BRPI0610819A2 - regulação pós-transcricional da expressão gênica - Google Patents

Abstract

REGULAçãO PóS-TRANSCRICIONAL DA EXPRESSãO GêNICA. A presente invenção fornece plantas transgênicas que possuem dentro do seu genoma DNA que inclui um gene exógeno que codifica um polipeptídeo e que possui em sua não traduzida a 3' uma seqúência de desestabilização, através da qual o polipeptídeo é expresso em um nível menor na semente de plantas transgênicas em relação à expressão na ausência da seqúência de desestabilização. São ainda descritos processos para diminuir após a transcrição a estabilidade da mensagem de um gene de interesse em uma planta que envolvem a adição de uma sequência de desestabilização na região não traduzida a 3' do gene de interesse.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "REGULA-ÇÃO PÓS-TRANSCRICIONAL DA EXPRESSÃO GÊNICA".

Este pedido de patente reivindica o benefício da data de depósi-to do pedido de Patente U.S. provisório N- de série 60/682.471, depositadoem 19 de maio de 2005, cuja descrição inteira é especificamente incorpora-da aqui como referência.

1. Campo da Invenção

A presente invenção se refere de forma geral à biologia molecu-lar de plantas e mais especificamente a métodos para a regulação pós-transcrição da expressão gênica em plantas.

2. Antecedentes da Invenção

No campo da biotecnologia, um foco principal tem sido sobre oaumento do nível de expressão de transgenes, por exemplo, para atingir umalvo comercial específico. Os elementos moleculares que regulam para me-nos a expressão gênica foram enormemente esquecidos porque foram ge-ralmente considerados como não possuindo valor comercial. Todavia, oselementos que regulam para menos a expressão gênica, especialmente e-lementos que regulam para menos a expressão gênica de uma maneira pre-visível, podem ser úteis, particularmente quando for desejável atingir um ní-vel específico de expressão gênica. Por exemplo, a expressão muito alta deum certo gene não é sempre desejável e pode-se desejar atingir a expres-são de um certo transgene acima de um nível ainda abaixo de um outro ní-vel. Enquanto a expressão gênica pode ser regulada na etapa de transcrição(por exemplo, através da seleção de promotores apropriados ou de elemen-tos promotores que serão utilizados com um certo transgene), é ainda possí-vel regular pós-transcricionalmente a expressão gênica. Tal controle pós-transcrição da expressão gênica também oferece a vantagem de ainda per-mitir utilizar os perfis temporais, espaciais ou de indução que podem ser ob-tidos através do uso de promotores apropriados ou de elementos promotores.

Uma abordagem para o controle pós-transcrição da expressãogênica é controlar a estabilidade do RNA mensageiro (mRNA) produzidopela transcrição gênica. Foi mostrado que inclusão de uma seqüência dedesestabilização na região não traduzida a 3' (3' UTR) de um RNA transcritodesestabiliza o mRNA e reduz a meia-vida do mRNA no tabaco {Nicotianatabacum) e nos RNAs de animais. Por exemplo, os genes SAUR (RNAs daauxina "up" pequena) de plantas contêm o elemento DST, uma seqüência de43 pares de base na região não traduzida a 3' (3' UTR) altamente conserva-da ao longo das espécies vegetais, que foi reportado como conferindo insta-bilidade nos mRNAs de SAUR pelo menos em plantas de tabaco. Vide, porexemplo, Newman e outros (1993), Green (1993) e Gutiérrez e outros (1999)e Feldbrugge e outros (2001), que são incorporados como referência aqui.

Não era sabido se o terminador de SAUR ou se o elemento DST teriam efei-tos similares sobre os RNAs de plantas de cultivo dicotiledôneas ou de plan-tas monocotiledôneas.

Acredita-se que um outro motivo de RNA conservado, várias có-pias de AUUUA, desestabiliza os mRNAs em animais e também é encontra-do em plantas; foi relatado que as repetições AUUUA desetabilizam os mR-NAs no tabaco enquanto que as repetições AUUAA não o fazem, indicando. especificidade de seqüência para este motivo e não apenas um conteúdo deAU. Vide, por exemplo, Ohme-Takagi e outros (1993) e Gutiérrez e outros(1999), que são incorporados aqui como referência. Entretanto, não era sa-, bido se a repetição AUUUA teria efeitos similares em outras dicotiledôneasou em plantas monocotiledôneas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece um método de regulação pós-transcricional da expressão gênica em uma planta, tal como plantas de culti-vo dicotiledôneas e plantas de cultivo monocotiledôneas. Mais especifica-mente, a presente invenção descreve um método de diminuição pós-transcricional da estabilidade da mensagem em uma planta, incluindo a adi-ção de uma seqüência desestabilizadora na região não traduzida a 3' de umgene de interesse na planta, em que a estabilidade da mensagem do genede interesse é diminuída pós-transcrição, resultando preferencialmente naexpressão do gene de interesse em um nível inferior relativo ao observadoquando a seqüência desestabilizadora não está presente.

Em um aspecto, a presente invenção fornece uma planta trans-gênica que possui em seu genoma DNA que compreende um gene exógenoque codifica um polipeptídeo e que possui em sua região não traduzida a 3'uma ou mais seqüências desestabilizadoras, em que o polipeptídeo é ex-presso em um nível menor na semente da planta transgênica em relação àexpressão na ausência de uma ou mais seqüências desestabilizadoras.

Em um outro aspecto, a presente invenção reivindica uma plantatransgênica que possui em seu genoma DNA que inclui um promotor nãoconstitutivo ligado de forma operacional a um gene exógeno que codifica umpolipeptídeo e que possui em sua região não traduzida a 3' uma ou mais se-qüências desestabilizadoras, em que o polipeptídeo é expresso em um nívelinferior na planta transgênica em relação à expressão na ausência da umaou mais seqüências desestabilizadoras.

Em um aspecto adicional, a presente invenção reivindica umaplanta de cultivo transgênica utilizada para alimento ou alimentação e quepossui em seu genoma DNA que inclui um gene exógeno que codifica umpolipeptídeo e que possui em sua região não traduzida a 3' uma ou mais se-qüências desestabilizadoras, em que o polipeptídeo é expressor em um nívelmenor na planta de cultivo transgênica utilizada para alimento ou alimenta-ção em relação à expressão na ausência da uma ou mais seqüências deses-tabilizadoras.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção reivindica umaplanta transgênica que possui em seu genoma DNA que compreende umgene exógeno que codifica um polipeptídeo e que possui em sua região nãotraduzida a 3' uma ou mais seqüências desestabilizadoras incluindo repeti-ções ATTTAA sobrepostas, em que o dito polipeptídeo é expresso em umnível menor na dita planta transgênica em relação à expressão na ausênciada dita uma ou mais seqüências desestabilizadoras.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção reivindica ain-da uma planta transgênica que possui em seu genoma DNA que inclui umgene que codifica a antranilato sintase e que possui na sua região não tra-duzida a 3' uma ou mais seqüências desestabilizadoras, em que a antranila-to sintase é expressa em um nível menor na planta transgênica em relação àexpressão na ausência da uma ou mais seqüências desestabilizadoras.

A presente invenção fornece ainda métodos para diminuir pós-transcrição a estabilidade da mensagem de um gene de interesse em umaplanta de cultivo utilizada para alimento ou alimentação. Em uma modalida-de, o método inclui a adição de uma ou mais seqüências desestabilizadorasna região não traduzida a 3' do gene de interesse na planta de cultivo utili-zada para alimento ou alimentação, em que a estabilidade da mensagem dogene de interesse é diminuída pós-transcrição e resulta preferencialmentena expressão do gene em um nível menor que aquele em que a uma oumais seqüências desestabilizadoras estão ausentes.

Outras modalidades específicas da invenção são divulgadas nadescrição detalhada a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

FIGURA 1. Exemplos não limitantes de construções que contêmseqüências desestabilizadoras que são utilizadas nos experimentos detransformação transitória descritos nos exemplos abaixo. Um planejamentogeral é ilustrado e os elementos pertinentes das construções são listados.

FIGURA 2. Um exemplo não limitante de elementos desestabili-zadores úteis na diminuição do nível de expressão de um gene ou polipeptí-deo como descrito no Exemplo 2. Variações diferentes de terminadores deSAUR (pMON63688) diminuíram eficientemente a expressão gênica quandocomparados com o terminador NOS (pMON63691) em construções utilizan-do o promotor Lea9 controlando o gene GUS.

FIGURA 3. Um exemplo não limitante de elementos desestabili-zadores úteis na diminuição do nível de expressão de um gene ou polipeptí-deo como descrito no Exemplo 2. O terminador SAUR (pMON63688, varia-ção 1) diminuiu eficientemente a expressão gênica quando comparado como terminador NOS (pMON 13773) em construções utilizando o promotor7Salpha' que controla o gene GUS.

FIGURA 4. Um exemplo não limitante de elementos desestabili-zadores úteis na diminuição do nível de expressão de um gene ou polipeptí-deo como descrito no Exemplo 4. O elemento 2XDST em combinação com oterminador NOS (pMON63687) pode diminuir eficientemente a expressãogênica quando comparado com o terminador NOS isoladamente(pMON58101) em construções utilizando o promotor USP controlando o ge-ne GUS.

FIGURA 5. Um exemplo não limitante de elementos desestabili-zadores úteis na diminuição do nível de expressão de um gene ou polipeptí-deo como descrito no Exemplo 4. O elemento 2XDST em combinação com oterminador NOS (pMON63698) diminuiu eficientemente a expressão gênicaquando comparado com o terminador NOS isoladamente (pMON13773) emconstruções utilizando o promotor 7Salpha' controlando o gene GUS.

FIGURA 6. Um exemplo não limitante de elementos desestabili-zadores úteis na diminuição do nível de expressão de um gene ou polipeptí-deo como descrito no Exemplo 4. O elemento 2XDST em combinação com oterminador NOS (pMON63697) diminuiu eficientemente a expressão gênicaquando comparada com o terminador NOS isoladamente (pMON63691) emconstruções utilizando o promotor Lea9 controlando o gene GUS.

FIGURA 7. Um exemplo não limitante de elementos desestabili-zadores úteis na diminuição do nível de expressão de um gene ou polipeptí-deo como descrito no Exemplo 8. Números de cópias diferentes do elementoDST em combinação com os terminadores NOS (pMON78113, pMON78116,pMON78117) diminuíram eficientemente a expressão gênica quando compa-rados com o terminador NOS isoladamente (pMON64316) em construçõesque utilizam o promotor Perl controlando o gene GUS. O número de cópiasde DST estava negativamente correlacionado com o nível de expressão gê-nica.

FIGURA 8. Exemplos não limitantes de construções contendoseqüências desestabilizadoras e úteis para gerar as plantas transgênicas dainvenção. Um planejamento geral é ilustrado e os elementos principais dasconstruções são listados como descrito no Exemplo 9.

A FIGURA 9 apresenta exemplos não limitantes de elementosdesestabilizadores úteis na diminuição do nível de expressão de um gene oupolipeptídeo como descrito no Exemplo 9. Os elementos DST e ricos em AL)diminuíram eficientemente a expressão gênica em um sistema de expressãotransitória de milho. O terminador SAUR continha 1X DST. É mostrado odesvio padrão. Os níveis de expressão mostrados são relativos aos vetoresde controle que continham o terminador NOS, o espaçador 1 ou o espaçador 2.

A FIGURA 10 apresenta exemplos não limitantes de elementosdesestabilizadores úteis na diminuição do nível de expressão de um gene oupolipeptídeo como descrito no Exemplo 10. Os níveis menores de triptofano(Trp) foram atingidos na soja transgênica através da inclusão de elementosdesestabilizadores (motivos DST) na região não traduzida a 3'. O softwareestatístico JUMP foi utilizado para gerar o gráfico, que apresenta os resulta-dos de valores de sementes R1 individuais de vários eventos. As linhas hori-zontais são os valores médios do nível de Trp que são fornecidos em partespor milhão (ppm). Os círculos mostrados na coluna marcada com "t de Stu-dents para Cada Par" representam a variabilidade do nível de Trp em cadasemente; o tamanho do círculo indica o grau de variabilidade. Quando ne-nhum dos círculos se sobrepõe com um outro, os valores médios são a dife-rença estatisticamente significativa de cada outro.

FIGURA 11. Exemplos não limitantes de elementos desestabili-zadores úteis na diminuição do nível de expressão de um gene ou polipeptí-deo como descrito no Exemplo 9. Os níveis menores de triptofano (Trp) fo-ram correlacionados com níveis menores de RNA no estágio estacionário nasoja transgênica, que demonstra que a inclusão de 2 cópias dos elementosdesestabilizadores (motivos DST) na região não traduzida a 3' é suficientepara diminuir os produtos da transcrição. Sementes imaturas dos dois even-tos de pMON63680 (-DST) e dos dois eventos de pMON66892 (+DST) fo-ram coletadas e o RNA total foi extraído utilizando o método convencional.

