WO1997029194A2 - Herstellung von l-ascorbinsäure - Google Patents

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WO1997029194A2
WO1997029194A2 PCT/EP1997/000461 EP9700461W WO9729194A2 WO 1997029194 A2 WO1997029194 A2 WO 1997029194A2 EP 9700461 W EP9700461 W EP 9700461W WO 9729194 A2 WO9729194 A2 WO 9729194A2
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cell
lactone
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Ralf Mattes
Heidrun Schmidt
Klaus-Dieter Kulbe
Gernot Miemietz
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Herbstreith & Fox Kg Pektin-Fabrik Neuenbürg
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/14—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus with filters, sieves or membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C

Definitions

  • the present invention relates to a new process for the production of L-ascorbic acid as well as suitable recombinant enzymes and nucleic acids coding therefor.
  • L-ascorbic acid or vitamin C is produced in large quantities by the chemical industry. Production has increased steadily over the past 20 years and in 1984 global production reached 35,000 tons. At the moment it is likely to be more than 70,000 tons.
  • L-ascorbic acid was first chemically produced by the Reichstein process. In this process, glucose is used as a substrate and implemented in five steps as follows:
  • German patent 35 02 141 discloses a method for intrasequential cofactor regeneration in two- or multi-stage enzymatic syntheses, in which a substrate is reduced enzymatically in the same reactor and the reduction product obtained is converted enzymatically into an oxidation product or a substrate is oxidized enzymatically and the oxidation product obtained is converted enzymatically into a reduction product and the desired end product is isolated in a manner known per se, two enzymes having the same cofactor specificity being used for the coupled processes of oxidation and reduction.
  • This method can also be used, for example, for the production of L-ascorbic acid from D-galacturonic acid or D-glucuronic acid, which are optionally converted into their lactones or a mixture of the lactones and then oxidized enzymatically to the corresponding 2-keto acids and added Ascorbic acid are rearranged, which is then isolated in a manner known per se.
  • EP-A-0 476 442 discloses an L-gulono- ⁇ -lactone dehydrogenase in purified form which catalyzes the oxidation of L-gulono- ⁇ -lactone to L-ascorbic acid, for example in the presence of an electron acceptor other than oxygen.
  • Such an enzyme is available from Gluconobacter oxydans, has a high substrate specificity for L-gulono- ⁇ -lactone, a pH optimum of 7-8 and is made up of 3 subunits, which are a flavoprotein, a cytochrome c Protein and a simple protein with molecular weights of approximately 61,000, 32,500 and 16,500 D respectively. Cu 2+ and Mn 2+ ions show a strong inhibition of the enzyme.
  • the enzyme or a microorganism or microorganism extract containing this enzyme can be used as a substrate for the synthesis of L-ascorbic acid using L-guiono- ⁇ -lactone. Disadvantages of this enzyme, however, are that it has relatively low activity and stability. Furthermore, the construction from 3 separate subunits makes recombinant extraction of the enzyme very difficult.
  • the object underlying the present invention was to provide new enzymes for L-ascorbic acid synthesis and a new synthesis process in which the disadvantages of the prior art are at least partially eliminated.
  • a first aspect of the present invention relates to a new enzyme which catalyzes the enzymatic conversion of D-glucuronic acid or galacturonic acid to L-gulonic acid or L-galactonic acid, a nucleic acid coding therefor and a method for the recombinant production of the enzyme.
  • This enzyme which can be called uronate reductase (UDH)
  • UDH uronate reductase
  • D-glucuronic acid and D-galacturonic acid are substrates of this enzyme, which are reduced with the coenzymes NADPH and / or NADH.
  • the K “value for the substrates D-glucuronic acid and D-galacturonic acid is 65 mM and 4.5 mM, respectively.
  • the K "value for that Coenzyme NADPH is 0.008 mM.
  • the enzyme is stable, shows an optimum at pH 6.2-8.5 and a temperature of 45 ° C.
  • the enzyme L-hexonate dehydrogenase (HDH) from Lipomyces starkeyi described by Fobo (dissertation University of Hohenheim, Stuttgart (1988)) was completely purified. After tryptic digestion, short amino acid sequences could be determined from this purified product and oligonucleotides could be synthesized based on the sequence data, with which the gene coding for UDH could be isolated from genomic Saccharomyces cerevisiae DNA.
  • HDH L-hexonate dehydrogenase
  • the UDH from S.cerevisiae has a much higher affinity for the substrates D-glucuronic acid and D-galacturonic acid and for the coenzyme NADPH than the HDH from L.starkeyi. Furthermore UDH has a higher stability than HDH and can be stored at -20 ° C for an unlimited time. Even at 8 ° C, over 50% of the initial activity can still be measured after 650 h.
  • An object of the invention is thus the use of a DNA sequence which codes for a protein with a uronate reductase activity and (a) which is shown in SEQ ID No. 1 shown nucleotide sequence,
  • (c) comprises a nucleotide sequence hybridizing with the sequences from (a) or / and (b), for the production of an enzyme for the synthesis of L-ascorbic acid.
  • the in SEQ ID No. 1 nucleotide sequence shown codes for the complete uronate reductase from the microorganism Saccharomyces cerevisiae.
  • the present invention also comprises a DNA sequence which corresponds to one of these sequences hybridizes, provided that it codes for a protein that has a uronate reductase activity.
  • Hybridization is used as in Sambrook et al. (Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1,101-1,104). Hybridization is preferably used if, after washing for 1 hour with 1 ⁇ SSC and 0.1% SDS at 55 ° C., preferably at 62 ° C. and particularly preferably at 68 ° C., in particular for 1 hour in 0.2 ⁇ SSC and 0.1% SDS at 55 ° C, preferably at 62 ° C and particularly preferably at 68 ° C a positive hybridization signal is observed.
  • One under such washing conditions with the in SEQ ID No. 1 nucleotide sequence shown or a nucleotide sequence hybridizing therewith in the context of the degeneration of the genetic code corresponding to the nucleotide sequence is covered by the present invention.
  • the DNA sequence according to the invention preferably has a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID no. 1 nucleotide sequence shown has a homology of at least 70%, particularly preferably of at least 80% and most preferably of at least 90%.
  • Nucleotide sequences according to the invention can be obtained in particular from microorganisms of the genus Saccharomyces.
  • a recombinant vector is preferably used which contains at least one copy of a DNA sequence according to the invention.
  • This vector can be any prokaryotic or be a eukaryotic vector on which the DNA sequence according to the invention is preferably under the control of an expression signal (promoter, operator, enhancer, etc.).
  • Preferred examples of vectors according to the invention are prokaryotic vectors, in particular circular plasmid vectors, which are described, for example, by Sambrook et al. , Supra, chapters 1-4.
  • the DNA sequence is particularly preferably under the control of a controllable promoter which can be activated by adding a chemical inductor or by changing the temperature.
  • controllable promoter which can be activated by adding a chemical inductor or by changing the temperature.
  • promoters are known to the person skilled in the art, e.g. the lac promoter, the tac promoter, the trp promoter and promoters of bacteriophage lambda etc.
  • the vector according to the invention can also be a eukaryotic vector, e.g. a yeast vector or a vector suitable for higher cells. Examples of such vectors can be found in Sambrook et al. supra, chapter 16.
  • a cell which is transformed with a DNA sequence according to the invention or a vector according to the invention is preferably used to produce the enzyme for the synthesis of L-ascorbic acid.
  • this cell is a prokaryotic cell, especially a gram negative prokaryotic cell, e.g. an E. coli cell.
  • the cell according to the invention can also be a eukaryotic cell, such as a fungal cell (e.g. yeast), a animal cell or a plant cell.
  • Methods for transforming prokaryotic or eukaryotic cells with exogenous nucleic acid sequences are familiar to the person skilled in the field of molecular biology (cf. e.g. Sambrook et al., Chapters 1-4 and 16).
  • the invention also relates to the use of a protein with a uronate reductase activity, which is encoded by a DNA sequence according to the invention, as an enzyme in a process for the production of L-ascorbic acid.
  • This protein (a) preferably comprises the protein shown in SEQ ID No. 2 shown amino acid sequence or (b) an amino acid sequence homologous to the sequence from (a) at least 80%, in particular at least 90%.
  • the enzyme can be produced on the one hand from cells which naturally contain a gene coding for the protein with uronate reductase activity.
  • the production of the enzyme by recombinant DNA technology is preferred, a cell being transformed with a DNA sequence as defined above or a vector containing this DNA sequence, the transformed cell being cultivated under conditions in which the DNA sequence is expressed and the expression product is obtained from the cell or the culture medium.
  • An E. coli cell is preferably used for the recombinant production of a protein with uronate reductase activity and the expression product is isolated from the cell extract.
  • an adjustable expression system e.g. of the tac promoter
  • 400 mg of E. coli crude extract 670 U uronate reductase with a specific activity of 15 U / mg.
  • 18 U enzyme with a specific activity of 33 U / mg after purification can be obtained after 9 days of culture of the starting organism Lipomyces starkeyi.
  • the uronate reductase gene is preferably under the control of a regulatable expression signal, for example an expression signal which can be regulated by lactose, for example the lac or the tac promoter.
  • a regulatable expression signal for example an expression signal which can be regulated by lactose, for example the lac or the tac promoter.
  • lactose for example the lac or the tac promoter.
  • the udh gene must be transferred into a host cell which can absorb and metabolize lactose.
  • Preferred host cells are E. coli B and E. coli RM 82.
  • E. coli B is a strain with intact lactose operon, the cells are capable of lactose through a specific transport system absorb the medium and convert it into the actual inductor allolactose.
  • E.coli RM 82 the specific transport system for lactose is defective, so that only small amounts of lactose enter the cell via other transport systems and are metabolized there normally.
  • D-glucuronic acid and / or D-galacturonic acid are particularly preferably used. These substrates can be easily prepared on an industrial scale by chemo-enzymatic processes from starch, pectin (Kulbe et al. (1987): Ann. N.Y. Acad. Sci. 506, 543-551), sucrose or lactose.
  • the concentration of the substrates in the reaction mixture can be varied over a wide range depending on the reaction conditions. Good results are obtained with concentrations of 20 mM-500 mM, e.g. 50 mM or 250 mM achieved.
  • NADPH and / or NADH, in particular NADPH are used as coenzymes.
  • concentration of the coenzymes in the reaction mixture is preferably from 0.05-0.5 mM and particularly preferably from 0.08-0.25 mM, with a subsequent addition advantageously being carried out during the reaction.
  • the process is preferably carried out in the presence of a system for coenzyme regeneration. tion carried out.
  • a system for coenzyme regeneration can be found in the aforementioned German patent specification 35 02 143.
  • a particularly preferred system for coenzyme regeneration is glucose dehydrogenase (GDH), which converts D-glucose to D-gluconic acid, where arise from NADP *, NADPH and H * .
  • GDH is a commercially available enzyme and can be obtained from Bacillus cereus, for example.
  • the stability of the UDH is improved in the presence of a sulfhydryl reagent, especially DTT or DTE.
  • the sulfhydryl reagent can be added at the start of the reaction. Preference is given to replenishing during the reaction.
  • the concentration of the sulfhydryl reagent in the reaction mixture is preferably 1-50 mM, particularly preferably 2-20 mM.
  • a further increase in the stability of the UDH is achieved by adding a complexing agent, in particular EDTA.
  • concentration of the complexing agent in the reaction mixture is preferably 0.1-10 mM, particularly preferably 0.5-5 mM.
  • the UDH and, if available, the GDH can be used as a bacterial crude extract or as a purified enzyme. If appropriate, the enzymes can also be present in immobilized form. Continuous process control is particularly preferred.
  • a solution which contains the substrate for UDH and the substrate of the enzyme used for the coenzyme regeneration, in the case of GDH glucose is passed into an enzyme reactor, with the UDH, the enzyme used for coenzyme regeneration, for example GDH, and the coenzyme, e.g. NADPH or / and NADH.
  • the reactor has a membrane at its outflow opening, which allows the enzymes and the coenzyme to be retained.
  • This membrane is preferably a negatively charged ultrafiltration membrane, for example made of sulfonated polysulfone, as described, for example, by Howaldt et al. (1988): Ann. NY Acad. Be 542, 400-405, or Kulbe and Chmiel (1988): Ann. NY Acad. Be 542, 444-464.
  • Another object of the present invention is thus an enzyme reactor comprising
  • a substrate, coenzyme and, if appropriate, solution 10 containing stabilizers is introduced through a sterile filter 12 into an enzyme reactor 14.
  • the reactor 14 contains UR and optionally GDH in soluble form.
  • the reactor is equipped with a septum 16 and a stirring device 18.
  • a negatively charged ultrafiltration membrane 20 is arranged at the outflow opening of the reactor.
  • the reactor also contains measuring devices for determining the conductivity 22, the pressure 24 and the pH value 26.
  • the pH value can be set, for example, by adding acid 28 (for example HCl) or alkali 30 (for example NaOH) via a controller 32 become.
  • the product solution 34 finally flows out of the reactor.
  • L-gulonic acid or L-galactonic acid By reacting the substrates D-glucuronic acid or D-galacturonic acid with UDH, L-gulonic acid or L-galactonic acid is formed. These products are then further reacted to L-ascorbic acid.
  • the L-gulonic acid or L-galactonic acid formed is preferably first converted into the corresponding lactone, ie in particular L-gulono- ⁇ -lactone or L-galactono- ⁇ -lactone. This lactone formation can take place by acidification and heating.
  • a strong inorganic acid, in particular HCl is preferably used for acidification.
  • the concentration of the acid is preferably 100-1000 mM, in particular 200-500 mM.
  • a maximum lactone formation is found at a concentration from 250 mM.
  • the heating takes place to a temperature of preferably at least 45 ° C., in particular at least 50 ° C. Most preferably the temperature is 55-70 ° C.
  • the incubation period is preferably at least 15 minutes. From an incubation period of 30 min. about 50-60% lactone are formed. A longer incubation period does not result in a significant increase in yield. Lactone formation can also be carried out by incubation with a suitable lactonase.
  • Yet another object of the first aspect of the present invention is a DNA sequence which codes for a protein with a uronate reductase activity and one with the sequence shown in SEQ ID no. 1 shown sequence or a sequence corresponding to this sequence in the context of the degeneration of the genetic code hybridizing nucleotide sequence, characterized ge indicates that the DNA sequence codes for a protein which is different from that shown in SEQ ID No. 2 amino acid sequence shown by at least one amino acid.
  • Another object of the present invention is a protein with uronate reductase activity, which is at least one amino acid of that in SEQ ID. No. 2 amino acid sequence shown differs.
  • This protein preferably has a homology of at least 80% to the amino acid sequence according to SEQ ID No. 2 on.
  • the protein for NADH o as coenzyme has a higher maximum conversion rate and / or a lower K “value than the protein with the in SEQ ID No. 2 amino acid sequence shown.
  • modified proteins differ from that in SEQ ID No. 2 amino acid sequence shown by an exchange of Arg (57) by Glu, an exchange of Tyr (47) by Glu or / and an exchange of Gin (29) by Gly.
  • a second aspect of the present invention is the recombinant production of proteins with L-gulono- ⁇ -lactone oxidase activity (GulOx) in high yield and the use of these proteins in the synthesis of vitamin C.
  • GulOx L-gulono- ⁇ -lactone oxidase activity
  • GulOx catalyzes the oxidation of L-gulono- ⁇ -lactone or L-galactono- ⁇ -lactone in the presence of 0 2 to L-ascorbic acid.
  • GulOx is available from eukaryotes, for example from the microsome fraction of rat liver (Nishikimi et al., Arch. Biochem. Bio ⁇ phys. 175 (1976), 427-435).
  • As a prosthetic group GulOx has a covalently bound flavin component, which is involved in electron transfer to 0 2 .
  • the molecular weight in the SDS gel was determined to be 51 kd. In the native state, however, aggregates are around 500 kd in size.
  • the K "value for L-gulono- ⁇ -lactone was determined to be 0.066 mM.
  • GulOx also converts L-galactono-, D-mannono- and D-altrono- ⁇ -lactone to L-ascorbic acid.
  • In the recombinant expression of GulOx in monkey cell cultures Yagi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 177 (1991), 659-663), only very low yields, namely a specific activity of 0.38 mU / mg received. A recombinant expression in E. coli has not been achieved so far.
  • the present invention thus relates to a prokaryotic cell which is capable of a DNA sequence which codes for a protein having an L-gulono- ⁇ -lactone oxidase activity and (a) which is shown in SEQ ID No. 3 shown nucleotide sequence, (b) a nucleotide sequence corresponding to the sequence from (a) in the context of the degeneration of the genetic code or (c) a nucleotide sequence hybridizing with the sequences from (a) or / and (b) .
  • the prokaryotic cell is preferably a gram-negative cell, in particular an E. coli cell.
  • the DNA sequence coding for the GulOx is under the control of a suitable expression signal which is recognized by the transcription apparatus of the prokaryotic cell.
