EP1240336A2 - Enzyme und gene für die herstellung von vanillin - Google Patents

Enzyme und gene für die herstellung von vanillin

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Publication number
EP1240336A2
EP1240336A2 EP00993419A EP00993419A EP1240336A2 EP 1240336 A2 EP1240336 A2 EP 1240336A2 EP 00993419 A EP00993419 A EP 00993419A EP 00993419 A EP00993419 A EP 00993419A EP 1240336 A2 EP1240336 A2 EP 1240336A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
enzymes
host cell
dna
coa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00993419A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen Rabenhorst
Alexander Steinbüchel
Horst Priefert
Sandra Achterholt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Symrise AG
Original Assignee
Haarmann and Reimer GmbH
Symrise AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Haarmann and Reimer GmbH, Symrise AG filed Critical Haarmann and Reimer GmbH
Publication of EP1240336A2 publication Critical patent/EP1240336A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group

Definitions

  • the present invention relates to enzymes for the production of vanillin from ferulic acid, their use in the production of vanillin, DNA coding for these enzymes and host cells transformed with this DNA.
  • EP A 0 583 687 describes the preparation of substituted methoxyphenols using a new Pseudomonas sp. described.
  • the starting material here is eugenol and the end products obtained are ferulic acid, vanillic acid, coniferyl alcohol and
  • Pseudomonas fluorescens are described in WO 97/35999, J. Biol. Chem. 273: 4163-4170 and Microbiology 144: 1397-1405.
  • Enzymes from Amycolatopsis sp. HR167 found for the synthesis of vanillin from ferulic acid.
  • the enzymes were isolated and characterized.
  • Enzymes according to the invention are those which exercise at least the activity of a feruloyl-CoA synthetase and comprise an amino acid sequence which particularly preferably has at least 70% identity, preferably 80% identity
  • the degree of identity of the amino acid sequences is preferably determined with the aid of the program GAP from the program package GCG, version 9.1 under standard settings (Nucleic Acids Research 12, 387 (1984).
  • the term "enzymes” as used herein refers to proteins that are characterized by the functionality described above. It encompasses amino acid chains, which can either be modified by natural processes, such as post-translational processing, or by chemical processes known per se. Such modifications can be made in different places and several times in one
  • Polypeptide occur, such as on the peptide backbone, on the amino acid side chain, at the amino and or at the carboxy terminus. They include, for example, acetylations, acylations, ADP ribosylations, amidations, covalent linkages with flavins, heme moieties, nucleotides or nucleotide derivatives, lipids or lipid derivatives or phosphatidylinositol, cyclizations,
  • the enzymes according to the invention can be in the form of "mature” proteins or as parts of larger proteins, e.g. as fusion proteins. Furthermore, they can have secreting or “leader” sequences, pro-sequences, sequences which enable simple purification, such as multiple histidine residues, or additional stabilizing amino acids.
  • Enzymes which, compared to the feruloyl-CoA synthetase and the enoyl-CoA hydratase / aldolase, which consist of the enzymes according to the invention with an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, are 50% higher or exercise reduced activity are still considered to be according to the invention.
  • the enzymes according to the invention can have deletions or amino acid substitutions in comparison to the corresponding region of naturally occurring feruloyl-CoA synthetases and the enoyl-CoA hydrates / aldolases, as long as they exert at least one biological activity of the complete enzymes.
  • Conservative substitutions are preferred. Such conservative substitutions include variations in which one amino acid is replaced by another amino acid from the following group:
  • Aromatic residues Phe, Tyr and Tip.
  • the present invention also relates to nucleic acids which code for the enzymes according to the invention.
  • the nucleic acids according to the invention are in particular single-stranded or double-stranded deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA).
  • DNA deoxyribonucleic acids
  • RNA ribonucleic acids
  • Preferred embodiments are fragments of genomic DNA, which may contain introns, and cDNAs.
  • Preferred embodiments of the nucleic acids according to the invention are cDNAs which have a nucleotide acid sequence according to SEQ ID NO 1.
  • Nucleic acids which hybridize to the sequences according to SEQ ID NO: 1 under stringent conditions are also encompassed by the present invention.
  • hybridize describes the process in which a single-stranded nucleic acid molecule with a complementary strand undergoes base pairing.
  • DNA fragments for example, can be isolated from other organisms which code for enzymes with the activity of feruloyl-CoA synthetases and / or enoyl-CoA hydratases / aldolases.
  • the present invention furthermore encompasses nucleic acids which have at least 70% identity, preferably 80% identity, particularly preferably 90% identity, very particularly preferably 95% identity, with a sequence according to SEQ ID NO: 1 over a length of at least 20, preferably at least 25, particularly preferably at least 30 consecutive nucleotides and very particularly preferably over their entire lengths.
  • the degree of identity of the nucleic acid sequences is preferably determined with the aid of the GAP program from the GCG program package, version 9.1 under standard settings (Nucleic Acids Research 12, 387 (1984).
  • the present invention furthermore relates to DNA constructs which comprise a nucleic acid according to the invention and a heterologous promoter.
  • heterologous promoter refers to a promoter which has different properties than the promoter which is used in the
  • promoter as used herein generally refers to expression control sequences.
  • heterologous promoters depends on whether pro- or eukaryotic cells or cell-free systems are used for expression.
  • heterologous promoters are the lac system, the trp system, the main operator and promoter regions of phage lambda, the control regions of the fd coat protein, the promoter of 3-phosphoglycerate kinase, the early or late promoter of SV40, the adenovirus or of the cytomegalovirus, the promoter of the acid phosphatase and the promoter of the ⁇ -mating factor of the yeast.
  • the invention furthermore relates to vectors which contain a nucleic acid according to the invention or a DNA construct according to the invention. All plasmids, phasmids, used in molecular biological laboratories can be used as vectors.
  • Cosmids YACs or artificial chromosomes can be used.
  • the present invention also relates to host cells which contain a nucleic acid according to the invention, a DNA construct according to the invention or a vector according to the invention.
  • host cell refers to cells which do not naturally contain the nucleic acids according to the invention.
  • prokaryotic cells such as bacteria of the genera Bacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Streptomyces, are suitable as host cells.
  • Streptococcus Staphylococcus, preferably E. coli, as well as eukaryotic cells, such as yeasts of the genera Saccharomyces, Candida, Pichia, filamentous fungi of the genera Aspergillus, Penicillium, or plant cells or whole plants of various genera, such as Nicotiana, Solanum, Brassica, Beta, Capsicum and vanilla.
