CN110423739A - 一种茶树菇纤溶酶及其制备方法 - Google Patents

一种茶树菇纤溶酶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种茶树菇纤溶酶及其制备方法，涉及生物工程技术领域，所述茶树菇纤溶酶由两个亚基A和B组成，亚基A的分子量为31.4kDa；亚基B的分子量为21.2kDa；亚基A的N端的十二个氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；亚基B的N端的十二个氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明提供的纤溶酶最适作用温度为47℃；在人体生理pH时能保存较好的活性，不同浓度Fe2+对茶树菇纤溶酶表现出明显的抑制作用；具有良好的溶栓性能，使用上安全性好，制作成本低廉，为在制备溶栓药物和/或功能食品中的应用提供了一定的研究基础，也为茶树菇的综合利用提供了一个新途径。

Description

一种茶树菇纤溶酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种茶树菇纤溶酶及其制备方法。
背景技术
血栓类疾病严重威胁着人类的生命与健康，其致残率和致死率逐年升高，是导致当今人类死亡的主要原因之一。溶栓法是目前治疗和预防血栓性疾病的主要手段，目前应用于临床治疗的溶栓药物疗效肯定，但还存在许多缺陷，且价格昂贵。因此，研制高效、快速、防止再栓塞且降低副作用的新型溶栓药物是现代医学的迫切需要，从自然界各种生物资源中开发新型溶栓物质是溶栓剂产品开发的重要途径。
茶树菇(Agrocybe aegerita)属担子菌门，伞菌纲，伞菌亚纲，伞菌目，球盖菇科，田头菇属真菌，又名柱状田头菇、杨树菇、茶薪菇等。茶树菇富含人体所需的氨基酸和微量元素，并含有抗癌活性的多糖。茶树菇味道鲜美，有滋阳壮阴、美容养颜的功效，对肾虚、水肿、风湿等有独特疗效，对抗癌、抗氧化、降压降脂等有较理想的治疗功能，是传统的药食同源真菌，具有重要的医用价值，是一种亟待开发的重要资源。
近十余年时间，本申请人团队一直致力于微生物源纤溶酶的制备、分离纯化及其功能性研究，突破性的从蛹虫草和好食脉孢菌中分离出4种新纤溶酶，授权了相关发明专利4项，其授权号分别为ZL201510159992.7、ZL201010204473.5、ZL200910072630.9、ZL200810137564.4。这4种纤溶酶均是通过真菌发酵方式制得的，真菌发酵代谢产物较多，导致纤溶酶的后续分离纯化的步骤较多，过多的分离纯化步骤会降低纤溶酶的活力，导致纤溶效果下降，近年来申请人一直在努力寻找成分不复杂的新来源纤溶酶，易于后续的分离纯化。申请人团队通过筛选发现大多数食用菌中均含有纤溶酶，其中以茶树菇中纤溶酶含量较高，达2780.05±34.32U/g(以干重计)，值得注意的是，国内外相关研究中还未有关于从茶树菇中提取纤溶酶的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种茶树菇纤溶酶及其制备方法。本发明提供的茶树菇纤溶酶最适作用温度为47℃；在人体生理pH时能保存较好的活性，不仅具备良好的溶栓效果、而且使用上安全性好，易于人体吸收、制作成本低廉，具有开发应用的前景。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种茶树菇纤溶酶，所述茶树菇纤溶酶由两个亚基A和B组成，所述亚基A的分子量为31.4kDa；所述亚基B的分子量为21.2kDa；所述亚基A的N端的十二个氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述亚基B的N端的十二个氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供上述技术方案所述的茶树菇纤溶酶的制备方法，包括：用生理盐水浸提茶树菇子实体，得到浸提液；将所述浸提液进行固液分离，得到的粗酶液依次进行盐析、凝胶色谱、弱阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱和强阳离子交换色谱分离，得到茶树菇纤溶酶。
优选地，所述茶树菇子实体的质量与生理盐水的体积比为1kg:(8～12)L。
优选地，所述浸提的条件包括：浸提的时间为5～7h，浸提的温度为3～5℃。
优选地，所述凝胶色谱柱分离条件包括：洗脱液为0.01～0.03mol/L PBS缓冲溶液，流速为4～6mL/min；所述洗脱液的pH值为6.0。