Uma parte do RNA foi utilizada para quantificar o nível do produto da trans-crição por Taqman e a outra parte foi utilizada para análise de Northern. Opainel A mostra o nível do Produto da Transcrição por Taqman. Para -DST,s1-s4 eram plantas de um evento e s5-s7 eram plantas de um segundo e-vento. Para +DST, s8-s9 eram plantas de um evento e s10-s15 eram plantasde um segundo evento. O painel B mostra o nível do produto da transcriçãorelativo em um northern blot. O Agro AS foi utilizado como uma sonda. Osresultados de Taqman e do northern são coerentes um com o outro. A parteinferior do painel B mostra a quantidade de carregamento relativa de RNA noblot.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

I. Plantas transaênicas

A presente invenção fornece uma planta transgênica que possuiem seu genoma DNA que compreende um gene exógeno que codifica umpolipeptídeo e que possui em sua região não traduzida a 3" uma seqüênciadesestabilizadora, em que o polipeptídeo é expresso em um nível menor nasemente da planta transgênica em relação à expressão na ausência da se-qüência desestabilizadora.

A planta transgênica pode ser derivada de qualquer planta mo-nocotiledônea ou dicotiledônea de interesse, incluindo, mas não limitada àsplantas de interesse comercial ou agrícola, tais como plantas de cultivo (es-pecialmente plantas de cultivo utilizadas para alimentos humanos ou alimen-tação animal), árvores produtoras de madeira ou polpa, plantas vegetais,plantas de frutos e plantas ornamentais. Os exemplos não limitantes de plan-tas de interesse incluem plantas de cultivo de grãos tais como trigo, aveia,cevada, milho, centeio, triticale, arroz, painço, sorgo, quinoa, amaranto etrigo-sarraceno; plantas de cultivo de forragem tais como gramíneas forragei-ras e alfafa forrageira; plantas de cultivo de semente oleosa tais como algo-dão, açafroa, girassol, soja, canola, semente de colza, linho, amendoins edendê; castanhas de árvores (tais como noz, caju, avelã, pecan, amêndoa esimilares); cana-de-açúcar, coco, tamareira, oliva, beterraba-de-açúcar, cháe café; árvores produtoras de madeira ou polpa; plantas de cultivo vegetaistais como legumes (por exemplo, feijões, ervilhas, lentilhas, alfalfa, amendo-im), alface, aspargo, alcachofra, aipo, cenoura, rabanete, as brassicas (porexemplo, repolhos, couves, mostardas e outras brassicas folhosas, brócolis,couve-flor, couve de Bruxelas, nabo, couve-rábano), cucubitáceas comestí-veis (por exemplo, pepinos, melões, abóboras de verão, abóboras de inver-no), tipos de alho e cebola comestíveis (por exemplo, cebolas, alho, alho-poró, chalota, cebolinha), membros comestíveis da família botânica Solana-ceae (por exemplo, tomates, berinjelas, batatas, pimentas, Physallis) emembros comestíveis de Chenopodiaceae (por exemplo, beterraba, acelga,espinafre, quinoa, amaranto); plantas de cultivo frutíferas tais como maçã,pêra, frutas cítricas (por exemplo, laranja, lima, limão, toranja e outras), dru-pas (por exemplo, damasco, pêssego, ameixa, nectarina), banana, abacaxi,uva, kiwi, papaia, abacate e bagas; e plantas ornamentais incluindo plantasde flores ornamentais, árvores ornamentais e arbustos, plantas rasteiras or-namentais e gramíneas ornamentais. As plantas dicotiledôneas preferidasincluem, mas não estão limitadas a canola, algodão, batata, quinoa, amaran-to, trigo-sarraceno, açafroa, soja, beterraba-de-açúcar e girassol, mais prefe-rencialmente soja, canola e algodão. Em uma modalidade particularmentepreferida, a planta transgênica é uma planta monocotiledônea transgênica,mais preferencialmente uma planta de cultivo monocotiledônea transgênica,tal como, mas não limitada a trigo, aveia, cevada, milho, centeio, triticale,arroz, gramíneas ornamentais e forrageiras, sorgo, painço e cana-de-açúcar,mais preferencialmente milho, trigo e arroz. Por "gene exógeno" entende-sequalquer gene que ocorre fora do contexto em que este ocorre normalmentena natureza.

Assim, um gene exógeno pode ser um gene não nativo a e in-troduzido na forma de um transgene na planta transgênica da invenção oupode ser um gene nativo à planta transgênica da invenção, mas localizadoem um contexto sem ser aquele em que ocorre normalmente na natureza(por exemplo, um gene nativo ligado de forma operacional a um promotornão nativo e introduzido na forma de um transgene na planta). O termo "li-gado de forma operacional" quando utilizado em referência à relação entreas seqüências de ácidos nucléicos e/ou às seqüências de aminoácidos serefere à ligação das seqüências de forma que realizem sua função pretendi-da. Por exemplo, a ligação de forma operacional de uma seqüência promoto-ra a uma seqüência de nucleotídeos de interesse se refere à ligação da se-qüência promotora e a seqüência de nucleotídeos de interesse de uma ma-neira tal que a seqüência promotora seja capaz de direcionar a transcriçãoda seqüência de nucleotídeos de interesse e/ou a síntese de um polipeptí-deo codificado pela seqüência de nucleotídeos de interesse. O termo tam-bém se refere à ligação de seqüências de aminoácidos de tal maneira queuma proteína funcional é produzida.

O gene exógeno que codifica um polipeptídeo pode ser qualquergene exógeno de interesse que é transcrito em um produto da transcrição deRNA que pode pelo menos em parte ser traduzido em um polipeptídeo, pre-ferencialmente um gene que transcreve um RNA mensageiro (mRNA) quecontém ou pode ser produzido para conter uma região não traduzida a 3' (3'UTR) na qual a seqüência desestabilizadora pode ser colocada. O gene e-xógeno pode incluir uma seqüência que ocorre naturalmente ou um derivadoou homólogo de tal seqüência que ocorre naturalmente. Os derivados ou oshomólogos de seqüências que ocorrem naturalmente podem incluir, mas nãoestão limitados a deleções de seqüência, mutações pontuais isoladas oumúltiplas, alterações em um sítio de enzima de restrição particular, adição deelementos funcionais ou outros meios de modificação molecular de uma se-qüência que ocorre naturalmente. As técnicas para a obtenção de tais deri-vados são bem-conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, as metodologiasdivulgadas em Sambrook e Russell, 2001, incorporado aqui como referência.

Os exemplos não limitantes de genes exógenos adequados in-cluem genes que codificam fatores de transcrição e genes que codificamenzimas envolvidas na biossíntes ou no catabolismo de moléculas de inte-resse (tais como aminoácidos, ácidos graxos e outros lipídeos, açúcares eoutros carboidratos e polímeros biológicos). Os exemplos não limitantes es-pecíficos de genes exógenos adequados incluem genes que codificam a an-tranilato sintase; genes envolvidos em vias biossinteticas de várias etapas,em que pode ser de interesse regular o nível de um ou mais intermediários,tais como genes que codificam enzimas para a biossíntese do polihidroxial-canoato (vide, por exemplo, a Patente U.S. N- 5.750.848, incorporada espe-cificamente aqui como referência); genes que codificam proteínas de contro-le de ciclo celular, tais como proteínas com atividade similar ao inibidor dequinase dependente de ciclina (CDK) (vide, por exemplo, os genes divulga-dos na WO 05007829, incorporada especificamente aqui como referência);genes que codificam proteínas que, quando expressas nas plantas transgê-nicas, tornam as plantas transgênicas resistentes a pragas ou a agentes pa-togênicos (vide, por exemplo, os genes para colesterol oxidase que são di-vulgados na Patente U.S. N- 5.763.245, incorporada especificamente aquicomo referência); genes que codificam proteínas que codificam uma caracte-rística que pode ser selecionada (tal como resistência a antibióticos, especi-almente se for desejável expressar tal gene em um nível suficiente parapermitir a seleção de uma célula que carrega o gene, mas não tão alto parapermitir que células adjacentes que não carregam o gene "escapem" ou so-brevivam à seleção); genes em que a expressão é preferencialmente transi-tória (por exemplo, genes envolvidos na resistência a pragas ou agentes pa-togênicos, especialmente quando a expressão é induzida pela praga ou peloagente patogênico); e genes que podem induzir ou restaurar a fertilidade(vide, por exemplo, os genes barstar/barnase descritos na Patente U.S. N26.759.575, incorporada especificamente aqui como referência).

A seqüência desestabilizadora pode incluir qualquer seqüênciaque confira instabilidade ao RNA transcrito pelo gene exógeno, por exemplo,através da diminuição da estabilidade ou da meia-vida de um mRNA trans-crito partondo do gene endógeno. Em uma modalidade preferida, a seqüên-cia desestabilizadora é pelo menos uma selecionada do terminador SAUR a3', um elemento DST, um motivo ATTTA, um motivo ATTTAA e uma combi-nação de motivos ATTTA e ATTTAA. Os motivos de DNA ATTTA ou ATT-TAA são transcritos nos motivos de RNA AUUUA ou AUUUAA. Mais prefe-rencialmente, a presença da seqüência desestabilizadora resulta na expres-são do gene exógeno em um nível menor na planta transgenica em relaçãoà expressão na ausência da seqüência desestabilizadora. Mais de uma se-qüência desestabilizadora ou várias cópias de uma ou mais seqüências de-sestabilizadoras, podem ser utilizadas. Nos exemplos não limitantes, umaplanta transgênica da invenção pode ter em seu genoma DNA que inclui umgene exógeno que possui em sua região não traduzida a 3' pelo menos umterminador SAUR ou várias cópias de elementos DST ou uma combinaçãode terminadores SAUR, elementos DST ou uma combinação de motivosATTTA e ATTTAA.

O terminador SAUR a 3' pode ser um terminador SAUR a 3' deseqüência conhecida, cujos exemplos não limitantes incluem variações doterminador SAUR a 3' amplificadas pela PCR partindo do DNA genômico deArabidopsis utilizando iniciadores baseados em um gene SAUR publicado,SAUR-AC1 (vide Gil e outros (1994), que é incorporado aqui como referên-cia) e divulgados aqui com SEQ ID N-: 1, SEQ ID N2: 2, SEQ ID N2: 3 e SEQID N2: 4.

O terminador SAUR a 3' também pode ser um novo homólogodo terminador SAUR a 3', que pode ser identificado por um versado na téc-nica, por exemplo, através da identificação de homólogos aos genes SAURconhecidos e do seqüenciamento da região 3' UTR destes genes ou atravésda identificação direta de homólogos de terminadores SAUR a 3' conheci-dos.

Similarmente, o elemento DST pode ser um elemento DST co-nhecido ou um novo homólogo do elemento DST. Os exemplos não limitan-tes de um elemento DST incluem um elemento DST do gene 15A da soja, talcomo divulgado aqui como SEQ ID Ns: 5 ("1XDST"), SEQ ID N2: 6("2XDST"), SEQ ID N2: 7 ("3XDST"), SEQ ID N2: 8 ("4XDST"), SEQ ID N2: 9("5XDST") e SEQ ID N2: 10 ("6XDST").

Os motivos ATTTA adequados incluem seqüências que contêmrepetições de ATTTA. Os motivos ATTTAA adequados incluem seqüênciasque contêm repetições de ATTTAA. Preferencialmente, pelo menos 3 cópiasdos motivos ATTTA ou ATTTAA são observadas na seqüência repetitiva. Asmodalidades não limitantes incluem seqüências desestabilizadoras que in-cluem 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 e até mais de 15 cópias dosmotivos ATTTA ou ATTTAA em uma repetição sobreposta. Assim, os exem-plos não limitantes incluem 3x ATTTA (ATTTATTTATTTA (SEQ ID N2: 27)),5x ATTTA (ATTTATTTATTTATTTATTTA (SEQ ID N-: 28)), 11x ATTTAA(ATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAA (SEQ ID N2: 29)) e uma combinação de 7x ATTTA/ATTTAA (por exem-plo, ATTTATTTATTTAATTTAATTTAATTTATTTAA (SEQ ID N2: 30) e com-binações similares). Estes exemplos são fornecidos para ilustrar a naturezade sobreposição das repetições e não devem ser interpretados como limitan-tes de forma alguma.

As seqüências homólogas podem ser identificadas, por exemplo,através do uso de ferramentas de comparação conhecidas pelos versadosna técnica, tal como, mas não limitada a BLAST (Altschul e outros (1997),que é incorporado aqui como referência). Assim, as seqüências de DNA ge-nômico provenientes de uma espécie vegetal de interesse, especialmente deuma planta de cultivo de interesse, podem ser pesquisadas em relação ahomólogos de SAUR, homólogos de terminadores de SAUR a 3' conhecidosou homólogos de elementos DST conhecidos. Um versado na técnica reali-zará que uma variedade de iniciadores poderia ser planejada utilizando se-qüências de SAUR conhecidas, seqüências terminadoras de SAUR a 3' co-nhecidas ou elementos DST conhecidos (por exemplo, seqüências forneci-das em Newman e outros (1993), McCIure e outros (1989) e Yamamoto eoutros (1992) e Gil e outros (1994) e seqüências fornecidas aqui na SEQ IDN2: 1 até a SEQ ID N2: 10) para amplificar e isolar o DNA para seqüencia-mento e análise em relação à capacidade de desestabilizar produtos datranscrição de mRNA utilizando métodos adequados tais como os fornecidosnesta descrição, fornecendo assim novas seqüências SAUR adicionais, no-vas seqüências terminadoras de SAUR a 3' ou novos elementos DST úteisna presente invenção.

