污水按1∶1-3的体积比组成的混合污水，然后在污泥的浓度为2.0-3.0g/L、溶解氧为2-4mg/L的条件下对污泥进行闷曝8-10h，再静沉2-4h，然后每天换水1次再排出1/3上清液，运行2-4天后排出全部上清液，然后在水力停留时间为6-8h，静沉时间为2-4h的条件下，将低温生化培养箱的温度降到10℃运行8-10天，再降到8℃运行8-10天，最后降到4℃运行8-10天，然后分离、纯化菌株，即完成菌种的培养和驯化；二、耐冷菌的筛选：将步骤一得到的菌株分别按8-15％的接种量接种于LB培养液中，在温度为3-8℃、转速为100-120转/分的条件下培养1.5-3天，经过两次转接后再以8-15％接种量接种于生活污水所占体积比为8-15％的LB培养液中得到菌液，将得到的菌液以8-15％接种量接种于发酵罐中得到悬浮液，然后在温度为10-15℃、pH值为7.0-8.0、转速为120-130转/分、溶氧为1∶1的条件下活化培养，选择对数生长期悬浮液的OD585吸光值为1.4-1.6的菌株，然后在转速为4000-6000转/分的条件下离心15-25min，然后弃去上清液后，将离心后得到的沉淀物用磷酸缓冲液清洗两遍、生理食盐水清洗三遍后，再在转速为4000-6000转/分的条件下离心15-25min，然后弃去上清液，即完成耐冷菌的筛选；三、耐冷菌的固定：将步骤二筛选出的耐冷菌制成质量浓度为8-10％的耐冷菌悬浮液，将得到的耐冷菌悬浮液与质量浓度为8-10％、海藻酸钠含量为0.016g/L的聚乙烯醇水溶液在温度为20-25℃的条件下按照1∶1的体积比混合，然后将混合后的溶液与聚氨酯泡沫填料按照1∶3的体积比混合，然后静置1-2h得到包埋耐冷菌的聚氨酯泡沫载体，再将包埋耐冷菌的聚氨酯泡沫载体放入CaCl2含量为0.016g/L、pH值为6.7的饱和硼酸溶液中浸泡，然后在24h内每间隔7-9h搅拌一次，再用生理食盐水冲洗三次和自来水冲洗三次即得固定化耐冷菌；其中步骤一所述的模拟污水是由10L自来水、3.0-5.0g葡萄糖、0.2g KH2PO4、2.0gNH4Cl、6.0g NaHCO3、0.15g MgSO4、0.014g CaCl2·2H2O和3.0mL微量元素营养液组成，其中微量元素营养液由1L蒸馏水、1.54g FeCl3·6H2O、0.15gH3BO3、0.03g CuSO4·5H2O、0.18g KI、0.12gMnCl2·4H2O、0.06g Na2MoO4·2H2O、0.12gZnSO4·7H2O、0.15g CoCl2·6H2O和10.0g EDTA组成。
本发明的固定化耐冷菌与中温菌进行COD去除率的对比试验后的试验结果得出：低温环境下(4℃)固定化耐冷菌对COD的去除率比中温菌高出63.67％，固定化耐冷菌在中、低温条件下都具有较高的活性和COD去除能力。同时固定化耐冷菌在中温环境下COD去除率比固定化耐冷菌在低温环境条件下的COD去除率高出6.02％。
本发明的固定化耐冷菌在冬季对污水的COD平均去除率为85.79％，全年COD去除率平均值为86.66％，可见本发明的固定化耐冷菌在冬季的COD平均去除率较高，没有因为在冬季温度较低而使固定化耐冷菌失去活性，不需要在对污水的处理过程中二次投加固定化耐冷菌。
附图说明
图1是具体实施方式一制备的固定化耐冷菌与中温菌对COD去除率的对比曲线图，a区表示吸附期，b区表示降解期，c区表示稳定期，-■-表示在中温(25℃)的条件下中温菌对COD的去除率曲线，-●-表示在中温(25℃)的条件下具体实施方式一制备的固定化耐冷菌对COD的去除率曲线，-▲-表示在低温(4℃)的条件下具体实施方式一制备的固定化耐冷菌对COD的去除率曲线，
Figure A20081013702700061
表示在低温(4℃)的条件下中温菌对COD的去除率曲线。图2是具体实施方式一制备的固定化耐冷菌对COD去除率的效果图，-■-表示水处理过程中进水的COD曲线，表示水处理过程中出水的COD曲线，-●-表示具体实施方式一制备的固定化耐冷菌在12个月中对COD的去除率曲线。