  • yeasts of the genera Saccharomyces, Candida, Pichia, filamentous fungi of the genera Aspergillus, Penicillium, or plant cells or whole plants of various genera, such as Nicotiana, Solanum, Brassica, Beta, Capsicum and vanilla.
  • the present invention furthermore relates to processes for producing the enzymes according to the invention.
  • host cells which contain one of the nucleic acids according to the invention can be cultured under suitable conditions.
  • the nucleic acid to be expressed can be adapted to the "codon usage" of the host cells.
  • the desired enzymes can then be isolated from the cells or the culture medium in a conventional manner.
  • the enzymes can also be produced in in tro systems.
  • a rapid method for isolating the enzymes according to the invention begins with the expression of a fusion protein, whereby the fusion partner can be easily affinity-purified.
  • the fusion partner can be, for example, glutathione S-transferase.
  • the fusion protein can then on one
  • Glutathione affinity column can be purified.
  • the fusion partner can be separated by partial proteolytic cleavage, for example on linkers between the fusion partner and the polypeptide according to the invention to be purified.
  • the linker can be designed to include target amino acids, such as arginine and lysine residues, that define sites for trypsin cleavage. About such linkers standard cloning methods using oligonucleotides can be used.
  • isolation or purification as used herein mean that the enzymes of the invention are derived from other proteins or others
  • a composition containing the enzymes according to the invention is preferably enriched at least 10-fold and particularly preferably at least 100-fold with respect to the protein content compared to a preparation from the host cells.
  • the enzymes according to the invention can also be affinity-purified without a fusion partner with the aid of antibodies which bind to the enzymes.
  • the present invention furthermore also relates to processes for producing the nucleic acids according to the invention.
  • the nucleic acids according to the invention can be produced in the usual way.
  • the nucleic acid molecules can be synthesized completely chemically. It is also possible to chemically synthesize only short pieces of the sequences according to the invention and to label such oligonucleotides radioactively or with a fluorescent dye.
  • the labeled oligonucleotides can be used to start from bacteria or
  • nucleic acids according to the invention are obtained in a simple manner.
  • the nucleic acids according to the invention can also be produced by means of PCR methods using chemically synthesized oligonucleotides.
  • oligonucleotide (s) as used herein means DNA molecules consisting of 10 to 50 nucleotides, preferably 15 to 30 nucleotides. They are chemically synthesized and can be used as probes.
  • the invention also relates to the individual production steps for the production of vanillin from ferulic acid:
  • the production processes mentioned above are based on the isolated enzymes or cell extracts mentioned which contain the enzymes mentioned.
  • the invention likewise relates to production methods based on host cells containing the abovementioned genes and host cells transformed with the DNA or the vectors mentioned.
  • the preferred substrate for the production of vanillin with the above-mentioned host cells is ferulic acid.
  • Synthetic, semi-synthetic or complex culture media come into consideration as the nutrient medium for the host cells used according to the invention. These can contain carbon-containing and nitrogen-containing compounds, inorganic salts, possibly trace elements and vitamins.
  • Carbohydrates, hydrocarbons or basic organic chemicals can be considered as carbon-containing compounds.
  • Examples of compounds which can preferably be used are sugars, alcohols or sugar alcohols, organic acids or complex mixtures.
  • the preferred sugar is glucose.
  • Citric acid or acetic acid can preferably be used as organic acids.
  • the complex mixtures include e.g. Malt extract, yeast extract, casein or casein hydrolyzate.
  • Inorganic compounds are suitable as nitrogen-containing substrates. Examples include nitrates and ammonium salts. Organic nitrogen sources can also be used. These include yeast extract, soy flour, casein, casein hydrolyzate and corn steep liquor.
  • the inorganic salts that can be used include, for example, sulfates, nitrates, chlorides, carbonates and phosphates.
  • the salts mentioned preferably contain sodium, potassium, magnesium, manganese, calcium, zinc and iron as metals.
  • the temperature for cultivation is preferably in the range of 5 to 100 ° C.
  • the range from 15 to 60 ° C. is particularly preferred, and 22 to 45 ° C. is most preferred.
  • the pH of the medium is preferably 2 to 12.
  • the process according to the invention can be carried out continuously or batchwise.
  • the duration of the fermentation until a maximum amount of product is reached depends on the special type of host cells used. Basically, however, the times of fermentation are between 2 and 200 hours.
  • the invention enables the production of vanillin from ferulic acid with any host cells.
  • NMG mutagenesis Receive mutants that have defects in individual steps of the ferulic acid catabolism.
  • HR167 Wildtyps a gene bank was created in the cosmid pVKIOO, which has a broad host range and is also replicated stably in Pseudomonads.
  • the hybrid cosmids were transduced into ⁇ phage particles in accordance with Escherichia coli S17-1.
  • the library included 5000 recombinant E. coli S17-1 clones.
  • hybrid cosmid of each clone was conjugated into two ferulic acid negative mutants (mutants SK6167 and SK6202) of the strain Pseudomonas sp. HR199 transferred and checked for a possible ability to complement.
  • the complementing property of the plasmids pVKl-1, pVK12-l, pVK15-l could be attributed to a 20 kbp EcoRI fragment ( ⁇ 200).
  • the genes ye_ and ech, which code for the feruloyl-CoA synthetase and enoyl-CoA hydratase / aldolase, were localized on a 4 kbp Estl subfragment (P40).
  • yeast extract-malt extract-glucose medium YMG, yeast extract 0.4%, wt / vol, malt extract 1%, wt / vol, glucose 0.4%, wt / vol, pH 7.2
  • Ferulic acid, vanillin, vanillic acid and protocatechic acid were dissolved in dimethyl sulfoxide and added to the respective medium in a final concentration of 0.1% (wt / vol).
  • transconjugants from Pseudomonas sp. tetracycline and kanamycin were used in final concentrations of 25 ⁇ g / ml and 300 ⁇ g / ml, respectively.
  • Nitrosoguanidine mutagenesis The nitrosoguanidine mutagenesis of Pseudomonas sp. HR199 was carried out with modifications according to Miller (Miller, J.H. 1972. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.). Potassium phosphate (KP) buffer was used instead of the citrate buffer
  • FCS activity was determined at 30 ° C. by an optical enzymatic test, modified according to Zenk et al. (Zenk et al. 1980. Anal. Biochem. 101: 182-187).
  • the reaction mixture with a volume of 1 ml contained 0.09 mmol potassium phosphate (pH 7.0), 2.1 mmol MgCl 2 , 0.7 mmol ferulic acid, 2 mmol ATP, 0.4 mmol coenzyme A and enzyme solution.
