JP5016594B2 - アスパラギンおよび蛋白質を増強したトウモロコシ植物ならびに種子 - Google Patents
アスパラギンおよび蛋白質を増強したトウモロコシ植物ならびに種子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5016594B2 JP5016594B2 JP2008512378A JP2008512378A JP5016594B2 JP 5016594 B2 JP5016594 B2 JP 5016594B2 JP 2008512378 A JP2008512378 A JP 2008512378A JP 2008512378 A JP2008512378 A JP 2008512378A JP 5016594 B2 JP5016594 B2 JP 5016594B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- corn
- asparagine
- plant
- promoter
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Cereal-Derived Products (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明は、一般的に植物バイオテクノロジーの技術分野に関し、より詳細には、トウモロコシ植物および種子におけるアスパラギンおよび蛋白質を増強することに関する。
図1は、pMON79706のプラスミド地図を示す。
図2は、pMON66229のプラスミド地図を示す。
図3は、pMON66230のプラスミド地図を示す。
図4は、pMON66231のプラスミド地図を示す。
図5は、pMON66239のプラスミド地図を示す。
図6 pMON79706事象における導入遺伝子発現。誤差バーは、遺伝子組換え事象につきn=5および同系繁殖系対照につきn=10での、95%の信頼区間を表わす。
図7 pMON92870事象における導入遺伝子発現。誤差バーは、遺伝子組換え事象につきn>3および同系繁殖系対照につきn=10植物での、95%の信頼区間を表わす。
配列番号:1はZea mays AsnS1をコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号:2はZea mays AsnS1ポリペプチドである。
配列番号:3はZea mays AsnS2をコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号:4はZea mays AsnS2ポリペプチドである。
配列番号:5はZea mays AsnS3をコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号:6はZea mays AsnS3ポリペプチドである。
配列番号:7はGlycine max AsnSをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号:8はGlycine max AsnSポリペプチドである。
配列番号:9はXylella fastidiosa AsnSをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号:10はXanthomonas campestris AsnSをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号:11はBacillus halodurans AsnSをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号:12はOryza sativa AsnSをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号:13はGaldieria sulphuraria AsnSをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号:14はGaldieria sulphuraria AsnSをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号:15はGaldieria sulphuraria AsnSをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号:16はGaldieria sulphuraria AsnSをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号:17はSaccharomyces cerevisiae CGPG3913 AsnSをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号:18は順方向(f)AsnS PCRプライマー配列である。
配列番号:19は順方向(f)AsnS PCRプライマー配列である。
配列番号20〜43は、Gatewayクローニング手順を用いた一次および二次の順方向(f)ならびに逆方向(r)AsnS PCRプライマー配列である。
配列番号:44 順方向(f)AsnS PCRプライマー配列.
配列番号:45 順方向(f)AsnS PCRプライマー配列.
配列番号:46 ZmASセンスプライマー
配列番号:47 ZmASアンチセンスプライマー
配列番号:48 トウモロコシAsnS3順方向プライマー
配列番号:49 トウモロコシAsnS3逆方向プライマー
以下は、本発明の実施において当業者を援助するために提供された本発明の詳細な説明である。本明細書に特記されない限りは、用語は、関連技術分野における当業者により従来の用法により理解されるべきものである。また、分子生物学における共通の用語の定義は、Riegerら, 1991;およびLewin, 1994に見出すこともできる。37CFR§1.822で記載されたDNA塩基についての命名法が用いられる。アミノ酸残基についての標準的な1および3文字の命名法が用いられる。本願明細書に記載された具体例における修飾および変形は、本発明の精神または範囲から逸脱することなくして、当業者によってなされ得る。
