CN105112387A - 一种脂肪酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

<b>本发明公开了一种脂肪酶的制备方法。该脂肪酶是以</b><b>保藏号为CGMCC？No.1836的好食脉孢霉（<i>N.sitophila</i>）菌株17号为</b><b>菌种，以麸皮和玉米黄粉为培养基的主要成分，添加</b><b>0.1%</b><b>的吐温</b><b>-80</b><b>和</b><b>0.01%KCl</b><b>，培养基初始</b><b>pH6.0</b><b>，接种量</b><b>1%</b><b>，在</b><b>33℃</b><b>培养</b><b>48h</b><b>后即得富含脂肪酶的发酵液，酶活力高达</b><b>303.83U/mL</b><b>。对发酵液离心后收集上清液，上清液依次经过</b><b>30</b><b>％</b><b>W/V</b><b>饱和度硫酸铵盐析、</b><b>Octyl-Sepharose？FF</b><b>疏水相互作用层析、</b><b>Superdex？75</b><b>凝胶层析制得高纯度的脂肪酶，再经过冷冻干燥制得脂肪酶冻干粉；该脂肪酶分子量约为</b><b>32000</b><b>道尔顿左右，在</b><b>pH7-9</b><b>、</b><b>30-40℃</b><b>左右时酶活力较稳定，具有分解油脂的能力。本发明所用菌株来源安全，产酶周期较短，性能优良；培养原料廉价易得；本发明中所得脂肪酶是一种胞外酶，在制备中特别有利于后续的分离和纯化。</b>

Description

一种脂肪酶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及好食脉孢霉液体发酵制备脂肪酶的方法和纯化方法。
背景技术
脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3）又称为三酰基甘油酯水解酶，可以催化三酰甘油酯及其它一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外，还表现出如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶催化反应具有立体选择性、底物专一性、副反应少、反应条件温和、不需辅酶及可用于有机溶剂等特点，在食品、皮革、生物柴油、医疗医药和洗涤剂等多个生产领域都有应用。
国内外市场的脂肪酶酶制剂种类主要有Novozyme435Lipase、LipaseTLIM、LipozymeRMIM、LipaseAYS、LipaseAY-30G、LipaseAY、LipaseAK等，这些市售的酶制剂价格较贵，难以开展大规模的工业应用，所以，新型、质优价廉的脂肪酶的开发一直以来备受研究者关注。
脉孢菌属（Neurospora）隶属于真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），核菌纲(Pyrenomycetes)，球壳目（Sphaeriales）。FDA组织认为脉孢菌是少数几种可食用的安全生物，是对医药、农业和环境很重要的一类生物，同时也是遗传学和生物化学研究中非常重要的模式生物。利用好食脉孢霉生产脂肪酶具有很好的应用前景。
发明内容
本发明的发明目的之一在于提供一种好食脉孢霉液体发酵制备脂肪酶的发酵方法。该方法所产的脂肪酶产量高、活性高，是一种胞外酶，有利于后续的纯化，而且安全性良好，制备成本比较低廉。
本发明的发明目的之二在于提供一种脂肪酶的纯化方法。该纯化方法操作步骤简单，回收率较高。
本发明所使用的菌种为好食脉孢霉（N.sitophila）菌株17号，保藏号为CGMCCNo.1836。该菌株是本申请人于1999年3月在中国北方酱类食品发酵中间产物酱块中分离、筛选得到的。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
1、以好食脉孢霉（N.sitophila）菌株17号为菌种，经过斜面培养、液体种子培养和液体发酵培养生产脂肪酶；
2、培养方法：斜面培养→液体种子培养→液体发酵培养
斜面培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA斜面），培养基含煮沸马铃薯汁20%W/V、葡萄糖2%W/V、琼脂2%W/V，pH自然，121℃灭菌30min，冷却接种后在28～30℃条件下培养3～5天。
