WO2001044480A2 - Enzyme und gene für die herstellung von vanillin - Google Patents
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Classifications
-
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-
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
Abstract
Enzyme aus Amycolatopsis sp. HR167 (DSMZ 9992) können für die Synthese von Vanillin aus Ferulasäure eingesetzt werden. Für diese Enzyme codierende DNA sowie mit dieser DNA transformierte Wirtszellen können für die Produktion von Vanillin eingesetzt werden.
Description
Enzyme und Gene für die Herstellung von Vanillin
Die vorliegende Erfindung betrifft Enzyme für die Herstellung von Vanillin aus Ferulasäure, deren Verwendung bei der Herstellung von Vanillin, für diese Enzyme codierende DNA sowie mit dieser DNA transformierte Wirtszellen.
In der EP A 0 583 687 wird die Herstellung substituierter Methoxyphenole mit einer neuen Pseudomonas sp. beschrieben. Ausgangsmaterial ist hier Eugenol und die erhaltenen Endprodukte sind Ferulasäure, Vanillinsäure, Coniferylalkohol und
Coniferylaldehyd.
Aus „Biocatalytic transformation of ferulic acid: an abundant aromatic natural product; J. Ind. Microbiol. 15:457-471" sind die Biotransformationsmöglichkeiten mit Ferulasäure bekannt.
In Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 88, No.l, 103-106 (1999) wird ebenfalls die Biotransformation von Ferulasäure zu Vanillin beschrieben.
Die Gene und Enzyme zur Synthese von Coniferylalkohol, Coniferylaldehyd, Ferulasäure, Vanillin und Vanillinsäure aus Pseudomonas sp. wurden in EP-A 0 845 532 beschrieben.
Die Enzyme zur Umsetzung von tr< _-Ferulasäure zu trαπs-Feruloyl-SCoA Ester und weiter zum Vanillin, sowie das Gen für die Spaltung des Esters aus
Pseudomonas fluorescens werden in WO 97/35999, J. Biol. Chem. 273:4163-4170 und Microbiology 144:1397-1405 beschrieben.
In EP A 97 110 010 und in Appl. Microbiol. Biotechnol. 51:456-461 wird ein Prozess für die Produktion von Vanillin mit Streptomyces setonii beschrieben.
In der DE A 198 50 242 wird die Konstruktion von Produktionsstämmen für die Herstellung von substituierten Phenolen durch gezielte Inaktivierung von Genen des Eugenol- und Ferulasäure-Katabolismus beschrieben.
Die DE-A 195 32 317 beschreibt die fermentative Gewinnung von Vanillin aus
Ferulasäure mit Amycolatopsis sp. in hohen Ausbeuten.
Es wurden Enzyme aus Amycolatopsis sp. HR167 (DSMZ 9992) für die Synthese von Vanillin aus Ferulasäure gefunden.
Die Enzyme wurden isoliert und charakterisiert.
Enzyme gemäß der Erfindung sind solche, welche zumindest die Aktivität einer Feruloyl-CoA Synthetase ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 70 %ige Identität, vorzugsweise 80 %ige Identität, besonders bevorzugt
90 %ige Identität, ganz besonders bevorzugt 95 %ige Identität, mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30, fortlaufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlängen aufweisen, sowie solche, welche die Aktivität einer Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 70 %ige Identität, vorzugsweise 80 %ige Identität, besonders bevorzugt 90 %ige Identität, ganz besonders bevorzugt 95 %ige Identität, mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlängen aufweisen.
Der Grad der Identität der Aminosäuresequenzen wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms GAP aus dem Programmpaket GCG, Version 9.1 unter Standardeinstellungen (Nucleic Acids Research 12, 387 (1984).
Der Ausdruck "Enzyme", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Proteine, die durch die oben beschriebene Funktionalität charakterisiert sind. Er umfasst Aminosäureketten, die entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch an sich bekannte chemische Verfahren modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem
Polypeptid vorkommen, wie beispielsweise an dem Peptid-Rückgrat, an der Aminosäure-Seitenkette, am Amino- und oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid- Derivaten, Lipiden oder Lipid-Derivaten oder Phophatidylinositol, Cyclisierungen,
Disulfidbrückenbildungen, Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen, Glycosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoylierungen, Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen, Selenoylierungen und tRNA-vermittelte Additionen von Aminosäuren.
Die erfindungsgemäßen Enzyme können in der Form "reifer" Proteine oder als Teile größerer Proteine, z.B. als Fusionsproteine, vorliegen. Weiterhin können sie Sezer- nierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätzliche stabilisierende Aminosäuren aufweisen.
