KR102134723B1

KR102134723B1 - 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물

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Publication number: KR102134723B1
Application number: KR1020190114279A
Authority: KR
Inventors: 권성필; 이현석; 장동철; 김홍유; 최대웅
Original assignee: 청담씨디씨제이앤팜 유한책임회사
Priority date: 2019-09-17
Filing date: 2019-09-17
Publication date: 2020-07-16

Abstract

본 발명은 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물 제조방법에 관한 것으로, 고농도의 레스베라트롤을 함유함으로 말미암아, 뛰어난 항산화 효능, 항균력을 발휘할 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조한 포도 추출물을 포함하는 리포좀을 제공하는데, 이를 통해 레스베라트롤을 안정성 있게 유지할 수 있으며, 피부 투과도가 증가하여, 세포 내 세라마이드 함량을 증진시킬 수 있는 화장품을 제조할 수 있다.

Description

레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 {Method for production of grape extract with enhanced resveratrol content and cosmetic composition therefrom}

본 발명은 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

아토피성 피부염은 피부 건조와 소양증을 특징으로 하는 가장 흔한 만성 염증성 피부 질환 중 하나로 유전적인 소인과 여러 외부 요인과의 상호작용을 포함한 병리생리학적인 면을 가지고 있으며, 환경오염으로 인한 피부 세포에 활성산소(free radical)가 과잉 발생하는 것도 아토피성 피부염과 밀접한 관계가 있다. 자유 라디칼은 자외선, 대기 오염 물질, 자동차 배기가스 등의 요인들에 의해 과잉 발생되며, 피부의 불포화 지방산에 활성 산소가 결합하여 과산화 지질이 생성되면 각질층의 보습기능이 파괴되어 피부를 건조하게 만들게 되고 결과적으로 피부염증을 악화시키게 된다.

아토피 피부염의 전형적인 현상인 건조한 피부의 특징은 피부거침(roughness)과 각질(scaling)이며 때로 홍반(redness), 피부균열(cracking), 가려움증(itching) 등이 있다. 일반적으로 아토피 피부염은 각질층 내의 세라마이드(ceramides)의 함량이 감소됨에 따라 발생하는 것으로서 각질층의 수분 유지기능이 떨어짐에 따라 피부가 건조되어 각질이 쉽게 일어나는 등 피부 장벽(skin barrier) 기능이 저하됨에 따라 자극유발물질이 각질층 내로 침입하여 자극을 유발시키고, 정상피부에서는 침입하기 어려운 항원 단백질이 침입함에 따라 피부 알러지 등이 용이하게 발생하여 견디기 힘들 만큼의 소양증 증상을 나타내게 된다.

아토피 치료제는 주로 증상을 완화하기 위한 것들이 주를 이루고 있으며, 그 원인을 명확하게 밝히지 못함에 따른 근본적인 치료제의 개발이 이루어지지 못하고 있는 실정이다. 따라서, 천연물을 활용하여 아토피성 피부질환 개선용 소재 및 제품 개발을 이루어 내는 것이 관련 시장 진입 및 경쟁력 확보를 위해선 필요하다.

대한민국 공개특허 10-2014-0143644호(공개일자:2014.12.17)는 초임계 추출 편백 정유를 이용한 아토피 피부염 개선을 위한 피부외용 조성물에 관한 것으로, 초임계 유체 추출법을 이용하여 추출한 편백 정유를 함유하여 아토피 피부염을 개선시킬 수 있으며 보습활성이 우수한 피부외용 조성물에 대해 기재되어 있다.

본 발명은 항산화 효능, 항균력이 뛰어난 천연물의 추출물을 발굴하고, 이를 유효성분으로 포함하는 리포좀을 함유하는 화장료 조성물을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 포도에 자외선을 조사한 후, 0~80% 에탄올 수용액을 용매로 가하여 20~60℃ 온도에서 10~120분간 초음파 추출하는 것을 특징으로 하는 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물의 제조방법에 있어서, 상기 포도는, 바람직하게 포도의 과피 또는 가지인 것이 좋다.

본 발명의 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물의 제조방법에 있어서, 상기 자외선 조사는, 바람직하게 자외선을 1~4일 동안 조사하는 것이 좋다.

본 발명은 상기 본 발명의 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물의 제조방법에 의해 제조한 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물을 함유하는 리포좀을 제공한다.

본 발명은 상기 본 발명의 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물의 제조방법에 의해 제조한 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물을 함유하는 리포좀을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 레스베라트롤의 함량이 증진되 포도 추출물 제조방법을 제공하는데, 고농도의 레스베라트롤을 함유함으로 말미암아, 뛰어난 항산화 효능, 항균력을 발휘할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조한 포도 추출물을 포함하는 리포좀을 제공하는데, 이를 통해 레스베라트롤을 안정성 있게 유지할 수 있으며, 피부 투과도가 증가하여, 세포 내 세라마이드 함량을 증진시킬 수 있는 화장품을 제조할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 포도 추출물 제조 공정을 모식화한 것이다.
도 2는 UV 조사 기간(1~4일)에 따른 레스베라트롤 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3의 A)는 UV 조사 기간(1~4일)에 따른 총 페놀(Total polyphenol) 함량 변화, B)는 총 플라보노이드(Total flavonoid) 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 zebrafish 생존율에 대한 포도 과피 및 포도 가지 추출물의 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 5는 zebrafish 심장 박동률에 대한 포도 과피 및 포도 가지 추출물의 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 6은 포도 과피 추출물 및 포도 가지 추출물의 DPPH 소거능을 측정한 결과 그래프이다.
도 7은 포도 과피 추출물 및 포도 가지 추출물의 ROS 생성량에 대한 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 8은 포도 과피 추출물과 포도 가지 추출물의 지브라피시(zebrafish) 체내 ROS 소거 활성을 나타낸 결과그래프이다.
도 9는 포도 과피 추출물과 포도 가지 추출물의 지브라피시(zebrafish) 세포 사멸 보호 활성을 나타낸 결과그래프이다.
도 10은 포도 과피 추출물 및 포도 가지 추출물의 항균력 측정 결과 그래프이다.
도 11은 포도 과피 추출물과 포도 가지 추출물의 HaCaT에서의 세포 생존율(cell viability) 측정 결과 그래프이다.
도 12는 포도 과피 추출물과 포도 가지 추출물의 C16, 18, 20, 22, 24:1, 24 그리고 18-d7 세라마이드의 크로마토그램(chromatogram) (A) 및 세라마이드 정량을 위한 검정곡선(B)이다.
도 13은 포도 과피 추출물과 포도 가지 추출물 농도에 따른 세포 내 세라마이드 함량 변화를 나타낸 결과그래프이다.
도 14는 포도 과피 추출물을 함유하는 리포좀 제형 안정성 시험 결과 그래프이다.
도 15는 포도 과피 추출물을 함유하는 리포좀 제형의 TEM 사진이다.
도 16은 리포좀 제형 1% 함량의 화장품 제조를 나타낸 그림이다.

