CN105219754A

CN105219754A - 一种放线菌纤溶酶的制备方法

Info

Publication number: CN105219754A
Application number: CN201510635616.0A
Authority: CN
Inventors: 邓永平; 刘晓兰; 郑喜群; 艾瑞波
Original assignee: Qiqihar University
Current assignee: Qiqihar University
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2016-01-06

Abstract

本发明公开了一种放线菌纤溶酶的制备方法，所述方法的具体步骤如下：（1）向含有放线菌纤溶酶的发酵上清液中加入硫酸铵粉末，使其饱和度为25％-35%W/V，4℃放置过夜后，进行离心得到上清液，再向该上清液中加入硫酸铵粉末，使其饱和度为55-65%W/V，4℃放置过夜后，进行离心得到沉淀，用PB缓冲液将沉淀溶解，得到粗酶液；（2）将步骤（1）得到的粗酶液进行低温离心除杂质，得到的上清液依次通过Octyl-Sepharose？FF疏水相互作用层析和Phenyl-Sepharose？HP疏水相互作用层析纯化，得到色谱纯的酶，经透析除盐后冷冻干燥制得纤溶酶冻干粉，放入-20℃条件下可长期保存。本发明的放线菌纤溶酶的分离纯化方法具有操作步骤简单、回收率高的优点。

Description

一种放线菌纤溶酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种放线菌纤溶酶的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

血栓栓塞类疾病严重危害人类生命和健康，溶栓法目前是治疗和预防血栓性疾病的主要手段，研制高效、快速、防止再栓塞并能降低出血等不良反应的新型溶栓药物是现代医学的迫切需要。

纤溶酶具有溶解血纤维蛋白的功能，血纤维蛋白是构成血栓的主要成分。利用微生物发酵生产纤溶酶具有生产周期短，占地面积小，产物含量高等优点。因此，研制高效、特异性强的微生物纤溶酶是生产新型溶栓药物的主要方式。

本申请人一直在探索微生物在现代生物溶栓剂制备中的应用潜力，分别于2006年、2010年成功地培制出了专利申请号为200610163497.6和200810137564.4的两种微生物纤溶酶，这两种纤溶酶培养所使用的菌种都是真菌，真菌发酵代谢产物较多，导致纤溶酶的后续分离纯化步骤较多，过多的分离纯化步骤会降低纤溶酶的活力，导致纤溶效果下降，因此，多年来本申请人一直在努力寻找发酵代谢产物种类较少，易于产物分离纯化的优良产酶菌种。

嗜酸放线菌(Acidophilicactinomycetes)广泛分布于酸性环境中，可以产生耐酸的胞外酶，如几丁质酶、蛋白酶、淀粉酶等，在酸性土壤有机物的降解循环中起着重要作用。此外，由于大多数真菌适宜于酸性环境中生存，所以嗜酸放线菌也是极具潜力的抗真菌活性物质的产生者。从嗜酸放线菌的代谢产物中开发新的天然生物活性物质，对新型药物的开发具有重要意义。放线菌YY21是一种中度嗜酸放线菌，在GYM和PDA培养基上可以产生基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝分化成波曲状孢子丝，孢子呈球形；菌株适宜的生长pH范围为3~7，可以向细胞外分泌蛋白酶、淀粉酶，可以分解含硫氨基酸产生硫化氢，不能产生纤维素酶；能够利用葡萄糖和棉子糖作为碳源。在筛查放线菌YY21液体培养液的抑菌效果时，发现培养液中含纤溶酶，申请人遂开始对放线菌YY21液体发酵产纤溶酶进行了深入研究，本发明就是该项研究的部分内容。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种中度嗜酸放线菌纤溶酶的分离纯化方法。

本发明的具体步骤：

1、硫酸铵盐析浓缩放线菌纤溶酶溶液：将放线菌YY21液体发酵产物在4℃条件下10000r/min离心20min，得到上清液。经硫酸铵分级盐析后得到粗酶液。

、Octyl-SepharoseFF疏水相互作用层析：向盐析后得到的粗酶液中加入硫酸铵粉末，充分溶解，使粗酶液中硫酸铵饱和度达到30％，经Octyl-SepharoseFF疏水相互作用层析柱纯化，用30→0％W/V硫酸铵溶液梯度洗脱，收集有纤溶活性组分进行下一步的操作；

3、Phenyl-SepharoseHP疏水相互作用层析：向经Octyl-SepharoseFF疏水相互作用层析柱纯化后收集的纤溶活性组分中加入硫酸铵粉末，使其硫酸铵饱和度达到15％，上样后用15→0％W/V硫酸铵溶液梯度洗脱，收集有纤溶活性组分进行下一步的操作；