Enzyme, die im Vergleich zu der Feruloyl-CoA Synthetase und der Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase, die aus den erfindungsgemäßen Enzymen mit einer Amino- säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 bestehen, eine um 50 % höhere oder verminderte Aktivität ausüben, werden noch als erfindungsgemäß betrachtet.
Die erfindungsgemäßen Enzyme können im Vergleich zu der entsprechenden Region natürlich vorkommender Feruloyl-CoA Synthetasen und der Enoyl-CoA Hydrata- sen/Aldolasen Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen aufweisen, solange sie
zumindest noch eine biologische Aktivität der vollständigen Enzyme ausüben. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:
1. Kleine ahphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro und
Gly;
2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp, Asn, Glu und Gin;
3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys;
4. Große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys; und
5. Aromatische Reste: Phe, Tyr und Tip.
Die folgende Liste zeigt bevorzugte konservative Substitutionen:
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Nukleinsäuren, die für die erfindungsgemäßen Enzyme codieren.
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich insbesondere um einzel- strängige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA). Bevorzugte Ausführungsformen sind Fragmente genomischer DNA, die Introns enthalten können, und cDNAs.
Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren stellen cDNAs dar, welche eine Nukleotidsäuresequenz gemäß SEQ ID NO 1 besitzen.
Nukleinsäuren, welche unter stringenten Bedingungen an die Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 hybridisieren, sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Der Ausdruck "hybridisieren", wie er hierin verwendet wird, beschreibt den Vorgang, bei welchem ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem komplementären Strang eine Basenpaarung eingeht. Auf diese Weise können ausgehend von der hierin offenbarten Sequenzinformation beispielsweise DNA-Fragmente aus anderen Organismen isoliert werden, welche für Enzyme mit der Aktivität von Feruloyl-CoA Synthetasen und/oder Enoyl-CoA Hydratasen/ Aldolasen codieren.
Weiterhin sind von der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren umfasst, die eine zumindest 70 %ige Identität, vorzugsweise 80 %ige Identität, besonders bevorzugt 90 %ige Identität, ganz besonders bevorzugt 95 %ige Identität, mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Nukleotide und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlängen aufweisen.
Der Grad der Identität der Nukleinsäuresequenzen wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms GAP aus dem Programmpaket GCG, Version 9.1 unter Standardeinstellungen (Nucleic Acids Research 12, 387 (1984).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin DNA-Konstrukte, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und einen hetero logen Promotor umfassen.
Der Ausdruck "heterologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der andere Eigenschaften als derjenige Promotor aufweist, der im
Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert. Der Ausdruck "Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich allgemein auf Expressionskontrollsequenzen.
Die Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhängig, ob zur Expression pro- oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden. Beispiele für heterologe Promotoren sind das lac-System, das trp-System, die Haupt-Operator- und Promotorregionen des Phagen lambda, die Kontrollregionen des fd-Hüllproteins, der Promotor der 3-Phosphoglyceratkinase, der frühe oder späte Promotor des SV40, des Adenovirus oder des Cytomegalovirus, der Promotor der Sauren Phosphatase und der Promotor des α-Mating-Faktors der Hefe.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthalten. Als Vektoren können alle in molekularbiologischen Laboratorien verwendete Plasmide, Phasmide,
Cosmide, YACs oder künstliche Chromosomen verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen erfin- dungsgemäßen Vektor enthalten.
Der Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicherweise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren nicht enthalten.
Als Wirtszellen eignen sich sowohl prokaryotische Zellen, wie Bakterien der Gattungen Bacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Streptomyces,
Streptococcus, Staphylococcus, vorzugsweise E. coli, als auch eukaryotische Zellen, wie Hefen der Gattungen Saccharomyces, Candida, Pichia, filamentöse Pilze der Gattungen Aspergillus, Penicillium, oder Pflanzenzellen oder ganze Pflanzen verschiedener Gattungen, wie Nicotiana, Solanum, Brassica, Beta, Capsicum und Vanilla.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Enzyme. Zur Herstellung der Enzyme, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codiert werden, können Wirtszellen, die eine der erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten, unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden. Dabei kann die zu exprimierende Nukleinsäure an die "Codon Usage" der Wirtszellen angepaßt werden. Die gewünschten Enzyme können danach auf übliche Weise aus den Zellen oder dem Kulturmedium isoliert werden. Die Enzyme können auch in in tro-Systemen hergestellt werden.
Ein schnelles Verfahren zum Isolieren der erfindungsgemäßen Enzyme, die von Wirtszellen unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure synthetisiert werden, beginnt mit der Expression eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise affinitätsgereinigt werden kann. Der Fusionspartner kann beispielsweise Glutathion S-Transferase sein. Das Fusionsprotein kann dann an einer
Glutathion-Affinitätssäule gereinigt werden. Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung beispielsweise an Linkern zwischen dem Fusionspartner und dem zu reinigenden erfindungsgemäßen Polypeptid abgetrennt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel-Aminosäuren, wie Arginin- und Lysin-Reste einschließt, die Stellen für eine Spaltung durch Trypsin definieren. Um solche Linker
zu erzeugen, können Standard-Klonierungsverfahren unter Verwendung von Oligo- nukleotiden angewendet werden.
Weitere mögliche Reinigungsverfahren basieren auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z.B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch- Chromatographie und Affinitätschromatographie.
Die Ausdrücke "Isolierung oder Reinigung", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten, dass die erfindungsgemäßen Enzyme von anderen Proteinen oder anderen
Makromolekülen der Zellen abgetrennt werden. Vorzugsweise ist eine die erfindungsgemäßen Enzyme enthaltende Zusammensetzung hinsichtlich des Proteingehalts gegenüber einer Präparation aus den Wirtszellen mindestens 10-fach und besonders bevorzugt mindestens 100-fach angereichert.
Die erfindungsgemäßen Enzyme können auch ohne Fusionspartner mit Hilfe von Antikörpern, die an die Enzyme binden, affinitätsgereinigt werden.
Ferner sind auch Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auf die übliche Weise hergestellt werden. Beispielsweise können die Nuklein- säuremoleküle vollständig chemisch synthetisiert werden. Man kann auch nur kurze Stücke der erfindungsgemäßen Sequenzen chemisch synthetisieren und solche Oligo- nukleotide radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren. Die markierten Oligonukleotide können verwendet werden, um ausgehend von Bakterien oder
Pflanzen-mRNA hergestellte cDNA-Banken oder ausgehend von genomischer Bakterien oder Pflanzen-DNA hergestellte genomische Banken zu durchsuchen. Klone, an die die markierten Oligonukleotide hybridisieren, werden zur Isolierung der betreffenden DNA ausgewählt. Nach der Charakterisierung der isolierten DNA erhält man auf einfache Weise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auch mittels PCR- Verfahren unter Verwendung chemisch synthetisierter Oligonukleotide hergestellt werden.
Der Ausdruck "Oligonukleotid(e)", wie er hierin verwendet wird, bedeutet DNA- Moleküle, die aus 10 bis 50 Nukleotiden, vorzugsweise 15 bis 30 Nukleotiden, bestehen. Sie werden chemisch synthetisiert und können als Sonden verwendet werden.
Ebenso betrifft die Erfindung die einzelnen Herstellungsschritte der Herstellung von Vanillin aus Ferulasäure:
a) das Verfahren zur Herstellung von Feruloyl-CoenzymA aus Ferulasäure, das in Anwesenheit von Feruloyl-CoA Synthetase stattfindet;
b) das Verfahren zur Herstellung von 4-Hydroxy-3-methoxyphenyl-ß-hydroxy- propionyl CoenzymA aus Feruloyl-CoenzymA, das in Anwesenheit von
Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase stattfindet;
c) das Verfahren zur Herstellung von Vanillin aus 4-Hydroxy-3-methoxyphenyl- ß-hydroxypropionyl-CoenzymA, das in Anwesenheit von Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase stattfindet.
Die oben genannten Herstellungsverfahren basieren auf den genannten isolierten Enzymen oder Zellextrakten, die die genannten Enzyme enthalten.
Ebenso betrifft die Erfindung Herstellungsverfahren basierend auf Wirtszellen enthaltend die oben genannten Gene und Wirtszellen transformiert mit der genannten DNA bzw. den genannten Vektoren.
Bevorzugtes Substrat für die Herstellung von Vanillin mit den oben genannten Wirtszellen ist Ferulasäure. Jedoch kann der Zusatz weiterer Substrate oder sogar der
Austausch der Ferulasäure gegen ein anderes Substrat möglich sein.
Als Nährmedium für die erfindungsgemäß eingesetzten Wirtszellen kommen synthetische, halbsynthetische oder komplexe Kulturmedien in Betracht. Diese können kohlenstoffhaltige und stickstoffhaltige Verbindungen, anorganische Salze, gegeben- enfalls Spurenelemente sowie Vitamine enthalten.
Als kohlenstoffhaltige Verbindungen können Kohlenhydrate, Kohlenwasserstoffe oder organische Grundchemikalien in Betracht kommen. Beispiele für vorzugsweise verwendbare Verbindungen sind Zucker, Alkohole bzw. Zuckeralkohole, organische Säuren oder komplexe Gemische.
Als Zucker kommt vorzugsweise Glucose in Betracht. Als organische Säuren können vorzugsweise Zitronensäure oder Essigsäure zum Einsatz kommen. Zu den komplexen Gemischen zählen z.B. Malzextrakt, Hefeextrakt, Casein oder Caseinhydro- lysat.
Als stickstoffhaltige Substrate kommen anorganische Verbindungen in Betracht. Beispiele hierfür sind Nitrate und Ammoniumsalze. Ebenso können organische Stickstoffquellen zum Einsatz kommen. Hierzu zählen Hefeextrakt, Sojamehl, Casein, Caseinhydrolysat und Maisquellwasser.
Zu den einsetzbaren anorganischen Salzen zählen beispielsweise Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate und Phosphate. Als Metalle enthalten die genannte Salze vorzugsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Mangan, Calcium, Zink und Eisen.
Die Temperatur für die Kultivierung liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 100°C. Besonders bevorzugt ist der Bereich von 15 bis 60°C, höchst bevorzugt sind 22 bis 45°C.
Der pH- Wert des Mediums beträgt bevorzugt 2 bis 12. Besonders bevorzugt ist der
Bereich von 4 bis 8.
Grundsätzlich können für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens alle dem Fachmann bekannten Bioreaktoren eingesetzt werden. Vorzugsweise kommen alle für Submersverfahren geeigneten Vorrichtungen in Betracht. Das heißt, es kön- nen erfindungsgemäß Gefäße ohne oder mit mechanischer Mischeinrichtung eingesetzt werden. Zu ersteren zählen z.B. Schüttelapparaturen, Blasensäulen- oder Schlaufenreaktoren. Zu letzteren gehören vorzugsweise alle bekannten Vorrichtungen mit Rührern in beliebiger Gestaltung.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden. Die Dauer der Fermentation bis zum Erreichen einer maximalen Produktmenge hängt von der speziellen Art der eingesetzten Wirtszellen ab. Grundsätzlich liegen die Zeiten der Fermentation jedoch zwischen 2 und 200 Stunden.
Die Erfindung ermöglicht die Herstellung von Vanillin aus Ferulasäure mit beliebigen Wirtszellen.
Beispiele:
Vorgehensweise:
Von dem Ferulasäure verwertenden Stamm Pseudomonas sp. HR199 wurden nach
NMG-Mutagenese Mutanten erhalten, die Defekte in einzelnen Schritten des Ferula- säure-Katabolismusses aufwiesen. Ausgehend von partiell EcoRI-verdauter Gesamt- DNA des Amycolatopsis sp. HR167 Wildtyps wurde eine Genbank in dem Cosmid pVKIOO angelegt, welches über ein breites Wirtsspektrum verfügt und auch in Pseudomonaden stabil repliziert wird. Die Hybridcosmide wurden nach Verpackung in λ-Phagenpartikel nach Escherichia coli S17-1 transduziert. Die Genbank umfaßte 5000 rekombinante E. coli S17-1 Klone. Das Hybridcosmid eines jeden Klons wurde konjugativ in zwei Ferulasäure-negative Mutanten (Mutanten SK6167 und SK6202) des Stammes Pseudomonas sp. HR199 übertragen und auf eine mögliche Fähigkeit zur Komplementation überprüft. Dabei wurden die Hybridcosmide pVKl-1, pVK12-
1, pVK15-l identifiziert, deren Erhalt die Mutanten SK6167 und SK6202 wieder in die Lage versetzten Ferulasäure zu verwerten.
Die komplementierende Eigenschaft der Plasmide pVKl-1, pVK12-l, pVK15-l konnte auf ein 20 kbp EcoRI-Fragment (Ε200) zurückgeführt werden. Auf einem 4 kbp Estl-Subfragment (P40) wurden die Gene ye_- und ech lokalisiert, die für die Feruloyl-CoA Synthetase und Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase codieren.
Durch Expression dieser Gene waren rekombinante Stämme von E. coli XLl-Blue in der Lage Ferulasäure in Vanillin zu überführen.
Material und Methoden:
Wachstumsbedingungen der Bakterien. Stämme von Escherichia coli wurden bei 37°C in Luria-Bertani (LB) oder M9-Mineralmedium (Sambrook, J. E. F. Fritsch und
T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2. Aufl., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.) angezogen. Stämme von Pseudomonas sp. wurden bei 30°C in Nutrient Broth (NB, 0,8 %, wt/vol) oder in Mineralmedium (MM) (Schlegel, H. G. et al. 1961. Arch. Mikrobiol. 38:209-222) angezogen. Stämme von Amycolatopsis sp. wurden bei 42°C in Hefeextrakt-Malz- extrakt-Glucose-Medium (YMG, Hefeextrakt 0,4 %, wt/vol, Malzextrakt 1 %, wt/vol, Glucose 0,4 %, wt/vol, pH 7,2) angezogen. Ferulasäure, Vanillin, Vanillinsäure und Protocatechusäure wurden in Dimethylsulfoxid gelöst, und dem jeweiligen Medium in einer Endkonzentration von 0,1 % (wt/vol) zugesetzt. Bei der Anzucht von Transkonjuganten von Pseudomonas sp. wurden Tetracyclin und Kanamycin in Endkonzentrationen von 25 μg/ml bzw. 300 μg/ml eingesetzt.
Nitrosoguanidin-Mutagenese. Die Nitrosoguanidin-Mutagenese von Pseudomonas sp. HR199 wurde mit Modifikationen nach Miller (Miller, J. H. 1972. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.) durchgeführt. An Stelle des Citrat-Puffers kam Kalium-Phosphat (KP)-Puffer
(100 mM, pH 7,0) zum Einsatz. Die Endkonzentration von N-Methyl-N'-Nitro-N- Nitrosoguanidin betrug 200 μg/ml. Die erhaltenen Mutanten wurden hinsichtlich des Verlustes der Fähigkeit Ferulasäure als Wachstumssubstrate nutzen zu können ge- screent.
Qualitativer und quantitativer Nachweis von Stoffwechselintermediaten in Kulturüberständen. Kulturüberstände wurden direkt, bzw. nach Verdünnung mit H2O- bidest. mittels Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (Knauer-HPLC) analysiert. Die Chromatographie erfolgte an Nucleosil-100 C18 (7 μm, 250 x 4 mm). Als Lösungsmittel diente 0,1 % (vol/vol) Ameisensäure und Acetonitril. Der verwendete
Gradient zur Elution der Substanzen verlief wie folgt. 00:00 - 06:30 — > 26 % Acetonitril 06:30 - 08:00 — > 100 % Acetonitril 08:00 - 12:00 — > 100 % Acetonitril 12:00 - 13:00 — > 26 % Acetonitril
13 : 00 - 18 : 00 — > 26 % Acetonitril
Bestimmung der Feruloyl-CoA-Synthetase (Ferulasäure-Thiokinase)-Aktivität. Die Bestimmung der FCS-Aktivität erfolgte bei 30°C durch einen optisch enzymatischen Test, modifiziert nach Zenk et al. (Zenk et al. 1980. Anal. Biochem. 101:182-187). Der Reaktionsansatz mit einem Volumen von 1 ml enthielt 0,09 mmol Kalium-Phosphat (pH 7,0), 2,1 mmol MgCl2, 0,7 mmol Ferulasäure, 2 mmol ATP, 0,4 mmol Coenzym A und Enzymlösung. Die Entstehung des CoA-Esters aus Ferulasäure wurde bei λ = 345 nm verfolgt (ε = 10 cm^/mmol). Die Enzymaktivität wurde in Einheiten (U) angegeben, wobei 1 U der Enzymmenge entspricht, die 1 mmol Substrat pro Minute umsetzt. Die Proteinkonzentrationen in den Proben wurden nach
Lowry et al. (Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A. L. Farr und R. J. Randall. 1951. J. Biol. Chem. 193:265-275) bestimmt.
Elektrophoretische Methoden. Die Auftrennung von proteinhaltigen Extrakten erfolgte unter denaturierenden Bedingungen in 11,5 % (wt/vol) Polyacrylamidgelen nach der Methode von Laemmli (Laemmli, U. K. 1970. Nature (London) 227:680- 685). Zur unspezifischen Proteinfärbung wurde Serva Blue R verwendet.
Transfer von Proteinen aus Polyacrylamidgelen auf PVDF-Membranen. Proteine wurden aus SDS-Polyacrylamidgelen mit Hilfe eines Semidry-Fastblot Gerätes
(B32/33, Biometra, Göttingen, Deutschland) nach Herstellerangaben auf PVDF- Membranen (Waters-Millipore, Bedford, Mass., USA) übertragen.
