CN101134951B

CN101134951B - 一种纤溶酶的培制方法

Info

Publication number: CN101134951B
Application number: CN200610163479A
Authority: CN
Inventors: 刘晓兰; 郑喜群; 邓永平; 吴耘红
Original assignee: Qiqihar University
Current assignee: Qiqihar University
Priority date: 2006-12-04
Filing date: 2006-12-04
Publication date: 2010-05-19
Anticipated expiration: 2026-12-04
Also published as: CN101134951A

Abstract

本发明涉及一种纤溶酶及其培制方法，以保藏号为CGMCC No.1836的好食脉孢霉(N.sitophila)菌株17号为菌种，经培养发酵、分离和提纯制成；该纤溶酶由两个亚基组成，相对分子量分别为30000和15500，等电点为7.9±0.2；本发明产品具备很好的溶栓性能，而且又无出血活性，不表现抗凝血活性，也无明显的急性毒性，因而具有在临床上开展试验、开发应用的前景；同时，本发明产品也为尚为稀薄的纤溶酶家族增添了一名新的成员；另外，由于本发明的纤溶酶为一种胞外酶，在制备中特别有利于后续的分离和纯化；由于本发明产品是以来源广泛的麸皮和豆渣为主要培养基，不仅原料成本低廉，而且也为这些原有资源的开发利用提供了新的途径。

Description

一种纤溶酶的培制方法

技术领域

本发明涉及一种纤溶酶的培制方法。

背景技术

血栓类疾病严重的威胁着人类的生命和健康，是导致当今人类死亡的最主要原因之一，而且在目前这种病的发病率仍然在逐年上升。眼下血栓疾病的治疗方法主要有三种：一是外科手术法，从操作上看，这种方法对技术的条件要求很高，操作上难度也很大，患者需要付出的费用也很昂贵。二是抗栓疗法，即给患者长期服用阿斯匹林等抗凝药物，虽然在很大程度上可以控制病情，但是却不能除去已经形成的血栓。三是溶栓疗法，即给患者注射溶栓剂以促使血管再通，这种方法与前两种方法比具有高效、特异、费用低等特点，因此溶栓药物的研究开发在国际、国内都相当活跃。从六十年代溶栓药物上市到现在，溶栓剂的发展大致分三代：第一代溶栓剂：包括链激酶(streptokinase，SK)、尿激酶(urokinase，UK)等，所存在的不足是这类制剂具有其自身难以克服的缺陷，如引起出血等副作用等。第二代溶栓剂：包括t-PA、pro-UK、APSAC，这些制剂虽然较上一代产品已有所改进，但是这种缺陷依然存在。第三代溶栓剂是正在研究开发中的溶栓药物。目前国际上正在致力于以下两种研究：一是用蛋白质工程，如分子定点突变，结构域的删除、增加、拼接或融合等手段对现有溶栓剂分子进行改造。二是积极开发各种生物来源的血栓溶解物质。现已有从蛇毒、蚯蚓、微生物以及吸血昆虫和海洋生物中提取到了具有纤溶活性的物质的报道。在自然界，由于微生物的种类繁多，来源广泛，再加上其自身所具有的繁殖快，生长周期短，适应性强的优势，各国的发酵工业又都有较为完备甚至是十分发达的基础，一旦有了成熟的工艺，很快就可以大批量地生产，因此，应用微生物生产溶栓剂展示出了特别诱人的前景。

目前，国内有关纤溶酶的研究可以说是才刚刚开始，已有的少量成果主要还局限于蚯蚓纤溶酶，此外，仅有几项从链霉菌Y405、链霉菌C3662发酵液中提取到的纤溶酶等报导。在临床应用研究中，需要具有大量的备选品种和相关产物以便于加以比较和从中筛选，而目前我们现已取得的进展还远远不能满足临床上的研究需要。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种纤溶酶的培制方法，该纤溶酶不仅具有很好的溶栓性能，而且使用上安全性好，制备成本也很低廉。

本发明产品纤溶酶培养所使用的菌种为Neurospora sitophlia 17号好食脉孢霉，保藏号为CGMCC No.1836。该菌株是本申请人于1999年3月在中国北方酱类食品发酵中间产物酱块中分离、筛选得到的。

以上述菌株为菌种，经过培养发酵、分离和提纯，便可培制出本发明的纤溶酶产品。

本发明的培制的纤溶酶经SDS-PAGE法和凝胶过滤层析法的分析测定，被证实为具有以下酶学性质：该纤溶酶酶分子由两个亚基组成，相对分子量分别为30000和15500，IEF测定等电点为7.9±0.2。