  • N-terminal amino acid sequences were determined using a protein peptide
  • Genomic DNA was isolated using the Marmur method (Marmur, J. 1961. J. Mol. Biol. 3: 208-218).
  • Recipient vaccination line was crossed. After incubation for 48 h at 30 ° C, the transconjugants grew directly behind the crossing point, whereas neither donor nor recipient strain was able to grow.
  • Haarmann & Reimer Holzminden, Germany
  • E. Merck AG Darmstadt, Germany
  • Fluka Chemie Buchs, Switzerland
  • Serva Feinbiochemica Heidelberg, Germany
  • Sigma Chemie Deisenhofen, Germany
  • the Pseudomonas sp. HR199 was subjected to a nitrosoguanidine mutagenesis with the aim of isolating mutants with defects in the ferulic acid catabolism.
  • the mutants obtained were classified in terms of their ability to use ferulic acid and vanillin as a source of carbon and energy.
  • the mutants SK6167 and SK6202 were no longer able to use ferulic acid as a C and energy source, but were able to utilize vanillin like the wild type.
  • Mutants came in conjugation experiments as recipients of the gene bank from Amycolatopsis sp. HR167 used.
  • the genomic DNA of the strain Amycolatopsis sp. HR167 was isolated and subjected to partial restriction digestion with EcoRI.
  • the DNA preparation thus obtained was ligated with EcoRI-cut vector pVKIOO.
  • the hybrid cosmids of the 5000 transductants were conjugatively transferred into the mutants SK6167 and SK6202 using a mini-complementation process.
  • the transconjugants obtained were able to grow on MM plates with ferulic acid in terms of their ability to grow back on ferulic acid (complementation of the
  • mutants SK6167 and SK6202 were complemented by obtaining the hybrid cosmids pVKl-1, pVK12-l, pVK15-l.
  • the complementary property was due to a 20 kbp EcoRI fragment.
  • the fragment E200 was preparatively isolated from the EcoRI-digested hybrid cosmid pVKl-1 and ligated with EcoRI-digested pBluescript SK ⁇ DNA.
  • E. coli XLl-Blue was transformed into the ligation mixture. After “blue-white” selection on LB-Tc-Amp agar plates containing X-Gal and IPTG, "white” transformants were obtained whose hybrid plasmid pSK ⁇ 200 contained the fragment E200 cloned. With the help of this plasmid and by using different restriction enzymes, a physical map of the fragment E200 was made.
  • the region complementing the mutants SK6167 and SK6202 was determined by cloning subfragments of E200 in the vectors pVKIOl and pMP92, both of which have a broad host spectrum and are also stable in pseudomonas, with subsequent conjugative transfer into the mutants SK6167 and SK6202 to a 4 kbp Pstl subfragment (P40) limited. After cloning this
  • the 4 kbp Estl subfragment (P40) was preparatively isolated from the PstL-digested hybrid plasmid pSKE200 and ligated with Estl-digested pBluescript SK "DNA. E. coli XLl-Blue was transformed with the ligation approach. According to" Blau-Wschreib "- Selection on LB-Tc-Amp agar plates containing X-Gal and isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) "white” transformants were obtained, the
  • Hybrid plasmid pSKP40 contained the fragment P40 cloned.
  • the recombinant strains of E. coli XLl-Blue had a feruloyl-CoA synthetase activity of 0.54 U / mg protein.
  • E. coli XLl-Blue (pSKP40) was cultured in 50 ml LB medium with 12.5 ⁇ g / ml tetracycline and 100 ⁇ g / ml ampicillin at 37 ° C. for 24 h.
  • the cells were harvested sterile, washed with 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) and resuspended in 50 ml HR-MM with 5.15 mM ferulic acid. After 6 h, 2.3 mM vanillin were left
  • SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide and amino acid sequences of the feruloyl-CoA synthetase and the enoyl-CoA hydratase / aldolase cDNAs.
  • SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3 also show the amino acid sequences of those of the feruloyl-CoA
  • Proteins derived from synthetase and the enoyl-CoA hydratase / aldolase cDNA sequences are Proteins derived from synthetase and the enoyl-CoA hydratase / aldolase cDNA sequences.

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Abstract

Enzyme aus Amycolatopsis sp. HR167 (DSMZ 9992) können für die Synthese von Vanillin aus Ferulasäure eingesetzt werden. Für diese Enzyme codierende DNA sowie mit dieser DNA transformierte Wirtszellen können für die Produktion von Vanillin eingesetzt werden.

Description

Enzyme und Gene für die Herstellung von Vanillin
Die vorliegende Erfindung betrifft Enzyme für die Herstellung von Vanillin aus Ferulasäure, deren Verwendung bei der Herstellung von Vanillin, für diese Enzyme codierende DNA sowie mit dieser DNA transformierte Wirtszellen.
In der EP A 0 583 687 wird die Herstellung substituierter Methoxyphenole mit einer neuen Pseudomonas sp. beschrieben. Ausgangsmaterial ist hier Eugenol und die erhaltenen Endprodukte sind Ferulasäure, Vanillinsäure, Coniferylalkohol und
Coniferylaldehyd.
Aus „Biocatalytic transformation of ferulic acid: an abundant aromatic natural product; J. Ind. Microbiol. 15:457-471" sind die Biotransformationsmöglichkeiten mit Ferulasäure bekannt.
In Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 88, No.l, 103-106 (1999) wird ebenfalls die Biotransformation von Ferulasäure zu Vanillin beschrieben.
Die Gene und Enzyme zur Synthese von Coniferylalkohol, Coniferylaldehyd, Ferulasäure, Vanillin und Vanillinsäure aus Pseudomonas sp. wurden in EP-A 0 845 532 beschrieben.
Die Enzyme zur Umsetzung von tr< _-Ferulasäure zu trαπs-Feruloyl-SCoA Ester und weiter zum Vanillin, sowie das Gen für die Spaltung des Esters aus
Pseudomonas fluorescens werden in WO 97/35999, J. Biol. Chem. 273:4163-4170 und Microbiology 144:1397-1405 beschrieben.
In EP A 97 110 010 und in Appl. Microbiol. Biotechnol. 51:456-461 wird ein Prozess für die Produktion von Vanillin mit Streptomyces setonii beschrieben. In der DE A 198 50 242 wird die Konstruktion von Produktionsstämmen für die Herstellung von substituierten Phenolen durch gezielte Inaktivierung von Genen des Eugenol- und Ferulasäure-Katabolismus beschrieben.
Die DE-A 195 32 317 beschreibt die fermentative Gewinnung von Vanillin aus
Ferulasäure mit Amycolatopsis sp. in hohen Ausbeuten.
