CN115491312B - 一种好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法及应用 - Google Patents

一种好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种好氧反硝化菌‑小球藻菌藻生物膜的制备方法及应用，包括生物膜载体的制备以及生物膜的制备2个步骤，本发明通过好氧反硝化菌和小球藻耦合成藻菌共生体系，综合利用好氧反硝化菌和小球藻间的协同关系，进而实现污水中氮和抗生素的高效去除，在含抗生素的高氮源污染废水，如养殖废水、含有制药废水或医院废水的市政生活污水和工业废水的处理等污水处理领域具有很好的开拓和应用前景，本发明中的藻菌生物膜构建方法简单、污染物去除效率高，对总氮和四环素类抗生素的去除率可达94.75％和97.83％。

Description

一种好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物膜制备技术领域，具体涉及一种好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法及应用。
背景技术
含氮物质的大量排放是导致水环境持续恶化的原因之一，目前氮素污染物的日益积累已经严重破坏了生态平衡，并进一步威胁到人类的健康安全。与此同时，抗生素在许多地区的广泛使用甚至滥用，抗生素污染问题给人类疾病防治及生态系统平衡都带来了严重的挑战。
传统生物脱氮过程由于不同阶段中起主导作用的微生物对氧和碳源等的需求不同，使得整个过程相对来说比较繁琐，并且好氧阶段和厌氧阶段必须要严格划分为两个单独的系统独立进行，另外，由于自养过程中硝化细菌生长缓慢、周期长、对无机物的需求与反硝化细菌截然不同，这就导致传统生物脱氮占地要求较大、过程复杂，同时也会额外增加成本。
好氧反硝化过程可以直接在有氧存在的条件下，通过异养反硝化菌将NO3 --N还原成气态氮产物。在有氧的条件下，使得这硝化反硝化在同一反应器中同时发生。并且，在此系统中，反硝化过程中产生的碱可以弥补硝化过程中消耗的碱，从而通过减少额外补充化学物质的量来进一步达到节约成本的效果该法在氮素污染去除方面表现出巨大的潜力。
藻菌共生体系可利用菌藻间的关系实现污染物的高效去除，在污水处理领域具有广阔的应用前景，其作用机理是微藻通过光合作用向水体提供O2，提高水中溶解氧含量，使细菌去除污染物能力增强；同时，细菌的代谢产物或呼吸产物(如CO2)可为藻类的光合作用提供原料。
生物膜的制备通常是在菌类、藻类或菌与藻之间的相互作用下产生的，不同的菌类和藻类的作用关系不同，因此所制备的生物膜对水中污染物的处理能力也有所差异，本发明的目的在于提供一种对含氮和抗生素废水具有高效去除率的菌藻组合生物膜。此外，载体对生物膜的污水处理能力也有一定的影响，常见的载体材料制备生物膜时往往效率不高，在使用过程中容易出现老化脱模的现象，影响对污水的处理效果。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法及应用，利用好氧反硝化菌耦合小球藻实现同步脱氮和去除水中抗生素。
为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)生物膜载体的制备：将多孔谷壳、聚乳酸和卵磷脂混合均匀后干燥制粒，然后将颗粒浸入到聚乙烯醇溶液与好氧反硝化菌菌液的混合液中，搅拌均匀后，取出晾干，即得到生物膜载体；
(2)好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备：将步骤(1)所得到的生物膜载体固定在污水反应器中，加入小球藻藻液，进行生物膜培养，待生物膜载体表面布满菌藻，即得到生物膜。
优选的，步骤(1)中，所述好氧反硝化菌为不动杆菌(Acinetobacter sp.)AD-5，其保藏编号为CCTCC M 20211654。