  • the DNA sequence is preferably located on a suitable recombinant vector under the control of a regulatable expression signal (see above).
  • the cell according to the invention can give an extract with a specific GulOx activity of 5 5 mU / mg, in particular ⁇ 10 mU / mg and particularly preferably 10-200 mU / mg.
  • the enzyme yield after expression can be increased if the cells are washed in buffer after harvesting and then centrifuged.
  • a subsequent precipitation with 16% ammonium sulfate, in which the active enzyme is in the precipitate, can achieve a further significant increase in the specific activity.
  • the in SEQ ID NO. The nucleotide sequence shown in FIG. 3 codes for the complete rat L-gulono- ⁇ -lactone oxidase.
  • the present invention also comprises a DNA sequence which hybridizes with one of these sequences. The conditions under which hybridization can be determined are as described above.
  • the DNA sequence preferably has a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO. 3 has a homology of at least 70%, particularly preferably of at least 80% and most preferably of at least 90%.
  • the DNA sequence in the cell according to the invention is preferably on a vector suitable for gene expression in prokaryotes. Examples of suitable vectors have already been mentioned.
  • the invention also relates to an unglycosylated protein with L-gulono- ⁇ -lactone oxidase activity from prokaryotes which is encoded by a DNA sequence which (a) has the sequence shown in SEQ ID No. 3 nucleotide sequence shown, (b) a nucleotide sequence corresponding to the sequence from (a) in the context of the degeneration of the genetic code or (c) a nucleotide sequence hybridizing with the sequences from (a) or / and (b).
  • This protein preferably comprises those in SEQ ID NO. 4 shown sequence or (b) an amino acid sequence homologous to the sequence from (a) at least 80%, in particular at least 90%.
  • the protein according to the invention is produced by a prokaryotic cell (i) of a DNA sequence which codes for a protein with an L-gulono- ⁇ -lactone-oxide activity and (b) one comprises the nucleotide sequence corresponding to the sequence from (a) in the context of the degeneration of the genetic code or (c) a nucleotide sequence which hybridizes with the sequences from (a) and / and (b), or (ii) a recombinant vector which comprises at least one copy of a Contains DNA sequence from (a), (b) or / and (c), transformed, cultivated the transformed cell under conditions in which the DNA sequence is expressed and the expression product from the cell or the culture medium wins.
  • the expression product is preferably obtained from the cell extract, if appropriate after ammonium sulfate precipitation.
  • the cell extract has a specific GulOx activity of ⁇ 5 mU / mg.
  • the unglycosylated protein according to the invention with L-gulono- ⁇ -lactone oxidase activity or a cell extract containing this protein, which can be obtained from prokaryotes, can be used in a process for the synthesis of L-ascorbic acid.
  • a 0 2 -containing substrate solution is brought into contact with the GulOx and the L-ascorbic acid formed by enzymatic conversion of the substrate is then obtained.
  • L-Gulono- ⁇ -lactone or / and L-Galactono-lactone are preferably used as the substrate.
  • the GulOx can be used both as a bacterial crude extract, which can optionally be washed and concentrated, as an ammonium sulfate precipitation product and as a solubilized product Enzyme can be used.
  • An immobilized GulOx is particularly preferably used.
  • the reaction is preferably carried out in the range from pH 6-8. It is found that in the range 7-8 the GulOx has a higher enzymatic activity and stability, but that in the range 6-7 the L-ascorbic acid is more stable. The choice of pH must therefore be optimized depending on the specific requirements.
  • a sulfhydryl reagent in particular dithiothreitol (DTT) or dithioerythritol (DTE) improves the stability of the ascorbic acid and thus increases the yield.
  • the sulfhydryl reagent is preferably added in a concentration of about 1-5 mM. Particularly good results are obtained if the sulfhydryl reagent is metered in during the reaction, e.g. an addition of 2 mM DDT after every 5 hours of reaction.
  • the hydrogen peroxide-decomposing effect of the catalase has a favorable effect on the stability of the ascorbic acid and additionally supplies the GulOx with molecular oxygen which is formed when H 2 0 2 is broken down.
  • a stabilizing effect can be achieved which is roughly comparable to the addition of the sulfhydryl reagent.
  • the substrate concentration can be varied within a wide range and is generally about 1-500 mM, in particular from 20-250 mM. It was surprisingly found that an increase in the substrate concentration in the product batch leads to an increase in the maximum achievable L-ascorbic acid concentration.
  • the ascorbic acid formed by the reaction can be stabilized by acidification, in particular to a pH of ⁇ . 5, in particular a pH of about 3 can be achieved.
  • the oxygen-enriched substrate solution 40 is introduced into an enzyme reactor 42 with a constant flow.
  • the reactor 42 contains immobilized GulOx 44, which is preferably bound to a particulate matrix with a large surface area.
  • the pH within the enzyme reactor can be adjusted to a value favorable for the enzyme activity, i.e. high pH of 7-8 are kept. After leaving the reactor, the pH can be lowered by adding acid (46), thus stabilizing the ascorbic acid.
  • the L-ascorbic acid is finally obtained from the product solution 48 obtained in this way.
  • An object of the invention is therefore an enzyme reactor, comprising
  • a third aspect of the present invention is the synthesis of L-ascorbic acid in a multi-stage process in which a first enzymatic reaction step, which is catalyzed by a protein with uronate reductase activity, is combined with a second enzymatic reaction step, which is carried out by a protein with L-gulono- ⁇ -lactone oxidase activity is catalyzed.
  • a first enzymatic reaction step which is catalyzed by a protein with uronate reductase activity
  • a second enzymatic reaction step which is carried out by a protein with L-gulono- ⁇ -lactone oxidase activity is catalyzed.
  • D-glucuronic acid- ⁇ -lactone or / and D-galacturonic acid- ⁇ -lactone is used as the UDH substrate in the first enzymatic reaction step.
  • the product of the first enzymatic reaction step is L-gulono- ⁇ -lactone or / and L-galactono- ⁇ -lactone, which can be used directly as a substrate for the second enzymatic reaction step.
  • this method is less preferred because the substrate specificity of the UR for lactones is relatively low.
  • An indirect coupling is therefore preferred, in which the first and second enzymatic reaction steps are used spatially separated.
  • the product formed in the first step when D-glucuronic acid or / and D-galacturonic acid is used is lactonized and the resulting solution is used as a substrate for the second step. Surprisingly, it was found that the product solution formed in the first step after lactonization can be used directly in the second step without prior purification.
  • the invention thus relates to a method with direct enzyme coupling, in which
  • D-glucuronic acid- ⁇ -lactone or / and D-galacturonic acid- ⁇ -lactone is converted by a protein with uronate reductase activity to L-gulono- ⁇ -lactone or / and L-galactono- ⁇ -lactone , and
  • step (b) the products formed in step (a) are converted directly into L-ascorbic acid by a protein with L-gulono- ⁇ -lactone oxidase activity.
  • step (a) D-glucuronic acid and / or D-galacturonic acid is converted to L-gulonic acid or / and L-galactonic acid by a protein with uronate reductase activity convicted, (b) the products formed in step (a) are converted into L-gulono- ⁇ -lactone or / and L-galactono- ⁇ -lactone by lactonization and
  • step (c) the products formed in step (b) are converted into L-ascorbic acid by a protein with L-gulono- ⁇ -lactone oxidase activity.
  • the D-glucuronic acid and / or D-galacturonic acid used as substrates for step (a) of the indirect process are, for example, by enzymatic isomerization of the fructuronic acid accessible from sucrose by oxidation and hydrolysis, e.g. by glucuronate isomerase (EC 5.3.1.12) from E. coli (Karapally and Dietrich (1970): Can J. Biochem. 48, 154-160).
  • glucuronate isomerase EC 5.3.1.12
  • E. coli e.g. by glucuronate isomerase (EC 5.3.1.12) from E. coli (Karapally and Dietrich (1970): Can J. Biochem. 48, 154-160).
  • glucuronate isomerase EC 5.3.1.12
  • EC 1.1.1.22 NAD-dependent UDP-glucose dehydrogenase
  • UDP-glucose is in turn produced from glucose-1-phosphate (GIP).
  • GIP glucose-1-phosphate
  • Phosphorylases which synthesize GIP from starch or maltodextrins are known, e.g. Maltodextrin phosphorylase (EC 2.4.1.1) from Corynebacterium callunae (Weinhausel et al. (1994): Appl. Microbiol. Biotechnol. 41, 510-515; Nidetzky et al. (1995): J. Carbohydrate Chemistry 14, 1017-1028), from E. coli (Weinhausel et al. (1995): Enzyme Microbiol. Techn. 17, 140-146) or starch phosphorylase (EC 2.4.1.1) from potatoes (EP-A-0 305 908).
  • the first enzymatic reaction step of the method according to the invention is both direct and indirect Enzyme coupling is preferably carried out in the presence of a coenzyme regeneration system as described above. It is also preferred to carry out this process step continuously in an enzyme reactor.
  • Step (b) of the indirect process comprises lactonization of the products formed in step (a). As described above, this is preferably done by heating and acidifying.
  • a protein with L-gulono- ⁇ -lactone oxidase activity is preferably used, which is derived from a DNA sequence with the sequence shown in SEQ ID No. 3 nucleotide sequence shown, a nucleotide sequence corresponding to this sequence in the context of the degeneration of the genetic code or a nucleotide sequence hybridizing with these sequences is encoded.
  • the protein is preferably obtained from prokaryotic cells.
  • the protein with GulOx activity preferably uses 0 2 as the cosubstrate.
  • the process is conveniently carried out as a continuous process.
  • the reaction can be carried out in a single enzyme reactor.
  • two separate reactors are advantageously used.
  • the method according to the invention has numerous significant advantages over known methods.
  • small protecting groups must be used, which leads to the avoidance of wastewater problems.
  • the process can be carried out under mild reaction conditions with a small number of synthesis steps. No chemical hydrogenation, no use of H 2 and no use of Cl 2 are required.
  • much better activities and yields than in the prior art can be achieved with the aid of the enzymes described.
  • the invention is to be explained by the following sequence protocols and illustrations. Show it:
  • SEQ ID No. 1 the nucleotide sequence of a uronate dehydrogenase gene
  • SEQ ID No. 2 the amino acid sequence of uronate dehydrogenase
  • SEQ ID No. 3 the nucleotide sequence of an L-gulono- ⁇ -lactone
  • Oxidase gene o SEQ ID No. 4 the amino acid sequence of an L-gulono- ⁇ -lactone
  • Fig. 1 a uronate dehydrogenase enzyme reactor and Fig. 2 an L-gulono- ⁇ -lactone oxidase enzyme reactor.
  • the enzyme activities were determined with the aid of an optical test in a photometer, by measuring the change in extinction at 340 nm as a result of the decrease or increase in the NADP (H) concentration at 25 ° C. Measured variable was the change in extinction per unit of time, which is proportional to the converted coenzyme concentration.
  • One unit (U) is the amount of enzyme used under test conditions
  • reaction buffer 5 mM K-phosphate buffer pH 7.0, 100 mM KCl and 0.1% NaN 3 ).
  • the activity of GulOx was determined by measuring the concentration of the end product L-ascorbic acid. This test included the oxidation of the ascorbic acid and a subsequent conversion to the bis (dinitrophenyl) hydrazone, which can be detected by HPLC at 495 nm.
  • One unit (U) is the amount of enzyme that converts 1 ⁇ mol substrate per minute at 37 ° C. under test conditions.
  • reaction buffer 50 mM potassium phosphate buffer pH 7.0, 50 mM Na citrate, 1.7 mM DTT
  • the sample was 90 min. incubated at 50 ° C. This was followed by elution of the hydrazone by shaking out in 400 ⁇ l of ethyl acetate.
  • the HPLC separation of the sample was carried out on a Polygosil 60-5 (silicic acid). N-Hexane / ethyl acetate / n-propanol / acetic acid (4/3 / 0.2 / 0.1) was used as the eluent. 0
  • HDH hexonate reductase
  • the DNA sequence according to SEQ ID No. 1 encoded polypeptide could be synthesized with high yield in E. coli JM 109.
  • the protein band visible in the SDS gel corresponded to approximately 15-20% of the total amount of soluble protein. The growth of the cells was not impaired.
  • D-glucuronic acid and D-galacturonic acid are substrates that 5 are reduced with the coenzyme NADPH.
  • the I ⁇ value for the D-glucuronic acid is 7.64 mM.
  • the K "value is 4.5 mM.
  • the enzyme is stable, shows a pH optimum at pH 6, 2-8.5 and a temperature optimum at 45 ° C. 0
  • the molecular weight of the recombinant UDH in SDS-PAGE is between 30 and 43 kD.
  • the inducer IPTG used for expression is very expensive and can also have a toxic effect on E. coli cells.
  • the udh gene had to be transferred to a host which can absorb and metabolize lactose.
  • An example of a suitable bacterial strain is E. coli B (Donch and Greenbert (1986), BJ Bacteriol. 95, 1555-1559), a strain with intact lactose operon, which can take up lactose from the medium and convert it into the actual inducer allolactose.
  • E. coli B Donch and Greenbert (1986), BJ Bacteriol. 95, 1555-1559
  • the udh gene was cloned into the expression vector pBTac 1 (Brosius et al. (1981), J. Mol. Biol, 148, 107-127) behind the adjustable tac promoter. To ensure that the gene is added without the addition of
  • the bacteria were still treated with a second plasmid pFDX500 (Brinkmann et al.
  • E. coli RM82 (Mattes (1985), habilitation thesis University of Regensburg).
  • the specific transport system for lactose is defective, so that only very small amounts of lactose can get into the cell. It is metabolized normally in the cell.
  • another plasmid pREM6677 (Mattes (1985), habilitation thesis University of Regensburg) was cotransformed, which also contains the lac repressor.
  • induction of the above-mentioned bacterial strains could be achieved with a lactose concentration of ⁇ 0.2% in the medium.
  • a continuous or / and discontinuous addition of inductor preferably follows during the cultivation. It was possible to measure 2.4 U / mg (E. coli B) or 1.5 U / mg (E. coli RM82) in the crude extract, which corresponds to a yield of about 70% compared to induction with IPTG.
  • E. coli B cells maximum specific activity of the crude extract was achieved after four hours of induction with 0.2% lactose.
  • E.coli RM 82 the maximum specific activity in the crude extract was reached after an hour of induction time.
  • Table 1 shows the values for the maximum speed (v max ) and the Michaelis constant (K ") of the native enzyme and of the mutants with NADH or NADPH as coenzyme and D-galacturonic acid as substrate.
  • the mutant R57E had no major effects on the coenzyme specificity. A decrease in the maximum conversion rate with NADPH as coenzyme was found. A slightly improved maximum sales speed was found for NADH.
  • the mutant Q29G showed a worse maximum turnover rate and a worse K "value in NADPH.
  • a deterioration in the maximum turnover rate was also found, but a drastic improvement in the K" value.
  • the mutant Y47E showed a somewhat deteriorated K "value for NADPH.
  • NADH the maximum sales rate deteriorated, but the K "value was very much improved.
  • the standard approach for a batch reaction was as follows: 0.15 U UDH / ml; 0.5 U GDH / ml and 50 or 250 mM substrate in a total volume of 20 ml.
  • D-glucuronic acid, D-galacturonic acid and D-glucurono- ⁇ -lactone were used as substrates. With a substrate concentration of 250 mM, an almost complete conversion of the substrate solutions could be achieved.
  • the initial concentration of the coenzyme in the batches was 0.06 mM, 0.012 mM and 0.15 mM, respectively. A significant improvement in sales was achieved by increasing the concentration from 0.06 mM to 0.012 mM. An increase to 0.15 mM did not result in a further increase in sales.
  • the coenzyme could be recycled up to 2000 times in the UDH / GDH enzyme system.
  • buffer 5 mM potassium phosphate, 100 mM KCl, 0.1% NaN 3
  • Substrate concentration 50 mM D-glucuronic acid, 50 mM D-glucose, 0.15 mM NADP
  • NADP was replenished.
  • Productivity could be improved by doubling the flow rate from 5 ml / h (average residence time 10 h) to 10 ml / h (average residence time 5 h).
  • the amount of product formed in the first 100 h increased by 79%.
  • the turnover in the continuous reactor tests averaged 77-85%.
  • L-Gulon or L-galactonic acid solutions (100 mM) were at 60 ° C for 15 min. and addition of HCl (final concentration of 250 mM).
  • the yield of lactone formation was about 45%. By extending the incubation period to 30 min, the yield could be improved to approximately 60% become. A longer incubation period did not result in a further increase in yield.
  • L-galactonic acid solutions were incubated in the presence of different HCl concentrations at 60 ° C.
  • the maximum lactone formation was reached at a concentration of 250 mM and above.
  • the cDNA for rat GulOx is known (Koshizaka et al. (1988): J. Biol. Chem 263, 1619-1621).