Es wurden Enzyme aus Amycolatopsis sp. HR167 (DSMZ 9992) für die Synthese von Vanillin aus Ferulasäure gefunden.
Die Enzyme wurden isoliert und charakterisiert.
Enzyme gemäß der Erfindung sind solche, welche zumindest die Aktivität einer Feruloyl-CoA Synthetase ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 70 %ige Identität, vorzugsweise 80 %ige Identität, besonders bevorzugt
90 %ige Identität, ganz besonders bevorzugt 95 %ige Identität, mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30, fortlaufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlängen aufweisen, sowie solche, welche die Aktivität einer Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 70 %ige Identität, vorzugsweise 80 %ige Identität, besonders bevorzugt 90 %ige Identität, ganz besonders bevorzugt 95 %ige Identität, mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlängen aufweisen.
Der Grad der Identität der Aminosäuresequenzen wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms GAP aus dem Programmpaket GCG, Version 9.1 unter Standardeinstellungen (Nucleic Acids Research 12, 387 (1984). Der Ausdruck "Enzyme", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Proteine, die durch die oben beschriebene Funktionalität charakterisiert sind. Er umfasst Aminosäureketten, die entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch an sich bekannte chemische Verfahren modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem
Polypeptid vorkommen, wie beispielsweise an dem Peptid-Rückgrat, an der Aminosäure-Seitenkette, am Amino- und oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid- Derivaten, Lipiden oder Lipid-Derivaten oder Phophatidylinositol, Cyclisierungen,
Disulfidbrückenbildungen, Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen, Glycosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoylierungen, Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen, Selenoylierungen und tRNA-vermittelte Additionen von Aminosäuren.
Die erfindungsgemäßen Enzyme können in der Form "reifer" Proteine oder als Teile größerer Proteine, z.B. als Fusionsproteine, vorliegen. Weiterhin können sie Sezer- nierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätzliche stabilisierende Aminosäuren aufweisen.
Enzyme, die im Vergleich zu der Feruloyl-CoA Synthetase und der Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase, die aus den erfindungsgemäßen Enzymen mit einer Amino- säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 bestehen, eine um 50 % höhere oder verminderte Aktivität ausüben, werden noch als erfindungsgemäß betrachtet.
Die erfindungsgemäßen Enzyme können im Vergleich zu der entsprechenden Region natürlich vorkommender Feruloyl-CoA Synthetasen und der Enoyl-CoA Hydrata- sen/Aldolasen Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen aufweisen, solange sie zumindest noch eine biologische Aktivität der vollständigen Enzyme ausüben. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:
1. Kleine ahphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro und
Gly;
2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp, Asn, Glu und Gin;
3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys;
4. Große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys; und
5. Aromatische Reste: Phe, Tyr und Tip.
Die folgende Liste zeigt bevorzugte konservative Substitutionen:
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Nukleinsäuren, die für die erfindungsgemäßen Enzyme codieren.
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich insbesondere um einzel- strängige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA). Bevorzugte Ausführungsformen sind Fragmente genomischer DNA, die Introns enthalten können, und cDNAs.
Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren stellen cDNAs dar, welche eine Nukleotidsäuresequenz gemäß SEQ ID NO 1 besitzen.
Nukleinsäuren, welche unter stringenten Bedingungen an die Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 hybridisieren, sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Der Ausdruck "hybridisieren", wie er hierin verwendet wird, beschreibt den Vorgang, bei welchem ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem komplementären Strang eine Basenpaarung eingeht. Auf diese Weise können ausgehend von der hierin offenbarten Sequenzinformation beispielsweise DNA-Fragmente aus anderen Organismen isoliert werden, welche für Enzyme mit der Aktivität von Feruloyl-CoA Synthetasen und/oder Enoyl-CoA Hydratasen/ Aldolasen codieren.
Weiterhin sind von der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren umfasst, die eine zumindest 70 %ige Identität, vorzugsweise 80 %ige Identität, besonders bevorzugt 90 %ige Identität, ganz besonders bevorzugt 95 %ige Identität, mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Nukleotide und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlängen aufweisen. Der Grad der Identität der Nukleinsäuresequenzen wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms GAP aus dem Programmpaket GCG, Version 9.1 unter Standardeinstellungen (Nucleic Acids Research 12, 387 (1984).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin DNA-Konstrukte, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und einen hetero logen Promotor umfassen.
Der Ausdruck "heterologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der andere Eigenschaften als derjenige Promotor aufweist, der im
Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert. Der Ausdruck "Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich allgemein auf Expressionskontrollsequenzen.
Die Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhängig, ob zur Expression pro- oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden. Beispiele für heterologe Promotoren sind das lac-System, das trp-System, die Haupt-Operator- und Promotorregionen des Phagen lambda, die Kontrollregionen des fd-Hüllproteins, der Promotor der 3-Phosphoglyceratkinase, der frühe oder späte Promotor des SV40, des Adenovirus oder des Cytomegalovirus, der Promotor der Sauren Phosphatase und der Promotor des α-Mating-Faktors der Hefe.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthalten. Als Vektoren können alle in molekularbiologischen Laboratorien verwendete Plasmide, Phasmide,
Cosmide, YACs oder künstliche Chromosomen verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen erfin- dungsgemäßen Vektor enthalten. Der Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicherweise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren nicht enthalten.
Als Wirtszellen eignen sich sowohl prokaryotische Zellen, wie Bakterien der Gattungen Bacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Streptomyces,
Streptococcus, Staphylococcus, vorzugsweise E. coli, als auch eukaryotische Zellen, wie Hefen der Gattungen Saccharomyces, Candida, Pichia, filamentöse Pilze der Gattungen Aspergillus, Penicillium, oder Pflanzenzellen oder ganze Pflanzen verschiedener Gattungen, wie Nicotiana, Solanum, Brassica, Beta, Capsicum und Vanilla.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Enzyme. Zur Herstellung der Enzyme, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codiert werden, können Wirtszellen, die eine der erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten, unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden. Dabei kann die zu exprimierende Nukleinsäure an die "Codon Usage" der Wirtszellen angepaßt werden. Die gewünschten Enzyme können danach auf übliche Weise aus den Zellen oder dem Kulturmedium isoliert werden. Die Enzyme können auch in in tro-Systemen hergestellt werden.