本発明は、トウモロコシ・アスパラギンシンテターゼ(Zm.AsnS2)酵素をコードする異種DNA分子を含む導入遺伝子をそれらのゲノムに含む遺伝子組換えトウモロコシ植物および種子を含みかつ提供し、ここに、そのDNA分子は、例えば、配列番号:3および機能的なアスパラギンシンテターゼ活性を持つかかる配列に少なくとも90%、95%または99%の同一性を有する配列を含む。
アスパラギンシンテターゼをコードする本発明の1以上のDNA構築体は、植物形質転換またはトランスフェクションに用い得る。外来性の遺伝子物質は、植物細胞に転移でき、その植物細胞は、全体、稔性または無菌の植物に再生し得る。外来性の遺伝子物質は、天然発生するか、またはいずれかの生物に挿入できるいずれかの源からのいずれかの遺伝子物質である。
植物細胞の形質転換のための最も一般的に用いられている方法は、Agrobacterium媒介DNA転移プロセスおよび遺伝子銃(biolistics)または微粒子銃媒介プロセス(すなわち、遺伝子銃)である。典型的には、核形質転換が望ましいが、葉緑体またはアミロプラストのごとき色素体を特に形質転換することが望ましいならば、植物色素体を、所望のポリヌクレオチドの遺伝子銃媒介形質転換を利用して形質転換し得る。
本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞、哺乳動物、サカナ細胞、サカナ、トリ細胞、トリ、藻類細胞、藻類、真菌細胞、真菌または細菌細胞のごときいずれの細胞または生物にも導入し得る。本発明の蛋白質は、適当な細胞または生物において生成され得る。好ましい宿主および形質転換体は、Aspergillusのごとき真菌細胞、酵母、哺乳動物、特にウシおよびブタ、昆虫、細菌および藻類を含む。特に好ましい細菌は、Agrobacterium tumefaciensおよびE. coliである。
当業者は、本発明により提供される方法および組成物の多数の利点を理解するであろう。以下の実施例は本発明の好ましい具体例を示すために含まれる。以下の実施例において示された技術が、本発明の実行において良好に機能する発明者により発見された技術を表わし、かくして、その実施についての好ましい様式を構成すると考えることができることは当業者により十分に理解されるであろう。しかしながら、当業者ならば、本開示に徴して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多数の変形が、開示された特定の具体例においてなすことができ、依然として、同様または類似する結果を得ることができることを認識するであろう。本願明細書に引用された全ての参考文献は、それらが本明細書に使用された方法、技術または組成物についての背景を補足、説明、提供するか、あるいはそれらを教示する範囲までここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
トウモロコシおよびダイズ植物cDNAならびにゲノムライブラリーの構築。
この実施例は、本発明のトウモロコシAsnSおよびダイズポリヌクレオチド配列が単離されたトウモロコシおよびダイズ植物組織から作成されたcDNAライブラリーの生成を記載する。cDNAライブラリーは、当該技術分野において知られた技術、例えば、Alba, 2004を用いて、Zea maysおよびGlycine maxの組織から生成された。トウモロコシcDNAライブラリーは2つの異なった組織から生成された。ライブラリーは、同系繁殖系90DDD5からの遷延(dilatory)相にて収穫された初期の核から生成した。第2のトウモロコシcDNAライブラリーは、トウモロコシ同系繁殖系H99からのシルキング成長段階でシルク組織およびトウモロコシ同系繁殖系MO17からの発芽用花粉をから作成した。ダイズ(Glycine max)からのcDNAライブラリーの構築については、分裂組織および胚軸の一部を、品種A3237(Asgrow)の再水和した乾燥ダイズ種子から切り取った。外植片は、まず、18時間の光/日、28℃で6日間固体組織培養基上で表面が殺菌された種子を発芽させ、次いで、少なくとも24時間4℃に発芽した種子を移すことにより調製した。ライブラリー調製物に用いた組織については、子葉を除去して、注目するその特定の組織を富化した。0.5〜2グラムの組織を合計RNAおよびポリA+RNAの調製に用いた。全cDNAライブラリーについては、植物組織を収穫し、液体窒素中で直ちに冷凍した。収穫した組織は、合計RNAの調製まで−80℃にて貯蔵した。合計RNAを、製造者によって推奨されるように、実質的に、Invitrogen Corporation (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, U.S.A.)からのTrizol試薬を用いて精製した。ポリA+RNA(mRNA)は、製造者(Dynabeads, Dynal Biotech, Oslo, Norway)によって推奨されるように、実質的に、磁気的オリゴdTビーズを用いて精製した。
連結独立(ligation independent)およびGatewayクローニング法によるAsnSポリヌクレオチド配列の単離およびトウモロコシ形質転換。