优选地，所述弱阳离子交换色谱分离采用线性洗脱，起始缓冲溶液为0.01～0.03mol/LPBS缓冲溶液，洗脱液为含有0.8～1mol/L NaCl的0.01～0.03mol/LPBS缓冲溶液；所述缓冲溶液的pH值独立的为6.0；所述流速独立的为1～3mL/min。
优选地，所述疏水相互作用色谱分离采用线性洗脱，起始缓冲溶液为0.01～0.03mol/LPBS缓冲溶液，洗脱液为含有硫酸铵饱和度10％的0.01～0.03mol/LPBS缓冲溶液；所述缓冲溶液的pH值独立的为7.4。
优选地，所述强阳离子交换色谱分离采用线性洗脱，起始缓冲溶液为0.01～0.03mol/LPBS缓冲溶液，洗脱液为含有0.8～1mol/L NaCl的0.01～0.03mol/LPBS缓冲溶液；所述缓冲溶液的pH值独立的为5.5。
本发明提供了一种茶树菇纤溶酶及其制备方法。本发明提供的茶树菇纤溶酶最适作用温度为47℃；在人体生理pH时能保存较好的活性；Fe3+、K+和Zn2+对该酶有明显的保护作用，而不同浓度Fe2+对茶树菇纤溶酶表现出明显的抑制作用；不但可以直接降解血纤维蛋白，还可以激活纤溶酶原间接降解血纤维蛋白，且可以顺次降解人血纤维蛋白原的α、β和γ链，具有良好的溶栓效果。本发明提供的制备方法简单，制备成本低廉。
本发明提供的茶树菇纤溶酶适宜在人体生理pH下发挥作用，实施例中的试验证明本发明提供的茶树菇纤溶酶具有良好的溶栓性能，不仅能独立溶栓，还能够激活纤溶酶原间接溶栓，无明显的急性毒性，因而具有开发应用的前景，也为稀薄的纤溶酶家族增添了一名新成员。本发明为该茶树菇纤溶酶在制备溶栓药物和/或功能食品中的应用提供了一定的研究基础，也为茶树菇的综合利用提供了一个新途径。
附图说明
图1为实施例1茶树菇纤溶酶溶解血纤维蛋白作用图；
图2为实施例1SDS-PAGE法验证茶树菇纤溶酶对人血纤维蛋白原降解图。
具体实施方式
本发明提供了一种茶树菇纤溶酶，所述茶树菇纤溶酶由两个亚基A和B组成，所述亚基A的分子量为31.4kDa；所述亚基B的分子量为21.2kDa；所述亚基A的N端的十二个氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述亚基B的N端的十二个氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
在本发明中，所述茶树菇纤溶酶的相对分子质量为52kDa左右。
在本发明中，所述SEQ ID No.1的序列如下所示：S-N-A-D-G-N-G-H-G-T-H-V。在本发明中，所述SEQ ID No.2的序列如下所示：A-I-V-T-Q-T-N-A-P-W-G-L。
本发明还提供上述技术方案所述的茶树菇纤溶酶的制备方法，包括：用生理盐水浸提茶树菇子实体，得到浸提液；将所述浸提液进行固液分离，得到的粗酶液依次进行盐析、凝胶色谱、弱阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱和强阳离子交换色谱分离，得到茶树菇纤溶酶。
在本发明中，所述茶树菇子实体优选将茶树菇子实体晾晒后进行粉碎后得到。本发明对所述粉碎的方法没有特殊限定，采用常规粉碎方法即可。本发明对所述茶树菇子实体的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明实施例中，所述茶树菇子实体优选购置于古田县天鲜农产品有限公司，地址为古田县凤都镇双珠村凤林路75号，商品条形码为6951370108152。
在本发明中，所述茶树菇子实体粉末的质量与生理盐水的体积比优选为1kg:(8～12)L，更优选为1kg:10L。在本发明中，所述浸提的时间优选为5～7h，更优选为6h。在本发明中，所述浸提的温度优选为3℃～5℃，更优选为4℃。
本发明对所述固液分离的方法没有特殊限定，采用常规固液分离方法即可。在本发明实施例中，优选采用离心的方法进行固液分离，所述离心的转速优选为8000～12000r/min，更优选为10000r/min；所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min。
在本发明中，所述上清液进行盐析优选采用硫酸铵进行盐析，所述盐析的环境温度优选为3℃～5℃，更优选为4℃；所述盐析的时间优选为10h～14h，更优选为12h。在本发明中，所述盐析的目的是为了去除杂蛋白。
在本发明中，所述上清液经盐析后，优选经过固液分离后，将得到的沉淀经PBS缓冲液溶解后，再进行凝胶色谱分离。在本发明中，所述凝胶色谱柱优选为Sephadex G-25凝胶色谱柱。在本发明中，所述凝胶色谱柱分离条件优选包括：洗脱液为0.01～0.03mol/L的PBS缓冲溶液；所述流速优选为4～6mL/min，更优选为6mL/min；所述洗脱液的pH值优选为6.0。在本发明中，所述洗脱液优选为0.02mol/L的PBS缓冲溶液。在本发明中，采用凝胶色谱分离的目的是为了脱色和脱除多余的硫酸铵盐。