  • the rat liver from a commercially available cDNA bank (Stratagene, Heidelberg) was analyzed with the aid of the procedure described in SEQ ID no. 9 and 10 shown oligonucleotides performed a PCR amplification, the fragment contained isolated, cloned and sequenced. This is the one in SEQ ID No. 3 contain the sequence shown that for a polypeptide with the SEQ ID no. 4 encoded sequence shown.
  • SEQ ID No. 3 contain the sequence shown that for a polypeptide with the SEQ ID no. 4 encoded sequence shown.
  • 2 differences were found: position 252 G instead of A; Codon Val instead of Ile and position 567 C instead of G, Codon His instead of Glu.
  • the GulOx cDNA was cloned into the expression vector pET-12a (Studier et al. (1990), Meth. Enzymol. 185, 60-89), on which it is under the control of the T7 promoter.
  • pET-12a E.coli BL21 (DE3) cells (Studier and Moffat (1986), J. Mol. Biol. 189, 113-130) with pLys S (Dünn and Studier (1983), J. Mol. Biol. 166 , 477-535).
  • the specific activities were determined from these cell extracts. At a cultivation temperature of 37 ° C, a specific activity of 10 mU / mg, at 30 ° C a specific activity of 32 mU / mg and at 25 ° C a specific activity of 24 mU / mg were obtained. The highest specific activity of the protein is thus achieved at a cultivation temperature of 30 °. The greatest amount of enzyme is also produced at this temperature (SDS-PAGE).
  • the highest specific activity of GulOx which has been reported in publications so far, is about 500-600 mU / mg after multi-stage purification from rat liver.
  • the activity values of 32 mU / mg obtained at 30 ° C should correspond to a share of 5-7% of the total protein. This was confirmed by the densitometric evaluation of SDS-PA gels. It can therefore be assumed that the GulOx protein visible as a band in the SDS gel is completely active.
  • the cell extract digested by ultrasound was subjected to precipitation with 16% ammonium sulfate. Most of the active enzyme was found in the fraction pelleted by centrifugation. The specific activity was increased to 120 mU / mg. The proportion of GulOx in the total cell protein was approximately 20-25%.
  • GulOx By adding detergents, GulOx could be separated from the membrane fraction and thus brought into solution. Good results were achieved with a solubilization buffer which contained 100 mM potassium phosphate, pH 7.0 or 7.8, 0.4 M sucrose, 1 mM EDTA and 1% Triton-XIOO. The enzyme yield was about 50% of the initial activity in both cases. The supernatants after centrifugation were used for vitamin C synthesis. The detergent Triton-XIOO could be eliminated with the aid of ion exchange chromatography (DEAE-Sepharose fast flow).
  • lactonized reaction was used in the GulOx standard test (methods). The same enzyme activity was measured as when adding pure substrate. Accordingly, a lactonized UDH / GDH approach is just as suitable for ascorbic acid production as a freshly prepared substrate solution of commercially available L-gulono- ⁇ -lactone. The components in the reaction mixture do not inhibit the GulOx. The ascorbate concentration was higher than in the direct coupling method (example 3.1.).
  • TGT AAA AGT AAA GGC ATT GTG GTT GAA GCT TAT TCT CCG TTA GGT AGT 672 Cys Lys Ser Lys Gly Ile Val Val Glu Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Ser 210 215 220
  • CAC CCA CAG CTG GAT GAG CAT GGC CTG GCC ATG TCC AAT CTG GGA GCA 336

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Synthese von L-Ascorbinsäure, für dieses Verfahren geeignete rekombinante Enzyme und die für die Enzyme kodierende Nucleinsäure.

Description

Hersteilung von L-Ascorbinsäure
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure sowie dafür geeignete rekom¬ binante Enzyme und dafür codierende Nukleinsäuren.
L-Ascorbinsäure oder Vitamin C wird von der chemischen Indu¬ strie in großen Mengen hergestellt. Während der letzten 20 Jahre hat eine ständige Zunahme der Produktion stattgefunden und im Jahr 1984 erreichte die Weltproduktion 35.000 Tonnen. Gegenwärtig dürfte sie mehr als 70.000 Tonnen betragen.
L-Ascorbinsäure wurde erstmals chemisch durch das Reichstein- Verfahren hergestellt. In diesem Verfahren wird Glucose als Substrat verwendet und in fünf Schritten wie folgt umgesetzt:
1. Reduktion von Glucose zu D-Sorbitol unter Verwendung eines Nickelkatalysators, 2. Oxidation von D-Sorbitol zu L-Sorbose, die durch Aceto- bacter xylinum oder durch Acetobacter suboxidans durchge¬ führt werden kann, 3. Herstellung von Diacetonsorbose oder 2,3 : 4,6-Diisopro- pyliden-L-xylo-2-hexafuranose durch Behandlung mit Aceton und Schwefelsäure, 4. Oxidation dieses Produkts zu 2-Keto-L-Gulonsäure unter Verwendung von Platin als Katalysator, 5. Enolisierung und intramolekulare Lactonbildung zu L-As¬ corbinsäure.
Bis heute hat dieses Verfahren große Bedeutung aufgrund der Verwendung von Glucose als preisgünstigem Ausgangssubstrat und der chemischen Stabilität der Zwischenprodukte, insbesondere Diaceton-Sorbitol. Derzeit liegt die praktische Ausbeute die¬ ses Verfahrens im Bereich von ca. 50 %. Nachteile dieses Verfahrens bestehen in der großen Zahl von Synthesestufen, die in Folge der Bildung von Nebenprodukten mit erheblichen Ausbeuteverlusten verbunden sind. Insbesondere wird eine kontinuierliche Verfahrensdurchführung durch den mikrobiologischen Oxidationsschritt von D-Sorbitol zu L-Sor- bose unterbrochen. Weitere Nachteile entstehen aufgrund der Verwendung von Aceton als Schutzgruppe und den damit verbunde¬ nen Abwasserproblemen.
Weitere mikrobielle Verfahren zur Biosynthese von Ascorbin¬ saure werden in einem Übersichtsartikel von J. Boudrant (En¬ zyme Microb. Technol. , 12, 1990, 322-329) offenbart. Diese Verfahren umfassen ausgehend von Glucose mehrere enzymatische Umsetzungsschritte, bei denen schließlich 2-Keto-L-gulonsäure entsteht. Die Umsetzung dieses Produkts zu L-Ascorbinsäure erfolgt unter Anwesenheit von Säure und Alkohol unter Ausbeu¬ ten von etwa 75 %. Auch diese Verfahren weisen Nachteile hin¬ sichtlich der Ausbeute und der Schwierigkeit der Durchführung auf.
Das deutsche Patent 35 02 141 offenbart ein Verfahren zur intrasequentiellen Cofaktor-Regeneration bei zwei- oder mehr¬ stufigen enzymatischen Synthesen, wobei man im gleichen Reak¬ tor ein Substrat enzymatisch reduziert und das dabei erhaltene Reduktionsprodukt enzymatisch in ein Oxidationsprodukt über¬ führt oder ein Substrat enzymatisch oxidiert und das dabei erhaltene Oxidationsprodukt enzymatisch in ein Reduktionspro¬ dukt überführt und das gewünschte Endprodukt in an sich be¬ kannter Weise isoliert, wobei für die gekoppelten Vorgänge der Oxidation und Reduktion zwei Enzyme verwendet werden, die gleiche Cofaktor-Spezifität besitzen. Dieses Verfahren kann beispielsweise auch zur Herstellung von L-Ascorbinsäure aus D- Galacturonsäure oder D-Glucuronsäure eingesetzt werden, die gegebenenfalls in ihre Lactone oder ein Gemisch der Lactone überführt werden und anschließend enzymatisch zu den entspre¬ chenden 2-Keto-Säuren oxidiert und zu Ascorbinsaure umgelagert werden, die dann in an sich bekannter Weise isoliert wird. EP-A-0 476 442 offenbart eine L-Gulono-γ-lacton-Dehydrogenase in gereinigter Form, welche die Oxidation von L-Gulono-γ-lac- ton zu L-Ascorbinsäure katalysiert, z.B. in Gegenwart eines von Sauerstoff verschiedenen Elektronenakzeptors. Ein derarti- ges Enzym ist aus Gluconobacter oxydans erhältlich, hat eine hohe Substratspezifität für L-Gulono-γ-lacton, ein pH-Optimum von 7-8 und ist aus 3 Untereinheiten aufgebaut, bei denen es sich um ein Flavoprotein, ein Cytochrom c Protein und ein einfaches Protein mit Molekulargewichten von ca. 61.000, 32.500 bzw. 16.500 D handelt. Cu2+- und Mn2+-Ionen zeigen eine starke Hemmung des Enzyms. Das Enzym bzw. ein dieses Enzym enthaltender Mikroorganismus oder Mikroorganismenextrakt kann zur Synthese von L-Ascorbinsäure unter Verwendung von L-Gu¬ lono-γ-lacton als Substrat eingesetzt werden. Nachteile dieses Enzyms bestehen jedoch darin, daß es eine relativ geringe Aktivität und Stabilität aufweist. Weiterhin wird durch den Aufbau aus 3 separaten Untereinheiten eine rekombinante Gewin¬ nung des Enzyms sehr erschwert.
Angesichts dieses Standes der Technik bestand die der vorlie¬ genden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe darin, neue Enzyme für die L-Ascorbinsäuresynthese sowie ein neues Synthesever¬ fahren bereitzustellen, bei dem die Nachteile des Standes der Technik mindestens teilweise beseitigt sind.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein neues Enzym, welches die enzymatische Umsetzung von D-Glucu¬ ronsäure bzw. Galacturonsäure zu L-Gulonsäure bzw. L-Galacton- säure katalysiert, eine dafür codierende Nukleinsäure und ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung des Enzyms. Dieses Enzym, das als Uronat-Reduktase (UDH) bezeichnet werden kann, ist aus dem Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae erhält¬ lich. D-Glucuronsäure und D-Galacturonsäure sind Substrate dieses Enzyms, die mit den Coenzymen NADPH oder/und NADH redu- ziert werden. Der K„-Wert für die Substrate D-Glucuronsäure und D-Galacturonsäure ist 65 mM bzw. 4,5 mM. Der K„-Wert für das Coenzym NADPH ist 0,008 mM. Das Enzym ist stabil, zeigt ein Optimum bei pH 6,2-8,5 und einer Temperatur von 45°C.
Zur Gewinnung dieses Enzyms wurde das von Fobo (Dissertation Universität Hohenheim, Stuttgart (1988) ) beschriebene Enzym L- Hexonatdehydrogenase (HDH) aus Lipomyces starkeyi vollständig aufgereinigt . Aus diesem gereinigten Produkt konnten nach tryptischer Verdauung kurze Aminosäuresequenzen ermittelt und aufgrund der Sequenzdaten Oligonukleotide synthetisiert wer- den, mit denen das für UDH codierende Gen aus genomischer Saccharomyces cerevisiae DNA isoliert werden konnte.
Die UDH aus S.cerevisiae hat eine wesentlich höhere Affinität für die Substrate D-Glucuronsäure und D-Galacturonsäure sowie für das Coenzym NADPH als die HDH aus L.starkeyi. Weiterhin besitzt UDH eine höhere Stabilität als HDH und kann bei -20°C für unbegrenzte Zeit aufbewahrt werden. Selbst bei 8°C sind nach 650 h noch über 50 % der Ausgangsaktivität meßbar.
Die für das udh-Gen codierende DNA-Sequenz wurde bereits bei Oechsner et al . , (FEBS Lett . 238 (1988), 123-128) als GCY (galactose-inducible, crystalline-like yeast protein) codie¬ rendes Gen beschrieben. Die Funktion des GCY-Proteins im He¬ festoffwechsel sowie die Verwendung dieses Proteins zur L- Ascorbinsaure waren bisher nicht bekannt.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung einer DNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer Uronat-Reduktase- Aktivität codiert und (a) die in SEQ ID No. 1 gezeigte Nukleotidsequenz,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybridisie¬ renden Nukleotidsequenz umfaßt, zur Herstellung eines Enzyms für die Synthese von L-Ascorbinsäure. Die in SEQ ID No. 1 gezeigte Nukleotidsequenz codiert für die vollständige Uronat-Reduktase aus dem Mikroorganismus Saccha- romyces cerevisiae. Neben dieser Sequenz und einer dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes ent- sprechenden Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit glei¬ cher Aminosäuresequenz codiert, umfaßt die vorliegende Erfin¬ dung auch noch eine DNA-Sequenz, die mit einer dieser Sequen¬ zen hybridisiert, vorausgesetzt, daß sie für ein Protein co¬ diert, das eine Uronat-Reduktase-Aktivität besitzt.
Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104) ver¬ wendet. Vorzugsweise spricht man von einer Hybridisierung, wenn nach Waschen für 1 Stunde mit 1 X SSC und 0,1 % SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C, insbesondere für 1 Stunde in 0,2 X SSC und 0,1 % SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleotidsequenz oder einer damit im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidse¬ quenz hybridisierende Nukleotidsequenz wird von der vorliegen¬ den Erfindung erfaßt.
Vorzugsweise weist die erfindungsgemäße DNA-Sequenz eine Nu¬ kleotidsequenz auf, die zu der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nu¬ kleotidsequenz eine Homologie von mindestens 70 %, besonders bevorzugt von mindestens 80 % und am meisten bevorzugt von mindestens 90 % aufweist.
Erfindungsgemäße Nukleotidsequenzen sind insbesondere aus Mikroorganismen der Gattungen Saccharomyces erhältlich.
Vorzugsweise wird ein rekombinanter Vektor verwendet, der mindestens eine Kopie einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz enthält. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryontischer Vektor sein, auf dem die erfindungsgemäße DNA-Sequenz sich vorzugsweise unter Kontrolle eines Expres¬ sionssignals (Promotor, Operator, Enhancer, etc.) befindet. Bevorzugte Beispiele für erfindungsgemäße Vektoren sind proka- ryontische Vektoren, insbesondere zirkuläre Plasmidvektoren, die z.B. bei Sambrook et al. , Supra, Kapitel 1-4 beschrieben sind.
Besonders bevorzugt befindet sich die DNA-Sequenz unter Kon- trolle eines regulierbaren Promotors, der durch Zugabe eines chemischen Induktors oder durch Temperaturänderung aktiviert werden kann. Beispiele derartiger Promotoren sind dem Fachmann bekannt, z.B., der lac-Promotor, der tac-Promotor, der trp- Promotor sowie Promotoren des Bakteriophagen Lambda etc.
Andererseits kann der erfindungsgemäße Vektor auch ein eukary¬ ontischer Vektor sein, z.B. ein Hefevektor oder ein für höhere Zellen geeigneter Vektor. Beispiele derartiger Vektoren finden sich bei Sambrook et al. supra, Kapitel 16.
Zur Herstellung des Enzyms für die Synthese von L-Ascorbin¬ säure verwendet man vorzugsweise eine Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. Vorzugsweise ist diese Zelle eine prokaryontisehe Zelle, insbesondere eine gram-negative proka- ryontische Zelle, z.B. eine E.coli Zelle. Andererseits kann die erfindungsgemäße Zelle jedoch auch eine eukaryontische Zelle sein, wie etwa eine Pilzzelle (z.B. Hefe) , eine tie¬ rische oder eine pflanzliche Zelle. Verfahren zur Transforma- tion prokaryontischer oder eukaryontischer Zellen mit exogenen Nukleinsäuresequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig (vgl. z.B. Sambrook et al . , Kapitel 1-4 und 16) .
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Proteins mit einer Uronat-Reduktase-Aktivität, das von einer erfindungs¬ gemäßen DNA-Sequenz codiert ist, als Enzym in einem Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure. Vorzugsweise umfaßt die¬ ses Protein (a) die in SEQ ID No. 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder (b) eine zur Sequenz aus (a) mindestens 80 %, insbeson¬ dere mindestens 90 % homologe Aminosäuresequenz.
Die Herstellung des Enzyms kann einerseits aus Zellen erfol¬ gen, die natürlicherweise ein für das Protein mit Uronat-Re- duktase-Aktivität codierendes Gen enthalten. Bevorzugt ist jedoch die Herstellung des Enzyms durch rekombinante DNA-Tech- nologie, wobei man eine Zelle mit einer wie vorstehend defi¬ nierten DNA-Sequenz oder einem diese DNA-Sequenz enthaltenden Vektor transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingun¬ gen kultiviert, bei denen eine Expression der DNA-Sequenz erfolgt und das Expressionsprodukt aus der Zelle oder dem Kulturmedium gewinnt.
Vorzugsweise verwendet man für die rekombinante Herstellung eines Proteins mit Uronat-Reduktase-Aktivität eine E.coli Zelle und isoliert das Expressionsprodukt aus dem Zellextrakt. Auf diese Weise kann unter Verwendung eines regulierbaren Expressionssystems, z.B. des tac-Promotors, aus 400 mg E.coli Rohextrakt, 670 U Uronat-Reduktase mit einer spezifischen Aktivität von 15 U/mg erhalten werden. Im Gegensatz dazu kön¬ nen nach 9-tägiger Kultur des Ausgangsorganismus Lipomyces starkeyi nur 18 U Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 33 U/mg nach Reinigung erhalten werden.