该纤溶酶酶分子有直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原间接溶解纤维蛋白的作用，可以顺次降解纤维蛋白原α、β和γ链。还可以水解生色底物N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，测得的酶促反应的米氏常数为0.24mmol/L；该纤溶酶不降解人血清蛋白，最适作用pH为7.4，适宜在人体生理pH下发挥作用，在pH4.8-9.8范围内37℃保温24h后酶活力保持在80％以上；最适作用温度为50℃，在32℃-42℃保温4h酶活力保持在75％以上；Fe²⁺和Fe³⁺在离子浓度为0.5mmol/L时对酶的活性有激活作用，该纤溶活性受丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制。

本发明产品的培制方法：以Neurospora sitophlia 17号好食脉孢霉为菌种，经固体发酵法培养后产生纤溶酶，将固体发酵物用生理盐水浸提6h，用纱布过滤除去菌体和固形物，收集滤过液，用40％～80％饱和度的硫酸铵分级盐析，再采用现代色谱分离技术对该纤溶酶进行纯化，使酶纯度达到色谱纯。

本发明产品的制备具体步骤：

1、以Neurospora sitophlia 17号好食脉孢霉为菌种，经过斜面培养、固体发酵培养生产纤溶酶；

2、培养方法：斜面培养-→固体发酵培养

斜面保存采用葡萄糖-琼脂培养基(PDA斜面)，28～30℃培养4天，浅盘发酵培养基含豆渣、麸皮和无机盐，豆渣和麸皮干重比为4∶1，无机盐为CaCl₂(0.75％)，FeSO₄·7H₂O(0.045％)，pH自然，接种量为2×10⁶个孢子/克干基，28～30℃培养48h。用生理盐水对固体发酵物进行浸提6h，纱布过滤得到滤过液。

3、粗提纯纤溶酶：经过40％～80％饱和度硫酸铵分级盐析，离心除去杂质，得到粗酶液。

4、精提纯纤溶酶：采用现代色谱技术对粗酶液进行精提纯，主要采用以下方法得到色谱纯的纤溶酶：

A、Octyl-SepharoseFF疏水相互作用层析：a、梯度洗脱：将样品盐饱和度调到40％，上样后用40％～0硫酸铵溶液梯度洗脱，收集有纤溶活性组分；b、步阶式洗脱：将样品盐饱和度调到40％，上样后先用40％饱和度硫酸铵溶液洗脱，至吸光度无变化时，采用20％饱和度硫酸溶液洗脱，到吸光度无变化时使用不含盐的缓冲液进行洗脱，收集有纤溶活性组分。

B、SephadexG-25凝胶过滤层析：用pH7.4磷酸盐缓冲液洗脱，收集有纤溶活性组分；

C、SP-SepharoseHP离子交换层析：样品脱盐后上样，用含0～0.8mol/L的NaCl缓冲液梯洗，收集有纤溶活性组分。

D、Superdex75凝胶过滤层析，收集有纤溶活性组分。

本发明的优点：本发明产品具备很好的溶栓性能，而且又无出血活性，不表现抗凝血活性，也无明显的急性毒性，因而具有在临床上开展试验、开发应用的前景。同时，本发明产品也为尚为稀薄的纤溶酶家族增添了一名新的成员。另外，由于本发明的纤溶酶为一种胞外酶，在制备中特别有利于后续的分离和纯化。由于本发明产品是以来源广泛的麸皮和豆渣为主要培养基，不仅原料成本低廉，而且也为这些原有资源的开发利用提供了新的途径。

附图说明

图1为利用血纤维蛋白平板法证实本发明产品纤溶酶溶纤作用的图片

图2为SDS-PAGE测定本发明产品纤溶酶对人血纤维蛋白原的降解图片

本发明所使用的菌种Neurospora sitophlia17号好食脉孢霉已由本申请人于2006年10月12日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提供了保藏，分类命名为Neurospora sitophlia，所注明的鉴定参据为17号，保藏号为CGMCC No.1836。

具体实施例

实施例1：

1、菌种：Neurospora sitophlia 17号好食脉孢霉

2、培养基及培养条件：

(1)斜面培养基(PDA斜面)：葡萄糖2％、琼脂2％、用20％土豆汁配制，pH自然，28℃恒温培养3d。

(2)制霉素抗性初筛平板培养基：斜面培养基中含10U/ml制霉菌素，0.02％(w/v)入LiCl·H₂O，0.08(w/v)去氧胆酸钠，25～28℃恒温培养36h；

(3)复筛用固体发酵培养基：豆渣∶麸皮＝4∶1(干重比)，CaCl₂0.75％、FeSO₄·7H₂O 0.045％、pH自然，接种量为5×10⁵个/瓶，28～30℃发酵3d。