Ein schnelles Verfahren zum Isolieren der erfindungsgemäßen Enzyme, die von Wirtszellen unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure synthetisiert werden, beginnt mit der Expression eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise affinitätsgereinigt werden kann. Der Fusionspartner kann beispielsweise Glutathion S-Transferase sein. Das Fusionsprotein kann dann an einer
Glutathion-Affinitätssäule gereinigt werden. Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung beispielsweise an Linkern zwischen dem Fusionspartner und dem zu reinigenden erfindungsgemäßen Polypeptid abgetrennt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel-Aminosäuren, wie Arginin- und Lysin-Reste einschließt, die Stellen für eine Spaltung durch Trypsin definieren. Um solche Linker zu erzeugen, können Standard-Klonierungsverfahren unter Verwendung von Oligo- nukleotiden angewendet werden.
Weitere mögliche Reinigungsverfahren basieren auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z.B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch- Chromatographie und Affinitätschromatographie.
Die Ausdrücke "Isolierung oder Reinigung", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten, dass die erfindungsgemäßen Enzyme von anderen Proteinen oder anderen
Makromolekülen der Zellen abgetrennt werden. Vorzugsweise ist eine die erfindungsgemäßen Enzyme enthaltende Zusammensetzung hinsichtlich des Proteingehalts gegenüber einer Präparation aus den Wirtszellen mindestens 10-fach und besonders bevorzugt mindestens 100-fach angereichert.
Die erfindungsgemäßen Enzyme können auch ohne Fusionspartner mit Hilfe von Antikörpern, die an die Enzyme binden, affinitätsgereinigt werden.
Ferner sind auch Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auf die übliche Weise hergestellt werden. Beispielsweise können die Nuklein- säuremoleküle vollständig chemisch synthetisiert werden. Man kann auch nur kurze Stücke der erfindungsgemäßen Sequenzen chemisch synthetisieren und solche Oligo- nukleotide radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren. Die markierten Oligonukleotide können verwendet werden, um ausgehend von Bakterien oder
Pflanzen-mRNA hergestellte cDNA-Banken oder ausgehend von genomischer Bakterien oder Pflanzen-DNA hergestellte genomische Banken zu durchsuchen. Klone, an die die markierten Oligonukleotide hybridisieren, werden zur Isolierung der betreffenden DNA ausgewählt. Nach der Charakterisierung der isolierten DNA erhält man auf einfache Weise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auch mittels PCR- Verfahren unter Verwendung chemisch synthetisierter Oligonukleotide hergestellt werden.
Der Ausdruck "Oligonukleotid(e)", wie er hierin verwendet wird, bedeutet DNA- Moleküle, die aus 10 bis 50 Nukleotiden, vorzugsweise 15 bis 30 Nukleotiden, bestehen. Sie werden chemisch synthetisiert und können als Sonden verwendet werden.
Ebenso betrifft die Erfindung die einzelnen Herstellungsschritte der Herstellung von Vanillin aus Ferulasäure:
a) das Verfahren zur Herstellung von Feruloyl-CoenzymA aus Ferulasäure, das in Anwesenheit von Feruloyl-CoA Synthetase stattfindet;
b) das Verfahren zur Herstellung von 4-Hydroxy-3-methoxyphenyl-ß-hydroxy- propionyl CoenzymA aus Feruloyl-CoenzymA, das in Anwesenheit von
Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase stattfindet;
c) das Verfahren zur Herstellung von Vanillin aus 4-Hydroxy-3-methoxyphenyl- ß-hydroxypropionyl-CoenzymA, das in Anwesenheit von Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase stattfindet.
Die oben genannten Herstellungsverfahren basieren auf den genannten isolierten Enzymen oder Zellextrakten, die die genannten Enzyme enthalten.
Ebenso betrifft die Erfindung Herstellungsverfahren basierend auf Wirtszellen enthaltend die oben genannten Gene und Wirtszellen transformiert mit der genannten DNA bzw. den genannten Vektoren.
Bevorzugtes Substrat für die Herstellung von Vanillin mit den oben genannten Wirtszellen ist Ferulasäure. Jedoch kann der Zusatz weiterer Substrate oder sogar der
Austausch der Ferulasäure gegen ein anderes Substrat möglich sein. Als Nährmedium für die erfindungsgemäß eingesetzten Wirtszellen kommen synthetische, halbsynthetische oder komplexe Kulturmedien in Betracht. Diese können kohlenstoffhaltige und stickstoffhaltige Verbindungen, anorganische Salze, gegeben- enfalls Spurenelemente sowie Vitamine enthalten.
Als kohlenstoffhaltige Verbindungen können Kohlenhydrate, Kohlenwasserstoffe oder organische Grundchemikalien in Betracht kommen. Beispiele für vorzugsweise verwendbare Verbindungen sind Zucker, Alkohole bzw. Zuckeralkohole, organische Säuren oder komplexe Gemische.
Als Zucker kommt vorzugsweise Glucose in Betracht. Als organische Säuren können vorzugsweise Zitronensäure oder Essigsäure zum Einsatz kommen. Zu den komplexen Gemischen zählen z.B. Malzextrakt, Hefeextrakt, Casein oder Caseinhydro- lysat.
Als stickstoffhaltige Substrate kommen anorganische Verbindungen in Betracht. Beispiele hierfür sind Nitrate und Ammoniumsalze. Ebenso können organische Stickstoffquellen zum Einsatz kommen. Hierzu zählen Hefeextrakt, Sojamehl, Casein, Caseinhydrolysat und Maisquellwasser.
Zu den einsetzbaren anorganischen Salzen zählen beispielsweise Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate und Phosphate. Als Metalle enthalten die genannte Salze vorzugsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Mangan, Calcium, Zink und Eisen.
Die Temperatur für die Kultivierung liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 100°C. Besonders bevorzugt ist der Bereich von 15 bis 60°C, höchst bevorzugt sind 22 bis 45°C.
Der pH- Wert des Mediums beträgt bevorzugt 2 bis 12. Besonders bevorzugt ist der
Bereich von 4 bis 8. Grundsätzlich können für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens alle dem Fachmann bekannten Bioreaktoren eingesetzt werden. Vorzugsweise kommen alle für Submersverfahren geeigneten Vorrichtungen in Betracht. Das heißt, es kön- nen erfindungsgemäß Gefäße ohne oder mit mechanischer Mischeinrichtung eingesetzt werden. Zu ersteren zählen z.B. Schüttelapparaturen, Blasensäulen- oder Schlaufenreaktoren. Zu letzteren gehören vorzugsweise alle bekannten Vorrichtungen mit Rührern in beliebiger Gestaltung.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden. Die Dauer der Fermentation bis zum Erreichen einer maximalen Produktmenge hängt von der speziellen Art der eingesetzten Wirtszellen ab. Grundsätzlich liegen die Zeiten der Fermentation jedoch zwischen 2 und 200 Stunden.