포도는 포도나무의 열매로 장과(漿果)이며, 향미가 좋고 과즙이 풍부하여 널리 이용되는 과일이다. 성숙함에 따라 당분이 증가하고 산이 감소하며, 완숙하면 당분이 최대가 된다. 품종은 캠벨 얼리, 머스캣 배일리, 블랙 함부르크, 델러웨어 등 다양하고 주로 생과로 먹으며, 포도주·주스 등의 음료와 잼, 건과, 통조림 등으로 가공하여 먹는다.

본 발명에서 상기 포도는 특별한 종에 한정되지 않고 다양한 종을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 크림슨 종 또는 캠벨 종을 사용하는 것이 좋다. 또한, 본 발명에서 포도는 바람직하게 포도의 과피 또는 가지를 사용하는 것이 좋다. 도 1에는 본 발명에 따른 포도 추출물의 제조과정을 모식화하여 나타내었다.

본 발명의 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물의 제조방법에 있어서, 상기 자외선 조사는, 바람직하게 자외선을 1~4일 동안 조사하는 것이 좋다. 이를 통해 추출물 중 레스베라트롤의 함량을 극대화 할 수 있기 때문이다.

한편, 본 발명은 상기 본 발명의 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물의 제조방법에 의해 제조한 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물을 함유하는 리포좀을 제공한다.

리포좀은 공지의 방법에 의하여 제조할 수 있는데, 본 발명에서는 인지질로 대두(soybean)에서 추출한 레시틴으로 포스파티딜콜린(phosphatidyl choline) 성분이 95% 이상인 것을 사용하였다. 레시틴은 글리세롤의 한쪽에는 콜린, 인산 등의 친수성 성분이 결합되고 다른쪽에는 소수성의 아실기가 결합된 구조를 가지고 있어 계면활성을 가지므로 주로 유화제의 목적으로 사용된다.다만, 본 발명에서 사용하는 용어, '레시틴'은 천연계면활성제인 레시틴만을 지칭하는 것이 아니라, 이외에 레시틴으로부터 유래한 계면활성제를 모두 포함하는 것으로 정의하며, 인지질로 사용되어 리포좀을 제조하는 것에 사용할 수 있는 것이면 종류에 상관 없이 어느 것이나 본 발명에서 사용할 수 있다.

리포좀(Liposome)은 물을 좋아하는 성질인 친수성(hydrophilic) 부위와 물을 싫어하는 성질인 소수성(hydrophobic) 부위를 동시에 가지고 있는 양친매성 지질의 생체세포막의 구성성분인 인지질을 주성분으로 사용하여 형성된 지질이중막 구조의 소포체이다. 유용물질을 리포좀 내에 탑재함으로써, 유용물질의 안정성 향상을 도모할 수 있고, 피부 투과도를 증진시킬 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 본 발명의 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물의 제조방법에 의해 제조한 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물을 함유하는 리포좀을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다. 하기 실험에 의하면, 본 발명의 화장료 조성물은 레스베라트롤을 안정성 있게 유지할 수 있으며, 피부 투과도가 증가하여, 세포 내 세라마이드 함량을 증진시킬 수 있는 효과가 발휘된다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형은 특별한 것에 한정되는 것은 아니며, 공지의 여러 제형을 다 포함할 수 있음을 밝혀두는 바이다.

이하, 본 발명에 대해 하기 실시예 및 실험예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 모두 포함한다.

[실시 예 1 : 포도 추출물 제조를 위한 공정 확립]

1) 최적 추출법 확립 위한 과피, 과육 및 가지를 대상으로 하는 샘플 제조

포도의 추출 수율 및 유효성분 추출의 향상을 위해 포도(크림슨 종 포도 사용)의 과피, 과육 및 가지를 동결건조시켜 분말을 제조한 후, 이를 이용하여 추출법 개선을 위한 샘플 제조를 진행하였다. 하기와 같이 추출 조건을 달리하여 샘플을 제조하고, 샘플 내 유효성분의 함량을 하기에서 분석하였다.

(1) 포도의 과피, 과육 및 가지 분말 5 g에 0, 30, 50, 80 % 에탄올 50 mL을 가하여 상온에서 10 분간 초음파 추출한 후 4000 rpm, 10 분간 원심분리하여 상층액을 0.45 um 실린지 필터로 여과 (다양한 에탄올 함량의 용매를 사용한 샘플).

(2) 포도의 과피, 과육 및 가지 분말 5 g에 80 % 에탄올 50 mL을 가하여 상온, 40, 60 ℃에서 10 분간 초음파 추출한 후 4000 rpm, 10 분간 원심분리하여 상층액을 0.45 um 실린지 필터로 여과 (다양한 온도에서 초음파 추출을 수행한 샘플).