本发明优选将所述凝胶色谱分离得到的活性成分再进行弱阳离子交换色谱分离。在本发明中，所述弱阳离子交换色谱柱优选为CM-Sepharose Fast Flow弱阳离子交换色谱柱。在本发明中，所述弱阳离子交换色谱柱分离优选采用线性洗脱，所述起始缓冲溶液优选为0.01～0.03mol/L的PBS缓冲溶液，更优选为0.02mol/L的PBS缓冲溶液，洗脱液为含有0.8～1mol/LNaCl的0.01～0.03mol/LPBS缓冲溶液，优选为含0.8mol/LNaCl的0.02mol/L PBS溶液；所述缓冲溶液的pH值独立的优选为6.0；所述流速独立的优选为1～3mL/min，更优选为2mL/min。
本发明优选将所述弱阳离子交换色谱分离得到的活性组分再进行疏水相互作用色谱分离。在本发明中，所述疏水相互作用色谱分离柱优选为Source 15PHE疏水相互作用色谱柱。在本发明中，所述疏水相互作用色谱柱分离优选采用线性洗脱，所述起始缓冲溶液优选为0.01～0.03mol/L的PBS缓冲溶液，更优选为0.02mol/L的PBS缓冲溶液，洗脱液为含有硫酸铵饱和度10％的0.01～0.03mol/L PBS缓冲溶液，优选为含有硫酸铵饱和度10％的0.02mol/L PBS缓冲溶液；所述缓冲溶液的pH值独立的优选为7.4。
本发明优选将所述疏水相互作用色谱分离得到的活性组分再进行强阳离子交换色谱分离。在本发明中，所述强阳离子交换色谱分离柱优选为Mono S 5/50强阳离子交换色谱柱。在本发明中，所述强阳离子交换色谱分离优选采用线性梯度洗脱，所述起始缓冲溶液优选为0.01～0.03mol/L的PBS缓冲溶液，更优选为0.02mol/L的PBS缓冲溶液，洗脱液为含有0.7～0.9mol/LNaCl的0.01～0.03mol/L PBS缓冲溶液，优选为0.8mol/LNaCl的0.02mol/L PBS缓冲溶液；所述缓冲溶液的pH值独立的优选为5.5。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
茶树菇纤溶酶的制备
1)、粗酶液的制备：茶树菇子实体晾晒粉碎，取茶树菇子实体粉末以1：10(w/v)比例加入0.9％生理盐水，4℃下浸提6h，4℃、10000r/min离心15min，取上清液备用；
2)、取离心后上清液调整其硫酸铵饱和度至80％，4℃盐析过夜，在4℃、10000r/min条件下离心15min，弃去上清，沉淀用50mL 0.02mol/L PBS(pH6.0)缓冲溶液溶解，4℃备用；
3)、凝胶色谱脱盐脱色分离：将盐析后的酶溶液经Sephadex G-25凝胶色谱柱进行分离，洗脱液为0.02mol/L PBS(pH6.0)缓冲溶液，流速6mL/min，收集活性组分；
4)、弱阳离子交换色谱分离：将上述3)活性组分经CM-Sepharose Fast Flow弱阳离子交换色谱柱进行分离，起始缓冲溶液为0.02mol/L PBS(pH6.0)缓冲溶液，洗脱液为含0.8mol/L NaCl的0.02mol/LPBS(pH6.0)，然后用3倍柱体积的起始缓冲溶液和3倍柱体积的洗脱液按照NaCl浓度递增的方向进行线性洗脱，流速2mL/min，收集活性组分；
5)、疏水相互作用色谱分离：将上述4)活性组分经Source 15PHE疏水相互作用色谱进行分离，采用线性洗脱方式，起始缓冲溶液为含硫酸铵饱和度10％的0.02mol/L PBS(pH7.4)缓冲溶液，洗脱液为0.02mol/L PBS(pH7.4)缓冲溶液，上样后用3倍柱体积的起始缓冲溶液和3倍柱体积的洗脱液按照硫酸铵饱和度10％-0线性洗脱，收集活性组分；
6)、强阳离子交换色谱分离：将上述5)活性组分经Mono S 5/50强阳离子交换色谱进行分离，起始缓冲溶液为0.02mol/LPBS(pH5.5)缓冲溶液，洗脱液为含0.8mol/LNaCl的0.02mol/LPBS(pH5.5)缓冲溶液。上样后用5倍柱体积的起始缓冲溶液和5倍柱体积的洗脱液按照NaCl浓度递增的方向进行线性洗脱，收集活性组分。得到所述茶树菇茶树菇纤溶酶。
实施例2
测定分离纯化后的实施例1的茶树菇纤溶酶的性质。采用血纤维蛋白平板法测定相关酶学性质。
实施例1制备的茶树菇纤溶酶是由两个亚基组成，两个亚基的分子量分别为31.4kDa和21.2kDa；最适作用温度为47℃；在人体生理pH时能保存较好的活性，在中性碱性环境比在酸性环境稳定；Fe3+、K+和Zn2+对该酶有明显的保护作用，而不同浓度Fe2+对茶树菇纤溶酶表现出明显的抑制作用。该酶不但可以直接降解血纤维蛋白，还可以激活纤溶酶原间接降解血纤维蛋白；可以顺次降解人血纤维蛋白原的α、β和γ链；Edman降解法测得两个亚基的N端十二个氨基酸序列分别为：①S-N-A-D-G-N-G-H-G-T-H-V、②A-I-V-T-Q-T-N-A-P-W-G-L。