Die Erfindung ermöglicht die Herstellung von Vanillin aus Ferulasäure mit beliebigen Wirtszellen.
Beispiele:
Vorgehensweise:
Von dem Ferulasäure verwertenden Stamm Pseudomonas sp. HR199 wurden nach
NMG-Mutagenese Mutanten erhalten, die Defekte in einzelnen Schritten des Ferula- säure-Katabolismusses aufwiesen. Ausgehend von partiell EcoRI-verdauter Gesamt- DNA des Amycolatopsis sp. HR167 Wildtyps wurde eine Genbank in dem Cosmid pVKIOO angelegt, welches über ein breites Wirtsspektrum verfügt und auch in Pseudomonaden stabil repliziert wird. Die Hybridcosmide wurden nach Verpackung in λ-Phagenpartikel nach Escherichia coli S17-1 transduziert. Die Genbank umfaßte 5000 rekombinante E. coli S17-1 Klone. Das Hybridcosmid eines jeden Klons wurde konjugativ in zwei Ferulasäure-negative Mutanten (Mutanten SK6167 und SK6202) des Stammes Pseudomonas sp. HR199 übertragen und auf eine mögliche Fähigkeit zur Komplementation überprüft. Dabei wurden die Hybridcosmide pVKl-1, pVK12-
1, pVK15-l identifiziert, deren Erhalt die Mutanten SK6167 und SK6202 wieder in die Lage versetzten Ferulasäure zu verwerten.
Die komplementierende Eigenschaft der Plasmide pVKl-1, pVK12-l, pVK15-l konnte auf ein 20 kbp EcoRI-Fragment (Ε200) zurückgeführt werden. Auf einem 4 kbp Estl-Subfragment (P40) wurden die Gene ye_- und ech lokalisiert, die für die Feruloyl-CoA Synthetase und Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase codieren.
Durch Expression dieser Gene waren rekombinante Stämme von E. coli XLl-Blue in der Lage Ferulasäure in Vanillin zu überführen.
Material und Methoden:
Wachstumsbedingungen der Bakterien. Stämme von Escherichia coli wurden bei 37°C in Luria-Bertani (LB) oder M9-Mineralmedium (Sambrook, J. E. F. Fritsch und
T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.) angezogen. Stämme von Pseudomonas sp. wurden bei 30°C in Nutrient Broth (NB, 0,8 %, wt/vol) oder in Mineralmedium (MM) (Schlegel, H. G. et al. 1961. Arch. Mikrobiol. 38:209-222) angezogen. Stämme von Amycolatopsis sp. wurden bei 42°C in Hefeextrakt-Malz- extrakt-Glucose-Medium (YMG, Hefeextrakt 0,4 %, wt/vol, Malzextrakt 1 %, wt/vol, Glucose 0,4 %, wt/vol, pH 7,2) angezogen. Ferulasäure, Vanillin, Vanillinsäure und Protocatechusäure wurden in Dimethylsulfoxid gelöst, und dem jeweiligen Medium in einer Endkonzentration von 0,1 % (wt/vol) zugesetzt. Bei der Anzucht von Transkonjuganten von Pseudomonas sp. wurden Tetracyclin und Kanamycin in Endkonzentrationen von 25 μg/ml bzw. 300 μg/ml eingesetzt.
Nitrosoguanidin-Mutagenese. Die Nitrosoguanidin-Mutagenese von Pseudomonas sp. HR199 wurde mit Modifikationen nach Miller (Miller, J. H. 1972. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.) durchgeführt. An Stelle des Citrat-Puffers kam Kalium-Phosphat (KP)-Puffer
(100 mM, pH 7,0) zum Einsatz. Die Endkonzentration von N-Methyl-N'-Nitro-N- Nitrosoguanidin betrug 200 μg/ml. Die erhaltenen Mutanten wurden hinsichtlich des Verlustes der Fähigkeit Ferulasäure als Wachstumssubstrate nutzen zu können ge- screent.
Qualitativer und quantitativer Nachweis von Stoffwechselintermediaten in Kulturüberständen. Kulturüberstände wurden direkt, bzw. nach Verdünnung mit H2O- bidest. mittels Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (Knauer-HPLC) analysiert. Die Chromatographie erfolgte an Nucleosil-100 C18 (7 μm, 250 x 4 mm). Als Lösungsmittel diente 0,1 % (vol/vol) Ameisensäure und Acetonitril. Der verwendete
Gradient zur Elution der Substanzen verlief wie folgt. 00:00 - 06:30 — > 26 % Acetonitril 06:30 - 08:00 — > 100 % Acetonitril 08:00 - 12:00 — > 100 % Acetonitril 12:00 - 13:00 — > 26 % Acetonitril
13 : 00 - 18 : 00 — > 26 % Acetonitril Bestimmung der Feruloyl-CoA-Synthetase (Ferulasäure-Thiokinase)-Aktivität. Die Bestimmung der FCS-Aktivität erfolgte bei 30°C durch einen optisch enzymatischen Test, modifiziert nach Zenk et al. (Zenk et al. 1980. Anal. Biochem. 101:182-187). Der Reaktionsansatz mit einem Volumen von 1 ml enthielt 0,09 mmol Kalium-Phosphat (pH 7,0), 2,1 mmol MgCl2, 0,7 mmol Ferulasäure, 2 mmol ATP, 0,4 mmol Coenzym A und Enzymlösung. Die Entstehung des CoA-Esters aus Ferulasäure wurde bei λ = 345 nm verfolgt (ε = 10 cm^/mmol). Die Enzymaktivität wurde in Einheiten (U) angegeben, wobei 1 U der Enzymmenge entspricht, die 1 mmol Substrat pro Minute umsetzt. Die Proteinkonzentrationen in den Proben wurden nach
Lowry et al. (Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A. L. Farr und R. J. Randall. 1951. J. Biol. Chem. 193:265-275) bestimmt.
Elektrophoretische Methoden. Die Auftrennung von proteinhaltigen Extrakten erfolgte unter denaturierenden Bedingungen in 11,5 % (wt/vol) Polyacrylamidgelen nach der Methode von Laemmli (Laemmli, U. K. 1970. Nature (London) 227:680- 685). Zur unspezifischen Proteinfärbung wurde Serva Blue R verwendet.
Transfer von Proteinen aus Polyacrylamidgelen auf PVDF-Membranen. Proteine wurden aus SDS-Polyacrylamidgelen mit Hilfe eines Semidry-Fastblot Gerätes
(B32/33, Biometra, Göttingen, Deutschland) nach Herstellerangaben auf PVDF- Membranen (Waters-Millipore, Bedford, Mass., USA) übertragen.
