CN101845469A - 连续补料发酵生产槐糖脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种连续补料发酵生产槐糖脂的方法,步骤如下:(1)孢子悬液的制备:将球拟酵母菌TJZKBA10326接种到斜面上,于30℃恒温培养2-4天,加入0.75%的生理盐水洗涤菌丝体,获得菌悬液,悬液中孢子含量约为105-106个;(2)上述菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中得到液体种子;(3)上述液体种子培养基用于接种至灭菌后的5L发酵罐中发酵;(4)发酵24-72h之间,每12h补加浓度为30-60g/L的油类;发酵过程中,补加浓度为30-60g/L的葡萄糖,控制葡萄糖浓度在5-10g/L;溶氧20-30%,pH值3.3-3.8;(5)发酵72h后,用与发酵液等体积的乙酸乙脂/异丙醇,比例4:1,单位v/v,混合有机溶剂提取槐糖脂,并抽真空除去有机溶剂,得槐糖脂产量为200-240g/L。该方法缩短发酵周期,提高生产效率和得率。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵生产槐糖脂的方法,特别涉及一种连续补料发酵生产槐糖脂的方法。
背景技术
槐糖脂(sophorolipid)是一种可降解的生物表面活性剂。生物表面活性剂具有较高的选择性,其表面活性受极端温度、pH值、盐度等条件影响小。与其它通过化学合成或石油炼制法生产的表面活性剂相比,生物表面活性剂在食品、化妆品、医药和环境保护等领域具有广阔的应用前景。槐糖脂作为其中重要的一员,毒性低,与人体和环境相容性好,具有良好的乳化、分散、增溶等特性,在食品、医药、化妆品、冶金、环境保护、废油回收等领域具有研究和开发价值,目前已应用于日化、食品工业、石油工业等。国际上对槐糖脂理论研究及应用开发已开展多年,最近欧美及韩国一些学者经研究发现,槐糖脂具有一定的抑菌作用,并且能够刺激皮肤表皮细胞和真皮成纤维细胞的生长,这些研究对槐糖脂的有效应用具有非常重要的意义。我国目前该领域还处于起步阶段。
目前通常采用一步发酵法生产槐糖脂,由于生产工艺的种种限制使得槐糖脂的发酵水平较低,发酵到90h产量只有大约80g/L,240h产量能达到250g/L左右。但是发酵周期较长,生产工艺较复杂,再加上后提取工艺损失率较大,所以槐糖脂的收率也较低,导致槐糖脂的成本较高,市场价格也较高,很不利于槐糖酯的推广应用。
因此,提供一种高效可行的连续补料发酵生产槐糖脂的方法,是该技术领域科研人员急需开发的新课题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服上述已有技术的不足之处,提供一种高效可行并可降低槐糖脂生产成本,减小投资,降低成本,益于生产应用的连续补料发酵生产槐糖脂的方法。
为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下:一种连续补料发酵生产槐糖酯的方法,其特征在于实施步骤如下:
(1)孢子悬液的制备:将球拟酵母菌TJZKBA10326接种到培养基斜面上,于30℃恒温培养2-4天,加入质量浓度为0.75%的生理盐水洗涤菌丝体,获得菌悬液,悬液中孢子含量约为105-106个,待用;斜面培养基组成包括,单位1L:葡萄糖8g,麦芽粉3g,蛋白胨4g,酵母粉4g,琼脂15g,用蒸馏水定容至1L,pH值3.5;其中所用菌种:球拟酵母菌(Torulopsisbombicola)TJZKBA10326;
(2)上述菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中,液体种子培养基组成包括,单位1L:糖类含量20-60g,油类含量20-60g,酵母粉4-8g,尿素0.5-1g,用蒸馏水定容至1L,pH值3.5;将液体种子培养基于121℃、15min灭菌再冷却至室温;然后按照体积百分比2-5%的接种量将孢子悬液接入上述冷却的液体种子培养基中,500ml规格的摇瓶装液量是100ml,摇瓶于30-34℃、转速为100-150rpm的摇床上培养24h,得到液体种子;
