KR100794296B1 - 알파-리놀렌산 저함유 들깨 - Google Patents

알파-리놀렌산 저함유 들깨 Download PDF

Info

Publication number
KR100794296B1
KR100794296B1 KR1020070003113A KR20070003113A KR100794296B1 KR 100794296 B1 KR100794296 B1 KR 100794296B1 KR 1020070003113 A KR1020070003113 A KR 1020070003113A KR 20070003113 A KR20070003113 A KR 20070003113A KR 100794296 B1 KR100794296 B1 KR 100794296B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
perilla
linolenic acid
alpha
carrier
gene
Prior art date
Application number
KR1020070003113A
Other languages
English (en)
Inventor
김경환
하선화
김정봉
김용환
박종석
권순종
홍승범
윤웅한
조강진
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020070003113A priority Critical patent/KR100794296B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100794296B1 publication Critical patent/KR100794296B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 알파-리놀렌산(α-linolenic acid) 생합성에 관여하는 Delta-15 불포화효소 유전자를 RNAi 방법을 이용하여 그 기능을 제어하여 알파-리놀렌산 함량이 감소된 들깨 품종 육성에 관한 것이다.
들깨 소포체(ER, endoplasmic reticulum)에서 유래한 delta 15 desaturase (fad3) 유전자를 분리하여 염기서열을 결정하였으며 이중 같은 기능을 하는 엽록체 유래의 delta 15 desaturase (fad7)과 염기서열의 상동성이 56%인 193bp의 서열을 이용하여 RNA interference(RNAi) 운반체(F3SiA)를 작성하였다. 이를 이용하여 들깨(품종; 엽실들깨)에 형질전환하여 형질전환체를 확보하였고 형질전환체는 마커유전자로 활용한 제초제저항성 유전자(bar)의 발현에 의한 제초제 저항성에 의해서 선발하였다. 형질전환체에서 ER 유래 delta 15 desaturase (fad3)의 발현을 Northern blot으로 확인하였으며 종자의 지방산을 분석한 결과 대조구는 알파-리놀렌산(α-linolenic acid)이 60%정도이나 형질전환체 분리세대(이형접합체)인 T1세대에서 19.4%, 고정세대(동형접합체)인 T2계통에서는 3.6%로 15배정도 감소함을 확인하였다.따라서, 본 발명의 알파-리놀렌산의 함량이 4%정도로 감소된 형질전환들깨는 기타 품종에 비하여 산패문제와 산패시 악취를 감소시키고 저장기간이 기존 품종보다 연장될 수 있다.
들깨, delta 15 desaturase, RNAi, 알파-리놀렌산