Vorzugsweise befindet sich das Uronat-Reduktase-Gen unter Kontrolle eines regulierbaren Expressionssignals, z.B. eines durch Lactose regulierbaren Expressionssignals, z.B. dem lac- oder dem tac-Promotor. Um im produktionstechnischen Maßstab mit Lactose anstelle des teuren synthetischen Induktors IPTG arbeiten zu können, muß das udh-Gen in eine Wirtszelle über¬ führt werden, die Lactose aufnehmen und verstoffwechseln kann. Bevorzugte Wirtszellen sind E.coli B und E.coli RM 82. E.coli B ist ein Stamm mit intaktem Lactoseoperon, die Zellen sind in der Lage durch ein spezifisches Transportsystem Lactose aus dem Medium aufzunehmen und in den eigentlichen Induktor Allo- lactose umzuwandeln. Bei E.coli RM 82 ist das spezifische Transportsystem für Lactose defekt, so daß Lactose nur in geringen Mengen über andere Transportsysteme in die Zelle gelangt und dort normal verstoffwechselt wird.
Mittels der oben genannten DNA-Sequenzen, Vektoren, transfor¬ mierten Zellen ist die Bereitstellung von Proteinen mit Uro- nat-Reduktase-Aktivität auf einfache Weise möglich, die sich hervorragend in Verfahren zur Synthese von L-Ascorbinsäure eignen. In einem solchen Verfahren wird eine ein Coenzym ent¬ haltende Substratlösung mit UR in Kontakt gebracht, wobei in einer enzymatischen Reaktion L-Gulonsäure bzw. L-Galactonsäure gebildet werden. Diese Produkte werden anschließend durch weitere enzymatische Reaktionen zu L-Ascorbinsäure umgesetzt. Als Substrate verwendet man vorzugsweise D-Glucuronsäure, D- Galacturonsäure, D-Glucurono-γ-lacton oder/und D-Galacturono- γ-lacton. Besonders bevorzugt verwendet man D-Glucuronsäure oder/und D-Galacturonsäure. Diese Substrate können auf ein- fache Weise in technischem Maßstab durch chemo-enzymatische Verfahren aus Stärke, Pektin (Kulbe et al. (1987): Ann. N.Y. Acad. Sei. 506, 543-551), Saccharose oder Lactose hergestellt werden.
Die Konzentration der Substrate im Reaktionsansatz kann je nach den Reaktionsbedingungen über einen weiten Bereich vari¬ iert werden. Gute Ergebnisse werden mit Konzentrationen von 20 mM-500 mM, z.B. 50 mM oder 250 mM erzielt.
Als Coenzyme werden NADPH oder/und NADH, insbesondere NADPH eingesetzt. Die Konzentration der Coenzyme im Reaktionsansatz beträgt vorzugsweise von 0,05-0,5 mM und besonders bevorzugt von 0,08-0,25 mM, wobei während der Reaktion günstigerweise eine Nachdosierung erfolgt.
Zur Vereinfachung der Reaktionsführung wird das Verfahren vorzugsweise in Gegenwart eines Systems zur Coenzymregenerie- rung durchgeführt. Beispiele für geeignete Systeme zur Coen- zymregenerierung finden sich in der bereits genannten deut¬ schen Patentschrift 35 02 143. Ein besonders bevorzugtes Sy¬ stem zur Coenzymregenerierung ist die Glucose-Dehydrogenase (GDH) , die D-Glucose zu D-Gluconsäure umsetzt, wobei aus NADP*, NADPH und H* entstehen. GDH ist ein kommerziell erhältliches Enzym und kann z.B. aus Bacillus cereus gewonnen werden.
Durch die kontinuierliche Coenzymregenerierung kann die wäh- rend der Reaktion notwendige Nachdosierung des Coenzyms stark verringert oder völlig vermieden werden. Zur Beschleunigung der Reaktion und bei einer längeren Reaktionsdauer kann es sich jedoch selbst bei einer Coenzymregenerierung manchmal als günstig erweisen, das Coenzym während der Reaktion nachzudo- sieren.
Die Stabilität der UDH wird in Gegenwart eines Sulfhydrylrea- genz, insbesondere DTT oder DTE, verbessert. Das Sulfhydryl- reagenz kann am Beginn der Reaktion zugesetzt werden. Vorzugs- weise erfolgt während der Reaktion eine Nachdosierung. Die Konzentration des Sulfhydrylreagenz im Reaktionsansatz beträgt vorzugsweise 1-50 mM, besonders bevorzugt 2-20 mM.
Eine weitere Stabilitätserhöhung der UDH wird durch Zusatz eines Komplexierungsmittels, insbesondere EDTA, erreicht. Die Konzentration des Komplexierungsmittels im Reaktionsansatz beträgt vorzugsweise 0,1-10 mM, besonders bevorzugt 0,5-5 mM.
Die UDH und, sofern vorhanden, die GDH können als bakterieller Rohextrakt oder als gereinigtes Enzym eingesetzt werden. Gege¬ benenfalls können die Enzyme auch in immobilisierter Form vorliegen. Besonders bevorzugt ist eine kontinuierliche Ver¬ fahrensführung. Hierzu wird eine Lösung, die das Substrat für UDH und das Substrat des für die Coenzymregenerierung verwen- deten Enzyms, im Falle von GDH Glucose enthält, in einen En¬ zymreaktor geleitet, m dem sich UDH, das zur Coenzymregene¬ rierung verwendete Enzym, z.B. GDH, und das Coenzym, z.B. NADPH oder/und NADH, befinden. Bei einem Einsatz der Enzyme in löslicher Form besitzt der Reaktor an seiner Ausströmöffnung eine Membran, die eine Rückhaltung der Enzyme und des Coenzyms gestattet. Diese Membran ist vorzugsweise eine negativ gela- dene Ultrafiltrationsmembran, z.B. aus sulfoniertem Polysul- fon, wie sie z.B. bei Howaldt et al. (1988) : Ann. N.Y. Acad. Sei 542, 400-405, oder Kulbe and Chmiel (1988) : Ann. N.Y. Acad. Sei 542, 444-464 beschrieben ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Enzymreaktor, umfassend
(a) ein Protein mit Uronat-Reduktase-Aktivität,
(b) ein Coenzym, ausgewählt aus NADH oder/und NADPH,
(c) mindestens eine Einströmöffnung zur Zufuhr von Sub- strat,
(d) mindestens eine Ausströmöffnung zur Entnahme von Produkt, und
(e) gegebenenfalls ein Enzym zur Coenzymregenerierung und dessen Substrat.
Ein Beispiel für einen bevorzugten Reaktor ist in Abb. 1 dar¬ gestellt. Hierbei wird eine Substrat, Coenzym und gegebenen¬ falls Stabilisatoren enthaltene Lösung 10 durch einen Steril¬ filter 12 in einen Enzymreaktor 14 eingeleitet. Der Reaktor 14 enthält UR und gegebenenfalls GDH in löslicher Form. Der Reak¬ tor ist mit einem Septum 16 und einer Rührvorrichtung 18 aus¬ gestattet. An der Ausströmöffnung des Reaktors ist eine nega¬ tiv geladene Ultrafiltrationsmembran 20 angeordnet. Weiterhin enthält der Reaktor Meßvorrichtungen zur Bestimmung der Leit- fähigkeit 22, des Drucks 24 und des pH-Werts 26. Der pH-Wert kann beispielsweise durch Zudosierung von Säure 28 (z.B. HCI) oder Lauge 30 (z.B. NaOH) über einen Regler 32 eingestellt werden. Aus dem Reaktor strömt schließlich die Produktlösung 34 aus.
Durch Umsetzung der Substrate D-Glucuronsäure bzw. D-Galactu¬ ronsäure mit UDH entstehen L-Gulonsäure bzw. L-Galactonsäure. Diese Produkte werden anschließend zu L-Ascorbinsäure weiter¬ reagiert. Vorzugsweise wird hierzu zunächst die gebildete L- Gulonsäure bzw. L-Galactonsäure in das entsprechende Lacton, d.h. insbesondere L-Gulono-γ-lacton bzw. L-Galactono-γ-lacton überführt. Diese Lactonbildung kann durch Ansäuern und Erhit¬ zen erfolgen. Zum Ansäuern wird vorzugsweise eine starke an¬ organische Säure, insbesondere HCI, verwendet. Die Konzentra¬ tion der Säure beträgt vorzugsweise 100-1000 mM, insbesondere 200-500 mM. Bei Verwendung von HCl wird bei einer Konzentra- tion ab 250 mM ein Maximum an Lactonbildung gefunden. Das Erhitzen erfolgt auf eine Temperatur von vorzugsweise minde¬ stens 45°C, insbesondere mindestens 50°C. Am meisten bevorzugt beträgt die Temperatur 55-70°C. Die Inkubationsdauer beträgt vorzugsweise mindestens 15 min. Ab einer Inkubationsdauer von 30 min. werden ca. 50-60 % Lacton gebildet. Eine längere Inku¬ bationsdauer bringt keine signifikante Ausbeutesteigerung mit sich. Weiterhin kann die Lactonbildung auch durch Inkubation mit einer geeigneten Lactonase erfolgen.
Noch ein weiterer Gegenstand des ersten Aspekts der vorliegen¬ den Erfindung ist eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer Uronat-Reduktase-Aktivität codiert und eine mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz oder einer dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Sequenz hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein Protein codiert, das sich von der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäuresequenz um mindestens eine Aminosäure unterscheidet.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß durch Mutagenese der in SEQ. ID No. 1 gezeigten Nukleotidsequenz neue Nukleo- tidsequenzen erhältlich sind, die für enzymatisch aktive Pro¬ teine mit einer höheren Affinität für das Coenzym NADH als das Ausgangsprodukt codieren. Bei großtechnischen Verfahren ist die Verwendung des Coenzyms NADH gegenüber dem Coenzym NADPH aus Kostengründen deutlich bevorzugt. Daher können modifi- zierte Proteine mit erhöhter Affinität für NADH insbesondere bei großtechnischen Anwendungen eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein s Protein mit Uronat-Reduktase-Aktivität, das sich um mindestens eine Aminosäure von der in SEQ ID. No. 2 gezeigten Aminosäure¬ sequenz unterscheidet. Vorzugsweise weist dieses Protein eine Homologie von mindestens 80 % zur Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 auf. Besonders bevorzugt besitzt das Protein für NADH o als Coenzym eine höhere maximale Umsatzgeschwindigkeit oder/ und einen geringeren K„-Wert als das Protein mit der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäusresequenz.
Spezifische Beispiele für solche modifizierten Proteine unter- s scheiden sich von der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäurese¬ quenz durch einen Austausch von Arg (57) durch Glu, einen Austausch von Tyr (47) durch Glu oder/und einen Austausch von Gin (29) durch Gly.
0 Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die rekom¬ binante Herstellung von Proteinen mit L-Gulono-γ-Lactonoxi- dase-Aktivität (GulOx) in hoher Ausbeute und die Verwendung dieser Proteine bei der Synthese von Vitamin C.
5 GulOx katalysiert die Oxidation von L-Gulono-γ-Lacton bzw. L- Galactono-γ-Lacton in Anwesenheit von 02 zu L-Ascorbinsäure. GulOx ist aus Eukaryonten, z.B. aus der Mikrosomenfraktion der Rattenleber erhältlich (Nishikimi et al. , Arch. Biochem. Bio¬ phys. 175 (1976), 427-435). GulOx besitzt als prosthetische 0 Gruppe einen kovalent gebundenen Flavinanteil, der am Elek¬ tronentransfer auf 02 beteiligt ist. Im SDS-Gel wurde das Molekulargewicht mit 51 kd bestimmt. Im nativen Zustand liegen jedoch Aggregate mit einer Größe von etwa 500 kd vor. Der K„- Wert für L-Gulono-γ-Lacton wurde mit 0,066 mM bestimmt. Neben 5 L-Gulono-γ-Lacton setzt GulOx auch L-Galactono-, D-Mannono- und D-Altrono-γ-Lacton zu L-Ascorbinsäure um. Bei der rekombinanten Expression von GulOx in Äffenzellkultu¬ ren (Yagi et al . , Biochem. Biophys. Res. Commun. 177 (1991) , 659-663) wurden bisher nur sehr geringe Ausbeuten, nämlich eine spezifische Aktivität von 0,38 mU/mg erhalten. Eine re- kombinante Expression in E.coli wurde bisher nicht erreicht.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß bei rekombinanter Expression von GulOx in E.coli das Enzym in einer um ein Viel¬ faches höheren spezifischen Aktivität als bei der rekombinan- ten Expression in Äffenzellkulturen und bei der Aufreinigung aus Mikrosomenpräparationen von Leberzellextrakten erhalten werden konnte.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine pro- karyontische Zelle, die in der Lage ist, eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität codiert und (a) die in SEQ ID No. 3 gezeigte Nukleotidsequenz, (b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder (c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybridisierende Nukleo¬ tidsequenz, zur Expression zu bringen.
Vorzugsweise ist die prokaryontische Zelle eine gram-negative Zelle, insbesondere eine E.coli Zelle. Die für die GulOx co- dierende DNA-Sequenz ist unter Kontrolle eines geeigneten Expressionssignals, welches vom Transkriptionsapparat der prokaryontisehen Zelle erkannt wird. Vorzugsweise befindet sich die DNA-Sequenz auf einem geeigneten rekombinanten Vektor unter Kontrolle eines regulierbaren Expressionssignals (siehe oben) .
Die erfindungsgemäße Zelle kann bei Expression der DNA-Sequenz und anschließendem Zellaufschluß einen Extrakt mit einer spe¬ zifischen GulOx-Aktivität von ≥ 5 mU/mg, insbesondere von ≥ 10 mU/mg und besonders bevorzugt von 10-200 mU/mg ergeben. Die Enzymausbeute nach der Expression kann erhöht werden, wenn man die Zellen nach der Ernte in Puffer wäscht und anschlie¬ ßend zentrifugiert. Durch eine anschließende Fällung mit 16 % Ammoniumsulfat, bei der das aktive Enzym sich im Niederschlag befindet, kann eine weitere signifikante Erhöhung der spezifi¬ schen Aktivität erreicht werden.
Die in SEQ ID NO. 3 gezeigte Nukleotidsequenz kodiert für die vollständige L-Gulono-γ-Lacton-Oxidase aus der Ratte. Neben dieser Sequenz und einer dieser Sequenz im Rahmen der Degene¬ ration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit gleicher Aminosäuresequenz codiert, umfaßt die vorliegende Erfindung auch noch eine DNA-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen hybridisiert. Die Bedingungen, bei denen eine Hybridisierung bestimmt werden kann, sind dabei wie zuvor beschrieben.
Vorzugsweise weist die DNA-Sequenz eine Nukleotidsequenz auf, die zu der in SEQ ID NO. 3 gezeigten Nukleotidsequenz eine Homologie von mindestens 70 %, besonders bevorzugt von minde¬ stens 80 % und am meisten bevorzugt von mindesten 90 % auf¬ weist.
Die DNA-Sequenz befindet sich in der erfindungsgemäßen Zelle vorzugsweise auf einem für die Genexpression in Prokaryonten geeigneten Vektor. Beispiele geeigneter Vektoren wurden be¬ reits genannt.
Die Erfindung betrifft auch ein unglykosiliertes Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität aus Prokaryonten, das codiert ist von einer DNA-Sequenz, welche (a) die in SEQ ID No. 3 gezeigte Nukleotidsequenz, (b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder (c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt. Vorzugsweise umfaßt dieses Protein (a) die in SEQ ID NO . 4 gezeigte Sequenz oder (b) eine zur Sequenz aus (a) mindestens 80 %, insbesondere mindestens 90 % homologe Aminosäuresequenz.
Die Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins erfolgt da¬ durch, daß man eine prokaryontische Zelle (i) einer DNA-Se¬ quenz, die für ein Protein mit einer L-Gulono-γ-lacton-Oxi- dase-Aktivität codiert und (b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder (c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt, oder (ii) einen rekombinanten Vektor, der mindestens eine Kopie einer DNA-Sequenz aus (a) , (b) oder/und (c) enthält, trans¬ formiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kulti- viert, bei denen eine Expression der DNA-Sequenz erfolgt und das Expressionsprodukt aus der Zelle oder dem Kulturmedium gewinnt .
Vorzugsweise wird das Expressionsprodukt aus dem Zellextrakt, gegebenenfalls nach Ammoniumsulfatfällung, gewonnen. Der Zell- extrakt weist eine spezifische GulOx-Aktivität von ≥ 5 mU/mg auf .