优选的，所述多孔谷壳的制备方法包括如下步骤：
(a1)谷壳的预处理：将谷壳进行干燥、粉碎过筛后加入到1-2mol/L的碱溶液中，在30-60℃下超声处理30-60min，待超声处理完毕后，洗涤，烘干，即得到谷壳纤维；
(a2)多孔谷壳的制备：将谷壳纤维加入到质量浓度为25-35％的酸溶液中，在40-70℃下进行超声处理40-80min，待超声处理完毕后，经离心、洗涤、冷冻干燥，即得到多孔谷壳；
优选的，所述好氧反硝化菌菌液的制备方法如下：
(b1)好氧反硝化菌的筛选驯化：从湖泊或污水厂采集污泥样本，于含有好氧反硝化细菌富集培养基的无菌锥形瓶中在30℃、100-200r/min的条件下培养3-5天，取少量菌液于新鲜驯化培养基中继续培养，重复3-5次，挑选脱氮效果好的菌液于驯化培养基上划线培养，反复多次挑选出适合的单菌即为好氧反硝化菌，将所得的好氧反硝化细菌接种到LB培养基中，在30℃、100-200r/min的条件下培养3-5天，最终可得到特定纯种的好氧反硝化菌；
(b2)好氧反硝化菌的扩大培养：将好氧反硝化菌以占培养液体积比5％-10％接种到灭菌后的同步硝化反硝化培养基中，在30℃、100-200r/min的条件下培养3-5天，得到好氧反硝化菌菌液。
优选的，步骤(1)中，多孔谷壳、聚乳酸和卵磷脂的质量比为80-120:5-10:2-6。
优选的，步骤(1)中，将聚乙烯醇与水混合后加热溶解，得到聚乙烯醇溶液，冷却后再与好氧活性污泥浓缩液混合。
优选的，步骤(1)中，好氧反硝化菌菌液浓度为1×107-1×109cfu/mL。
优选的，步骤(2)中，污水反应器中污水水质指标为：pH为7.0-9.0，COD为100-300mg/L，TN为5-40mg/L，TP为1-5mg/L，抗生素为0.1-5mg/L，其中所述抗生素为四环素、氧四环素、氧氟沙星、环丙沙星中的一种或多种。
优选的，步骤(2)中，小球藻的接种密度为1×105-1×107cells/mL。
优选的，步骤(2)中，生物膜培养条件为：光照强度为2500-3000Lux，光暗比为12h：12h，温度为23-27℃，溶氧量为3-5mg/L，污水日更新率为20％，培养时间为6-8天。
本发明提供一种由上述制备方法得到的好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜。
本发明还提供好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜在污水处理中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过好氧反硝化菌和小球藻耦合成藻菌共生体系，小球藻通过光合作用向水体提供O2，提高水中溶解氧含量，使细菌去除污染物能力增强，小球藻也能对抗生素起到吸附和生物降解作用，降低抗生素对细菌的毒害；同时，细菌的代谢产物(如CO2)可为藻类的光合作用提供原料，充分利用好氧反硝化菌和小球藻间的协同关系，进而实现污水中氮和抗生素的高效去除，在含抗生素的高氮源污染废水，如养殖废水、含有制药废水或医院废水的市政生活污水和工业废水的处理等污水处理领域具有很好的开拓和应用前景，本发明中的藻菌生物膜构建方法简单、污染物去除效率高，对总氮和四环素类抗生素的去除率可达94.75％和97.83％。
(2)本发明通过对谷壳进行多孔化改性，增加了谷壳的孔隙率和比表面积，使谷壳能够负载更多的微生物，同时也提高了谷壳与微生物之间的粘附能力，进而提高了生物膜的挂膜率以及降低了生物膜的脱模率。
具体实施方式
以下通过具体较佳实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。
需要说明的是，无特殊说明外，本发明中涉及到的化学试剂均通过商业渠道购买。
本发明中所使用的小球藻由中国科学院水生生物研究所提供，编号为FACHB-8；