(3)上述液体种子培养基用于接种至灭菌后的5L发酵罐中,发酵罐培养基组成包括,单位1L:初始糖类含量30-80g,初始油类含量30-80g,酵母粉4-8g,尿素0.5-1g;用蒸馏水定容至3L,pH值4.0-4.5,将发酵罐培养基于121℃、15min灭菌再冷却至室温;然后按照体积比2-5%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中,发酵温度30-34℃,溶氧控制在30-40%,发酵时间24h;
(4)发酵24-72h,每12h补加浓度为30-60g/L的油类;发酵过程中,补加浓度为30-60g/L的葡萄糖,控制葡萄糖浓度在5-10g/L;溶氧20-30%,pH值3.3-3.8;
(5)发酵72h结束后,用与发酵液等体积的有机溶剂乙酸乙脂/异丙醇,所述乙酸乙脂/异丙醇两者比例4:1,单位v/v,混合有机溶剂提取槐糖脂,并在70℃抽真空除去有机溶剂,得到槐糖脂产量为200-240g/L。
所述糖类选用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、菊糖其中一种。
所述油类选用玉米油、菜籽油、大豆油、橄榄油、蓖麻油、花生油其中一种。
本发明的有益效果是:本发明采用连续发酵生产槐糖脂工艺可以大大减短发酵周期,采用一般发酵工艺周期约是240h左右,但是连续补料发酵周期可以降至72h,可将生产效率提高65%-75%,得率提高20%-30%,有效提高生产质量。并且不需要复杂的设备,处理方法简单,发酵过程简单易行,连续化、自动化发酵生产节省了人力,大大提高了各种底物的利用率。因此降低了生产成本,利于槐糖脂的开发应用的推广。该方法具有很高的实际应用价值,市场优势非常明显。
具体实施方式
以下结合实施例,对依据本发明提供的具体实施方式详述如下:
实施例1
(1)孢子悬液的制备:将球拟酵母菌TJZKBA10326接种到培养基斜面上,于30℃恒温培养2天,加入质量浓度为0.75%的生理盐水洗涤菌丝体,获得菌悬液,悬液中孢子含量约为3.6×105个,待用;斜面培养基组成包括(1L):葡萄糖8g,麦芽粉3g,蛋白胨4g,酵母粉4g,琼脂15g,用蒸馏水定容至1L,pH值3.5。其中所用菌种为:球拟酵母菌(Torulopsisbombicola)TJZKBA10326。
(2)上述菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中,液体种子培养基组成包括(1L):果糖30g,玉米油30g,酵母粉5g,尿素0.5g,用蒸馏水定容至1L,pH值3.5。将液体种子培养基于121℃、15min灭菌再冷却至室温;然后按照体积百分比2%的接种量将孢子悬液接入上述冷却的液体种子培养基中(500ml规格的摇瓶装液量是100ml),摇瓶于30℃、转速为100rpm的摇床上培养24h,得到液体种子。
(3)上述液体种子培养基用于接种至灭菌后的5L发酵罐中,发酵罐培养基组成包括(1L):果糖50g,玉米油50g,酵母粉6g,尿素0.5g。用蒸馏水定容至3L,pH值4.2,将发酵罐培养基于121℃、15min灭菌再冷却至室温;然后按照体积百分比3%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中,发酵温度30℃,溶氧控制在35%,发酵时间24h。
(4)发酵24-72h之间,每12h补加浓度为30g/L的玉米油。发酵过程中,补加浓度为40g/L的葡萄糖,控制葡萄糖浓度在5g/L。溶氧20%,pH值3.5。
(5)发酵72h结束后,用与发酵液等体积的乙酸乙脂/异丙醇(乙酸乙脂/异丙醇比值是4:1,v/v),其混合有机溶剂提取槐糖脂,并在70℃抽真空除去有机溶剂,得到槐糖脂产量为215g/L。
所述糖类选用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、菊糖其中一种。
所述油类选用玉米油、菜籽油、大豆油、橄榄油、蓖麻油、花生油其中一种。
实施例2