Das aus Prokaryonten erhältliche erfindungsgemäße unglykosi- lierte Protein mit L-Gulono-γ-lacton Oxidase-Aktivität oder ein dieses Protein enthaltender Zellextrakt kann in einem Verfahren zur Synthese von L-Ascorbinsäure eingesetzt werden.
Hierbei bringt man eine 02 enthaltende Substratlösung mit der GulOx in Kontakt und gewinnt anschließend die durch enzyma¬ tische Umsetzung des Substrats gebildete L-Ascorbinsäure. Als Substrat werden vorzugsweise L-Gulono-γ-lacton oder/und L- Galactono-lacton eingesetzt.
Die GulOx kann dabei sowohl als bakterieller Rohextrakt, der gegebenenfalls gewaschen und aufkonzentriert sein kann, als Ammoniumsulfat-Fällungsprodukt und auch als solubilisiertes Enzym eingesetzt werden. Besonders bevorzugt verwendet man eine immobilisierte GulOx.
Die Reaktion wird vorzugsweise im Bereich von pH 6-8 durch- geführt. Dabei findet man, daß im Bereich von pH 7-8 die GulOx eine höhere enzymatische Aktivität und Stabilität aufweist, daß aber im Bereich von 6-7 die L-Ascorbinsäure stabiler ist. Die Wahl des pH-Werts muß daher je nach spezifischen Erforder¬ nissen optimiert werden.
Weiterhin wurde festgestellt, daß der Zusatz eines Sulfhydryl- Reagenz, insbesondere Dithiothreitol (DTT) oder Dithioerythri- tol (DTE) die Stabilität der Ascorbinsaure verbessert und somit die Ausbeute erhöht. Vorzugsweise wird das Sulfhydryl- reagenz in einer Konzentration von etwa 1-5 mM zugesetzt. Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn man das Sulf- hydrylreagenz während der Reaktion nachdosiert, z.B. eine Zugabe von 2 mM DDT nach jeweils 5 Stunden Reaktionsdauer.
Auch die Durchführung der Reaktion in Gegenwart von Katalase kann bevorzugt sein. Die Wasserstoffperoxid-zersetzende Wir¬ kung der Katalase wirkt sich günstig auf die Stabilität der Ascorbinsaure aus und versorgt die GulOx zusätzlich mit mole¬ kularem Sauerstoff, der beim Abbau von H202 gebildet wird. Durch Zusatz von Katalase kann eine stabilisierende Wirkung erreicht werden, die in etwa mit der Zugabe des Sulfhydrylrea- genz vergleichbar ist.
Die Substratkonzentration kann in weiten Bereichen variiert werden und beträgt im allgemeinen etwa 1-500 mM, insbesondere von 20-250 mM. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß eine Erhöhung der Substratkonzentration im Produktansatz zu einer Vergrößerung der jeweils maximal erreichbaren L-Ascor- binsäurekonzentration führt. Eine Stabilisierung der durch die Reaktion gebildeten Ascor¬ binsaure kann durch Ansäuern, insbesondere auf einen pH-Wert von <. 5, insbesondere einem pH von etwa 3 erreicht werden.
Um die Produktivität der GulOx zu erhöhen, ist es bevorzugt, die L-Ascorbinsäuresynthese in einem kontinuierlichen System mit einem immobilisierten Enzym durchzuführen (vgl. Abb. 2) . Die mit Sauerstoff angereicherte Substratlösung 40 wird dabei mit konstantem Fluß in einem Enzymreaktor 42 eingeleitet. Der Reaktor 42 enthält immobilisierte GulOx 44, die vorzugsweise an eine partikelförmige Matrix mit großer Oberfläche gebunden ist. Der pH-Wert innerhalb des Enzymreaktors kann auf einem für die Enzymaktivität günstigen, d.h. hohen pH von 7-8 gehal¬ ten werden. Nach Verlassen des Reaktors kann der pH-Wert durch Zugabe von Säure (46) gesenkt und damit die Ascorbinsaure stabilisiert werden. Aus der auf diese Weise erhaltenen Pro¬ duktlösung 48 erfolgt schließlich die Gewinnung der L-Ascor¬ binsäure.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Enzymreaktor, um¬ fassend
(a) ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität,
(b) Sauerstoff als Cosubstrat,
(c) mindestens eine Einströmöffnung zur Zufuhr von Sub- strat, und
(d) mindestens eine Ausströmöffnung zur Entnahme von Produkt.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Synthese von L-Ascorbinsäure in einem mehrstufigen Verfahren, bei dem ein erster enzymatischer Reaktionsschritt, der von einem Pro¬ tein mit Uronat-Reduktase-Aktivität katalysiert wird, mit einem zweiten enzymatischen Reaktionsschritt kombiniert wird, der durch ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität katalysiert wird. Bei der erfindungsgemäßen Kopplung von UDH und GulOx kann zwi¬ schen einer direkten Kopplung und einer indirekten Kopplung unterschieden werden. Bei der direkten Enzymkopplung wird im ersten enzymatischen Reaktionsschritt als UDH-Substrat D-Glu- curonsäure-γ-lacton oder/und D-Galacturonsäure-γ-lacton ver¬ wendet. Als Produkt des ersten enzymatischen Reaktionsschritts wird L-Gulono-γ-lacton oder/und L-Galactono-γ-lacton erhalten, das direkt als Substrat für den zweiten enzymatischen Reak¬ tionsschritt eingesetzt werden kann. Dieses Verfahren ist jedoch weniger bevorzugt, da die Substratspezifität der UR für Lactone relativ gering ist. Bevorzugt ist daher eine indirekte Kopplung, bei der der erste und zweite enzymatische Reaktions¬ schritt räumlich getrennt eingesetzt werden. Das bei Verwen¬ dung von D-Glucuronsäure oder/und D-Galacturonsäure im ersten Schritt entstehende Produkt wird lactonisiert und die entste¬ hende Lösung als Substrat für den zweiten Schritt verwendet. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die im ersten Schritt entstehende Produktlösung nach Lactonisierung direkt in den zweiten Schritt ohne vorhergehende Aufreinigung einge- setzt werden kann.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren mit direkter Enzym¬ kopplung, wobei man
(a) D-Glucuronsäure-γ-lacton oder/und D-Galacturonsäure-γ- lacton durch ein Protein mit Uronat-Reduktase-Aktivität zu L-Gulono-γ-lacton oder/und L-Galactono-γ-lacton über¬ führt, und
(b) die in Schritt (a) gebildeten Produkte direkt durch ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität in L- Ascorbinsaure überführt.
Bevorzugt ist jedoch ein Verfahren zur Synthese von L-Ascor¬ binsäure mit indirekter Enzymkopplung, wobei man (a) D-Glucuronsäure oder/und D-Galacturonsäure durch ein Protein mit Uronat-Reduktase-Aktivität zu L-Gulonsäure oder/und L-Galactonsäure überführt, (b) die in Schritt (a) gebildeten Produkte durch Lactonisie- rung in L-Gulono-γ-lacton oder/und L-Galactono-γ-lacton überführt und
(c) die in Schritt (b) gebildeten Produkte durch ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität in L-Ascorbin¬ säure überführt .
Die als Substrate für den Schritt (a) des indirekten Verfah¬ rens verwendeten D-Glucuronsäure oder/und D-Galacturonsäure sind beispielsweise durch enzymatische Isomerisierung der aus Saccharose durch Oxidation und Hydrolyse zugänglichen Fruc- turonsäure z.B. durch Glucuronat-Isomerase (EC 5.3.1.12) aus E.coli (Karapally und Dietrich (1970) : Can J. Biochem. 48, 154-160) erhältlich. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, durch enzymatische Oxidation von UDP-Glucose durch die NAD- abhängige UDP-Glucose-Dehydrogenase (EC 1.1.1.22) aus Pseudo¬ monas elodea (Tazuke et al . (1977) : J. Ferment. Technol . 55, 501-509) UDP-Glucuronsäure zu erhalten. UDP-Glucose wird wie¬ derum aus Glucose-1-phosphat (GIP) hergestellt. Phosphoryla- sen, welche aus Stärke bzw. Maltodextrinen GIP synthetisieren, sind bekannt, z.B. Maltodextrinphosphorylase (EC 2.4.1.1) aus Corynebacterium callunae (Weinhäusel et al . (1994) : Appl . Microbiol. Biotechnol . 41, 510-515; Nidetzky et al . (1995) : J. Carbohydrate Chemistry 14, 1017-1028) , aus E.coli (Weinhäusel et al . (1995) : Enzyme Microbiol. Techn. 17, 140-146) oder Stärkephosphorylase (EC 2.4.1.1) aus Kartoffeln (EP-A-0 305 908) .
Vorzugsweise wird als Protein mit Uronat-Reductase-Aktivität ein Protein verwendet, welches von der in SEQ ID No. 1 gezeig¬ ten Nukleotidsequenz, einer dieser Sequenz im Rahmen der Dege¬ neration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenz oder einer mit diesen Sequenzen hybridisierenden Nukleotidse¬ quenz codiert ist.
Der erste enzymatische Reaktionsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird sowohl bei direkter als auch bei indirekter Enzymkopplung vorzugsweise in Gegenwart eines Systems zur Coenzymregenerierung, wie oben beschrieben, durchgeführt. Weiterhin ist es bevorzugt, diesen Verfahrensschritt kontinu¬ ierlich in einem Enzymreaktor durchzuführen.
Schritt (b) des indirekten Verfahrens umfaßt die Lactonisie- rung der im Schritt (a) gebildeten Produkte. Dies erfolgt, wie zuvor beschrieben, vorzugsweise durch Erhitzen und Ansäuern.
Für den zweiten enzymatischen Reaktionsschritt wird vorzugs¬ weise ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität verwendet, welches von einer DNA-Sequenz mit der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleotidsequenz, eine dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleo- tidsequenz oder einer mit diesen Sequenzen hybridisierenden Nukleotidsequenz codiert ist. Vorzugsweise wird das Protein aus prokaryontisehen Zellen gewonnen. Das Protein mit GulOx- Aktivität verwendet vorzugsweise 02 als Cosubstrat.
Das Verfahren wird günstigerweise als kontinuierlicher Prozeß durchgeführt. Bei der direkten Verfahrensvariante kann die Reaktion in einem einzigen Enzymreaktor durchgeführt werden. Bei der indirekten Verfahrensvariante verwendet man günstiger¬ weise zwei separate Reaktoren.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist gegenüber bekannten Ver¬ fahren zahlreiche signifikante Vorteile auf. Zunächst müssen kleine Schutzgruppen verwendet werden, was zur Vermeidung von Abwasserproblemen führt. Weiterhin kann das Verfahren unter milden Reaktionsbedingungen mit einer geringen Anzahl von Synthesestufen durchgeführt werden. Es ist keine chemische Hydrierung, keine Verwendung von H2 und keine Verwendung von Cl2 erforderlich. Schließlich können mit Hilfe der beschriebe¬ nen Enzyme wesentlich bessere Aktivitäten und Ausbeuten als im Stand der Technik erreicht werden. Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Sequenz- Protokolle und Abbildungen erläutert werden. Es zeigen:
SEQ ID No. 1 die Nukleotidsequenz eines Uronat-Dehydroge- s nase-Gens,
SEQ ID No. 2 die Aminosäuresequenz einer Uronat-Dehydrogena- se, SEQ ID No. 3 die Nukleotidsequenz eines L-Gulono-γ-lacton-
Oxidase-Gens, o SEQ ID No. 4 die Aminosäuresequenz einer L-Gulono-γ-lacton-
Oxidase,
SEQ ID No, 5 s und 6 Aminosäureteilsequenzen der Hexonat-Dehydroge- nase aus L. starkeyi, SEQ ID No. 7 und 8 Nukleotidsequenzen von degenerierten Oligonu- kleotidprimern zur Isolierung des Uronat-Dehy- 0 drogenase-Gens aus S. cerevisiae,
SEQ ID. No. 9 und 10 Nukleotidsequenzen von Oligonukleotidprimern zur Isolierung des L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-
Gens aus einer Ratten cDNA-Bank, 5
Abb. 1 einen Uronat-Dehydrogenase-Enzymreaktor und Abb. 2 einen L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Enzymreaktor.
Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachstehen- 0 den Beispiele erläutert werden:
Methoden
1. Aktivitätstests für UDH und GDH
Die Enzymaktivitäten wurden mit Hilfe eines optischen 5 Tests im Photometer bestimmt, indem die Extinktionsände¬ rung bei 340 nm infolge der Abnahme bzw. Zunahme der NADP (H) -Konzentration bei 25°C gemessen wurde. Meßgröße war die Extinktionsänderung pro Zeiteinheit, die proportional zur umgesetzten Coenzymkonzentration ist. Eine Einheit (U) ist die Menge an Enzym, die unter Testbedingungen
1 μmol Substrat pro Minute bei 25°C umsetzt.
Reaktionsansatz zur Bestimmung von UDH:
100 mM Substrat (D-Glucuronsäure) und 0,1 mM Coenzym (NADPH) in Reaktionspuffer (5 mM K-Phosphatpuffer pH 7,0, 100 mM KCl und 0,1 % NaN3) .
Reaktionsansatz zur Bestimmung von GDH:
100 mM Substrat (D-Glucose) , 0,2 mM Coenzym (NADP) in
Reaktionspuffer (siehe oben) .
2. Aktivitätstest für GulOx
Die Aktivität von GulOx wurde durch Konzentrationsmessung des Endprodukts L-Ascorbinsäure bestimmt. Dieser Test beinhaltete die Oxidation der Ascorbinsaure und eine an¬ schließende Umwandlung zum Bis- (Dinitrophenyl)hydrazon, welches mit HPLC bei 495 nm nachgewiesen werden kann. Eine Einheit (U) ist diejenige Menge an Enzym, die unter Testbedingungen 1 μmol Substrat pro Minute bei 37°C um¬ setzt.
Reaktionsansatz zur Bestimmung von GulOx:
50 μl Probelösung, 2,5 mM Substrat (L-Gulono-γ-lacton) in Reaktionspuffer (50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0, 50 mM Na-Citrat, 1,7 mM DTT) in einem Gesamtvolumen von 300 μl; Inkubationsdauer: 15 min bei 37°C.
Nach der enzymatischen Reaktion wurden die Proben mit 50 μl einer 30-%igen Meta-Phosphorsäure abgestoppt und 5 min bei 10 000 g abzentrifugiert. Von dem Überstand wurden 330 μl abpipettiert und in ein neues Reaktions- gefäß überführt, in das die zur Derivatisierung von L- Ascorbinsäure notwendigen Lösungen zugegeben wurden:
20 μl Dichlorphenol indophenol (0,2 %) 300 μl Thioharnstoff (2 % in 5 %iger Metaphosphorsäure) 60 μl Dinitrophenylhydrazin (2 % in 9 N H2S04) .
Die Probe wurde 90 min. bei 50°C inkubiert. Danach er- s folgte eine Elution des Hydrazons durch Ausschütteln in 400 μl Ethylacetat. Die HPLC Auftrennung der Probe wurde einer Polygosil 60-5 (Silikasäure) durchgeführt. Als Laufmittel wurde n-Hexan/Ethylacetat/n-Propanol/Essig- säure (4/3/0,2/0,1) verwendet. 0
Beispiel 1 Uronat-Reduktase
1.1. Aufreinigung von HDH aus Lipomyces starkeyi
Die Aufreinigung der Hexonat-Reduktase (HDH) aus L.star- 5 keyi bis zur Homogenität erfolgte aus dem Rohextrakt durch Hydrophobe Interaktionschromatographie an Phenylse- pharose fast flow, gefolgt von Anionenaustausch-Chromato- graphie an Q-Sepharose fast flow und abschließender er¬ neuter Hydrophober Chromatographie an Alkyl-Superose HR 0 5/5 bis zu einer spezifischen Aktivität von 33 U/mg (220fache Anreicherung) .
Aus dem gereinigten Enzym konnten nach tryptischer Ver¬ dauung 2 kurze Aminosäurensequenzen ermittelt werden (SEQ 5 ID No. 5 und 6) . Aufgrund dieser Sequenzdaten wurden Oligonukleotide synthetisiert, um das udh-Gen aus geno¬ mischer Saccharomyces cerevisiae DNA zu isolieren.
1.2. Charakterisierung des Uronat-Reduktase-Gens 0 Die Isolierung genomischer DNA aus Saccharomyces cerevi¬ siae erfolgte nach Sambrook et al . , Supra. Durch PCR- Technik unter Verwendung der aus den Aminosäuresequenzen SEQ ID No. 5 und 6 abgeleiteten degenerierten Oligonu¬ kleotide SEQ ID No. 7 und 8 konnte ein DNA-Fragment am- 5 plifiziert und isoliert werden. Dieses wurde als Sonde verwendet, um aus genomischer DNA von S.cerevisiae ein genomisches Fragment durch Hybridisierung nachzuweisen und zu isolieren. Das Fragment wurde kloniert und sequen¬ ziert. Die in SEQ ID No. 1 gezeigte Sequenz ist darin enthalten und codiert für ein Polypeptid mit der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäuresequenz.
