CN105671106A - 一种采用橄榄油发酵法制备鞘糖脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以橄榄油为原料制备鞘糖脂的方法，其特征在于采用以下步骤：A、以橄榄油为碳源，以斯达油脂酵母菌为菌种，温度为-10℃-20℃，摇床转速为100-300r/min，培养24-48h得到摇瓶菌种；B、配制种子培养基；C、配制发酵培养基；D、将摇瓶菌种接种到种子培养基中，接种体积分率为5-10%，温度为37-50℃，转速为150-300r/min，振荡培养24-36h，得种子培养液；E、取5-15mL步骤D所得种子培养液接种到100-150mL的发酵培养基中，于45-75℃、150-300r/min的条件下摇床振荡培养3-6h；F.、对培养液进行过滤精制，去除发酵培养基中的细胞及未发酵完全的底物烃或碳源物质，得含有鞘糖脂的溶液，经过冷冻干燥得含有鞘糖脂的粉末。本发明以橄榄油为原料，获得鞘糖脂的产率高、纯度高。

Description

一种采用橄榄油发酵法制备鞘糖脂的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种采用橄榄油发酵法制备鞘糖脂的方法。

背景技术

橄榄油在地中海沿岸国家有几千年的历史，含有比任何植物油都要高的不饱和脂肪酸、丰富的维生素A、D、E、F、K和胡萝卜素等脂溶性维生素及抗氧化物等多种成分，并且不含胆固醇，因而人体消化吸收率极高。橄榄油中橄榄油富含与皮肤亲和力极佳的角鲨烯和人体必需脂肪酸，吸收迅速，有效保持皮肤弹性和润泽，而橄榄油中所含丰富的单不饱和脂肪酸和维生素E及酚类抗氧化物质，能消除面部皱纹，延缓肌肤衰老，有护肤护发和防治手足皴裂等功效。

糖类角质层屏障成分（Glycolipids）即糖脂，是糖类通过其还原末端以糖苷键与脂类连接起来的化合物，它是自然界中的一类在细胞膜上承担物质传输和能量传递的具有生理活性的重要物质。鉴于脂质部分的不同，糖脂可分为四类：含鞘氨醇的鞘糖脂；含甘油脂的甘油糖脂；含磷酸多菇醇衍生的糖脂；含类固醇衍生的糖脂。其中的鞘糖脂(GSLs)大多分布在细胞的膜结构中，由糖基和神经酰胺组成，其神经鞘氨醇骨架一侧通过糖苷键连有寡糖链，另一侧通过酰胺键与脂肪酸相连。

目前，通常采用有机全合成方法来制备GSLs，该方法的实验设计主要包括三大部分：糖供应体的合成、鞘氨醇的合成以及通过糖苷化反应获得产物GSLs，该化学合成方法步骤繁琐、产率低下、合成成本较高，且所涉及的试剂污染严重，这些缺陷都不利于工业化生产。而通过生物发酵方法来获得GSLs成为一种低污染、环境友好的高效生产方式。

GSLs与神经酰胺的作用类似，它和构成皮肤角质层的物质结构相近，都是在真核细胞的表面形成一层碳水化合物的网状结构，从而使肌肤达到锁水保湿的功效。其次，GSLs也是细胞脂质双层结构的重要组成部分，有修复肌肤屏障功能的作用。

发明内容

本发明所需解决的技术问题是：提供一种以橄榄油为原料，通过发酵来获得高附加值的鞘糖脂的方法，该方法获得鞘糖脂的产率高、纯度高。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种以橄榄油为原料制备鞘糖脂的方法，其特征在于采用以下步骤：

A、以橄榄油为碳源，以斯达油脂酵母菌（Lipomycesstarkeyi2.1608，中国科学院微生物研究所提供）为菌种，温度为-10℃-20℃，摇床转速为100-300r/min，培养24-48h得到摇瓶菌种；

B、按以下质量比配制种子培养基：DMEM培养基35-55%，橄榄油30-50%，甘露糖3-7%，麦芽糖5-12%，棉子糖3-6%，乳酸0.01-0.3%，酵母粉0.01-0.1%，谢氏丙酸杆菌0.01-0.05%，四氢嘧啶0.01-0.08%，磷酸盐缓冲液0.1-1.0%调整种子培养基PH到6.3-6.7；