(1)孢子悬液的制备:将球拟酵母菌TJZKBA10326接种到斜面上,于30℃恒温培养2天,加入质量浓度为0.75%的生理盐水洗涤菌丝体,获得菌悬液,悬液中孢子含量约为4.5×105个,待用;斜面培养基组成包括(1L):葡萄糖8g,麦芽粉3g,蛋白胨4g,酵母粉4g,琼脂15g,用蒸馏水定容至1L,pH值3.5。
(2)上述菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中,液体种子培养基组成包括(1L):蔗糖50g,菜籽油50g,酵母粉7g,尿素0.8g,用蒸馏水定容至1L,pH值3.5。将液体种子培养基于121℃、15min灭菌再冷却至室温;然后按照体积比4%的接种量将孢子悬液接入上述冷却的液体种子培养基中(500ml规格的摇瓶装液量是100ml),摇瓶于32℃、转速为120rpm的摇床上培养24h,得到液体种子。
(3)上述液体种子培养基用于接种至灭菌后的5L发酵罐中,发酵罐培养基组成包括(1L):蔗糖60g,菜籽油60g,酵母粉7g,尿素0.8g。用蒸馏水定容至3L,pH值4.5,将发酵罐培养基于121℃、15min灭菌再冷却至室温;然后按照体积比4%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中,发酵温度32℃,溶氧控制在30%,发酵时间24h。
(4)发酵24-72h之间,每12h补加浓度为40g/L的菜籽油。发酵过程中,补加浓度为50g/L的葡萄糖,控制葡萄糖浓度在8g/L。溶氧30%,pH值3.3。
(5)发酵72h结束后,用与发酵液等体积的乙酸乙脂/异丙醇(4:1,v/v)混合有机溶剂提取槐糖脂,并在70℃抽真空除去有机溶剂,得到槐糖脂产量为229g/L。
其它同实施例1。
实施例3
(1)孢子悬液的制备:将球拟酵母菌TJZKBA10326接种到斜面上,于30℃恒温培养3天,加入质量浓度为0.75%的生理盐水洗涤菌丝体,获得菌悬液,悬液中孢子含量约为5.8×105个,待用;斜面培养基组成包括(1L):葡萄糖8g,麦芽粉3g,蛋白胨4g,酵母粉4g,琼脂15g,用蒸馏水定容至1L,pH值3.5。
(2)上述菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中,液体种子培养基组成包括(1L):葡萄糖60g,大豆油60g,酵母粉8g,尿素1g,用蒸馏水定容至1L,pH值3.5。将液体种子培养基于121℃、15min灭菌再冷却至室温;然后按照体积比3%的接种量将孢子悬液接入上述冷却的液体种子培养基中(500ml规格的摇瓶装液量是100ml),摇瓶于34℃、转速为150rpm的摇床上培养24h,得到液体种子。
(3)上述液体种子培养基用于接种至灭菌后的5L发酵罐中,发酵罐培养基组成包括(1L):葡萄糖80g,大豆油80g,酵母粉6g,尿素1g。用蒸馏水定容至3L,pH值4.3,将发酵罐培养基于121℃、15min灭菌再冷却至室温;然后按照体积比5%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中,发酵温度34℃,溶氧控制在40%,发酵时间24h。
(4)发酵24-72h之间,每12h补加浓度为60g/L的大豆油。发酵过程中,补加浓度为30g/L的葡萄糖,控制葡萄糖浓度在6g/L。溶氧25%,pH值3.8。
(5)发酵72h结束后,用与发酵液等体积的乙酸乙脂/异丙醇(4:1,v/v)混合有机溶剂提取槐糖脂,并在70℃抽真空除去有机溶剂,得到槐糖脂产量为237g/L。
其它同实施例1。
实施例4
(1)孢子悬液的制备:将球拟酵母菌TJZKBA10326接种到斜面上,于30℃恒温培养4天,加入质量浓度为0.75%的生理盐水洗涤菌丝体,获得菌悬液,悬液中孢子含量约为7.6×105个,待用;斜面培养基组成包括(1L):葡萄糖8g,麦芽粉3g,蛋白胨4g,酵母粉4g,琼脂15g,用蒸馏水定容至1L,pH值3.5。
(2)上述菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中,液体种子培养基组成包括(1L):菊糖20g,橄榄油20g,酵母粉4g,尿素0.6g,用蒸馏水定容至1L,pH值3.5。将液体种子培养基于121℃、15min灭菌再冷却至室温;然后按照体积比5%的接种量将孢子悬液接入上述冷却的液体种子培养基中(500ml规格的摇瓶装液量是100ml),摇瓶于30℃、转速为110rpm的摇床上培养24h,得到液体种子。