Bestimmung von N-terminalen Aminosäuresequenzen. Die Bestimmung von N- terminalen Aminosäuresequenzen erfolgte mit Hilfe eines Protein Peptide
Sequenzers (Typ 477 A, Applied Biosystems, Foster City, USA) und eines PTH- Analysers nach Herstellerangaben.
Isolierung und Manipulation von DNA. Die Isolierung von genomischer DNA er- folgte nach der Methode von Marmur (Marmur, J. 1961. J. Mol. Biol. 3:208-218).
Die Isolierung und Analyse von Plasmid-DNA bzw. von DNA-Restriktionsfrag-
menten, die Verpackung von Hybridcosmiden in λ-Phagenpartikel und die Trans- duktion von E. coli erfolgten nach Standardmethoden (Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York.).
Transfer von DNA. Präparation und Transformation von kompetenten Escherichia co/.-Zellen erfolgten nach der Methode von Hanahan (Hanahan, D. 1983. J. Mol. Biol. 166:557-580). Konjugativer Plasmidtransfer zwischen Plasmid-tragenden Escherichia coli S 17-1 -Stämmen (Donor) und Pseudomonas sp.-Stämmen (Rezipient) erfolgte auf NB-Agarplatten nach der Methode von Friedrich et al.
(Friedrich, B. et al. 1981. J. Bacteriol. 147:198-205), oder durch eine "Mini- komplementations-Methode" auf MM-Agarplatten mit 0,5 % (wt/vol) Gluconat als C-Quelle und 25 μg/ml Tetracyclin oder 300 μg/ml Kanamycin. Dabei wurden Zellen des Rezipienten in einer Richtung als Impfstrich aufgetragen. Nach 5 min wurden dann Zellen der Donor-Stämme als Impfstriche aufgetragen, wobei der
Rezipienten-Impfstrich gekreuzt wurde. Nach einer Inkubation für 48 h bei 30°C wuchsen die Transkonjuganten direkt hinter der Kreuzungsstelle, wohingegen weder Donor- noch Rezipienten-Stamm zum Wachstum in der Lage war.
DNA-Sequenzierung. Die Bestimmung von Nukleotidsequenzen erfolgte nach der
Didesoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (Sanger et al. 1977. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-5467) mit einem "LI-COR DNA-Sequencer Modell 4000L" (LI-COR Inc., Biotechnology Division, Lincoln, NE, USA) unter Verwendung eines "Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza- dGTP" (Amersham Life Science, Amersham International pls, Little Chalfont,
Buckinghamshire, England) jeweils nach Vorschrift des Herstellers bestimmt.
Mit Hilfe von synthetischen Oligonukleotiden wurden nach der "Primer-hopping Strategie" von Strauss et al. (Strauss, E. C. et al. 1986. Anal. Biochem. 154:353-360) beide DNA-Stränge sequenziert.
Chemikalien, Biochemikalien und Enzyme. Restriktionsenzyme, T4 DNA-Ligase, Lambda-DNA und Enzyme bzw. Substrate für die optisch enzymatischen Tests wurden von C. F. Boehringer & Söhne (Mannheim, Deutschland) oder von GIBCO/BRL (Eggenstein, Deutschland) bezogen. Agarose vom Typ NA wurde von Pharmacia-LKB (Uppsala, Schweden). Alle anderen Chemikalien waren von
Haarmann & Reimer (Holzminden, Deutschland), E. Merck AG (Darmstadt, Deutschland), Fluka Chemie (Buchs, Schweiz), Serva Feinbiochemica (Heidelberg, Deutschland) oder Sigma Chemie (Deisenhofen, Deutschland).
Beispiel 1
Isolierung von Mutanten des Stammes Pseudomonas sp. HR199 mit Defekten im Ferulasäure-Katabolismus
Der Stamm Pseudomonas sp. HR199 wurde einer Nitrosoguanidin-Mutagenese unterzogen mit dem Ziel Mutanten mit Defekten im Ferulasäure-Katabolismus zu isolieren. Die erhaltenen Mutanten wurden bezüglich ihres Vermögens Ferulasäure und Vanillin als C- und Energiequelle nutzen zu können klassifiziert. Die Mutanten SK6167 und SK6202 waren nicht mehr in der Lage Ferulasäure als C- und Energie- quelle zu nutzen, vermochten jedoch wie der Wildtyp Vanillin zu verwerten. Die o.g.
Mutanten kamen bei Konjugationsexperimenten als Rezipienten der Genbank von Amycolatopsis sp. HR167 zum Einsatz.
Beispiel 2
Anlegen einer Amycolatopsis sp. HR167 Genbank im Cosmidvektor pVKIOO
Die genomische DNA des Stammes Amycolatopsis sp. HR167 wurde isoliert und einer partiellen Restriktionsverdauung mit EcoRI unterzogen. Die so erhaltene DNA- Präparation wurde mit EcoRI-geschnittenem Vektor pVKIOO ligiert. Die DNA-
Konzentrationen lagen dabei relativ hoch, um die Entstehung konkatemerer Liga-
tionsprodukte zu forcieren. Die Ligationsansätze wurden in λ-Phagenpartikel verpackt, mit denen anschließend E. coli S17-1 transduziert wurde. Die Selektion der Transduktanten erfolgte auf Tetracyclin-haltigen LB-Agarplatten. Auf diese Weise wurden 5000 Transduktanten erhalten, die über unterschiedliche Hybridcosmide verfügten.
Beispiel 3
Identifizierung von Hybridcosmiden, die essentielle Gene des Ferulasäure-Katabo- lismus beherbergen
Die Hybridcosmide der 5000 Transduktanten wurden durch ein Minikomplemen- tations- Verfahren konjugativ in die Mutanten SK6167 und SK6202 übertragen. Die erhaltenen Transkonjuganten wurden auf MM-Platten mit Ferulasäure bezüglich ihres Vermögens wieder auf Ferulasäure wachsen zu können (Komplementation der
Mutanten) untersucht. Die Mutanten SK6167 und SK6202 wurde durch den Erhalt der Hybridcosmide pVKl-1, pVK12-l, pVK15-l komplementiert. Die komplementierende Eigenschaft war auf ein 20 kbp EcoRI-Fragment zurückzuführen.
Beispiel 4
Analyse des 20 kbp EcoRI-Fragments (Ε200) des Hybridcosmids pVKl-1
Das Fragment E200 wurde präparativ aus dem mit EcoRI-verdautem Hybridcosmid pVKl-1 isoliert und mit EcoRI- verdauter pBluescript SK~ DNA ligiert. Mit dem
Ligationsansatz wurde E. coli XLl-Blue transformiert. Nach "Blau-Weiß"-Selektion auf X-Gal und IPTG enthaltenden LB-Tc-Amp-Agarplatten wurden "weiße" Transformanden erhalten, deren Hybridplasmid pSKΕ200 das Fragment E200 kloniert enthielten. Mit Hilfe dieses Plasmids und durch Einsatz unterschiedlicher Restriktions- enzyme wurde eine physikalische Karte des Fragments E200 angefertigt.
Der die Mutanten SK6167 und SK6202 komplementierende Bereich wurde durch Klonierung von Subfragmenten von E200 in den Vektoren pVKIOl und pMP92, die beide über ein weites Wirtsspektrum verfügen und auch in Pseudomonaden stabil sind, mit anschließender konjugativer Übertragung in die Mutanten SK6167 und SK6202 auf ein 4 kbp Pstl-Subfragment (P40) eingegrenzt. Nach Klonierung dieses
Fragments in pBluescript SK" wurde die Nukleotidsequenz bestimmt, wobei die Gene fcs und ech identifiziert wurden, die für die Feruloyl-CoA Synthetase und Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase codieren. Das fcs Genprodukt von 491 Aminosäuren wies eine 35 %ige Identität (über einen Bereich von 491 Aminosäuren) mit dem fαdD13 Genprodukt aus Mycobacterium tuberculosis (Cole et al. 1998. Nature
393:537-544) auf. Das ech Genprodukt von 287 Aminosäuren wies eine 62 %ige Identität (über einen Bereich von 267 Aminosäuren) mit der p-hydroxycinnamoyl CoA hydratase/lyase aus Pseudomonas fluorescens (Gasson et al. 1998. Metabolism of ferulic acid to vanillin. J. Biol. Chem. 273:4163-4170) auf.
Beispiel 5
Heterologe Expression von Genen des Ferulasäure-Katabolismus aus Amycolatopsis sp. HR167 in Escherichia coli
Das 4 kbp Estl-Subfragment (P40) wurde präparativ aus dem mit Pstl-verdautem Hybridplasmid pSKE200 isoliert und mit Estl-verdauter pBluescript SK" DNA ligiert. Mit dem Ligationsansatz wurde E. coli XLl-Blue transformiert. Nach "Blau- Weiß"-Selektion auf X-Gal und Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG) enthal- tenden LB-Tc-Amp-Agarplatten wurden "weiße" Transformanden erhalten, deren
Hybridplasmid pSKP40 das Fragment P40 kloniert enthielten. Die rekombinanten Stämme von E. coli XLl-Blue wiesen eine Feruloyl-CoA Synthetase Aktivität von 0,54 U/mg Protein auf.