5
1.3. Rekombinante Expression von UDH
Das von der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID No. 1 codierte Poly¬ peptid konnte mit hoher Ausbeute in E.coli JM 109 syn¬ thetisiert werden. Die im SDS-Gel sichtbare Proteinbande o entsprach etwa 15-20 % der Gesamtmenge an löslichem Pro¬ tein. Die Zellen wurden nicht in ihrem Wachstum beein¬ trächtigt.
D-Glucuronsäure und D-Galacturonsäure sind Substrate, die 5 mit dem Coenzym NADPH reduziert werden. Der I^-Wert für die D-Glucuronsäure ist 7,64 mM. Für die D-Galacturon¬ säure ist der K„-Wert 4,5 mM. Das Enzym ist stabil, zeigt ein pH-Optimum bei pH 6, 2-8,5 und ein Temperaturoptimum bei 45°C. 0
Das Molekulargewicht der rekombinanten UDH liegt bei SDS- PAGE zwischen 30 und 43 kD. Die Affinität zum Coenzym NADPH ist mit K„ = 0,008 mM deutlich besser als die von HDH aus L.starkeyi (K„ = 0,035 mM) . 5
Bei rekombinanter Expression in E.coli konnte nach vier¬ stündiger Induktion durch Ammoniumsulfatfällung (40 %) des Zellextrakts und anschließender fraktionierter Ionen¬ austausch-Chromatographie des Überstands an einer Mono-S- 0 Säule ein nahezu reines Protein mit einer spezifischen Aktivität von 15 U/mg erhalten werden.
1.4. Optimierung der udh-Expression s Der im Beispiel 1.3. zur Expression verwendete Induktor IPTG ist sehr teuer und kann zudem toxisch auf E.coli Zellen wirken. Um mit dem wesentlich kostengünstigeren Induktor Lactose arbeiten zu können, mußte das udh-Gen in einen Wirt überführt werden, der Lactose aufnehmen und verstoffwechseln kann. Ein Beispiel für einen geeigneten Bakterienstamm ist E.coli B (Donch und Greenbert (1986) , B.J. Bacteriol . 95, 1555-1559) , ein Stamm mit intaktem Lactoseoperon, der Lactose aus dem Medium aufnehmen und in den eigentlichen Induktor Allolactose umwandeln kann. Zur Expression in E.coli B wurde das udh-Gen in den Ex¬ pressionsvektor pBTac 1 (Brosius et al . (1981) , J. Mol. Biol, 148, 107-127) hinter den regulierbaren tac-Promotor kloniert. Um sicherzustellen, daß das Gen ohne Zugabe von
Induktor nicht exprimiert wird, wurden die Bakterien noch mit einem zweiten Plasmid pFDX500 (Brinkmann et al .
(1989) , Gene 85, 109-114) cotransformiert, das ein Gen für den Repressor des lac-Promotors trägt. Dieser Repres- sor kann auch den tac-Promotor regulieren.
Ein weiterer geeigneter Bakterienstamm ist E.coli RM82 (Mattes (1985) , Habilitationsschrift Universität Regens- bürg) . Bei diesen Zellen ist das spezifische Transportsy¬ stem für Lactose defekt, so daß Lactose nur in sehr ge¬ ringen Mengen in die Zelle gelangen kann. In der Zelle wird es normal verstoffwechselt . Auch hier wurde ein weiteres Plasmid pREM6677 (Mattes (1985) , Habilitations- schrift Universität Regensburg) cotransformiert, das ebenfalls den lac-Repressor enthält.
Eine Induktion der obengenannten Bakterienstämme konnte bei einer Lactosekonzentration von ≥ 0,2 % im Medium erreicht werden. Während der Kultivierung folgt vorzugs¬ weise eine kontinuierliche oder/und diskontinuierliche Zugabe von Induktor. Es konnten im Rohextrakt 2,4 U/mg (E.coli B) bzw. 1,5 U/mg (E.coli RM82) gemessen werden, was einer Ausbeute von etwa 70 % gegenüber der Induktion mit IPTG entspricht. Bei E.coli B Zellen wurde nach vierstündiger Induktion mit 0,2 % Lactose eine maximale spezifische Aktivität des Rohextrakts erreicht. Bei Verwendung von E.coli RM 82 wurde bereits nach einer Stunde Induktionszeit die hier maximale spezifische Aktivität im Rohextrakt erreicht.
1.5. UDH-Mutanten
Es wurden drei UDH-Mutanten hergestellt. Bei der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäuresequenz wurde das Arginin 57 gegen Glutaminsäure, das Tyrosin 47 gegen Glutaminsäure oder das Glutamin 29 gegen Glycin ausgetauscht.
In Tabelle 1 sind die Werte für die maximale Geschwindig¬ keit (vmax) sowie die Michaelis-Konstante (K„) des nativen Enzyms sowie der Mutanten mit NADH bzw. NADPH als Coenzym und D-Galacturonsäure als Substrat angegegen.
Tabelle 1
Figure imgf000028_0001
Die Mutante R57E hatte keine großen Auswirkungen auf die Coenzymspezifität. Es wurde eine Verringerung der maxima¬ len Umsatzgeschwindigkeit mit NADPH als Coenzym festge¬ stellt. Für NADH wurde eine etwas verbesserte maximale Umsatzgeschwindigkeit gefunden.
Die Mutante Q29G zeigte bei NADPH eine schlechtere maxi¬ male Umsatzgeschwindigkeit und einen schlechteren K„-Wert, Für NADH wurde ebenfalls eine Verschlechterung der maxi¬ malen Umsatzgeschwindigkeit, aber eine drastische Verbes¬ serung des K„-Werts gefunden. Die Mutante Y47E zeigte für NADPH einen etwas verschlech¬ terten K„-Wert. Für NADH wurde die maximale Umsatzge¬ schwindigkeit verschlechtert, aber der K„-Wert war sehr stark verbessert.
1.6. UDH-katalvsierte Substratumsetzung mit Coenzymregenerierung
Durch Kopplung der UDH-Reaktion mit einem System zur Coenzymregenerierung konnten hohe Substratumsätze erzielt werden.
1.6.1. Batchreaktionen
Der Standardansatz für eine Batchreaktion war wie folgt: 0,15 U UDH/ml; 0,5 U GDH/ml und 50 bzw. 250 mM Substrat in einem Gesamtvolumen von 20 ml.
Als Substrate wurden D-Glucuronsäure, D-Galacturonsäure und D-Glucurono-γ-lacton verwendet. Bei einer Substrat¬ konzentration von 250 mM konnte eine nahezu vollständige Umsetzung der Substratlösungen erreicht werden.
Die Anfangskonzentration des Coenzyms in den Ansätzen betrug 0,06 mM, 0,012 mM bzw. 0,15 mM. Durch Erhöhung der Konzentration von 0,06 mM auf 0,012 mM konnte eine deut- liehe Umsatzverbesserung erreicht werden. Eine Erhöhung auf 0,15 mM hatte keine weitere Umsatzsteigerung zur Folge. Im Enzymsystem UDH/GDH konnte das Coenzym bis zu 2000 mal recyclisiert werden.
Es wurde auch der Einfluß des UDH/GDH-Verhältnisses auf die Reaktion untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß eine GDH-Zugabe im Überschuß nicht nötig war und daß eine ausreichende CoenzymbereitStellung für die UDH auch bei einer annähernd gleichen UDH- und GDH-Aktivität zumindest für eine Coenzymstartkonzentration von 0,15 mM gegeben war. UDH/GDH-Enzymverhältnisse (Aktivität) von 1/1 bzw. 1/1,5 lieferten bei ausreichender Coenzymmenge vergleich- bare Umsätze. Bei geringen Coenzymkonzentrationen oder längerer Reaktionsdauer erwies sich jedoch ein GDH-Über- schuß als vorteilhaft.
Eine Zugabe von 10 mM DTT zum Ansatz führte zu einer deutlichen Verbesserung der Stabilität von UDH. Auch durch Zusatz von 2 mM EDTA konnte die Stabilität von UDH verbessert werden.
1.6.2. Kontinuierliche Ansätze
Kontinuierliche Reaktorversuche wurden unter folgenden
Bedingungen durchgeführt: Puffer: 5 mM Kaliumphosphat, 100 mM KCl, 0,1 % NaN3
Temperatur: 25°C
Rührergeschwindigkeit: 300 RPM pH-Wert: 7,0
Substratkonzentration: 50 mM D-Glucuronsäure, 50 mM D- Glucose, 0,15 mM NADP
Zusätze: 5 mM DTT
Gesamtmenge an Enzym: UDH 15 U/GDH 80 U
Während der Reaktionsdauer erfolgte eine Nachdosierung von NADP. Durch Verdoppelung der Flußrate von 5 ml/h (mittlere Verweilzeil 10 h) auf 10 ml/h (mittlere Ver¬ weilzeit 5 h) konnte die Produktivität verbessert werden. Die in den ersten 100 h gebildete Produktmenge erhöhte sich um 79 %. Der Umsatz lag bei den kontinuierlichen Reaktorversuchen im Durchschnitt bei 77-85 %.
1.7. Lactonisierung
L-Gulon- bzw. L-Galactonsäurelösungen (100 mM) wurden bei 60°C für 15 min. und Zugabe von HCl (Endkonzentration von 250 mM) inkubiert. Die Ausbeute der Lactonbildung betrug dabei ca. 45 %. Durch Verlängerung der Inkubationsdauer auf 30 min konnte die Ausbeute auf ca. 60 % verbessert werden. Eine längere Inkubationsdauer brachte keine wei¬ tere Ausbeutesteigerung mit sich.
L-Galactonsäurelösungen wurden in Gegenwart unterschied- licher HCI-Konzentrationen bei 60°C inkubiert. Bei einer Konzentration ab 250 mM wurde die maximale Lactonbildung erreicht .
Beispiel 2 L-Gulono-γ-lacton-Oxidase (GulOx)
2.1. Klonierung der cDNA von GulOx
Die cDNA für GulOx aus der Ratte ist bekannt (Koshizaka et al. (1988) : J. Biol. Chem 263, 1619-1621) . Aus einer kommerziell verfügbaren cDNA-Bank der Rattenleber (Stra- tagene, Heidelberg) wurde mit Hilfe der in SEQ ID No. 9 und 10 gezeigten Oligonukleotide eine PCR-Amplifikation durchgeführt, das enthaltene Fragment isoliert, kloniert und sequenziert. Darin ist die in SEQ ID No. 3 gezeigte Sequenz enthalten, die für ein Polypeptid mit der in SEQ ID No. 4 gezeigten Sequenz codiert. Gegenüber der von Koshizaka et al . , Supra, publizierten Sequenz wurden 2 Unterschiede gefunden: Position 252 G statt A; Codon Val statt Ile und Position 567 C statt G, Codon His statt Glu.
2.2. Rekombinante Expression von GulOx in E.coli
Die cDNA von GulOx wurde in den Expressionsvektor pET-12a (Studier et al . (1990) , Meth. Enzymol . 185, 60-89) klo- niert, auf dem sie sich unter Kontrolle des T7-Promotors befindet. Mit diesem Konstrukt wurden E.coli BL21 (DE3) Zellen (Studier und Moffat (1986) , J. Mol. Biol. 189, 113-130) mit pLys S (Dünn und Studier (1983) , J. Mol. Biol. 166, 477-535) transformiert.
Übernachtkulturen plasmidhaltiger Zellen in LB-Medium wurden 1 : 100 verdünnt und bei 3 verschiedenen Wachs- turnstemperaturen (25°C, 30°C und 37°C) angezogen. Bei einem OD600 von 0,7-0,8 erfolgte eine Induktion mit 0,4 mM IPTG, nach der dann weitere 3-4 h bei der entspre¬ chenden Temperatur geschüttelt wurde. Die Ernte der Zel- len erfolgte in allen Kulturen bei einem OD600 von etwa 2,6 mit anschließenden Konzentrierung und Aufschluß durch Ultraschallbehandlung.
Von diesen Zellextrakten wurden die spezifischen Aktivi- täten bestimmt. Bei einer Anzuchttemperatur von 37°C konnte eine spezifische Aktivität von 10 mU/mg, bei 30°C eine spezifische Aktivität von 32 mU/mg und bei 25°C eine spezifische Aktivität von 24 mU/mg erhalten werden. Somit wird bei einer Anzuchttemperatur von 30° , die höchste spezifische Aktivität des Proteins erreicht . Ebenso wird bei dieser Temperatur auch die größte Menge an Enzym produziert (SDS-PAGE) .
Die höchste spezifische Aktivität der GulOx, über die bisher in Publikationen berichtet wurde, beträgt nach mehrstufiger Aufreinigung aus Rattenleber ca. 500- 600 mU/mg. In diesem Fall sollten die bei 30°C erhaltenen Aktivitätswerte von 32 mU/mg einen Anteil von 5-7 % vom Gesamtprotein entsprechen. Dies wurde durch densitome- trische Auswertung von SDS-PA-Gelen bestätigt. Daher kann angenommen werden, daß das im SDS-Gel als Bande sichtbare GulOx-Protein vollständig aktiv ist.
2.3. Optimierung der Expression Bei dem in Beispiel 2.2. beschriebenen Verfahren wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in TE-Puffer
(10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert und nach
Ultraschallaufschluß direkt in den Aktivitätstest bzw. für die SDS-PAGE-Analyse eingesetzt.
Bei einmaligem Waschen der Zellen in TE-Puffer und an¬ schließendem Zentrifugieren wurden Werte für die spezi- fische Enzymaktivität von 50-60 mU/mg erhalten, die um den Faktor 2 höher als die in Beispiel 2.2. angegebenen Werte für die Expression bei 30°C lagen.
Auch bei Waschen der Zellen in 50 mM Kaliumphosphat- Puffer pH 7,0 konnte eine Verbesserung der Enzymaktivität gefunden werden. Durch Zusatz von 1, 7 mM DTT zum Puffer konnte zusätzlich eine minimale Erhöhung (5 %) der spezi¬ fischen Aktivität erreicht werden.
Der durch Ultraschall aufgeschlossene Zellextrakt wurde einer Fällung mit 16 % Ammoniumsulfat unterzogen. Der größte Teil des aktiven Enzyms wurde in der durch Zen¬ trifugation pelletierten Fraktion gefunden. Dabei wurde eine Erhöhung der spezifischen Aktivität auf 120 mU/mg erreicht. Der Anteil von GulOx am Gesamtzellprotein be¬ trug ca. 20-25 %.
2.4. Stabilität der Enzvmaktivität Zur Untersuchung der Stabilität des Enzyms in der Vita- min-C-Synthesereaktion wurde ein Langzeittest durchge¬ führt, bei dem die Enzymreaktion nach unterschiedlich langen Zeiten (zwischen 15 min und 16 h) analysiert wurde. Es sollte dabei festgestellt werden, ob das Enzym über längere Zeit bei 37°C aktiv ist und das Endprodukt Vitamin C produziert.
Hierzu wurden 6 verschiedene Ansätze mit identischen Mengen (ca. 0,15 mU) GulOx enthaltendem Zellextrakt ge- startet. Die nachfolgende Inkubation bei 37°C wurde zu unterschiedlichen Zeiten (15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h und 16 h) gestoppt und das gebildete Vitamin C zum Hydra- zon derivatisiert. Dabei wurde ein lineares Verhältnis zwischen der gebildeten Menge an Vitamin C und der Zeit nur im Bereich zwischen 15 min und 1 h gefunden. Danach nahm die vom Enzym produzierte Menge an Vitamin C langsa- mer zu. Dieser Verlust der Linearität war auf den Ver¬ brauch des Substrats zurückzuführen.
Weiterhin wurde die Stabilität der GulOx bei 37°C unter- sucht. Hierzu wurden in 7 verschiedenen Ansätzen gleiche
Mengen GulOx (ca. 5 mU) bei 37°C unterschiedlich lange
(zwischen 15 min und 16 h) vorinkubiert und anschließend in den standardisierten Aktivitätstest eingesetzt.
Es wurde gefunden, daß nach 1 h Vorinkubation das Enzym noch nahezu 100 % Aktivität besitzt. Danach nahm die spezifische Aktivität ab. Nach 16 h Vorinkubation war noch ca. 40 % der ursprünglichen Aktivität vorhanden.
Durch Zusatz von Detergenzien konnte GulOx von der Mem¬ branfraktion getrennt und somit in Lösung gebracht wer¬ den. Gute Ergebnisse wurden mit einem Solubilisierungs- puffer erzielt, der 100 mM Kaliumphosphat, pH 7,0 bzw. 7,8, 0,4 M Saccharose, 1 mM EDTA und 1 % Triton-XIOO enthielt. Die Enzymausbeute betrug in beiden Fällen ca. 50 % der Ausgangsaktivität. Die Überstände nach der Zen¬ trifugation wurden zur Vitamin-C-Synthese eingesetzt. Das Detergens Triton-XIOO konnte mit Hilfe von Ionenaustau¬ scher- Chromatographie (DEAE-Sepharose fast flow) besei- tigt werden.
