CN101245325A

CN101245325A - 一株产新型碱性蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌

Info

Publication number: CN101245325A
Application number: CNA2007100050551A
Authority: CN
Inventors: 闫志勇; 王斌; 钱冬萌; 宋旭霞; 丁守怡; 代玉梅; 李荣贵
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2007-02-12
Filing date: 2007-02-12
Publication date: 2008-08-20
Anticipated expiration: 2027-02-12
Also published as: CN101245325B

Abstract

本发明涉及一株产新型碱性蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌，属于微生物领域。一株产新型碱性蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌，保藏号为CGMCC No.1868。本发明的优点是：本发明菌株CGMCC No.1868分离自沙蚕消化道，能分泌大量碱性蛋白酶，其蛋白酶在碱性、高热环境中显示了良好的稳定性，该菌株具有进一步研究开发的巨大潜力。

Description

一株产新型碱性蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌

技术领域

本发明涉及一株产新型碱性蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌，属于微生物领域。

背景技术

蛋白酶属于水解酶类，能作用于蛋白质的肽链催化肽键水解，是一类用途广泛的工业用酶，也是当今世界上产销量最大的商业酶，目前已广泛应用到食品、酿造、医药、纺织、皮革、日用化学、洗涤剂、饲料以及水产加工等多个行业，对国民经济的发展起着重要的作用。

蛋白酶广泛分布于动物、植物、微生物中。20世纪90年代后，随着基因工程的加入，发酵技术的发展及新型发酵设备的发明，微生物日益成为工业酶制剂的主要来源。产生蛋白酶的微生物种类繁多，细菌、真菌、放线菌、原虫皆有报道。目前，用于蛋白酶工业生产最主要的菌株及最重要的研发对象都是芽胞杆菌(地衣、枯草、短小芽胞杆菌等)。我国碱性蛋白酶的工业生产菌株有地衣芽胞杆菌2709、C1213、嗜碱性短小芽胞杆菌B4等。另外，一些能产生极端蛋白酶(如耐低温、高温、盐、酸碱的蛋白酶)极端微生物也越来越受到关注。

目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的筛选，并通过发酵条件优化和遗传育种、物理化学诱变或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。我国的蛋白酶研究近20年来取得了很大进展，与蛋白酶生产制备相关的产酶株的筛选、育种、发酵、诱变、工程菌构建与表达、酶的纯化与制备等技术日臻成熟。目前已生产和应用的蛋白酶品种有21种之多，广泛用于丝绸脱胶、皮革脱毛、毛皮软化、电影废胶片回收，生化药物生产以及用作医药、洗涤剂等。但是，与国外相比，我国的蛋白酶研究还存在许多问题，如产酶微生物的资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一，价格昂贵，应用面还不够广泛等。

以往人们多从土壤、温泉水中采集样本筛选产蛋白酶微生物。近年来，越来越多的科研工作者开始把目光投向海洋。科研证据充分表明海洋中形形色色的嗜热、嗜冷、嗜压、嗜盐或嗜不同pH的极端环境中分离的微生物有望成为新型生物学活性酶资源的宿主菌。目前报道的海洋产蛋白酶菌株主要是嗜冷假单胞菌、副溶血弧菌和黄杆菌等。

发明内容

本发明的目的是提供一株产新型碱性蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一株产新型碱性蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌，保藏号为CGMCC No.1868。

本发明提供的菌株从海洋生物双齿围沙蚕消化道中分离得到，能够分泌一种新型碱性蛋白酶，经微生物学鉴定和基因学归属后证实属寡养单胞菌，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center，CGMCC，北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100080，电话010-62542758。)，保藏日为2006年11月22日，保藏号为CGMCC No.1868。建议的分类命名为嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia。

嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No.1868为革兰阴性菌，多数为杆状，两端钝圆，大小约为0.5～1.0μm×2～4μm，不规则散在；排列极生多鞭毛，菌体的一端有1～4根鞭毛。该菌株的菌落为中等大小、圆形、凸起、边缘整齐湿润的光滑型菌落，培养24h为灰白色，48h后产生褐色色素。

嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No.1868用于制备碱性蛋白酶的用途。嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No.1868在自然状态下就可以分泌大量碱性蛋白酶，在培养物的上清液中具有极高的浓度，只需简单方法就可以分离纯化。该蛋白酶经过初步研究发现，分子量约为41Kd，是一种耐高温的碱性蛋白酶，且具有活性稳定，活性高(比活性达150U/mg)，不同于已经报道的其他蛋白酶。