(3) 포도의 과피, 과육 및 가지 분말 5 g에 80 % 에탄올 50 mL을 가하여 상온(20℃)에서 10분, 30분, 60분, 90분, 120분 간 초음파 추출한 후 4000 rpm, 10 분간 원심분리하여 상층액을 0.45 um 실린지 필터로 여과 (다양한 추출시간에 따른 샘플).

2) 레스베라트롤의 고수율 추출을 위한 샘플 제조

포도(캠벨 종 사용)를 과피와 가지로 분리하여 (과육에는 레스베라트롤 함량이 낮아, 과육은 하기 실험에서 제외함) 동결 건조 후 상기 및 하기에서 확립된 최적화된 추출조건으로 추출물(샘플)을 수득하였다. 하지만, 추출한 시료의 레스베라트롤 함량이 동결건조 분말 기준 5 μg/g 이하로 나타났다. 원료로 사용하기에는 레스베라트롤 함량이 너무 낮아 레스베라트롤 함량을 증가시킬 수 있는 자외선 조사법을 개발하고자 하였으며, 그를 위한 샘플을 하기와 같이 제조하였다.

(1) 포도에 자외선을 1~4일간 1일 간격으로 각각 조사한 샘플.

(2) 포도에 자외선을 조사하지 않은 샘플.

(3) 포도에 자외선을 조사하지 않고 7일 방치한 샘플.

상기의 세가지 샘플을 대상으로 하기에 레스베라트롤을 비롯한 여러 유효성분 함량을 각각 분석하였고, 피부 효능을 비롯한 각종 기능성을 분석하였다.

3) 상기 샘플들을 대상으로 HPLC를 이용한 레스베라트롤 및 프테로스틸벤 함량 분석

상기에서 수득한 샘플들의 레스베라트롤과 프테로스틸벤 함량을 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography, HPLC)를 사용하여 분석하였다. HPLC 분석 조건은 이동상 A: 0.1 % acetic acid in DI, B: 0.1 % acetic acid in acetonitrile을 사용하여 그래디언트(gradient) 조건(표 1)에서 1 mL/min 유속으로 분리하였다. Luna C18 (250 x 4.6 mm, 5 μm) 컬럼을 사용하였으며, 레스베라트롤과 프테로스틸벤 검출을 위해 사용한 파장은 306 nm이었다. 표준용액으로 레스베라트롤과 프테로스틸벤을 6.25~50 μg/mL 농도로 제조하여 검량선 작성에 사용하였다.

레스베라트롤과 프테로스틸벤 분석을 위한 그래디언트(gradient) 조건

Time (min)	A (%)	B (%)
0	60	40
7	60	40
7.5	0	100
15	0	100
15.1	60	40
25	60	40

레스베라톨 추출 수율을 분석한 결과, 우선 상기 (1)에서 제조한 샘플에 있어, 과실은 모든 조건에서 레스베라트롤이 검출되지 않았다. 가지 분말은 다양한 조건하에서 추출 조건을 최적화한 결과, 하기 표 2와 같이 80% 에탄올, 상온, 추출시간 10분에서 레스베라트롤의 추출 수율이 가장 높았다.

추출 조건에 따른 크림슨 포도의 레스베라트롤 추출 수율

		과실(㎍/g)	RSD (%)	가지 (㎍/g)	RSD (%)
에탄올 (%)	0	-	-	-	-
	30	-	-	31.53	3.2
	50	-	-	62.70	2.6
	80	-	-	97.75	2.8
추출온도 (℃)	상온	-	-	98.29	3.1
	40	-	-	96.37	2.8
	60	-	-	95.84	2.9
추출시간 (min)	10	-	-	98.12	2.9
	30	-	-	96.97	3.2
	60	-	-	95.99	3.1

*RSD: 상대표준편차

한편, UV를 조사하지 않은 시료와 3일 UV 조사 시료의 과피와 가지의 레스베라트롤 추출 조건을 확인한 결과, 하기 표 3과 같이 과피는 80% 에탄올, 상온, 추출시간 30분, 가지는 80% 에탄올, 상온, 추출시간 60분 조건에서 추출 수율이 가장 높게 나타났다.

UV 조사(3일 조사 샘플)에 따른 레스베라트롤 추출 수율의 변화 확인

		UV day 0				UV day 3
		과피 (㎍/g)	RSD (%)	가지 (㎍/g)	RSD (%)	과피 (㎍/g)	RSD (%)	가지 (㎍/g)	RSD (%)
에탄올 (%)	0	-	-	-	-	-	-	-	-
	30	0.55	1.99	132.66	2.44	414.28	1.73	391.06	1.80
	50	1.54	2.43	171.56	1.80	532.75	2.01	498.32	1.97
	80	4.00	2.04	268.98	2.10	826.52	1.61	778.03	1.32
추출온도 (℃)	상온	4.05	1.36	270.31	1.68	824.04	1.45	776.74	1.48
	40	3.88	1.91	261.73	1.26	802.63	1.30	762.77	1.75
	60	3.63	1.95	254.65	0.78	784.64	1.64	749.28	1.24
추출시간 (min)	10	3.18	1.55	245.93	2.54	744.19	2.22	712.62	2.03
	30	3.99	1.36	257.94	1.85	825.02	1.45	744.97	1.90
	60	3.79	1.72	270.15	2.28	804.38	1.60	776.88	1.91
	90	3.60	1.59	259.93	2.02	786.14	1.03	749.61	1.76
	120	3.15	2.15	245.76	2.09	741.73	1.65	706.39	2.13

*RSD: 상대표준편차

한편, 자외선 조사의 시간을 1~4일간으로 다양하게 조사한 시료와 조사하지 않은 시료의 레스베라트롤과 프테로스틸벤 함량을 분석한 결과, 도 2와 같이 UV를 조사하지 않은 포도의 레스베라트롤 함량은 과피 4.02 ㎍/g, 가지 269.41 ㎍/g으로 나타났다. 하지만, UV조사한 시료 중 3일 조사 시료는 과피 825.5 ㎍/g, 가지 777.14 ㎍/g으로 나타나 레스베라트롤 증가율이 각각 16,955%, 225%로 큰 폭으로 증가하였다. 다만, 레스베라트롤의 함량은 크게 증가하였지만, 프테로스틸벤은 UV를 조사한 시료에서도 검출되지 않았다.