Description

알파-리놀렌산 저함유 들깨{Transgenic Perilla frutescens with low content of alpha linolenic acid}
도1은 RNAi 방법에 사용된 delta 15 불포화효소의 염기서열을 나타낸 것이다.
도2는 pENTR-Fad3-193과 최종 식물형질전환용 pF3SiA 운반체의 구조를 나타낸 것이다.
도3은 들깨 형질전환 및 형질전환 식물체의 순화 과정을 나타낸 것이다.
도4는 형질전환들깨의 delta 15 desaturase 유전자 발현량 비교하여 나타낸 것이다.
도5는 형질전환들깨(T2세대)와 기존품종간의 지방산 조성 비교한 것을 나타낸 것이다.
본 발명은 RNA interference(RNAi) 방법을 이용하여 유전자의 발현을 억제하여 효소의 활성을 저하하고 식물체의 성분의 변화를 유도하는 기술분야이다.
종래 들깨의 성분육종은 재래종의 순계분리에 의한 것으로, 들깨에서 RNAi 방법을 이용하여 지방산 조성 성분을 변화한 연구는 전무한 실정이다.
따라서, 본 발명은 RNAi방법을 이용하여 유전자 운반체를 만들고 이를 형질전환하여 60%정도 다량 함유된 알파-리놀렌산의 함량을 기존품종보다 감소된 계통을 육성하고자 한다.
들깨 소포체(ER, endoplasmic reticulum)에서 유래한 delta 15 desaturase (fad3) 유전자를 분리하여 염기서열을 결정하였으며 이중 같은 기능을 하는 엽록체 유래의 delta 15 desaturase (fad7)과 염기서열의 상동성이 56%인 193bp의 서열을 이용하여 RNA interference(RNAi) 운반체(F3SiA)를 작성하였다. 이를 이용하여 들깨(품종; 엽실들깨)에 형질전환하여 형질전환체를 확보하였고 형질전환체는 마커유전자로 활용한 제초제저항성 유전자(bar)의 발현에 의한 제초제 저항성에 의해서 선발하였다. 형질전환체에서 소포체 유래 delta 15 desaturase (fad3)의 발현을 Northern blot으로 확인하였으며 종자의 지방산을 분석한 결과 대조구는 알파-리놀렌산(α-linolenic acid)이 60%정도이나 형질전환체 분리세대(이형접합체)인 T1세대에서 19.4%, 고정세대(동형접합체)인 T2계통에서는 3.6%로 15배정도 감소함을 확인하였다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시 예 1: 들깨 소포체 특이 delta 15 desaturase 유전자중 RNAi 에 특이적인 염기서열 결정
이미 보고된 들깨 소포체 특이적인 delta 15 desaturase(fad3) 유전자(Genbank No. AF213482 )의 염기서열 1,613 bp중에서 엽록체의 delta 15 desaturase(fad7) 유전자와 염기서열 비교하여 상동성이 상대적으로 떨어지는 부위(56%)인 762-954 bp 부위의 193bp의 염기서열(서열번호 1)을 RNAi 운반체 작성에 이용하였다.
벨기에의 겐트대학으로부터 구입한 게이트웨이 운반체 pB7GWIWG2(II)을 이용하여 알파-리놀렌산 저함유 들깨 개발용 운반체를 제작하였다. 들깨로부터 분리한 소포체 특이 Fad3 유전자 일부(서열번호 1)가 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이적으로 가지고 있는 재조합 핵산서열 부위를 일부 포함하면서 소포체 특이 Fad3 유전자 일부 193bp를 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계된 프라이머 Fad3-B1 (5'-AAAAAGCAGGCTGAGAGGGGCTTGATAGT-3' : 서열번호2)와 Fad3-B2 (5'-AGAAAGCTGGGTGGTACCAAGGGAGTTTC-3' :서열번호3)를 제작하여 유전자 증폭 반응(PCR : polymerase chain reaction)을 통해 약 200 bp의 유전자 단편을 분리하였다.
증폭된 PCR 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이 재조합 핵산서열 부위 전체를 포함하는 프라이머 attB1(5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3' :서열번호4)와 attB2(5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3' :서열번호5)를 사용하여 각각 PCR과정을 반복하 였다.