种子培养基制作方法：将30g～50g麸皮加入到1000mL自来水中，浸泡过夜后过滤，留滤液，向滤液中添加1.5～3%W/V的蛋白胨，加热充分溶解后，调节pH至5.0即制得种子培养基。250mL三角瓶装50mL液体种子培养基，121℃灭菌30min后冷却，每瓶培养基接入10 5 ～10 6 个孢子后在28～30℃、150r/min条件下培养48小时。
发酵培养基含10%W/V麸皮、6%W/V玉米黄粉，0.1%V/V的吐温-80，0.01%W/VKCl，培养基初始pH5.5～6.5，250mL三角瓶装50mL液体种子培养基，121℃灭菌30min后冷却，接入1%V/V的液体种子，在28～33℃培养48小时，经过离心得到上清液，上清液中脂肪酶活力为303.83U/mL。
、粗提纯纤溶酶：经过30%W/V饱和度硫酸铵盐析，4℃环境中静置过夜，再经10000r/min冷冻离心20min除去固形物，得到的上清液即为含脂肪酶的粗酶液。
、精提纯纤溶酶
采用色谱技术对粗酶液进行精提纯，依次采用以下方法纯化得到高纯度的脂肪酶：
A、Octyl-SepharoseFF疏水相互作用色谱
将粗酶液中的硫酸铵饱和度调到30%W/V，平衡液为含30%W/V饱和度硫酸铵的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH7.0。上样后用含30%～0W/V硫酸铵饱和度的缓冲液梯度洗脱，收集有脂肪酶活性组分；
B、Superdex75凝胶过滤色谱
以经过Octyl-SepharoseFF疏水相互作用色谱分离的脂肪酶活性组分作为该步骤的样品，上样后用pH7.4的含0.3mol/LNaCl的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗脱，收集有脂肪酶活性组分。
本发明的优点：本发明的发酵培养基由麸皮和玉米黄粉组成，不仅原料成本低廉，而且也为这些原有资源的开发利用提供了新的途径；本方法发酵周期短，条件温和，易于控制；提供的用于好食脉孢霉发酵生产脂肪酶的培养基，具有脂肪酶产率高，脂肪酶活力高等优点。另外，由于本发明的脂肪酶为一种胞外酶，在制备中特别有利于后续的分离和纯化，纯化步骤简短，有利于节省成本，提高回收率。
本发明所使用的菌种好食脉孢霉（Neurospora.sitophila）17号已由本申请人于2006年10月12日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）提供了保藏，保藏号为CGMCCNo.1836。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
为了便于理解，下面结合以下实施例对本发明予以进一步说明。实施例中涉及的百分号（%）若无特别说明，是指100mL溶液中所含溶质的克数或毫升数。本研究中脂肪酶活力定义为：温度为37℃，脂肪酶催化对硝基苯酚棕榈酸酯（P-NPP），每小时生成1μg的对硝基苯酚定义为一个酶活力单位，国际单位(U/mL)。
具体实施例
实施例1：
1、斜面培养：斜面培养基含煮沸马铃薯汁20%、葡萄糖2%、琼脂2%，pH自然，121℃灭菌30min，冷却接种好食脉孢霉（N.sitophila）17号后在28～30℃条件下培养3～5天。
、种子培养：250mL三角瓶装50mL液体种子培养基，121℃灭菌30min后冷却，每瓶培养基接入10 5 ～10 6 个好食脉孢霉（N.sitophila）17号孢子后在28～30℃、150r/min条件下培养2d。
种子培养基制作方法：将30g～50g麸皮加入到1000mL自来水中，浸泡过夜后过滤，留滤液，向滤液中添加1.5～3%的蛋白胨，加热充分溶解后，调节pH至5.0即可。
、液体发酵培养：发酵培养基含10%麸皮、6%玉米黄粉，0.1%的吐温-80，培养基初始pH5.5～6.5，250mL三角瓶装50mL液体种子培养基，121℃灭菌30min后冷却，接入1%的液体种子，在28～33℃培养72小时。培养结束后，发酵液在4℃，10000rpm离心10min后获得的上清液即包含了所需的脂肪酶，测定的脂肪酶活力为71.21U/mL。同时以引用培养基（10%麸皮、6%玉米黄粉，培养基初始pH5.5～6.5）为对照，生产的脂肪酶活性提高了近10倍。
实施例2
1、斜面培养同实施例1
2、种子培养同实施例2
3、发酵培养基含10%麸皮、6%玉米黄粉，0.1%的吐温-80，0.01%KCl，培养基初始pH5.5～6.5，250mL三角瓶装50mL液体种子培养基，121℃灭菌30min后冷却，接入1%的液体种子，在28～33℃培养72小时。培养结束后，发酵液在4℃，10000rpm离心10min后获得的上清液即包含了所需的脂肪酶，测定的脂肪酶活力为171.55U/mL。同时以引用培养基（10%麸皮、6%玉米黄粉，0.1%的吐温-80，培养基初始pH5.5～6.5）为对照，生产的脂肪酶活性提高了2.4倍。