本发明中的好氧反硝化菌株不动杆菌AD-5从湖泊污泥中分离筛选得到，其分类命名为：不动杆菌(Acinetobacter sp.)AD-5，其为新种，于2021年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏编号为：CCTCC M 20211654。
实施例1
一种好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)多孔谷壳的制备：
将100g谷壳进行干燥、粉碎过筛后，加入到500mL，1mol/L的氢氧化钠溶液中，在40℃下超声处理40min，待超声处理完毕后，洗涤，烘干，即得到谷壳纤维；
将100g谷壳纤维加入到质量浓度为500mL，30％的硫酸溶液中，在50℃下进行超声处理60min，待超声处理完毕后，经离心、洗涤、冷冻干燥，即得到多孔谷壳；
(2)好氧反硝化菌菌液制备：
从湖泊采集污泥样本，于含有好氧反硝化细菌富集培养基的无菌锥形瓶中在30℃、150r/min的条件下培养4天，取少量菌液于新鲜驯化培养基中继续培养，重复4次，挑选脱氮效果好的菌液于驯化培养基上划线培养，反复多次挑选出适合的单菌即为好氧反硝化菌，将所得的好氧反硝化细菌接种到LB培养基中，在30℃、150r/min的条件下培养4天，最终可得到特定纯种的好氧反硝化菌，富集培养基配方为：蛋白胨5g，酵母浸出液5g，NaCl 10g，蒸馏水1L；驯化培养基配方为：CH3COONa 2.93g，KNO3 0.722g，KH2PO4 0.088g，MgSO4·7H2O0.2g，微量元素2mL，蒸馏水1L；微量元素配方为：EDTA 15g，ZnSO4 0.2g，MnCl2·4H2O 1.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，CuSO4·5H2O 0.5g，CoCl2·6H2O 0.3g，Na2MoO4·2H2O 0.2g，CaCl20.1g，蒸馏水1L，LB培养基配方为：蛋白胨10g，酵母浸出液5g，NaCl 5g，蒸馏水1L；
将好氧反硝化菌以占培养液体积比8％接种到灭好菌的同步硝化反硝化培养基中，30℃、150r/min的条件下培养4天，得到好氧反硝化培养液，所述同步硝化反硝化培养基配方为：CH3COONa 0.937g，NH4Cl 0.0765g，KNO3 0.144g，KH2PO4 0.0351g，MgSO4·7H2O0.2g，微量元素2mL，蒸馏水1L；
(3)好氧反硝化菌生物膜载体的制备：将100g多孔谷壳、5g聚乳酸和2g卵磷脂混合均匀后干燥制粒，然后将颗粒浸入到300mL，8wt％的聚乙烯醇溶液与300mL好氧反硝化菌液(悬浮物浓度为1×108cfu/mL)的混合液中，搅拌均匀后，取出晾干，即得到生物膜载体；
(4)好氧反硝化菌-小球藻生物膜的制备：将生物膜载体固定在污水反应器中，加入小球藻藻液，小球藻的接种密度为8×105cells/mL，污水反应器中污水水质指标为：pH为7.8，COD为200mg/L，TN为25mg/L，TP为5mg/L，四环素为2mg/L，进行生物膜培养，生物膜培养条件为：光照强度为2500Lux，光暗比为12h：12h，温度为25℃，溶氧量为4mg/L，污水日更新率为20％，培养时间为7天，待生物膜载体表面布满菌藻，即得到菌藻生物膜。
实施例2
一种好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)多孔谷壳的制备：
将100g谷壳进行干燥、粉碎过筛后，加入到500mL，2mol/L的氢氧化钠溶液中，在50℃下超声处理30min，待超声处理完毕后，洗涤，烘干，即得到谷壳纤维；
将100g谷壳纤维加入到质量浓度为500mL，35％的硫酸溶液中，在60℃下进行超声处理60min，待超声处理完毕后，经离心、洗涤、冷冻干燥，即得到多孔谷壳；
(2)好氧反硝化菌菌液制备：