2.6. Charakterisierung der rekombinanten GulOx pH-Optimum Für diese Untersuchungen wurden 2 verschiedene Puffersy- steme (Kaliumphosphat und Tris/HCl) ausgewählt. Die Akti¬ vität der GulOx im Tris/HCl-Puffer und im Bereich von pH 7,6-8,2 mit ca. 12,2 mU/ml annähernd auf gleichem Niveau. Höhere Aktivitäten (bis 15,3 mU/ml wurden mit dem Caliumphosphatpuffer erreicht. Dabei steigt die Aktivität durch GulOx mit Erhöhung des pH-Werts deutlich an und erreicht ihr Maximum bei pH 7,8. Enzymstabilität
In TE-Puffer (pH 7,0) waren bei einer Inkubationstempera¬ tur von 5 bzw. 20°C nach 340 bzw. 490 h noch 50 % der Enzymaktivität vorhanden. Im Kaliumphosphatpuffer besaß die GulOx nach ca. 540 h noch 50 % Restaktivität.
Inhibitoren
Verschiedene Stoffe, die als Inhibitoren der GulOx-Akti- vität in Betracht zu ziehen sind, wurden in teilweise unterschiedlichen Konzentrationen zum Standard-Enzymtest zugegeben. Neben dem Konservierungsmittel Natriumazid (0,1 %) und dem Antischaummittel Polypropylenglycol (0,5 %) wurden die Abbauprodukte der Ascorbinsaure L- Threonsäure (2 bzw. 10 mM) und Oxalsäure (2 bzw. 10 mM) sowie L-Gulonsäure (1 bzw. 10 mM) , die bei Hydrolyse von L-Gulono-lacton entstehen kann, zugesetzt.
Keine dieser Substanzen hatte eine deutliche Hemmwirkung. Lediglich die Zugabe von 10 mM Oxalsäure senkte die En- zymaktivität um ca. 10 %.
Beispiel 3
Kopplung der Enzyme Uronat-Reduktase und L-Gulono-γ-lacton- Oxidase
3.1. Direkte Kopplung der Enzyme UDH/GDH und GulOx
Die Versuche wurden in 100 mM Kaliumphosphat von pH 7,0 unter Zusatz von 1,7 mM DTT und 50 mM Na-Citrat durchge- führt. Die Ansätze enthielten je 7,5 mM Glucose und D- Glucuronsäure bzw. D-Glucurono-γ-lacton, 280 mU UDH, 825 mU GDH und 0,75 mM NADP. Nach Zugabe von 3 mU GulOx (unbehandelter Rohextrakt) wurden die Ansätze für 2 h bei 37°C inkubiert. Bei Verwendung von D-Glucorono-γ-lacton als Substrat konnte im Ansatz L-Ascorbinsäure nachgewie¬ sen werden. 3.2. Indirekte Kopplung (mit Lactonisierung)
Ein gemäß Beispiel 1.7. lactonisierter Reaktionsansatz wurde in den GulOx-Standardtest (Methoden) eingesetzt. Es wurde die gleiche Enzymaktivität, wie bei Zugabe von reinem Substrat gemessen. Demnach ist ein lactonisierter UDH/GDH-Ansatz ebenso gut für die Ascorbinsäureproduktion geeignet wie eine frisch hergestellte Substratlösung von käuflichem L-Gulono-γ-lacton. Die GulOx wird durch die Komponenten im Reaktionsansatz nicht gehemmt. Die Ascor- bat-Konzentration war höher als im Verfahren mit der direkten Kopplung (Beispiel 3.1.) .
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(l) ANMELDER:
(A) NAME: Herbstreith & Fox KG Pektin-Fabrik
Neuenbuerg
(B) STRASSE: Turnstrasse 37 (C) ORT: Neuenbuerg
(E) LAND: DE
(F) POSTLEITZAHL: 75305
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Herstellung von L-Ascorbinsaeure
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 10
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG: (A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30
(EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 939 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE:1..936
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
ATG CCT GCT ACT TTA CAT GAT TCT ACG AAA ATC CTT TCT CTA AAT ACT 48
Met Pro Ala Thr Leu His Asp Ser Thr Lys Ile Leu Ser Leu Asn Thr 1 5 10 15
GGA GCC CAA ATC CCT CAA ATA GGT TTA GGT ACG TGG CAG TCG AAA GAG 96
Gly Ala Gin Ile Pro Gin Ile Gly Leu Gly Thr Trp Gin Ser Lys Glu
20 25 30
AAC GAT GCT TAT AAG GCT GTT TTA ACC GCT TTG AAA GAT GGC TAC CGA 144
Asn Asp Ala Tyr Lys Ala Val Leu Thr Ala Leu Lys Asp Gly Tyr Arg
35 40 45 CAC ATT GAT ACT GCT GCT ATT TAC CGT AAT GAA GAC CAA GTC GGT CAA 192
Hxs Ile Asp Thr Ala Ala Ile Tyr Arg Asn Glu Asp Gin Val Gly Gin
50 55 60 GCC ATC AAG GAT TCA GGT GTT CCT CGG GAA GAA ATC TTT GTT ACT ACA 240 Ala Ile Lys Asp Ser Gly Val Pro Arg Glu Glu Ile Phe Val Thr Thr 65 70 75 80 AAG TTA TGG TGT ACA CAA CAC CAC GAA CCT GAA GTA GCG CTG GAT CAA 288 Lys Leu Trp Cys Thr Gin His His Glu Pro Glu Val Ala Leu Asp Gin 85 90 95
TCA CTA AAG AGG TTA GGA TTG GAC TAC GTA GAC TTA TAT TTG ATG CAT 336 Ser Leu Lys Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Met His 100 105 110
TGG CCT GCC AGA TTA GAT CCA GCC TAC ATC AAA AAT GAA GAC ATC TTG 384 Trp Pro Ala Arg Leu Asp Pro Ala Tyr Ile Lys Asn Glu Asp Ile Leu 115 120 125
AGT GTG CCA ACA AAG AAG GAT GGT TCT CGT GCA GTG GAT ATC ACC AAT 432 Ser Val Pro Thr Lys Lys Asp Gly Ser Arg Ala Val Asp Ile Thr Asn 130 135 140
TGG AAT TTC ATC AAA ACC TGG GAA TTA ATG CAG GAA CTA CCA AAG ACT 480 Trp Asn Phe Ile Lys Thr Trp Glu Leu Met Gin Glu Leu Pro Lys Thr 145 150 155 160 GGT AAA ACT AAG GCC GTT GGA GTC TCC AAC TTT TCT ATA AAT AAC CTG 528 Gly Lys Thr Lys Ala Val Gly Val Ser Asn Phe Ser Ile Asn Asn Leu 165 170 175
AAA GAT CTA TTA GCA TCT CAA GGT AAT AAG CTT ACG CCA GCT GCT AAC 576 Lys Asp Leu Leu Ala Ser Gin Gly Asn Lys Leu Thr Pro Ala Ala Asn 180 185 190
CAA GTC GAA ATA CAT CCA TTA CTA CCT CAA GAC GAA TTG ATT AAT TTT 624 Gin Val Glu Ile His Pro Leu Leu Pro Gin Asp Glu Leu Ile Asn Phe 195 200 205
TGT AAA AGT AAA GGC ATT GTG GTT GAA GCT TAT TCT CCG TTA GGT AGT 672 Cys Lys Ser Lys Gly Ile Val Val Glu Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Ser 210 215 220
ACC GAT GCT CCA CTA TTG AAG GAA CCG GTT ATC CTT GAA ATT GCG AAG 720 Thr Asp Ala Pro Leu Leu Lys Glu Pro Val Ile Leu Glu Ile Ala Lys 225 230 235 240 AAA AAT AAC GTT CAA CCC GGA CAC GTT GTT ATT AGC TGG CAC GTC CAA 768 Lys Asn Asn Val Gin Pro Gly His Val Val Ile Ser Trp His Val Gin 245 250 255
AGA GGT TAT GTT GTC TTG CCA AAA TCT GTG AAT CCC GAT CGA ATC AAA 816 Arg Gly Tyr Val Val Leu Pro Lys Ser Val Asn Pro Asp Arg Ile Lys 260 265 270
ACG AAC AGG AAA ATA TTT ACT TTG TCT ACT GAG GAC TTT GAA GCT ATC 864 Thr Asn Arg Lys Ile Phe Thr Leu Ser Thr Glu Asp Phe Glu Ala Ile 275 280 285
AAT AAC ATA TCG AAG GAA AAG GGC GAA AAA AGG GTT GTA CAT CCA AAT 912 Asn Asn Ile Ser Lys Glu Lys Gly Glu Lys Arg Val Val His Pro Asn 290 295 300
TGG TCT CCT TTC GAA GTA TTC AAG TAA 939 Trp Ser Pro Phe Glu Val Phe Lys 305 310 ( 2 ) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 2 :
( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE : 312 Aminosäuren
(B ) ART : Aminosäure (D) TOPOLOGIE : l inear
( i i ) ART DES MOLEKÜLS : Protein
(xi ) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 2 : Met Pro Ala Thr Leu His Asp Ser Thr Lys Ile Leu Ser Leu Asn Thr 1 5 10 15
Gly Ala Gin Ile Pro Gin Ile Gly Leu Gly Thr Trp Gin Ser Lys Glu 20 25 30
Asn Asp Ala Tyr Lys Ala Val Leu Thr Ala Leu Lys Asp Gly Tyr Arg 35 40 45
His Ile Asp Thr Ala Ala Ile Tyr Arg Asn Glu Asp Gin Val Gly Gin 50 55 60
Ala Ile Lys Asp Ser Gly Val Pro Arg Glu Glu Ile Phe Val Thr Thr 65 70 75 80 Lys Leu Trp Cys Thr Gin His His Glu Pro Glu Val Ala Leu Asp Gin
85 90 95
Ser Leu Lys Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Met His 100 105 110
Trp Pro Ala Arg Leu Asp Pro Ala Tyr Ile Lys Asn Glu Asp Ile Leu 115 120 125
Ser Val Pro Thr Lys Lys Asp Gly Ser Arg Ala Val Asp Ile Thr Asn 130 135 140
Trp Asn Phe Ile Lys Thr Trp Glu Leu Met Gin Glu Leu Pro Lys Thr 145 150 155 160 Gly Lys Thr Lys Ala Val Gly Val Ser Asn Phe Ser Ile Asn Asn Leu
165 170 175
Lys Asp Leu Leu Ala Ser Gin Gly Asn Lys Leu Thr Pro Ala Ala Asn 180 185 190
Gin Val Glu Ile His Pro Leu Leu Pro Gin Asp Glu Leu Ile Asn Phe 195 200 205
Cys Lys Ser Lys Gly Ile Val Val Glu Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Ser 210 215 220
Thr Asp Ala Pro Leu Leu Lys Glu Pro Val Ile Leu Glu Ile Ala Lys 225 230 235 240 Lys Asn Asn Val Gin Pro Gly His Val Val Ile Ser Trp His Val Gin
245 250 255
Arg Gly Tyr Val Val Leu Pro Lys Ser Val Asn Pro Asp Arg Ile Lys 260 265 270 Thr Asn Arg Lys Ile Phe Thr Leu Ser Thr Glu Asp Phe Glu Ala Ile 275 280 285
Asn Asn Ile Ser Lys Glu Lys Gly Glu Lys Arg Val Val His Pro Asn 290 295 300
Trp Ser Pro Phe Glu Val Phe Lys 305 310
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 1323 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: DoppelStrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE:1..1320
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3
ATG GTC CAT GGG TAC AAA GGG GTC CAG TTC CAA AAT TGG GCA AAG ACC 48 Met Val His Gly Tyr Lys Gly Val Gin Phe Gin Asn Trp Ala Lys Thr 315 320 325
TAT GGT TGC AGT CCA GAG GTG TAC TAC CAG CCC ACC TCC GTG GAG GAG 96 Tyr Gly Cys Ser Pro Glu Val Tyr Tyr Gin Pro Thr Ser Val Glu Glu 330 335 340
GTC AGA GAG GTG CTG GCC CTG GCC CGG GAG CAG AAG AAG AAA GTG AAG 144
Val Arg Glu Val Leu Ala Leu Ala Arg Glu Gin Lys Lys Lys Val Lys 345 350 355 360 GTG GTG GGT GGT GGC CAC TCG CCT TCA GAC ATT GCC TGC ACT GAC GGT 192 Val Val Gly Gly Gly His Ser Pro Ser Asp Ile Ala Cys Thr Asp Gly 365 370 375
TTC ATG ATC CAC ATG GGC AAG ATG AAC CGG GTT CTC CAG GTG GAC AAG 240 Phe Met Ile His Met Gly Lys Met Asn Arg Val Leu Gin Val Asp Lys 380 385 390
GAG AAG AAG CAG GTA ACA GTG GAA GCC GGT ATC CTC CTG GCT GAC CTG 288 Glu Lys Lys Gin Val Thr Val Glu Ala Gly Ile Leu Leu Ala Asp Leu 395 400 405
CAC CCA CAG CTG GAT GAG CAT GGC CTG GCC ATG TCC AAT CTG GGA GCA 336
His Pro Gin Leu Asp Glu His Gly Leu Ala Met Ser Asn Leu Gly Ala
410 415 420
GTG TCT GAT GTG ACA GTT GCT GGT GTC ATT GGA TCC GGA ACA CAT AAC 384
Val Ser Asp Val Thr Val Ala Gly Val Ile Gly Ser Gly Thr His Asn
425 430 435 440 ACA GGG ATC AAG CAC GGC ATC CTG GCC ACT CAG GTG GTG GCC CTG ACC 432 Thr Gly Ile Lys His Gly Ile Leu Ala Thr Gin Val Val Ala Leu Thr 445 450 455 CTG ATG ACA GCT GAT GGA GAA GTT CTG GAA TGT TCT GAG TCA AGA AAT 480
Leu Met Thr Ala Asp Gly Glu Val Leu Glu Cys Ser Glu Ser Arg Asn
460 465 470
5 GCA GAT GTG TTC CAG GCT GCA CGG GTG CAC CTG GGT TGC CTG GGC ATC 528
Ala Asp Val Phe Gin Ala Ala Arg Val His Leu Gly Cys Leu Gly Ile
475 480 485
ATC CTC ACC GTC ACC CTG CAG TGT GTG CCT CAG TTT CAC CTT CAG GAG 576 io Ile Leu Thr Val Thr Leu Gin Cys Val Pro Gin Phe His Leu Gin Glu
490 495 500
ACA TCC TTC CCT TCG ACC CTC AAA GAG GTC CTT GAC AAC CTA GAC AGC 624
Thr Ser Phe Pro Ser Thr Leu Lys Glu Val Leu Asp Asn Leu Asp Ser
15 505 510 515 520
CAC CTG AAG AGG TCT GAG TAC TTC CGC TTC CTC TGG TTT CCT CAC ACT 672
His Leu Lys Arg Ser Glu Tyr Phe Arg Phe Leu Trp Phe Pro His Thr
525 530 535
20
GAG AAC GTC AGC ATC ATC TAC CAA GAC CAC ACC AAC AAG GCC CCC TCC 720
Glu Asn Val Ser Ile Ile Tyr Gin Asp His Thr Asn Lys Ala Pro Ser
540 545 550
25 TCT GCA TCT AAC TGG TTT TGG GAC TAT GCC ATC GGG TTC TAC CTA CTG 768
Ser Ala Ser Asn Trp Phe Trp Asp Tyr Ala Ile Gly Phe Tyr Leu Leu
555 560 565
GAG TTC TTG CTC TGG ACC AGC ACC TAC CTG CCA TGC CTC GTG GGC TGG 816
30 Glu Phe Leu Leu Trp Thr Ser Thr Tyr Leu Pro Cys Leu Val Gly Trp
570 575 580
ATC AAC CGC TTC TTC TTC TGG ATG CTG TTC AAC TGC AAG AAG GAG AGC 864
Ile Asn Arg Phe Phe Phe Trp Met Leu Phe Asn Cys Lys Lys Glu Ser
35 585 590 595 600
AGC AAC CTC AGT CAC AAG ATC TTC ACC TAC GAG TGT CGC TTC AAG CAG 912
Ser Asn Leu Ser His Lys Ile Phe Thr Tyr Glu Cys Arg Phe Lys Gin
605 610 615
40
CAT GTA CAA GAC TGG GCC ATC CCT AGG GAG AAG ACC AAG GAG GCC CTA 960
His Val Gin Asp Trp Ala Ile Pro Arg Glu Lys Thr Lys Glu Ala Leu
620 625 630
45 CTG GAG CTA AAG GCC ATG CTG GAG GCC CAC CCC AAA GTG GTA GCC CAC 1008
Leu Glu Leu Lys Ala Met Leu Glu Ala His Pro Lys Val Val Ala His
635 640 645
TAC CCC GTA GAG GTG CGC TTC ACC CGA GGC GAT GAC ATT CTG CTG AGC 1056 so Tyr Pro Val Glu Val Arg Phe Thr Arg Gly Asp Asp Ile Leu Leu Ser
650 655 660
CCC TGC TTC CAG AGG GAC AGC TGC TAC ATG AAC ATC ATT ATG TAC AGG 1104
Pro Cys Phe Gin Arg Asp Ser Cys Tyr Met Asn Ile Ile Met Tyr Arg
55 665 670 675 680
CCC TAT GGA AAG GAC GTG CCT CGG CTA GAC TAC TGG CTG GCC TAT GAG 1152
Pro Tyr Gly Lys Asp Val Pro Arg Leu Asp Tyr Trp Leu Ala Tyr Glu
685 690 695
60
ACC ATC ATG AAG AAG TTT GGA GGA AGA CCC CAC TGG GCA AAG GCC CAC 1200
Thr Ile Met Lys Lys Phe Gly Gly Arg Pro His Trp Ala Lys Ala His
700 705 710
65 AAT TGC ACC CAG AAG GAC TTT GAG GAA ATG TAC CCC ACC TTT CAC AAG 1248
Asn Cye Thr Gin Lys Asp Phe Glu Glu Met Tyr Pro Thr Phe His Lys 715 720 725
TTC TGT GAC ATC CGT GAG AAG CTG GAC CCC ACT GGA ATG TTC TTG AAT 1296
Phe Cys Asp Ile Arg Glu Lys Leu Asp Pro Thr Gly Met Phe Leu Asn 730 735 740
TCG TAC CTG GAG AAA GTC TTC TAC TAA 1323
Ser Tyr Leu Glu Lys Val Phe Tyr 745 750
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 440 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
( ii ) ART DES MOLEKÜLS : Protein
(xi ) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 4 :
Met Val His Gly Tyr Lys Gly Val Gin Phe Gin Asn Trp Ala Lys Thr 1 5 10 15
Tyr Gly Cys Ser Pro Glu Val Tyr Tyr Gin Pro Thr Ser Val Glu Glu 20 25 30
Val Arg Glu Val Leu Ala Leu Ala Arg Glu Gin Lys Lys Lys Val Lys 35 40 45 Val Val Gly Gly Gly His Ser Pro Ser Asp Ile Ala Cys Thr Asp Gly 50 55 60
Phe Met Ile His Met Gly Lys Met Asn Arg Val Leu Gin Val Asp Lys 65 70 75 80
Glu Lys Lys Gin Val Thr Val Glu Ala Gly Ile Leu Leu Ala Asp Leu 85 90 95
His Pro Gin Leu Asp Glu His Gly Leu Ala Met Ser Asn Leu Gly Ala 100 105 110
Val Ser Asp Val Thr Val Ala Gly Val Ile Gly Ser Gly Thr His Asn 115 120 125 Thr Gly Ile' Lys His Gly Ile Leu Ala Thr Gin Val Val Ala Leu Thr 130 135 140
Leu Met Thr Ala Asp Gly Glu Val Leu Glu Cys Ser Glu Ser Arg Asn 145 150 155 160
Ala Asp Val Phe Gin Ala Ala Arg Val His Leu Gly Cys Leu Gly Ile 165 170 175
Ile Leu Thr Val Thr Leu Gin Cys Val Pro Gin Phe His Leu Gin Glu 180 185 190
Thr Ser Phe Pro Ser Thr Leu Lys Glu Val Leu Asp Asn Leu Asp Ser 195 200 205 His Leu Lys Arg Ser Glu Tyr Phe Arg Phe Leu Trp Phe Pro His Thr 210 215 220
Glu Asn Val Ser Ile Ile Tyr Gin Asp His Thr Asn Lys Ala Pro Ser 5 225 230 235 240
Ser Ala Ser Asn Trp Phe Trp Asp Tyr Ala Ile Gly Phe Tyr Leu Leu 245 250 255 io Glu Phe Leu Leu Trp Thr Ser Thr Tyr Leu Pro Cys Leu Val Gly Trp 260 265 270
Ile Asn Arg Phe Phe Phe Trp Met Leu Phe Asn Cys Lys Lys Glu Ser 275 280 285