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式中固定化耐冷菌的制备方法如下：一、菌种的培养和驯化：将冬季污水处理系统的曝气池中的污泥放入温度为15℃的低温生化培养箱中，通入由生活污水与模拟污水按1∶1-3的体积比组成的混合污水，然后在污泥的浓度为2.0-3.0g/L、溶解氧为2-4mg/L的条件下对污泥进行闷曝8-10h，再静沉2-4h，然后每天换水1次再排出1/3上清液，运行2-4天后排出全部上清液，然后在水力停留时间为6-8h，静沉时间为2-4h的条件下，将低温生化培养箱的温度降到10℃运行8-10天，再降到8℃运行8-10天，最后降到4℃运行8-10天，然后分离、纯化菌株，即完成菌种的培养和驯化；二、耐冷菌的筛选：将步骤一得到的菌株分别按8-15％的接种量接种于LB培养液中，在温度为3-8℃、转速为100-120转/分的条件下培养1.5-3天，经过两次转接后再以8-15％接种量接种于生活污水所占体积比为8-15％的LB培养液中得到菌液，将得到的菌液以8-15％接种量接种于发酵罐中得到悬浮液，然后在温度为10-15℃、pH值为7.0-8.0、转速为120-130转/分、溶氧为1∶1的条件下活化培养，选择对数生长期悬浮液的OD585吸光值为1.4-1.6的菌株，然后在转速为4000-6000转/分的条件下离心15-25min，然后弃去上清液后，将离心后得到的沉淀物用磷酸缓冲液清洗两遍、生理食盐水清洗三遍后，再在转速为4000-6000转/分的条件下离心15-25min，然后弃去上清液，即完成耐冷菌的筛选；三、耐冷菌的固定：将步骤二筛选出的耐冷菌制成质量浓度为8-10％的耐冷菌悬浮液，将得到的耐冷菌悬浮液与质量浓度为8-10％、海藻酸钠含量为0.016g/L的聚乙烯醇水溶液在温度为20-25℃的条件下按照1∶1的体积比混合，然后将混合后的溶液与聚氨酯泡沫填料按照1∶3的体积比混合，然后静置1-2h得到包埋耐冷菌的聚氨酯泡沫载体，再将包埋耐冷菌的聚氨酯泡沫载体放入CaCl2含量为0.016g/L、pH值为6.7的饱和硼酸溶液中浸泡，然后在24h内每间隔7-9h搅拌一次，再用生理食盐水冲洗三次和自来水冲洗三次即得固定化耐冷菌；其中步骤一所述的模拟污水是由10L自来水、3.0-5.0g葡萄糖、0.2g KH2PO4、2.0g NH4Cl、6.0g NaHCO3、0.15g MgSO4、0.014gCaCl2·2H2O和3.0mL微量元素营养液组成，其中微量元素营养液由1L蒸馏水、1.54g FeCl3·6H2O、0.15gH3BO3、0.03g CuSO4·5H2O、0.18g KI、0.12gMnCl2·4H2O、0.06g Na2MoO4·2H2O、0.12g ZnSO4·7H2O、0.15g CoCl2·6H2O和10.0g EDTA组成。
本实施方式中的磷酸缓冲液是pH值为7.5、浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠或磷酸二氢钠溶液；经检测实施方式步骤一所述的混合污水的COD值为300-500mg/L，总磷值为2.1-6.7mg/L，氨氮值为40-60mg/L，pH为7.5-8.5。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中筛选出6株菌株，经检测这6株菌株分别隶属于动胶菌属、气单胞菌属、黄杆菌属、微球菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属。其它与具体实施方式一相同。
将本实施方式得到的固定化耐冷菌在复合生物反应器中进行试验，污水在复合生物反应器中先后经过活性污泥法处理和生物接触氧化法处理两个处理过程，其中活性污泥法处理的过程中污泥浓度为2.0-3.0g/L，溶解氧浓度为2.0～4.0mg/L，在污水经过生物接触氧化法处理的过程中将本实施方式得到的固定化耐冷菌投加到复合生物反应器中，固定化耐冷菌投加量为反应器有效体积的25-35％，溶解氧浓度为4.0～8.0mg/L，污水在复合生物反应器中的运行初期采用间歇培养方式，复合生物反应器水利停留时间为10h，溶解氧为3～4mg/L，在进水时按C∶N∶P为100∶5∶1的比例投加营养物质，每次换水之前停止曝气，混合液静沉2h后，排出1/3上清液，形成循环。如此运行10天后，至水中聚乙烯醇溶出较少时系统开始正式运行。当复合生物反应器稳定运行时，系统水力停留时间(HRT)为9-11h，污泥负荷为0.25～0.30kg/(kg·d)，当水温为4-25℃时，系统出水达到污水一级B排放标准。
