CN104894013B

CN104894013B - 七鳃鳗口腔腺寄生菌株lj1、分泌蛋白、分离方法及用途

Info

Publication number: CN104894013B
Application number: CN201510255294.7A
Authority: CN
Inventors: 李庆伟; 肖蓉; 唐敏; 李丽
Original assignee: Liaoning Normal University
Current assignee: Liaoning Normal University
Priority date: 2015-05-19
Filing date: 2015-05-19
Publication date: 2018-04-20
Anticipated expiration: 2035-05-19
Also published as: CN104894013A

Abstract

本发明公开一种七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1（Stenotrophomonas maltophilia ），已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 10680。该菌株所分泌天然蛋白是一种高活性纤溶酶，能够在几秒钟内迅速降解血液中的纤维蛋白原的三条多肽链，从而有效抑制血液凝固及血栓形成；并且还能够通过直接降解纤维蛋白或激活纤溶酶原从而具有溶栓作用；对血液中的其他组分均无明显的降解作用，表明该分泌蛋白具有较强的专一性，在抗血栓类药物领域有较高的应用前景。

Description

七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1、分泌蛋白、分离方法及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种分泌蛋白活性高，即能够同时降解纤维蛋白原Aα链、 Bβ链和γ链，又能够降解纤维蛋白的七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1、分泌蛋白、分离方法及用途。

背景技术

随着人类平均寿命的延长、生活环境以及膳食习惯的变化，心、脑血管疾病的发病率、死亡率和致残率正逐年增高。最常见的是血栓性心脑血管疾病，通常表现为心肌梗死、脑卒中以及周围血管病变。据世界卫生组织统计，全球每年平均有1700万人被心脑血管血栓疾病夺走生命，占世界总死亡人数的30%。市场上对预防和治疗血栓性疾病药物的需求量已呈现出逐年增长之势。纤维蛋白原和纤维蛋白是凝血级联反应过程中两个关键的底物蛋白质。目前，研究人员已从蛇的毒腺、吸血动物的唾液腺、植物以及细菌中分离得到了多种具有纤溶活性的水解酶—纤溶酶，用于制备抗凝溶栓药物。但是现有纤溶酶活性较低，只能降解纤维蛋白原，多数对纤维蛋白并无作用。且大多只能降解纤维蛋白原的Aα链和Bβ链，基本不降解纤维蛋白原的γ链。只有来源于真菌（Pleurotus ostreatus）、植物(Carica candamarcensis)、蜜蜂毒腺（Conus ermineus）和粉正蚓（Lumbricus rubellus）的蛋白酶才能够全部降解纤维蛋白原Aα链、 Bβ链和γ链。

发明内容

本发明为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种分泌蛋白活性高，即能够同时降解纤维蛋白原Aα链、 Bβ链和γ链，又能够降解纤维蛋白的七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1、分泌蛋白、分离方法及用途。

本发明的技术解决方案是：一种七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1（Stenotrophomonas maltophilia ），已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 10680。

一种上述七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1的分泌蛋白，其特征在于其cDNA序列及氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。

一种上述七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1的分离方法，其特征在于按照如下步骤进行：

a.取七鳃鳗口腔腺分泌液；

b.用pH 7.4、含有50 mM NaCl 的50 mM Tris-HCl将分泌液稀释100倍，

然后涂LB平板于37℃恒温培养过夜；

c. 从LB平板上挑取单克隆菌落于含有5 ml LB的培养基中，28℃摇床中培养12~48 h。

一种上述七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1的分泌蛋白在制备抗血栓类药物中的应用。

本发明从七鳃鳗口腔腺分泌液中分离得到具有高纤溶活性的菌株，属于嗜麦芽寡养单胞菌，菌株代码LJ1，拉丁文学名Stenotrophomonas maltophilia ，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 10680，菌种保藏日期：2015年4月2日。该菌株所分泌天然蛋白是一种高活性纤溶酶，能够在几秒钟内迅速降解血液中的纤维蛋白原的三条多肽链，从而有效抑制血液凝固及血栓形成；并且还能够通过直接降解纤维蛋白或激活纤溶酶原从而具有溶栓作用；对血液中的其他组分均无明显的降解作用，表明该分泌蛋白具有较强的专一性，在抗血栓类药物领域有较高的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例分泌蛋白的纤维蛋白原水解酶活性效果示意图。