实施例2

1、斜面培养同实施例1

2、固体发酵培养：摇瓶发酵培养基的组成是：豆渣∶麸皮(4∶1)+CaCl₂0.75％+FeSO₄·7H₂O 0.045％。每瓶培养基接种3.4×10⁵个孢子，在28℃恒温箱培养48h，然后用生理盐水浸提4～6h，浅盘发酵培养基组成和培养条件同摇瓶培养。

3、纤溶酶的分离纯化：固体发酵产物经过生理盐水浸提后，依次经过40～80％饱和度硫酸铵分级盐析、Octyl-SepharoseFF疏水相互作用层析、SP-SepharoseHP离子交换层析、Phenyl疏水相互作用层析和RESOURCE疏水相互作用层析，收集有纤溶活性成分。

实施例3

1、斜面培养同实施例1

2、固体发酵同实施例2浅盘发酵；

3、纤溶酶的分离纯化：脉孢霉固体发酵液经过生理盐水浸提、40～80％硫酸铵分级盐析后，采用Octyl-Sepharose FF疏水相互作用层析、Sephadex G-25凝胶过滤层析、SP-SepharoseHP强阳离子交换层析、Superdex75凝胶过滤层析，收集有纤溶活性组分。

实施例4

1、斜面培养同实施例1

2、固体发酵同实施例2浅盘发酵；

3、纤溶酶分离纯化同实施例3

4、测定分离纯化后的纤溶酶的性质：脉孢霉纤溶酶由两个亚基组成，相对分子量分别为30000和15500，等电点7.9±0.2，有直接溶解蛋白和激活纤溶酶原间接溶解纤维蛋白的作用，与人纤溶酶相同，顺次降解纤维蛋白原α、β和γ链；

5、测定脉孢霉纤溶酶的部分毒理性质：小鼠体内试验证明脉孢霉纤溶酶无出血活性；不表现抗凝血活性；无明显的急性毒性。

实施例5

纤溶酶纤溶活性证明：

采用血纤维蛋白平板法和电泳法检验此酶对纤维蛋白的溶解性。

A血纤维蛋白平板法

此平板法含有血纤维蛋白原(市售的血纤维蛋白原中可能含有纤维蛋白)和凝血酶，可溶性纤维蛋白原在凝血酶作用形成纤维蛋白单体，血纤维蛋白单体自发缔结，多聚化形成可见的血纤维蛋白凝胶，将酶液加到平板凝胶表面后，经过一段时间培养后即将血纤维蛋白溶解，在平板凝胶表面形成透明圈。见图1。

B电泳法

将纤溶酶和人血纤维蛋白原等体积混匀在37℃作用2min后，用SDS--PAGE检测脉孢霉纤溶酶是否降解人血纤维蛋白原，降解图谱见图2(从右至左泳道依次为人血纤维蛋白原、脉孢霉纤溶酶与纤维蛋白原混合后作用5min、45min、1h、2h、6h、9h、24h)。

如图2所示：45min后对α、β链降解完全，而在6h时对γ链已经完全降解，这一降解顺序与人纤溶酶降解纤维蛋白原各亚基的情况相似。

Claims

1.一种纤溶酶的培制方法，以保藏号为CGMCC No.1836的Neurosporasitophlia 17号好食脉孢霉为菌种，经培养发酵、分离和提纯制成，该纤溶酶由两个亚基组成，相对分子量分别为30000和15500，等电点为7.9±0.2，该方法包括以下步骤：以Neurospora sitophlia 17号好食脉孢霉为菌种，经过斜面培养、固体发酵培养生产纤溶酶，从发酵产物中分离纯化纤溶酶。

2.如权利要求1所述的纤溶酶的培制方法：斜面保存采用葡萄糖琼脂培养基，28～30℃培养4天，发酵培养基含豆渣、麸皮和无机盐，28～30℃培养48小时，用生理盐水对固体发酵产物浸提6小时，经纱布过滤得到过滤液。

3.如权利要求2所述的纤溶酶的培制方法：将所得到的过滤液经过40～80％饱和度硫酸铵分级盐析，离心除去杂质，得到粗酶液，采用现代色谱技术纯化纤溶酶。

4.如权利要求3所述纤溶酶的培制方法：其粗酶液纯化的具体方法如下：

a、Octyl-Sepharose Fast Flow疏水相互作用层析：将样品盐饱和度调到40％，上样后用40％～0硫酸铵溶液梯度洗脱，收集有纤溶活性组分；

b、Sephadex G-25凝胶过滤层析：用pH7.4磷酸盐缓冲液洗脱，收集有纤溶活性组分；

c、SP-Sephar离子交换层析：样品脱盐后上样，用0～0.8mol/L的NaCl缓冲溶液梯洗，收集有纤溶活性组分；

d、Sephadex 75凝胶过滤层析：用pH7.4磷酸盐缓冲液洗脱，收集有纤溶活性组分。