この実施例は、連結独立およびGatewayRクローニング法を用いた、AsnSをコードするポリヌクレオチド分子の単離ならびに本発明のDNA構築体の構築を示し、その構築体は、表1に記載した様々な植物および微生物源から単離したAsnSポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含む。連結したAsnSをコードするポリヌクレオチド分子の発現を駆動するために用いたプロモーター分子は、コメアクチン1プロモーター、P−Os.Act1(ここに出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第5,641,876号);Zea mays PPDK(Matsuokaら, 1993)、P−RTBV−1(ここに出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第5,824,857号)、およびP−Zm.NAS(トウモロコシからのニコチアナミン合成酵素2ポリペプチドをコードするゲノム領域のプロモーター分子)である。
配列番号:48:GCAGTCGCTGTCGTTACCCGGCATCATGTGTGGCATC
配列番号:49:GCGAGTACCGCTGGGTTCTAACGTACTCTCGTCAGACCGCG
の設計に用いた。
1. 94℃で2分間
2. 94℃で15秒間
3. 70℃で30秒間(1サイクル当たり-1℃)
4. 72℃で5分間
5. 工程2に行く、9回
6. 94℃で15秒間
7. 60℃で30秒間
8. 72℃で5分間
9. 工程6に行く、24回。
10. 72℃で10分間
11. 10℃保持
12. 終了
AsnSポリヌクレオチド配列でのトウモロコシのベクター構築および形質転換
トウモロコシAsnS2(配列番号:3、pMON79706、図1)をPCR(ポリメラーゼ鎖反応)の使用により増幅した。PCR反応用の反応条件は、製造者のプロトコール(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)に従った。前記のように調製した約100ngのトウモロコシDNAを、各30ナノモルの順方向(f)プライマー(配列番号:32)および逆方向(r)プライマー(配列番号:33)ならびに各10ミクロモルのdATP、dCTP、dGTPおよびTTP、LA PCR Buffer II (Takara Bio INC, Shiga, Japan)中の2.5ユニットのTaKaRaLA Taqを用いて増幅した。94℃で1分間の最初のインキュベーション後、35サイクルのPCRを94℃にて45秒間行った後、60℃で45秒間のアニーリングに続けて、72℃で1分15秒間、72℃で7分間の1サイクルを行った。
ZmASアンチセンス 5'TGCAGAATTCTATCCCTCGATGG; (配列番号:47)
のプライマー対を用いて、pMON66240からのトウモロコシAsnS2を増幅した。PCRセットアップは以下の通りである:50μl PCR反応の全容積中で、1μlの10mMのZmASセンスおよびZmASアンチセンスの各プライマー、pMON66240の0.2〜0.5μgのプラスミドDNA(1μl)、5μlの10X AccuPrime Tm Pfx Reaction Mix、1μlのACCuPrime Tm Pfx DNA Polymerase (Invitrogen)、および41μlの蒸留水。PCR反応は、以下のサイクル・パラメーターで行った:94℃で1分間後、変性のための94℃15秒間の30サイクル;アニーリングの58℃15秒間、および68℃4分間に続いて;68℃での10分間の伸長。PCR産物をQIAGEN (QIAGEN Inc.)からのPCR精製キットを用いて精製した。PCRトウモロコシAsnS2生成物のアリコートをNcoIおよびEcoRI制限酵素で消化し、PCR産物のもう一つのアリコートをAflIIIおよびNcoIで消化した。次いで、NcoIおよびEcoRIフラグメントをpMON94901のNcoIおよびEcoRIサイトにクローニングした。トウモロコシAsnS2のAflIIIおよびNcoI 5’末端フラグメントをNcoIサイトにてトウモロコシAsnS2フラグメントのNcoIおよびEcoRIにクローニングした。e35SプロモーターおよびHsp17ターミネーターとの作動可能な連結においてトウモロコシAsnS2を含む得られたプラスミド(pMON74940)をNotIで消化し、NotIで消化したpMON53616に連結してpMON74946を構築した。
トウモロコシ種子試料の蛋白質およびアミノ酸の分析。
この実施例は、HPLCおよび近赤外線の測定を用いて、増加したアスパラギンおよび蛋白質を持つ本発明の種子を選択するための蛋白質およびアミノ酸の分析方法を記載する。種子蛋白質分析については、各処理につき50〜100種子よりなる小さなバルク試料を、近赤外線透過率分光法(Infratec model 1221, Tecator, Hoganas Sweden)を用いて測定した。この手順は、近赤外線の吸収と、典型的な種子試料中に含まれた化学成分量との間に線形関係が存在するという観察に基づいた。未知の試料を分析するのに先立ち、スペクトルデータをキャリブレーション試料で集め、一次分析技術を用いて、引き続いて分析した。用いた一次技術は、窒素燃焼(Murray and Williams, 1987)であった。多変数のモデルを、分光計からのスペクトルのデータおよび一次データを用いて開発した。このケースにおいて、PLS−1(部分的最小二乗法回帰タイプI)の多変数モデルを152のキャリブレーション試料を用いて構築した。未知の各試料を分光計で少なくとも5回スキャンし、その蛋白質含量は各走査で予測した。試料をスキャンした各回にて、それを試料キュベットに戻して加えて、テストした試料の正確な表示を提供した。予測した蛋白質の値を複数の走査につき平均し、次いで、各試料につき報告した。
遺伝子組換えトウモロコシ植物におけるアスパラギンレベルおよび粒蛋白質含量の圃場評価。