图2是本发明实施例分泌蛋白的纤维蛋白水解酶活性检测效果图。

菌种保藏日期：2015-04-02。

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。

菌种保藏代号：CGMCC 10680。

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

具体实施方式

七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1的分离：

a. 在中国黑龙江省松花江同江流域捕获处于洄游期的成体日本七鳃鳗数条，在无菌条件下剥离位于眼眶下、口腔内、呈豆子形状的口腔腺体，将腺体内的液体（分泌液）抽出；

b. 无菌条件下，将分泌液用无菌的、含有50 mM NaCl 的50 mM Tris-HCl（pH7.4）稀释100倍，然后涂LB平板于37℃恒温培养过夜；

c.从LB平板上挑取单克隆菌落于含有5 ml LB的培养基中，于28℃摇床中培养12~48h，获得菌株。

对所获得菌株进行了16S rDNA鉴定、生理生化性质分析及菌株的保存。

该菌株的16S rDNA如SEQ ID NO：1 所示，属于嗜麦芽寡养单胞菌，菌株代码LJ1，拉丁文学名Stenotrophomonas maltophilia ，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 10680，菌种保藏日期：2015年4月2日。

七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1分泌蛋白的制备：

采用硫酸铵沉淀富集活性菌株上清，经透析及冷冻干燥后，运用离子交换层析（DEAE-Sephadex）/疏水层析（Phenyl Sepharose ^TM CL-4B）分离纯化得到电泳纯蛋白；经质谱鉴定、N末端测序及基因克隆方法获得该蛋白的cDNA序列。BCA法测定分泌蛋白质的浓度；12%十二烷基磺酸钠聚丙酰胺凝胶电泳和质谱检测目的蛋白质的纯度。

七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1分泌蛋白的开放阅读框序列为1854 bp长，蛋白质有617个氨基酸组成，其cDNA序列及由其推导的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。

实验：

1．本发明实施例分泌蛋白的纤维蛋白原水解酶活性实验：

将人纤维蛋白原（2.5mg/ml）与本发明实施例的分泌蛋白（10μg）于37℃反应，并于10秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟和30分钟时取样，采用12%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。结果如图1所示：1，纤维蛋白原对照；2-9依次为本发明实施例的分泌蛋白与纤维蛋白原反应时间为10秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟和30分钟结果。结果表明当本发明实施例分泌蛋白与纤维蛋白原反应10秒时，大部分纤维蛋白原的Aα链已发生降解；小部分的Bβ链发生降解；反应时间为30秒时，Aα链已完全被降解；反应时间为2分钟时，Bβ链被完全降解；反应时间为10分钟时，γ链开始发生降解；反应时间为15分钟时，该分泌蛋白对纤维蛋白原γ链的降解反应已达到平衡，在35 kDa-45 kDa之间产生很明显的降解带。

2．纤维蛋白平板法检测本发明实施例分泌蛋白的纤维蛋白水解酶活性及纤溶酶原激活剂活性。

纤维蛋白平板法是目前最为经典的测定纤溶酶活力的方法，其原理是利用凝血酶引起纤维蛋白原形成纤维蛋白制成平板以检测纤维蛋白水解酶活性。以标准蚓激酶和标准尿激酶作为对照，测定本发明分泌蛋白的纤维蛋白水解酶活性。

缓冲液A 20 mM Tris-HCl，pH 8.0

缓冲液B 20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 8.0

琼脂糖溶液 75 mg/mL溶于缓冲液B

纤维蛋白原溶液 50 mg/mL溶于缓冲液A

凝血酶 200 U/mL溶于缓冲液A

纤溶酶原溶液 60 U/mL溶于缓冲液A

a. 琼脂糖溶液100 mL在微波炉中加热溶解，在60℃的水浴中至少保温25分钟；

b. 迅速加入15.0 mL的纤维蛋白原溶液，0.5 mL凝血酶溶液和1.0 mL的纤溶酶原溶液，轻轻晃动混匀；

c. 将混合液迅速倒入8块灭菌的塑料平皿中（＝5.0 cm），待其冷却凝固后，于4℃下保存备用，此平板为富含纤溶酶原的平板，记为阳性板（＋）；

d. 制作不含纤溶酶原的阴性（－）平板时，不加纤溶酶原溶液；为避免市售的纤维蛋白原中可能含有的纤溶酶原，将制好的平板须放在80℃下灭活30分钟；

e. 测活时，在平板上打孔，加入待测样品，37℃下温箱保温16小时后取出观察是否有溶圈出现。

结果如图2所示：图2中A：不含有纤溶酶原的纤维蛋白平板（阴性）。B：含有纤溶酶原的纤维蛋白平板（阳性）。1，尿激酶（25 U）；2，蚓激酶（2 U）；3，本发明实施例分泌蛋白（10μg）。