15
Ser Asn Leu Ser His Lys Ile Phe Thr Tyr Glu Cys Arg Phe Lys Gin 290 295 300
His Val Gin Asp Trp Ala Ile Pro Arg Glu Lys Thr Lys Glu Ala Leu 20 305 310 315 320
Leu Glu Leu Lys Ala Met Leu Glu Ala His Pro Lys Val Val Ala His 325 330 335
25 Tyr Pro Val Glu Val Arg Phe Thr Arg Gly Asp Asp Ile Leu Leu Ser 340 345 350
Pro Cys Phe Gin Arg Asp Ser Cys Tyr Met Asn Ile Ile Met Tyr Arg 355 360 365
30
Pro Tyr Gly Lys Asp Val Pro Arg Leu Asp Tyr Trp Leu Ala Tyr Glu 370 375 380
Thr Ile Met Lys Lys Phe Gly Gly Arg Pro His Trp Ala Lys Ala His 35 385 390 395 400
Asn Cys Thr Gin Lys Asp Phe Glu Glu Met Tyr Pro Thr Phe His Lys 405 410 415
40 Phe Cys Asp Ile Arg Glu Lys Leu Asp Pro Thr Gly Met Phe Leu Asn 420 425 430
Ser Tyr Leu Glu Lys Val Phe Tyr 435 440
45
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
so (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
55
( xi ) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 5 Asp Leu Tyr Leu Met His
60 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
Gly Val Ser Asn Phe 1 5
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Ein^elstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 7:
GAYTTRTAYT TRATGCA 17
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 8:
(i) SEQUENZ KENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8: AARTTKAAKA CKCC 14
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9: GCGAATTCTT ATGGTCCATG CCTACAAACC G 31
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10: GCAAGCTTCC TGCTTTAGTA GAAGACTTT 29

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer DNA-Sequenz, die für ein Protein mit s einer Uronat-Reduktase-Aktivität codiert und
(a) die in SEQ ID No. 1 gezeigte Nukleotidsequenz,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degenera¬ tion des genetischen Codes entsprechende Nukleo¬ tidsequenz oder o (c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybri¬ disierende Nukleotidsequenz umfaßt, zur Herstel¬ lung eines Enzyms für die Synthese von L-Ascorbin¬ säure.
5 2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine Homologie von mindestens 70 % zu der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleotidsequenz auf¬ weist . 0
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz auf einem Vektor lokalisiert ist.
5 4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein prokaryontischer Vektor ist.
5. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4 , 0 dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz unter Kontrolle eines regulierbaren Expressionssignals ist.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-5, 5 dadurch gekennzeichnet, daß eine rekombinante Zelle mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 oder einem Vektor nach einem der An¬ sprüche 3-5 transformiert wird.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine E.coli Zelle ist.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zelle mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 oder einem diese DNA-Sequenz enthaltenden Vektor transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingun¬ gen kultiviert, bei denen eine Expression der DNA-Se- quenz erfolgt und das Expressionsprodukt aus der Zelle oder dem Kulturmedium gewinnt.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Expressionsprodukt in Form eines Zellex¬ trakts gewinnt.
10. Verwendung eines Proteins mit einer Uronat-Reduktase- Aktivität, das von einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 codiert ist als Enzym in einem Verfahren zur Her¬ stellung von L-Ascorbinsäure.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein
(a) die in SEQ ID No. 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder
(b) eine zur Sequenz aus (a) mindestens 80 % homologe Aminosäuresequenz umfaßt.
12. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Protein in isolierter Form oder einen das Protein enthaltenden Zellextrakt einsetzt.
13. Verwendung nach nach einem der Ansprüche 10-12, s dadurch gekennzeichnet, daß man eine ein Coenzym enthaltende Substratlösung mit UDH in Kontakt bringt und die gebildete L-Gulonsäure bzw. L-Galactonsäure zu L-Ascorbinsäure weiterreagieren läßt.
10
14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat D-Glucuronsäure bzw. D-Galacturon¬ säure oder deren Lactone einsetzt.
15
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-14, dadurch gekennzeichnet, daß NADPH oder/und NADH als Coenzym einsetzt.
20 16. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Gegenwart eines Systems zur Co¬ enzymregenerierung, insbesondere in Gegenwart von Glu- cose-Dehydrogenase, durchführt.
25
17. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-16, dadurch gekennzeichnet, daß man das Coenzym in einer Ausgangskonzentration von 0,05-0,5 mM, insbesondere von 0,08-0,25 mM einsetzt.
30
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-17, dadurch gekennzeichnet, daß man das Coenzym während der Reaktion nachdosiert.
35 19. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Gegenwart eines Sulfhydrylrea¬ genz, insbesondere Dithiothreitol oder Dithioerythritol , durchführt .
5 20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man das Sulfhydrylreagenz während der Reaktion nach¬ dosiert .
io 21. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Gegenwart eines Komplexierungs¬ mittels, insbesondere EDTA, durchführt.
15 22. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-21, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren zur Synthese von L-Ascorbinsäure kontinuierlich in einem oder mehreren Enzymreaktoren durchführt, an deren Ausströmöffnungen vorzugsweise ge-
20 ladene Ultrafiltrationsmembranen vorgesehen sein können.
23. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-22, dadurch gekennzeichnet, daß man die gebildete L-Gulonsäure bzw. L-Galactonsäure 25 in das entsprechende Lacton überführt .
24. Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Lactonbildung durch Ansäuern und Erhitzen 30 oder/und durch Inkubation mit einer Lactonase erfolgt.
25. Enzymreaktor, umfassend
(a) ein Protein mit Uronat-Reduktase-Aktivität,
(b) ein Coenzym ausgewählt aus NADH oder/und NADPH, 35 (c) mindestens eine Einströmöffnung zur Zufuhr von
Substrat, (d) mindestens eine Ausströmöffnung zur Entnahme von Produkt, und
(e) gegebenenfalls ein Enzym zur Coenzymregenerierung.
5 26. Enzymreaktor nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß an der Ausströmöffnung eine vorzugsweise geladene Membran vorgesehen ist, die den Durchtritt von Produkt und Rückhaltung von Enzymen und Coenzymen gestattet .
10
27. DNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer Uronat-Reduk¬ tase-Aktivität codiert und eine mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz oder einer dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden is Sequenz hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein Protein codiert, das sich von der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäuresequenz um mindestens eine Aminosäure unterscheidet.
20
28. Protein mit Uronat-Reduktase-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß von einer DNA-Sequenz nach Anspruch 27 codiert ist.
25 29. Protein nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß es eine zu der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäure¬ sequenz mindestens 80 %ige Homologie aufweist.
30 30. Protein nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß es für NADH als Coenzym eine höhere maximale Umsatz- geschwindigkeit oder/und einen geringeren K„-Wert als das Protein mit der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäu-
35 resequenz besitzt.
31. Protein nach einem der Ansprüche 28-30, dadurch gekennzeichnet, daß es sich von der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäu¬ resequenz unterscheidet durch: (a) einen Austausch von Arg (57) durch Glu,
(b) einen Austausch von Tyr (47) durch Glu oder/und
(c) einen Austausch von Gin (29) durch Gly.
32. Prokaryontische Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie in der Lage ist, eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität codiert und
(a) die in SEQ ID No. 3 gezeigte Nukleotidsequenz, (b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degene¬ ration des genetischen Codes entsprechende Nu¬ kleotidsequenz oder (c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt, zur Expression zu bringen.
33. Zelle nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine E.coli Zelle ist.
34. Zelle nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz unter Kontrolle eines regulierbaren Expressionssignals ist.
35. Zelle nach einem der Ansprüche 32-34, dadurch gekennzeichnet, daß sie bei Expression der DNA-Sequenz einen Zellextrakt mit einer spezifischen GulOx-Aktivität von ≥ 5 mU/mg ergibt.
36. Zelle nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische GulOx-Aktivität im Zellextrakt im Bereich von 10-200 mU/mg liegt.
37. Unglykosiliertes Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase- Aktivität aus Prokaryonten, das codiert ist von einer DNA-Sequenz, welche
(a) die in SEQ ID No. 3 gezeigte Nukleotidsequenz, (b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degenera¬ tion des genetischen Codes entsprechende Nukleo¬ tidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybri¬ disierende Nukleotidsequenz umfaßt.
38. Unglykosiliertes Protein nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß es
(a) die in SEQ ID No. 4 gezeigte Aminosäuresequenz oder
(b) eine zur Sequenz aus (a) mindestens 80 % homologe Aminosäuresequenz umfaßt.
39. Verfahren zur Gewinnung eines Proteins nach Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, daß man eine prokaryontische Zelle mit (i) einer DNA-Sequenz, die für ein Protein mit einer L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität codiert und (b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degene¬ ration des genetischen Codes entsprechende Nu¬ kleotidsequenz oder (c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt, oder (ii) einen rekombinanten Vektor, der mindestens eine
Kopie einer DNA-Sequenz aus (a) , (b) oder/und (c) enthält, transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingun¬ gen kultiviert, bei denen eine Expression der DNA-Se¬ quenz erfolgt und das Expressionsprodukt aus der Zelle oder dem Kulturmedium gewinnt.
5
40. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß man eine E.coli Zelle verwendet.
io 41. Verfahren nach Anspruch 39 oder 40, dadurch gekennzeichnet, daß man das Expressionsprodukt aus dem Zellextrakt ge¬ winnt.
is 42. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß der Zellextrakt eine spezifische GulOx-Aktivität von ≥ 5 mU/mg aufweist.
20 43. Verwendung eines Proteins nach Anspruch 37 oder 38 oder eines nach einem der Ansprüche 39-42 hergestellten Pro¬ teins oder eines das Protein enthaltenden Zellextrakts in einem Verfahren zur Synthese von L-Ascorbinsäure.
25 44. Verwendung nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß man eine 02 enthaltende Substratlösung mit GulOx in Kontakt bringt und die gebildete L-Ascorbinsäure ge¬ winnt.
30 45. Verwendung nach Anspruch 43 oder 44, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat L-Gulono-γ-lacton oder/und L-Galac¬ tono-γ-lacton einsetzt.
3s 46. Verwendung nach einem der Ansprüche 43-45, dadurch gekennzeichnet, daß eine immobilisierte GulOx einsetzt.
47. Verwendung nach einem der Ansprüche 43-46, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion bei pH 6-8 durchführt.
5 48. Verwendung nach einem der Ansprüche 43-47, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Gegenwart eines Sulfhydrylrea¬ genz, insbesondere Dithiothreitol oder Dithioerythritol, durchführt.
10
49. Verwendung nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß man das Sulfhydrylreagenz während der Reaktion nach¬ dosiert.
15
50. Verwendung nach einem der Ansprüche 43-49, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Gegenwart von Katalase durch¬ führt.
20
51. Verwendung nach einem der Ansprüche 43-50, dadurch gekennzeichnet, daß man das Substrat in einer Konzentration von 1- 500 mM, insbesondere von 20-250 mM einsetzt.
25
52. Verwendung nach einem der Ansprüche 43-51, dadurch gekennzeichnet, daß man die gebildete L-Ascorbinsäure durch Ansäuern, insbesondere auf einen pH-Wert ≤ 5, stabilisiert.
30
53. Verwendung nach einem der Ansprüche 43-52, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren kontinuierlich durchführt.
35 54. Enzymreaktor, umfassend
(a) ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivi- tat, (b) Sauerstoff als Cosubstrat ,
(c) mindestens eine Einströmöffnung zur Zufuhr von Substrat, und
(d) mindestens eine Ausströmöffnung zur Entnahme von Produkt .
55. Verfahren zur Synthese von L-Ascorbinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) D-Glucuronsäure-γ-lacton oder/und D-Galacturonsäu- re-γ-lacton durch ein Protein mit Uronat-Reduk¬ tase-Aktivität zu L-Gulono-γ-lacton oder/und L-Ga¬ lactono-γ-lacton überführt und (b) die in Schritt (a) gebildeten Produkte durch ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität direkt in L-Ascorbinsäure überführt.
56. Verfahren zur Synthese von L-Ascorbinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) D-Glucuronsäure oder/und D-Galacturonsäure durch ein Protein mit Uronat-Reduktase-Aktivität zu L- Gulonsäure oder/und L-Galactonsäure überführt,
(b) die in Schritt (a) gebildeten Produkte durch Lac- tonisierung in L-Gulono-γ-lacton oder/und L-Galac¬ tono-γ-lacton überführt und
(c) die in Schritt (b) gebildeten Produkte durch ein Protein mit L-Gulono-γ-lacton-Oxidase-Aktivität in L-Ascorbinsäure überführt .
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