从湖泊采集污泥样本，于含有好氧反硝化细菌富集培养基的无菌锥形瓶中在30℃、150r/min的条件下培养4天，取少量菌液于新鲜驯化培养基中继续培养，重复4次，挑选脱氮效果好的菌液于驯化培养基上划线培养，反复多次挑选出适合的单菌即为好氧反硝化菌，将所得的好氧反硝化细菌接种到LB培养基中，在30℃、150r/min的条件下培养4天，最终可得到特定纯种的好氧反硝化菌，富集培养基配方为：蛋白胨5g，酵母浸出液5g，NaCl 10g，蒸馏水1L；驯化培养基配方为：CH3COONa 2.93g，KNO3 0.722g，KH2PO4 0.088g，MgSO4·7H2O0.2g，微量元素2mL，蒸馏水1L；微量元素配方为：EDTA 15g，ZnSO4 0.2g，MnCl2·4H2O 1.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，CuSO4·5H2O 0.5g，CoCl2·6H2O 0.3g，Na2MoO4·2H2O 0.2g，CaCl20.1g，蒸馏水1L，LB培养基配方为：蛋白胨10g，酵母浸出液5g，NaCl 5g，蒸馏水1L；
将好氧反硝化菌以占培养液体积比8％接种到灭好菌的同步硝化反硝化培养基中，30℃、150r/min的条件下培养4天，得到好氧反硝化培养液，所述同步硝化反硝化培养基配方为：CH3COONa 0.937g，NH4Cl 0.0765g，KNO3 0.144g，KH2PO4 0.0351g，MgSO4·7H2O0.2g，微量元素2mL，蒸馏水1L；
(3)好氧反硝化菌生物膜载体的制备：将100g多孔谷壳、8g聚乳酸和4g卵磷脂混合均匀后干燥制粒，然后将颗粒浸入到300mL，10wt％的聚乙烯醇溶液与300mL好氧反硝化菌液(悬浮物浓度为1×108cfu/mL)的混合液中，搅拌均匀后，取出晾干，即得到生物膜载体；
(4)好氧反硝化菌-小球藻生物膜的制备：将生物膜载体固定在污水反应器中，加入小球藻藻液，小球藻的接种密度为6×105cells/mL，污水反应器中污水水质指标为：pH为7.8，COD为200mg/L，TN为25mg/L，TP为5mg/L，四环素为2mg/L，进行生物膜培养，生物膜培养条件为：光照强度为2500Lux，光暗比为12h：12h，温度为25℃，溶氧量为4mg/L，污水日更新率为20％，培养时间为7天，待生物膜载体表面布满菌藻，即得到菌藻生物膜。
实施例3
一种好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)多孔谷壳的制备：
将100g谷壳进行干燥、粉碎过筛后，加入到500mL，1mol/L的氢氧化钠溶液中，在60℃下超声处理50min，待超声处理完毕后，洗涤，烘干，即得到谷壳纤维；
将100g谷壳纤维加入到质量浓度为500mL，25％的硫酸溶液中，在50℃下进行超声处理60min，待超声处理完毕后，经离心、洗涤、冷冻干燥，即得到多孔谷壳；
(2)好氧反硝化菌菌液制备：
从湖泊采集污泥样本，于含有好氧反硝化细菌富集培养基的无菌锥形瓶中在30℃、150r/min的条件下培养4天，取少量菌液于新鲜驯化培养基中继续培养，重复4次，挑选脱氮效果好的菌液于驯化培养基上划线培养，反复多次挑选出适合的单菌即为好氧反硝化菌，将所得的好氧反硝化细菌接种到LB培养基中，在30℃、150r/min的条件下培养4天，最终可得到特定纯种的好氧反硝化菌，富集培养基配方为：蛋白胨5g，酵母浸出液5g，NaCl 10g，蒸馏水1L；驯化培养基配方为：CH3COONa 2.93g，KNO3 0.722g，KH2PO4 0.088g，MgSO4·7H2O0.2g，微量元素2mL，蒸馏水1L；微量元素配方为：EDTA 15g，ZnSO4 0.2g，MnCl2·4H2O 1.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，CuSO4·5H2O 0.5g，CoCl2·6H2O 0.3g，Na2MoO4·2H2O 0.2g，CaCl20.1g，蒸馏水1L，LB培养基配方为：蛋白胨10g，酵母浸出液5g，NaCl 5g，蒸馏水1L；