Além disso, modificações nas seqüências desestabilizadorasconhecidas ou novas podem ser feitas por um versado na técnica. As modi-ficações podem incluir, mas não estão limitadas a deleções de seqüência,mutações pontuais isoladas ou múltiplas, alterações em um sítio de enzimade restrição particular, adição de elementos funcionais, repetição de elemen-tos ou outros meios de modificação molecular que podem deixar inalteradaou até mesmo intensificar, a capacidade das seqüências desestabilizadorasde desestabilizar os produtos da transcrição de mRNA. As técnicas para aobtenção de tais derivados são bem-conhecidas na técnica. Vide, por exem-plo, as metodologias divulgadas em Sambrook e Russell, 2001, incorporadoaqui como referência. As técnicas para a mutagênese ou para a criação dedeleções em um segmento de DNA são bem-conhecidas pelos versados natécnica e são divulgadas em detalhes, por exemplo, na Patente U.S. N-6.583.338, que é incorporada aqui como referência em sua totalidade.

Em uma modalidade não limitante da invenção, a planta trans-gênica é uma planta de cultivo dicotiledônea (por exemplo, soja) ou umaplanta de cultivo monocotiledônea (por exemplo, milho) em que é desejadofornecer um conteúdo modificado de aminoácidos na planta de cultivo trans-gênica ou na semente da planta de cultivo transgênica e o gene exógeno éum gene para a biossíntese de um aminoácido (por exemplo, lisina, triptofa-no ou metionina); uma seqüência ou seqüências desestabilizadoras podemser utilizadas para expressar o gene de biossíntese de aminoácidos em umnível menor na planta ou na semente de cultivo transgênica em relação àexpressão na ausência da seqüência desestabilizadora, fornecendo assimvárias opções para a composição de aminoácidos da planta ou da sementede cultivo transgênica.

A presente invenção fornece ainda uma planta transgênica quepossui em seu genoma DNA que inclui um promotor não constitutivo ligadode forma operacional a um gene exógeno que codifica um polipeptídeo eque possui em sua região não traduzida a 3' uma seqüência desestabilizado-ra, em que o polipeptídeo é expresso em um nível menor na planta transgê-nica em relação à expressão na ausência da seqüência desestabilizadora.

A planta transgênica pode ser derivada de qualquer planta mo-nocotiledônea ou dicotiledônea de interesse; em algumas modalidades pre-feridas, a planta transgênica é uma planta de cultivo. Uma descrição de plan-tas adequadas para a invenção é fornecida anteriormente sob o título"Transgenic Plants I".

Os promotores não constitutivos adequados para uso com asplantas transgênicas da invenção incluem promotores específicos espacial-mente, promotores específicos temporalmente e promotores que podem serinduzidos. Os promotores específicos espacialmente podem incluir promoto-res específicos a organelas, células, tecidos ou órgãos (por exemplo, umpromotor específico ao plastídeo, específico à raiz ou específico à sementepara a supressão da expressão do RNA-alvo nos plastídeos, raízes ou se-mentes, respectivamente). Os promotores específicos temporalmente podemincluir promotores que tendem a promover a expressão durante certos está-gios do desenvolvimento no ciclo de crescimento de uma planta ou durantemomentos diferentes do dia ou da noite ou em estações diferentes em umano. Os promotores que podem ser induzidos incluem promotores induzidospor agentes químicos ou por condições ambientais tais como, mas não limi-tadas ao estresse biótico ou abiótico (por exemplo, déficit de água ou seca,calor, frio, níveis de nutrientes ou de sais, níveis altos ou baixos de luz ouinfecção por pragas ou agentes patogênicos). Um promotor específico à ex-pressão também pode incluir promotores que são geralmente expressos deforma constitutiva, mas em graus ou "forças" diferentes de expressão, inclu-indo promotores comumente considerados como "promotores fortes" ou co-mo "promotores fracos".

Muitos promotores funcionais específicos à expressão em plan-tas e úteis no método da invenção são conhecidos na técnica. Por exemplo,a Patente U.S. N2 5.837.848, a Patente U.S. N2 6.437.217 e a Patente U.S.N2 6.426.446 descrevem promotores específicos à raiz; a Patente U.S. N26.433.252 descreve um promotor da oleosina L3 do milho; a Publicação doPedido de Patente U.S. 2004/0216189 descreve um promotor para um genenuclear de planta que codifica uma aldolase localizada no plastídeo; a Pa-tente U.S. N2 6.084.089 descreve promotores que podem ser induzidos pelofrio; a Patente U.S. N2 6.140.078 descreve promotores que podem ser indu-zidos pelo sal; a Patente U.S. N2 6.294.714 descreve promotores que podemser induzidos pela luz; a Patente U.S. N2 6.252.138 descreve promotoresque podem ser induzidos por agentes patogênicos; e a Publicação do Pedi-do de Patente U.S. 2004/0123347 descreve promotores que podem ser in-duzidos por déficit de água. Cada uma das patentes e publicações que des-creve promotores e o uso dos mesmos, especialmente em construções deDNA recombinante funcionais em plantas, é especificamente incorporadaaqui como referência.

As seqüências de ácidos nucléicos que não são promotores ouelementos promotores ou homólogos dos mesmos que ocorrem naturalmen-te, mas que podem regular a expressão de um gene também podem ser Ci-teis para uso com as plantas transgênicas da invenção. Os exemplos de taisseqüências reguladoras "independentes do gene" incluem seqüências deRNA que ocorrem naturalmente ou planejadas artificialmente que incluemuma região de ligação ao ligante ou aptâmero e uma região reguladora (quepode ter atuação em eis). Vide, por exemplo, Isaacs e outros (2004), Bayer eSmolke (2005), Mandai e Breaker (2004), Davidson e Ellington (2005), Win-kler e outros (2002), Sudarsan e outros (2003) e Mandai e Breaker (2004),dos quais cada um é incorporado especificamente aqui como referência.Tais "riborreguladores" poderiam ser selecionados ou planejados para espe-cificidade espacial ou temporal específica, por exemplo, para regular a tra-dução do gene exógeno apenas na presença (ou ausência) de uma certaconcentração do ligante apropriado.

O gene exógeno que codifica um polipeptídeo pode ser qualquergene exógeno de interesse que é transcrito em um produto da transcrição deRNA que pode ser pelo menos em parte traduzido em um polipeptídeo, pre-ferencialmente um gene que transcreve um RNA mensageiro (mRNA) quecontém ou pode ser produzido para conter uma região não traduzida a 3' (3'UTR) na qual a seqüência desestabilizadora pode ser colocada. Os exem-plos de genes exogenos adequados são descritos sob o título "TransgenicPlants I". A seqüência desestabilizadora pode incluir qualquer seqüência queconfira instabilidade ao RNA transcrito pelo gene exógeno, por exemplo, a-través da diminuição da estabilidade ou da meia-vida de um mRNA transcritopartindo do gene endógeno. Em uma modalidade preferida, a seqüência de-sestabilizadora é pelo menos uma selecionada de um terminador SAUR a 3',um elemento DST, um motivo ATTTA, um motivo ATTTAA e uma combina-ção de motivos ATTTA e ATTTAA, que são também descritos sob o título"Transgenic Plants I".

A invenção fornece ainda uma planta de cultivo transgênica utili-zada para alimento ou para alimentação e que possui em seu genoma DNAque inclui um gene exógeno que codifica um polipeptídeo e que possui emsua região não traduzida a 3' uma seqüência desestabilizadora, em que opolipeptídeo é expresso em um nível menor na planta de cultivo transgênicautilizada para alimento ou para alimentação em relação à expressão na au-sência da seqüência desestabilizadora.

A planta de cultivo transgênica utilizada para alimento ou paraalimentação pode ser qualquer planta de cultivo monocotiledônea ou dicoti-ledônea utilizada para alimento ou para alimentação, cujos exemplos ade-quados são fornecidos anteriormente sob o título "Transgenic Plants I". Asplantas de cultivo dicotiledônea preferidas utilizadas para alimento ou paraalimentação incluem, mas não estão limitadas a canola, algodão, batata,quinoa, amaranto, trigo-sarraceno, açafroa, soja, beterraba-de-açúcar e gi-rassol, mais preferencialmente soja, canola e algodão. As plantas de cultivomonocotiledôneas preferidas utilizadas para alimento ou alimentação inclu-em, mas não estão limitadas a trigo, aveia, cevada, milho, centeio, triticale,arroz, gramíneas forrageiras, sòrgo, painço e cana-de-açúcar, mais prefe-rencialmente milho, trigo e arroz. Em algumas modalidades específicas, asoja e o milho são plantas particularmente preferidas.

O gene exógeno que codifica um polipeptídeo pode ser qualquergene exógeno de interesse que é transcrito em um produto da transcrição deRNA que pode pelo menos em parte ser traduzido em um polipeptídeo, pre-ferencialmente um gene que se transcreve em um RNA mensageiro (mRNA)que contém ou pode ser produzido para conter uma região não traduzida a3' (3' UTR) na qual a seqüência desestabilizadora pode ser colocada. Osexemplos de genes exógenos adequados são descritos anteriormente sob otítulo "Transgenic Plants I". A seqüência desestabilizadora pode incluir qual-quer seqüência que confira instabilidade ao RNA transcrito pelo gene exó-geno, por exemplo, diminuindo a estabilidade ou a meia-vida de um mRNAtranscrito partindo do gene endógeno. Em uma modalidade preferida, a se-qüência desestabilizadora é pelo menos uma selecionada de um terminadorSAUR a 3', um elemento DST, um motivo ATTTA, um motivo ATTTAA e umacombinação de motivos ATTTA e ATTTAA, como também descrito anterior-mente sob o título "Transgenic Plants I".

II. Repetições ATTTAA

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma plantatransgênica que possui em seu genoma DNA que compreende um gene e-xógeno que codifica um polipeptídeo e que possui na sua região não tradu-zida a 3' uma seqüência desestabilizadora que inclui repetições ATTTAAsobrepostas, em que o dito polipeptídeo é expresso em um nível menor nadita planta transgênica em relação à expressão na ausência da dita seqüên-cia desestabilizadora.

A planta transgênica pode ser derivada de qualquer planta mo-nocotiledônea ou dicotiledônea de interesse; em algumas modalidades pre-feridas, a planta transgênica é uma planta de cultivo. Uma descrição de plan-tas adequadas para este aspecto da invenção é fornecida anteriormente sobo título "Transgenic Plants I".

O gene exógeno que codifica um polipeptídeo pode ser qualquergene exógeno de interesse que é transcrito em um produto da transcrição deRNA que pode pelo menos em parte ser traduzido em um polipeptídeo, pre-ferencialmente um gene que se transcreve em um RNA mensageiro (mRNA)que contém ou pode ser produzido para conter uma região não traduzida a3' (3' UTR) na qual a seqüência desestabilizadora pode ser colocada. Osexemplos de genes exógenos adequados são descritos anteriormente sob otítulo "Transgenic Plants I".

A seqüência desestabilizadora inclui repetições ATTTAA sobre-postas. Em uma modalidade preferida, a seqüência desestabilizadora incluipelo menos 3 repetições ATTTAA sobrepostas e pode incluir 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15 e até mesmo mais de 15 cópias do motivo ATTTAA emuma repetição sobreposta. Assim, os exemplos não limitantes incluem 3xATTTAA (ATTTAATTTAATTT A A; SEQ ID N2: 31), 5x ATTTAA (ATTTAATT-TAATTTAATTTAATTTAA; SEQ ID Ns: 32) e 11x ATTTAA(ATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAA; SEQ ID N2: 29). Em outras modalidades, as repetições ATTTAA so-brepostas podem ser encontradas em combinação com repetições ATTTA,tal como nas combinações descritas anteriormente sob o título "TransgenicPlants I".

III. Plantas Transqênicas com Expressão Moderada da Antranilato Sintase

A presente invenção fornece ainda uma planta transgênica quepossui em seu genoma DNA que inclui um gene que codifica a antranilatosintase e que possui em sua região não traduzida a 3' uma seqüência de-sestabilizadora, em que a antranilato sintase é expressa em um nível menorna planta transgênica em relação à expressão na ausência da seqüênciadesestabilizadora.

A planta transgênica pode ser derivada de quaisquer plantasmonocotiledôneas ou dicotiledôneas de interesse tais como são fornecidasanteriormente sob o título "Transgenic Plants I". Em algumas modalidadespreferidas, a planta transgênica pode ser uma planta de cultivo, tal comoplantas de cultivo em que é desejado aumentar os níveis de triptofano naplanta inteira ou em tecidos ou células vegetais específicas. Os exemplosnão limitantes incluem modalidades em que a planta transgênica é soja oumilho.

