JP6594205B2 - バニリンシンターゼ - Google Patents
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Description
本発明は、バニリンの製造方法ならびに、かかる製造に有用な、微生物または植物などの宿主生物に関する。
バニラは世界で最も人気のあるフレーバー化合物であり、多くの食品を含む多数の商用製品で使用されている。天然のバニラは、単子葉植物のラン目に含まれるラン属に属する、着生登攀性ランVanilla planifolia AndrewsおよびVanilla tahitensisの鞘から得られる。バニリン(3−メトキシ−4−ヒドロキシベンズアルデヒド)が、発酵バニラ鞘から得られるバニラ抽出物中の主要なフレーバー化合物である。バニリンは、高濃度では生きている細胞に毒性である。鞘の中で、バニリンは非毒性のファイトアンティシピン(phytoanticipin)バニリングルコシドとして蓄積し、これは組織が損傷されると、活性な防御化合物に変換される。フレーバー成分として使用するためのバニラ鞘の発酵および保蔵処理中、バニリングルコシドの大部分は加水分解されて、遊離バニリンが提供される。バニリンについての推定の総世界市場は、年間10500トンである。バニラ鞘からの天然バニリンの生産は、困難で時間およびコストのかかるプロセスである。1kgのバニリンの生産には約500kgのバニラ鞘が必要であり、これは約40,000の花の受粉に対応する。今日、世界のバニリン生産のわずか3%がバニラ鞘からのものである。大半はオイゲノールなどの異なる化石炭化水素から、またはリグニンの酸加水分解により、合成的に生産されている。バニラ蘭における経路をコードする遺伝子の異種発現を用いた、微生物における、バニリンの生物工学的生産は未だに達成されておらず、その理由は、遺伝子が同定されていないからである。代わりにバニリンは、酵母、真菌、細菌、およびin vitroの細胞培養物において、バニリンと構造的に関連する外因的に添加された基質から、組み合わせによりバニリンを形成するであろう酵素をコードする、他の生物からの遺伝子を発現させることによって、生産されている。
天然のバニラにおける2つの主要な芳香化合物は、p−ヒドロキシベンズアルデヒドとバニリンである。p−ヒドロキシベンズアルデヒドはバニリンと同じ構造的要素の一部を含むため、バニリンの前駆体と考えられている。バニリンからの経路は、すべてがフェニルアラニン由来の代謝産物の代謝グリッドを構成すると仮定されている。US2003/0070188には、胚形成細胞培養においてVanilla planifoliaからp−ヒドロキシベンズアルデヒドを生産する可能性のある方法が記載されている。US2003/0070188に記載された1つの方法は、p−クマル酸の鎖短縮を触媒してp−ヒドロキシベンズアルデヒドを生成することができると記載されている、4−ヒドロキシ−ベンズアルデヒドシンターゼ(4-HBS)を利用する。文献はさらに、クリーピングベントグラスでの4-HBSの発現を記載するが、しかし、かかる発現の結果に関してはいかなる情報も提供されていない。また4−ヒドロキシベンズアルデヒドは、4-HBSを発現する酵母において検出できなかったことが記載されている。
Podstolski et al., 2002には、4−ヒドロキシ−ベンズアルデヒドシンターゼ(4-HBS)が、チオール試薬の存在下で補因子を必要とすることなく、4−クマル酸を4−ヒドロキシベンズアルデヒドに非酸化的に変換することが記載されている。
本発明は、フェルラ酸またはフェルラ酸誘導体をバニリンに変換することができる酵素(本明細書ではバニリンシンターゼと称する)を提供する。この酵素は、多数の異なる宿主生物およびin vitroにおいて、バニリンの製造に用いることができる。
したがって、本発明の一側面は、フェルラ酸からバニリンを製造する方法であって、ここで方法は、バニリンシンターゼを発現する宿主生物の使用を含み、およびフェルラ酸を前記宿主生物に添加してもよく、または前記宿主生物がフェルラ酸を生成することができる、前記方法を提供する。
a)微生物を提供すること、ここで前記微生物は、
i.フェルラ酸を生成することができ;および
ii.配列番号1のバニリンシンターゼ(VpVAN)またはこれと少なくとも80%の配列同一性を共有するその機能的相同体をコードする異種核酸を含み;および
b)前記微生物を、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること、
c)バニリンおよび/またはバニリングルコシドを、微生物から、および/または培養培地から単離すること、
を含む、前記方法を提供する。
a)微生物を提供すること、ここで前記微生物は、
i.フェルラ酸および/またはフェルラ酸誘導体を生成することができ;および
ii.バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素であり;および
b)前記微生物を、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること、
c)バニリンおよび/またはバニリングルコシドを、微生物から、および/または培養培地から単離すること、
を含む、前記方法を提供する。
i.フェルラ酸を生成することができ;および
ii.バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号1のVpVAN、またはこれと少なくとも70%、例えば少なくとも80%の配列同一性を共有するその機能的相同体である。
a)微生物を提供すること、ここで前記微生物は、配列番号1のバニリンシンターゼ(VpVAN)またはこれと少なくとも80%の配列同一性を共有するその機能的相同体をコードする異種核酸を含み;および
b)前記微生物を、フェルラ酸および/またはフェルラ酸誘導体の存在下で、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること;および
c)バニリンおよび/またはバニリングルコシドを、微生物から、および/または培養培地から単離すること。
a)微生物を提供すること、ここで前記微生物はバニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素であり;および
b)前記微生物を、フェルラ酸および/またはフェルラ酸誘導体の存在下で、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること;および
c)バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび/またはバニリングルコシドを、微生物から、および/または培養培地から単離すること。
a)フェルラ酸および/またはフェルラ酸誘導体を提供すること、
b)前記フェルラ酸および/またはフェルラ酸誘導体を、バニリンシンターゼと接触させること、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号1の(VpVAN)、またはこれと少なくとも80%の配列同一性を共有するその機能的相同体であり、これによりバニリンを製造する、
を含む。
a)配列番号1のVpVANまたはこれと少なくとも80%の配列同一性を共有するその機能的相同体をコードする異種核酸を含む、植物を提供すること;および
b)前記植物を栽培すること;および
c)バニリンを植物から単離すること、
を含む。
a)バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む植物を提供すること、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素であり;および
b)前記植物を栽培すること;および
c)バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび/またはバニリングルコシドを、植物から単離すること、
を含む。
a)バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む植物を提供すること、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号1のVpVAN、またはこれと少なくとも80%の配列同一性を共有するその機能的相同体であり;および
b)前記植物を栽培すること;および
c)植物を動物試料に加工すること、
を含む。
a)可食部を含む植物を提供すること、ここで前記植物は、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号1のVpVAN、またはこれと少なくとも80%の配列同一性を共有するその機能的相同体であり;および
b)前記植物を栽培すること;および
c)前記可食部を収穫すること;
を含み、これによりバニリンの味覚を有する食品を得る。
バニリンシンターゼ
本発明は、バニリンシンターゼおよびその使用に関する。したがって、本発明は特に、本発明のバニリンシンターゼを発現する宿主生物を用いて、バニリンまたはバニリングルコシドを製造する方法にも関する。宿主生物は、本明細書の以下の節「微生物」に記載の任意の微生物であってよく、または宿主生物は、本明細書の以下の節「植物」に記載の任意の植物であってよい。一般に宿主生物は、バニリンシンターゼをコードする異種核酸、および任意に、本明細書の以下に記載の1種または2種以上の追加の異種核酸を含む。
本発明のバニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素である。特に、本発明のバニリンシンターゼは、植物においてin vivoで、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素であることが好ましい。また、バニリンシンターゼは、微生物においてin vivoで、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素であることも好ましい。
フェルラ酸の構造は、本明細書の以下の節「フェルラ酸」に提供される。
本発明で使用されるバニリンシンターゼは、任意の適当な起源からのバニリンシンターゼであってよく、好ましくはバニリンシンターゼは、植物のバニリンシンターゼであって、バニリン、バニリルアルコール、バニリングリコシドおよび/またはバニリルアルコールグリコシドを天然に生成するものである。したがって、一態様において、バニリンシンターゼはVanilla planifoliaのバニリンシンターゼである。
a)バニリン、バニリルアルコール、バニリングリコシドおよび/またはバニリルアルコールグリコシドを生成する植物を、提供すること、
b)前記植物から核酸(例えば、DNAまたはcDNA)を得ること、
c)配列番号1と少なくとも50%、例えば少なくとも60%、例えば少なくとも70%の配列同一性の配列を有するポリペプチドをコードする核酸を同定すること、
d)前記核酸によりコードされたポリペプチドが、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができるかどうかを試験すること。
b)バニリン、バニリルアルコール、バニリングリコシドおよび/またはバニリルアルコールグリコシドを生成する植物からの核酸の配列情報を提供すること、
c)配列番号1と少なくとも50%、例えば少なくとも60%、例えば少なくとも70%の配列同一性の配列を有するポリペプチドをコードする核酸を同定すること、
d)前記核酸によりコードされたポリペプチドが、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができるかどうかを試験すること。
本発明で使用される別のバニリンシンターゼは、配列番号21のバニリンシンターゼ、またはこれと少なくとも70%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも91%、例えば少なくとも92%、例えば少なくとも93%、例えば少なくとも94%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%、例えば100%の配列同一性を有するその機能的相同体である。好ましくは、バニリンシンターゼは、配列番号21のバニリンシンターゼである。配列同一性は、好ましくは、本明細書の以下の節「配列同一性」に記載のようにして算出される。与えられた配列のバニリンシンターゼの機能的相同体は、上記の配列同一性を有し、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる。
a)最N末端の1〜150個の範囲のアミノ酸を欠く、配列番号1のバニリンシンターゼ、
b)最N末端の21〜137個の範囲のアミノ酸を欠く、配列番号1のバニリンシンターゼ、