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[실험예 1: 상기 실시예 1에서 제조한 샘플의 피부 효능 분석]

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 샘플의 독성 평가, 항산화 효능, 항균력 및 아토피 보호 효능을 확인하고자 하였다.

1) in vivo (zebrafish)에서의 독성 평가

(1) 생존율 측정

독성 평가로서 먼저 생존율(survival rates)을 측정하였다. 24 well plate에 well 당 10개의 수정 후 7-9 hpf (hour post fertilization)이 된 제브라피시 배아(embryos)를 넣고, embryo media를 0.95 ml 채워주었다. UV를 3일간 조사한 것과 조사하지 않은 것의 포도 과피 추출물과 포도 가지 추출물을 각각 50 ㎕ 씩 처리한 후 7 (day post fertilization)까지 매일 생존율을 측정였다.

그 결과, 도 4와 같이 UV를 3일간 조사한 포도 가지 추출물과 UV를 조사하지 않은 포도 가지 추출물 모두 고농도(200 μg/ml)를 처리하였을 때 독성을 나타내는 것으로 확인하였고, Control군과 100 μg/ml 이하 농도 처리군에서는 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.

하지만, UV를 3일간 조사한 포도 과피 추출물과 UV를 조사하지 않은 포도 과피 추출물은 모든 실험군에서 Control군과 함께 독성을 나타내지 않는 것으로 확인하였다.

(2) 심장 박동률(hearbeat rates)을 측정

24 well plate에 well 당 5개의 수정 후 7-9 hpf (hour post fertilization)이 된 제브라피시 배아(embryos)를 넣고, embryo media를 0.95 ml 채워주었다. UV를 3일간 조사한 것과 조사하지 않은 것의 포도 과피 추출물과 포도 가지 추출물을 각각 50 ㎕ 씩 처리한 후 48 hpf에 유충(larvae)을 1마리씩 슬라이드 글라스(slide glass)에 올려놓은 후 광학현미경 관찰 하에 1분 동안 심장 박동수를 측정하였다.

그 결과, 도 5와 같이 UV를 3일간 조사한 포도 가지 추출물과 UV를 조사하지 않은 포도 가지 추출물 모두 고농도(200 μg/ml)를 처리하였을 때 심장 박동률이 증가하는 것을 확인하였고, 100 μg/ml 이하 농도 처리군에서는 Control군과 유사한 심장 박동률을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, UV를 3일간 조사한 포도 과피 추출물과 UV를 조사하지 않은 포도 과피 추출물을 처리한 모든 실험군에서 Control군과 유사한 심장 박동률을 나타내는 것을 확인하였다.

2) 항산화 효능 측정

항산화 효능 측정을 위해 in vitro 및 in vivo 실험을 수행하였다.

(1) DPPH 어세이(DPPH assay)

0.2 mM DPPH(1,1-dipenyl-2-picrylhydrazyl)사용하여 DPPH 소거능 측정 결과, 도 6과 같이 UV를 조사하지 않은 포도 과피 추출물과 3일간 조사한 포도 과피 추출물의 IC50 값은 각각 389.4 ㎍/mL과 382.5 ㎍/mL로 나타나 거의 비슷하였으나, UV를 3일간 조사한 포도 과피 추출물의 DPPH 소거 활성이 상대적으로 더 좋게 나타났다.

또한, UV를 조사하지 않은 포도 가지 추출물과 3일간 조사한 포도 가지 추출물의 IC50 값은 각각 30.5 ㎍/mL과 38.0 ㎍/mL로 나타나, UV를 조사하지 않은 포도 가지 추출물의 DPPH 소거 활성이 상대적으로 더 좋게 나타났으며, 포도 과피 추출물 보다 훨씬 좋은 효능을 보였다.

(2) ROS 생성량 측정 평가

HaCaT 세포를 3X10⁴cells/ml과 8X10⁴cells/ml로 각각 96 well plate에 시딩(seeding)하여 배양하였다. 24시간 후 UV를 3일간 조사한 것과 조사하지 않은 것의 포도 과피와 포도 가지 추출물을 2시간 전처리 후, H₂O₂ 1mM을 24시간 동안 처리하여 세포생존율을, 30분간 처리하여 ROS(Reactive oxygen species) 생성량을 측정하였다.

ROS 생성량은 DCFH-DA 형광시약(10 μM)을 처리하여 ROS 생성량을 확인하였고, 세포보 효과(세포생존율)는 MTT 시약을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 도 7과 같이 과산화수소를 처리하였을 때 세포상에서 ROS가 증가되던 것이 포도 과피 추출물과 포도 가지 추출물을 처리하였을 때 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.

(3) 지프라피시 배아(zebrafish embryos)의 ROS 생성량 및 세포사멸(cell death) 측정

12 well plate에 well 당 15개의 수정 후 7-9 hpf (hour post fertilization)이 된 제브라피시 배아(embryos)를 넣고, embryo media를 0.9 ml 채워주었다. UV를 3일간 조사한 것과 조사하지 않은 것의 포도 과피 추출물과 포도 가지 추출물을 각각 50 ㎕ 씩 1시간 처리한 후 AAPH를 처리하였다. AAPH 처리 후 3 dpf(day post fertilization) 때에 DCFH-DA 형광시약(20 μg/ml)과 아크리딘 오렌지(Acridine orange) 형광시약(7 μg/ml)을 각각 처리하여 지프라피시(zebrafish) 체내 ROS 생성량과 세포 사멸을 형광현미경으로 측정하여 항산화 효능을 측정하였다.