本发明的优点是：本发明菌株CGMCC No.1868分离自沙蚕消化道，能分泌大量碱性蛋白酶，其蛋白酶在碱性、高热环境中显示了良好的稳定性，该菌株具有进一步研究开发的巨大潜力。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制。

附图说明

图1为菌株D2的革兰染色(10×100)照片。

图2为菌株D2的鞭毛染色(10×100)照片。

图3为菌株D2在透射电子显微镜下的形态(10×100)照片。

图4为菌株D2的生长曲线图。

图5为菌株D2的温度生长曲线图。

图6为菌株D2的生长pH曲线图。

图7为菌株D2的NaCl耐受曲线图。

图8为菌株D2的系统发育分析图。

图9为菌株D2在奶粉平板上的蛋白酶活性图。

图10-1和图10-2分别为菌株D2的培养上清液SDS电泳和明胶蛋白酶结果图。

图11为菌株D2产蛋白酶的时间图。

图12为D2蛋白酶活性的pH值曲线图。

图13为D2蛋白酶活性的温度曲线图。

具体实施方式

实施例1：D2菌株的生物学特征及鉴定

一.D2菌株的分离

双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis Grube)采集自青岛胶洲湾近海海岸的泥沙中。将活沙蚕用无菌海水洗净后置于无菌海水中24h使其排泄出肠道中的代谢物，解剖分离出消化道，用棉拭蘸取内容物接种至营养琼脂平板培养基(杭州微生物试剂有限公司)上，25℃培养24h，获得单个菌落。

D2菌株的菌落为中等大小、圆形、凸起、边缘整齐湿润的光滑型菌落，培养24h为灰白色，48h后产生褐色色素。

二.D2菌株的形态特征

取25℃培养24h的D2菌单个菌落分别进行革兰染色(南京建成生物工程研究所)、鞭毛染色(Baso生物技术有限公司)和透射电子显微镜下进行观察，结果发现菌株D2为革兰阴性菌，多数为杆状，两端钝圆，大小约为0.5～1.0μm×2～4μm，不规则散在(图1和图2)；排列极生多鞭毛，菌体的一端有1～4根鞭毛(图3)。

三.D2菌株的生理特征

1.需氧性：D2菌株为专性需氧菌。

2.细菌的生长曲线：

挑取菌株D2的单个菌落，接种入含50mL肉膏蛋白胨液体培养基(0.3％牛肉膏，1.0％蛋白胨，0.5％NaCl，pH 7.2)的三角烧瓶(250mL)中，25℃150rpm恒温摇床摇菌18h作为种子液。另取盛有5mL肉膏蛋白胨(pH8.0)培养液的试管14只，均准确加入50μL(接种量1％)种子液，于25℃恒温摇床150rpm振荡培养分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h后，以空白肉膏蛋白胨培养基调零，测OD₆₀₀。结果见图4。

(1)生长温度曲线：

挑取菌株D2的单个菌落，接入含50mL种子培养液的三角烧瓶(250mL中)，25℃150rpm恒温摇床摇菌18h作为种子液。在5mL的无菌肉膏蛋白胨培养管(pH8.0)中分别准确加入50μL(接种量1％)种子液，分别于5～45℃恒温培养18h(SIM冷冻水浴循环仪)。用空白肉膏蛋白胨培养基调零，测OD600。结果见图5。

(2)细菌的生长pH曲线：

挑取菌株D2的单个菌落，接入含50mL种子培养液的三角烧瓶(250mL中)，25℃150rpm恒温摇床摇菌18h作为种子液。在5mL不同pH5.5～10(.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.5、10)的无菌肉膏蛋白胨培养管中分别准确加入50μL(接种量1％)种子液，于25℃恒温摇床150rpm振荡培养18h。用空白肉膏蛋白胨培养基调零，测OD600。结果见图6。

(3)细菌的生长NaCl耐受曲线

挑取菌株D2的单个菌落，接入含50mL种子培养液的三角烧瓶(250mL中)，25℃150rpm恒温摇床摇菌18h作为种子液。在5mL不同浓度NaCl(0～10％)的无菌肉膏蛋白胨培养管中分别准确加入50μL(接种量1％)种子液，于25℃恒温摇床150rpm振荡培养18h。用空白肉膏蛋白胨培养基调零，测OD600。结果见图7。

四.D2菌株的生化特征

(1)亚胺培南：耐药(R)

(2)靛基质：阴性

(3)O/F葡萄糖： -(产碱型)