显示：在不含有纤溶酶原的纤维蛋白平板上（阴性纤维蛋白平板），本发明实施例分泌蛋白能够像蚓激酶（阳性对照）一样在阴性纤维蛋白平板上形成明显的纤维蛋白溶圈，表明该组分能够直接水解纤维蛋白；此时，尿激酶由于需要通过依赖激活纤溶酶原从而在纤维蛋白平板上形成溶圈，因此不能在阴性纤维蛋白平板上形成溶圈。在含有纤溶酶原的纤维蛋白平板上（阳性纤维蛋白平板），本发明实施例分泌蛋白依然能够在阳性纤维蛋白平板上形成纤维蛋白溶圈，表明其具有纤维蛋白水解酶活性。此外，阳性纤维蛋白平板上的溶圈面积比阴性纤维蛋白平板上的溶圈面积大，提示本发明实施例分泌蛋白还具有激活纤溶酶原的活性。

SEQUENCE LISTING

<110> 辽宁师范大学

<120> 七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1、分泌蛋白、分离方法及用途

<130> 2015

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1537

<212> DNA

<213> Stenotrophomonas maltophilia

<400> 1

cagagtttga tcctggctca gagtgaacgc tggcggtagg cctaacacat gcaagtcgaa 60

cggcagcaca ggggagcttg ctccttgggt ggcgagtggc ggacgggtga ggaatacatc 120

ggaatctact ctgtcgtggg ggataacgta gggaaactta cgctaatacc gcatacgacc 180

tacgggtgaa agcaggggat cttcggacct tgcgcgattg aatgagccga tgtcggatta 240

gctagttggc ggggtaaagg cccaccaagg cgacgatccg tagctggtct gagaggatga 300

tcagccacac tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 360

ttggacaatg ggcgcaagcc tgatccagcc ataccgcgtg ggtgaagaag gccttcgggt 420

tgtaaagccc ttttgttggg aaagaaatcc agccggctaa tacctggttg ggatgacggt 480

acccaaagaa taagcaccgg ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac gaagggtgca 540

agcgttactc ggaattactg ggcgtaaagc gtgcgtaggt ggtcgtttaa gtccgttgtg 600

aaagccctgg gctcaacctg ggaactgcag tggatactgg acgactagag tgtggtagag 660

ggtagcggaa ttcctggtgt agcagtgaaa tgcgtagaga tcaggaggaa catccatggc 720

gaaggcagct acctggacca acactgacac tgaggcacga aagcgtgggg agcaaacagg 780

attagatacc ctggtagtcc acgccctaaa cgatgcgaac tggatgttgg gtgcaatttg 840

gcacgcagta tcgaagctaa cgcgttaagt tcgccgcctg gggagtacgg tcgcaagact 900

gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agtatgtggt ttaattcgat 960

gcaacgcgaa gaaccttacc tggccttgac atgtcgagaa ctttccagag atggattggt 1020

gccttcggga actcgaacac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1080

tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgtccttagt tgccagcacg taatggtggg 1140

aactctaagg agaccgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca 1200

tggcccttac ggccagggct acacacgtac tacaatggta gggacagagg gctgcaagcc 1260

ggcgacggta agccaatccc agaaacccta tctcagtccg gattggagtc tgcaactcga 1320

ctccatgaag tcggaatcgc tagtaatcgc agatcagcat tgctgcggtg aatacgttcc 1380

cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtttg ttgcaccaga agcaggtagc 1440