この実施例は、形質転換したトウモロコシ植物および種子におけるアスパラギンおよび蛋白質のレベルに対するトウモロコシAsnS構築体(pMON79706およびpMON92870)の効果;および粒蛋白質含量に対するトウモロコシAsnS構築体(pMON79700およびpMON79653)の効果の圃場評価の結果を記載する。トウモロコシ組織中の遊離アスパラギンの相対的な濃度は、pMON79706またはpMON92870で形質転換したR0トウモロコシ植物から誘導した同系繁殖系から得た。pMON79706については、R0形質転換体を親の同系繁殖系LH59に戻し交配して、BC1種子を作成した。導入遺伝子で分離するBC1種子を圃場苗床に植え、個々の植物をNPTIIマーカー遺伝子の存在につきスコアした。葉組織を、遊離アミノ酸分析のための個々の遺伝子組換え事象について、導入遺伝子ポジティブおよび導入遺伝子ネガティブな植物からの遊離アミノ酸分析のために集めた。pMON79706トランスジェニック植物の葉遊離アミノ酸を、各事象内のネガティブな等値線(isoline)の植物と比較し、JMP 5.1 ソフトウエア(SAS Institute, Cary, NC)スチューデントt検定により統計的に分析した。pMON92870について、R0形質転換体を親の同系繁殖系LH244に戻し交配して、BC1種子を創製した。BC1種子を圃場苗床で植え、自家受粉して、BC1S1種子を創製し、引き続いて第2の同系繁殖系の苗床に植えた。導入遺伝子ポジティブの植物をNPTIIマーカー遺伝子の存在につきスコアリング後に、各遺伝子組換え事象につき同定した。葉組織を苗床で等間隔に植えられた導入遺伝子ポジティブのBC1S1植物および親の同系繁殖系の試験区画(plot)から集めた。pMON92870についての葉遊離アミノ酸は、分散分析を行ないSAS 9.1ソフトウェアを用いて、スチューデントt検定を行なうことにより親対照に対する導入遺伝子のエントリーを比較することにより統計的に分析した。双方の構築体についての遊離アミノ酸分析について、葉組織は開花期に上部の十分に伸長した葉を取り出した後、ドライアイスで凍結することにより集めた。葉試料を冷凍粉砕し、凍結乾燥し、HPLCにより遊離アミノ酸含量を測定した。
pMON79706およびpMON92870による導入遺伝子発現およびアスパラギンシンテターゼ酵素活性の圃場評価
導入遺伝子発現を、pMON79706およびpMON92870の遺伝子組換え事象において確認した。また、pMON79706については、BC1S3同型接合性同系繁殖系での圃場試験における葉アスパラギン含量の決定に用いた組織を、開花期でのpMON79706からの3’−ターミネーター配列(St.Pis4)からの発現の測定に基づいた導入遺伝子発現の決定に用いた。2つの葉試料が、5つの各複製試験区画(同系繁殖系対照については10)から収穫し、プールし、ドライアイス上で凍結した。次いで、葉試料を発現分析のために粉砕凍結した。RNA抽出については、50mgの凍結組織を96ウェルプレートに等分した。各試料をABI核酸溶菌液(Applied Biosystems, Foster City, CA)−対−1X PBS pH7.4(MgClまたはCaClが無い)の1:1溶液を含有する500mlの溶解緩衝液で抽出した。RNAを粗製溶解物から核酸を捕らえるための濾板を用いて、新鮮な凍結組織試料から抽出し、50μlのABI溶離緩衝液を用いて、境界RNAを溶出した。定量的PCRは、5μlのABI一工程RT−PCR試薬と共に5μlのRNA鋳型を用いて行った。その反応はABI Taqman 7900 PCR装置で40のPCRサイクルを行い、サイクリングパラメーターは、48℃30分間、95℃10分間、95℃10秒、60℃1分間であった。蛍光性の測定値は、ジャガイモプロテアーゼ阻害剤II(St.Pis4)から誘導したターミネーター配列および内因性対照(ユビキチン)の双方につき各40サイクルにて各ウェルから得た。試料のサブセットは逆転写酵素なくして試行して、DNA汚染をモニターした。試料を、内因性対照のサイクル閾値からSt.Pis4についてのサイクル閾値を減じることにより、相対的な発現をスコアした。サイクル閾値(Ct)を決定し、デルタCtを、内因性対照値を引いたSt.Pis4から計算した。インサイツ野生型を、平均の内因性対照シグナルを計算し、40にてSt.Pis4シグナル値をセットすることにより創製した。未知試料のデルタCtは、インサイツ野生型のデルタCtから引いた。最終データは、野生型に対しpinII(St.Pis4)発現として報告した。定量的RT−PCR分析は、pMON79706の6事象のうちの6つからの導入遺伝子の過剰発現を確認した(図6)。
アスパラギンおよび粒蛋白質含量に対するpMON66231、pMON66239およびpMON74946の効果の圃場評価
トウモロコシ組織における遊離アスパラギンの相対的含量は、トウモロコシAsnS2がトウモロコシFDAプロモーターの制御下にあるpMON66231(図4)で形質転換されたR0トウモロコシ植物(LH244バックグラウンド)から誘導されたハイブリッド系から得た。ハイブリッドは、雄性同系繁殖系LH59にR0植物を交配させることにより作成し、それは分離する(1:1)F1集団を創製する。得られたF1種子は、各位置にて2複製で3つのミッドウェスト位置に植えた。試験区画にV3成長段階にてグリホサートを噴霧して、ヌル(null)分離個体を消失させた。ハイブリッド対照は、境界線内に植え、比較はハイブリッド対照に対して成した。上葉を3つの場所すべてで、日没2時間後に、開花時点にて各試験区画内の3つの植物から集め、プールした。葉を直ちにドライアイス上に置き、次いで、処理まで−80℃で貯蔵した。葉を凍結粉砕し、一部分をHPLCによる遊離アミノ酸分析のために凍結乾燥した。データは、Bonferroni調整のp値を用いて、削除されたスチューデント化された残余につきツー・パス方法で外れ値につきスクリーニングした。分散分析計算が開始される前に、外れ値を同定し、データセットから除去した。データは、アクロスロケーション無作為化完全ブロック計画(across-locations randomized complete block design)により分析した。構築体−事象組合せは、固定された効果でモデル化し、位置および位置内の代表(rep)を無作為効果でモデル化した。処理比較は、構築体−事象組合せの最小二乗法の対比を行うことによりなした。相対的な葉アスパラギンは、pMON66231の12の事象のうち11において有意に増加し、対照における3%と比較して、16%の高さのアスパラギンレベルであった(表7)。また、成熟粒蛋白質は、試験区画当たり10の穂の収穫後に測定し、各試験区画の種子の殻を除去し、プールし、次いで、粒蛋白質含量を測定した。12事象のうちの9つは、LH244/LH59のハイブリッド対照を超えて、成熟粒において蛋白質含量を有意に増加させることが判明した。