(4)分解葡萄糖产酸：阴性

(5)分解麦芽糖产酸：阴性

(6)脲酶：阴性

(7)鸟氨酸脱羧：阴性

(8)赖氨酸脱羧：阴性

(9)β-半乳糖苷酶：阳性

(10)明胶液化：阳性

(11)甘露醇分解：阴性

(12)枸橼酸盐利用：阴性

(13)葡萄糖酸盐氧化：阴性

(14)氧化酶：阴性

(15)触酶：阳性

(16)麦芽糖同化：阳性

(17)葡萄糖同化：阳性

实施例2：D2菌株的16S rRNA基因序列测定和系统发育分析

一.基因组DNA的提取：将菌株D2接种于LB液体培养基(1％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)中过夜培养至对数生长期，用基因组DNA提取试剂盒(Promega公司，货号：#A1120))提取DNA。

1.PCR扩增：

(1)引物设计：正向引物：5’-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3’，反向引物5’-AGTAAGGAGGT GATCCAACCGCA-3’，分别对应于大肠埃希菌(E.coli)16SrRNA基因(GenBank J01695)的第8～27位和第1519～1541位的核苷酸；引物由上海生物工程有限公司合成。

(2)PCR扩增：反应体系(50μL)组成：模板2.0μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，10×PCR缓冲液5μL，MgCl₂(25mmol/L)5.0μL，dNTP(2.5mmol/Leach)5.0μL，引物(10μmol/L)各2.0μL。扩增条件为：94℃6min后，94℃预变性45s，54℃45s，72℃90s，30个循环后72℃延伸10min。

(3)PCR产物的纯化：PCR产物用Wizard PCR preps DNA purificatonsystem(Promega公司，#A7280))纯化。

2.克隆和序列测定：

将经过纯化的PCR产物连接到pGEM-T Easy载体(Promega，#A1360)上，转化E.coli JM109，在含IPTG和X-gal的ALB固体平板上蓝白斑筛阳性重组克隆，提取质粒(OMEGA，D6942)，AB 3730自动测序仪测序。

(1)2菌株的16S rRNA基因序列如下，全长1539bp，GenBank收录号为DQ839619。

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAGTGAACGCTGGCGGTAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACAGTAAGAGCTTGCTCTTATGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATACATCGGAATCTACTTTTTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCCAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCAGCCGGGTAATACCTGGTTGGGATGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTCGTTTAAGTCTGTTGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCAGTGGAAACTGGACGACTAGAGTGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCCATGGCGAAGGCAGCTACCTGGACCAACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCGATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGCGACGGTAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGCAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGCCGCTTGCCACGGTGTGGCCGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGTTGGATCACCTCCTT

二.2菌株的16S rRNA基因序列的系统发育分析

将菌株D216S rRNA基因1539bp的序列输入GenBanK与已收录的细菌基因序列进行BLASTn比较。利用CLUSTAL X(1.83)与其他相关细菌序列进行对比，选用MEGA(3.0)软件Kimura 2-parameter距离模型进行NJ分析生成系统发育树，发育树用Bootstrap法(重复数为1000)检验。

结果显示，与菌株D2的16S rRNA基因序列一致性(identity)最高的为嗜麦寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，其一致性为99％；同时，系统发育分析显示，菌株D2与其他嗜麦寡养单胞菌位于同一分支。结合生化反应结果，充分证明该菌为嗜麦寡养单胞菌。见图8。

一.蛋白酶活性的初步检测

将菌株D2直接点种于奶粉平板(1％脱脂奶粉，1％琼脂)上，室温(25℃)培养48h，观察溶圈大小，结果发现其具有极强的蛋白溶解活性(图9)。

二.菌株D2培养液中蛋白酶的确定

将菌株D2接种到种子培养基(0.3％牛肉膏，1.0％蛋白胨，0.5％NaCl，pH7.2)中25℃摇床150rpm摇菌24h，13000r/min 4℃离心15min，取上清用0.20μm的滤菌器过滤进一步除菌后，进行SDS-PAGE电泳，发现上清液中有一42kD左右的高浓度蛋白(图10-1)。

采用酪蛋白酶图谱法确定42kD蛋白的蛋白酶活性，具体方法如下：制备15％的SDS-聚丙稀酰胺凝胶(含0.8％酪蛋白)。取蛋白酶样品30μL加非还原性载样缓冲液(loading buffer)30μL混合加样进行电泳。电泳后取下凝胶，用蒸馏水冲洗干净后浸入复性缓冲液(renature buffer)，振荡30～60min(期间更换4次缓冲液)后，倒掉复性缓冲液加入孵育缓冲液(Developing buffer)，25℃温浴过夜。然后用考玛斯亮蓝R-250染色液充分染色，脱色后观察。结果显示，该42kD的蛋白具有明显的蛋白酶活性(图10-2)。