그 결과, 도 8과 같이 UV를 3일간 조사한 포도 가지 추출물과 UV를 조사하지 않은 포도가지 추출물 모두 AAPH에 의해 지브라피시(zebrafish) 체내 축적된 ROS를 감소시키는 활성이 나타났고, 고농도 (100 μg/ml)에서 비교하였을 때 UV를 조사하지 않은 포도 가지 추출물의 지브라피시(zebrafish) 체내 ROS 축적이 Control 군과 유사하게 나타났다.

그리고, UV를 3일간 조사한 포도 과피 추출물과 UV를 조사하지 않은 포도 과피 추출물 모두 AAPH에 의해 지브라피시(zebrafish) 체내 축적된 ROS를 감소시키는 활성이 나타났으나, UV를 조사한 포도 과피 추출물의 저농도 (50 μg/ml)에서는 ROS를 감소시키는 효능이 없었고, UV를 조사하지 않은 포도 과피 추출물은 처리한 모든 농도에서 ROS를 감소시키는 효능을 나타냈다.

또한, 도 9와 같이 UV를 3일간 조사한 포도 가지 추출물과 UV를 조사하지 않은 포도 가지 추출물 모두 AAPH에 의해 지브라피시(zebrafish)의 세포 사멸 (cell death)을 감소시키는 효능을 나타냈다.

그리고 UV를 3일간 조사한 포도 과피 추출물과 UV를 조사하지 않은 포도 과피 추출물 모두 AAPH에 의해 지브라피시(zebrafish)의 세포 사멸 (cell death)을 감소시키는 효능을 나타냈다.

(4) 항균력 측정

포도 과피 추출물 및 포도 가지 추출물의 항균력 측정을 위해 한천 배지 확산법(paper disk diffusion method)으로 측정하였으며, 사용한 균주는 황색포도상구균(S. aureus)이었다.

항균력 측정 결과, 도 10과 같이 포도 과피 추출물은 UV 조사 0일과 3일 모두 clear zone이 형성되지 않아 항균력이 없는 것으로 나타났다. 포도 가지 추출물은 clear zone이 형성되어 항균력이 있는 것으로 나타났으나, UV 조사 0일과 3일 시료간의 항균력 차이는 없었다.

[실험예 2: 스핑고지질 대사체 분석]

본 실험예에서는 자외선을 3일간 처리한 포도 과피 추출물 및 포도 가지 추출물의 스핑고지질 대사체 함량을 분석하고자 하였다.

1) HaCaT 세포의 세포 생존율(cell viability) 측정

HaCaT 세포를 배양하여 자외선을 3일간 처리한 포도 과피 추출물 0.105~0.843 mg/mL와 가지 추출물 0.026~0.208 mg/mL 농도로 각각 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, HaCaT 세포에서 시험물질의 세포독성을 조사하기 위해 포도 과피 추출물과 포도 가지 추출물을 다양한 농도로 세포 배양액에 처리하여 24시간 배양한 후 MTT assay를 실시하였다. 그 결과, 도 11과 같이 포도 과피 추출물 0.105~0.843 mg/mL와 포도 가지 추출물 0.026~0.208 mg/mL 농도로 처리한 경우 세포 생존율에는 영향을 미치지 않았다. 따라서 포도 과피 추출물 0.211~0.843 mg/mL와 가지 추출물 0.052~ 0.208 mg/mL 농도로 이후 실험 진행시 추출물 처리 농도를 설정하여 수행하였다.

2) 스핑고지질 대사체 분석

HaCaT 세포를 UV를 3일간 조사한 포도 과피 추출물 0.211~0.843 mg/mL와 포도 가지 추출물 0.052~0.208 mg/mL 농도로 각각 처리하여 24시간 동안 배양하였다. control (음성대조군)은 추출물을 용해시킨 용매를 첨가하여 배양한 세포를 사용하였다.

배양 세포를 모아 용해(lysis)시킨 후 단백질 정량하여 100 ㎍에 해당하는 용해물(lysate)에 400 ㎕ 메탄올, 0.1 M 염산 300 ㎕ 그리고 800 ㎕ 클로로포름을 넣고 30분 동안 추출 후 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 클로로포름층을 새로운 튜브로 회수하여 진공원심분리 농축기를 사용하여 건조 후 100 ㎕ 메탄올에 재용해하여 LC-MS/MS 분석을 하였다.

LC-MS/MS 분석 조건은 이동상 A: 2 mM ammonium formate in DI (1% formic acid), B: 1 mM ammonium formate in methanol (1% formic acid)을 사용하여 그래디언트(gradient) 조건(표 8)에서 0.3 mL/min 유속으로 분리하였다. Kintex C18 (100 x 2.1 mm, 2.6 μm) 컬럼을 사용하였으며 스핑고지질은 selected reaction monitoring (SRM) 모드를 사용하여 d18:1/C16:0 m/z 538.7 → 264.2, d18:1/C18:0 m/z 566.7 → 264.2, d18:1/C20:0 m/z 594.7 → 264.2, d18:1/C22:0 m/z 622.7 → 264.2, d18:1/C24:1 m/z 648.7 → 264.2, d18:1/C24:0 m/z 650.7 → 264.2 그리고 d18:1/C18:0-d7 m/z 573.5 → 271.3에서 ceramide를 검출하였다. 세라마이드 MS/MS 조건은 하기 표 9와 같았다. 이온화 조건은 ESI voltage 3.5 kV, Capillary 온도는 300 ℃이다. 표준용액으로는 N-아실 체인 길이(N-acyl chain length)에 따른 각각의 세라미아드 표준품을 0.00781 ~ 1 μM 농도로 제조하여 검정곡선 작성에 사용하였다. 각 시료와 표준품에 100 pmol의 d18:1/C18:0-d7 첨가하여 내부표준물질로 사용하였다.