C、按以下质量比配制发酵培养基：EMEM培养基58-90%，硝酸钠10-15%，钼酸铵14-20%，乳酸0.01-0.3%，酵母粉0.01-0.1%，谢氏丙酸杆菌0.01-0.05%，四氢嘧啶0.01-0.08%，磷酸缓冲液0.1-1.0%调节发酵培养基的PH到6.0-7.0；

D、将摇瓶菌种接种到种子培养基中，接种体积分率为5-10%，温度为37-50℃，转速为150-300r/min，振荡培养24-36h，得种子培养液；

E、取5-15mL步骤D所得种子培养液接种到100-150mL的发酵培养基中，于45-75℃、150-300r/min的条件下摇床振荡培养3-6h；

F.、对培养液进行过滤精制，去除发酵培养基中的细胞及未发酵完全的底物烃或碳源物质，得含有鞘糖脂的溶液，经过冷冻干燥得含有鞘糖脂的粉末。

上述制备过程中选择以硝酸钠与钼酸铵为发酵培养基的无机盐类，上述两者的混合物为氮源，使得铵和硝基在菌体生长和产物合成中共同协作，从而可达到提高鞘糖脂产量的目的。以单糖甘露糖、双糖麦芽糖、三糖棉子糖作为发酵所用的糖类物质，三者协同作用共同提供产物鞘糖脂的糖极性头，提高了发酵产率。经测定本发明所得粉末中鞘糖脂的含量为8.5%-10.0%。

所述种子培养基的组成及制备方法如下表1所示：

表1：种子培养基的组成及其制备方法

所述发酵培养基的组成及其制备方法如下表2所示：

表2：发酵培养基的组成及其制备方法

将实施例1步骤四中得到的产物进行定性定量检测，其结构如图1所示。

薄层色谱：岛津CS-9301双波长飞点薄层扫描仪，光密度扫描范围200nm-370nm，扫描方式normal扫描结合difference扫描，反射光谱方式SX=3。取鞘糖脂标准样，加入到甲醇中制得1mL含0.05mg的溶液，作为对照品溶液，以苯-异丙醇-水（4:1:1）作为展开剂。然后分别取样品与制得的标准样各2μL，点板展开，晾干后进行荧光扫描测定，通过对比荧光强度的积分值得到所测样品中鞘糖脂的纯度为8.85%。其中硅胶板中斑点对照图如图2所示。

质谱仪：安捷伦6420，电喷雾电离源（ESI），正离子电离模式，离子源温度100℃，脱溶剂温度250℃，脱溶剂氮气流速400L/h。刮取样品与标准样斑点位置一致的硅胶，用乙醇洗脱后浓缩作为测试样品。测试结果为，该鞘糖脂的长骨链骨架为d18:1，正离子模式下的m/z为264.3，而在本测试结果中，高能总离子流量图显示的m/z值与理论值相一致，说明所测物质中存在该骨架的鞘糖脂。其中，其高能总离子流量图3所示，骨架结构如图4所示。

另外，正离子模式下m/z=379.1证明该物质的糖极性头中含有糖醛酸（m=176.07）和半乳糖（m=162.05），其二级质谱图如图5所示。综上所述，可确定得到的产物为图1中所示结构。

实施例1所制备样品的功效评价

将实施例1中得到的样品添加到乳液体系中，按表3配方进行对比试验，考察其保湿效果。其中，配方二为添加0.5%实施例1所制备样品，配方一为对照组。

表3考察实施例1所制备样品保湿功效的乳液配方

随机抽取50名，年龄20-35岁左右的女性志愿者为实验对象，编号1-50，仪器为CorneometreCM825，测试环境为一个空气流动相对稳定，且室温25±2℃，湿度40±5%的房间内，被测试者在测试前至少在测试房间内斜躺30min，使皮肤与测试的标准环境有一个平衡和相对稳定的基值。然后，分别取配方一与配方二的乳液各2mL分别均匀涂抹在受试者面部左右两侧，涂抹30min后，观察其使用前后面部水分的对照情况。