刊行物、特許および特許出願のすべては、個々の公開または特許出願が参照によって組込まれるように具体的にかつ個々に示されるかのごとき同程度までここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
以下の参考文献は、それらが本願明細書に記載されるものに補助的な典型的な手順または他の細部を提供する程度まで、ここに出典明示して具体的に本明細書の一部とみなす:
米国特許第4,761,373号
米国特許第4,957,748号
米国特許第5,100,679号
米国特許第5,219,596号
米国特許第5,322,783号
米国特許第5,322,938号
米国特許第5,538,880号
米国特許第5,550,318号
米国特許第5,563,055号
米国特許第5,610,042号
米国特許第5,633,435号
米国特許第5,936,069号
米国特許第6,005,076号
米国特許第6,146,669号
米国特許第6,156,227号
米国特許第6,194,636号
米国特許第6,232,526号
米国特許出願公開20040216189A1
米国特許出願公開20050048624A1
Alba, Plant J., 39(5): 681-808, 2004.
Allard, In: Principles of Plant Breeding, 2nd Ed., John Wiley & Sons, ISBN: 0471023094, 1999.
Altschulら, Nucleic Acids Res., 25:33893402, 1997,
Aslanidis および de Jong, Nucleic Acids Res., 18(20):6069-6074, 1990.
Ausubelら, eds. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989.
Bevan, Nucleic Acids Res., 12:8711-8721,1984.
Chuら, Scientia Sinica, 18:659, 1975.
Dellaportaら, Plant Molecular Biology Reporter, 1:19-21, 1983.
D'Halluinら, Bio/Technology, 10:309314, 1992.
Fraleyら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4803-4807, 1983.
Haymesら, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985.
Hayward, In: Plant Breeding: Principles and Prospects, Vol. 1, Chapman & Hall, ISBN: 0412433907, 1993.
Henikoff および Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1091510919, 1992.
Herrera-Estrellaら, Nature, 303:209, 1983.
Hincheeら, Bio/Technology, 6:915922, 1988
Jones および Shenk, Cell, 13:181188, 1978.
Jonesら, Mol. Gen. Genet., 210(1):1-4, 1987.
Kleeら, Bio-Technology, 3(7):637-642, 1985.
Lewin, In: Genes V, Oxford University Press, NY, 1994.
Matsuokaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:9586-9590, 1993.
Murashige および Skoog, Physiol. Plant, 15:473-497, 1962.
Murray および Williams, In: Chemical Principles of Near-Infrared Technology, Near-Infrared Technology in the Agricultural and Food Industries, Williams and K. Norris (Eds.,), 1987.
PCT出願 WO 95/06128
Reynaertsら, In: Selectable and Screenable Markers, Gelvin and Schilperoort (Eds.), Plant Molecular Biology Manual, Kluwer, Dordrecht, 1988.
Richards, In: Plant Breeding Systems, Stanley Thornes Pub Ltd; 2nd Ed., ISBN: 0412574500, 1997.
Riegerら, Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991.
Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001
Stalkerら, J. Biol. Chem., 263:6310-6314, 1988.
Thilletら, J. Biol. Chem., 263:12500-12508, 1988.