Beispiel 6
Biotransformation von Ferulasäure zu Vanillin mit ruhenden Zellen des rekombinanten Stammes von Escherichia coli XLl-Blue (pSKP40), der das fcs und ech Gen aus Amycolatopsis sp. HR167 exprimiert
E. coli XLl-Blue (pSKP40) wurde in 50 ml LB-Medium mit 12,5 μg/ml Tetracyclin und 100 μg/ml Ampicillin bei 37°C für 24 h kultiviert. Die Zellen wurden steril geerntet, mit 100 mM Kalium-Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und in 50 ml HR- MM mit 5,15 mM Ferulasäure resuspendiert. Nach 6 h waren 2,3 mM Vanillin, nach
8 h 2,8 mM und nach 23 h 3,1 mM Vanillin im Kulturüberstand nachweisbar.
Erläuterungen zum Sequenzprotokoll:
SEQ ID NO: 1 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der Feruloyl-CoA Synthetase und der Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase-cDNAs. SEQ ID NO: 2, und SEQ ID NO: 3 zeigen ferner die Aminosäuresequenzen der von den Feruloyl-CoA
Synthetase und der Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase-cDNA-Sequenzen abgeleiteten Proteine.
Claims
1. Enzyme aus Amycolatopsis sp. für die Synthese von Vanillin aus Ferulasäure.
2. Enzyme nach Anspruch 1 ausgewählt aus der Gruppe der Feruloyl-CoA
Synthetasen oder Enoyl-CoA Hydratase/ Aldolasen.
3. Enzyme nach den Ansprüchen 1 und 2, welche die Aktivität einer Feruloyl- CoA Synthetase ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 70 %ige Identität mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 über eine Länge von wenigstens 20 fortlaufenden Aminosäuren aufweisen.
4. Enzyme nach den Ansprüchen 1 und 2, welche die Aktivität einer Enoyl- CoA Hydratase/Aldolase ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 70 %ige Identität mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO:
3 über eine Länge von wenigstens 20 fortlaufenden Aminosäuren aufweisen.
5. Nucleinsäure umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Enzym gemäß der Ansprüche 1 bis 4 codiert und funktioneile Äquivalente davon.
6. Nucleinsäure gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA handelt.
7. Nucleinsäure nach den Ansprüchen 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Fragmente genomischer DNA oder cDNA handelt.
8. Nucleinsäure nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 über eine Länge von wenigstens 20 Nucleotide mit einer zumindest 70 %igen Identität entspricht.
. DNA-Konstrukt umfassend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 und einen heterologen Promotor.
10. Vektor umfassend eine Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 oder ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 9.
11. Cosmidklone, enthaltend eine Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9.
12. Wirtszelle, enthaltend eine Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 oder ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 9 oder 10.
13. Wirtszelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine prokaryotische Zelle handelt.
14. Wirtszelle nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Escherichia coli handelt.
15. Wirtszelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine eukaryotische Zelle handelt.
16. Wirtszelle nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen einzellig oder filamentös wachsenden Pilz handelt.
17. Wirtszelle nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um
Pflanzenzellen handelt.
18. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms gemäß der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, umfassend a) das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 12 bis 17 unter Bedingungen, die die Expression der Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 gewährleistet, oder b) das Exprimieren einer Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 11 in einem in-vitro System, und c) die Gewinnung des Enzyms aus der Zelle, dem Kulturmedium oder dem w-v/tro-System.
19. Verfahren zur Herstellung von Feruloyl-CoenzymA aus Ferulasäure, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in Anwesenheit von Feruloyl-CoA
Synthetase stattfindet.
20. Verfahren zur Herstellung von 4-Hydroxy-3-methoxyphenyl-ß-hydroxy- propionyl-CoenzymA, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in Anwe- senheit von Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase stattfindet
21. Verfahren zur Herstellung von Vanillin aus 4-Hydroxy-3-methoxyphenyl-ß- hydroxypropionyl-CoenzymA, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in Anwesenheit von Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase stattfindet.
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| AK | Designated states |
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| AL | Designated countries for regional patents |
Kind code of ref document: A3 Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG |
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| WWE | Wipo information: entry into national phase |
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| WWE | Wipo information: entry into national phase |
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| REG | Reference to national code |
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