图6中A、B和C分别为50名志愿者在未涂抹乳液前和涂抹配方一乳液与涂抹配方二乳液30min后的皮肤水分含量的平均值（A为未涂抹乳液前的测试值，B为涂抹配方一乳液的测试值，C为涂抹配方二乳液的测试值）。从图中可明显看出，在涂抹含有实施例1制备样品的配方二乳液后，皮肤的水分含量值比未涂抹乳液前提高了100%，而在涂抹配方一的乳液后，水分含量只提高了50%，说明实施例1所制备的样品能够在很大程度上提高皮肤的含水量，从而达到保湿的功效。

附图说明

图1为鞘糖脂的结构图，其中R=CH₃CH₂COOH；

图2为薄层扫描斑点对照图；

图3样品高能总离子流量图；

图4鞘糖脂的长骨链骨架结构图；

图5糖极性头的二级质谱图；

图6皮肤水分含量测试图表。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1：

一种以橄榄油为原料制备鞘糖脂的方法，采用以下步骤：

1）以橄榄油为碳源，以斯达油脂酵母菌（Lipomycesstarkeyi2.1608，中国科学院微生物研究所提供）为菌种，温度为-10℃，摇床转速为100r/min，培养24h得到摇瓶菌种；

2）制备种子培养基与发酵培养基，其配方成分及制备方法详见表4与表5；

3）将菌株接种到种子培养基中，接种体积分率为5%，实验条件控制在37℃，150r/min的范围内振荡培养24h。然后取5mL的种子培养液接种到已灭菌的100mL的发酵培养基中，于45℃、150r/min的条件下摇床振荡培养3h；

4）对培养液进行过滤精制，去除发酵培养基中的细胞及未发酵完全的底物烃或碳源物质，得含有鞘糖脂的溶液，经过冷冻干燥得含有鞘糖脂的粉末。经测定本实施例所得粉末中鞘糖脂的含量为8.85%。

表4：实施例1中种子培养基的配方成分及其处理方法

表5：实施例1中发酵培养基的配方成分及其处理方法

实施例2：

一种以橄榄油为原料制备鞘糖脂的方法，采用以下步骤：

1）以橄榄油为碳源，以斯达油脂酵母菌（Lipomycesstarkeyi2.1608，中国科学院微生物研究所提供）为菌种，温度为0℃，摇床转速为120r/min，培养28h得到摇瓶菌种；

2）制备种子培养基与发酵培养基，其配方成分及制备方法详见表6与表7；

3）将菌株接种到种子培养基中，接种体积分率为6%，实验条件控制在40℃，180r/min的范围内振荡培养27h。然后取6mL的种子培养液接种到已灭菌的110mL的发酵培养基中，于49℃、180r/min的条件下摇床振荡培养4h；

4）对培养液进行过滤精制，去除发酵培养基中的细胞及未发酵完全的底物烃或碳源物质，得含有鞘糖脂的溶液，经过冷冻干燥得含有鞘糖脂的粉末。经测定本实施例所得粉末中鞘糖脂的含量为9.35%。

表6：实施例2中种子培养基的配方成分及其处理方法

表7：实施例2中发酵培养基的配方成分及其处理方法

实施例3：

一种以橄榄油为原料制备鞘糖脂的方法，采用以下步骤：

1）以橄榄油为碳源，以斯达油脂酵母菌（Lipomycesstarkeyi2.1608，中国科学院微生物研究所提供）为菌种，温度为5℃，摇床转速为110r/min，培养30h得到摇瓶菌种；

2）制备种子培养基与发酵培养基，其配方成分及制备方法详见表8与表9；

3）将菌株接种到种子培养基中，接种体积分率为7%，实验条件控制在46℃，210r/min的范围内振荡培养29h。然后取8mL的种子培养液接种到已灭菌的120mL的发酵培养基中，于59℃、120r/min的条件下摇床振荡培养4.8h；

4）对培养液进行过滤精制，去除发酵培养基中的细胞及未发酵完全的底物烃或碳源物质，得含有鞘糖脂的溶液，经过冷冻干燥得含有鞘糖脂的粉末。经测定本实施例所得粉末中鞘糖脂的含量为9.25%。