将好氧反硝化菌以占培养液体积比8％接种到灭好菌的同步硝化反硝化培养基中，30℃、150r/min的条件下培养4天，得到好氧反硝化培养液，所述同步硝化反硝化培养基配方为：CH3COONa 0.937g，NH4Cl 0.0765g，KNO3 0.144g，KH2PO4 0.0351g，MgSO4·7H2O0.2g，微量元素2mL，蒸馏水1L；
(3)好氧反硝化菌生物膜载体的制备：将100g多孔谷壳、10g聚乳酸和3g卵磷脂混合均匀后干燥制粒，然后将颗粒浸入到300mL，10wt％的聚乙烯醇溶液与300mL好氧反硝化菌液(悬浮物浓度为1×108cfu/mL)的混合液中，搅拌均匀后，取出晾干，即得到生物膜载体；
(4)好氧反硝化菌-小球藻生物膜的制备：将生物膜载体固定在污水反应器中，加入小球藻藻液，小球藻的接种密度为6×105cells/mL，污水反应器中污水水质指标为：pH为7.8，COD为200mg/L，TN为25mg/L，TP为5mg/L，四环素为2mg/L，进行生物膜培养，生物膜培养条件为：光照强度为2800Lux，光暗比为12h：12h，温度为27℃，溶氧量为5mg/L，污水日更新率为20％，培养时间为7天，待生物膜载体表面布满菌藻，即得到菌藻生物膜。
实施例4
一种好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)多孔谷壳的制备：
将100g谷壳进行干燥、粉碎过筛后，加入到500mL，2mol/L的氢氧化钠溶液中，在60℃下超声处理60min，待超声处理完毕后，洗涤，烘干，即得到谷壳纤维；
将100g谷壳纤维加入到质量浓度为500mL，35％的硫酸溶液中，在70℃下进行超声处理80min，待超声处理完毕后，经离心、洗涤、冷冻干燥，即得到多孔谷壳；
(2)好氧反硝化菌菌液制备：
从湖泊采集污泥样本，于含有好氧反硝化细菌富集培养基的无菌锥形瓶中在30℃、150r/min的条件下培养4天，取少量菌液于新鲜驯化培养基中继续培养，重复4次，挑选脱氮效果好的菌液于驯化培养基上划线培养，反复多次挑选出适合的单菌即为好氧反硝化菌，将所得的好氧反硝化细菌接种到LB培养基中，在30℃、150r/min的条件下培养4天，最终可得到特定纯种的好氧反硝化菌，富集培养基配方为：蛋白胨5g，酵母浸出液5g，NaCl 10g，蒸馏水1L；驯化培养基配方为：CH3COONa 2.93g，KNO3 0.722g，KH2PO4 0.088g，MgSO4·7H2O0.2g，微量元素2mL，蒸馏水1L；微量元素配方为：EDTA 15g，ZnSO4 0.2g，MnCl2·4H2O 1.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，CuSO4·5H2O 0.5g，CoCl2·6H2O 0.3g，Na2MoO4·2H2O 0.2g，CaCl20.1g，蒸馏水1L，LB培养基配方为：蛋白胨10g，酵母浸出液5g，NaCl 5g，蒸馏水1L；
将好氧反硝化菌以占培养液体积比8％接种到灭好菌的同步硝化反硝化培养基中，30℃、150r/min的条件下培养4天，得到好氧反硝化培养液，所述同步硝化反硝化培养基配方为：CH3COONa 0.937g，NH4Cl 0.0765g，KNO3 0.144g，KH2PO4 0.0351g，MgSO4·7H2O0.2g，微量元素2mL，蒸馏水1L；
(3)好氧反硝化菌生物膜载体的制备：将100g多孔谷壳、6g聚乳酸和4g卵磷脂混合均匀后干燥制粒，然后将颗粒浸入到300mL，10wt％的聚乙烯醇溶液与300mL好氧反硝化菌液(悬浮物浓度为1×108cfu/mL)的混合液中，搅拌均匀后，取出晾干，即得到生物膜载体；