c)最N末端の120〜140個の範囲のアミノ酸を欠く、配列番号1のバニリンシンターゼ、
d)最N末端の130〜140個の範囲のアミノ酸を欠く、配列番号1のバニリンシンターゼ、
f)最N末端の21個のアミノ酸を欠く、配列番号1のバニリンシンターゼ、
g)最N末端の61個のアミノ酸を欠く、配列番号1のバニリンシンターゼ、
h)最N末端の137個のアミノ酸を欠く、配列番号1のバニリンシンターゼ、
i)最N末端の21個のアミノ酸を欠く、配列番号21のバニリンシンターゼ、
j)最N末端の140個のアミノ酸を欠く、配列番号21のバニリンシンターゼ、
k)上記a)からj)までのいずれかと少なくとも70%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも98%の配列同一性を共有する機能的相同体であって、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる、前記機能的相同体。
a)配列番号1のaa22〜356を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
b)配列番号1のaa138〜356を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
c)配列番号21のaa22〜359を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
d)配列番号21のaa141〜359を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
e)a)からd)までのいずれかと少なくとも70%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも98%の配列同一性を共有する機能的相同体であって、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる、前記機能的相同体。
本発明の別の態様において、バニリンシンターゼは、天然のバニリンシンターゼからの配列および他の配列を含むキメラタンパク質である。本発明のかかる態様において、バニリンシンターゼは次の式で表されるポリペプチドであってよい:
シグナルペプチドは、任意のシグナルペプチドであってよい。当業者はシグナルペプチドを、例えばSignalP 4.1.ソフトウェアを使用して同定することができ、このソフトウェアはTechnical University of DenmarkのCenter for Biological Sequence analysisから容易に入手可能である。
特に、シグナルペプチドは、宿主生物に内因性のシグナルペプチドであることが好ましい(すなわち、前記バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含有する宿主生物)。より好ましくは、シグナルペプチドは、宿主生物に内因性のシステインプロテアーゼからのシグナルペプチドである。さらにより好ましくは、シグナルペプチドは、クラン(Clan)CAに属する、より好ましくはファミリーC1に属する、さらにより好ましくはサブファミリーAに属するシステインプロテアーゼからのシグナルペプチドであり、ここで前記システインプロテアーゼは、宿主生物に内因性である。前記クラン、ファミリーおよびサブファミリーは、MEROPSデータベースで定義された通りである。例えば、システインプロテアーゼは、アリューレイン・システインプロテアーゼのクラスに属するシステインプロテアーゼであってよい。前述の、システインプロテアーゼからのシグナルペプチドであることについては、特に、宿主生物が植物である本発明の態様に適用可能である。
a)ポリペプチドをコードする核酸、またはポリペプチドをコードする核酸の配列情報、または宿主生物のポリペプチドの配列情報を、提供すること、
b)配列番号1と、少なくとも50%、例えば少なくとも60%、例えば少なくとも70%の配列同一性を有し、およびシステインプロテアーゼである、ポリペプチドを同定すること、
c)前記システインプロテアーゼのシグナルペプチドを、例えばSignalP 4.1.ソフトウェアを使用して同定すること、
これにより、シグナルペプチドを同定すること。
切断部位は、任意のプロテアーゼ切断部位であってよい。特に、切断部位は、宿主生物に対して内因性であることが好ましい。より好ましくは、切断部位は、宿主生物に内因性のシステインプロテアーゼからの切断部位である。さらにより好ましくは、切断部位は、クラン(Clan)CAに属する、より好ましくはファミリーC1に属する、さらにより好ましくはサブファミリーAに属するシステインプロテアーゼからの切断部位であり、ここで前記システインプロテアーゼは、宿主生物に内因性である。前記クラン、ファミリーおよびサブファミリーは、MEROPSデータベースで定義された通りである。例えば、システインプロテアーゼは、アリューレイン・システインプロテアーゼのクラスに属するシステインプロテアーゼであってよい。前述の、システインプロテアーゼからの切断部位であることについては、特に、宿主生物が植物である本発明の態様に適用可能である。
a)ポリペプチドをコードする核酸、またはポリペプチドをコードする核酸の配列情報、または宿主生物のポリペプチドの配列情報を、提供すること、
b)配列番号1と、少なくとも50%、例えば少なくとも60%、例えば少なくとも70%の配列同一性を有し、およびシステインプロテアーゼである、ポリペプチドを同定すること、
c)配列番号1と、前記b)で同定されたポリペプチドの間のアラインメントを調製すること、
d)配列番号1のアミノ酸135〜141に対応する前記ポリペプチドのアミノ酸を同定すること、ここで配列番号1のアミノ酸135〜141に対応するアミノ酸は、切断部位である。
異種核酸は、この節に記載された、バニリンシンターゼをコードする任意の異種核酸であってよい。例えば異種核酸は、配列番号2を含む核酸または配列番号2の相補的配列にハイブリダイズ可能な核酸であってよい。
したがって、本発明の一態様は、バニリン、バニリルアルコール、および/またはそのグルコシドを製造する方法に関し、ここで該方法は、以下のステップを含む:
a)微生物を提供すること、ここで前記微生物は、
i.フェルラ酸および/またはフェルラ酸誘導体を生成することができ;および
ii.バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号1の(VpVAN)、またはこれと少なくとも70%、例えば少なくとも80%の配列同一性を共有するその機能的相同体であり;および
b)前記微生物を、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること、
c)バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび/またはバニリングルコシドを、微生物から、および/または培養培地から単離すること。
a)微生物を提供すること、ここで前記微生物はバニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号1の(VpVAN)、またはこれと少なくとも70%、例えば少なくとも80%の配列同一性を共有するその機能的相同体であり;および
b)前記微生物を、フェルラ酸またはフェルラ酸誘導体の存在下で、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること、
c)バニリンおよび/またはバニリングルコシドを、微生物から、および/または培養培地から単離すること。
a)微生物を提供すること、ここで前記微生物は、
i.フェルラ酸および/またはフェルラ酸誘導体を生成することができ;および
ii.バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号1の(VpVAN)、またはこれと少なくとも70%、例えば少なくとも80%の配列同一性を共有するその機能的相同体であり;および
b)前記微生物を、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること、
c)バニリングルコシドを、微生物から、および/または培養培地から単離すること;および
d)前記バニリングルコシドを脱グルコシル化すること。
a)微生物を提供すること、ここで前記微生物は、
i.バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号1の(VpVAN)、またはこれと少なくとも80%の配列同一性を共有するその機能的相同体であり;および
iii.バニリンをグルコシル化することができ;および
b)前記微生物を、フェルラ酸またはフェルラ酸誘導体の存在下で、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること、
c)バニリングルコシドを、微生物から、および/または培養培地から単離すること;および
d)前記バニリングルコシドを脱グルコシル化すること。
微生物は、微生物を培養するのに適した任意の培地で培養することができる。当業者は、特定の微生物に依存して、適切な培地を選択することができるであろう。特に、増殖条件は、バニリンシンターゼが前記微生物中で発現されるように、選択する必要がある。微生物は、流加培養または連続プロセスで増殖させることができる。典型的には、微生物は、所望の時間、所定の温度(単数または複数)で、発酵槽で増殖させる。この方法において使用される特定の微生物に依存して、フェルラ酸および/またはグルコシルトランスフェラーゼの合成に関与する酵素をコードする他の異種核酸もまた、存在することができ、発現されてよい。
本発明の一態様において、培養培地は、クマル酸を高レベルで含有しないことが好ましく、例えば培養培地は、最大で1mM、例えば最大で0.5mM、例えば最大で0.01mMのクマル酸を含んでよく、例えば検出可能なクマル酸を含まない。
この方法は、バニリングルコシドが好ましくはバニリンβ−D−グルコシドである、バニリンまたはバニリングルコシドの製造に関する。製造されるバニリンまたはバニリングルコシドの量は、約1mg/L〜約1,500mg/Lまたはそれ以上であることができる。例えば、約1〜約10mg/L、約3〜約10mg/L、約5〜約20mg/L、約10〜約50mg/L、約10〜約100mg/L、約25〜約500mg/L、約100〜約1,500mg/L、または約200〜約1,000mg/Lのバニリンまたはバニリングルコシド、または、約250〜約5,000mg/L、約1,000〜約15,000mg/L、または約2000〜約50000mg/L、またはさらに約2,000〜約100000mg/L、またはさらに約5,000〜約200,000mg/Lを製造することができる。一般に、より長い培養時間は、より大量の生成物につながる。したがって微生物は、1日〜7日、1日〜5日、3日〜5日、約3日、約4日、または約5日、培養することができる。
いくつかの態様において、バニリンまたはバニリングルコシドを単離し、均質に精製する(例えば、少なくとも90%、92%、94%、96%、または98%純度)。他の態様において、バニリンまたはバニリングルコシドは、微生物からの抽出物として提供される。この点に関し、バニリンまたはバニリングルコシドは単離されるが、必ずしも均質に精製はされない。
単離され、必要に応じて精製されたバニリンまたはバニリングルコシドの抽出物は、例えば食品、栄養補助食品、栄養補給食品、医薬組成物、歯科衛生組成物、および化粧品などのフレーバー消耗品において、使用が見出される。
これは、当技術分野で周知の方法による化学的加水分解によって、または例えばグルコシダーゼ活性を有する酵素の使用により酵素的に、実施することができる。特に、β−グルコシダーゼを使用することができる。多くの適切なβ−グルコシダーゼは、当業者に知られている。脱グルコシル化は、例えば、初めにバニリングルコシドを回収すること、例えばメタノールなどの適切な溶媒中での抽出、または生産する微生物や植物からの排出後のそれらの収集により、回収することによって、実施することができる。第2に、グルコシル化中間体を精製し、in vitroでβ−グルコシダーゼに暴露するか、または適切な化学的加水分解に供することができる。
したがって、精製は、以下のステップを含むことができる:
a)培養培地および/または培養後のバニリングルコシドを含有する微生物の抽出物および/またはバニリングルコシドを含有する植物の抽出物を得ること:および
b)前記培養培地または抽出物を、有機相と接触させ、混合すること、
c)有機相から水相を分離すること;および
d)有機相を廃棄すること;および
e)バニリングルコシドを、本明細書で上述したグルコシダーゼ処理などのグルコシダーゼ処理により、脱グルコシル化して、これによりバニリンを含む液体を得ること;および