表8：实施例3中种子培养基的配方成分及其处理方法

表9：实施例3中发酵培养基的配方成分及其处理方法

实施例4：

一种以橄榄油为原料制备鞘糖脂的方法，采用以下步骤：

1）以橄榄油为碳源，以斯达油脂酵母菌（Lipomycesstarkeyi2.1608，中国科学院微生物研究所提供）为菌种，温度为10℃，摇床转速为200r/min，培养36h得到摇瓶菌种；

2）制备种子培养基与发酵培养基，其配方成分及制备方法详见表10与表11；

3）将菌株接种到种子培养基中，接种体积分率为8%，实验条件控制在40℃，150r/min的范围内振荡培养30h。然后取10mL的种子培养液接种到已灭菌的150mL的发酵培养基中，于70℃、300r/min的条件下摇床振荡培养6h；

4）对培养液进行过滤精制，去除发酵培养基中的细胞及未发酵完全的底物烃或碳源物质，得含有鞘糖脂的溶液，经过冷冻干燥得含有鞘糖脂的粉末。经测定本实施例所得粉末中鞘糖脂的含量为8.95%。

表10：实施例4中种子培养基的配方成分及其处理方法

表11：实施例4中发酵培养基的配方成分及其处理方法

实施例5

一种以橄榄油为原料制备鞘糖脂的方法，采用以下步骤：

1）以橄榄油为碳源，以斯达油脂酵母菌（Lipomycesstarkeyi2.1608，中国科学院微生物研究所提供）为菌种，温度为20℃，摇床转速为300r/min，培养48h得到摇瓶菌种；

2）制备种子培养基与发酵培养基，其配方成分及制备方法详见表12与表13；

3）将菌株接种到种子培养基中，接种体积分率为10%，实验条件控制在50℃，280r/min的范围内振荡培养36h。然后取5mL的种子培养液接种到已灭菌的150mL的发酵培养基中，于75℃、300r/min的条件下摇床振荡培养6h；

4）对培养液进行过滤精制，去除发酵培养基中的细胞及未发酵完全的底物烃或碳源物质，得含有鞘糖脂的溶液，经过冷冻干燥得含有鞘糖脂的粉末。经测定本实施例所得粉末中鞘糖脂的含量为10.0%。

表12：实施例5中种子培养基的配方成分及其处理方法

表13：实施例5中发酵培养基的配方成分及其处理方法

Claims (1)

1.一种以橄榄油为原料制备鞘糖脂的方法，其特征在于采用以下步骤：

A、以橄榄油为碳源，以斯达油脂酵母菌为菌种，温度为-10℃-20℃，摇床转速为100-300r/min，培养24-48h得到摇瓶菌种；

B、按以下质量比配制种子培养基：DMEM培养基35-55%，橄榄油30-50%，甘露糖3-7%，麦芽糖5-12%，棉子糖3-6%，乳酸0.01-0.3%，酵母粉0.01-0.1%，谢氏丙酸杆菌0.01-0.05%，四氢嘧啶0.01-0.08%，磷酸盐缓冲液0.1-1.0%调整种子培养基PH到6.3-6.7；

C、按以下质量比配制发酵培养基：EMEM培养基58-90%，硝酸钠10-15%，钼酸铵14-20%，乳酸0.01-0.3%，酵母粉0.01-0.1%，谢氏丙酸杆菌0.01-0.05%，四氢嘧啶0.01-0.08%，磷酸缓冲液0.1-1.0%调节发酵培养基的PH到6.0-7.0；

D、将摇瓶菌种接种到种子培养基中，接种体积分率为5-10%，温度为37-50℃，转速为150-300r/min，振荡培养24-36h，得种子培养液；

E、取5-15mL步骤D所得种子培养液接种到100-150mL的发酵培养基中，于45-75℃、150-300r/min的条件下摇床振荡培养3-6h；

F.、对培养液进行过滤精制，去除发酵培养基中的细胞及未发酵完全的底物烃或碳源物质，得含有鞘糖脂的溶液，经过冷冻干燥得含有鞘糖脂的粉末。