(4)好氧反硝化菌-小球藻生物膜的制备：将生物膜载体固定在污水反应器中，加入小球藻藻液，小球藻的接种密度为6×105cells/mL，污水反应器中污水水质指标为：pH为7.8，COD为200mg/L，TN为25mg/L，TP为5mg/L，四环素为2mg/L，进行生物膜培养，生物膜培养条件为：光照强度为3000Lux，光暗比为12h：12h，温度为27℃，溶氧量为3mg/L，污水日更新率为20％，培养时间为7天，待生物膜载体表面布满菌藻，即得到菌藻生物膜。
对比例1
一种好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)好氧反硝化菌菌液制备：
从湖泊采集污泥样本，于含有好氧反硝化细菌富集培养基的无菌锥形瓶中在30℃、150r/min的条件下培养4天，取少量菌液于新鲜驯化培养基中继续培养，重复4次，挑选脱氮效果好的菌液于驯化培养基上划线培养，反复多次挑选出适合的单菌即为好氧反硝化菌，将所得的好氧反硝化细菌接种到LB培养基中，在30℃、150r/min的条件下培养4天，最终可得到特定纯种的好氧反硝化菌。富集培养基配方为：蛋白胨5g，酵母浸出液5g，NaCl 10g，蒸馏水1L，驯化培养基配方为：CH3COONa 2.93g，KNO3 0.722g，KH2PO4 0.088g，MgSO4·7H2O0.2g，微量元素2mL，蒸馏水1L；微量元素配方为：EDTA 15g，ZnSO4 0.2g，MnCl2·4H2O 1.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，CuSO4·5H2O 0.5g，CoCl2·6H2O 0.3g，Na2MoO4·2H2O 0.2g，CaCl20.1g，蒸馏水1L，LB培养基配方为：蛋白胨10g，酵母浸出液5g，NaCl 5g，蒸馏水1L；
将好氧反硝化菌以占培养液体积比8％接种到灭好菌的同步硝化反硝化培养基中，30℃、150r/min的条件下培养4天，得到好氧反硝化培养液，所述同步硝化反硝化培养基配方为：CH3COONa 0.937g，NH4Cl 0.0765g，KNO3 0.144g，KH2PO4 0.0351g，MgSO4·7H2O0.2g，微量元素2mL，蒸馏水1L；
(2)好氧反硝化菌生物膜载体的制备：将100g谷壳、8g聚乳酸和4g卵磷脂混合均匀后干燥制粒，然后将颗粒浸入到300mL，10wt％的聚乙烯醇溶液与300mL好氧反硝化菌液(悬浮物浓度为1×108cfu/mL)的混合液中，搅拌均匀后，取出晾干，即得到生物膜载体；
(3)好氧反硝化菌-小球藻生物膜的制备：将生物膜载体固定在污水反应器中，加入小球藻藻液，小球藻的接种密度为6×105cells/mL，污水反应器中污水水质指标为：pH为7.8，COD为200mg/L，TN为25mg/L，TP为5mg/L，四环素为2mg/L，进行生物膜培养，生物膜培养条件为：光照强度为2500Lux，光暗比为12h：12h，温度为25℃，溶氧量为4mg/L，污水日更新率为20％，培养时间为7天，待生物膜载体表面布满菌藻，即得到菌藻生物膜。
对比例2
一种小球藻生物膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)生物膜载体的制备：将100g谷壳进行干燥、粉碎过筛后，加入到500mL，2mol/L的氢氧化钠溶液中，在50℃下超声处理30min，待超声处理完毕后，洗涤，烘干，即得到谷壳纤维；
将100g谷壳纤维加入到质量浓度为500mL，35％的硫酸溶液中，在60℃下进行超声处理60min，待超声处理完毕后，经离心、洗涤、冷冻干燥，即得到生物膜载体；
(2)小球藻生物膜的制备：将生物膜载体固定在污水反应器中，加入小球藻藻液，小球藻的接种密度为6×105cells/mL，污水反应器中污水水质指标为：pH为7.8，COD为200mg/L，TN为25mg/L，TP为5mg/L，四环素为2mg/L，进行生物膜培养，生物膜培养条件为：光照强度为2500Lux，光暗比为12h：12h，温度为25℃，溶氧量为4mg/L，污水日更新率为20％，培养时间为7天，待生物膜载体表面布满菌藻，即得到小球藻生物膜。