ttaaccttcg ggagggcgct tgccacggtg tggccgatga ctggggtgaa gtcgtaacaa 1500

ggtagccgta tcggaaggtg cggctggatc acctcct 1537

<210> 2

<211> 1854

<212> DNA

<213> Stenotrophomonas maltophilia

<400> 2

1 gtg atc aag aag cag aac ctt cgc atc aat gtg ctt gcc gcc gcc 45

1 Met Ile Lys Lys Gln Asn Leu Arg Ile Asn Val Leu Ala Ala Ala 15

46 gtg ctg tcg atg acg gct gtc ggt gcc gtc cac gct gct gga ctg 90

16 Val Leu Ser Met Thr Ala Val Gly Ala Val His Ala Ala Gly Leu 30

91 ccg acc cgt gag ccg gtg cgc cag gcc agt acc gcc caa ccg ggg 135

31 Pro Thr Arg Glu Pro Val Arg Gln Ala Ser Thr Ala Gln Pro Gly 45

136 gcc gag cgc atc atc gtc aag tac cgt gcc ggc gct gct gcc gcc 180

46 Ala Glu Arg Ile Ile Val Lys Tyr Arg Ala Gly Ala Ala Ala Ala 60

181 acc gac cgc tcg gcg aag ctg tcc acc gtg cag tcc gca ctg acc 225

61 Thr Asp Arg Ser Ala Lys Leu Ser Thr Val Gln Ser Ala Leu Thr 75

226 cgt gcc agc ctc tcc ggc ggc acc tcc cgc gcc agt acc ctc ggc 270

76 Arg Ala Ser Leu Ser Gly Gly Thr Ser Arg Ala Ser Thr Leu Gly 90

271 ccg cag gtg gtg cgc aag ctg tcg acc ggt gcg gac ctc atc cgt 315

91 Pro Gln Val Val Arg Lys Leu Ser Thr Gly Ala Asp Leu Ile Arg 105

316 gtg cag ggg cgc ctg gcc ccg gcc gag ctg cag cgc gta ctg aag 360

106 Val Gln Gly Arg Leu Ala Pro Ala Glu Leu Gln Arg Val Leu Lys 120

361 gag ctg aag gcc gac ccg tcg gtg cag tac gcc gag gcc gat gtg 405

121 Glu Leu Lys Ala Asp Pro Ser Val Gln Tyr Ala Glu Ala Asp Val 135

406 aag ctg cgc cgt acc gag ctg cgt gcc ggt gac gtg cag ccg gcg 450

136 Lys Leu Arg Arg Thr Glu Leu Arg Ala Gly Asp Val Gln Pro Ala 150

451 ctg gcg ccg aat gat ccc tac tac cag cag tac cag tgg cac ctg 495

151 Leu Ala Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Gln Gln Tyr Gln Trp His Leu 165

496 cac aac gcc acc ggc ggc atc aac gca ccg tcg gcg tgg gat gta 540

166 His Asn Ala Thr Gly Gly Ile Asn Ala Pro Ser Ala Trp Asp Val 180

541 tcg cag ggc gaa ggc gtg gtg gtg gcg gta ctc gac acc ggt atc 585

181 Ser Gln Gly Glu Gly Val Val Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile 195

586 ctg ccg cag cac ccg gac ctg gtc ggc aac ctg ctg gaa ggc tac 630

196 Leu Pro Gln His Pro Asp Leu Val Gly Asn Leu Leu Glu Gly Tyr 210

631 gac ttc atc agc gat gcc gag acg tcg cgc cgt gcc acc aac gat 675

211 Asp Phe Ile Ser Asp Ala Glu Thr Ser Arg Arg Ala Thr Asn Asp 225

676 cgc gtg ccg ggc gcg cag gat tat ggc gac tgg gtc gag aac gac 720

226 Arg Val Pro Gly Ala Gln Asp Tyr Gly Asp Trp Val Glu Asn Asp 240

721 aac gag tgc tac acc ggc tcc gtc gcc gag gac agc tcc tgg cac 765

241 Asn Glu Cys Tyr Thr Gly Ser Val Ala Glu Asp Ser Ser Trp His 255

766 ggt acc cat gtg gcc ggt acc gtg gcc gag cag acc aac aac ggc 810

256 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Glu Gln Thr Asn Asn Gly 270

