CN108611292A - 耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球及制备方法及应用。首先筛选出高效氨氧化细菌，然后对氨氧化细菌进行耐冷性驯化得到耐冷氨氧化细菌，其次制得生物炭球并将制的数个生物炭球置于耐冷氨氧化细菌富集液中得挂膜生物炭球，之后再将上述挂膜生物炭球置于耐冷氨氧化细菌包埋混合液中并从中取出再逐粒放入饱和硼酸溶液中，最后，将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液中，并放置于冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，即得。显然本发明不但能提高氨氧化细菌在低温环境的氨氮降解效果，保证能够应用于自然流动水体，且又免受石油烃的毒害。具体应用于辽河湿地现场实现该复杂环境的水体净化，在温度为15℃的水体中，氨氮的降解效果高达96%。

Description

耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球的制备方法及应用

本申请为2015100864643《一种耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法和应用》的分案申请，申请日为2015年2月17日。

技术领域

本发明属于水污染治理技术，具体涉及一种耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球的制备方法及应用。

背景技术

氨氮过高是水体富营养化的主要因素之一，是水污染控制的主要指标。目前国内外针对氨氮的去除方法主要包括物理方法、化学方法和生物方法。物理方法只能实现污染物在空间上的位移，不能实现彻底的去除；化学方法快速有效，但由于引进化学药剂，处理不当会对水体构成二次污染；生物方法利用微生物的代谢将氨氮转化为氮气，实现污染物的去除，同时不会对环境构成二次污染，已被广泛的认可。生物方法较物理方法和化学方法相比最大的特点是处理成本低，且处理效果好，不会造成二次污染。

已有“一种处理氨氮废水的方法”（CN102001721A）的国家发明，该方法是在微波场辐照氨氮废水和活性炭的混合液进行脱除氨氮，虽然该方法去除效率高，但只改变了氨氮的存在形态，但是没有彻底去除，并且该方法不适用于自然地表水体。

研究表明，利用微生物降解水体中的氨氮受到诸如温度等环境条件的影响，造成降解效率的降低。低温环境会影响微生物酶的活性和繁殖速率，抑制对氨氮的去除。目前文献报道氨氧化细菌的最适生长温度为30℃-35℃，对于北方寒冷地区，特别是诸如辽河湿地这样的面积广阔的自然湿地，低温条件不利于氨氧化细菌对氨氮的降解。

已有专利（CN102268386A）筛选出一株降解效果好的氨氧化细菌，在温度为30℃的实验室培养条件下，该菌株的氨氧化效率可达90%，因此该方法筛选出的氨氧化细菌的最佳温度高，不能在低温环境产生较好的去除效果。一种耐低温硝化细菌的筛选方法(CN102286390A)的国家发明专利，通过该方法筛选出的氨氧化细菌（专利中称亚硝酸细菌）能够在温度为10℃-15℃的条件下保持其硝化效果，但高效菌剂在自然水体中的投加却是一个十分重要的问题。因为培养驯化获得的高效菌剂投加在固定容积的反应器中，虽然通过改变反应器内的条件能够获得较好的降解效果，但应用于流动态的自然河流中，随着水体的流动，菌剂在水体中易冲散，不能保证足够的停留时间和足够的微生物浓度，不能实现较好的去除效果。又，辽河湿地为重要的石油开采区，石油的开采、运输和储存造成的石油泄漏，会对微生物构成毒害作用，从而制约对氨氮的降解。

因此，制备一种耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球，应用于辽河湿地现场实现该复杂环境的水体净化是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球制备方法及应用，以克服现有技术存在的问题。

本发明首先考虑到位于我国北方的辽河口湿地，常年处于低温状态，生态环境敏感的复杂生态系统。然而，利用已有的传统物理、化学和生物方法无法达到较好的修复效果，且治理成本高。所以从当地的湿地沉积物中筛选、驯化的耐冷氨氧化细菌处理辽河水体中的氨氮，不但处理效果好、费用低，而且因地制宜，不会对原有的生态环境构成威胁。又，考虑到在流动态的自然河流中，为保证耐性降解菌在水体中不被冲散，即保证足够的停留时间和足够的微生物浓度，以解决在自然水体中的投加的有效问题，从而实现良好的去除效果。因此本发明首次提出以生物炭球为载体的脱氮菌固定化技术，制成耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球，以确保其微生物不会被水流冲散和单位体积的微生物量的同时，又对耐冷氨氧化细菌具有保护作用，实现了氨氮的高效去除。

因此本发明的方法是，首先筛选出高效氨氧化细菌，然后对氨氧化细菌进行耐冷性驯化得到耐冷氨氧化细菌，其次，制得生物炭球，并将制得的数个生物炭球置于耐冷氨氧化细菌富集液中得到挂膜生物炭球，再将上述挂膜生物炭球置于耐冷氨氧化细菌包埋混合液中并从中取出再逐粒放入饱和硼酸溶液中，最后，将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液中，并放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，即得到耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球。

上述所述的高效氨氧化细菌的筛选方法，包括如下步骤：

（1）富集培养：称取干重10g-20g的沉积物，加入到一个盛有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天后吸取10mL至另一个富集培养基中，于上述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化细菌的浓度，最终得到氨氧化细菌富集液；上述富集培养基为：(NH₄)₂SO₄5.5g，CaCO₃5.5g，NaCl2.0g，MgSO₄0.5g，K₂HPO₄1.5g，MnSO₄0.01g，FeSO₄0.02g，蒸馏水1000mL，5%Na₂CO₃调节pH=8.0，121℃灭菌30min

（2）纯化分离：将上述氨氧化菌富集液按10^-1-10^-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于28℃-30℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种氨氧化细菌，上述步骤3中的固体培养基：NH₄SO₄ 2g，NaH₂PO₄0.25g，MgSO₄·7 H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O0.01g，K₂HPO₄0.75g，NaCl 0.01g，CaCO₃5g，琼脂20g蒸馏水1000mL，5%Na₂CO₃调节pH=7.2，121℃灭菌30min。

所述的氨氧化细菌的耐冷性驯化方法，是将上述筛选出的氨氧化细菌以富集液与富集培养基5%的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min-180r/min的条件下震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的氨氧化细菌即为耐冷氨氧化细菌。

所述生物炭球挂膜方法：将生物炭球置于上述耐冷氨氧化细菌富集液中浸泡4-6天，得到挂膜生物炭球；

所述耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球：是将上述挂膜生物炭球与包埋混合液混合，然后逐粒放入饱和硼酸溶液，放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球；上述的包埋混合液是10%聚乙烯醇的水溶液和20%的湿菌体按体积（10-15）：1的比例混合得到的，上述湿菌体是取50ml-100ml的微生物富集液经5000-8000r/min离心10-15min, 去除上清液后用无菌水清洗若干次后得到的。

上述所述的生物炭球的制备方法，包括如下步骤：

（1）取秸秆洗净，烘干至恒重，将秸秆粉碎后过筛，得到秸秆粉末，经过马弗炉烧制成生物炭；

（2）将上述烧制的生物炭用去离子水清洗若干次，并利用0.1mol/L的硝酸作为改性剂，在200r/min的磁力搅拌条件下，使上述改性剂与生物炭充分混匀，且进行改性一天后，再用去离子水清洗至pH为中性得到化学改性生物炭；之后再将上述的化学改性生物炭置于频率40KHz的微波清洗仪中微波震荡40min-90min，过滤，恒温干燥后得到物化改性生物炭；

（3）再将粘土在恒温干燥箱中干燥，过100目-200目筛得到粘土粉末；

（4）将上述物化改性的生物炭与粘土粉末按质量比为（0.5-1）：10的比例混合后，加入到硅酸钠和碳酸氢钠用去离子水溶解的混合液中，用制球机制成球粒后，再置于恒温干燥箱中干燥，最后置于马弗炉烧制成生物炭球，上述硅酸钠与粘土质量比为3%，碳酸氢钠与粘土质量比为1.5%。

上述的马弗炉的烧制条件皆为：升温速度10℃/min, 温度为300℃-400℃和保温时间180min，恒温干燥条件皆为60℃-80℃条件下干燥8h-12h 。

上述的耐冷氨氧化细菌应用于低温条件氨氮污染水体净化。

上述耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球应用于低温条件氨氮污染水体净化。

上述的耐冷氨氧化细菌为已被驯化的Ochrobactrum.sp和Aquamicrobium.sp。

本发明的优点在于制备耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球，不但能够提高氨氧化细菌在低温环境的氨氮降解效果，实现应用于自然流动水体，且又免受石油烃的毒害。具体应用于辽河湿地现场实现该复杂环境的水体净化功能，应用发现在温度为15℃的水体中，氨氮的降解效果高达96%。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

对某河流受污较严重区域进行采样，通过检测氨氮浓度达3.4mg/L，采用以生物炭球为载体的耐冷氨氧化细菌固定化方法在温度为10℃的条件下对水体中的氨氮进行静态处理，包括步骤如下：

首先，筛选出高效氨氧化细菌：称取干重20g的沉积物，加入到一个盛有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，于200r/min，30℃的条件下震荡培养数天后吸取10mL至另一个富集培养基中，于上述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化菌的浓度，最终得到氨氧化细菌富集液；为保证筛选出的细菌为氨氧化细菌，取一定量上述氨氧化细菌富集液于白瓷板上与一定量Griess试剂混合，若生成紫红色络合物即完成检测；为得到单一的菌落，将上述氨氧化菌富集液按10^-1-10^-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于30℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为单一形态的单一菌，得到纯种氨氧化细菌。

然后，对氨氧化细菌的耐冷性驯化：将上述纯种氨氧化细菌挑取到一个富集培养基中于200r/min，30℃的条件下震荡培养数天培养，得到单菌株富集液。待菌株进入对数增长期（上述单菌株富集液吸光度OD600≈0.6）时，以5%的接种量接种到一个100mL的富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150-180r/min的条件下震荡培养数天，筛选出耐冷氨氧化细菌，经鉴定为Ochrobactrum.sp。

其次，制备生物炭球并进行生物炭球挂膜：称取芦苇秸秆200g，用去离子水洗净，烘干至恒重，用植物秸秆粉碎机将芦苇秸秆粉碎后过20目筛，得到芦苇秸秆粉末，经过马弗炉烧制成为生物炭。马弗炉的烧制条件为：升温速度10℃/min,温度为300℃和保温时间180min；为增加生物炭的比表面积，即为增加生物炭的孔隙度，去除生物炭内的灰分，采用物化联合手段对上述生物炭进行表面改性：向烧制好的5g生物炭中加入0.1mol/L的硝酸溶液，充分混匀，在室温200r/min的条件下在磁力搅拌器下搅拌24h，用去离子水清洗生物炭至中性，使得生物炭得到化学改性。将化学改性后的生物炭置于微波清洗机中以频率40KHz的微波震荡40min，进一步去除灰分和增加其孔隙度。物化改性后的生物炭经过滤后置于60℃干燥箱中恒温干燥8h，烘干后制成物化生物炭置于避光保存；将100g辽河口湿地粘土在60℃的恒温干燥箱中干燥12h，过100目筛，得到粘土粉末,置于棕色瓶中备用；将硅酸钠和碳酸氢钠分别按粘土质量比为3%和1.5%用去离子水溶解混匀，将物化改性的生物炭烘干后与粘土粉末按1:10的例混合加入到硅酸钠和碳酸氢钠混合液中，用制球机制成直径为0.8cm的球粒后置于80℃的恒温干燥箱中干燥8h，得到干燥炭球颗粒；将制好的生物炭球置于马弗炉在升温速度10℃/min,温度为300℃和保温时间180min的条件下烧制。

最后，将200g生物炭球置于400mL耐冷氨氧化细菌中浸泡6天，得到挂膜生物炭球；取100ml的上述耐冷氨氧化细菌经8000r/min离心15min, 去除上清液后用无菌水清洗若干次后得到湿菌体；按体积15：1的比例称取10%聚乙烯醇的水溶液和20%的上述湿菌体，混合得到包埋混合液；再将上述挂膜生物炭球与包埋混合液混合，然后逐粒放入饱和硼酸溶液，放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球。

静态试验：取受污染的河水于反应器中，将将交联好的固定化生物炭球平铺于反应器中，在温度为10℃的环境下进行静态去除实验，每5天进行一次氨氮浓度的测定。20天后，氨氮去除率为92%。

实施例2

对某湿地表层水体进行采样，通过检测氨氮浓度达1.6mg/L，采用以生物炭球为载体的耐冷氨氧化细菌固定化方法在温度为15℃的条件下对水体中的氨氮进行动态处理，包括步骤如下：

首先，筛选出高效氨氧化细菌：：称取干重10g的沉积物，加入到一个盛有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，于150r/min，28℃的条件下震荡培养数天后吸取10mL至另一个富集培养基中，于上述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化菌的浓度，最终得到氨氧化细菌富集液；为保证筛选出的细菌为氨氧化细菌，取一定量上述氨氧化细菌富集液于白瓷板上与一定量Griess试剂混合，若生成紫红色络合物即完成检测；为得到单一的菌落，将上述氨氧化菌富集液按10^-1-10^-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于30℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为单一形态的单一菌，得到纯种氨氧化细菌。

然后，对氨氧化细菌的耐冷性驯化：将上述纯种氨氧化细菌挑取到一个富集培养基中于150r/min，28℃的条件下震荡培养数天培养，得到单菌株富集液。待菌株进入对数增长期（上述单菌株富集液吸光度OD600≈0.6）时，以5%的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150-180r/min的条件下震荡培养数天，筛选出耐冷氨氧化细菌，经鉴定为Aquamicrobium.sp。

其次，制备生物炭球并进行生物炭球挂膜：称取芦苇秸秆100g，用去离子水洗净，烘干至恒重，用植物秸秆粉碎机将芦苇秸秆粉碎后过20目筛，得到芦苇秸秆粉末，经过马弗炉烧制成为生物炭。马弗炉的烧制条件为：升温速度10℃/min,温度为400℃和保温时间180min；为增加生物炭的比表面积，即为增加生物炭的孔隙度，去除生物炭内的灰分，采用物化联合手段对上述生物炭进行表面改性：向烧制好的10g生物炭中加入0.1mol/L的硝酸溶液，充分混匀，在室温200r/min的条件下在磁力搅拌器下搅拌24h，用去离子水清洗生物炭至中性，使得生物炭得到化学改性。将化学改性后的生物炭置于微波清洗机中以频率40KHz的微波震荡60min，进一步去除灰分和增加其孔隙度。物化改性后的生物炭经过滤后置于80℃干燥箱中恒温干燥8h，烘干后制成物化生物炭置于避光保存；基于对辽河口湿地原生态环境的保护和经济性考虑，采用辽河本地粘土作为原材料。将110g辽河口湿地粘土在80℃的恒温干燥箱中干燥8h，过100目筛，得到粘土粉末,置于棕色瓶中备用；将硅酸钠和碳酸氢钠分别按粘土质量比为3%和1.5%用去离子水溶解混匀，将物化改性的生物炭烘干后与粘土粉末按0.5:10的例混合加入到硅酸钠和碳酸氢钠混合液中，用制球机制成直径为1.0cm的球粒后置于80℃的恒温干燥箱中干燥8h，得到干燥炭球颗粒；将制好的生物炭球置于马弗炉在升温速度10℃/min,温度为400℃和保温时间180min的条件下烧制。

最后，将50g生物炭球置于100mL耐冷氨氧化细菌中浸泡4天，得到挂膜生物炭球；取100ml的上述耐冷氨氧化细菌经8000r/min离心15min, 去除上清液后用无菌水清洗若干次后得到湿菌体；按体积10：1的比例称取10%聚乙烯醇的水溶液和20%的上述湿菌体，混合得到包埋混合液；再将上述挂膜生物炭球与包埋混合液混合，然后逐粒放入饱和硼酸溶液，放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球。

静态试验：取某湿地水体于反应器中，将将交联好的固定化小球50g平铺于反应器中，在温度为15℃的条件下进行动态去除实验，每5天进行一次氨氮浓度的测定，氨氮的去除率约为96%左右。

Claims (4)

1.耐冷氨氧化细固定化生物炭球的制备方法，其特征是首先筛选出高效氨氧化细菌，然后对氨氧化细菌进行耐冷性驯化得到耐冷氨氧化细菌，其次制得生物炭球置，并将制得的数个生物炭球置于耐冷氨氧化细菌富集液中得到挂膜生物炭球，再将上述挂膜生物炭球置于与耐冷氨氧化细菌包埋混合液中并从中取出再逐粒放入饱和硼酸溶液中，最后，将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液中，并放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球；

上述高效氨氧化细菌的筛选方法，包括如下步骤：

（1）富集培养：称取干重10g-20g的沉积物，加入到一个盛有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天后吸取10mL至另一个富集培养基中，于上述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化细菌的浓度，最终得到氨氧化细菌富集液；上述富集培养基为：(NH₄)₂SO₄ 5.5g，CaCO₃ 5.5g，NaCl2.0g，MgSO₄ 0.5g，K₂HPO₄ 1.5g，MnSO₄ 0.01g，FeSO₄ 0.02g，蒸馏水1000mL，5%Na₂CO₃调节pH=8.0，121℃灭菌30min；

（2）纯化分离：将上述氨氧化菌富集液按10^-1-10^-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于28℃-30℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种氨氧化细菌，上述培养基为：NH₄SO₄ 2g，NaH₂PO₄ 0.25g，MgSO₄·7 H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，K₂HPO₄0.75g，NaCl 0.01g，CaCO₃ 5g，琼脂 20g蒸馏水1000mL，5%Na₂CO₃调节pH=7.2，121℃灭菌30min；

上述对氨氧化细菌进行耐冷性驯化，包括以下步骤：

将上述筛选出的氨氧化细菌以富集液与富集培养基5%的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min-180r/min的条件下震荡培养数天，即筛选出对氨氮降解效果好的氨氧化细菌---耐冷氨氧化细菌；

上述生物炭球的制备方法，包括如下步骤：

（1）取秸秆洗净，烘干至恒重，将秸秆粉碎后过筛，得到秸秆粉末，经过马弗炉烧制成生物炭；

（2）将上述烧制的生物炭用去离子水清洗若干次，并利用0.1mol/L的硝酸作为改性剂，在200r/min的磁力搅拌条件下，使上述改性剂与生物炭充分混匀，进行改性一天后，再用去离子水清洗至pH为中性得到化学改性生物炭；再将上述的化学改性生物炭置于频率40KHz的微波清洗仪中微波震荡40min-90min，过滤，恒温干燥后得到物化改性生物炭；

（3）再将粘土在恒温干燥箱中干燥，过100目-200目筛得到粘土粉末；

（4）将上述物化改性的生物炭与粘土粉末按质量比为（0.5-1）：10的比例混合后，加入到硅酸钠和碳酸氢钠用去离子水溶解的混合液中，用制球机制成球粒后，再置于恒温干燥箱中干燥，最后置于马弗炉烧制成生物炭球，上述硅酸钠与粘土质量比为3%，碳酸氢钠与粘土质量比为1.5%；

上述生物炭球挂膜方法，包括以下步骤：

将生物炭球置于上述耐冷氨氧化细菌富集液中浸泡4-6天，得到挂膜生物炭球；

上述的包埋混合液是10%聚乙烯醇的水溶液和20%的湿菌体按体积（10-15）：1的比例混合得到的，上述湿菌体是取50ml-100ml的微生物富集液经5000-8000r/min离心10-15min,去除上清液后用无菌水清洗若干次后得到的。

2.如权利要求1所述的生物炭球的制备方法，其特征在于上述生物炭球的制备方法中，马弗炉的烧制条件皆为：升温速度10℃/min, 温度为300℃-400℃和保温时间180min，恒温干燥条件皆为60℃-80℃条件下干燥8h-12h。

3.如权利要求1所述的生物炭球的制备方法，其特征在于上述氨氧化细菌的耐冷性驯化方法得到的耐冷氨氧化细菌应用于低温条件氨氮污染水体净化。

4.权利要求1所述的制备方法得到的生物炭球应用于低温条件氨氮污染水体净化。