将本实施方式得到的固定化耐冷菌与中温菌进行COD去除率的对比试验，固定化耐冷菌与中温菌分别在中温条件(25℃)和低温条件(4℃)下对COD去除率的对比曲线如图1，由试验结果得出低温环境下(4℃)固定化耐冷菌对COD的去除率比中温菌高出63.67％，而在中温环境条件下(25℃)，中温菌对COD的去除率仅比固定化耐冷菌高出9.55％，这充分证明了固定化耐冷菌在中、低温条件下都具有较高的活性和COD去除率，而中温菌在低温条件下的活性及COD去除能力几乎不存在。同时固定化耐冷菌在中温环境下COD去除率比其在低温环境条件下高出6.02％。
将本实施方式得到的固定化耐冷菌进行COD去除率的试验，向污水中投加本实施方式得到的固定化耐冷菌，投加量为反应器有效体积的25-35％，然后从1月份开始在温度为4-10℃的条件下对污水进行处理，处理时间为12个月，由图2(固定化耐冷菌对COD去除率的效果图)可知，在运行初期即使温度较低亦有较好的去除效果。反应器连续运行，在夏季系统水温为20-25℃，这个温度使得微生物达到最佳的生长温度，微生物活性较高，此时处理污水的效果较好，本实施方式得到的固定化耐冷菌也达到了最佳生长温度，随后进入低温期即4-10℃，系统由低温到中温再到低温，此种变化对系统有一定的冲击，对系统的稳定运行影响较大，但是从图2中可以看出，即使这样系统依然保持了较高的去除有机物的能力，这说明采用固定化方法可以保持耐冷菌的活性，减少耐冷菌的流失，克服了温度变化对耐冷菌的不利影响，保证了系统稳定运行，使得污水出水COD在一年四季都能够达到污水一级B排放标准，水处理系统连续运行了12个月，进水的COD为144.48～586.28mg/L，出水的COD为20.635～58.875mg/L，平均值为49.40mg/L，冬季COD平均去除率为85.79％，全年COD去除率平均值为86.66％，可见本实施方式得到的固定化耐冷菌在冬季的COD平均去除率较高，没有因为在冬季温度较低而使固定化耐冷菌失去活性。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的污泥浓度为2.1-2.9g/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的污泥浓度为2.5g/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的污泥的溶解氧为2.1-3.9mg/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的污泥的溶解氧为3mg/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中闷曝时间为9h。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述混合污水由生活污水与模拟污水按1∶1.5-2.5的体积比组成。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述混合污水由生活污水与模拟污水按1∶2的体积比组成。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的混合污水的COD值为350-450mg/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的混合污水的COD值为400mg/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的混合污水的总磷值为2.5-6.0mg/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的混合污水的总磷值为3-5mg/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的混合污水的总磷值为2.5mg/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的混合污水的氨氮值为45-55mg/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的混合污水的氨氮值为50mg/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的混合污水的pH为7.8-8.3。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的混合污水的pH为8。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中耐冷菌悬浮液的质量浓度为8.5-9.5％。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中耐冷菌悬浮液的质量浓度为9％。其它与具体实施方式一相同。