811 gtc ggc atg gcc ggt gtc gcg cac aag gcc aag gtg ctg ccg gtc 855

271 Val Gly Met Ala Gly Val Ala His Lys Ala Lys Val Leu Pro Val 285

856 cgc gtg ctc ggc aag tgc ggt ggc tac ctt tcc gat atc gcc gac 900

286 Arg Val Leu Gly Lys Cys Gly Gly Tyr Leu Ser Asp Ile Ala Asp 300

901 gcc atc acc tgg gcg tct ggc ggc acg gtg gcc ggc gta ccc gcc 945

301 Ala Ile Thr Trp Ala Ser Gly Gly Thr Val Ala Gly Val Pro Ala 315

946 aat acc aac ccg gcc gag gtc atc aac atg agc ctc ggc ggc agc 990

316 Asn Thr Asn Pro Ala Glu Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ser 330

991 ggc agc tgc gac ggg acc tac cag gat gcg atc aac ggc gcg atc 1035

331 Gly Ser Cys Asp Gly Thr Tyr Gln Asp Ala Ile Asn Gly Ala Ile 345

1036 tcg cgg ggc acc acc gtg gtc gtg gcc gca ggc aac gag acc gac 1080

346 Ser Arg Gly Thr Thr Val Val Val Ala Ala Gly Asn Glu Thr Asp 360

1081 aac gcc tcc aag tac cgc cca gcc agt tgc gac ggc gtg gtg acc 1125

361 Asn Ala Ser Lys Tyr Arg Pro Ala Ser Cys Asp Gly Val Val Thr 375

1126 gtc ggc gcc acc cgc atc acc ggc ggg atc acc tac tac tcg aac 1170

376 Val Gly Ala Thr Arg Ile Thr Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ser Asn 390

1171 tac ggc acc cgt gtg gac ctg tcc ggt ccg ggc ggt ggc ggc agt 1215

391 Tyr Gly Thr Arg Val Asp Leu Ser Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser 405

1216 gtg gac ggc aat ccg ggc ggc tac gtc tgg cag tcc ggc tcc gat 1260

406 Val Asp Gly Asn Pro Gly Gly Tyr Val Trp Gln Ser Gly Ser Asp 420

1261 gcg gcc acc acc ccg gag tcg ggc agc tac agc tac atg ggc atg 1305

421 Ala Ala Thr Thr Pro Glu Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Met Gly Met 435

1306 ggc ggc acg tcg atg gcc tcg ccg cac gtg gct gct gtt gct gca 1350

436 Gly Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Ala Val Ala Ala 450

1351 ctg gtg cag agc gcg ctg atc gcc aag ggc aag gat ccg ctg gcc 1395

451 Leu Val Gln Ser Ala Leu Ile Ala Lys Gly Lys Asp Pro Leu Ala 465

1396 ccg gcc gcg atg cgc acc ctg ctg aag gag acc gcg cgt ccg ttc 1440

466 Pro Ala Ala Met Arg Thr Leu Leu Lys Glu Thr Ala Arg Pro Phe 480

1441 ccg gtc gcc att ccg gca gcc acc ccg atc ggt acc ggt att ctc 1485

481 Pro Val Ala Ile Pro Ala Ala Thr Pro Ile Gly Thr Gly Ile Leu 495

1486 gat gcc aag gcc gcg ctg gcc aag gca ctg gaa gaa ccg tgc acc 1530

496 Asp Ala Lys Ala Ala Leu Ala Lys Ala Leu Glu Glu Pro Cys Thr 510

1531 gag aac tgc ggg ccg gtg gcc acg ccg ctg acc aac aag gct gcc 1575

511 Glu Asn Cys Gly Pro Val Ala Thr Pro Leu Thr Asn Lys Ala Ala 525

1576 gtc ggt ggc ctg aat ggt gct gcc gcc agc agc cgc ctg tac agc 1620

526 Val Gly Gly Leu Asn Gly Ala Ala Ala Ser Ser Arg Leu Tyr Ser 540

1621 ttc gaa gcc gtc gcc ggc aag cag ctc agc gtg atc acc tac ggt 1665

541 Phe Glu Ala Val Ala Gly Lys Gln Leu Ser Val Ile Thr Tyr Gly 555

1666 ggc acc ggc aac gtg tcg gtc tac atc gcc cag gga cgc gag ccg 1710

556 Gly Thr Gly Asn Val Ser Val Tyr Ile Ala Gln Gly Arg Glu Pro 570

1711 agc gcc agc gac aac gac ggc aag tcg acc cgt cct ggc acg tcc 1755

571 Ser Ala Ser Asp Asn Asp Gly Lys Ser Thr Arg Pro Gly Thr Ser 585

1756 gaa acg gtg cgg gtg aac aag ccg gtg gcc ggc acc tac tac atc 1800

586 Glu Thr Val Arg Val Asn Lys Pro Val Ala Gly Thr Tyr Tyr Ile 600

1801 aag gtg gtg ggc gag gcg gcc tac aac ggc gtg agc atc ctt gcc 1845

601 Lys Val Val Gly Glu Ala Ala Tyr Asn Gly Val Ser Ile Leu Ala 615

1846 acg cag taa 1854

616 Thr Gln * 617

Claims

1.一种七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1（Stenotrophomonas maltophilia），已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 10680。

2.一种如权利要求1所述七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1的分泌蛋白，其特征在于其cDNA序列及氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。

3.一种如权利要求2所述七鳃鳗口腔腺寄生菌株LJ1的分泌蛋白在制备溶血栓纤维蛋白药物中的应用。