2차로 PCR된 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리오파지 측 특이 재조합 핵산서열 부위를 포함하는 pDONR201 벡터와 BP 재조합반응을 거쳐 pENTR-Fad3-193의 중간 클로닝 벡터가 제작되었다. 이 운반체는 최종 식물형질전환 운반체를 제작하기 위해 목적유전자를 sense와 antisense 방향으로 동시에 삽입하면서 두 유전자 사이에 palindrom 특이 구조를 형성하도록 인트론(intron)이 내재된 pB7GWIWG2(II) 벡터와 다시 LR 재조합 반응을 거쳐 최종적인 pF3SiA 운반체가 완성되었다. 이 때, 기본 운반체(binary vector)로 사용된 pB7GWIWG2(II)는 미생물 선발을 위한 스펙티노마이신 (spectinomycin) 저항성 유전자를 가지며, 식물체 선발인자로 제초제 저항성 Bar유전자를 포함하고 있다. 제작된 형질전환용 운반체들은 액체질소를 이용한 직접적인 아그로박테리아 형질전환 방법 (Holster 등, freeze-thaw method, 1978)에 따라 아그로박테리아 튜메파시엔스 균주 GV3101에 형질전환 시킨 후, An 등의 알카리 방법 (alkaline lysis)에 근거한 아그로박테리아 급속 선발 (quick-screen)을 이용하여 아그로박테리아 내 도입을 확인하였다.
실시 예 2 : pF3SiA 운반체의 들깨 형질전환 및 형질전환체 획득
들깨 식물형질전환을 위하여 들깨(엽실) 종자를 70% 에탄올에 1분간 침지하고 멸균수로 3～4회 세척하고 filter paper로 건조시켜 1/2 MS 배지에 파종하였다. 파종 후 6～8일 경과된 배축을 0.5～1㎝ 정도의 크기로 절단한 후 형질전환을 위한 explant로 사용하였다.
pF3SiA운반체가 형질전환된 Agrobacterium tumefaciens GV3101을 30시간 배양 후(OD600〓1.0) 5,000rpm에서 5분 정도 원심분리하여 배양액을 제거한 후 MS 액체배지로 약 20배 희석하여 상기 explant와 20분 방치하였다. explant를 멸균된 filter paper로 건조시킨 후 공동배양배지(MS 기본배지, 3% sucrose, 3㎎/L BA, 0.2% gelrite. 0.2% phytagel)에서 25℃, 2～3일간 공동배양(co-culture)하였다.
3일간 공동배양이 끝난후 표면에 잔류하는 Agrobacterium을 제거하기 위하여, 공동배양한 explant를 cefatoxime 250㎎/L가 첨가된 MS 배지로 세척한 후 멸균된 종이에 올려 외부의 수분을 제거한 뒤 shoot를 유도하는 선발-슈트유도배지(MS 기본배지, 3% sucrose, 3㎎/L BA, 0.1㎎/L NAA, 0.2% gelrite. 0.2% phytagar, 1.2㎎/L phosphinothricin, 500㎎/L carbenicillin, pH 5.6)에 옮겨서 형질전환된 배축에서만 shoot를 유도되도록 하였다.
3주마다 새로운 선발배지로 계대배양하면서 유도된 shoot 부분만을 절단하여 shoot 신장배지 (MS 기본배지, 3% sucrose, 3㎎/L BA, 0.2% gelrite. 0.2% phytagar, 1.2㎎/L phosphinothricin, 500㎎/L carbenicillin, pH 5.6)에서 shoot를 신장시킨 후, 2차 선발배지 (MS 기본배지, 3% sucrose, 3㎎/L BA. 0.2% gelrite. 0.2% phytagar, 2㎎/L phosphinothricin, 500㎎/L carbenicillin, pH 5.6)에서 배양?선발한 후에 뿌리유도배지(1/2 MS 기본배지, 500㎎/L carbenicillin, pH 5.8)에 계대 배양하였다. 들깨 형질전환 조건을 표1에 나타내었다.
들깨 형질전환 조건
품종 explant 전배양 Agrobacterium 공동배양 shoot 유도 shoot 신장 뿌리생성
엽실 배축 없음 MS기본배지 BAP 3㎎/L MS기본배지 BAP 3㎎/L NAA 0.1㎎/L MS기본배지 BAP 3㎎/L 1/2 MS 기본배지
배양기간 - - 2~3일 2~3달 2달 1~2주일
항생제조건 없음 phosphinothricin 1.2㎎/L carbenicillin 500㎎/L phosphinothricin 1.2㎎/L carbenicillin 500㎎/L carbenicillin 500㎎/L
뿌리가 발달된 개체들은 배양병에서 꺼내서 뿌리를 물로 잘 씻어 준 후 플라스틱의 순화통에서 멸균된 질석(vermiculite)에 이식하여 순화시켰다. 재분화된 형질전환개체를 대상으로 형질전환여부를 확인하기 위하여 1차적으로 0.3% 제초제를 처리하여 제초제 저항성 식물체를 선별하였다. 그 결과 33개체의 형질전환체를 확보하였다.
상기의 아그로박테리움을 들깨 배축에 감염시켜 형질전환하고 형질전환된 들깨로 재분화시키는 과정의 사진을 도3에 나타내었다. 도3에서 사진 A는 분리한 배축과 아그로박테리움을 공동배양하는 모습, B는 shoot 유도배지에서 shoot가 유도되는 모습, C는 유도된 shoot가 발달한 모습, D는 뿌리유도배지에서 뿌리가 유도되는 모습, E는 뿌리까지 생성된 재분화 식물체를 질석에서 순화하는 모습, F는 온실에 옮겨져서 생장한 재분화 식물체의 모습을 나타낸다.
실시예 3. 형질전환들깨에서 유전자의 발현량 확인
제초제를 살포하여 생존한 형질전환들깨를 대상으로 잎과 미숙종자에서 유전자의 발현량을 알아보기 위하여 총 RNA를 분리하고 delta 15 desaturase 유전자를 프로브로 사용하여 Northern blot 분석을 실시하였다.
분석한 결과 잎에서는 delta 15 desaturase 유전자의 발현은 대조구와 형질전환체에서 거의 발현되지 않았으나 미숙종자에서는 대조구에서 발현량이 높았으며 형질전환체에서는 계통에 따라서 발현량의 차이가 있었다. 70번, 75번, 93번, 142번 계통의 발현량은 상대적으로 낮아서 본 발명자들이 삽입한 F3SiA 운반체가 delta 15 desaturase 유전자 발현을 효율적으로 억제함을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 형질전환들깨의 지방산 분석
형질전환들깨의 지방산을 분석하기 위하여 0.1g의 들깨 시료를 대상으로 막자사발을 이용하여 분쇄하고 1㎖의 internal STD(PDA:pentadecanoic acids in MeOH, 1000ppm)과 1㎖의 solvent(chloroform:MeOH = 2:1)를 첨가한 후solvent 4㎖ test tube에 넣어 지방산을 용출하고 0.58% NaCl solution을 5㎖ 넣고 10분간 sonication하였다. 추출액을 원심분리한 후 상층액을 버리고 rotary evaporator를 이용하여 시료를 농축한 후 농축한 시료에 0.5㎖의 toluene과 2㎖의 0.5N NaOH in MeOH를 첨가하여 끓는 물에 5분간 반응시켜 지방산을 용출하였다. 이후 2.5㎖의 14% BF3 in MeOH를 첨가한 후 끓는 물에서 5분간 반응시켜 지방산을 methylation 시켜 methyl ester로 만든후 10㎖의 petroleum ether와 15㎖의 3차 증류수를 넣고 잘 섞은 후 10분간 sonication하였다. 반응액을 NaSO4를 이용하여 filteration한 후에 상등액을 농축하고 1ml petroleum ether를 넣은 후 GC를 이용하여 분석하였다. 지방산 분석을 위한 검출기로는 FID를 사용하였으며 자세한 분석조건은 표 2와 같다.
가스크로마토그래피 분석조건
GC HP5890 Ⅱ
column HP-20M (50m x 0.2 mm x 0.1㎛)
Headpressure 10 psi
Injector temp. 250 ℃
Oven temp. 190 ℃
FID
Temp. 250 ℃
Air 350 ㎖/min
H2 40 ㎖/min
지방산 분석 결과를 표3에 나타내었으며, 대조구의 경우 알파-리놀렌산 (18:3)이 61%였으나 형질전환체는 지방산 조성이 변화가 없는 계통과 30~40%대로 감소한 계통이 있었으며, 특히 93번 계통은 19.4%로 가장 많이 감소하였다. Northern blot결과에서도 93번 계통은 유전자의 발현량이 대조구에 비해 상대적으로 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 형질전환체의 후대계통 분리비 및 지방산 조성 분석
형질전환계통 중에서 가장 알파-리놀렌산의 함량이 낮은 93번계통과 142번 계통 위주로 후대계통 전개를 실시하였으며 이중에서 특히 93, 142계통은 제초제 저항성 유전자의 삽입여부를 이용하여 분리비를 확인하였다(χ2-test). 분리비를 확인한 결과 93번 계통과 142번 계통은 3:1의 분리비를 보여서 single copy가 삽입된 것을 간접적으로 확인하였으며, 한편 고정세대(동형접합체)와 분리세대(이형접합체)간의 비율도 1 : 2 정도로 나타났으며 결과를 표4에 나타내었다.
형질전환 들깨 T1종자의 지방산 분석
sample 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 total(㎍)
엽실들깨 6.9 1.9 13.5 16.2 61.5 410.1
22 7.4 1.5 12.5 19.7 58.9 354.5
23 7.7 1.6 17.9 42.3 30.6 382.0
24 7.7 1.6 16.2 45.0 29.5 418.9
27 7.8 1.5 12.9 19.9 57.9 319.3
29 7.4 1.6 14.1 33.2 43.7 398.8
61 7.1 1.4 13.4 16.5 61.6 434.8
68 6.7 1.5 11.1 13.6 67.1 436.0
80 7.4 1.1 14.0 33.8 43.8 435.4
84 7.2 1.2 14.3 41.3 36.0 442.3
87 7.2 1.3 14.7 40.2 36.6 496.7
93 7.1 1.5 14.9 57.1 19.4 465.0
96 7.2 1.2 13.6 36.7 41.3 458.5
99 6.8 1.1 14.7 49.6 27.7 471.4
100 7.1 1.3 15.2 38.4 38.0 452.1
101 6.6 2.0 13.9 15.0 62.4 468.9
103 6.6 1.7 14.8 14.2 62.7 526.9
109 6.9 1.6 14.4 49.8 27.3 346.3
112 7.0 1.8 10.6 15.8 64.8 413.5
121 6.8 1.7 15.6 12.8 63.1 467.1
124 7.8 1.9 17.0 30.2 43.2 371.4
128 7.4 1.6 16.4 13.5 61.2 466.0
131 7.3 1.7 16.7 11.5 62.8 410.4
134 7.3 1.7 15.9 12.8 62.3 435.7
142 7.9 1.7 16.2 47.9 26.2 420.4
144 7.4 1.4 14.3 14.2 62.6 405.6
146 7.7 1.2 14.4 34.0 42.6 416.6
148 7.5 1.3 17.3 38.9 35.0 441.5
157 6.9 1.7 15.7 12.1 63.5 439.0
160 7.4 1.6 15.7 11.7 63.6 414.0
163 7.7 1.6 14.6 11.1 64.9 445.1
166 7.3 1.1 16.1 11.8 63.8 458.3
167 7.4 1.2 16.0 12.0 63.3 442.7
173 7.8 1.3 16.4 40.1 34.4 435.0
형질전환들깨의 후대 분리비 검정
계통명 (T2) 개체수 고사주수 분리비 χ2-test 비고
93-1 53 0 - - 동형접합체 (고정, homo)
93-2 54 12 3 : 1 0.10 <P<0.90 이형접합체 (분리, hetero)
93-3 50 15 3 : 1 0.10 <P<0.90 "
93-4 57 14 3 : 1 0.90 <P<0.95 "
93-5 55 0 - - 동형접합체 (고정, homo)
93-6 57 14 3 : 1 0.90 <P<0.95 이형접합체 (분리, hetero)
142-1 55 0 - - 동형접합체 (고정, homo)
142-2 55 14 3 : 1 0.90 <P<0.95 이형접합체 (분리, hetero)
142-3 59 0 - - 동형접합체 (고정, homo)
142-4 57 10 3 : 1 0.10 <P<0.90 이형접합체 (분리, hetero)
142-6 56 0 - - 동형접합체 (고정, homo)