O gene que codifica a antranilato sintase pode ser qualquer ge-ne que ocorra naturalmente para a seqüência do antranilato ou homólogosdestes genes, tais como podem ser identificados partindo dos bancos dedados de seqüências através do uso de ferramentas de comparação conhe-cidas pelos versados na técnica, tal como, mas não limitado a BLAST (Alts-chul e outros (1997), que é incorporado aqui como referência). O gene quecodifica a antranilato sintase pode incluir uma seqüência derivada com baseem uma antranilato sintase que ocorre naturalmente, mas com uma ou maismodificações tais como deleções de seqüência, mutações pontuais isoladasou múltiplas, alterações em um sítio de enzima de restrição particular, adiçãode elementos funcionais, repetição de elementos ou outros meios de modifi-cação molecular. Tais modificações podem ser feitas para aumentar ou alte-rar as propriedades da antranilato sintase na planta transgênica. Um exem-plo não limitante de modificação inclui a otimização de códons de uma an-tranilato sintase procariótica para expressão em uma planta transgênica.

O gene para a antranilato sintase contém preferencialmente nasua região não traduzida a 3' uma seqüência desestabilizadora, que podeincluir qualquer seqüência que confira instabilidade ao gene para o RNAtranscrito da antranilato sintase, por exemplo, através da diminuição da es-tabilidade ou da meia-vida de um mRNA transcrito partindo do gene para aantranilato sintase. Em uma modalidade preferida, a seqüência desestabili-zadora é pelo menos uma selecionada de um terminador SAUR a 3', um e-lemento DST, um motivo ATTTA, um motivo ATTTAA e uma combinação demotivos ATTTA e ATTTAA, como também descrito anteriormente sob o título"Transgenic Plants I". Mais preferencialmente, a seqüência desestabilizadoraé tal que a antranilato sintase é expressa em um nível menor na plantatransgênica em relação à expressão na ausência da seqüência desestabili-zadora.

IV. Fornecimento de Plantas Transqênicas

Vários aspectos da presente invenção estão direcionados àsplantas transgênicas como descrito nos parágrafos anteriores. A presenteinvenção considera e reivindica plantas transgênicas (em muitas modalida-des plantas de cultivo transgênicas em particular), tanto regeneradas direta-mente partindo de células que foram transformadas com o DNA transgênicoincluindo um gene exógeno que possui em sua região não traduzida a 3'uma seqüência desestabilizadora, assim como a progênie de tais plantastransgênicas, por exemplo, progênie retrocruzada e progênie híbrida deplantas transformadas.

A preparação de construções de ácidos nucléicos para a trans-formação de células vegetais e a produção da planta transgênica fazem usode técnicas bem-conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, as metodologiasdivulgadas em Maliga e outros, 1995 e Sambrook e Russell, 2001, que sãoespecificamente incorporados aqui como referência. Um versado na técnicaseria familiar com técnicas para a transformação de células vegetais parafornecer uma planta transgênica da invenção. Vide, por exemplo, métodosde bombardeio com microprojéteis que são divulgados nas Patentes U.S.N- 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208 e 6.399.861 e métodos de transforma-ção mediados por Agrobacterium como descrito na Patente U.S. N25.591.616, das quais cada uma é incorporada especificamente aqui comoreferência. As técnicas úteis para a transformação de células vegetais utili-zando a integração específica ao sítio incluem o sistema cre-lox divulgadona Patente U.S. N2 4.959.317 e o sistema de FLP-FRT divulgado na PatenteU.S. N2 5.527.695, das quais ambas são incorporadas aqui como referência.

A transformação de células vegetais para produzir as plantastransgênicas da invenção é preferencialmente praticada em cultura de tecidoem meio e em um ambiente controlado. Os métodos e os materiais para atransformação prática para produção das plantas transgênicas desta inven-ção, por exemplo, vários meios e células-alvos receptoras, transformação deembriões imaturos e a regeneração subseqüente de plantas transgênicasférteis, são divulgados nas Patentes U.S. N9s 6.194.636 e 6.232.526, quesão incorporadas aqui como referência.

Após o fornecimento do DNA transgênico às células vegetaisreceptoras, as células transformadas são geralmente identificadas para ocultivo adicional e a regeneração das plantas. Para aumentar a capacidadede identificar transformantes, pode-se empregar um gene marcador que po-de ser selecionado ou detectado, em que a população de células potencial-mente transformada pode ser avaliada através da exposição das células aum agente ou agentes de seleção ou detectada em relação à característicado gene marcador desejado. Os exemplos não limitantes de marcadores quepodem ser detectados incluem um gene que expressa uma proteína coloridaou fluorescente tal como uma luciferase ou a proteína fluorescente verde(GFP) ou um gene que expressa um gene da befa-glucuronidase ou de uidA(GUS) para o qual são conhecidos vários substratos cromogênicos. Os e-xemplos não limitantes de marcadores selecionáveis incluem aqueles queconferem resistência a antibióticos tais como canamicina e paromomicina{nptll), higromicina B (aph IV) e gentamicina (aac3e aacCA) ou resistência aherbicidas tais como glufosinato {bar ou pat) e glifosato (aroA ou EPSPS); osexemplos particularmente úteis de tais marcadores selecionáveis são ilus-trados nas Patentes U.S. N— 5.550.318, 5.633.435, 5.780.708 e 6.118.047,das quais todas são especificamente incorporadas aqui como referência.

As plantas transgenicas da presente invenção podem ser adicio-nalmente modificadas ou hibridizadas para fornecer plantas transgenicasderivadas que possuem características acumuladas, tais como característi-cas adicionais agronomicamente desejáveis, as técnicas para as quais sãoconhecidas por um versado na técnica. Vide, por exemplo, as Publicaçõesde Pedidos de Patentes U.S. 2003/0106096 e 2002/0112260 e as PatentesU.S. N- 5.034.322, 5.776.760, 6.107.549 e 6.376.754, das quais todas sãoespecificamente incorporadas aqui como referência. Os exemplos não limi-tantes de tais características incluem, mas não estão limitados à resistênciaou à tolerância ao estresse abiótico tal como seca ou estresse à temperaturae à resistência a pragas ou agentes patogênicos como ilustrado pelas Paten-tes U.S. N- 5.250.515, 5.880.275, 6.506.599 e 5.986.175 e Publicação dePedido de Patente U.S. 2003/0150017 A1, das quais todas são incorporadasaqui como referência. As sementes de plantas transgenicas podem ser cole-tadas de plantas transgenicas férteis e ser utilizadas para crescer geraçõesde progênie de plantas transformadas desta invenção incluindo linhagens deplantas híbridas úteis, por exemplo, para a seleção de plantas que possuemuma característica agronômica melhorada. Em adição à transformação diretade uma planta com um DNA recombinante, as plantas transgenicas podemser preparadas através do cruzamento de uma primeira planta que possuium DNA recombinante com uma segunda planta que não possui o DNA. Porexemplo, o DNA recombinante pode ser introduzido em uma primeira linha-gem de planta que é tratável à transformação para produzir uma plantatransgênica que pode ser cruzada com uma segunda linhagem de plantapara introduzir o DNA recombinante na segunda linhagem de planta. Umaplanta transgênica com DNA recombinante que fornece uma característicaagronômica melhorada, por exemplo, maior rendimento, pode ser cruzadacom uma linhagem de planta transgênica que possui outro DNA recombinan-te que confere ainda uma outra característica, por exemplo, resistência aherbicida ou resistência a pragas, para produzir plantas de progênie quepossuem DNA recombinante que confere ambas as características. Tipica-mente, em tal cruzamento para a combinação das características a plantatransgênica que doa a característica adicional é uma linhagem do sexo mas-culino e a planta transgênica que carrega as características básicas é a li-nhagem de planta do sexo feminino. A progênie deste cruzamento se segre-gará de forma que algumas das plantas carregarão o DNA para ambas ascaracterísticas parentais e algumas carregarão DNA para uma característicaparental; tais plantas podem ser identificadas por marcadores associadoscom o DNA recombinante parental. As plantas da progênie que carregam oDNA para ambas as características parentais podem ser cruzadas de voltana linhagem parental do sexo feminino várias vezes, por exemplo, geralmen-te 6 até 8 gerações, para produzir uma planta de progênie com substancial-mente o mesmo genótipo que uma linhagem parental transgênica original,mas para o DNA recombinante da outra linhagem parental transgênica.

. V. Regulação Pós-Transcrição da Expressão Gênica Através do Controle daEstabilidade da Mensagem

A presente invenção fornece ainda um método para diminuirpós-transcrição a estabilidade da mensagem de um gene de interesse emuma planta de cultivo utilizada para alimento ou alimentação, incluindo a adi-ção de uma seqüência desestabilizadora na região não traduzida a 3' do ge-ne de interesse na planta de cultivo utilizada para alimento ou alimentação,em que a estabilidade da mensagem do gene de interesse é diminuída apósa transcrição. Preferencialmente, o decréscimo pós-transcripcional da estabi-lidade da mensagem resulta na expressão do gene em um nível menor quequando a seqüência desestabilizadora está ausente.

A planta de cultivo transgênica utilizada para alimento ou alimen-tação pode ser qualquer planta de cultivo monocotiledônea ou dicotiledôneautilizada para alimento ou alimentação, cujos exemplos adequados são for-necidos anteriormente sob o título "Transgenic Plants I". As plantas de culti-vo dicotiledôneas preferidas utilizadas para alimento ou alimentação inclu-em, mas não estão limitadas a canola, algodão, batata, quinoa, amaranto,trigo-sarraceno, açafroa, soja, beterraba-de-açúcar e girassol, mais prefe-rencialmente soja, canola e algodão. As plantas de cultivo monocotiledôneaspreferidas utilizadas para alimento ou alimentação incluem, mas não estãolimitadas a trigo, aveia, cevada, milho, centeio, triticale, arroz, gramíneasforrageiras, sorgo, painço e cana-de-açúcar, mais preferencialmente milho,trigo e arroz. Em algumas modalidades específicas, a soja e o milho sãoplantas particularmente preferidas.

O gene de interesse pode ser qualquer gene que possa ser re-gulado após a transcrição através de uma seqüência desestabilizadora, as-sim, qualquer gene de interesse que é transcrito em um produto da transcri-ção de RNA que pode pelo menos em parte ser traduzido em um polipeptí-deo, preferencialmente um gene que se transcreve em um RNA mensageiro(mRNA) que contém ou pode ser produzido para conter uma região não tra-duzida a 3' (3' UTR) na qual a seqüência desestabilizadora pode ser coloca-da. Os exemplos de genes de interesse adequados são os genes exógenosque são descritos anteriormente sob o título "Transgenic Plants I". Os exem-plos não limitantes de genes de interesse adequados incluem os genes en-volvidos na biossíntese de moléculas de interesse, tais como aminoácidos,ácidos graxos e outros lipídeos e açúcares e outros carboidratos. Em umamodalidade da invenção, o gene de interesse está ligado de forma operacio-nal a pelo menos um elemento promotor no cassete de expressão transgênico.

A seqüência desestabilizadora pode incluir qualquer seqüênciaque confira instabilidade ao RNA transcrito pelo gene de interesse, comodescrito anteriormente sob o título "Transgenic Plants I". Em uma modalida-de preferida, a seqüência desestabilizadora é pelo menos uma selecionadade um terminador SAUR a 3', um elemento DST, um motivo ATTTA, um mo-tivo ATTTAA e uma combinação de motivos ATTTA e ATTTAA. Os motivosde DNA ATTTA ou ATTTAA são transcritos em motivos de RNA AUUUA ouAUUUAA. Mais preferencialmente, a presença da seqüência desestabiliza-dora resulta na expressão do gene de interesse em um nível menor na plan-ta transgênica em relação à expressão na ausência da seqüência desestabi-lizadora. Mais de uma seqüência desestabilizadora ou várias cópias de umaou mais seqüências desestabilizadoras, podem ser utilizadas. Nos exemplosnão limitantes, uma planta transgênica da invenção pode ter em seu genomaDNA que inclui um gene de interesse que possui na sua região não traduzi-da a 3' pelo menos um terminador SAUR ou várias cópias de elementosDST ou qualquer combinação de terminadores SAUR, elementos DST oumotivos AUUUA ou AUUUAA.

VI. Exemplos

Os exemplos a seguir são inclusos para demonstrar as modali-dades preferidas da invenção. Deve ser considerado pelos versados na téc-nica que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam técnicasdescobertas pelo inventor para funcionarem bem na prática da invenção eassim podem ser consideradas como constituindo os modos preferidos paraa prática da mesma. Entretanto, os versados na técnica devem, à luz dapresente descrição, considerar que muitas alterações podem ser feitas nasmodalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado i-gual ou similar sem sair do espírito e do escopo da invenção.

Todas as seqüências de ácidos nucléicos são fornecidas na di-reção 5' para 3' a não ser que seja citado de outra maneira. As construçõese os vetores descritos aqui são fornecidos como exemplos ilustrativos e nãodevem ser tomados como limitantes de forma alguma.

Exemplo 1:

Clonagem dos Terminadores SAUR de Arabidopsis

Este exemplo ilustra seqüências desestabilizadoras úteis na pre-sente invenção. Mais especificamente, este exemplo descreve a clonagemde terminadores SAUR de Arabidopsis.