4、经过SephadexG25凝胶过滤层析除去上一步纤溶活性收集液中的硫酸铵，经冷冻干燥获得纤溶酶冻干粉。

本发明的优点：

1、原有的分离纯化方法工艺路线长，样品一般要经过三次甚至更多次柱层析才能达到电泳纯，分离时间较长、回收率较低而且操作过程繁琐复杂。而本发明采用盐析法浓缩发酵液中纤溶酶，盐析后无需脱盐步骤，只需通过两步疏水相互作用层析的分离纯化便可得到高纯度纤溶酶，大大缩短了酶的纯化流程，减少了酶活力的损失。该方法工艺过程简单，分离纯化效率高，酶回收率较高。

、本发明所采用的纯化方法使酶始终处于一定的硫酸铵饱和度中，有利于保护酶的催化活力和稳定性。

、本发明以中度嗜酸放线菌为菌种生产纤溶酶，赋予了纤溶酶性质的特殊性，即在偏酸性的环境中依然能够保持稳定的活性，适宜开发为口服用药。

附图说明

图1为SDS-PAGE法测定纤溶酶的纯度图片。

图2为纤溶酶在血纤维蛋白平板上形成溶圈的图片。

具体实施例

下面结合实施例对本发明作详细说明，但本发明所保护范围不限于此。

本发明所使用的放线菌菌株YY21已由本申请人于2012年2月27日向位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供了菌种保藏，保藏号为CGMCCN _O .5816，其分类学命名为放线菌Actinomycetesp.。

实施例中的凝血酶、纤维蛋白原、尿激酶标准品均购自sigma公司。

实施例1

1、斜面培养基：葡萄糖0.4-0.5%，酵母膏0.3-0.6%，麦芽浸膏0.5-1.5%，碳酸钙0.1-0.2%，琼脂1.5%，pH6.7。

斜面培养条件：28℃培养4-7d。

、种子培养基：葡萄糖0.4-0.5%，酵母膏0.3-0.6%，麦芽浸膏0.5-1.5%，碳酸钙0.1-0.2%，调节pH为6.7，灭菌后备用。

培养条件：转速为170-190r/min，28℃震荡培养28-32h，作为液体种子。

、发酵培养基：小米粉6-8%，葡萄糖2-4%，碳酸钙0.1-0.3%，氯化钠0.4-0.6%，蛋白胨0.6-0.7%，pH6.7，5%接种量。

培养条件：150-170r/min，22℃发酵90-100h。

将放线菌YY21液体发酵产物在4℃条件下10000r/min离心20min，得到上清液，纤溶酶比活力为12.01mg/mL。

、放线菌纤溶酶粗酶液的制备：向含有放线菌纤溶酶的发酵上清液中加入硫酸铵粉末，使其饱和度为25％-35%W/V，4℃放置10h-12h后，进行离心得到上清液，再向该上清液中加入硫酸铵粉末，使其饱和度为55-65%W/V，4℃放置10h-12h后，进行离心得到沉淀，用PB缓冲液将沉淀溶解，得到粗酶液，此时纤溶酶比活力为22.50mg/mL。

实施例2

1、斜面培养同实施例1

2、种子培养同实施例1

3、发酵培养同实施例1

4、放线菌纤溶酶粗酶液的制备同实施例1

5、Octyl-SepharoseFF疏水相互作用层析方法

向粗酶液中加入硫酸铵粉末，充分溶解，使其硫酸铵饱和度达到30％，上样Octyl-SepharoseFF疏水相互作用层析柱后用30→0％W/V硫酸铵溶液梯度洗脱，收集有纤溶活性组分，获得纤溶酶比活力为112.07mg/mL。

实施例3

1、斜面培养同实施例1

2、种子培养同实施例1

3、发酵培养同实施例1

4、放线菌纤溶酶粗酶液的制备同实施例1

5、Octyl-SepharoseFF疏水相互作用层析方法同实施例2

6、Phenyl-SepharoseHP疏水相互作用层析方法

调节Octyl-SepharoseFF疏水相互作用层析收集活性组分的硫酸铵饱和度到15％，进行Phenyl-SepharoseHP疏水相互作用层析，上样后用15→0％W/V硫酸铵溶液梯度洗脱，收集有纤溶活性组分进行，酶的比活力达到173.16U/mg，活力回收率19.35%。

实施例4

1、斜面培养同实施例1

2、种子培养同实施例1

3、发酵培养同实施例1

4、放线菌纤溶酶粗酶液的制备同实施例1

5、Octyl-SepharoseFF疏水相互作用层析方法同实施例2

6、Phenyl-SepharoseHP疏水相互作用层析方法同实施例3

7、纤溶酶的透析除盐、冷冻干燥制得冻干粉，纯度及部分氨基酸序列分析

采用截留分子量10000Da的透析袋在纯水中透析除盐，利用BaCl ₂ 检测透析终点。透析后的酶液在-60℃冰箱中冷冻，经冷冻干燥机干燥得到纤溶酶冻干粉。采用SDS-PAGE测定纤溶酶的纯度，结果见说明书附图图1。经过Q-TOF2串联质谱测得其中五个肽段的氨基酸序列分别为：A-Q-S-V-P-Y-G-L-S-Q-L-K，其分子量为1289.6644；V-A-V-L-D-S-G-L-D-S-S-H-P-D-L-K，其分子量为1651.8243；N-S-L-E-S-T-A-T-N-L-G-N-P-A-G-A-T-Y-G-K，其分子量为1964.8844；h-p-n-w-T-n-t-n-v-r，其分子量为1237.5844；Y-P-S-V-L-A-V-G-A-V-D-N-G-V-S-N-K，其分子量为1688.8043。