实施例3
实施例1制备的茶树菇纤溶酶的纤溶活性
采用血纤维蛋白平板法检验此酶对血纤维蛋白的溶解性。
A血纤维蛋白平板法
血纤维蛋白平板含有血纤维蛋白原(市售的血纤维蛋白原中可能含有纤维蛋白)和凝血酶，可溶性的纤维蛋白原在凝血酶的作用下形成纤维蛋白单体，纤维蛋白单体自发缔结，多聚化形成可见的血纤维蛋白凝胶，将茶树菇纤溶酶液加到此平板凝胶表面，经过短时间的培养后，茶树菇纤溶酶即可将血纤维蛋白溶解，在平板凝胶表面形成肉眼可见的透明圈，如图1。
B SDS-PAGE电泳法
将实施例1制得的茶树菇纤溶酶和人血纤维蛋白原等体积混合均匀，37℃水浴反应，用SDS-PAGE法检测茶树菇纤溶酶降解人血纤维蛋白原，降解图谱见图2(从左至右泳道依次为人血纤维蛋白原、茶树菇纤溶酶与血纤维蛋白原混合后作用1min、3min、10min、20min、30mim、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h)。1min后α链就完全降解，10min后β链完全降解，2h后γ链降解完全，这一降解顺序与人纤溶酶降解纤维蛋白原的情况相同。
由此可知，本发明的茶树菇纤溶酶可以溶解血纤维蛋白；可以顺次降解人血纤维蛋白原的α、β和γ链。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 齐齐哈尔大学
<120> 一种茶树菇纤溶酶及其制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Asn Ala Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Ile Val Thr Gln Thr Asn Ala Pro Trp Gly Leu
1 5 10

Claims (8)

1.一种茶树菇纤溶酶，其特征在于，所述茶树菇纤溶酶由两个亚基A和B组成，所述亚基A的分子量为31.4kDa；所述亚基B的分子量为21.2kDa；所述亚基A的N端的十二个氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述亚基B的N端的十二个氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的茶树菇纤溶酶的制备方法，其特征在于，包括：用生理盐水浸提茶树菇子实体，得到浸提液；将所述浸提液进行固液分离，得到的粗酶液依次进行盐析、凝胶色谱、弱阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱和强阳离子交换色谱分离，得到茶树菇纤溶酶。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述茶树菇子实体的质量与生理盐水的体积比为1kg:(8～12)L。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述浸提的条件包括：浸提的时间为5～7h，浸提的温度为3～5℃。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱分离条件包括：洗脱液为0.01～0.03mol/L PBS缓冲溶液，流速为4～6mL/min；所述洗脱液的pH值为6.0。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述弱阳离子交换色谱分离采用线性洗脱，起始缓冲溶液为0.01～0.03mol/LPBS缓冲溶液，洗脱液为含有0.8～1mol/LNaCl的0.01～0.03mol/LPBS缓冲溶液；所述缓冲溶液的pH值独立的为6.0；所述流速独立的为1～3mL/min。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述疏水相互作用色谱分离采用线性洗脱，起始缓冲溶液为0.01～0.03mol/LPBS缓冲溶液，洗脱液为含有硫酸铵饱和度10％的0.01～0.03mol/L PBS缓冲溶液；所述缓冲溶液的pH值独立的为7.4。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述强阳离子交换色谱分离采用线性洗脱，起始缓冲溶液为0.01～0.03mol/LPBS缓冲溶液，洗脱液为含有0.8～1mol/LNaCl的0.01～0.03mol/LPBS缓冲溶液；所述洗脱液的pH值独立的为5.5。
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