实施例3
1、斜面培养同实施例1
2、种子培养同实施例2
3、发酵培养基含10%麸皮、6%玉米黄粉，0.1%的吐温-80，0.01%KCl，培养基初始pH6.0，250mL三角瓶装50mL液体种子培养基，121℃灭菌30min后冷却，接入1%的液体种子，在33℃培养48小时。培养结束后，发酵液在4℃，10000rpm离心10min后获得的上清液即包含了所需的脂肪酶，测定的脂肪酶活力为401.96U/mL。同时以引用培养方法（10%麸皮、6%玉米黄粉，0.1%的吐温-80，培养基初始pH5.5～6.5，250mL三角瓶装50mL液体种子培养基，121℃灭菌30min后冷却，接入1%的液体种子，在28～33℃培养72小时）为对照，生产的脂肪酶活性提高了2.3倍。
实施例4
1、斜面培养同实施例1
2、种子培养同实施例2
3、发酵培养基含10%麸皮、6%玉米黄粉，0.1%的吐温-80，0.01%KCl，培养基初始pH5.5～6.5，250mL三角瓶装50mL液体种子培养基，121℃灭菌30min后冷却，接入1%的液体种子，在28～33℃培养48小时。培养结束后，发酵液在4℃、10000rpm离心10min后获得的上清液即包含了所需的脂肪酶。
、顺次经过如下步骤纯化脂肪酶：
（1）盐析：向离心后获得的上清液中缓慢加入30%硫酸铵，在4℃静置过夜后，经4℃、10000rpm离心10min后获得的上清液即包含了所需的脂肪酶，作为样品进行下一步的纯化。
（2）Octyl-SepharoseFF疏水相互作用色谱
色谱条件：将上一步盐析得到的样品中硫酸铵饱和度调到30%，平衡液为含30%饱和度硫酸铵的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH7.0。上样后用含30%～0硫酸铵饱和度的缓冲液梯度洗脱，收集有脂肪酶活性组分，纯化后所得脂肪酶比活力为8.29U/mg，作为样品进行下一步的纯化。
（3）Superdex75凝胶过滤色谱
色谱条件：上样后用pH7.4的含0.3mol/LNaCl的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗脱，收集有脂肪酶活性组分，纯化后所得脂肪酶比活力为26.5U/mg，活性回收率25%，纯化倍数31.4倍。
实施例5
1、斜面培养同实施例1
2、种子培养同实施例2
3、发酵培养同实施例4
4、脂肪酶的分离纯化同实施例4
5、脂肪酶的酶学性质：酶相对分子量约为32000Da，在pH7-9、30℃左右时酶活力最高，5mmol/L的Mg 2+ 对酶活力有促进作用。分解亚麻籽油的能力较强，分解玉米油能力较弱。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种脂肪酶，以保藏号为CGMCCNo.1836的好食脉孢霉（N.sitophila）菌株17号为菌种，经培养发酵、分离和提纯制成，该脂肪酶分子量约为32000Da。
2.一种如权利要求1所述的脂肪酶的培制方法，包括以下步骤：以好食脉孢霉（N.sitophila）菌株17号为菌种，依次经过斜面培养、种子培养、液体发酵生产脂肪酶，再依次经过盐析和色谱分离技术从发酵产物中分离纯化脂肪酶。
3.如权利要求2所述的脂肪酶的种子培养方法，其特征在于：种子培养基含3～5％W/V麸皮、1.5～3％W/V蛋白胨，pH值5.0，250mL三角瓶装50mL液体种子培养基，121℃灭菌30min，冷却后每瓶培养基接入10 5 ～10 6 个孢子，在28～30℃、150r/min条件下培养20h。
4.如权利要求2所述的脂肪酶的液体发酵方法，其特征在于：发酵培养基含10%W/V麸皮、6%W/V玉米黄粉，0.1%V/V的吐温-80，0.01W/V%KCl，培养基初始pH6.0，250mL三角瓶装50mL液体种子培养基，121℃灭菌30min后冷却，接入1%V/V的液体种子，在33℃培养48小时，经过离心得到含脂肪酶的上清液。
5.如权利要求2所述的盐析方法分离发酵产物中脂肪酶，其特征在于：将所得到的含脂肪酶的上清液经过30％W/V饱和度硫酸铵盐析，离心除去沉淀杂质，得到粗酶液。
6.如权利要求2所述的色谱分离技术，其特征在于：盐析后得到的粗酶液依次经过Octyl-SepharoseFastFlow疏水相互作用色谱和Superdex75凝胶过滤色谱分离纯化。
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