T2 종자의 지방산분석결과를 보면 모계통인(T1종자) 93번계통의 알파-리놀렌산 함량은 19.4%였으나 T2세대종자는 표5 에 있는 것처럼 고정세대인 93-1번의 경우는 알파-리놀렌산이 3.6%이고 분리세대는 20-25%정도였다. 다른 계통(142번)에서도 고정세대가 분리세대보다 전반적으로 알파-리놀렌산 함량이 더 많이 감소됨을 볼 수 있었다. T2종자의 지방산 분석을 그래프로 나타낸 제5도를 보면 대조구와 형질전환체의 지방산 조성차이를 극명하게 보여주고 있고 이를 보아 우리가 삽입한 유전자는 세대진전 후에도 정상적으로 작용함을 알 수 있다.
형질전환들깨 T2종자의 지방산 분석 결과
허sample 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 total
엽실들깨 8.5 2.0 12.0 13.6 63.9 407.0
93-1 7.5 1.9 14.0 72.9 3.6 450.3
93-2 7.3 2.0 13.6 51.3 25.8 374.2
93-3 7.5 2.0 14.4 55.3 20.9 399.4
99-1 7.0 2.5 14.6 46.6 29.4 460.6
99-2 7.0 2.2 14.6 61.3 14.9 481.4
99-3 7.1 2.6 16.2 44.9 29.1 452.3
109-1 7.5 1.8 14.3 56.9 19.4 484.0
109-2 7.6 2.0 15.6 66.4 8.4 440.6
109-3 7.4 1.9 14.5 49.2 27.0 490.4
142-1 7.5 2.1 14.4 66.5 9.5 486.7
142-2 7.6 1.9 13.4 54.2 22.9 425.1
142-3 7.4 2.0 14.1 63.5 12.9 455.3
23-1 7.4 2.2 14.0 44.3 32.1 453.7
61-1 7.4 2.3 11.8 16.2 62.2 466.6
80-1 7.5 2.1 13.9 45.5 30.9 436.1
84-1 7.5 1.9 14.7 54.4 21.4 419.6
87-1 7.4 2.0 14.0 65.7 10.9 420.2
96-1 7.9 1.9 14.2 60.3 15.7 439.2
124-1 7.6 2.1 13.6 40.7 36.0 417.7
146-1 7.7 2.0 14.4 59.7 16.2 487.7
148-1 7.6 2.0 14.7 62.4 13.3 492.3
149-1 7.9 2.0 12.9 39.7 37.6 457.1
실시예 6. 제초제 저항성 생물검정
상기 얻어진 재분화 개체에서 Bar 유전자의 최종산물인 단백질 즉, 포스피노트리신 아세틸전이효소(phosphinothricin acetyltransferase)가 생성되는 지를 GMO 진단키트 실험 및 실제 제초제 살포실험을 통해 확인하였다.
간편하게 전환유전자의 발현을 확인하기 위하여, 제초제 저항성 유전자(Bar) 발현단백질의 존재유무를 현장에서 손쉽게 확인할 수 있는 GMO(Genetically Modified Organism) 진단키트(Strategic Diagnostics Inc 사의 LL corn Grain test kit)를 활용하였다.
획득한 형질전환체에 0.3% basta용액(바스타액제, 미성농약)을 1회 살포하고 6～8일 경과 후에 제초제에 대해 저항성을 나타내는 개체를 1차로 선발하였다. 이어서 권장농도에 2배 더 강한 0.6% 바스타를 살포하여 제초제 저항성을 보이는 개체를 2차로 선발하였다. 후대 계통의 유지와 분석시에도 역시 제초제를 살포하여 생존한 개체를 형질전환체임을 확인하고 지방산 분석을 실시하였다.
그 결과 도6에 나타낸 바와 같이 형질전환체가 대조구에 비해 우수한 생육상태를 보임을 알 수 있었다.
알파-리놀렌산은 들깨의 주요 지방산으로 들깨 품종에 따라 차이는 있으나 지방산 총 함량 중 51~70%를 차지하고 있다. 들깨는 많은 양의 알파-리놀렌산을 함유하고 있어 식품영양학적으로 우수한 기름이나 알파-리놀렌산의 다량 함유는 산패가 쉽고 산패시 악취의 원인이 되는 등 장기간 저장을 어렵게 한다. 본 발명에 의한 알파-리놀렌산의 함량이 4%정도로 감소된 형질전환들깨는 기타 품종에 비하여 산패문제와 산패시 악취를 감소시키고 저장기간이 기존품종보다 연장될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