Claims (9)
- 異種アスパラギンシンテターゼ・ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種DNA構築体をそのゲノムに含む増加した蛋白質レベルを持つ遺伝子組換えトウモロコシ種子であって、ここに、該種子はそのゲノムに該DNA構築体を含まない同一品種の種子の蛋白質レベルに対し増加した蛋白質レベルを有し、
該ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号:5の配列を含む核酸配列;および
(b)配列番号:6のポリペプチド配列をコードする核酸配列よりなる群から選択される核酸配列を含む該トウモロコシ種子。 - 該プロモーターがコメアクチン1プロモーターである請求項1記載の遺伝子組換えトウモロコシ種子。
- 異種アスパラギンシンテターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種DNA構築体をそのゲノムに含む増加したアスパラギンレベルを持つ遺伝子組換えトウモロコシ植物であって、ここに、該植物はそのゲノムに該DNA構築体を含まない同一品種の植物のアスパラギンレベルに対し増加したアスパラギンレベルを有し、
異種アスパラギンシンテターゼをコードする該ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号:5の配列を含む核酸配列;および
(b)配列番号:6のポリペプチド配列をコードする核酸配列よりなる群から選択される核酸配列を含む該トウモロコシ植物。 - 該プロモーターが、コメアクチン1プロモーターである請求項3記載の遺伝子組換えトウモロコシ植物。
- a)アスパラギンシンテターゼ・ポリペプチドをコードするDNA分子に作動可能に連結されたトウモロコシ細胞に機能的なプロモーター分子を含む異種DNA構築体でトウモロコシ細胞を形質転換し;
b)トウモロコシ細胞を無傷のトウモロコシ植物に再生し;
c)該DNA構築体で形質転換しないトウモロコシ植物組織に対し組織における増加したアスパラギンを有するトウモロコシ植物を選択し;
d)トウモロコシ植物を成熟まで生長させ;次いで、
e)トウモロコシ植物から種子を収穫することを含むことを特徴とする増加したアスパラギンを持つ遺伝子組換えトウモロコシ植物の生成方法であって、
該DNA分子が、
(a)配列番号:5の配列を含む核酸配列;および
(b)配列番号:6のポリペプチド配列をコードする核酸配列よりなる群から選択される核酸配列を含むことを特徴とする該方法。 - さらに、f)増加した蛋白質を持つ種子を選択する工程を含むことを特徴とする請求項5記載の方法。
- コーンミールが、異種アスパラギンシンテターゼ・ポリペプチドをコードするDNA分子に作動可能に連結されたプロモーター分子を含む異種DNA構築体を含む他のコーンミールに対し増加した蛋白質を持つコーンミールであって、
該DNA分子が、配列番号:5の配列を含む該コーンミール。 - コーンミールが、異種アスパラギンシンテターゼ・ポリペプチドをコードするDNA分子に作動可能に連結されたプロモーター分子を含む異種DNA構築体を含む他のコーンミールに対し増加した蛋白質を持つコーンミールであって、
該DNA分子が、配列番号:6のポリペプチドをコードする該コーンミール。 - 請求項7または8記載のコーンミールから調製された動物飼料。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US68134805P | 2005-05-16 | 2005-05-16 | |
US60/681,348 | 2005-05-16 | ||
PCT/US2006/018560 WO2006124678A2 (en) | 2005-05-16 | 2006-05-15 | Corn plants and seed enhanced for asparagine and protein |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008539784A JP2008539784A (ja) | 2008-11-20 |
JP5016594B2 true JP5016594B2 (ja) | 2012-09-05 |
Family
ID=37102004
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008512378A Active JP5016594B2 (ja) | 2005-05-16 | 2006-05-15 | アスパラギンおよび蛋白質を増強したトウモロコシ植物ならびに種子 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20070006338A1 (ja) |
EP (1) | EP1882038B1 (ja) |
JP (1) | JP5016594B2 (ja) |
CN (1) | CN101248182B (ja) |
AR (1) | AR053269A1 (ja) |
AU (1) | AU2006247506B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0610816B1 (ja) |
CA (1) | CA2625583C (ja) |
MX (1) | MX291669B (ja) |
NZ (1) | NZ563198A (ja) |
UY (1) | UY29533A1 (ja) |
WO (1) | WO2006124678A2 (ja) |
ZA (1) | ZA200709564B (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AR053269A1 (es) | 2005-05-16 | 2007-04-25 | Monsanto Technology Llc | Plantas y semillas de maiz con mejoramiento de asparagina y proteina |
EP2540831A3 (en) * | 2006-08-17 | 2013-04-10 | Monsanto Technology, LLC | Transgenic plants with enhanced agronomic traits |
WO2008131155A2 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-30 | Monsanto Technology Llc | Corn plants and seed enhanced for asparagine and protein |
FR2959229B1 (fr) * | 2010-04-21 | 2013-01-18 | Vect Horus | Derives peptidiques, leur preparation et leurs utilisations |
CN104427861B (zh) | 2012-05-08 | 2018-05-04 | 孟山都技术公司 | 玉米事件mon 87411 |
CN111118053B (zh) * | 2013-03-25 | 2022-07-01 | 北京未名凯拓作物设计中心有限公司 | 水稻育性调控构建体及其转化事件和应用 |
CN106874710A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-06-20 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 一种用于利用肿瘤ffpe样本检测体细胞突变的装置 |
US20220307047A1 (en) * | 2018-06-14 | 2022-09-29 | Benson Hill, Inc. | Increasing plant growth and yield by using a ring/u-box superfamily protein |
CN112772418A (zh) * | 2021-03-04 | 2021-05-11 | 云南海达新生态环境建设有限公司 | 一种秋石斛兰花芽组织培养快速繁殖的方法 |
CN116987721A (zh) * | 2022-04-26 | 2023-11-03 | 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 | 控制玉米蛋白含量和氮高效的关键基因 |
Family Cites Families (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US42433A (en) * | 1864-04-19 | Improvement in rollers for rolling iron | ||
US4761373A (en) | 1984-03-06 | 1988-08-02 | Molecular Genetics, Inc. | Herbicide resistance in plants |
US5107065A (en) | 1986-03-28 | 1992-04-21 | Calgene, Inc. | Anti-sense regulation of gene expression in plant cells |
US5322938A (en) | 1987-01-13 | 1994-06-21 | Monsanto Company | DNA sequence for enhancing the efficiency of transcription |
