CN103468612A - 中度嗜盐菌株及由该菌株产生的嗜盐酯酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从山东威海双岛盐场筛选得到的酯酶高产菌株whb27及由该菌株产生的新型嗜盐耐有机溶剂酯酶及该酯酶的应用。该菌株为中度嗜盐菌株（Halobacillus trueperi）whb27，已于2013年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.7631。由该菌株纯化得到的嗜盐酯酶分子量约35KDa，在有机溶剂中具有稳定性，在高盐并含有机溶剂的油脂化工工业中具有潜在的应用前景。

Description

中度嗜盐菌株及由该菌株产生的嗜盐酯酶及其应用

技术领域

本发明涉及一株中度嗜盐菌株、嗜盐酯酶及其应用，特别是从山东威海双岛盐场筛选得到的一株高产嗜盐酯酶的中度嗜盐菌株及由该菌株产生的新型嗜盐酯酶及其应用，属生物技术领域。

背景技术

嗜盐菌是极端环境微生物的重要组成部分之一，主要指中度嗜盐菌(最适生长盐度为3%-15%)和极端嗜盐菌(最适生长盐度>15%-30％)。嗜盐菌存在于多种多样的盐域环境中，这类环境有自然形成的，如死海，盐湖等水环境、盐土环境，人工形成的如盐场、盐池等，还有很多盐腌制的食品、绘画材料和建筑材料等。我国有广阔的盐域环境和丰富的嗜盐微生物资源。作为一类新型的、极具应用前景的微生物资源，嗜盐菌近年来受到人们的广泛关注。

大多数生物工艺所用的酶都来源于非极端环境的微生物，为了得到在苛刻工业条件下具有最佳催化作用的酶，要通过蛋白质工程对这些酶进行改造，使之具有更好的热稳定性，对有机溶剂具有更强的耐受性等特性。嗜盐酶是由嗜盐菌产生的，通常具有极高的盐耐受性和较高的热耐受性，因而以嗜盐菌作为产酶资源正成为一个新的研究热点，应用于处理海产品、酱制产品以及化工、制药、石油、发酵等排放含高浓度无机盐废水的工业部门。

细菌产生的脂肪水解酶根据水解底物的不同划分为水解短链羧酸酯(小于12个C)的酯酶(carboxylester hydrolases，esterase，E.C.3.1.1.1)、可以在油水界面上水解长链甘油酯(大于12个C)的脂肪酶(甘油酯水解酶，triacylglycerolacylhydrolases,Lipase，E.C.3.1.1.3),第3类脂解酶包括可以水解极性磷脂的磷脂酶(E.C.3.1.4.3)。国内外有关于二甲亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）抗性酯酶，耐热嗜盐脂肪酶等的研究，但耐有机溶剂嗜盐酯酶的研究并未见国内文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株可以在发酵培养基中积累嗜盐酯酶的中度嗜盐菌株whb27。

本发明提供的菌株是从山东威海双岛盐场不同盐池的盐水和底泥中筛选得到的一种产新型嗜盐酯酶的中度嗜盐菌，该菌株为Halobacillus trueperi的一个新菌种，编号whb27。该中度嗜盐菌的分类名称为Halobacillus trueperi，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号（中国科学院微生物研究所），保藏日期为2013年5月20日，保藏编号为CGMCC No.7631。

本发明提供的中度嗜盐菌株whb27具有以下特征：菌落圆形，表面光滑，黄色；革兰氏染色阳性，镜检呈杆状，有芽孢；不能水解淀粉，分解葡萄糖产酸不产气，明胶液化试验、吲哚试验、触酶试验、V-P试验阳性，柠檬酸盐利用试验阴性；在1-15%NaCl、pH6.0-9.5、10～45℃之间都可生长，最适培养条件为盐度7%、pH7.5、28℃。具体生理生化特征见表1。

表1菌株whb27的生理生化特征

利用细菌通用引物PCR扩增菌株whb27的16S rDNA，得到该菌16SrDNA全序列1460bp，GenBank登录号为FJ444973。根据同源序列搜索的结果，与试验菌株一起用Clustal X软件进行匹配（align），用MEGA4.0软件进行分子系统学分析并生成系统进化树见图1。从系统进化树中可以看到whb27与Halobacillus trueperi XJSL8-7（GQ903456）被分在一个分支中，它们的16SrDNA序列同源性达到99%，结合上述生理生化分析，菌株whb27鉴定为Halobacillus trueperi。