세라마이드 분석을 위한 그래디언트(gradient) 조건

Time (min)	A (%)	B (%)
0	10	90
6	0	100
18	0	100
18.5	10	90
20	10	90

세라마이드 MS/MS 조건

Ceramide	Precursor ion (m/z)	Product ion (m/z)	CE (eV)
d18:1/C16:0	538.7	264.2	25
d18:1/C18:0	566.7	264.2	25
d18:1/C20:0	594.7	264.2	30
d18:1/C22:0	622.7	264.2	30
d18:1/C24:0	650.7	264.2	30
d18:1/C24:1	648.7	264.2	30
d18:1/C18:0-d7	573.5	271.3	25

C16, 18, 20, 22, 24:1, 24 그리고 C18-d7 세라마이드의 검출시간은 각각 7.38, 8.51, 9.71, 11.14, 11.22, 12.73 그리고 8.44 분에 모두 분리되어 검출되었다. 세라마이드의 크로마토그램(chromatogram) 및 검정곡선은 도 12와 같았다.

스핑고지질 대사체 분석 결과, 하기 표 10 및 도 13과 같이 Control의 C16, C18, C20, C22, C24:1 그리고 C24 세라마이드 함량은 각각 143.81, 5.90, 4.98, 50.95, 174.94 그리고 345.32 pmol/mg protein로 나타났다. 이에 비교할 때, 특히 포도 과피 추출물 0.843 mg/mL 농도로 처리한 세포의 세라마이드 함량은 각각 179.45, 6.93, 6.58, 74.85, 314.47 그리고 422.54 pmol/mg protein으로 나타나 control 대비 각각 25, 18, 32, 47, 80, 22 % 증가하였다.

포도 과피 추출물과 포도 가지 추출물의 농도에 따른 세포 내 세라마이드 함량 변화

AVG. (pmol/mg protein)	C16	C18	C20	C22	C24:1	C24
Control	143.81	5.90	4.98	50.95	174.94	345.32
과피 0.211 mg/mL	123.57	4.29	3.12	44.65	184.85	367.67
과피 0.421 mg/mL	115.43	5.03	3.61	51.79	191.07	384.03
과피 0.843 mg/mL	179.45	6.93	6.58	74.85	314.47	422.54
가지 0.052 mg/mL	123.17	4.47	3.18	33.17	183.34	161.49
가지 0.104 mg/mL	118.25	4.59	4.52	46.51	188.66	214.54
가지 0.208 mg/mL	153.15	6.80	6.19	58.24	163.15	252.03

[실시예 2: 포도 과피 추출물을 함유하는 리포좀 제조]-

본 실시예에서는 상기에서 UV를 3일간 처리하여 제조한 포도 과피 추출물을 함유하는 리포좀을 제조하였다.

리포좀 제조에 사용된 인지질은 대두(soybean)에서 추출한 지질을 수소 첨가시켜 불포화 성분을 제거한 레시틴으로 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline) 성분이 95%이상인 Emulmetik 950 (Lucas Meyer사)을 사용하였다. 인지질과 소듐 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate)를 9:1 비율로 혼합한 후 동량의 에탄올을 첨가하여 60 ℃ 항온조에서 완전히 용해시켜 투명한 졸 용액을 만들었다.

이를 상온에 굳힌 후 다시 60 ℃ 항온조에 가져가 투명한 졸 용액이 되면 UV를 3일간 처리하여 제조한 포도 과피 추출물을 넣고 10 min 이상 자석 교반시켰다. 50 ℃에서 감압 조건으로 플라스크 내부에 지질막(lipid film)이 형성되도록 완전히 건조하였다. 지질막에 증류수를 첨가하여 수화한 후, 2000 rpm, 10 min 동안 균질화(homogenizing)하여 최종 인지질 함량 2%의 리포좀을 완성하였다.

상기 포도 과피 추출물을 함유하는 리포좀 제형이 안정적으로 유지하는지 확인하기 위해 리포좀 제형을 제조 후 보관 튜브를 차광하여 상온에서 보관하여 4주 동안 매주 리포좀 제형 안정성을 분석하였다.

그 결과, 도 14와 같이 초기 포집율이 85.04%로 나타났으며, 4 주차 포집율이 85.28%로 초기 농도 대비 100.3%로 리포좀 제형이 큰 변화 없이 초기 포집율과 유사하게 유지하고 있었다.

또한, 완성된 리포좀 현탁액의 일정량을 취하여 0.1 μm 시린지 필터(syringe filter)를 사용하여 리포좀을 제거하였다. 그 후, 리포좀에 포집되지 않은 레스베라트롤의 함량과 초기 추출물의 레즈베라트롤의 함량을 HPLC로 분석하여 정량하였다. 포집효율은 HPLC를 이용해 나온 값을 하기 수학식 1에 대입하여 리포좀의 포집 효율을 계산하였다.

측정 결과, 초기 추출물의 레즈베라트롤 농도 89.45 μg/mL에서 리포좀에 포집되지 않은 레즈베라트롤의 농도는 14.19 μg/mL로 리포좀 제형의 포집효율은 84.13%으로 높게 나타났다.

한편, 상기에서 제조한 포도 과피 추출물을 함유하는 리포좀 제형을 전계방출 투과전자현미경(FE-TEM)으로 입자의 크기와 형태를 관찰하였다. 그 결과, 도 15과 같이 수십 나노 크기의 구형 입자를 확인하였다.