US4957748A (en) | 1987-03-23 | 1990-09-18 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Ruminant feed, method of making and method of using |
US5955651A (en) * | 1989-05-03 | 1999-09-21 | New York University | Transgenic plants that exhibit enhanced nitrogen assimilation |
US5550318A (en) | 1990-04-17 | 1996-08-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
US7705215B1 (en) | 1990-04-17 | 2010-04-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
US5322783A (en) | 1989-10-17 | 1994-06-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Soybean transformation by microparticle bombardment |
US5641876A (en) | 1990-01-05 | 1997-06-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Rice actin gene and promoter |
US5484956A (en) | 1990-01-22 | 1996-01-16 | Dekalb Genetics Corporation | Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin |
JP3209744B2 (ja) * | 1990-01-22 | 2001-09-17 | デカルブ・ジェネティクス・コーポレーション | 結実能力のある遺伝子変換コーン |
US5219596A (en) | 1990-08-24 | 1993-06-15 | Cargill, Incorporated | Composition and method thereof for increasing milk production in dairy cattle |
US5633435A (en) | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
US5100679A (en) | 1990-10-03 | 1992-03-31 | Cargill B.V. | Method of making a modified proteinaceous product and composition thereof |
US5610042A (en) | 1991-10-07 | 1997-03-11 | Ciba-Geigy Corporation | Methods for stable transformation of wheat |
US5824857A (en) * | 1991-11-08 | 1998-10-20 | Washington University | Plant promoter |
US5593874A (en) | 1992-03-19 | 1997-01-14 | Monsanto Company | Enhanced expression in plants |
HUT70467A (en) | 1992-07-27 | 1995-10-30 | Pioneer Hi Bred Int | An improved method of agrobactenium-mediated transformation of cultvred soyhean cells |
US5545545A (en) * | 1993-04-27 | 1996-08-13 | Regents Of The University Of Minnesota | Lysine-insensitive maize dihydrodipicolinic acid synthase |
US6326527B1 (en) * | 1993-08-25 | 2001-12-04 | Dekalb Genetics Corporation | Method for altering the nutritional content of plant seed |
US6969782B2 (en) | 1993-10-06 | 2005-11-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing transgenic plants having improved amino acid composition |
US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
US5936069A (en) | 1995-12-06 | 1999-08-10 | Iowa State University Research Foundation | Process for producing improved soy protein concentrate from genetically-modified soybeans |
US5844086A (en) | 1996-01-31 | 1998-12-01 | Stilts Corporation | Oil seed protein extraction |
EP0801134A1 (en) * | 1996-04-11 | 1997-10-15 | Hoechst Schering AgrEvo GmbH | Process for the production of plants with enhanced growth characteristics |
CN1202246C (zh) | 1998-04-08 | 2005-05-18 | 联邦科学和工业研究组织 | 获得修饰表型的方法和措施 |
US6146669A (en) | 1998-05-14 | 2000-11-14 | Cargill Incorporated | Method for processing oilseed material |
US6156227A (en) | 1999-03-01 | 2000-12-05 | Cargill, Incorporated | Deicer composition which includes a plant material which is a corrosion inhibitor |
MXPA01010304A (es) * | 1999-04-12 | 2002-05-06 | Monsanto Technology Llc | Plantas transgenicas que contienen niveles alterados de compuestos de esterol y tocoferoles. |
US20100293669A2 (en) * | 1999-05-06 | 2010-11-18 | Jingdong Liu | Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement |
US6194636B1 (en) | 1999-05-14 | 2001-02-27 | Dekalb Genetics Corp. | Maize RS324 promoter and methods for use thereof |
US6232526B1 (en) | 1999-05-14 | 2001-05-15 | Dekalb Genetics Corp. | Maize A3 promoter and methods for use thereof |
US7151204B2 (en) | 2001-01-09 | 2006-12-19 | Monsanto Technology Llc | Maize chloroplast aldolase promoter compositions and methods for use thereof |
EP1402037A1 (en) | 2001-06-22 | 2004-03-31 | Syngenta Participations AG | Plant genes involved in defense against pathogens |
AU2004258200A1 (en) | 2003-07-14 | 2005-01-27 | Monsanto Technology, Llc | Materials and methods for the modulation of cyclin-dependent kinase inhibitor-like polypeptides in maize |
WO2005033319A2 (en) * | 2003-10-02 | 2005-04-14 | Monsanto Technology Llc | Stacking crop improvement traits in transgenic plants |
US20060075515A1 (en) * | 2004-08-11 | 2006-04-06 | Luethy Michael H | Enhanced zein reduction in transgenic corn seed |
AR053269A1 (es) | 2005-05-16 | 2007-04-25 | Monsanto Technology Llc | Plantas y semillas de maiz con mejoramiento de asparagina y proteina |