本发明的另一目的是提供由上述嗜盐菌株whb27产生的新型嗜盐耐有机溶剂酯酶及其应用。

本发明提供的嗜盐酯酶通过如下方法得到：发酵嗜盐酯酶菌株whb27获得粗酶液，经过硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、SephadexG-75凝胶柱层析得到分子量约35KDa的纯化酯酶蛋白，酯酶活性为32.8U/mg，比粗酶液提高了42倍。

该嗜盐酯酶的最佳活性条件为：pH8.0、2.5mol/L NaCl、42℃。

酯酶的酶学性质如下：酯酶活性受Ba²⁺、Fe²⁺和Cu²⁺抑制，被Ca²⁺、Mn²⁺和Zn²⁺激活；EDTA对酯酶活性影响不大，但该酶受PMSF强烈抑制，表面活性剂SDS轻微抑制酯酶活性；纯化酯酶在乙醇、丙三醇、丙二醇、聚乙二醇4000和聚乙二醇6000等有机溶剂中活性稳定或升高，说明该酶在有机溶剂中具有良好的稳定性。

利用本发明纯化的嗜盐耐有机溶剂酯酶，可以用于高盐并含有机溶剂的油脂降解过程。

附图说明

图1whb27进化树。

图2NaCl对whb27生长的影响。

图3初始pH对whb27生长的影响。

图4温度对whb27生长的影响。

图5纯化酯酶SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图6pH对酯酶活性的影响。

图7NaCl浓度pH对酯酶活性的影响。

图8温度对酯酶活性的影响。

本发明的中度嗜盐菌的保藏日期为2013年5月20日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7631。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。但以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

基础培养基（Gibbons改良培养基）：酸水解酪蛋白5g，酵母膏10g，蛋白胨5g，柠檬酸三钠3g，KCl2g，MgSO4·7H2O20.0g，琼脂20g，陈海水1000mL，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min，7%-7.5%盐度。

发酵培养基：在基础培养基中加入1%橄榄油。

筛选培养基：固体培养基＋Rhodamine B0.02%＋橄榄油1.0%。

实施例1：菌株筛选

在筛选培养基平板上打孔，将分离自不同菌落的粗酶液加入其中，置于37℃培养箱进行反应，挑选有荧光圈的粗酶液对应的菌落纯化后发酵复筛。

实施例2：16S rDNA菌种鉴定

取指数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，按细菌基因组DNA小量提取试剂盒操作。正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反应液体系如下：

PCR反应条件如下：95℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸90S，30个循环。

经测序后获得的16S rDNA序列，在GenBank中进行BLAST比对确定其种属。

实施例3：whb27生长特性测定

⑴盐度对菌株whb27生长的影响

配制不同盐度的基础培养基（1-15%），定量接种，28℃恒温摇床180r/min培养48h，取菌液测OD₆₀₀吸光度值。生长最适NaCl浓度范围是嗜盐菌分类的重要标准。本实验菌属于中度嗜盐菌，根据图2显示，在1-15%NaCl浓度范围内whb27菌株均可生长，说明其对NaCl耐受性很强，最适生长NaCl浓度约为7%。

⑵初始pH对菌株生长的影响

在最适NaCl浓度条件下，将基础培养基调制成不同的pH（5-10），定量接种，28℃恒温摇床180r/min培养48h，取菌液测OD₆₀₀吸光度值。微生物新陈代谢的酶类活性受到pH的影响，从图3可看出该菌在pH6.0-9.5之间生长，小于6.5或大于9都几乎不生长，最适pH为7.5。

⑶培养温度对菌株生长的影响

在基础培养基上接种筛选的单菌落，设置摇床温度（5-50℃），180r/min培养48h，取菌液测OD₆₀₀吸光度值。根据图4所示，whb27在温度为10-45℃之间都可生长，而当温度大于45℃之后就几乎不生长，在28℃生长最旺盛。

实施例4：酯酶活性测定

酶活力测定以p-NPB为底物参照文献方法进行。

溶液A：176μL p-NPB溶于10mL异丙醇，4℃保存；

溶液B：pH8.0，50mM Tris-HCl缓冲液。

使用时将溶液A与溶液B按1:9的体积比混合，配制3.6mL反应液，并在底物反应液中加入2.5mol/L NaCl，加入400μL粗酶液，37℃反应10min，在410nm下测吸光值，根据对硝基苯酚的浓度计算酶活。