O terminador do gene SAUR-AC1 de Arabidopsis thaliana (Gil eoutros, 1994), que é incorporado como referência em sua totalidade aqui))foi amplificado pela PCR partindo do DNA genômico de Arabidopsis (cv. Co-lumbia) utilizando os iniciadores SAURfoM, ACCAGCCTTTGTTTCAACAA(SEQ ID N2: 11) e SAURrevI, CATAATCAATAAGAAAATAGATGTAC (SEQID N2: 12) planejados de acordo com a seqüência gênica publicada e forne-cida pela Invitrogen (Carlsbad, CA).

A PCR foi realizada com o Expand High Fidelity PCR System(número de catálogo 1 732 641, Roche Molecular Biochemicals, Indianapo-lis, IN). Os componentes e as condições da PCR primária eram como os for-necidos na Tabela 1.

Tabela 1

PCR Primária (vide o Exemplo 1)

<table>table see original document page 26</column></row><table><table>table see original document page 27</column></row><table>

Após a reação ter sido iniciada através da desnaturação da a-mostra a 94 graus Celsius durante 1 minuto, a mistura de reação foi incuba-da durante 20 ciclos consistindo em 94 graus Celsius durante 15 segundos,68 graus Celsius durante 30 segundos (1 grau Celsius diminuído por ciclo) e72 graus Celsius durante 3 minutos. A mistura de reação foi então incubadadurante 11 ciclos consistindo em 94 graus Celsius durante 15 segundos, 48graus Celsius durante 30 segundos, 72 graus Celsius durante 3 minutos. Oprocesso foi concluído com uma etapa de 72 graus Celsius durante 10 minu-tos e a mistura de reação foi mantida a 4 graus Celsius até o experimentoseguinte.

Os produtos da reação primária da PCR foram purificados utili-zando o kit de purificação QIAquick PCR (número de catálogo 28104, QIA-GEN Inc., Valencia, CA) e eluídos em 30 microlitros de H20. Uma segundareação utilizando iniciadores para a PCR contida foi realizada utilizando 5microlitros do produto da PCR purificado partindo da reação primária comomolde e os iniciadores SAURfor2EcoRI,AAAGAATTCAACTAGTAGGATCCAGTACTATACTACAACATTTCC (SEQID N2: 13) e SAURrev2Not, AAAGCGGCCGCCCGGGACCGGACTAACCG-CAGTTCA (SEQ ID N-: 14) planejados de acordo com a seqüência gênicapublicada e fornecidos pela Invitrogen (Carlsbad, CA).

A PCR foi realizada com o Expand High Fidelity PCR System(número de catálogo 1 732 641, Roche Molecular Biochemicals, Indianapo-lis, IN). Os componentes e as condições para a PCR contida eram como for-necidos na Tabela 1; a reação de amplificação foi realizada como descritoanteriormente.

O produto da PCR contida foi limpo utilizando o QIAquick PCRPurification Kit (número de catálogo 28104, QIAGEN Inc., Valencia, Califór-nia) e eluído em 30 microlitros de ddH20. Uma alíquota de 5 microlitros deDNA eluído foi digerida com Notl e EcoRI. O produto digerido foi separadoem gel de agarose. A banda do tamanho esperado (-750 pb) foi cortada epurificada utilizando o QIAquick Gel Extraction Kit (número de catálogo28704, QIAGEN Inc., Valencia, Califórnia). Os supostos fragmentos deSAUR foram clonados na forma de terminadores a 3' em um plasmídeo PUCque continha Lea9 como promotor e GUS como a seqüência codificadora. Aconstrução resultante (pMON63688) é representada na FIGURA 1. Os váriosclones das construções pMON63688 foram seqüenciados e inúmeras varia-ções de terminadores de SAUR foram identificadas com base na compara-ção de seqüências (Dnastar software package, DNASTAR, Inc., Madison,WI53715; www.dnastar.com). Em um experimento de clonagem separado, oterminador NOS foi clonado no mesmo vetor estrutural com o promotor Lea9e a seqüência codificadora de GUS para fornecer pMON63691 (FIGURA 1),que foi utilizado como um controle nos ensaios transitórios comparando osefeitos do terminador de SAUR com aqueles do terminador NOS.

Uma outra construção, pMON13773 (FIGURA 1), foi feita paraconter o promotor 7Salpha' que controla GUS com o terminador NOS. A va-riação 1 de SAUR foi clonada no pMON13773 para substituir o terminadorNOS. A nova construção, pMON63692, continha 7Salpha' promotor que con-trola GUS com o terminador NOS (FIGURA 1).Exemplo 2:

Caracterização dos Terminadores de SAUR em Um Sistema de Transforma-ção Transitória de Soja

Este exemplo ilustra seqüências desestabilizadoras úteis na pre-sente invenção e o uso das mesmas em um modelo de planta transgênica.

Mais especificamente, este exemplo descreve a caracterização de termina-dores de SAUR em um sistema de transformação transitória de soja.

As sementes de uma planta de cultivo dicotiledônea, soja (As-grow A3244), foram colhidas 25-28 dias após o florescimento e tratadas os-moticamente durante a noite a graus Celsius na escuridão em meio deGAMBORG (número de catálogo G5893, Sigma Company, St. Louis, MO)suplementado com 50 milimolares de glutamina, 111 milimolares de maltose,125 milimolares de rafinose, 125 milimolares de manitol e 3 gramas/litro deágar purificado, pH 5,6. Os cotilédones resultantes foram separados e bom-bardeados com DNA superenrolado purificado de pMON63691 (terminadorNOS) ou pMON63688 (terminadores de SAUR) utilizando a tecnologia depistola de partículas (Maliga e outros, 1995). Como um controle interno paranormalizar a variação experimental, uma construção separada com lucifera-se controlada por e35S pMON19425 (FIGURA 1) foi incluída a uma concen-tração de 1 micrograma/microlitro e em uma proporção molar de 1:1 comcada uma das construções de teste. Cada placa possuía seis cotilédones e 5até 6 placas em réplica foram bombardeadas por construção. Os tecidosbombardeados foram incubados durante 48 horas a 25 graus Celsius.

As proteínas foram extraídas de seis cotilédones de soja bom-bardeados utilizando 1 mililitro de tampão de extração contendo 0,1 molar defosfato de potássio (pH 7,8), 10 milimolares de DTT, 1 milimolar de EDTA,5% de glicerol e inibidor de proteinase (1 comprimido/50 mililitros, número decatálogo 1 697 498, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana).

Uma alíquota de 100 microlitros do extrato de proteína foi utilizada para umensaio da luciferase seguindo um procedimento "Steady-GIo" da Promega(número de catálogo E2510, Promega Corporation Madison, Wl). O tampãode ensaio de GUS foi feito através da adição de 8,8 miligramas de MUG (4-metilumbeliferil beta-D-glucuronida, número de catálogo M9130, Sigma, St.Louis, MO) em 10 mililitros de tampão de extração. Uma alíquota de 50 mi-crolitros do extrato de proteína foi misturada com 200 microlitros de tampãode ensaio de GUS. O ensaio de GUS foi realizado em uma leitora de placaespectrofotométrica Spectramax Gemini utilizando o Basic Kinetic Protocol ofSoftmax Pro software com excitação de 355 nanômetros, emissão de 460 elimite de 455 nanômetros (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). As leituras defluorescência foram registradas ao longo de um período de 2 horas com in-tervalos de 7 minutos e uma Vmáx de GUS foi obtida para cada amostra. Ca-da amostra foi analisada duas vezes e o valor médio foi utilizado para a aná-lise dos dados. A atividade de GUS foi normalizada de acordo com a ativida-de da luciferase em cada amostra e a força relativa do promotor foi expressaatravés do ajuste do vetor de controle pMON63691 (FIGURA 1) arbitraria-mente em 100%. Alternativamente, as proteínas GUS purificadas da plantatransgênica (número de catálogo G8162, Sigma, St. Louis, MO) em concen-trações conhecidas foram inclusas no ensaio para o cálculo da quantidadeabsoluta de GUS nas amostras. Os resultados (FIGURA 2) indicavam quetodas as variações dos terminadores de SAUR diminuíram significativamentea expressão de GUS quando comparadas com o terminador NOS, um termi-nador de referência para a expressão gênica em plantas transgênicas.

Um outro ensaio transitório foi feito de uma maneira similar paramostrar que os terminadores de SAUR diminuíam eficientemente a expres-são gênica quando 7Salpha' era utilizado como um promotor para controlar aexpressão de GUS (FIGURA 3).Exemplo 3:

Clonagem de Várias Cópias de Elementos DST em Vetores Com VáriosPromotores

Este exemplo ilustra adicionalmente as seqüências desestabili-zadoras úteis na presente invenção e o uso das mesmas com um gene deinteresse ligado de forma operacional a pelo menos um elemento promotorem um cassete de expressão transgênica. Mais especificamente, este e-xemplo descreve a clonagem de várias cópias de elementos DST em veto-res com vários promotores.

O elemento DST nos genes SAUR foi identificado como um ele-mento importante responsável para a desestabilização do mRNA. Para tes-tar se o elemento DST atua eficientemente em associação com o cassete deexpressão heteróloga na soja, dois fragmentos de oligonucleotídeos de fila-mento simples, 2xDSTfor,

AAAGAATTCGCTAGCAGGAGACTGACATAGATTGGAGGAGACATTTTGTATAATAAGGAGACTGACATAG (SEQ ID N2: 15) e 2xDSTrev,AAAGGATCCGATGGCCGCACTAGTTATTATACAAAATGTCTCCTCCAATCTATGTCAGTCTCCTTATTAT (SEQ ID N2: 16) foram planejados para a mon-tagem de um fragmento de DNA de filamento duplo contendo duas cópias deDST e fornecido pela Invitrogen (Carlsbad, CA).

A PCR para montagem do fragmento foi realizada com o ExpandHigh Fidelity PCR System (número de catálogo 1 732 641, Roche MolecularBiochemicals, Indianapolis, IN). Devido ao fato dos dois fragmentos de DNAde filamento simples possuírem regiões sobrepostas que são complementa-res uma com a outra, não era necessário o DNA molde. Os componentes eas condições para a PCR para montagem do fragmento eram como as for-necidas na Tabela 1; a reação foi realizada como descrito no Exemplo 1.

Uma alíquota de 3 microlitros da reação da PCR foi digerida comas enzimas EcoRI e BamHI e clonada no pMON58101 (FIGURA 1) que foilinearizado nos sítios entre o gene codificador de GUS e o terminador NOS.Os clones contendo 2XDST foram identificados através do seqüenciamentoe chamados de pMON63687 (FIGURA 1). Era esperado que a comparaçãoentre pMON58101 e pMON63687 demonstrasse o efeito de 2XDST sobre aexpressão gênica. Dois vetores adicionais foram produzidos através dasubstituição do promotor USP no pMON63687 por um promotor Lea9 ou umpromotor 7Salpha' para gerar pMON63697 e pMON63698 (FIGURA 1). OpMON63697 foi comparado com pMON63691, um vetor de controle que con-tém o promotor 7Salpha' controlando GUS com o terminador NOS. OpMON63698 foi comparado com pMON 13773, um outro vetor de controleque contém o promotor 7Salpha' controlando GUS com o terminador NOS.As comparações utilizaram um ensaio transitório e são descritas no Exemplo 4.

Exemplo 4:

Caracterização de 2XDST em um Sistema de Transformação Transitória deSoia

Este exemplo ilustra as seqüências desestabilizadoras úteis napresente invenção e o uso das mesmas com um gene de interesse ligado deforma operacional a pelo menos um elemento promotor em um cassete deexpressão transgênica. Mais especificamente, este exemplo descreve a ca-racterização de 2XDST em um sistema de transformação transitória de soja.

As sementes das plantas de soja (Asgrow A3244) foram colhidas25-28 dias após o florescimento e tratadas osmoticamente como descrito noExemplo 2. Os cotilédones resultantes foram separados e bombardeadoscom DNA superenrolado purificado de pMON58101 (terminador NOS) oupMON63687 (2XDST e terminador NOS) utilizando a tecnologia de pistolade partículas como descrito no Exemplo 2. O vetor de controle era umaconstrução com luciferase controlada por e35S, pMON19425.

As proteínas foram extraídas e analisadas com um ensaio daluciferase "Steady-GIo" e um ensaio de GUS como descrito no Exemplo 2. Aatividade de GUS foi normalizada de acordo com a atividade da luciferase decada amostra e a força relativa do promotor foi expressa através do ajustedo vetor de controle pMON58101 (FIGURA 1) arbitrariamente em 100%. Osresultados (FIGURA 4) indicavam que a inclusão de 2XDST diminuía signifi-cativamente a expressão de GUS quando comparada com a do terminadorNOS isoladamente.

Outros experimentos foram realizados para compararpMON13773 e pMON63698 (FIGURA 5) e para comparar pMON63691 epMON63697 (FIGURA 6). Os resultados mostraram de forma coerente que2XDST diminuía eficientemente a expressão gênica nos cotilédones de soja.