实施例3.D2碱性蛋白酶的分离、纯化和酶学特性

一.菌株D2产蛋白酶的时间曲线

将菌株D2接种于种子培养基，25℃摇床150rpm摇菌24h。从种子培养管中取D2菌液100μL接种于150ml培养瓶中。分别于1，2，3，4，5，6，7天后取菌液10mL，10000rpm×15min，取上清液分别用奶粉平板溶圈法和福林酚法测酶活力。结果表明培养48h后酶活力达到最高(图11)。

二.D2蛋白酶的纯化

将菌株D2接种到发酵培养基(0.3％牛肉膏，1.0％蛋白胨，0.5％NaCl，pH7.2)中，摇床培养48h后，13000r/min 4℃离心15min取上清液，80％饱和硫酸铵冰上过夜沉淀。沉淀溶于Tris-Cl缓冲液中(50mM，pH7.0)，同样缓冲液透析24h，先用DEAE-Sepharose FF进行阴离子交换层析，然后用SP-SepharoseFF进行阳离子交换层析，最后经Sephadex G-75分子筛层析后，收集活性组分，SDS-PAGE电泳，凝胶成像系统(UVP GDS-800)分析，结果显示，样品的纯度＞95％。

三.Q-TOF质谱序列分析

将该蛋白酶SDS-PAGE电泳后切胶条送国家生物医学分析中心，经胰蛋白酶胶内酶切，Q-TOF质谱分析获得1个内部氨基酸序列：Ala-Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Tyr-Pro-Leu-Glu-Phe-Val-Val-Gly-Lys，经相关数据库分析证明，该蛋白酶为一新发现的未知蛋白酶。

四.D2蛋白酶活性的最适pH测定

将经过纯化的D2蛋白酶在不同pH下进行酶促反应，Folin酚法测定最适pH。D2蛋白酶与底物酪蛋白在不同pH的缓冲液中40℃作用10min后进行酶活力测定。结果表明：该蛋白酶最适pH为9，在pH7～10范围内，酶活性均维持在最大酶活性的65％以上(图12)。

五.D2蛋白酶活性的最温度测定

酶最适温度测定为在pH9.0的冲液中测定不同温度下(SIM冷冻水浴循环仪)的酶活力。酶的最适温度测定表明该酶的最适温度为60℃(图13)。

序列表

<110>青岛大学

<120>一株产新型碱性蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1539

<212>DNA

<213>Stenotrophomonas maltophilia

<400>1

agagtttgat cctggctcag agtgaacgct ggcggtaggc ctaacacatg caagtcgaac 60

ggcagcacag taagagcttg ctcttatggg tggcgagtgg cggacgggtg aggaatacat 120

cggaatctac tttttcgtgg gggataacgt agggaaactt acgctaatac cgcatacgac 180

ctacgggtga aagcagggga tcttcggacc ttgcgcgatt gaatgagccg atgtcggatt 240

agctagttgg cggggtaaag gcccacccag gcgacgatcc gtagctggtc tgagaggatg 300

accagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 360

attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc cataccgcgt gggtgaagaa ggccttcggg 420

ttgtaaagcc cttttgttgg gaaagaaatc cagccgggta atacctggtt gggatgacgg 480

tacccaaaga ataagcaccg gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata cgaagggtgc 540

aagcgttact cggaattact gggcgtaaag cgtgcgtagg tggtcgttta agtctgttgt 600

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tgcaacgcga agaaccttac ctggccttga catgtcgaga actttccaga gatggattgg 1020

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ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtccttag ttgccagcac gtaatggtgg 1140

gaactctaag gagaccgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc 1200

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cggcgacggt aagccaatcc cagaaaccct atctcagtcc ggattggagt ctgcaactcg 1320

actccatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cagatcagca ttgctgcggt gaatacgttc 1380

ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttt gttgcaccag aagcaggtag 1440

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aggtagccgt atcggaaggt gcggttggat cacctcctt 1539

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

agagtttgat cctggctcag 20

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

agtaaggagg tgatccaacc gca 23

Claims

1. 一株产新型碱性蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌，保藏号为CGMCCNo.1868。

2. 权利要求1所述的嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No.1868用于制备碱性蛋白酶的用途。