对比例3
一种好氧反硝化菌生物膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)多孔谷壳的制备：
将100g谷壳进行干燥、粉碎过筛后，加入到500mL，1mol/L的氢氧化钠溶液中，在60℃下超声处理50min，待超声处理完毕后，洗涤，烘干，即得到谷壳纤维；
将100g谷壳纤维加入到质量浓度为500mL，25％的硫酸溶液中，在50℃下进行超声处理60min，待超声处理完毕后，经离心、洗涤、冷冻干燥，即得到多孔谷壳；
(2)好氧反硝化菌菌液制备：
从湖泊采集污泥样本，于含有好氧反硝化细菌富集培养基的无菌锥形瓶中在30℃、150r/min的条件下培养4天，取少量菌液于新鲜驯化培养基中继续培养，重复4次，挑选脱氮效果好的菌液于驯化培养基上划线培养，反复多次挑选出适合的单菌即为好氧反硝化菌，将所得的好氧反硝化细菌接种到LB培养基中，在30℃、150r/min的条件下培养4天，最终可得到特定纯种的好氧反硝化菌；富集培养基配方为：蛋白胨5g，酵母浸出液5g，NaCl 10g，蒸馏水1L；驯化培养基配方为：CH3COONa 2.93g，KNO3 0.722g，KH2PO4 0.088g，MgSO4·7H2O0.2g，微量元素2mL，蒸馏水1L；微量元素配方为：EDTA 15g，ZnSO4 0.2g，MnCl2·4H2O 1.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，CuSO4·5H2O 0.5g，CoCl2·6H2O 0.3g，Na2MoO4·2H2O 0.2g，CaCl20.1g，蒸馏水1L，LB培养基配方为：蛋白胨10g，酵母浸出液5g，NaCl 5g，蒸馏水1L；
将好氧反硝化菌以占培养液体积比8％接种到灭好菌的同步硝化反硝化培养基中，30℃、150r/min的条件下培养4天，得到好氧反硝化培养液，所述同步硝化反硝化培养基配方为：CH3COONa 0.937g，NH4Cl 0.0765g，KNO3 0.144g，KH2PO4 0.0351g，MgSO4·7H2O0.2g，微量元素2mL，蒸馏水1L；
(3)好氧反硝化菌生物膜载体的制备：将100g多孔谷壳、10g聚乳酸和3g卵磷脂混合均匀后干燥制粒，然后将颗粒浸入到300mL，10wt％的聚乙烯醇溶液与300mL好氧反硝化菌液(悬浮物浓度为1×108cfu/mL)的混合液中，搅拌均匀后，取出晾干，即得到生物膜载体；
(4)好氧反硝化菌生物膜的应用：将生物膜载体固定在污水反应器中，污水反应器中污水水质指标为：pH为7.8，COD为200mg/L，TN为25mg/L，TP为5mg/L，四环素为2mg/L，进行生物膜培养，生物膜培养条件为：光照强度为2500Lux，光暗比为12h：12h，温度为25℃，溶氧量为4mg/L，污水日更新率为20％，培养时间为7天，待生物膜载体表面布满菌藻，即得到好氧反硝化菌生物膜。
将实施例1-4和对比例1-3所制备的菌藻生物膜进行挂膜率的测试，测试方法如下：记录载体的原重，然后将挂膜后的生物膜载体烘干，称重，记录载体与生物膜质量之和，计算公式如下：
挂膜率(％)＝(挂膜后载体与生物膜质量之和-载体原重)/载体原重×100％结果如下表所示：
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 对比例1 对比例2 对比例3
挂膜率(％) 246.3 273.5 251.6 264.7 147.8 225.4 113.5
将实施例1-4和对比例1-3所制备的菌藻生物膜置于污水反应器内进行污水处理，待处理污水为实验室模拟的污水，其中COD为200mg/L，TN为25mg/L，TP为5mg/L，四环素为2mg/L，待处理污水连续循环进出水，运行一周后检测出水水质，计算去除率，实验结果如下表所示：
Figure BDA0003907909120000141
本发明通过好氧反硝化菌和小球藻耦合成藻菌共生体系，综合利用好氧反硝化菌和小球藻间的协同关系，进而实现污水中氮和抗生素的高效去除。
最后需要说明的是：以上实施例不以任何形式限制本发明。对本领域技术人员来说，在本发明基础上，可以对其作一些修改和改进。因此，凡在不偏离本发明精神的基础上所做的任何修改或改进，均属于本发明要求保护的范围之内。

Claims (6)

1.一种好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
（1）生物膜载体的制备：将多孔谷壳、聚乳酸和卵磷脂混合均匀后干燥制粒，然后将颗粒浸入到聚乙烯醇溶液与好氧反硝化菌菌液的混合液中，搅拌均匀后，取出晾干，即得到生物膜载体；
（2）好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备：将步骤（1）所得到的生物膜载体固定在污水反应器中，加入小球藻藻液，进行生物膜培养，待生物膜载体表面布满菌藻，即得到生物膜；
其中，步骤（1）中，所述多孔谷壳的制备方法包括如下步骤：
（a1）谷壳的预处理：将谷壳进行干燥、粉碎过筛后加入到1-2mol/L的碱溶液中，在30-60℃下超声处理30-60min，待超声处理完毕后，洗涤，烘干，即得到谷壳纤维；
（a2）多孔谷壳的制备：将谷壳纤维加入到质量浓度为25-35%的酸溶液中，在40-70℃下进行超声处理40-80min，待超声处理完毕后，经离心、洗涤、冷冻干燥，即得到多孔谷壳。
2.根据权利要求1所述的好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述好氧反硝化菌菌液的制备方法如下：
（b1）好氧反硝化菌的筛选驯化：从湖泊或污水厂采集污泥样本，于含有好氧反硝化细菌富集培养基的无菌锥形瓶中在30℃、100-200r/min的条件下培养3-5天，取少量菌液于新鲜驯化培养基中继续培养，重复3-5次，挑选脱氮效果好的菌液于驯化培养基上划线培养，反复多次挑选出适合的单菌即为好氧反硝化菌，将所得的好氧反硝化细菌接种到LB培养基中，在30℃、100-200 r/min的条件下培养3-5天，最终得到好氧反硝化菌；
（b2）好氧反硝化菌的扩大培养：将好氧反硝化菌以占培养液体积比5%-10%接种到灭菌后的同步硝化反硝化培养基中，在30℃、100-200 r/min的条件下培养3-5天，得到好氧反硝化菌菌液。
3.根据权利要求1所述的好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，多孔谷壳、聚乳酸和卵磷脂的质量比为80-120:5-10:2-6。
4.根据权利要求1所述的好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，好氧反硝化菌菌液浓度为1×107-1×109cfu/mL。
5.根据权利要求1所述的好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，污水反应器中污水水质指标为：pH为7.0-9.0，COD为100-300 mg/L，TN为5-40mg/L，TP为1-5 mg/L，抗生素为0.1-5 mg/L，其中所述抗生素为四环素、氧四环素、氧氟沙星、环丙沙星中的一种或多种，
小球藻的接种密度为1×105-1×107cells/mL。
6.根据权利要求1所述的好氧反硝化菌-小球藻菌藻生物膜的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，生物膜培养条件为：光照强度为2500-3000 Lux，光暗比为12h：12h，温度为23-27℃，溶氧量为3-5mg/L，污水日更新率为20%，培养时间为6-8天。
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