Bestimmung von N-terminalen Aminosäuresequenzen. Die Bestimmung von N- terminalen Aminosäuresequenzen erfolgte mit Hilfe eines Protein Peptide
Sequenzers (Typ 477 A, Applied Biosystems, Foster City, USA) und eines PTH- Analysers nach Herstellerangaben.
Isolierung und Manipulation von DNA. Die Isolierung von genomischer DNA er- folgte nach der Methode von Marmur (Marmur, J. 1961. J. Mol. Biol. 3:208-218).
Die Isolierung und Analyse von Plasmid-DNA bzw. von DNA-Restriktionsfrag- menten, die Verpackung von Hybridcosmiden in λ-Phagenpartikel und die Trans- duktion von E. coli erfolgten nach Standardmethoden (Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York.).
Transfer von DNA. Präparation und Transformation von kompetenten Escherichia co/.-Zellen erfolgten nach der Methode von Hanahan (Hanahan, D. 1983. J. Mol. Biol. 166:557-580). Konjugativer Plasmidtransfer zwischen Plasmid-tragenden Escherichia coli S 17-1 -Stämmen (Donor) und Pseudomonas sp.-Stämmen (Rezipient) erfolgte auf NB-Agarplatten nach der Methode von Friedrich et al.
(Friedrich, B. et al. 1981. J. Bacteriol. 147:198-205), oder durch eine "Mini- komplementations-Methode" auf MM-Agarplatten mit 0,5 % (wt/vol) Gluconat als C-Quelle und 25 μg/ml Tetracyclin oder 300 μg/ml Kanamycin. Dabei wurden Zellen des Rezipienten in einer Richtung als Impfstrich aufgetragen. Nach 5 min wurden dann Zellen der Donor-Stämme als Impfstriche aufgetragen, wobei der
Rezipienten-Impfstrich gekreuzt wurde. Nach einer Inkubation für 48 h bei 30°C wuchsen die Transkonjuganten direkt hinter der Kreuzungsstelle, wohingegen weder Donor- noch Rezipienten-Stamm zum Wachstum in der Lage war.
DNA-Sequenzierung. Die Bestimmung von Nukleotidsequenzen erfolgte nach der
Didesoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (Sanger et al. 1977. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-5467) mit einem "LI-COR DNA-Sequencer Modell 4000L" (LI-COR Inc., Biotechnology Division, Lincoln, NE, USA) unter Verwendung eines "Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza- dGTP" (Amersham Life Science, Amersham International pls, Little Chalfont,
Buckinghamshire, England) jeweils nach Vorschrift des Herstellers bestimmt.
Mit Hilfe von synthetischen Oligonukleotiden wurden nach der "Primer-hopping Strategie" von Strauss et al. (Strauss, E. C. et al. 1986. Anal. Biochem. 154:353-360) beide DNA-Stränge sequenziert. Chemikalien, Biochemikalien und Enzyme. Restriktionsenzyme, T4 DNA-Ligase, Lambda-DNA und Enzyme bzw. Substrate für die optisch enzymatischen Tests wurden von C. F. Boehringer & Söhne (Mannheim, Deutschland) oder von GIBCO/BRL (Eggenstein, Deutschland) bezogen. Agarose vom Typ NA wurde von Pharmacia-LKB (Uppsala, Schweden). Alle anderen Chemikalien waren von
Haarmann & Reimer (Holzminden, Deutschland), E. Merck AG (Darmstadt, Deutschland), Fluka Chemie (Buchs, Schweiz), Serva Feinbiochemica (Heidelberg, Deutschland) oder Sigma Chemie (Deisenhofen, Deutschland).
Beispiel 1
Isolierung von Mutanten des Stammes Pseudomonas sp. HR199 mit Defekten im Ferulasäure-Katabolismus
Der Stamm Pseudomonas sp. HR199 wurde einer Nitrosoguanidin-Mutagenese unterzogen mit dem Ziel Mutanten mit Defekten im Ferulasäure-Katabolismus zu isolieren. Die erhaltenen Mutanten wurden bezüglich ihres Vermögens Ferulasäure und Vanillin als C- und Energiequelle nutzen zu können klassifiziert. Die Mutanten SK6167 und SK6202 waren nicht mehr in der Lage Ferulasäure als C- und Energie- quelle zu nutzen, vermochten jedoch wie der Wildtyp Vanillin zu verwerten. Die o.g.
Mutanten kamen bei Konjugationsexperimenten als Rezipienten der Genbank von Amycolatopsis sp. HR167 zum Einsatz.
Beispiel 2
Anlegen einer Amycolatopsis sp. HR167 Genbank im Cosmidvektor pVKIOO
Die genomische DNA des Stammes Amycolatopsis sp. HR167 wurde isoliert und einer partiellen Restriktionsverdauung mit EcoRI unterzogen. Die so erhaltene DNA- Präparation wurde mit EcoRI-geschnittenem Vektor pVKIOO ligiert. Die DNA-
Konzentrationen lagen dabei relativ hoch, um die Entstehung konkatemerer Liga- tionsprodukte zu forcieren. Die Ligationsansätze wurden in λ-Phagenpartikel verpackt, mit denen anschließend E. coli S17-1 transduziert wurde. Die Selektion der Transduktanten erfolgte auf Tetracyclin-haltigen LB-Agarplatten. Auf diese Weise wurden 5000 Transduktanten erhalten, die über unterschiedliche Hybridcosmide verfügten.
Beispiel 3
Identifizierung von Hybridcosmiden, die essentielle Gene des Ferulasäure-Katabo- lismus beherbergen
Die Hybridcosmide der 5000 Transduktanten wurden durch ein Minikomplemen- tations- Verfahren konjugativ in die Mutanten SK6167 und SK6202 übertragen. Die erhaltenen Transkonjuganten wurden auf MM-Platten mit Ferulasäure bezüglich ihres Vermögens wieder auf Ferulasäure wachsen zu können (Komplementation der
Mutanten) untersucht. Die Mutanten SK6167 und SK6202 wurde durch den Erhalt der Hybridcosmide pVKl-1, pVK12-l, pVK15-l komplementiert. Die komplementierende Eigenschaft war auf ein 20 kbp EcoRI-Fragment zurückzuführen.