酯酶酶活单位：每分钟释放1μmoL对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活单位。

实施例4：酯酶纯化

从中度嗜盐菌whb27培养基斜面上取一环接种到50mL基础培养基（Gibbons改良培养基，盐度7%）中，28℃摇床（180r/min）培养12h，然后将该50mL种子液接种到450mL相同的新鲜培养基中，28℃摇床培养4d，得到的发酵液经10000r/min离心20min，上清液即为粗酶液，放4℃冰箱备用。

上述粗酶液经过30%-70%硫酸铵分级盐析；DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析，色谱条件如下：以20mmol/L pH8.0Tris-HCl平衡，0.1-2.0mol/L的NaCl进行线性洗脱，紫外蛋白监测，收集洗脱蛋白，以酶标仪分别检测每个峰的蛋白浓度及酶活，描绘洗脱液峰；Sephadex G-75凝胶柱层析，色谱条件如下：玻璃柱（直径×柱长=1.6cm×80cm），流动相为0.02mol/L Tris-HCl缓冲溶液，pH8.0，含0.15mol/L NaCl，流速为25mL/h，温度4℃，检测波长280nm，上样体积5.0ml，收集各层析峰并测定其活性。最终得到分子量约35KDa的纯化酯酶蛋白（图5），酯酶活性为32.8U/mg，比粗酶液提高了42倍。

实施例5：酯酶的酶学性质测定

⑴pH对酯酶活性的影响

在室温条件下，配制不同pH（6.0-10.0）的缓冲液（NaCl浓度2.5mol/L），42℃孵育30min，以p-NPB为底物测定酶活，如图6所示，whb27产生酯酶的最适pH为8.0，在pH7.5-9.0范围内比较稳定，说明酶对于pH值的耐受范围较宽。

⑵NaCl浓度对酯酶活性的影响

在室温条件下，配制不同NaCl浓度的（0-5mol/L）反应液（pH8.0），42℃孵育30min后测定酯酶活性，如图7所示，该酶反应的最适NaCl浓度为2.5mol/L，NaCl浓度为0时基本没有活性，说明该酶为嗜盐酯酶。

⑶反应温度对酶活性的影响

于不同温度（22-52℃）孵育，在最适条件下孵育30min后测定酶活，该酶催化的最适温度为42℃。在32-52℃范围内较稳定，可见适宜该酶催化的温度较宽。

⑷金属离子对酯酶活性的影响

纯化酯酶溶于含金属离子（20mmol/L）的Tris-HCl缓冲液中，在最适条件下孵育30min后测定酶活，以不含添加物的酶活性为100%，计算相对酶活。表2的结果显示，Mn²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺对酶有激活作用，酶活不同程度地提高了10-40%；而Ba²⁺、Fe²⁺和Cu²⁺对酶具有抑制作用；K⁺和Mg²⁺对酯酶活性基本没有影响。

表2金属离子对酯酶活性的影响

⑸化学试剂对酯酶活性的影响

纯化酯酶与化学试剂PMSF、EDTA二钠盐、SDS和DMSO及不同有机溶剂在最适条件下下孵育30min后测定酶活。以未加溶剂的酶经同样条件处理为对照，计算相对酶活。该酯酶受丝氨酸酶抑制剂PMSF抑制，活性降低50%，判断该酶与已报道的大多数脂肪水解酶一样具有以丝氨酸为活性中心的催化三元组；该酶亦受到EDTA、SDS和DMSO的抑制，酶活不同程度地下降。表3表明醇类对嗜盐酯酶的稳定性有一定的作用，其中聚乙二醇4000和聚乙二醇6000的效果最好，这种稳定机理可能是多羟基醇类可以通过共价键连接到酶分子表面，形成一层覆盖层，起到对酶的保护作用，有利提高酶的稳定性。其中甲醇、乙醇、丙三醇，1,2-丙二醇，聚乙二醇10000能使酶活保持在80%以上。

表3化学试剂对酯酶活性的影响

Claims (4)

1.一株中度嗜盐菌株（Halobacillus trueperi）whb27，已于2013年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.7631。

2.一种嗜盐酯酶，其特征在于，通过如下方法得到：发酵培养权利要求1所述的嗜盐酯酶菌株whb27获得粗酶液，经过硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶柱层析得到分子量约35KDa的纯化酯酶蛋白，酯酶活性为32.8U/mg。

3.如权利要求2所述的嗜盐酯酶，其特征在于，嗜盐酯酶的最佳活性条件为：pH8.0、2.5mol/L NaCl、42℃。

4.如权利要求2所述的嗜盐酯酶在高盐并含有机溶剂的油脂化工工业中的应用。

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