Os dados mostraram coletivamente que 2XDST pode atuar eficientementeindependentemente dos promotores utilizados no experimento.Exemplo 5:

Clonagem de Vetores Peii Contendo 2XDST, 4XDST ou 6XDST

Este exemplo ilustra as seqüências desestabilizadoras úteis napresente invenção e o uso das mesmas com um gene de interesse ligado deforma operacional a pelo menos um elemento promotor em um cassete deexpressão transgênica. Mais especificamente, este exemplo descreve a clo-nagem de vetores Perl conendo 2XDST, 4XDST ou 6XDST.

Vetores adicionais foram construídos seguindo os protocolospadronizados de clonagem molecular (Sambrook e Russell, 2001, que é in-corporado aqui como referência) para testar o efeito do número de cópias deDST sobre o nível de expressão gênica. O vetor pMON42316 (FIGURA 1), ovetor de controle, continha um promotor Perl controlando a expressão deGUS com um terminador NOS. O promotor Lea9 no pMON63697 foi cortadoe substituído pelo promotor Perl para produzir pMON78113 que tinha2XDST em combinação com o terminador NOS (FIGURA 1).

Para produzir várias cópias de DST, uma alíquota de 5 microli-tros do produto da PCR do Exemplo 3 foi digerida com Spel e Nhel. O DNAdigerido foi separado em gel de agarose, extraído utilizando o QIAquick GelExtraction Kit (número de catálogo 28704, QIAGEN Inc., Valencia, CA) eligado no pMON78113 que foi linearizado com Spel e tratado com a fosfata-se alcalina CIP. Os clones contendo 4XDST foram selecionados através dadigestão dupla com Spel e Nhel e chamados de pMON78116 (FIGURA 1).

O pMON78116 foi novamente linearizado com Spel, tratado coma fosfatase alcalina CIP e ligado ao fragmento de 2XDST preparado anteri-ormente. Os clones contendo 6XDST foram selecionados através da diges-tão dupla com Spel e Nhel e chamados de pMON78117 (FIGURA 1).

Exemplo 6:

Comparação de 2XDST. 4XDST ou 6XDST em um Sistema de Transforma-ção Transitória de Soja

Este exemplo ilustra as seqüências desestabilizadoras úteis napresente invenção e o uso das mesmas com um gene de interesse ligado deforma operacional com pelo menos um elemento promotor em um cassetede expressão transgênica. Mais especificamente, este exemplo descreve acomparação de 2XDST, 4XDST e 6XDST em um sistema de transformaçãotransitória de soja. 1

As sementes das plantas de soja (Asgrow A3244) foram colhidas25-28 dias após o florescimento e tratadas osmoticamente como descrito noExemplo 2. Os cotilédones resultantes foram separados e bombardeadoscom o DNA superenrolado purificado de pMON42316 (terminador NOS iso-ladamente), de pMON78113 (2XDST e terminador NOS), de pMON78116(4XDST e terminador NOS) ou de pMON78117 (6XDST e terminador NOS)utilizando a tecnologia de pistola de partículas como descrito no Exemplo 2.

O vetor de controle era uma construção com luciferase controlada por e35S,pMON 19425.

As proteínas foram extraídas e analisadas com um ensaio daluciferase "Steady-GIo" e um ensaio de GUS como descrito no Exemplo 2. Aatividade de GUS foi normalizada de acordo com a atividade da luciferase decada amostra e a força relativa do promotor foi expressa através do ajustedo vetor de controle pMON42316 (FIGURA 1) arbitrariamente em 100%. Osresultados (FIGURA 7) indicaram que o número de cópias de DST se corre-laciona negativamente com o nível de expressão gênica.

Exemplo 7:

Clonagem de 1XDST, 3XDST e 5XDST

Este exemplo ilustra as seqüências desestabilizadoras úteis napresente invenção. Mais especificamente, este exemplo descreve a clona-gem de 1XDST, 3XDST e 5XDST.

São produzidos vetores adicionais para avaliar adicionalmente acorrelação do número de cópias de DST e o nível de expressão gênica. Doisfragmentos de oligonucleotídeos de filamento simples, anelamento para fren-te 1XDST,CTAGCTAGGAGACTGACATAGATTGGAGGAGACATTTTGTATAATAGGA(SEQ ID N-: 17) e anelamento Comp para trás 1XDST,CTAGTCCTATTATACAAAATGTCTCCTCCAATCTATGTCAGTCTCCTAG(SEQ ID N2: 18) foram planejados para a montagem de um fragmento deDNA de filamento duplo contendo uma cópia de DST e fornecidos pela Inte-grated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA). O anelamento dos dois frag-mentos foi realizado em 1X tampão de PCR fornecido no Expand High Fide-lity PCR System (número de catálogo 1 732 641, Roche Molecular Bioche-micals, Indianapolis, Indiana).

Após a reação ter sido iniciada através da desnaturação da a-mostra a 96 graus Celsius durante 10 minutos, a temperatura foi diminuída auma velocidade de 0,2 grau Celsius/segundo e pausada durante 7 minutoscada a 80 graus Celsius, 70 graus Celsius, 60 graus Celsius, 50 graus Celsi-us, 40 graus Celsius e 30 graus Celsius. O processo terminou a 4 graus Cel-sius e a mistura foi armazenada a 4 graus Celsius até o experimento seguinte.

O fragmento 1XDST anelado foi então purificado utilizando oQIAquick PCR Purification Kit (número de catálogo 28104, QIAGEN Inc.,Valencia, CA) e eluído em 32 microlitros de H20 duplamente destilada. ODNA eluído foi tratado utilizando um kit do T4 Polinucleotido quinase (núme-ro de catálogo 18004-010, Invitrogen, Carlsbad, CA) salvo na forma do inser-to 1XDST. Para criar a construção de 1XDST, o pMON78113 foi digeridocom Spel e Nhel e tratado com a fosfatase alcalina CIP. A estrutura foi entãoligada ao inserto 1XDST para criar o pMON78119 (FIGURA 1).

Para criar as construções de 3XDST e de 5XDST, opMON78113 e o pMON78116 foram linearizados utilizando Spel e tratadoscom a fosfatase alcalina CIP. A estrutura foi então ligada ao inserto de1XDST. Os clones contendo 3XDST ou 5XDST foram selecionados atravésda digestão dupla com Spel e Nhel e chamados de pMON78120 epMON78121, respectivamente (FIGURA 1).

Exemplo 8:

Comparação de 1XDST. 2XDST, 3XDST, 4XDST e 5XDST em um Sistemade Transformação Transitória de Soja

Este exemplo ilustra as seqüências desestabilizadoras úteis napresente invenção e o uso das mesmas com um gene de interesse ligado deforma operacional a pelo menos um elemento promotor em um cassete deexpressão transgenica. Mais especificamente, este exemplo descreve acomparação de 1XDST, 2XDST, 3XDST, 4XDST e 5XDST em um sistemade transformação transitória de soja.

As sementes de plantas de soja (Asgrow A3244) foram colhidas25-28 dias após o florescimento e tratadas osmoticamente como descrito noExemplo 2. Os cotilédones resultantes foram separados e bombardeadoscom o DNA superenrolado purificado de pMON42316 (terminador NOS iso-ladamente), de pMON78119 (1XDST e terminador NOS), de pMON78113(2XDST e terminador NOS), de pMON78120 (3XDST e terminador NOS), depMON78116 (4XDST e terminador NOS) ou de pMON78121 (5XDST e ter-minador NOS) utilizando a tecnologia de pistola de partículas como descritono Exemplo 2. O vetor de controle era uma construção com luciferase con-trolada por e35S, pMON19425.

As proteínas foram extraídas e analisadas com um ensaio daluciferase "Steady-GIo" e um ensaio de GUS como descrito no Exemplo 2. Aatividade de GUS foi normalizada de acordo com a atividade da luciferase decada amostra e a força relativa do promotor foi expressa através do ajustedo vetor de controle pMON42316 (FIGURA 1) arbitrariamente em 100%. Osresultados (FIGURA 7) indicaram que o número de cópias de DST estavanegativamente correlacionado com o nível de expressão gênica. Os resulta-dos também mostraram que 1XDST era suficiente para diminuir a expressãogênica.

Exemplo 9:

Eficiência das Seqüências Desestabilizadoras em uma Planta de CultivoTransgenica (Soja)

Este exemplo ilustra as seqüências desestabilizadoras úteis napresente invenção e o uso das mesmas com um gene de interesse ligado deforma operacional a pelo menos um elemento promotor em um cassete deexpressão transgenica. Mais especificamente, este exemplo demonstra aeficiência das seqüências desestabilizadoras em uma planta de cultivotransgenica (soja).

Para confirmar adicionalmente a eficiência de DST como umaseqüência desestabilizadora da mensagem na soja transgênica, vários veto-res de transformação de Agrobacterium (FIGURA 8) foram construídos se-guindo os protocolos padronizados de clonagem molecular (Sambrook eRussell, 2001, que é incorporado aqui como referência). Um cassete de ex-pressão consistindo do promotor FMV, CTP2 e o gene codificador de CP4 e3'UTR de E9 foi incluso como um marcador de seleção em todos os vetores.

Uma proteína de fusão de Arabidopsis SSU 1A CTP e a antranilato sintasede Agrobacterium (AS) foram utilizadas como um gene codificador para des-regular a via biossintética do triptofano. O promotor Perl, Lea9 ou 7Salpha'foi utilizado para controlar a expressão do gene AS. O terminador NOS foiutilizado em combinação com DST na extremidade a 3' do cassete AS.

Os vetores descritos anteriormente foram transferidos para A-grobacterium tumefaciens, cepa ABI através de um método de cruzamentotriparental (Ditta e outros (1980), que é incorporado aqui como referência).As células bacterianas foram preparadas para a transformação através demétodos bem-conhecidos na técnica.

As sementes de soja disponíveis comercialmente (AsgrowA3244) foram germinadas ao longo de um período de 10-12 horas. Os ex-plantes de meristema foram cortados e colocados em um recipiente paraprodução de ferimentos e feridos através de ultra-som. Após a produção deferimentos, a cultura de Agrobacterium descrita anteriormente foi adicionadae os explantes foram incubados durante aproximadamente uma hora. Após ainoculação, a cultura de Agrobacterium foi removida através da pipetagemdos explantes colocados em co-cultura durante 2-4 dias. Os explantes foramentão transferidos para o meio de seleção consistindo em Woody Plant Mé-dium (WPM) (vide McCown & Lloyd (1981), que é incorporado aqui comoreferência em sua totalidade), mais 75 micromolares de glifosato e antibióti-cos para controlar o supercrescimento de Agrobacterium, durante 5-7 sema-nas para permitir a seleção e o crescimento de brotos transgênicos. Os bro-tos positivos em relação ao fenótipo foram colhidos aproximadamente 5-7semanas após a inoculação e colocados em meio seletivo para enraizamen-to compreendendo de Bean Rooting Media (BRM) com 25 micromolares deglifosato (vide a Patente U.S. N2 5.914.451, que é incorporada aqui comoreferência em sua totalidade) durante 2-3 semanas. Os brotos que produzi-ram raízes foram transferidos para a estufa e plantados no solo. Os brotosque permaneceram saudáveis na seleção, mas não produziram raízes, fo-ram transferidos para o meio de enraizamento não seletivo (isto é, BRM semglifosato) durante duas semanas adicionais. Os tecidos de qualquer um dosbrotos que produziram raízes fora da seleção foram testados em relação àexpressão do marcador selecionável de planta antes de serem transferidospara a estufa e plantados no solo. As plantas foram mantidas sob condiçõespadronizadas de estufa até a colheita das sementes R1.

Os níveis de aminoácidos livres foram analisados partindo decada um dos eventos transgênicos utilizando o procedimento a seguir. Assementes de cada um dos eventos transgênicos foram moídas individual-mente em um pó fino e aproximadamente 50 miligramas do pó resultanteforam transferidos para um tubo de centrífuga pré-pesado. O peso exato daamostra foi registrado e 1,0 mililitro de 5% de ácido tricloroacético foi adicio-nado em cada tudo de amostra. As amostras foram misturadas à temperatu-ra ambiente utilizando um vortex e então centrifugadas durante 15 minutos a14.000 rpm em uma microcentrífuga Eppendorf (Model 5415C, BrinkmannInstrument, Westbury, NY). Uma alíquota do sobrenadante foi removida eanalisada por HPLC (Agilent 1100) utilizando o procedimento apresentadona Publicação Técnica da Agilent "Amino Acid Analysis Using the ZorbaxEclipse-AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC" (17 de março de 2000),que é incorporada aqui como referência. Devido ao fato de que as sementesR1 de cada evento representavam uma população de sementes segregan-tes, a semente com o nível mais alto de triptofano entre as 10 sementes ana-lisadas por evento foi escolhida como um representante do genótipo homo-zigoto. Dez sementes não transgênicas selecionadas aleatoriamente da As-grow A3244 também foram analisadas. A semente com o nível mais alto detriptofano da A3244 não transgênica foi escolhida como um controle negative.Exemplo 10:

Eficiência da 3'-UTR de SAUR. 2XDST. 3XDST, 4XDST, 5XDST e 6XDSTna Transformação Transitória de Folha de Milho

Este exemplo ilustra as seqüências desestabilizadoras úteis napresente invenção e o uso das mesmas com um gene de interesse ligado deforma operacional a pelo menos um elemento promotor em um cassete deexpressão transgênica da invenção. Mais especificamente, este exemplodemonstra a eficiência da 3'-UTR de SAUR, 2XDST, 3XDST, 4XDST,5XDST e 6XDST na transformação transitória de folha de milho. Os elemen-tos de expressão gênica que funcionam em plantas dicotiledôneas não fun-cionam necessariamente também em plantas monocotiledôneas. O uso das3'-UTRs de SAUR e dos elementos DST para regular para menos a expres-são gênica em uma planta dicotiledônea, soja, é divulgado nos exemplosanteriores da presente invenção. Os mesmos elementos foram avaliados emuma monocotiledônea, especificamente uma planta de cultivo monocotiledô-nea (milho) para determinar sua eficiência na diminuição da expressão gênica.