Claims (10)

1、一种固定化耐冷菌的制备方法，其特征在于固定化耐冷菌的制备方法如下：一、菌种的培养和驯化：将冬季污水处理系统的曝气池中的污泥放入温度为15℃的低温生化培养箱中，通入由生活污水与模拟污水按1∶1-3的体积比组成的混合污水，然后在污泥的浓度为2.0-3.0g/L、溶解氧为2-4mg/L的条件下对污泥进行闷曝8-10h，再静沉2-4h，然后每天换水1次再排出1/3上清液，运行2-4天后排出全部上清液，然后在水力停留时间为6-8h，静沉时间为2-4h的条件下，将低温生化培养箱的温度降到10℃运行8-10天，再降到8℃运行8-10天，最后降到4℃运行8-10天，然后分离、纯化菌株，即完成菌种的培养和驯化；二、耐冷菌的筛选：将步骤一得到的菌株分别按8-15％的接种量接种于LB培养液中，在温度为3-8℃、转速为100-120转/分的条件下培养1.5-3天，经过两次转接后再以8-15％接种量接种于生活污水所占体积比为8-15％的LB培养液中得到菌液，将得到的菌液以8-15％接种量接种于发酵罐中得到悬浮液，然后在温度为10-15℃、pH值为7.0-8.0、转速为120-130转/分、溶氧为1∶1的条件下活化培养，选择对数生长期悬浮液的OD585吸光值为1.4-1.6的菌株，然后在转速为4000-6000转/分的条件下离心15-25min，然后弃去上清液后，将离心后得到的沉淀物用磷酸缓冲液清洗两遍、生理食盐水清洗三遍后，再在转速为4000-6000转/分的条件下离心15-25min，然后弃去上清液，即完成耐冷菌的筛选；三、耐冷菌的固定：将步骤二筛选出的耐冷菌制成质量浓度为8-10％的耐冷菌悬浮液，将得到的耐冷菌悬浮液与质量浓度为8-10％、海藻酸钠含量为0.016g/L的聚乙烯醇水溶液在温度为20-25℃的条件下按照1∶1的体积比混合，然后将混合后的溶液与聚氨酯泡沫填料按照1∶3的体积比混合，然后静置1-2h得到包埋耐冷菌的聚氨酯泡沫载体，再将包埋耐冷菌的聚氨酯泡沫载体放入CaCl2含量为0.016g/L、pH值为6.7的饱和硼酸溶液中浸泡，然后在24h内每间隔7-9h搅拌一次，再用生理食盐水冲洗三次和自来水冲洗三次即得固定化耐冷菌；其中步骤一所述的模拟污水是由10L自来水、3.0-5.0g葡萄糖、0.2g KH2PO4、2.0g NH4Cl、6.0g NaHCO3、0.15gMgSO4、0.014g CaCl2·2H2O和3.0mL微量元素营养液组成，其中微量元素营养液由1L蒸馏水、1.54g FeCl3·6H2O、0.15gH3BO3、0.03g CuSO4·5H2O、0.18gKI、0.12gMnCl2·4H2O、0.06g Na2MoO4·2H2O、0.12g ZnSO4·7H2O、0.15gCoCl2·6H2O和10.0g EDTA组成。
2、根据权利要求1所述的固定化耐冷菌的制备方法，其特征在于步骤一所述的污泥浓度为2.1-2.9g/L。
3、根据权利要求1所述的固定化耐冷菌的制备方法，其特征在于步骤一所述的污泥浓度为2.5g/L。
4、根据权利要求1所述的固定化耐冷菌的制备方法，其特征在于步骤一所述的污泥的溶解氧为2.1-3.9mg/L。
5、根据权利要求1所述的固定化耐冷菌的制备方法，其特征在于步骤一所述的污泥的溶解氧为3mg/L。
6、根据权利要求1所述的固定化耐冷菌的制备方法，其特征在于步骤一中闷曝时间为9h。
7、根据权利要求1所述的固定化耐冷菌的制备方法，其特征在于步骤一所述混合污水由生活污水与模拟污水按1∶1.5-2.5的体积比组成。
8、根据权利要求1所述的固定化耐冷菌的制备方法，其特征在于步骤一所述混合污水由生活污水与模拟污水按1∶2的体积比组成。
9、根据权利要求1所述的固定化耐冷菌的制备方法，其特征在于步骤三中耐冷菌悬浮液的质量浓度为8.5-9.5％。
10、根据权利要求1所述的固定化耐冷菌的制备方法，其特征在于步骤三中耐冷菌悬浮液的质量浓度为9％。
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