WO2008131155A2 (en) | 2007-04-19 | 2008-10-30 | Monsanto Technology Llc | Corn plants and seed enhanced for asparagine and protein |
-
2006
- 2006-05-04 AR ARP060101806A patent/AR053269A1/es not_active Application Discontinuation
- 2006-05-15 AU AU2006247506A patent/AU2006247506B2/en active Active
- 2006-05-15 MX MX2007014298A patent/MX291669B/es active IP Right Grant
- 2006-05-15 NZ NZ563198A patent/NZ563198A/en unknown
- 2006-05-15 US US11/434,566 patent/US20070006338A1/en not_active Abandoned
- 2006-05-15 CN CN2006800260163A patent/CN101248182B/zh active Active
- 2006-05-15 BR BRPI0610816-4A patent/BRPI0610816B1/pt active IP Right Grant
- 2006-05-15 CA CA2625583A patent/CA2625583C/en active Active
- 2006-05-15 JP JP2008512378A patent/JP5016594B2/ja active Active
- 2006-05-15 WO PCT/US2006/018560 patent/WO2006124678A2/en active Application Filing
- 2006-05-15 EP EP06759754.2A patent/EP1882038B1/en active Active
- 2006-05-16 UY UY29533A patent/UY29533A1/es not_active Application Discontinuation
-
2007
- 2007-11-06 ZA ZA200709564A patent/ZA200709564B/xx unknown
-
2010
- 2010-01-26 US US12/694,152 patent/US20110020526A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-12-27 US US13/338,101 patent/US9000265B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1882038A2 (en) | 2008-01-30 |
CN101248182B (zh) | 2013-11-27 |
WO2006124678A2 (en) | 2006-11-23 |
BRPI0610816B1 (pt) | 2017-11-21 |
MX2007014298A (es) | 2008-02-08 |
CA2625583C (en) | 2015-04-14 |
UY29533A1 (es) | 2006-12-29 |
JP2008539784A (ja) | 2008-11-20 |
BRPI0610816A2 (pt) | 2010-07-27 |
US9000265B2 (en) | 2015-04-07 |
US20070006338A1 (en) | 2007-01-04 |
US20110020526A1 (en) | 2011-01-27 |
WO2006124678A3 (en) | 2007-02-15 |
US20120291154A1 (en) | 2012-11-15 |
CA2625583A1 (en) | 2006-11-23 |
AR053269A1 (es) | 2007-04-25 |
MX291669B (es) | 2011-11-03 |
AU2006247506A1 (en) | 2006-11-23 |
EP1882038B1 (en) | 2016-09-14 |
NZ563198A (en) | 2010-04-30 |
ZA200709564B (en) | 2008-11-26 |
AU2006247506B2 (en) | 2012-12-06 |
CN101248182A (zh) | 2008-08-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5016594B2 (ja) | アスパラギンおよび蛋白質を増強したトウモロコシ植物ならびに種子 | |
US20090300803A1 (en) | Gene coding for acetolactate synthase | |
US20090099377A1 (en) | Production of increased oil and protein in plants by the disruption of the phenylpropanoid pathway | |
KR20110049769A (ko) | 생합성과 관련된 신규의 유전자들 | |
JP5154610B2 (ja) | 植物および真菌において2−アセチル−1−ピロリン合成を増強する核酸 | |
US11732270B2 (en) | Compositions and methods for manipulating the development of plants | |
US8357833B2 (en) | Corn plants and seed enhanced for asparagine and protein | |
US20170183680A1 (en) | Dominant negative mutant krp-related proteins (krp) in zea mays and methods of their use | |
US20110099665A1 (en) | Leafy cotyledon 1 transcriptional activator (lec1) variant polynucleotides and polypeptides compositions and methods of increasing transformation efficiency | |
US7179957B1 (en) | Method for altering nitrogen or oil content of seeds by down regulating AGL11 expression or activity | |
JP2013521003A (ja) | コーヒーにおけるガラクトマンナン含有量の調整 | |
US10253324B2 (en) | Genetically altered alfalfa producing clovamide and/or related hydroxycinnamoyl amides | |
JP3747456B2 (ja) | アミノ酸組成が改良されたトランスジェニック植物の作出法 | |
BRPI0810658B1 (pt) | Construto de dna, método de produção de uma planta de milho transgênica com teor alto de asparagina, alimento ou ração e método de produção do mesmo | |
JP2002518054A (ja) | アラビドプシスタリアナ(Arabidopsisthaliana)からのAIRシンセターゼを用いた殺草化合物のスクリーニング方法 | |
WO2011053167A1 (en) | Transcription factor polynucleotides and their use |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090127 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110719 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110831 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20110927 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111220 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120316 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20120316 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120522 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120608 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150615 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5016594 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |