CN103497909B

CN103497909B - 菌株jy9及其应用

Info

Publication number: CN103497909B
Application number: CN201310379188.0A
Authority: CN
Inventors: 刘庆华; 王金玉; 李旭东
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2013-08-27
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2033-08-27
Also published as: CN103497909A

Abstract

本发明公开了一种菌株其及应用。针对环境污染物生物处理技术领域苯胺废水或受苯胺污染的环境在强酸碱性、高浓度以及高盐时降解率差的问题，提供了一种更高效的苯胺降解菌株及其应用。菌株Pseudomonas Otitidis JY9，保藏编号CGMCC No.7787，可应用于苯胺类化合物降解，尤其在苯胺降解时适用的降解培养条件是：温度10℃～45℃，pH2～pH11；苯胺浓度≤5000mg/L。特别是在苯胺浓度2000mg/L，30℃、pH5.0～7.0条件下菌株CGMCC No.7787对苯胺降解率超过98.50%。本菌株具有耐盐性，NaCl含量≤5mg/L，尤其是≤4mg/L时能保持对苯胺的高效降解能力。此外该菌株在降解苯胺时加入共代谢底物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、酵母粉、蛋白胨、尿素中的一种或几种可提高降解率。菌株CGMCC No.7787还可应用于苯胺类化合物的降解。

Description

菌株JY9及其应用

技术领域

本发明公开了一种菌株JY9其及应用，特别是一种苯胺及苯胺类化合物降解菌株及其应用，属于微生物、环境微生物、环境污染物生物处理技术领域。

背景技术

苯胺是化工行业中最重要的中间体之一，广泛应用于橡胶、除草剂、印染、炼油、农药、医药、有机树脂、油漆、香水、制革、塑料等行业。作为一种“三致物质”，苯胺通过任何途径暴露于环境中都会成为严重的环境问题，危害环境安全与人类健康，而作为一种难降解芳香化合物，其对自然环境的破坏是持久性的。1989年苯胺已被中国列为“环境优先控制污染物”物质之一。

现阶段处理苯胺废水的方法包括物理法、化学法、生物法。其中生物法主要利用微生物代谢，氧化分解废水中的可溶性有机物及部分不溶的有机物，并转化成无害的稳定物质，从而使水质得到净化。生物处理技术具有较高的经济优势、无二次污染的特点，随着高效降解菌的分离筛选和生物处理工艺的改进完善，生物法处理苯胺废水显示出相当的竞争优势和应用潜力，而其中的主体即高效降解菌的筛选成为修复苯胺污染的生态系统的关键。

目前，现有技术中已筛选到多株高效降解菌，人民利用人工富集培养等技术，已经分离得到很多能降解或者转化苯胺的多种微生物菌种，大多数分离自一般废水生物处理系统。但是，一般苯胺废水以及受苯胺污染的环境具有高盐、高浓度以及强酸碱性等特点，而一般废水环境中分离的微生物的最适生长条件为低盐与中性pH，其在苯胺废水的高盐以及、酸性、碱性条件下生长受抑制，对苯胺的降解效率也受到极大抑制。因此目前见诸报道的苯胺降解菌在高盐及、酸性、碱性环境下的降解效率均不理想。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有降解苯胺存在的问题，提供一种假单胞菌菌株，以及该菌株在苯胺降解中的应用。

为实现上述目的，本发明首先提供一种菌株JY9：菌株PseudomonasOtitidis，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编10010），保藏日期2013年6月20日，保藏编号CGMCCNo.7787。

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787是革兰氏阴性好氧杆菌，在鉴定培养基（LB培养基）纯培养条件下，菌落呈淡黄色，较湿润，边缘整齐，圆形，小而凸起，正反颜色一致，氧化酶试验阳性，过氧化氢酶试验阳性，明胶水解试验阳性，淀粉水解试验阴性，可代谢精氨酸和组氨酸脱氨，可以以苯乙胺为唯一碳氮源。不能利用甘油或蔗糖。Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787的16SrDNA的Genebank登录号为KF159806。

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787能够应用于苯胺降解。

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787应用于苯胺降解适用的温度条件是10℃～45℃。优选的温度条件是15℃～45℃，20℃～40℃。

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787应用于苯胺降解适用的酸碱条件是pH2～pH11。优选为pH4～9，pH5～7。

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787应用于苯胺降解适用的苯胺浓度条件是苯胺浓度≤5000mg/L。优选的苯胺浓度是1000mg/L～3500mg/L，1000mg/L～3000mg/L及1000mg/L～2000mg/L。

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787应用于苯胺降解适用的苯胺浓度条件是NaCl含量≤5mg/L。优选的苯胺浓度是NaCl含量≤4mg/L，NaCl含量≤3mg/L。

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787应用于苯胺降解适用的降解培养优选的条件：苯胺浓度1000mg/L～3000mg/L，温度20℃～40℃，pH4～9；或者是苯胺浓度2000mg/L～3000mg/L，温度25℃～30℃，pH5～7；或者是苯胺浓度2000mg/L，温度30℃，pH7，NaCl含量≤4mg/L。

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787应用于苯胺降解适用的降解培养条件是：碳氮源是苯胺，或者碳氮源是苯胺与其他共代谢底物，所述其他共代谢底物是葡萄糖、蔗糖、乳糖、酵母粉、蛋白胨、尿素中的一种或几种。

根据试验数据，本发明所提供Pseudomonas Otitidis CGMCCNO.7787能够应用于苯胺废水生物处理与环境修复工程中的苯胺降解。优化的条件是在20℃～40℃、pH4～pH9、苯胺浓度不高于3500mg/L、盐分不高于4%时，苯胺降解效率更优。另一个更优化的条件是Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787生长环境中加入0.1%(w/v)的共代谢底物葡萄糖、蔗糖、乳糖、酵母粉、蛋白胨、尿素中的任一种或几种，能够提高苯胺废水生物处理效率。

菌株Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787能够应用于苯胺降解的原因在于能够促使苯环的裂解。而苯胺类化合物降解的关键在于苯环的裂解，微生物对苯胺类化合物的降解原理在于微生物产生合适的酶将苯环裂解，苯环裂解后再被转化为其他中间产物，最后将裂解后的中间产物转化为可被微生物细胞利用的物质，最终代谢为简单的化合物，完成苯胺类化合物的降解。此菌株能够降解苯胺，表明该菌能够产生裂解苯环的酶，能够降解苯胺类化合物。因此菌株Pseudomonas Otitidis CGMCCNO.7787能够应用于苯胺类化合物的降解。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：（1）提供了一种新菌株Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787；（2）菌株Pseudomonas OtitidisCGMCC NO.7787能够降解苯胺及苯胺类化合物；（3）在苯胺浓度2000mg/L30℃、pH5.0～7.0条件下菌株Pseudomonas Otitidis CGMCCNO.7787对苯胺降解率达到超过98.50%；（4）菌株Pseudomonas OtitidisCGMCC NO.7787能够耐受一定浓度的盐分，在盐分不高于4%时能够降解3500mg/L以下的苯胺溶液。

附图说明

图1是Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787培养图。

图2是Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787对苯胺的降解曲线。

图3是Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787对苯胺降解前后的液相色谱图。其中，图2各图代表的意思为：A、苯胺浓度，样品稀释100倍；B、降解48h，样品稀释10倍；C、降解72h，样品未稀释。

具体实施方式

以下结合优选实施例、试验例对本发明技术方案做进一步说明。

实施例一

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787的分离驯化。

1、样品

土壤样品：取自大庆油田油井附近受油类污染的土壤，过筛备用。

2、培养基

分离培养基：常用分离培养基，牛肉膏蛋白胨液体培养基、肉膏汤培养基、肉浸汤培养基。

驯化培养基：无机盐培养基中分别添加苯胺500mg/L、750mg/L、1000mg/L。

无机盐培养基：Na₂HPO₄ 2.52g、KH₂PO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.4g、(NH₄)₂SO₄ 0.5g微量元素液5mL、蒸馏水1000mL，pH7.0；其中微量元素液成份：EDTA 0.6g、ZnSO₄·7H₂O 0.22g、CaCl₂ 0.05g、MnCl₂·4H₂O0.05g、FeSO₄·7H2O 0.049g、(NH₄)₂Mo₇O₂₄·4H₂O 0.01g、CuSO₄·5H₂O0.016g、CoCl₂·6H₂O 0.02g、蒸馏水1000mL，pH7.0。

3、分离纯化和驯化培养操作：

取土壤样品10g于90mL分离培养基中，30℃，150rpm条件下培养2h，静置。待土壤沉降完全后取上层液10mL接种到驯化培养基（苯胺500mg/L），30℃、150rpm条件下培养；一星期后转培养，将10mL培养物转接到驯化培养基（苯胺750mg/L）中，依照上述条件培养，一星期后再转接至驯化培养基（苯胺1000mg/L）。驯化结束后，将培养物经梯度稀释涂布于添加苯胺的无机盐琼脂平板，得到生长较好的单菌落，通过划线分离获得纯培养，编号为JY9。

图1是菌落培养形态照片。在LB培养基纯培养条件下，菌株JY9的菌落形态为淡黄色、较湿润光滑、边缘整齐、圆形、小而凸起、正反颜色一致；革兰氏染色阴性，细胞呈短杆状；氧化酶试验阳性，过氧化氢酶试验阳性，明胶水解试验阳性，淀粉水解试验阴性；可代谢精氨酸和组氨酸脱氨，可以以苯乙胺为唯一碳氮源，不能利用甘油或蔗糖。菌株JY9经鉴定为Pseudomonas Otitidis菌株。

Pseudomonas Otitidis JY9的16SrDNA已提交Genebank，登录号KF159806。

测试例一

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787降解能力测试。

1、测试培养基与材料

测试培养基：无机盐培养基中添加苯胺2000mg/L；无机盐培养基同实施例一。

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787菌悬液：将菌株JY9接种到含苯胺浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，直到OD600值接近于1。

2、测试操作

将Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787菌悬液接种至测试培养基，30℃、160rpm摇床培养；分别测定接种后5h、10h、15h、20h、25h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、62h、72h、82h时培养基中剩余苯胺浓度并计算苯胺降解率，测试结果见图2。

图2是Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787对苯胺的降解曲线图。由图2可以看出：Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787对苯胺有显著的降解作用；接种10h内降解菌迅速适应降解环境，接种60h以后降解率达到90%以上。

HPLC检测培养基组分，HPLC分析检测条件为紫外检测波长230nm；流动相：甲醇：水=70:30（v/v）；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。检测结果见图3。

图3是Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787对苯胺降解前后的液相色谱图。图2A——苯胺浓度，样品稀释100倍；图2B——降解48h，样品稀释10倍；图2C——降解72h，样品未稀释。

本测试例说明Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787的筛选是以降解苯胺为筛选目的，所获得的菌株可利用苯胺作为唯一碳源与氮源进行生长繁殖，即可以降解苯胺。

试验例一

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787降解苯胺试验，苯胺浓度对细菌生长和苯胺降解率的影响。

1、培养基与材料

基础培养基：MSM培养基；

试验培养基：在基础培养基中分别添加苯胺，苯胺浓度如表1所示；

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787菌悬液：同测试例一。

2、培养测试操作

向试验培养基中分别接种Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787菌悬液，调节至pH7.0，30℃、160rpm摇床培养72h。培养结束测定培养基中剩余苯胺浓度并计算苯胺降解率，测定菌液浓度OD600，结果见表1。

表1 苯胺浓度对细菌生长和苯胺降解率的影响

No.	苯胺浓度（mg/L）	降解率（%）	OD600
				1	1000	94.21	0.467
2	1500	93.86	0.637
				3	2000	98.61	1.141
4	2500	86.3	1.247
				5	3000	81.44	1.262
6	3500	44.85	0.876
				7	4000	2.5	0.605
8	4500	1.7	0.058
				9	5000	1.9	0.041

表1结果显示，在浓度1000mg/L～3000mg/L范围内，PseudomonasOtitidis CGMCC NO.7787对苯胺能够有效降解，细胞生长随着苯胺浓度的升高而升高。其最适生长浓度为3000mg/L，其OD600为1.262。94.37%以上的降解率在浓度1000mg/L～2000mg/L处获得。当浓度达到3000mg/L时，苯胺降解率可达到81.44%。当浓度超过3500mg/L时，Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787的生长与苯胺降解能力受到明显抑制。

本试验例说明Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787具有高效降解高浓度苯胺的能力，为其在不同污染程度的环境中的应用提供了保障。

参考文献：OD600测定采用《微生物学实验》记载方法，袁丽红编，化学工业出版社，2010年。

试验例二

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787降解苯胺试验，温度对细菌生长与苯胺降解效率的影响。

1、培养基与材料

基础培养基：MSM培养基；

试验培养基：在基础培养基中分别添加苯胺2000mg/L；

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787菌悬液：同试验例一；

2、培养测试操作

向试验培养基中分别接种Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787菌悬液，调节至pH7.0，160rpm摇床培养72h。培养结束测定培养基中剩余苯胺浓度并计算苯胺降解率，测定菌液浓度OD600，结果见表2。

表2 温度对细菌生长和苯胺降解率的影响

No.	温度（℃）	降解率（%）	OD600
				1	10	3.81	0.067
2	15	33.75	0.433
				3	20	94.07	1.123
4	25	97.14	1.353
				5	30	96.01	1.128
6	35	96.6	1.213
				7	40	86	0.876
8	45	10.44	0.147

表2结果显示，在苯胺浓度2000mg/L的情况下，当温度高于40℃或低于20℃，细菌的生长和对苯胺的降解均受到抑制。当温度在20℃～40℃之间，苯胺降解率几乎不变，降解率均达到94.1%以上。最高值达到97.75%。

试验例三

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787降解苯胺试验，pH对细菌生长与苯胺降解效率的影响。

1、培养基与材料

基础培养基：MSM培养基；

试验培养基：在基础培养基中分别添加苯胺2000mg/L、3000mg/L；

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787菌悬液：同试验例一；

2、培养测试操作

向试验培养基中分别接种Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787菌悬液，30℃、160rpm摇床培养72h。培养结束测定培养基中剩余苯胺浓度并计算苯胺降解率，测定菌液浓度OD600，结果见表3.1、表3.2。

表3.1 pH对细菌生长和苯胺降解率的影响（苯胺2000mg/L）

No.	初始pH	降解率（%）	OD600
				1	2	8.62	0.056
2	3	37.8	0.638
				3	4	92.2	1.47
4	5	98.54	1.517
				5	6	97.51	1.377
6	7	93.21	1.27
				7	8	93.44	1.28
8	9	90.65	1.127
				9	10	27.18	0.47
10	11	12.89	0.056

表3.1结果显示，在苯胺浓度2000mg/L时，pH＝4～9之间，苯胺降解率不受明显影响；在pH＝4的条件下，降解率可达92.2%；在pH＝9的条件下，降解率可达90.65%；在pH＝10的条件下，细菌仍能正常生长，OD600值为0.47。

表3.2 pH对细菌生长和苯胺降解率的影响（苯胺3000mg/L）

No.	初始pH	降解率（%）	OD600
				1	4	75.2	1.461
2	5	81.54	1.48
				3	6	77.51	1.433
4	7	75.21	1.377
				5	8	68.44	1.311
6	9	34.65	1.213
				7	10	10.18	0.107
8	11	6.89	0.093

表3.2结果显示，在的苯胺浓度3000mg/L下，pH＝4～8之间，苯胺降解率不受明显影响；在pH＝4的条件下，降解率可达75.2%；在pH＝8的条件下，降解率可达68.44%；在pH＝9的条件下，细菌仍能正常生长，OD600值为1.213，对苯胺仍有降解能力，降解率达34.65%。

本试验例说明Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787对温度和pH的改变有着很强的适应范围，能在一定范围内环境因素的动态变化中保持着高效稳定的苯胺降解能力。

本实验在各种条件下所得出的试验结果，都是在其他条件严格控制的环境中得出的，因此，以上对底物浓度、温度、PH条件下苯胺降解率所做出的结果可以结合分析得出较优的降解培养条件范围，如苯胺浓度1000mg/L～3000mg/L，温度20℃～40℃，pH4～9，或者苯胺浓度2000mg/L～3000mg/L，温度25℃～30℃，pH5～7。

试验例四

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787降解苯胺试验，盐度对细菌降解苯胺效率的影响。

1、培养基与材料

基础培养基：MSM培养基；

试验培养基：在基础培养基中添加苯胺2000mg/L，分别添加NaCl，添加量如表4所示；

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787菌悬液：同试验例一；

2、培养测试操作

向试验培养基中接种Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787菌悬液，调节至pH5.0，30℃、160rpm摇床培养72h。培养结束测定培养基中剩余苯胺浓度并计算苯胺降解率，结果见表4。

表4 含盐量对细菌苯胺降解的影响

No.	含盐量(mg/L)	降解率(%)
			1	0	96.51
2	2	95.97
			3	3	94.09
4	4	88.68
			5	5	3.16

表4结果显示，在苯胺浓度2000mg/L下，含盐量不高于4%时，苯胺的降解基本不受盐分的影响，能够在72h内将2000mg/L的苯胺降解88%以上；而当含盐量高于5%时，苯胺的降解受到抑制，只有3.16%的降解率。结合试验例三，苯胺浓度2000mg/L，温度30℃，pH7，含盐量不高于4%时，苯胺的降解亦基本不受盐分的影响。

本试验例说明，含盐量在不高于4%时，盐分对Pseudomonas OtitidisCGMCC NO.7787的苯胺降解能力影响非常小。本试验例结合试验例一的试验结果，菌株在含盐量在不高于4%、苯胺浓度不高于3500mg/L条件下有较理想的苯胺降解率，表明Pseudomonas Otitidis CGMCCNO.7787能够在目前的大部分含盐环境中保持对苯胺的高效降解能力。

试验例五

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787降解苯胺试验，添加共代谢底物对细菌降解苯胺效率的影响。

1、培养基与材料

基础培养基：MSM培养基；

试验培养基：在基础培养基中分别添加苯胺3000mg/L与不同的共代谢底物0.1%(w/v)，共代谢底物名称如表6所示；

Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787菌悬液：同试验例一；

2、培养测试操作

向试验培养基中接种Pseudomonas Otitidis CGMCC NO.7787菌悬液，调节至pH5.0，30℃、160rpm摇床培养72h。培养结束测定培养基中剩余苯胺浓度并计算苯胺降解率，结果见表5。

表5 共代谢底物对苯胺降解率的影响

No.	碳氮源种类	降解率（%）
			1	空白	78.15
2	葡糖	88.65
			3	蔗糖	81.33
4	乳糖	82.61
			5	酵母提取物	86.3
6	蛋白胨	84.26
			7	尿素	81.48

表6结果显示，葡萄糖、蔗糖、乳糖、酵母粉、蛋白胨、尿素等的添加均不同程度地提高了苯胺降解率，降解率比对照组高出3.3%（尿素）～10.5%（葡萄糖）。

本试验例说明添加共代谢底物可提高Pseudomonas Otitidis CGMCCNO.7787对苯胺的降解能力。本试验例是添加单一共代谢底物对提高苯胺降解率的试验数据，表明菌株JY9能够利用这些共代谢底物作为碳氮源用于自身生长繁殖。。从专业基础而言，这些单一共代谢底物均是比苯胺容易降解的碳氮源，且没有相互抵触的试验结果，，可以认为，如果同时添加几种共代谢底物同样能够提高菌株JY9对苯胺的降解率效果。因此，在降解培养中添加一种或几种共代谢底物都能够促进细菌对苯胺解的降解。

本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.菌株Pseudomonas Otitidis JY9，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号CGMCC No.7787，保藏日期2013年6月20日。

2.如权利要求1所述的菌株CGMCC No.7787在苯胺降解中的应用。

3.如权利要求1所述的菌株CGMCC No.7787在含苯胺废水处理中的应用。

4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：适用的降解培养条件是：温度10℃～45℃，pH2～pH11。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：适用的降解培养条件是：苯胺浓度≤5000mg/L。

6.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述降解培养条件是：苯胺浓度1000mg/L～3000mg/L，温度20℃～40℃，pH4～9。

7.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述降解培养条件是：苯胺浓度2000mg/L～3000mg/L，温度25℃～30℃，pH5～7。

8.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：适用的降解培养条件是：NaCl含量≤5mg/L。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述降解培养条件是：苯胺浓度2000mg/L，温度30℃，pH7，NaCl含量≤4mg/L。

10.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述降解培养条件是：碳氮源是苯胺，或者碳氮源是苯胺与其他共代谢底物，所述其他共代谢底物是葡萄糖、蔗糖、乳糖、酵母粉、蛋白胨、尿素中的一种或几种。