(3)上述液体种子培养基用于接种至灭菌后的5L发酵罐中,发酵罐培养基组成包括(1L):菊糖30g,橄榄油30g,酵母粉5g,尿素0.6g。用蒸馏水定容至3L,pH值4.0,将发酵罐培养基于121℃、15min灭菌再冷却至室温;然后按照体积比2%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中,发酵温度32℃,溶氧控制在30%,发酵时间24h。
(4)发酵24-72h之间,每12h补加浓度为50g/L的橄榄油。发酵过程中,补加浓度为60g/L的葡萄糖,控制葡萄糖浓度在10g/L。溶氧30%,pH值3.6。
(5)发酵72h结束后,用与发酵液等体积的乙酸乙脂/异丙醇(4:1,v/v)混合有机溶剂提取槐糖脂,并在70℃抽真空除去有机溶剂,得到槐糖脂产量为208g/L。
其它同实施例1。
上述参照实施例对用连续发酵生产槐糖脂的方法进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,可根据所限定范围例举出若干个实施例,因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改,应属本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种连续补料发酵生产槐糖酯的方法,其特征在于实施步骤如下:
(1)孢子悬液的制备:将球拟酵母菌TJZKBA10326接种到培养基斜面上,于30℃恒温培养2-4天,加入质量浓度为0.75%的生理盐水洗涤菌丝体,获得菌悬液,悬液中孢子含量为105-106个,待用;斜面培养基组成包括,单位1L:葡萄糖8g,麦芽粉3g,蛋白胨4g,酵母粉4g,琼脂15g,用蒸馏水定容至1L,pH值3.5;
(2)上述菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中,液体种子培养基组成包括,单位1L:糖类含量20-60g,油类含量20-60g,酵母粉4-8g,尿素0.5-1g,用蒸馏水定容至1L,pH值3.5;将液体种子培养基于121℃、15min灭菌再冷却至室温;然后按照体积百分比2-5%的接种量将孢子悬液接入上述冷却的液体种子培养基中,500ml规格的摇瓶装液量是100ml,摇瓶于30-34℃、转速为100-150rpm的摇床上培养24h,得到液体种子;
(3)上述液体种子培养基用于接种至灭菌后的5L发酵罐中,发酵罐培养基组成包括,单位1L:初始糖类含量30-80g,初始油类含量30-80g,酵母粉4-8g,尿素0.5-1g;用蒸馏水定容至3L,pH值4.0-4.5,将发酵罐培养基于121℃、15min灭菌再冷却至室温;然后按照体积比2-5%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中,发酵温度30-34℃,溶氧控制在30-40%,发酵时间24h;
(4)发酵24-72h,每12h补加浓度为30-60g/L的油类;发酵过程中,补加浓度为30-60g/L的葡萄糖,控制葡萄糖浓度在5-10g/L;溶氧20-30%,pH值3.3-3.8;
(5)发酵72h结束后,用与发酵液等体积的有机溶剂乙酸乙脂/异丙醇,所述乙酸乙脂/异丙醇两者比例4:1,单位v/v,混合有机溶剂提取槐糖脂,并在70℃抽真空除去有机溶剂,得到槐糖脂产量为200-240g/L。
2.根据权利要求1所述的连续补料发酵生产槐糖酯的方法,其特征在于所述糖类选用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、菊糖其中一种。
3.根据权利要求1所述的连续补料发酵生产槐糖酯的方法,其特征在于所述油类选用玉米油、菜籽油、大豆油、橄榄油、蓖麻油、花生油其中一种。
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