[실험예 3: 상기 실시예 2에서 제조한 리포좀 제형의 피부투과도 평가]

본 실험예에서는 상기 실시예 2에서 제조한 리포좀 제형의 피부투과도를 평가하고자 하였다. 피부투과도 시험 방법은 skin pampa 테스트로 수행하였다. 프리즈마 버퍼(prisma buffer)로 블랭크(blank)를 준비하고 분석(reading)하였다.

다음으로 deep well plate에 샘플을 준비하는 과정으로서, deep well plate에 프리즈마 버퍼(prisma buffer) 1,000ul를 pH-map에 따라 넣고, 스톡 플레이트(stock plate)의 뚜껑을 열고 8channel pipettor를 이용하여 샘플 5ul를 따서 deep well plate로 옮겼다. 그리고 파이펫(pipette)을 500ul로 맞춘 후 4~6번 섞고, 솔루션(Solution)의 농도를 측정하거나 계산하여 어세이(aasay)의 <reference>로써 결과를 이용하였다.

다음으로 스킨 테스트 어세이(skin test assay)를 위해 도너판(donor plate)을 준비하는 과정으로서, deep well plate로부터 샘플 용액(sample solution) 200ul를 도너판(donor plate)을 옮기고, 뚜껑을 덮었다. 이때, PAMPA 샌드위치(PAMPA sandwich)의 상판(top plate)은 어셉터 판(acceptor plate)이고, PAMPA 샌드위치(PAMPA sandwich)의 하판(bottom plate)은 도너판(donor plate)이다.

다음으로 스킨 테스트 어세이(skin test assay)를 위해 PAMPA 샌드위치(PAMPA sandwich) 및 어셉터 판(acceptor plate)을 준비하는 과정으로서, 8 channel pipette을 200ul로 맞춘 후, 웰(Well)을 수화(hydration)하고 도너 판(donor plate)의 어세이(assay)를 준비한 후, 상판(top plate)을 수화 용액 저장고(hydration solution reservoir)로부터 서포트 판(support plate)으로 옮겼다. 그리고 어셉터 판(acceptor plate)의 각 웰(well)에 pH7.4의 프리즈마 버퍼(prisma buffer) 200ul를 넣고, 도너 판(donor plate)의 뚜껑을 벗긴 후, 버블(bubble)이 생기지 않게 주의하면서 acceptor plate bottom row(H)부터 도너 판(donor plate) 위에 천천히 올려놓았다. 이 때, 샌드위치(sandwich)가 만들어지고 나면 어셉터 판(acceptor plate) 위에 뚜껑을 덮고, 스킨 멤브레인(skin membrane)이 마르는 것을 방지하기 위하여 4~5분 이내에 끝내고 실험을 시작하여야 한다. 그리고 증발을 최소화하기 위하여 높은 상대 습도를 유지하기 위한 젖은 스펀지가 있는 습도 챔버(humidity chamber)나 gut-box에 샌드위치(sandwich)를 놓되, 샌드위치 판(sandwich plate)은 절대로 기울이면 안 된다. 그리고 RT에서 5hr 동안 휘젓지 않은 상태로 배양(incubation)하였다.

다음으로 도너(Donor)/어셉터(acceptor) 분석(reading)하는 과정으로서, 배양(incubation)을 끝내고, 습도 챔버(humidity chamber)로부터 PAMPA 샌드위치(PAMPA sandwich)를 꺼낸 후 덮개(lid)를 열고 8 channel pipettor를 이용하여 어셉터 판(acceptor plate)으로부터 150ul 씩 UV 판(UV plate)으로 옮긴 후 스펙트로포토미터(spectrophotometer)에서 250~498nm 범위로 설정하고 분석(reading)하였다.

그 결과는 하기 표 11과 같았으며, 투과 전 추출물의 레스베라트롤 함량과 투과후 단순 포도 과피 추출물 (리포좀 제형으로 개발하기 전 샘플)과 리포좀 제형의 레스베라트롤의 함량을 비교하여 투과율(%)을 나타내었다. 리포좀 제형으로 개발한 샘플의 투과도가 더 높게 나타났다.

투과도 비교

	Resveratrol (μg/mL)	투과률(%)
투과전 추출물	108.328
단순 포도 과피 추출물	1.869	1.73%
리포좀 제형으로 개발된 포고 과피 추출물	3.254	3.00%

[실시예 3: 포도 추출을 함유하는 화장료 조성물의 제조]

본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 제조한 리포좀 제형을 함유한 본 발명의 화장료 조성물을 제조하고자 하였으며, 3종(토너, 세럼, 크림)으로 제조하였다. 사용한 리포좀 제형의 포도 추출물의 함량은 100mg/mL이 되도록 제조하였다. 리포좀 제형 1% 함량의 화장품을 제조하면 화장품의 포도 추출물 함량은 1 mg/mL으로 레스베라트롤의 함량은 800 ng/mL이 되게하였고, 이는 세라마이드 함량이 증가하는 포도 추출물의 농도인 0.843 mg/mL보다 높은 함량을 가진 화장품으로 개발한 것이다(도 16).

1) 토너 제형

상기 리포좀 제형 1% 함량의 화장품 제조 시, 토너 제형은 하기 표 12의 화장료 조성물 함량으로 제조하였다.

	제품번호: 토너
	원료명	함량(%)	함량(%)	함량(%)
A (수상층)	D.I. Water	73.82	85.82	84.63
	실시예 2 제조 포도추출물 함유 리포좀	1.00	1.00	1.00
	글리세린	10.00	4.00	4.00
	부틸렌글라이콜	6.00	3.00	3.00
	프로판다이올	6.00	3.00	3.00
	트레할로스	1.00	1.00	2.00
	히알루론산	0.10	0.10	0.20
	PA-3	0.03	0.03	0.03
	Biovera 200X Aloe	0.01	0.01	0.10
	폴리쿼터늄-51	0.01	0.01	0.01
B (후첨)	1,2 hexanediol	2.00	2.00	2.00
B (후첨)	Ethylhexylglycerin	0.03	0.03	0.03
합계		100.00	100.00	100.00
합계		샘플1	샘플2	샘플3

각 샘플을 사용한 결과, 샘플 1은 사용감이 무거우며, 발림성이 좋지 않았다. 개선을 위해 글리세린, 부틸렌글라이콜, 프로판다이올 함량을 감소시켰다. 샘플 2는 사용감과 발림성이 좋아졌으나, 보습력이 부족하였다. 개선을 위해 트레할로스, 히알루론산, Biovera 200X Aloe의 함량을 증가시켰다. 최종샘플 3은 보습력이 증가하였으며, 사용감과 발림성 문제 개선도 되었다.