f)前記バニリンを含む液体を、有機相と接触させ、混合すること;および
g)バニリンを含む有機層を回収すること;および
h)任意に、バニリンを前記有機層からさらに精製すること。
一態様において、本発明は、バニリン、バニリルアルコール、および/またはそれらのグルコシドを製造する方法に関し、ここで該方法は、以下を含む:
a)配列番号1のVpVANをコードする異種核酸、またはこれと少なくとも80%の配列同一性を共有するその機能的相同体を含む植物を提供すること;および
b)前記植物を栽培すること;および
c)バニリン、バニリルアルコール、および/またはそれらのグルコシドを、植物から分離すること。
この態様において、植物は、本明細書の以下の節「植物」に記載の任意の植物であってよい。バニリンシンターゼをコードする核酸は、本明細書の上記の節「バニリンシンターゼ」に記載の任意のバニリンシンターゼをコードすることができる。好ましい態様において、方法は、バニリンを製造する方法である。
a)配列番号1のVpVANをコードする異種核酸、またはこれと少なくとも80%の配列同一性を共有するその機能的相同体を含む植物を提供すること;および
b)前記植物を栽培すること;および
c)バニリングルコシドを、植物から分離すること、
d)前記バニリングルコシドを脱グルコシル化すること。
植物は、この植物を栽培するのに適した任意の様式で栽培することができる。当業者は、特定の植物を栽培するために適した条件を、選択することができるであろう。
一態様において、前記植物は、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含まない同一の植物と比較して、バニリンを、少なくとも3倍、例えば少なくとも4倍、例えば少なくとも5倍、例えば少なくとも10倍多く生成することが好ましい。
本発明の記載のようにして調製された、バニリンまたは単離されたバニリンを含有する抽出物は、フレーバー消耗品において、例えば食品、栄養補助食品、栄養補給食品、医薬組成物、歯科衛生組成物および化粧品などにおいて、例えば使用を見出す。かかる消耗品の有用な例は、WO2013/022881の段落[0030]から[0046]に記載されている。WO2013/022881は、本明細書中に参照により組み込まれる。
一側面において、本発明は、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む微生物(ここでバニリンシンターゼは、本明細書の上記の節「バニリンシンターゼ」に記載の任意のバニリンシンターゼであってよい)、ならびにそれらの、バニリンおよび/またはバニリングルコシドの生成における使用に関する。
微生物は、バニリンシンターゼをコードする異種核酸に加えて、追加の異種核酸を含むことができ、例えば、フェルラ酸の合成に関与する1または2以上の酵素(例えば、本明細書の以下の節「フェルラ酸の合成に関与する酵素」に記載の、フェルラ酸の合成に関与する任意の酵素)を、またはグルコシルトランスフェラーゼ(本明細書の以下の節「グルコシルトランスフェラーゼ」に記載の任意のグルコシルトランスフェラーゼ)をコードする異種核酸である。
微生物が複数使用される場合、それらは、バニリンおよびバニリングルコシドを生成するための混合培養中で増殖させることができる。このような場合には、適切なトランスポーターの共発現は、中間体を増殖培地中に輸送し、バニリンまたはバニリングルコシドを生成する微生物への取り込みを容易にすることにおいて、有利となり得る。
さらなる態様において、酵母細胞は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Candida glabrata、Ashbya gossypii、Cyberlindnera jadinii、およびCandida albicansからなる群から選択される。一般に、酵母および真菌は、本発明で使用するための優れた微生物細胞である。これらは、遺伝子操作の望ましい容易さおよび、安価な培地上で高い細胞密度への急速な増殖を提供する。例えば酵母は、広範囲の炭素源で増殖し、グルコースには限定されない。したがって、本発明で使用される微生物は、以下に記載の酵母の群から選択することができる:
Candida boidiniiは、メチロトローフ酵母である(メタノールで増殖することができる)。Hansenula polymorphaおよびPichia pastorisなどの他のメチロトローフ種と同様に、異種タンパク質の生産のための優れたプラットフォームを提供する。分泌された外来タンパク質の複数グラム範囲の収率が報告されている。IPROの計算方法により、最近、Candida boidiniiキシロース還元酵素の補因子特異性を、NADPHからNADHに実験的に切り替える変異が予測された。Pythonに実装されたソフトウェアをダウンロードする方法および予測の実験的試験についての詳細は、以下の論文に概説されている。
Kluyveromyces lactisは、ケフィアの製造に通常に適用される酵母である。これはいくつかの糖で増殖することができ、最も重要なことには、牛乳および乳清中に存在する乳糖で増殖する。これは、チーズを製造するための、キモシン(子牛の胃の中に通常存在する酵素)の生産に特に適用されている。生産は、発酵槽にて40,000Lのスケールで行われる。
Saccharomyces cerevisiaeは、醸造、およびベーキングおよびアルコールの生産においてその使用が知られている、伝統的なパン酵母である。タンパク質の工場として、これは、技術的酵素および、インスリンおよびB型肝炎ワクチンなどの医薬品の生産に、成功して適用されている。
Yarrowia lipolyticaは、広範囲の基質で増殖することができる二形性酵母である(Arxula adeninivoransを参照)。これは、産業用途に高い可能性を有しているが、商業的に利用可能な組換え産物はまだ存在しない。
本発明の別の態様において、宿主細胞は、例えばアスペルギルスなどの糸状菌である。
さらに別の態様において、宿主細胞は植物細胞である。宿主細胞は高等植物の細胞であってもよいが、宿主細胞はまた、高等植物に属していない生物からの細胞であってもよく、例えばPhyscomitrella patens(コケニセツリガネゴケ)からの細胞である。
別の態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト、ネコ、ブタ、サル、イヌ、ネズミ、ラット、マウスまたはウサギの細胞である。
宿主細胞はまた、CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b、BHK細胞からなる群から選択することができる。
上述したように、宿主細胞はまた、細菌細胞などの原核細胞であってもよい。細胞が原核細胞の場合、細胞は、限定はされないが、大腸菌、コリネバクテリウム属、バチルス属、シュードモナス属およびストレプトミセス属の細胞から選択してもよい。
いくつかの態様において、本発明のバニリンシンターゼをコードする核酸は、植物または植物細胞に導入されて、バニリンまたはバニリングルコシドまたはバニリルアルコールまたはバニリルアルコールグルコシドを生成する。特に核酸は、Vanilla planifolia以外の植物に導入して、これらの植物においてバニリンの生成を得ることができる。
植物は、バニリンシンターゼをコードする異種核酸に加えて、追加の異種核酸、例えばフェルラ酸の合成に関与する1または2以上の酵素またはグルコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を含んでよい。
本明細書に記載の方法において使用されるバニリンシンターゼをコードする核酸を含む植物細胞は、植物全体の一部または全てを構成することができる。かかる植物は、考慮中の種のための適切な方法で、生育箱(グロースチャンバー)、温室、または野外のいずれかで、成長させることができる。植物は、子孫が異種核酸を継承するのであれば、バニリンシンターゼをコードする核酸を含む最初の植物の子孫であってもよい。トランスジェニック植物により生産された種子を成長させ、その後自家受粉させて(または外部交配および自家受粉させて)、核酸構築物についてホモ接合性の種子を得ることができる。
一過性に形質転換された植物細胞を使用する場合、レポーター活性を有するレポーターポリペプチドをコードするレポーター配列を、形質転換手順に含めることができ、レポーター活性または発現のためのアッセイは、形質転換後の適切な時間に行うことができる。アッセイを行うのに適した時間は、通常、形質転換後約1〜21日、例えば、約1〜14日、約1〜7日、または約1〜3日である。一過性アッセイの使用は、異なる種における迅速な分析のために、または特定のレシピエント細胞において発現が以前に確認されていない異種ポリペプチドの発現を確認するのに、特に便利である。
本発明で使用する、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む植物は、例えば以下から選択してよい:トウモロコシ(Zea. mays)、キャノーラ(Brassica napus、Brassica rapa ssp.)、アルファルファ(Medicago sativa)、イネ(Oryza sativa)、ライ麦(Secale cerale)、ソルガム(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、 ヒマワリ(Helianthus annuas)、コムギ(Tritium aestivumおよび他の種)、ライコムギ、ライ麦(Secale)、大豆(Glycine max)、タバコ(Nicotiana tabacum)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、ピーナッツ(Arachis hypogaea)、綿(Gossypium hirsutum)、サツマイモ(Impomoea batatus)、キャッサバ(Manihot esculenta)、コーヒー(Cofea spp.)、ココナッツ(Cocos nucifera)、パイナップル(Anana comosus)、柑橘類(Citrus spp.)、ココア(Theobroma cacao)、茶(Camellia senensis)、バナナ(Musa spp.)、アボカド(Persea americana)、イチジク(Ficus casica)、グアバ(Psidium guajava)、マンゴー(Mangifer indica)、オリーブ(Olea europaea)、パパイヤ(Carica papaya)、カシューナッツ(Anacardium occidentale)、マカダミア(Macadamia intergrifolia)、アーモンド(Primus amygdalus)、リンゴ(Malus spp)、セイヨウナシ(Pyrus spp)、プラムおよびサクラの木(Prunus spp)、リブス(currant etc.)、ブドウ、キクイモ(Helianthemum spp)、イネ科(Grass family)、砂糖および飼料用ビート(Beta vulgaris)、チコリ、オートムギ、オオムギ、野菜、および観葉植物。
例えば本発明の植物は、作物である(例えば、穀類および豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、タピオカ、イネ、ソルガム、キビ、キャッサバ、オオムギ、エンドウマメ、テンサイ、サトウキビ、大豆、アブラナ、ヒマワリおよびその他の根、塊茎または種子作物)。その他の重要な植物は、スパイスまたは医薬品としての使用のために栽培された、果樹、樹木作物、森の樹木または植物であってもよい(ハッカ属(Mentha spp.)、クローブ、アルテミーシア属(Artemesia spp.)、胸腺属(Thymus spp.)、Lavendula spp.、アリウム属(Allium spp.)、オトギリソウ、ニチニチソウ属(Catharanthus spp.)、ビンカ属(Vinca spp.)、ケシ属(Papaver spp.)、ジギタリス属(Papaver spp.)、Rawolfia spp.、バニラ属、(Petrusilium spp.)、ユーカリ、ティーツリー、トウヒ属(Picea spp.)、マツ属(Pinus spp.)、モミ属(Abies spp.)、ビャクシン属(Juniperus spp.))。本発明と共に使用される園芸植物には、レタス、エンダイブ、ならびにキャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、ニンジン、およびカーネーションおよびゼラニウムなどのアブラナ科野菜を含んでもよい。
植物はまた、例えば油糧種子植物またはマメ科植物などの穀物植物であってもよい。興味ある種子としては、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、ライ麦などの穀物の種子を含む。油糧種子植物は、綿、大豆、ベニバナ、ヒマワリ、アブラナ、トウモロコシ、アルファルファ、ヤシ、ココナッツ等を含む。マメ科植物は、インゲンおよびエンドウを含む。インゲンは、グアー、イナゴマメ、コロハ種子、大豆、ソラマメ(garden beans)、ササゲ、緑豆、ライマメ、ソラマメ(fava beans)、レンズ豆、ヒヨコマメを含む。
本発明のさらなる態様において、前記植物は、次の群から選択される:トウモロコシ、イネ、コムギ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、アブラナ、ジャガイモ、および大豆。したがって植物は、例えばイネであってもよい。
したがって、本発明で使用することができる1つの植物は、Arabidopsis、特にArabidopsis thalianaである。
興味深いことに、本発明は、Vanilla planifoliaとはかなり異なる植物であっても、バニリン、バニリルアルコールおよび/またはバニリングルコシドを生成するように操作できることを実証する。したがって、Vanilla planifoliaは単子葉植物であり、より具体的には着生登攀性ランであるが、本発明は驚くべきことに、双子葉植物でも、バニリン、バニリルアルコールおよび/またはバニリングルコシドを生成可能であることを実証する。このように、本発明の一態様において、宿主生物は双子葉植物である。本発明の好ましい態様において、植物はナス目の植物である。特に植物は、タバコ属の植物であってもよく、例えば植物は、Nicotiana tabacumであってよい。
動物飼料として使用される植物は、動物飼料として有用な任意の植物であってよい。一般に前記植物は、イネ科草本や豆類など草本植物であってよい。前記イネ科草本は、イネ科(Poaceae)やイネ科(Gramineae)の「イネ科植物(true grasses)」、ならびにカヤツリグサ科のスゲまたはイグサ科のイグサなどの任意のイネ科型草本であってもよい。有用なイネ科植物の例としては、例えば、穀物、竹および芝生の草(芝)および草原、例えばスイッチグラスが含まれる。
好ましくは、植物はVanilla planifoliaではなくてよい。また好ましくは、植物は、クリーピングベントグラスではなくてよい。
バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む微生物はまた、バニリンをグルコシル化できてもよい。細菌および真菌などのほとんどの微生物は、天然ではバニリンをグルコシル化することができない。したがって微生物は、少なくとも1種の、好ましくはバニリンのグルコシル化を効率的に触媒するグルコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を、含むことができる。
バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む類似の植物はまた、バニリンをグルコシル化することが可能であり得る。前記植物は、バニリンをグルコシル化可能な内因性のグルコシルトランスフェラーゼ活性を含むことができる。しかし、好ましくは、植物は少なくとも、グルコシルトランスフェラーゼ、好ましくはバニリンのグルコシル化を効率的に触媒することができるグルコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を、含むことができる。
本発明は、バニリンをフェルラ酸から、バニリンシンターゼの支援により製造する方法に関する。方法は、フェルラ酸を生成する微生物または植物の使用を採用してもよく、またはフェルラ酸を、微生物または植物に外因的に添加してもよい。
一部の微生物および多くの植物は、フェルラ酸を天然に生成して蓄積する。しかし、例えばほとんどの細菌または真菌などの他の微生物は、フェルラ酸を天然に生成しない。したがって、フェルラ酸の内因性生成に必要なすべての酵素をコードする遺伝子を天然に発現しない細菌または真菌に関連する本発明の態様において、方法は、前記細菌または真菌を、フェルラ酸を増殖培地に添加することにより、フェルラ酸と接触させることを含んでよい。フェルラ酸を天然に生成しない細菌または真菌に関連する本発明の態様において、前記細菌または真菌は、フェルラ酸の合成に関与する1または2以上の酵素を発現するように操作することができる。さらに本発明に含まれるのは、フェルラ酸の合成に関与する1または2以上の酵素を発現するように操作された1種の微生物を、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む微生物と共に用いることであり、例えば、これらは共培養される。
フェルラ酸の合成に関与する酵素は、例えば、以下からなる群から選択することができる:フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、trans−桂皮酸4−モノオキシゲナーゼ、チロシンアンモニアリアーゼ、4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼ、カフェ酸O−メチルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、trans−桂皮酸4−モノオキシゲナーゼ、クマル酸−CoAリガーゼ、シキミ酸O−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼ、カフェオイル−CoA O−メチルトランスフェラーゼ、カフェ酸O−メチルトランスフェラーゼ、およびフラボン3’−O−メチルトランスフェラーゼ。これらの酵素の各々は、本明細書で以下により詳細に記載されている。
フェルラ酸の生合成のための1つの経路(本明細書において、フェルラ酸経路1とする)は、以下の酵素を含む:
ステップ2:trans−桂皮酸4−モノオキシゲナーゼ(桂皮酸4−ヒドロキシラーゼ)、これは、本明細書の以下に記載の任意のtrans−桂皮酸4−モノオキシゲナーゼであってよい。
ステップ3:4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意の4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼであってよい。
本発明の微生物、例えば酵母細胞または細菌は、フェルラ酸経路1の1つの酵素をコードする少なくとも1種の異種核酸を含んでよく、例えば、それぞれがフェルラ酸経路1の異なる酵素をコードする少なくとも2種の異種核酸、例えばそれぞれがフェルラ酸経路1の異なる酵素をコードする少なくとも3種の核酸を含んでよい。特に、微生物、例えば酵母細胞または細菌は、それぞれがフェルラ酸経路1の異なる酵素をコードする4種の異種核酸を含んでよい。
ステップ1+2:チロシンアンモニアリアーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のチロシンアンモニアリアーゼであってよい。
ステップ3:4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意の4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼであってよい。
本発明の微生物、例えば酵母細胞または細菌は、経路2の1つの酵素をコードする少なくとも1種の異種核酸を含んでよく、例えば、それぞれが経路2の異なる酵素をコードする少なくとも2種の異種核酸を含んでよい。特に、微生物、例えば酵母細胞または細菌は、それぞれがフェルラ酸経路2の異なる酵素をコードする3種の異種核酸を含んでよい。
ステップ1:フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のフェニルアラニンアンモニアリアーゼであってよい。
ステップ2:trans−桂皮酸4−モノオキシゲナーゼ(桂皮酸4−ヒドロキシラーゼ)、これは、本明細書の以下に記載の任意のtrans−桂皮酸4−モノオキシゲナーゼであってよい。
ステップ4:シキミ酸O−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のシキミ酸O−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼであってよい。
ステップ5:4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意の4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼであってよい。
ステップ7:カフェオイル−CoA O−メチルトランスフェラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のカフェオイル−CoA O−メチルトランスフェラーゼであってよい。
ステップ1+2:チロシンアンモニアリアーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のチロシンアンモニアリアーゼであってよい。
ステップ4:シキミ酸O−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のシキミ酸O−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼであってよい。
ステップ6:シキミ酸O−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のシキミ酸O−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼであってよい。
ステップ7:カフェオイル−CoA O−メチルトランスフェラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のカフェオイル−CoA O−メチルトランスフェラーゼであってよい。
1)バニリルアルコールオキシダーゼ(VAO)、これは、本明細書の以下に記載の任意のVAOであってよい。
この経路は、オイゲノールから開始される。したがって微生物がオイゲノールを合成しない場合には、微生物をオイゲノールの存在下で培養することが好ましい。VAOに加えて、微生物は好ましくは、コニフェリルアルコールの転換を触媒してフェルラ酸を形成することができる酵素を含む。かかる酵素は、多くの微生物、例えばS. cerevisiaeにおいて、内因的に存在している。フェルラ酸経路5に関する詳細は、Lambert et al., 2013, Flavor and Fragrance Journal, DOI 10.1002/ffj.3171に記載されている。
本発明で使用されるフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、当業者に知られている任意のフェニルアラニンアンモニアリアーゼであってよい。特に、フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、EC 4.3.1.24に分類される酵素であってよい。
したがって、本発明によるフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、好ましくは、次の反応を触媒することができる酵素である:
したがって、フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号4のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、またはこれと少なくとも70%、例えば少なくとも75%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも91%、例えば少なくとも92%、例えば少なくとも93%、例えば少なくとも94%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%、例えば100%の配列同一性を共有する、その機能的相同体であってよい。配列同一性は、好ましくは、本明細書の以下の節「配列同一性」に記載のようにして算出される。
本発明で使用されるtrans−桂皮酸4−モノオキシゲナーゼは、当業者に知られている任意のtrans−桂皮酸4−モノオキシゲナーゼであってよい。trans−桂皮酸4−モノオキシゲナーゼは、桂皮酸4−ヒドロキシラーゼとも称される。特に、trans−桂皮酸4−モノオキシゲナーゼは、EC 1.14.13.11に分類される任意の酵素であってもよい。このように、trans−桂皮酸4−モノオキシゲナーゼは、好ましくは、次の反応を触媒することができる酵素である:
本発明で使用されるチロシンアンモニアリーゼは、当業者に知られている任意のチロシンアンモニアリーゼであってよい。特に、チロシンアンモニアリーゼは、EC 4.3.1.23に分類される任意の酵素であってよい。したがってチロシンアンモニアリーゼは、好ましくは、次の反応を触媒することができる酵素である:
したがって、チロシンアンモニアリーゼは、配列番号6のチロシンアンモニアリーゼ、またはこれと少なくとも70%、例えば少なくとも75%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも91%、例えば少なくとも92%、例えば少なくとも93%、例えば少なくとも94%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%、例えば100%の配列同一性を共有する、その機能的相同体であってよい。配列同一性は、好ましくは、本明細書の以下の節「配列同一性」に記載のようにして算出される。
本発明で使用される4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼは、当業者に知られている任意の4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼであってよい。特に、4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼは、EC 1.14.-.-に分類される任意の酵素であってよい。
4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼは、種々の供給源から、例えば植物からの4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼであってよい。有用な4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼの例は、以下を含む:レッドクローバーのクマル酸3’−ヒドロキシラーゼ(CYP98A44)、Arabidopsis thalianap−クマル酸3−ヒドロキシラーゼ(CYP98A3)(配列番号7)、Arabidopsis thalianaのCYP98A8p−クマル酸3−ヒドロキシラーゼ(配列番号8)、またはArabidopsis thalianaのCYP98A9p−クマル酸3−ヒドロキシラーゼ(配列番号9)。
本発明で使用されるカフェ酸O−メチルトランスフェラーゼは、当業者に知られている任意のカフェ酸O−メチルトランスフェラーゼであってよい。特に、カフェ酸O−メチルトランスフェラーゼは、EC 2.1.1.68に分類される任意の酵素であってよい。したがってカフェ酸O−メチルトランスフェラーゼは、好ましくは次の反応を触媒することができる酵素である:
本発明で使用されるフラボン3’−O−メチルトランスフェラーゼは、当業者に知られている任意のフラボン3’−O−メチルトランスフェラーゼであってよい。特に、フラボン3’−O−メチルトランスフェラーゼは、EC 2.1.1.42に分類される任意の酵素であってよい。したがってフラボン3’−O−メチルトランスフェラーゼは、好ましくは次の反応を触媒することができる酵素である:
本発明で使用される4−クマル酸−CoAリガーゼは、当業者に知られている任意の4−クマル酸−CoAリガーゼであってよい。特に、4−クマル酸−CoAリガーゼは、EC 6.2.1.12に分類される任意の酵素であってよい。したがって4−クマル酸−CoAリガーゼは、好ましくは次の反応を触媒することができる酵素である:
4−クマル酸−CoAリガーゼの機能的相同体もまた、次の反応を触媒することができる:
本発明で使用されるシキミ酸O−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼは、当業者に知られている任意のシキミ酸O−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼであってよい。特に、シキミ酸O−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼは、EC 2.3.1.133に分類される任意の酵素であってよい。したがってシキミ酸O−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼは、好ましくは次の反応を触媒することができる酵素である:
シキミ酸O−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼの機能的相同体もまた、次の反応を触媒することができる:
本発明で使用されるカフェオイル−CoA O−メチルトランスフェラーゼは、当業者に知られている任意のカフェオイル−CoA O−メチルトランスフェラーゼであってよい。特に、カフェオイル−CoA O−メチルトランスフェラーゼは、EC 2.1.1.104に分類される任意の酵素であってよい。したがってカフェオイル−CoA O−メチルトランスフェラーゼは、好ましくは次の反応を触媒することができる酵素である:
カフェオイル−CoA O−メチルトランスフェラーゼの機能的相同体もまた、次の反応を触媒することができる:
本発明で使用されるバニリルアルコールオキシダーゼ(VAO)は、当業者に知られている任意のVAOであってよい。特に、VAOは、EC 1.1.3.38に分類される任意の酵素であってよい。VAOは、種々の供給源から、例えば真菌からのVAOであってよい。有用なVAOの例は、Penicillium simplicissimum VAOを含む。
したがって、VAOは、NCBIデータベースの参照番号CAA75722の配列のVAO(2013年11月5日から利用可能)、またはこれと少なくとも70%、例えば少なくとも75%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも91%、例えば少なくとも92%、例えば少なくとも93%、例えば少なくとも94%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%、例えば100%の配列同一性を共有する、その機能的相同体であってよい。配列同一性は、好ましくは、本明細書の以下の節「配列同一性」に記載のようにして算出される。
高レベルの配列同一性は、第1の配列が第2の配列に由来する確度を示している。アミノ酸配列の同一性は、2つの整列した配列間で同一のアミノ酸配列を必要とする。したがって、参照配列と80%のアミノ酸同一性を共有する候補配列は、アラインメントに従って、候補配列中のアミノ酸の80%が参照配列中の対応するアミノ酸と同一であることを必要とする。本発明による同一性はコンピュータ解析の支援により決定され、これは例えば、限定はされないが、ClustalWコンピュータアラインメントプログラム(Higgins D., Thompson J., Gibson T., Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J., 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680)、およびその中で示唆されているデフォルトのパラメータである。ClustalWソフトウェアは、European Bioinformatics Institute http://www.ebi.ac.uk/clustalwのClustalW WWW Serviceから入手可能である。デフォルト設定でこのプログラムを使用すると、クエリーおよび参照ポリペプチドの成熟(生物活性)部分が整列される。完全に保存された残基の数を数え、参照ポリペプチドの長さで除算する。
ClustalWアルゴリズムは、ヌクレオチド配列を整列させるために、同様に使用してもよい。配列同一性は、アミノ酸配列について示されるのと同様の方法で計算することができる。1つの重要な態様において、本発明の細胞は、本明細書で定義される、核酸配列コードを含む。
本発明は、バニリンシンターゼをコードする異種核酸および、任意に、フェルラ酸の合成に関与する酵素(単数または複数)および/またはグルコシルトランスフェラーゼをコードする1または2以上の追加の異種核酸配列を含む、微生物および植物に関する。前記異種核酸の適切な発現を確実にするために、前記コード異種核酸は、一般に、微生物細胞または植物における発現を指令するプロモーター配列に、作動可能に連結されている。
プロモーター配列は一般に、コード異種核酸に直接隣接して配置されてよい。
・転写開始部位(TSS)
・RNAポリメラーゼの結合部位
・汎用転写因子結合部位
・主要な調節エレメントを含む傾向がある遺伝子の上流の、近位プロモーター配列
・特定の転写因子結合部位
・追加の調節エレメントを含み得る遺伝子の上流の、遠位プロモーター配列;多くの場合近位プロモーターよりも影響は弱い
・リプレッサータンパク質のための結合部位
微生物または植物が、フェルラ酸を基質として用いて高レベルの酵素を発現する本発明の態様において、かかる酵素の発現を減少させることが有利となり得る。
酵母などのある種の微生物は、フェルラ酸の脱カルボキシル化を触媒して4−ビニルグアイアコールを得ることができるフェルラ酸デカルボキシラーゼを発現する。したがって、微生物がフェルラ酸デカルボキシラーゼを発現する場合、前記フェルラ酸デカルボキシラーゼの発現が低減されることが好ましい。
本明細書において用いる用語フェルラ酸とは、次の構造:
本発明の一定の態様において、バニリンおよび/またはバニリングルコシドの製造方法は、生産する微生物または植物を、フェルラ酸および/またはフェルラ酸誘導体と接触させることを含む。前記微生物または植物は、フェルラ酸と接触させることが好ましい。特に、これは、微生物または植物が、フェルラ酸を生成することができない本発明の態様において適切である。ほとんどの細菌および真菌は、フェルラ酸を生成することができない。したがって、微生物が細菌または真菌、例えば酵母である本発明の態様において、微生物を、フェルラ酸および/またはフェルラ酸誘導体と接触させることが好ましい。
代替的に、前記微生物は、フェルラ酸誘導体または、フェルラ酸およびフェルラ酸誘導体の混合物の存在下で培養され、例えば培養培地は、フェルラ酸誘導体および/またはフェルラ酸を含んでいてもよい。したがって、培養培地は、好ましくは少なくとも1mMの、好ましくは少なくとも3mMの、例えば少なくとも5mMのフェルラ酸および/またはフェルラ酸誘導体を含んでよい。
フェルラ酸は、任意の有用な形態で提供することができる。例えば糖蜜は一般に多量のフェルラ酸を含み、したがって培養培地は、糖蜜を含むか、またはこれからなることができる。糖蜜は例えば、テンサイまたはサトウキビの糖蜜であってよい。
例えば、フェルラ酸はアギ、すなわちジャイアントフェンネルからの乾燥した乳液(latex)、またはその抽出物などの形態で提供することができる。フェルラ酸は、コーヒー、リンゴ、アーティチョーク、ピーナッツ、またはオレンジの種として、またはその抽出物として提供されてもよい。フェルラ酸はまた、ツユクサ類(commelinid)植物またはその一部として提供されてもよい。ツユクサ類植物は、例えばイネ、コムギ、オートムギ、大黒慈姑(Chinese water chestnut)またはパイナップルであってよい。フェルラ酸はまた、アサイーオイルの形態で提供することができる。
フェルラ酸は精製されたフェルラ酸であってもよく、例えば、前述のいずれかのソースから精製されてもよく、またはフェルラ酸は、有機化学の手順によって調製されてもよい。
前記グリコシドエステルは、グルコースなどの任意の糖を含んでもよい。グリコシドは、好ましくはグルコシドである。
したがって、フェルラ酸誘導体は例えば、フェルラ酸グルコースエステル、フェルラ酸グルコシド、フェルロイル−CoA、フェルラ酸、シキミ酸およびフェルロイル−キナ酸からなる群から選択してよい。
バニリンシンターゼ(VpVAN)
US2003/0070188から入手可能な配列情報に基づいて、4-HBSのコード配列を得た(配列番号2)。
PCRで生成されたDNAのためのTNT Quick Coupled Transcription/Translation PROMEGAキットを用いて、単離された4-HBS PCR生成遺伝子からタンパク質を生成した(発現されたタンパク質は、成功したin vitro翻訳をチェックするためにS35で標識した)。この酵素の基質特異性を調べるために、2.5mMのp−クマル酸、フェルラ酸、およびカフェ酸を、供給実験における推定基質として試験した。推定基質を有するタンパク質溶液をそれぞれ1時間および24時間投与した後、4-HBSの存在下または不在下で得られた代謝プロファイルを、LC−MSにより分析した。4-HBSはフェルラ酸のバニリンへの鎖短縮化を触媒したが、p−クマル酸またはカフェ酸の鎖短縮化を触媒することはできなかったことが、明確に確認された。図1(a)は、400mMのトリス/HCl、pH8、20mMのMgCl2、2.5mMのジチオスレイトール(DTT)中の5mMのフェルラ酸を、30℃にて1時間供給したタンパク質溶液の、抽出イオンクロマトグラムを示す。バニリンピークは7.5分に観察され、これは、4-HBSなしのタンパク質溶液を同じ条件下で処理した陰性対照中には、存在しない(図1(b)を参照)。図1(c)は、2.5mMのDTT、0.1mMのATPおよび0.1mMのNAD+中の5mMのCoAフェルラ酸を、30℃にて1時間供給したタンパク質溶液の、抽出イオンクロマトグラムを示す。ここでもまたバニリンピークが観察され、これは陰性対照中には存在しない(図1(d)を参照)。図1(e)は、7.5分におけるバニリン断片化パターン示す。
したがって、我々は4-HBSを、バニリンシンターゼまたはVpVANと再度名付けた。
VpVANの酵母での発現による、バニリングルコシドのフェルラ酸からの生成
この例では、酵母内で、V. planifoliaのVpVANの異種発現による、バニリングルコシドのフェルラ酸からの生合成を説明する。バニリンシンターゼの基質特異性は、S. cerevisiae株Fsb99における一過性の安定な発現によってさらに確認した。酵母は、Gal誘導性酵母発現ベクターP416 TEFに挿入した、配列番号1のVpVANをコードする核酸で形質転換した(前記細胞はまた、本明細書において、VpVAN形質転換酵母とも称される)。VpVAN形質転換酵母は、ガラクトースおよび5mMの推定基質を含む合成培地で増殖させた。バニリン形成はフェルラ酸の投与後に観察され、一方、p−クマル酸とカフェ酸の代謝は観察されなかった。独立したアプローチでは、配列番号1のVpVANがArabidopsis thalianaのUGT72E2(配列番号3)と共に、酵母で発現された。Arabidopsis thalianaのUGT72E2はフェルラ酸のグルコシル化を触媒し、バニリンシンターゼの、フェルラ酸グルコシドを基質として用いる能力の試験を可能とする。図12は、Arabidopsis thalianaのUGT72E2(配列番号3)を発現する酵母が、2.5mMのフェルラ酸を含む合成培地で増殖した場合に、フェルラ酸グルコシドを合成することを示す(図12参照)。生合成試験を、酵母発現のためにコドン最適化された、安定に組み込まれたVANを保有する酵母、またはシグナルペプチドを欠く切断型VAN(配列番号17;本明細書では、vp Δsp vanとも示す)、または酵母発現のためにコドン最適化されたシグナルペプチドを欠く切断型VANを用いて行った(図3)。酵母株は、異なる推定基質と共に72時間インキュベートし、その後、代謝産物プロファイルをLC−MSによって決定した。バニリングルコシドの形成は、フェルラ酸を基質として、試験したVANの両方のバージョンで観察された。最高の変換は、Δsp vanの切断型を使用して得られた。いかなる場合にも、カフェ酸またはp−クマル酸の炭素鎖短縮は観察されなかった。結果を図3に示す。フェルラ酸を有する酵母の投与はまた、芳香化合物4−ビニルグアイアコールグルコシドの生成をもたらした。したがって、バニリングルコシドの酵母における生成を、2ステップで、フェルラ酸を供給するかまたはフェルラ酸を生成することにより、行うことができる。
VpVANの基質特異性を、フェルラ酸およびフェルラ酸グルコシドを用いてさらに試験した。この実験は、バニリングルコシドの形成を検出するために行った。VpUGT72U1は、バニリンをグリコシル化することができるが、フェルラ酸をグリコシル化することはできない;一方、AtUGT72E2は、フェルラ酸およびバニリンの両方をグリコシル化することができる。VpUGT72U1を含有した酵母構築物は、フェルラ酸およびフェルラ酸グルコシドに対するVpVAN基質特異性を試験することができる。LC−MS抽出イオンクロマトグラムは、VpVANがフェルラ酸およびフェルラ酸グルコシドの両方の鎖切断を触媒することができることを示す(図4参照)。
Nicotiana benthamianaにおけるVpVANの一過性発現による、バニリンの固有フェルラ酸からの生成
この例では、VpVANを、通常はバニリンを生成しない植物におけるバニリンの生成のために使用できることを示す。V. planifolia以外の植物におけるVpVAN活性を、Nicotiana benthamianaの葉における一過性発現により評価した。配列番号1のVpVANをコードする遺伝子発現構築物をAgrobacterium tumefaciensに移し、p19遺伝子サイレンシングサプレッサーを保有するA. tumefaciensと共に、N. benthamianaの葉に共浸潤させた。接種の4日後、浸潤させたタバコの葉を採取し、LC−MSによる代謝産物プロファイリングに供した。結果を図5に示す。プロファイリングは、VpVANをコードする遺伝子発現構築物をトランスフェクトした植物からのタバコの葉のみに、バニリルアルコールグルコシドの形成を示した。バニリルアルコールは、生きている細胞における、バニリンの既知の代謝物であり、おそらくアルデヒドバニリンの細胞毒性を減少させるために生成される。したがってこれらの結果は、バニリンが、V. planifolia以外の植物におけるフェルラ酸から生成できることを示す。
バニリングルコシド生成のための、VpVANのタバコにおける安定発現
この例では、タバコNicotiana tabacumの安定に形質転換された株における、バニリングルコシドのde novo形成について記載する。植物において、バニリルアルコールグルコシドではなくバニリングルコシドの蓄積を確実にするために、VpVAN酵素と共に適切な高効率のバニリングリコシルトランスフェラーゼ酵素を共発現することが好適である。VpVAN(配列番号1)は、したがって、N. tabacumの形質転換株において、A. thalianaのUGT72E2(配列番号3)と安定して共発現される。まず、配列番号3のUGT72E2をコードする核酸を、pCAMBIAシリーズの1つなどの、強い構成的カリフラワーモザイクウイルスCaMV35Sプロモーターの制御下で植物における遺伝子発現を可能とする、植物形質転換ベクターのマルチクローニングサイトにクローニングする。ベクターは、細菌選択遺伝子および植物選択遺伝子の両方を保有する。配列番号3のUGT72E2をコードする核酸を保有するベクターを、Agrobacterium tumefaciensのC58C1/pGV3850に、Wen-Jun et al., 1983に記載のようにして、エレクトロポレーションによって形質転換する。A. tumefaciens細胞を選択培地で増殖させ、陽性形質転換体を一晩増殖させる。プレートからの細菌を20mLの最少A培地に懸濁し、密度を0.9〜1.0のOD600に調製し、および、約20枚の0.5cmの四角いN. tabacumの葉(4〜5週齢の組織培養成長植物)を、菌液(ディープウェルペトリ皿)に移す。四角い葉を溶液中で旋回させ、5分間放置し、その後それらを除去し、ブロット乾燥し、次に向軸側を固体RMOPに、プレート当たり約10枚移す。プレートは、暗所28℃にて、2〜3日間A. tumefaciensを5日間インキュベートし、その後葉片を、背軸側表面を培地に接触させて固体RMOP-TCHに移し、次に明所28℃で2〜3週間、1日あたり日光で16時間インキュベートする。材料は、苗条(シュート)が現れるまでほぼ2週間毎に継代培養し、その後苗木をMST-TCHポットに移し、1〜2週間、日光で16時間インキュベートし、根の形成時に、植物を温室内の土壌に移す。UGT72E2を発現するトランスジェニックタバコ植物からの植物材料を、次の形質転換に使用する。配列番号1のVpVANをコードする核酸を、上記のように植物発現ベクターにクローニングし、全体の手順を繰り返して、最終的に、UGT72E2とVpVANを共発現するトランスジェニックタバコ植物を得る。最終的トランスジェニック植物からの植物材料を収穫し、溶解して、バニリングルコシド含有量を、トランスジェニック植物からの葉材料で決定する。バニリングルコシドは、野生型タバコ植物には見出されない。
バニリン生成の増加
例2に記載したフェルラ酸を有する酵母の投与は、酵母のフェルラ酸デカルボキシラーゼ活性のために、高濃度の芳香化合物4−ビニルグアイアコールの生成ももたらした。S. cerevisiaeフェルラ酸デカルボキシラーゼ(FADase)はPADのスーパーファミリーに属し、フェルラ酸の4−ビニルグアイアコールへの、非酸化的脱カルボキシル化を介した形質転換を触媒する。
バニリン生成を増加させるために、FADase遺伝子を、従来の技術を用いてVpVAN形質転換酵母においてノックアウトする。特にFADase遺伝子は、本明細書の例2に記載された酵母株において、ノックアウトされる。
以下のプライマーを使用する:
LEU2Δpad1Δfad1_F AACATAATGCTGCAAATATAGATTGATTTCAATCTACGGAGTCCAACGCATTGAGCAGCTTCAATTGAGTAGATatgtctaagaatatcgttgtcctaccgg (配列番号19)
LEU2Δpad1Δfad1_R CGTGGAGTATAAAAGTTCGGAAAATTTTATTTAAAATCTGATTATATGGTTTTTCTTCCGTAGAAAGTCTATGGCAAttaagccaagatttccttgacagccttggcgatagc (配列番号20)
酵母におけるバニリンの生成
フェルラ酸を培地に添加することなく、バニリンの生成を可能にするため、VpVANで形質転換された酵母をさらに、フェルラ酸の合成に関与する酵素をコードする核酸で形質転換する。
株1
配列番号1のVpVANをコードする核酸および、配列番号3のArabidopsis thalianaのUGT72E2をコードする核酸で形質転換されたS. cerevisiaeを、例3に記載のようにして、次の核酸を用いて、それぞれS. cerevisiaeにおける発現を指向するプロモーターの制御下で調製する:
1.フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(Vannelli et al 2006, Shin et al 2012)
2.Arabidopsis thaliana CYP73A5(GenBank受入番号:U37235)
3.チロシンアンモニアリアーゼ(Vannelli et al 2006, Shin et al 2012)
4.4−クマル酸−CoAリガーゼArabidopsis thaliana4−クマル酸:CoAリガーゼ3(GenBank受入番号AF106088_1)
5.Nicotiana tabacumシキミ酸O−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ(GenBank受入番号Q8GSM7)
6.Arabidopsis thaliana p−クマル酸3−ヒドロキシラーゼ(CYP98A3)(GenBank受入番号:AEC09893.1)
7.Arabidopsis thalianaカフェオイル−CoA O−メチルトランスフェラーゼ(GenBank受入番号Q9C5D7)
配列番号1のVpVANをコードする核酸および、配列番号3のArabidopsis thalianaのUGT72E2をコードする核酸で形質転換されたS. cerevisiaeを、例3に記載のようにして、次の核酸を用いて、それぞれS. cerevisiaeにおける発現を指向するプロモーターの制御下で調製する:
1.フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(Vannelli et al 2006, Shin et al 2012)
2.Arabidopsis thaliana CYP73A5(GenBank受入番号:U37235)
3.4−クマル酸−CoAリガーゼArabidopsis thaliana4−クマル酸:CoAリガーゼ3(GenBank受入番号AF106088_1)
4.Nicotiana tabacumシキミ酸O−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ(GenBank受入番号Q8GSM7)
5.Arabidopsis thaliana p−クマル酸3−ヒドロキシラーゼ(CYP98A3)(GenBank受入番号:AEC09893.1)
6.Arabidopsis thaliana p−クマル酸3−ヒドロキシラーゼ(CYP98A3)(配列番号7)
形質転換された酵母細胞は、ガラクトースを含有する合成培地で増殖され、バニリングルコシドは増殖培地から単離される。
推定プレペプチドの存在下および不在下での、バニリンシンターゼの触媒活性
GenBankを用いた一般的な配列同一性検索によれば、VpVan配列は、システインプロテイナーゼに対して高い配列同一性を示した。最も高い配列同一性(77%)は、システインプロテイナーゼ(MEROPS−ペプチダーゼデータベース)のアリューレイン・クラスに属するElaeis guineensisシステインプロテイナーゼで見出された。興味深いことに、アラインメントは明白に、VpVan配列がプロテイナーゼ活性に必要な3つの主要な活性部位残基を含有することを実証した(Fan, J. et al. Expression of a senescence-associated cysteine protease gene related to peel pitting of navel orange (Citrus sinensis L. Osbeck. Plant Cell Tiss Org 98, 281-289 (2009))。酵素の活性がプレペプチドの不在下で強化されるか、または基質特異性を変化させるかを試験するために、VpVanから最初の137aa(VPΔ137van)、およびVpVANから最初の61aaを切断した。酵素の活性は、結合転写/翻訳(TNT)アッセイを用いてin vitroで試験した。したがって、Wt VpVANは配列番号1のポリペプチドをコードし、wt vp Δspは配列番号17のポリペプチドをコードし、vp Δ137 vanは配列番号1のaa138〜356をコードし、およびvp Δ61 vanは配列番号1のaa62〜356をコードする。
結合in vitro転写/翻訳アッセイで生成されたタンパク質を、それらの酵素の触媒能力について、アリコート(10μl)を0.5mM〜5mMの次の基質でインキュベーションすることによって分析した:400mMのトリス/HCl(pH8)、20mMのMgCl2および2.5mMのジチオスレイトール(DTT)(総容量:50μl)中の、フェルラ酸(Sigma)、p−クマル酸(Sigma)、カフェ酸(Sigma)、フェルラ酸グルコシド、p−クマル酸グルコシド、カフェ酸グルコシド、カフェオイル−コエンザイムA(MicroCombiChem e.K.)、p−クマリル−コエンザイムA(MicroCombiChem e.K.)、フェルロイル−コエンザイムA(MicroCombiChem e.K.)またはシナピル−コエンザイムA(MicroCombiChem e.K.)。酵素アッセイは、2.5mMのジチオスレイトール(DTT)、0.1mMのATPおよび0.1mMのNAD+の存在下および不在下で行った。アリコート(10μl)を特定の時点で回収し、酵素活性をMeOHの添加(25μl、25%(v/v)で)によって停止させ、加熱した(45℃、15分)。試料を氷で冷却し(30分)、マイクロタイターフィルタープレート(Merck Millipore)で遠心分離し(10,000rpm、10分間)、ろ液を最終的にLC−MSにより分析した。
結果を図6に示す。実験は、VpVanのN末端配列を除去することによる処理は、フェルラ酸グルコシドに対する活性に必要ではないことを示す(図6参照)。
タバコでの一過性発現の後に分析した、推定プレペプチドの存在下および不在下におけるin vivoのバニリンシンターゼの触媒活性
VpVAN(ER標的化シグナルペプチドを含む)の発現後に観察される生物学的活性を、in vivoにおいて、任意の外因的に添加された基質の不在下で、N. benthamianaの葉における一過性発現によって評価した。遺伝子構築物をAgrobacterium tumefaciensに移し、p19遺伝子サイレンシングサプレッサーを有するA. tumefaciens株に共浸潤させた。LC−MSプロファイリングは、バニリルアルコールグルコシドのVpVAN依存形成を示した。バニリルアルコールグルコシドは、アルコールデヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.1)によるバニリンの還元およびその後のバニリルアルコールの第一アルコール基のグルコシル化により生じる。バニラ種以外の植物における、バニリンシンターゼの導入によるバニリングルコシドの生物工学的生産のためには、宿主生物が、形成された遊離バニリンをバニリルアルコールへの還元前に対応するグルコシドへと効果的にグルコシル化するUGTを共発現することが、好ましい。
上記Nicotiana benthamianaの葉におけるVpVANおよびその切断型の一過性の発現は、次のようにして得た。目的のcDNA(Wt VpVANまたはwt vp Δ137 vanまたはwt vp Δ61 van)を保有する再結合されたpJAM1502ベクターを含有する、Agrobacterium tumefaciens株AGL1、および、遺伝子サイレンシング阻害タンパク質19(p19)を保有する再結合されたpJAM1502ベクターを保有するA. tumefaciens株AGL1の、一晩培養物を、遠心分離によって回収し、10mMのMES、pH5.5、10mMのMgCl2および100μMのアセトシリンゴンに再懸濁した(OD600=2.0)。インキュベーション(4時間、RT)の後、2つのA. tumefaciens株を用いて、24℃(日中)および17℃(夜間)で成長させた3週齢のNicotiana benthamiana植物の葉に、共浸潤させた。4または5日後、葉のディスク(直径1cm)を浸潤された葉から打ち抜き、代謝産物をLC−MS分析のために60%(v/v)MeOHに抽出した。結果を図7A)に示す。
VpVan配列は、ファミリーシステインプロテイナーゼ(上記参照)に属するタンパク質と高い配列同一性を示した。我々は、VpVanに対するアミノ酸配列同一性が71%である、タバコのシステインプロテイナーゼのファミリーに属するタンパク質を同定した(配列番号22)。アラインメントを調製した(図10参照)。VpVanシグナルペプチド(配列番号1のaa1〜21)を、SignalP 4.1ソフトウェア(Center for Biological Sequence analysis,Technical University of Denmarkから入手可能)を使用して同定した、配列番号22のシグナルペプチドに置き換えた構築物を調製した。このシグナルペプチドは、配列番号21のaa1〜22である。切断部位は、配列番号1のaa135〜141にて、残基137の位置(DGV/LPVT)の後ろの切断として同定された。配列番号1のaa135〜141に対応する配列番号22のアミノ酸は、図10のアライメントを使用して、配列番号22のaa140〜146として同定され、配列番号1のaa135〜141を、配列番号22のaa140〜146で置き換えた。こうして、シグナルペプチドおよびプロテアーゼ切断部位を、タバコシステインプロテアーゼのシグナルペプチドおよびプロテアーゼ切断部位で置き換えた。こうして得られたポリペプチドは、[配列番号22のaa1〜21]−[配列番号1のaa22〜134]−[配列番号22のaa140〜146]−[配列番号1のaa142〜356]から構成される。このタンパク質をコードする核酸は、本明細書においてvp nb Δsp Δ137vanと呼ばれ、配列番号24として提供される。この遺伝子構築物をA. tumefaciensに移し、野生型VpVANについてのこの例の上の記載と本質的に同様にタバコに浸潤させ、バニリンアルコールグルコシドの生成をLC−MSプロファイリングによって分析した。結果を図7Bに示す。
VpVanの配列は、シソ科に属するGlechoma hederacea(カキドウシ)からクローニングされた新規遺伝子GhVANと71%のアミノ酸配列同一性を示すことが見出された。GhVANの配列は配列番号21として提供される。G. hederaceaによって放出される揮発性成分の研究では、この植物が微量のバニリンを放出することが示された(N Radulovic 2010)。
基本的に例8の記載のように実施された、タバコにおけるGhVANの一過性の発現は、この遺伝子の発現が、タバコでのバニリンアルコールグルコシドの蓄積をもたらすこと、すなわち、この酵素が、VpVANと類似の機能特性を有することを実証した(図8参照)。
Claims (38)
- バニリン、バニリルアルコール、バニリングルコシドおよび/またはバニリルアルコールグルコシドを製造する方法であって、
a)微生物を提供すること、ここで前記微生物は、
i.フェルラ酸および/またはフェルラ酸グルコシドを生成することができ;および
ii.バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸をバニリンに変換することができる酵素であり;および
b)前記微生物を、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること、
c)バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび/またはバニリングルコシドを、微生物から、および/または培養培地から単離すること、
ここで、前記バニリンシンターゼが、
(A)配列番号1、配列番号21のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも90%の配列同一性を共有するその機能的相同体である、または
(B)切断型バニリンシンターゼであり、ここで切断型バニリンシンターゼが、
(I)配列番号1のaa22〜356を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
(II)配列番号1のaa62〜356を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
(III)配列番号1のaa138〜356を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
(IV)配列番号21のaa22〜359を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
(V)配列番号21のaa141〜359を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、または
(VI)(I)〜(V)のいずれかと少なくとも90%の配列同一性を共有する(I)から(V)のいずれかの機能的相同体である、
を含む、前記方法。 - 培養培地が、最大で1mMの、例えば最大で0.5mMの、例えば最大で0.01mMの、例えば検出不可能な、クマル酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 微生物であって、
i.フェルラ酸を生成することができ;および
ii.バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸をバニリンに変換することができる酵素である、
ここで、前記バニリンシンターゼが、配列番号1、配列番号21のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも90%の配列同一性を共有するその機能的相同体である、
前記微生物。 - 微生物が、細菌および真菌からなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 微生物が酵母である、請求項1、2および4のいずれか一項に記載の方法。
- 微生物が、フェルラ酸の合成に関与する酵素をコードする少なくとも1種の異種核酸を含む、請求項1、2、4および5のいずれか一項に記載の方法。
- フェルラ酸の合成に関与する酵素が、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、trans−桂皮酸4−モノオキシゲナーゼ、チロシンアンモニアリアーゼ、4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼ、カフェ酸O−メチルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、trans−桂皮酸4−モノオキシゲナーゼ、クマル酸−CoAリガーゼ、シキミ酸O−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、4−クマリル−3−ヒドロキシラーゼ、カフェオイル−CoA O−メチルトランスフェラーゼ、カフェ酸O−メチルトランスフェラーゼ、およびフラボン3’−O−メチルトランスフェラーゼ、からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- フェルラ酸の合成に関与する酵素が、バニリルアルコールオキシダーゼである、請求項6に記載の方法。
- 微生物を、オイゲノールを含む培養培地中で培養することを含む、請求項8に記載の方法。
- バニリンを製造する方法であって、以下のステップ:
a)微生物を提供すること、ここで前記微生物がバニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸をバニリンに変換することができる酵素であり;および
b)前記微生物を、フェルラ酸および/またはフェルラ酸誘導体の存在下で、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること;および
c)バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび/またはバニリングルコシドを、微生物から、および/または培養培地から単離すること、
ここで、前記バニリンシンターゼが、
(A)配列番号1、配列番号21のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも90%の配列同一性を共有するその機能的相同体である、または
(B)切断型バニリンシンターゼであり、ここで切断型バニリンシンターゼが、
(I)配列番号1のaa22〜356を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
(II)配列番号1のaa62〜356を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
(III)配列番号1のaa138〜356を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
(IV)配列番号21のaa22〜359を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
(V)配列番号21のaa141〜359を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、または
(VI)(I)〜(V)のいずれかと少なくとも90%の配列同一性を共有する(I)から(V)のいずれかの機能的相同体である、
を含む、前記方法。 - ステップb)が、微生物を、フェルラ酸の存在下で培養することを含む、請求項10に記載の方法。
- 培養培地が、少なくとも1mM、好ましくは少なくとも3mM、例えば少なくとも5mMのフェルラ酸を含む、請求項8または9に記載の方法。
- 培地が、糖蜜を含むかこれからなる、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
- バニリンおよび/またはバニリン誘導体の製造方法であって、
a)フェルラ酸および/またはフェルラ酸誘導体を提供すること、
b)フェルラ酸および/またはフェルラ酸誘導体をバニリンシンターゼと接触させること、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸をバニリンに変換することができ、これによりバニリンおよび/またはバニリン誘導体を生成する酵素である、
ここで、前記バニリンシンターゼが、
(A)配列番号1、配列番号21のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも90%の配列同一性を共有するその機能的相同体である、または
(B)切断型バニリンシンターゼであり、ここで切断型バニリンシンターゼが、
(I)配列番号1のaa22〜356を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
(II)配列番号1のaa62〜356を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
(III)配列番号1のaa138〜356を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
(IV)配列番号21のaa22〜359を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
(V)配列番号21のaa141〜359を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、または
(VI)(I)〜(V)のいずれかと少なくとも90%の配列同一性を共有する(I)から(V)のいずれかの機能的相同体である、
を含む、前記方法。 - in vitroで実施される、請求項1〜2および4〜14のいずれか一項に記載の方法。
- フェルラ酸誘導体がフェルラ酸グルコシドであり、バニリン誘導体がバニリングルコシドである、請求項14または15に記載の方法。
- バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび/またはバニリングルコシドを製造する方法であって、
a)バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む植物を提供すること、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸をバニリンに変換することができる酵素であり;および
b)前記植物を栽培すること;および
c)バニリンを植物から単離すること、
ここで、前記バニリンシンターゼが、
(A)配列番号21のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも90%の配列同一性を共有するその機能的相同体である、または
(B)切断型バニリンシンターゼであり、ここで切断型バニリンシンターゼが、
(I)配列番号1のaa22〜356からなるバニリンシンターゼ、
(II)配列番号1のaa62〜356からなるバニリンシンターゼ、
(III)配列番号1のaa138〜356からなるバニリンシンターゼ、
(IV)配列番号21のaa22〜359を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
(V)配列番号21のaa141〜359を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、または
(VI)(I)〜(V)のいずれかと少なくとも90%の配列同一性を共有する(I)から(V)のいずれかの機能的相同体である、
を含む、前記方法。 - バニリンシンターゼをコードする異種核酸およびグルコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を含む植物であって、前記バニリンシンターゼが、フェルラ酸をバニリンに変換することができる酵素であり、前記バニリンシンターゼが、配列番号21のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも90%の配列同一性を共有するその機能的相同体である、前記植物。
- 植物が双子葉植物である、請求項17に記載の方法。
- 植物がNicotiana tabacumである、請求項17または19に記載の方法。
- 植物が、ツユクサ類(commelinoids)およびアカザ科からなる群から選択される、請求項17または19に記載の方法。
- 動物飼料を製造する方法であって、
a)バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む植物を提供すること、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸をバニリンに変換することができる酵素であり;および
b)前記植物を栽培すること;および
c)植物を動物飼料に加工すること、
ここで、前記バニリンシンターゼが、
(A)配列番号21のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも90%の配列同一性を共有するその機能的相同体である、または
(B)切断型バニリンシンターゼであり、ここで切断型バニリンシンターゼが、
(I)配列番号1のaa22〜356からなるバニリンシンターゼ、
(II)配列番号1のaa62〜356からなるバニリンシンターゼ、
(III)配列番号1のaa138〜356からなるバニリンシンターゼ、
(IV)配列番号21のaa22〜359を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
(V)配列番号21のaa141〜359を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、または
(VI)(I)〜(V)のいずれかと少なくとも90%の配列同一性を共有する(I)から(V)のいずれかの機能的相同体である、
を含む、前記方法。 - 植物が、イネ科(Poaceae)またはイネ科(Gramineae family)のものである、請求項22に記載の方法。
- 食品を製造する方法であって、
a)可食部を含む植物を提供すること、ここで前記植物が、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸をバニリンに変換することができる酵素であり;および
b)前記植物を栽培すること;および
c)前記可食部を収穫すること、
ここで、前記バニリンシンターゼが、
(A)配列番号21のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも90%の配列同一性を共有するその機能的相同体である、または
(B)切断型バニリンシンターゼであり、ここで切断型バニリンシンターゼが、
(I)配列番号1のaa22〜356からなるバニリンシンターゼ、
(II)配列番号1のaa62〜356からなるバニリンシンターゼ、
(III)配列番号1のaa138〜356からなるバニリンシンターゼ、
(IV)配列番号21のaa22〜359を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
(V)配列番号21のaa141〜359を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、または
(VI)(I)〜(V)のいずれかと少なくとも90%の配列同一性を共有する(I)から(V)のいずれかの機能的相同体である、
を含み、これによりバニリンの味覚を有する食品を得る、前記方法。 - 植物がトマトである、請求項24に記載の方法。
- バニリンシンターゼが、次の式:
[シグナルペプチド]−X−[切断部位]−[切断型バニリンシンターゼ]
式中、Xはリンカー配列である、
で表されるポリペプチドである、請求項1、2、4〜17および19〜25のいずれか一項に記載の方法。 - 切断型バニリンシンターゼが、請求項1、10、14、17、22または24に定義されたものである、請求項26に記載の方法。
- シグナルペプチドが、宿主生物に内因性のタンパク質のシグナルペプチドである、請求項26または27に記載の方法。
- 切断部位が、宿主生物に内因性のタンパク質の切断部位である、請求項26〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 微生物または植物が、グルコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸も含む、請求項1、2、4〜17および19〜29のいずれか一項に記載の方法。
- グルコシルトランスフェラーゼが、UDP−グルコース:アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼである、請求項30に記載の方法。
- グルコシルトランスフェラーゼが、グルコースのバニリンへの転移を触媒することができ、これによりバニリングルコシドを形成するグルコシルトランスフェラーゼである、請求項30または31に記載の方法。
- グルコシルトランスフェラーゼが、配列番号3のUGT72E2またはこれと少なくとも90%の配列同一性を共有するその機能的相同体である、請求項30に記載の方法。
- バニリンを製造する方法である、請求項1〜2、4〜17および19〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 方法が、バニリングルコシドを、微生物から、および/または培養培地から、および/または植物から単離するステップを含み、および方法が、前記バニリングルコシドを脱グルコシル化するステップをさらに含む、請求項1〜2、4〜17および19〜34のいずれか一項に記載の方法。
- バニリングルコシドを脱グルコシル化するステップが、バニリングルコシドをグルコシダーゼに接触させることを含む、請求項35に記載の方法。
- グルコシダーゼが、β−グルコシダーゼである、請求項36に記載の方法。
- バニリングルコシドを製造する方法である、請求項1〜2、4〜17および19〜33のいずれか一項に記載の方法。
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