Em adição às 3'-UTRs de SAUR e aos elementos DST, a efici-ência de dois arranjos diferentes (motivos de AUUUA sobrepostos e um no-vo de AUUUAA sobreposto) de repetições sobrepostas de um motivo ricoem AU foi comparada em um sistema de monocotiledônea transformada deforma transitória. Neste exemplo não limitante, foram utilizadas 11 cópiasdos motivos ricos em AU; alternativamente, menos (preferencialmente pelomenos 3) ou mais (mais de 11) cópias poderiam ser utilizadas. Foram pro-duzidas quatro construções, das quais duas continham seqüências espaça-doras (seqüências aleatórias do mesmo comprimento) servindo como con-troles. Oligonucleotídeos complementares sintéticos (Invitrogen, Carlsbad,CA) foram utilizados para gerar as seqüências espaçadoras de controle e asseqüências das 11 cópias do motivo rico em AU em dois arranjos diferentes.Os iniciadores de oligonucleotídeos para o arranjo de AUUUA sobrepostoeram

CTAGCATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTT(SEQ ID N2: 19) e

GATCCTAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATG(SEQ ID N-: 20). Os iniciadores de oligonucleotídeos para o novo arranjo deAUUUAA sobreposto eram

CTAGCATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTTAATTTAG (SEQ ID N2: 21) e

GATCCTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATG (SEQ ID Ns: 22). Os iniciadores de oligonucleotídeos para oprimeiro controle espaçador eram

CTAGCATGAATACATCTGAATGTCTAGTATATTGATTGAAAGCTTTGTATG (SEQ ID N2: 23) e

GATCCATACAAAGCTTTCAATCAATATACTAGACATTCAGATGTATTCATG (SEQ ID N2: 24). Os iniciadores de oligonucleotídeos para o segundo con-trole espaçador eram

CTAGCATCTGATACTGACATGCATCATGCTAATTCAGACATGCATGAATTCAATACGTACG (SEQ ID N2: 25) e

GATCCGTACGTATTGAATTCATGCATGTCTGAATTAGCATGATGCATGTCAGTATCAGATG (SEQ ID N2: 26).

Estes pares de iniciadores de oligonucleotídeos complementaresforam anelados juntos em uma mistura de reação contendo 1 microlitro decada iniciador (100 micromolares), 10 microlitros de tampão 10X Invitrogen10 (150 milimolares de NaCI concentração final) e 88 microlitros de águaduplamente destilada esterilizada. As condições do termociclador eram 5minutos a 95 graus Celsius, seguidos por 70 ciclos de 95 graus Celsius (1grau Celsius diminuído por ciclo).

Os produtos anelados foram planejados para possuírem sítiosde Nhel e BamHI nas extremidades. Após o anelamento, os produtos foramdiluídos 1:50 e 1 microlitro foi utilizado para ligação na estrutura dopMON64263, que foi previamente cortado com Nhel e BamHI e purificadoem gel. As construções resultantes foram chamadas de pMON64264,pMON64265, pMON64266 e pMON64267. Os ensaios transitórios com folhade milho foram realizados com as construções listadas na Tabela 2 comodescrito no Exemplo 10. Os dados mostram que ambos os arranjos com 11cópias do motivo rico em AU resultaram em uma menor expressão (um de-créscimo de aproximadamente 50% em relação à expressão na ausência deuma repetição do motivo rico em AU) (FIGURA 9).

Tabela 2

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Os promotores utilizados nas construções de 3'-UTR de SAUR eDST (pMON63691, pMON63688, pMON63697, pMON78121, pMON78120,pMON78117, pMON781116) que foram analisados no ensaio transitório decotilédone de soja eram promotores específicos à semente (FIGURA 1). Ou-tros promotores específicos espacialmente, específicos temporalmente, quepodem ser induzidos ou constitutivos também são adequados. Como cons-truções iniciais para a avaliação em um sistema transitório de protoplastosde folha de milho, os promotores específicos à semente destas construçõesforam substituídos pelo promotor 35S melhorado utilizando técnicas padroni-zadas de biologia molecular. As construções completas são mostradas naTabela 2.

Os experimentos de transformação transitória de protoplastos defolha de milho foram realizados como a seguir: Os protoplastos foram isola-dos de folhas de milho LH200 x H50 de 12 dias de idade estioladas atravésde digestão enzimática com 2% de Cellulase RS e 0,3% de MacerozymeR10 (Karlan Research, Santa Rosa, CA). Os protoplastos foram submetidosà eletroporação (duas vezes em 1 milissegundo, 120 volts com 3 pulsos emintervalos de 5 segundos) com 4 picomols do DNA plasmideal, que era umamistura equivalente do DNA experimental e o DNA de controle interno (luci-ferase de vaga-lume, pMON19437). As eletroporações foram realizadas emtriplicata para cada construção e repetidas em um dia diferente (com pelomenos 24 horas entre os dois dias experimentais para minimizar a variaçãodia-a-dia) para um total de seis réplicas. Após a incubação durante a noite,as proteínas foram extraídas através da adição de 0,25 volume de 5X Passi-ve Lysing Buffer (Dual-Luciferase Repórter Assay System, número de catá-logo E1960, Promega, Madison, Wl) às células de protoplasto transformadase 20 microlitros do extrato de proteína foram utilizados para o ensaio da luci-ferase seguindo o protocol do Dual-Luciferase Repórter Assay System. Aatividade da luciferase de vaga-lume (fLUC) serviu como o controle interno.Para medir a atividade de GUS, 20 microlitros de 1X MUG (número de catá-logo M9130, Sigma, St. Louis, MO) foram adicionados em 20 microlitros doextrato de proteína e incubados a 37 graus Celsius durante 0,5 hora. Apósinterromper as reações através da adição de 180 microlitros de 0,2 molar deNa2C03, a fluorescência foi medida com excitação a 355 nanômetros e e-missão a 460 nanômetros utilizando uma máquina Wallac Victor2 (PerkinEI-mer, Boston, MA). Os resultados (FIGURA 9) demonstraram que os elemen-tos DST que resultaram na expressão gênica em um nível menor em umsistema transitório de soja também eram funcionais em um sistema de plan-tas monocotiledôneas. Similar ao resultado para a soja, o grau de regulaçãopara menos estava geralmente correlacionado com o número de cópias deDST. Neste exemplo particular, mais de 3 cópias de DST não resultaram emum decréscimo adicional nos níveis de expressão (FIGURA 9) e o uso de umterminador de SAUR contendo apenas uma cópia de DST resultou em umaexpressão gênica em um nível substancialmente mais baixo.

Foi descoberto que os elementos DST eram eficientes na diminui-ção do nível de triptofano na soja transgênica (vide o Exemplo 9). Duas cópias(2X) do elemento DST resultaram em uma diminuição do nível de triptofano emaproximadamente 30% (FIGURA 10) em relação aos níveis observados naausência da seqüência DST, com resultados similares observados para duasconstruções "parentais" diferentes (pMON66892 e pMON66891). Os dados deplantas tanto transformadas de forma transitória quanto transformadas de for-ma estável demonstraram que os elementos DST podem ser utilizados paramodular a expressão gênica em plantas de cultivo.

Todos os materiais e os métodos divulgados e reivindicados aquipodem ser produzidos e utilizados sem experimentos desnecessários comoinstruído pela descrição anterior. Embora os materiais e os métodos destainvenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas e e-xemplos ilustrativos, será evidente para os versados na técnica que varia-ções podem ser aplicadas aos materiais e aos métodos descritos aqui semsair do conceito, do espírito e do escopo da invenção. Todos os tais substitu-intes e modificações similares evidentes aos versados na técnica são consi-derados como estando dentro do espírito, do escopo e do conceito da inven-ção como definido pelas reivindicações em anexo.

REFERÊNCIAS

As referências a seguir, até a extensão que fornecem exemplosde procedimentos ou outros detalhes sumplementares aos apresentadosaqui, são especificamente incorporadas aqui como referência.

Patentes U.S.: Patente U.S. Ns 4.959.317; Patente U.S. No5.527.695; Patente U.S. No 5.538.880; Patente U.S. No 5.550.318; PatenteU.S. No 5.591.616; Patente U.S. No 5.633.435; Patente U.S. No 5.750.848;Patente U.S. No 5.776.760; Patente U.S. No 5.780.708; Patente U.S. No5.880.275; Patente U.S. No 5.837.848; Patente U.S. No 5.914.451; PatenteU.S. No 5.986.175; Patente U.S. No 6.107.549; Patente U.S. No 6.118.047;Patente U.S. No 6.140.078; Patente U.S. No 6.160.208; Patente U.S. No6.194.636; Patente U.S. No 6.232.526; Patente U.S. No 6.376.754; PatenteU.S. No 6.399.861; Patente U.S. No 6.506.599; Patente U.S. No 6.583.338;Patente U.S. No 6.759.575; Patente U.S. No 5.034.322; Patente U.S. No5.250.515; Patente U.S. No 5.763.245; Patente U.S. No 6.084.089; PatenteU.S. No 6.252.138; Patente U.S. No 6.294.714; Patente U.S. No 6.426.446;Patente U.S. No 6.433.252; Patente U.S. No 6.437.217

Publicação de Patente U.S. No 2004/0216189

Publicação de Patente U.S. No 2002/0112260

Publicação de Patente U.S. No 2003/0106096

Publicação de Patente U.S. No 2004/0123347

Publicação de Patente U.S. No 2003/0150017 A1

Altschul e outros, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402, 1997.

Bayer e Smolke, Nature Biotechnol., 23: 337-343, 2005.

Davidson e Ellington, Trends Biotechnol., 23: 109-112, 2005.

Ditta e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 7347-7351, 1980.

Feldbrugge e outros, Plant Mol. Biol., 49: 215-223, 2001.

Gil e outros, Plant Physiol., 104: 777-784, 1994.

Green, Plant Physiol., 102: 1065-1070, 1993.

Gutiérrez e outros, Trends Plant Sei., 4: 429-438, 1999.

Isaacs e outros, Nat. Biotechnol., 22: 841-847, 2004.

Maliga e outros, Methods in Plant Molecular Biology, A Labora-tory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995.

Mandai e Breaker, Nature Rev. Mol. Cell Biol., 5: 451-463, 2004.

Mandai e Breaker, Nature Struct. Mol. Biol., 11: 29-35, 2004.

McCIure e outros, Plant Cell, 1:229-239, 1989.

McCown & Lloyd, Proc. Intl. Plant Propag. Soe, 30: 421, 1981.

Newman e outros, Plant Cell, 5: 701-714, 1993.

Ohme-Takagi e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 11811-11815,1993.

Pedido de Patente PCT WO 05007829

Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3âEd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

Sudarsan e outros, RNA, 9: 644-647, 2003.Winkler e outros, Nature, 419: 952-956, 2002.Yamamoto e outros, Plant Cell Physiol., 33: 93-97, 1992.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Thai, Kwan Y.

Wang, QiDabrowski, JohnUlmasov, Tim N.

House, Ida M.