2) 세럼 제형

상기 리포좀 제형 1% 함량의 화장품 제조 시, 토너 제형은 하기 표 13의 화장료 조성물 함량으로 제조하였다.

	제품번호: 세럼
	원료명	함량(%)	함량(%)	함량(%)
A	D.I. Water	84.67	79.37	78.27
	실시예 2 제조 포도추출물 함유 리포좀	1.00	1.00	1.00
	글리세린	2.00	4.00	4.00
	부틸렌글라이콜	3.00	4.00	4.00
	fucocert	2.00	2.00	2.00
	프로판다이올		2.00	2.00
	Cosphaderm X 34	0.30	0.60	0.60
	트레할로스			1.00
	히알루론산			0.10
B	1,2 hexanediol	2.00	2.00	2.00
B	Ethylhexylglycerin	0.03	0.03	0.03
C	유기농 알코올	5.00	5.00	5.00
합계		100.00	100.00	100.00
합계		샘플1	샘플2	샘플3

각 샘플을 사용한 결과, 샘플 1은 점도가 약하며, 발림성 및 보습력이 미흡하였고, 점증제인 Cosphaderm X 34을 0.6%로 수정 및 발림성과 보습력의 문제개선을 위해 글리세린 4%, 부틸렌글라이콜 4% 증가와 프로판다이올을 추가하여야 했다. 샘플 2는 점성이 좋았으며, 발림성의 문제가 개선되었고, 보습력이 샘플1보다 올라왔으나, 미흡한 느낌이 들어, 보습제인 트레할로스와 히알루론산을 증가시켜야 했다. 최종샘플 3은 보습제가 미흡한 느낌이 없으며, 발림성과 점도 모두 좋았다.

3) 크림 제형

상기 리포좀 제형 1% 함량의 화장품 제조 시, 크림 제형은 하기 표 14의 화장료 조성물 함량으로 제조하였다.

	제품번호: 크림
	원료명	함량(%)	함량(%)	함량(%)
A (유상층)	호호바씨오일	0.50	0.50	0.50
	포도씨오일	1.00	1.00	1.00
	코코넛오일	1.00	1.00	1.00
	Caprylic/Capric Triglyceride	7.00	9.00	9.00
	Isoamyl Laurate	4.50	4.50	4.50
	SymbioMuls Rich	4.00	5.00	6.00
	Cetostearyl Alcohol	1.00	2.00	2.00
	Tocopherol	0.50	0.50	0.50
B (수상층)	D.I.Water	64.89	60.89	59.89
	실시예 2 제조 포도추출물 함유 리포좀	1.00	1.00	1.00
	글리세린	5.00	5.00	5.00
	프로판다이올	5.00	5.00	5.00
	Biovera 200X Aloe	0.10	0.10	0.10
	트레할로스	1.00	1.00	1.00
	시트릭산	0.01	0.01	0.01
C (후첨)	Dermosoft 1388 ECO	3.00	3.00	3.00
C (후첨)	Dermosoft GMCY	0.50	0.50	0.50
합계		100.00	100.00	100.00
합계		샘플1	샘플2	샘플3

각 샘플을 사용한 결과, 샘플 1은 점성이 너무 묽으며, 유분감과 흡수력이 미흡하였다. 점성 증가를 위해 유화제 Symbiomuls rich와 Cetostearyl Alcohol 함량을 증가시키며, 유분감과 흡수력으로 Caprylic/Capric Triglyceride을 증가시켰다. 샘플 2는 샘플 1에 비교하여, 점성이 증가하였으나 부족한 상태이며 유분감과 흡수력은 개선되었다. 점성 증가를 위해 Cetostearyl Alcohol의 함량을 증가시켰다. 최종샘플 3은 점성이 개선되었으며, 안정성에 문제가 안 생기며 흡수력과 발림성 모두 좋았다.

Claims

포도의 과피 및 가지에 자외선을 3일 동안 조사한 후, 80% 에탄올 수용액을 용매로 가하여 상온에서 30~60분간 초음파 추출하여 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물을 수득하는 과정, 상기 포도 추출물을 리포좀화하는 과정 및 화장료 조성물에 전체중량 대비 1 중량%의 리포좀을 함유하는 과정을 포함하되,
상기 화장료 조성물은, 상기 포도 추출물 함량이 1 mg/mL 이고, 상기 레스베라트롤 함량이 800 ng/mL 인 것을 특징으로 하는 항산화 및 항균용 화장료 조성물의 제조방법.
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포도의 과피 및 가지에 자외선을 3일 동안 조사한 후, 80% 에탄올 수용액을 용매로 가하여 상온에서 30~60분간 초음파 추출하여 레스베라트롤의 함량이 증진된 포도 추출물을 수득한 후, 상기 포도 추출물을 리포좀화하여 수득된 리포좀을 포함하되,
상기 리포좀을 화장료 조성물의 전체중량 대비 1 중량% 함유하여,
상기 화장료 조성물은 상기 포도 추출물 함량이 1 mg/mL 이고, 상기 레스베라트롤 함량이 800 ng/mL 인 것을 특징으로 하는 항산화 및 항균용 화장료 조성물.