Beispiel 4
Analyse des 20 kbp EcoRI-Fragments (Ε200) des Hybridcosmids pVKl-1
Das Fragment E200 wurde präparativ aus dem mit EcoRI-verdautem Hybridcosmid pVKl-1 isoliert und mit EcoRI- verdauter pBluescript SK~ DNA ligiert. Mit dem
Ligationsansatz wurde E. coli XLl-Blue transformiert. Nach "Blau-Weiß"-Selektion auf X-Gal und IPTG enthaltenden LB-Tc-Amp-Agarplatten wurden "weiße" Transformanden erhalten, deren Hybridplasmid pSKΕ200 das Fragment E200 kloniert enthielten. Mit Hilfe dieses Plasmids und durch Einsatz unterschiedlicher Restriktions- enzyme wurde eine physikalische Karte des Fragments E200 angefertigt. Der die Mutanten SK6167 und SK6202 komplementierende Bereich wurde durch Klonierung von Subfragmenten von E200 in den Vektoren pVKIOl und pMP92, die beide über ein weites Wirtsspektrum verfügen und auch in Pseudomonaden stabil sind, mit anschließender konjugativer Übertragung in die Mutanten SK6167 und SK6202 auf ein 4 kbp Pstl-Subfragment (P40) eingegrenzt. Nach Klonierung dieses
Fragments in pBluescript SK" wurde die Nukleotidsequenz bestimmt, wobei die Gene fcs und ech identifiziert wurden, die für die Feruloyl-CoA Synthetase und Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase codieren. Das fcs Genprodukt von 491 Aminosäuren wies eine 35 %ige Identität (über einen Bereich von 491 Aminosäuren) mit dem fαdD13 Genprodukt aus Mycobacterium tuberculosis (Cole et al. 1998. Nature
393:537-544) auf. Das ech Genprodukt von 287 Aminosäuren wies eine 62 %ige Identität (über einen Bereich von 267 Aminosäuren) mit der p-hydroxycinnamoyl CoA hydratase/lyase aus Pseudomonas fluorescens (Gasson et al. 1998. Metabolism of ferulic acid to vanillin. J. Biol. Chem. 273:4163-4170) auf.
Beispiel 5
Heterologe Expression von Genen des Ferulasäure-Katabolismus aus Amycolatopsis sp. HR167 in Escherichia coli
Das 4 kbp Estl-Subfragment (P40) wurde präparativ aus dem mit Pstl-verdautem Hybridplasmid pSKE200 isoliert und mit Estl-verdauter pBluescript SK" DNA ligiert. Mit dem Ligationsansatz wurde E. coli XLl-Blue transformiert. Nach "Blau- Weiß"-Selektion auf X-Gal und Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG) enthal- tenden LB-Tc-Amp-Agarplatten wurden "weiße" Transformanden erhalten, deren
Hybridplasmid pSKP40 das Fragment P40 kloniert enthielten. Die rekombinanten Stämme von E. coli XLl-Blue wiesen eine Feruloyl-CoA Synthetase Aktivität von 0,54 U/mg Protein auf. Beispiel 6
Biotransformation von Ferulasäure zu Vanillin mit ruhenden Zellen des rekombinanten Stammes von Escherichia coli XLl-Blue (pSKP40), der das fcs und ech Gen aus Amycolatopsis sp. HR167 exprimiert
E. coli XLl-Blue (pSKP40) wurde in 50 ml LB-Medium mit 12,5 μg/ml Tetracyclin und 100 μg/ml Ampicillin bei 37°C für 24 h kultiviert. Die Zellen wurden steril geerntet, mit 100 mM Kalium-Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und in 50 ml HR- MM mit 5,15 mM Ferulasäure resuspendiert. Nach 6 h waren 2,3 mM Vanillin, nach
8 h 2,8 mM und nach 23 h 3,1 mM Vanillin im Kulturüberstand nachweisbar.
Erläuterungen zum Sequenzprotokoll:
SEQ ID NO: 1 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der Feruloyl-CoA Synthetase und der Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase-cDNAs. SEQ ID NO: 2, und SEQ ID NO: 3 zeigen ferner die Aminosäuresequenzen der von den Feruloyl-CoA
Synthetase und der Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase-cDNA-Sequenzen abgeleiteten Proteine.

Claims

Patentansprttche
1. Enzyme aus Amycolatopsis sp. für die Synthese von Vanillin aus Ferulasäure.
2. Enzyme nach Anspruch 1 ausgewählt aus der Gruppe der Feruloyl-CoA
Synthetasen oder Enoyl-CoA Hydratase/ Aldolasen.
3. Enzyme nach den Ansprüchen 1 und 2, welche die Aktivität einer Feruloyl- CoA Synthetase ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 70 %ige Identität mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 über eine Länge von wenigstens 20 fortlaufenden Aminosäuren aufweisen.
4. Enzyme nach den Ansprüchen 1 und 2, welche die Aktivität einer Enoyl- CoA Hydratase/Aldolase ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 70 %ige Identität mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO:
3 über eine Länge von wenigstens 20 fortlaufenden Aminosäuren aufweisen.
5. Nucleinsäure umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Enzym gemäß der Ansprüche 1 bis 4 codiert und funktioneile Äquivalente davon.
6. Nucleinsäure gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA handelt.
7. Nucleinsäure nach den Ansprüchen 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Fragmente genomischer DNA oder cDNA handelt.
8. Nucleinsäure nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 über eine Länge von wenigstens 20 Nucleotide mit einer zumindest 70 %igen Identität entspricht.
. DNA-Konstrukt umfassend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 und einen heterologen Promotor.
10. Vektor umfassend eine Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 oder ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 9.
11. Cosmidklone, enthaltend eine Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9.
12. Wirtszelle, enthaltend eine Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 oder ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 9 oder 10.
13. Wirtszelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine prokaryotische Zelle handelt.
14. Wirtszelle nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Escherichia coli handelt.
15. Wirtszelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine eukaryotische Zelle handelt.
16. Wirtszelle nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen einzellig oder filamentös wachsenden Pilz handelt.
17. Wirtszelle nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um
Pflanzenzellen handelt.
18. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms gemäß der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, umfassend a) das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 12 bis 17 unter Bedingungen, die die Expression der Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 gewährleistet, oder b) das Exprimieren einer Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 11 in einem in-vitro System, und c) die Gewinnung des Enzyms aus der Zelle, dem Kulturmedium oder dem w-v/tro-System.
19. Verfahren zur Herstellung von Feruloyl-CoenzymA aus Ferulasäure, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in Anwesenheit von Feruloyl-CoA
Synthetase stattfindet.
20. Verfahren zur Herstellung von 4-Hydroxy-3-methoxyphenyl-ß-hydroxy- propionyl-CoenzymA, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in Anwe- senheit von Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase stattfindet
21. Verfahren zur Herstellung von Vanillin aus 4-Hydroxy-3-methoxyphenyl-ß- hydroxypropionyl-CoenzymA, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in Anwesenheit von Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase stattfindet.
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