<120> Regulação pós-transcricional da expressão gênica

<130> MONS:090WO

<140> DESCONHECIDO <140> 2006-05-15

<150> 60/682,471

<150> 2005-05-19

<160> 32

<210> 1<211> 660

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

agtactatac tacaacattt ccatattttt tttagattgt tagctaattt cccctggaga 60taattgtaaa ttgtttcaat gagaggaata tacaatacat agatcgtaat tgatcaatgc 120gtatttgcat gttaatacat ttgtgtcttg taccaaaaaa aggaattata catttgtgtc 180atttaactct ggacaccata catttcgtca ttacagtgaa acggcagaat ttgaacactc 240attattctgg ttggtagtta tttccatatt tctcaaagaa catttatgtg actattatca 300ttccttgcga caactgtaat aatgagaaaa cttggtattt tttttggctc ttcatataag 360ttgtttaaaa aatgtatttt caaacaataa ttaatagtgg cccaaacata atttaaaata 420ggtttcgaag cccaaagccc ataaattaaa cgcctaacat tcacgcgctc tttgactatg 480gttgcttagg aacagatgcg cgtggggaag ttggcaccgt tttttctctt gcttacatct 540attttttttt cttaaacgtc tatttatttg ctttacgtca ttgtaacgtt tgtttgtttt 600ctctgtatcg ttagttgttg tacacttgta ctatggacgt tgaactgcgg ttagtccggt 660<210> 2

<211> 662<212> DNA<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

agtactatac tacaacattt ccatattttttaattgtaaa ttgtttcaat gagaggaatagtatttgcat gttaatacat ttgtgtcttgatttaactct ggacaccata catttcgtcaattattctgg ttggtagtta tttccatattttccttgcga caactgtaat aatgagaaaattgtttaaaa aatgtatttt caaacaataaggtttcgaag cccaaagccc ataaattaaagttgcttagg aacagatgcg cgtggggaagattttttttt cttaaacgtc tatttatttgctctgtatcg ttagttgttg tacacttgta

<210> 3

<211> 662<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 3

agtactatac tacaacattt ccatattttttaattgtaaa ttgtttcaat gagaggaatagtatttgcat gttaatacat ttgtgtcttgatttaactct ggacaccata catttcgtcaattattctgg ttggtagtta tttccatattttccttgcga caactgtaat aatgagaaaattgtttaaaa aatgtatttt caaacaataaggtttcgaag cccaaagccc ataaattaaagttgcttagg agcagatgcg cgtggggaagattttttttt cttaaacgtc tatttatttgctctgtatcg ttagttgttg tacacttgtagt

<210> 4

tttagattgt tagctaattt cccctggaga 60

tacaatacat agatcgtaat tgatcaatgc 120

taccaaaaaa aggaattata catttgtgtc 180

ttacagtgaa acggcagaat ttgaacactc 240

tctcaaagaa catttatgtg actattatca 300

cttggtattt tttttggctc ttcatataag 360

ttaatagtgg cccaaacata atttaaaata 420

cgcctaacat tcacgcgctc tttgactatg 480

ttggcaccgt tttttctctt gcttacatct 540

ctttacgcca ttgtaacgtt tgtttgtttt 600

ctatggacgt tgggaactgc ggttagtccg 660

662

tttagattgt tagctaattt cccctggaga 60

tacaatacat agatcgtaat tgatcaatgc 120

taccaaaaaa aggaattata catttgtgtc 180

ttacagtgaa acggcagaat ttgaacactc 240

tctcaaagaa catttatgtg actattatca 300

cttggtattt tttttggctc ttcatataag 360

ttaatagtgg cccaaacata atttaaaata 420

cgcctaacat tcacgcgctc tttgactatg 480

ttggcaccgt tttttctctt gcttacatct 540

ctttacgtca ttgtaacgtt tgtttgtttt 600

ctatggacgt tgaaaactgc ggttagtccg 660

662<211> 662<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

agtactatac tacaacattt ccatattttt tttagattgt tagctaattt cccctggaga 60taattgtaaa ttgtttcaat gagaggaata tacaatacat agatcgtaat tgatcaatgc 120gtatttgcat gttaatacat ttgtgtcttg taccaaaaaa aggaattata catttgtgtc 180atttaactct ggacaccata catttcgtca ttacagtgaa acggcagaat ttgaacactc 240attattctgg ttggtagtta tttccatatt tctcaaagaa catttatgtg actattatca 300ttccttgcga caactgtaat aatgagaaaa cttggtattt tttttggctc ttcatataag 360ttgtttaaaa aatgtatttt caaacaataa ttaatagtgg cccaaacata atttaaaata 420ggtttcgaag cccaaagccc ataaattaaa cgcctaacat tcacgcgctc tttgactatg 480gttgcttagg aacagatgcg cgtggggaag ttggcaccgt tttttctctt gcttacatct 540attttttttt cttaaacgtc tatttatttg ctttacgtca ttgtaacgtt tgtttgtttt 600t ctctgtatcg ttagttgttg tacacttgta ctatggacgt tgaaacctgc ggttagtccg 660gt 662<210> 5<211> 43<212> DNA<213> constructo sintético

<400> 5

taggagactg acatagattg gaggagacat tttgtataat agg 43<210> 6<211> 80<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 6

aggagactga catagattgg aggagacatt ttgtataata aggagactga catagattgg 60aggagacatt ttgtataata 80<210> 7

<211> 129<212> DNA<213> constructo sintético

<400> 7

aggagactga catagattgg aggagacatt ttgtataata aggagactga catagattgg 60aggagacatt ttgtataata actagctagg agactgacat agattggagg agacattttg 120tataatagg 129

<210> 8

<211> 166

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 8

aggagactga catagattgg aggagacatt ttgtataata aggagactga catagattgg 60aggagacatt ttgtataata actagcagga gactgacata gattggagga gacattttgt 120ataataagga gactgacata gattggagga gacattttgt ataata 166<210> 9

<211> 215<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 9

aggagactga catagattgg aggagacatt ttgtataata aggagactga catagattgg 60aggagacatt ttgtataata actagcagga gactgacata gattggagga gacattttgt 120

ataataagga gactgacata gattggagga gacattttgt ataataacta gctaggagac 180

tgacatagat tggaggagac attttgtata atagg 215

<210> 10

<211> 252<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 10

aggagactga catagattgg aggagacatt ttgtataata aggagactga catagattgg 60aggagacatt ttgtataata actagcagga gactgacata gattggagga gacattttgt 120ataataagga gactgacata gattggagga gacattttgt ataataacta gcaggagact 180gacatagatt ggaggagaca ttttgtataa taaggagact gacatagatt ggaggagaca 240ttttgtataa ta 252<210> 11<211> 20<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 11

accagccttt gtttcaacaa 20<210> 12<211> 26<212> DNA<213> constructo sintético

<400> 12

cataatcaat aagaaaatag atgtac 26<210> 13<211> 45

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 13

aaagaattca actagtagga tccagtacta tactacaaca tttcc 45

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 14

aaagcggccg cccgggaccg gactaaccgc agttca 36

<210> 15

<211> 70

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 15

aaagaattcg ctagcaggag actgacatag attggaggag acattttgta taataaggag 60actgacatag 70

<210> 16<211> 70<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 16

aaaggatccg atggccgcac tagttattat acaaaatgtc tcctccaatc tatgtcagtc

tccttattat

<210> 17

<211> 49

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 17

ctagctagga gactgacata gattggagga gacattttgt ataatagga

<210> 18

<211> 49

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 18

ctagtcctat tatacaaaat gtctcctcca atctatgtca gtctcctag

<210> 19

<211> 51

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 19

ctagcattta tttatttatt tatttattta tttatttatt tatttattta g

<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 20

gatcctaaat aaataaataa ataaataaat aaataaataa ataaataaat g

<210> 21<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 21

ctagcattta atttaattta atttaattta atttaattta atttaattta atttaattta 60g 61

<210> 22

<211> 61

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 22

gatcctaaat taaattaaat taaattaaat taaattaaat taaattaaat taaattaaat 60

g 61

<210> 23

<211> 51

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 23

ctagcatgaa tacatctgaa tgtctagtat attgattgaa agctttgtat g 51

<210> 24

<211> 51

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 24

gatccataca aagctttcaa tcaatatact agacattcag atgtattcat g 51

<210> 25

<211> 61

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 25

ctagcatctg atactgacat gcatcatgct aattcagaca tgcatgaatt caatacgtac 60g 61

<210> 26<211> 61<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 26

gatccgtacg tattgaattc atgcatgtct gaattagcat gatgcatgtc agtatcagat

<210> 27<211> 13<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 27

atttatttat tta

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 28

atttatttat ttatttattt a

<210> 29

<211> 56

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 29

atttaattta atttaattta atttaattta atttaattta atttâattta atttaa

<210> 30

<211> 33

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 30

atttatttat ttaatttaat ttaatttatt taa

<210> 31<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 31

atttaattta atttaa

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> constructo sintético

<400> 32

atttaattta atttaattta atttaa

Claims (23)

1. Planta transgênica que compreende dentro de seu genomaDNA compreendendo um gene exógeno que codifica um polipeptídeo e quepossui em sua região não traduzida a 3' pelo menos uma primeira seqüênciade desestabilização, através da qual o dito polipeptídeo é expresso em umnível menor na semente da dita planta transgênica em relação à expressãona ausência da dita seqüência de desestabilização.

2. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, em que adita planta transgênica é uma planta de cultivo selecionada do grupo queconsiste em plantas de cultivo de grãos, plantas de cultivo de sementes ole-osas, plantas de cultivo de forragem e plantas de cultivo vegetais.

3. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, em que odito polipeptídeo compreende a antranilato sintase.

4. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, em que adita seqüência de desestabilização é selecionada do grupo que consiste emum terminador SAUR a 3', um elemento DST, um motivo ATTTA, um motivoATTTAA e uma combinação de motivos ATTTA e ATTTAA.

5. Planta transgênica que compreende dentro de seu genomaDNA compreendendo um promotor não constitutivo ligado de forma opera-cional a um gene exógeno que codifica um polipeptídeo e que compreendeem sua região não traduzida a 3' pelo menos uma primeira seqüência dedesestabilização, através da qual é expresso em um nível menor na ditaplanta transgênica em relação à expressão na ausência da dita seqüênciade desestabilização.

6. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 5, em que adita planta transgênica é uma planta de cultivo.

7. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 5, em que odito promotor não constitutivo é selecionado do grupo que consiste em pro-motores específicos espacialmente, promotores específicos temporalmenteou promotores que podem ser induzidos.

8. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 5, em que adita seqüência de desestabilização é selecionada do grupo que consiste emum terminador SAUR a 3', um elemento DST, um motivo ATTTA, um motivoATTTAA e uma combinação de motivos ATTTA e ATTTAA.

9. Planta de cultivo transgênica utilizada para alimento ou produ-to alimentício e que compreende dentro do seu genoma DNA compreenden-do um gene exógeno que codifica um polipeptídeo e que compreende emsua região não traduzida a 3' uma seqüência de desestabilização, através daqual o dito polipeptídeo é expresso em um nível menor na dita planta de cul-tivo transgênica utilizada para alimento ou produto alimentício em relação àexpressão na ausência da dita seqüência de desestabilização.

10. Planta de cultivo transgênica utilizada para alimento ou pro-duto alimentício de acordo com a reivindicação 9, em que a dita planta decultivo transgênica utilizada para alimento ou produto alimentício é uma mo-nocotiledônea.

11. Planta de cultivo transgênica utilizada para alimento ou pro-duto alimentício de acordo com a reivindicação 10, em que a dita monocoti-ledônea é o milho.

12. Planta de cultivo transgênica utilizada para alimento ou pro-duto alimentício de acordo com a reivindicação 9, em que a dita planta decultivo transgênica utilizada para alimento ou produto alimentício é uma dico-tiledônea.

13. Planta de cultivo transgênica utilizada para alimento ou pro-duto alimentício de acordo com a reivindicação 12, em que a dita dicotiledô-nea é a soja.

14. Planta de cultivo transgênica utilizada para alimento ou pro-duto alimentício de acordo com a reivindicação 9, em que a dita seqüênciade desestabilização é selecionada do grupo que consiste em um terminadorSAUR a 3', um elemento DST, um motivo ATTTA, um motivo ATTTAA e umacombinação de motivos ATTTA e ATTTAA.

15. Planta transgênica que compreende dentro do seu genomaDNA compreendendo um gene exógeno que codifica um polipeptídeo e quecompreende em sua região não traduzida a 3' uma seqüência de desestabi-lização que compreende repetições ATTTAA sobrepostas, através da qual odito polipeptídeo é expresso em um nível menor na dita planta transgênicaem relação à expressão na ausência da dita seqüência de desestabilizaçao.

16. Planta transgênica que compreende dentro do seu genomaDNA compreendendo um gene que codifica a antranilato sintase e que com-preende em sua região não traduzida a 3' uma seqüência de desestabiliza-çao, através da qual a dita antranilato sintase é expressa em um nível menorna dita planta transgênica em relação à expressão na ausência da dita se-qüência de desestabilizaçao.

17. Processo para diminuir após a transcrição a estabilidade damensagem de um gene de interesse em uma planta de cultivo utilizada paraalimento ou produto alimentício, que compreende a adição de uma seqüên-cia de desestabilizaçao na região não traduzida a 3' do dito gene de interes-se na dita planta de cultivo utilizada para alimento ou produto alimentício,através da qual a estabilidade da mensagem do dito gene de interesse édiminuída após a transcrição.

18. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que a ditaplanta de cultivo transgênica utilizada para alimento ou produto alimentício éuma monocotiledônea.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, em que a ditamonocotiledônea é o milho.

20. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que a ditaplanta de cultivo transgênica utilizada para alimento ou produto alimentício éuma dicotiledônea.

21. Processo de acordo com a reivindicação 20, em que a ditadicotiledônea é a soja.

22. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que a ditaseqüência de desestabilizaçao é selecionada do grupo que consiste em umterminador SAUR a 3', um elemento DST, um motivo ATTTA, um motivoATTTAA e uma combinação de motivos ATTTA e ATTTAA.

23. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que o ditogene de interesse está ligado de forma operacional a pelo menos um ele-mento promotor em um cassete de expressão transgênica.