实施例5

纤溶酶的活力测定采用血纤维蛋白平板法。

、血纤维蛋白平板的制备（以配制10个平板为例）

将0.25g琼脂糖溶于50mL生理盐水，置45℃水浴中保温30min后加250U的凝血酶混匀；0.2g牛血纤维蛋白原溶于巴比妥钠缓冲液（pH7.8），置45℃水浴中保温5min。分别取5mL凝血酶溶液和5mL纤维蛋白溶液混合倒入直径为9cm平板中，水平放置冷却凝固后放入冰箱备用。

、标准曲线制作方法

①尿激酶标准品的配制：将50000U/支的尿激酶用生理盐水稀释为30、25、20、15、10、5、1U/mL贮存备用。

②测定方法：取每一浓度的尿激酶标准品10μL加到血纤维蛋白平板表面，37℃保温6h，测量直径取平均值，平行实验3次。

③做回归曲线：得回归方程y=0.1219*exp（4.6918*x），其中x为溶圈直径（mm），y为酶活性（U/mL），R ² =0.978。

、放线菌纤溶酶活力测定：微量称取10μL放线菌纤溶酶加在血纤维蛋白平板表面上，37℃保温6h后测量形成的溶圈直径，代入2中公式得相应酶活力单位。

实施例6

可溶性蛋白浓度的测定采用福林-酚法。

以0.5mg/mL的牛血清白蛋白作为标准蛋白质溶液，取21支试管平均分成三组，按照表1所示加入各项试剂，分别测定640nm下各管的吸光值。以标准蛋白质含量（mg/mL）作为纵坐标，光吸收值为横坐标，绘制标准曲线。得到方程y=0.8424x-0.0128，R2=0.9981。未知蛋白质溶液浓度测定同标准曲线测定方法，以不加酶液做为对照调零。

表1可溶性蛋白含量标准曲线

Claims

1.一种放线菌纤溶酶的制备方法，该放线菌保藏号为CGMCCNo.5816，分类学命名为放线菌Actinomycetesp.，经液体发酵得到含纤溶酶的发酵液，经离心收集富含纤溶酶的上清液，依次采用硫酸铵分级盐析、Octyl-SepharoseFF疏水相互作用层析、Phenyl-SepharoseHP疏水相互作用层析、透析除盐、冷冻干燥制备得到纤溶酶冻干粉，经过Q-TOF2串联质谱测得纤溶酶五个肽段的氨基酸序列分别为：A-Q-S-V-P-Y-G-L-S-Q-L-K，其分子量为1289.6644；V-A-V-L-D-S-G-L-D-S-S-H-P-D-L-K，其分子量为1651.8243；N-S-L-E-S-T-A-T-N-L-G-N-P-A-G-A-T-Y-G-K，其分子量为1964.8844；h-p-n-w-T-n-t-n-v-r，其分子量为1237.5844；Y-P-S-V-L-A-V-G-A-V-D-N-G-V-S-N-K，其分子量为1688.8043。

2.如权利要求1所述的纤溶酶的制备方法：向含有放线菌纤溶酶的发酵上清液中加入硫酸铵粉末，使其饱和度为25％-35%W/V，4℃放置过夜后，进行离心收集上清液，再向该上清液中加入硫酸铵粉末，使其饱和度为55-65%W/V，4℃放置过夜后，进行离心收集沉淀，用缓冲液将沉淀溶解，得到粗酶液。

3.如权利要求1所述的纤溶酶的制备方法：将粗酶液的硫酸铵饱和度调到30％，进行Octyl-SepharoseFF疏水相互作用层析，上样后用含30%→0W/V硫酸铵缓冲溶液梯度洗脱，收集有纤溶活性组分。

4.如权利要求1所述的纤溶酶的制备方法：调节Octyl-SepharoseFF疏水相互作用层析收集活性组分的硫酸铵饱和度到15％，进行Phenyl-SepharoseHP疏水相互作用层析，上样后用15→0％W/V硫酸铵溶液梯度洗脱，收集有纤溶活性组分。

5.如权利要求1所述的纤溶酶的制备方法：Phenyl-SepharoseHP疏水相互作用层析收集的纤溶活性组分经过透析除硫酸铵，经冷冻干燥获得纤溶酶冻干粉。