  1. delta 15 desaturase 유전자 발현을 억제하기 위한 서열번호 2에 기재된 RNAi 운반체.
  2. 청구항 1의 운반체를 이용하여 형질전환된 알파-리놀렌산 함량이 감소한 들깨.
  3. 청구항 1의 운반체를 이용하여 형질전환된 제초제 저항성이 우수한 들깨.
  4. 청구항 1의 운반체를 이용한 형질전환을 통해 알파-리놀렌산 함량이 감소되고 제초제 저항성이 우수한 들깨를 육종하는 방법.
  5. 삭제
KR1020070003113A 2007-01-11 2007-01-11 알파-리놀렌산 저함유 들깨 KR100794296B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070003113A KR100794296B1 (ko) 2007-01-11 2007-01-11 알파-리놀렌산 저함유 들깨

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070003113A KR100794296B1 (ko) 2007-01-11 2007-01-11 알파-리놀렌산 저함유 들깨

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100794296B1 true KR100794296B1 (ko) 2008-01-14

Family

ID=39217708

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020070003113A KR100794296B1 (ko) 2007-01-11 2007-01-11 알파-리놀렌산 저함유 들깨

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100794296B1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH021A (ja) * 1989-05-09 1990-01-05 Seiko Epson Corp カラーフィルター
US6441278B1 (en) 1996-07-03 2002-08-27 Cargill Incorporated Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content
WO2004001001A2 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Calgene Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
US20060107348A1 (en) 2004-09-29 2006-05-18 Monsanto Technology, L.L.C. High yielding soybean plants with low linolenic acid

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH021A (ja) * 1989-05-09 1990-01-05 Seiko Epson Corp カラーフィルター
US6441278B1 (en) 1996-07-03 2002-08-27 Cargill Incorporated Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content
WO2004001001A2 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Calgene Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
US20060107348A1 (en) 2004-09-29 2006-05-18 Monsanto Technology, L.L.C. High yielding soybean plants with low linolenic acid

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
염기서열-2001

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Streber et al. Transgenic tobacco plants expressing a bacterial detoxifying enzyme are resistant to 2, 4-D
KR20150085846A (ko) Tal-매개 전이 DNA 삽입방법
JPH01500718A (ja) ブラッシカの種における形質転換及び外来遺伝子の発現
BRPI0610819A2 (pt) regulação pós-transcricional da expressão gênica
CN109983122A (zh) 植物中的靶向基因组优化
KR100685520B1 (ko) 종자 특이적 프로모터, 이의 증폭용 프라이머, 이를포함하는 발현벡터 및 형질전환세포
JP5594137B2 (ja) カプシノイドを生合成する遺伝子改変植物
EP1140043A2 (en) Transgenic plants comprising a conditionally lethal gene
CN109748960A (zh) 调控抗铝毒转录因子stop1蛋白的基因及其应用
Ahn et al. Development of an efficient Agrobacterium-mediated transformation system and production of herbicide-resistant transgenic plants in garlic (Allium sativum L.)
JPH09504171A (ja) アンモニウム輸送体、該輸送体を含有するプラスミド、細菌、酵母、植物細胞および植物
KR100794296B1 (ko) 알파-리놀렌산 저함유 들깨
CN111295093A (zh) 用于转基因表达的植物启动子
CN112430684B (zh) 一种用于检测水稻植物h23的核酸序列及其检测方法
KR20150061840A (ko) 시금치 유래의 cyp85 유전자를 이용한 20-히드록시엑디손 함량이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체
US20060075525A1 (en) Transgenic Echinacea plants
KR101987663B1 (ko) 식물체에서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 LeMADS-RIN 유전자 편집에 의해 에틸렌 생산을 감소시키는 방법
EP1191103A1 (en) Grass containing genetically modified endophytes
KR101857606B1 (ko) 5-메틸트립토판 저항성 안트라닐레이트 합성효소 변이체 유전자의 형질전환식물체 선별마커로서의 용도
JP2007306917A (ja) イネの病原菌に対する抵抗性を高める方法及び病原菌耐性イネ形質転換体
KR100803391B1 (ko) 전신 발현 프로모터, 이의 증폭용 프라이머, 이를 포함하는발현벡터 및 형질전환 식물체
JP3964701B2 (ja) 病害抵抗性イネ科植物
AU4716499A (en) Water stress or salt stress tolerant transgenic cereal plants
KR100496029B1 (ko) 들깨 형질전환 방법과 그에 의해 생산된 제초제 저항성들깨
WO2023038075A1 (ja) 遺伝子改変植物、植物の作出方法、及び成長促進剤

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
G170 Publication of correction