BRPI0610816A2 - semente e planta de milho transgênicas, método de produzir a referida planta, farinha de milho com proteìna aumentada e alimento - Google Patents

Abstract

SEMENTE E PLANTA DE MILHO TRANSGêNICAS, MéTODO DE PRODUZIR A REFERIDA PLANTA, FARINHA DE MILHO COM PROTEìNA AUMENTADA E ALIMENTO. A presente invenção refere-se a uma semente e planta de milho com níveis realçados de proteína e aminoácidos. A invenção da mesma forma se refere ao constructo de DNA que fornece expressão em células de milho transgênicas de uma enzima de asparagina sintetase. Os constructos de DNA são empregados em um método para produzir sementes e plantas de milho transgênicas para selecionar plantas e sementes com níveis realçados de proteína e aminoácidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SEMENTE EPLANTAS DE MILHO REALÇADAS PARA ASPARAGINA E PROTEÍNA".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório dos Es-tados Unidos Série N- 60/681.348 depositado em 16 de maio de 2005, adescrição total do qual está aqui incorporada por referência.

1. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se de modo geral ao campo de bio-tecnologia de planta e mais especificamente ao realce de asparagina e pro-teína em plantas e semente de milho.

2. Descrição da Técnica Relacionada

Os fazendeiros e consumidores desejam plantas de colheita comcaracterísticas agronômicas melhoradas tal como produção aumentada, pro-dução de proteína de semente aumentada, e composição nutricional melho-rada. Os componentes nutricionais desejáveis de plantas de colheita inclu-em, entre outros, fibra, antioxidantes tal como Vitamina E, selênio, ferro,magnésio, zinco, vitaminas B, lignans, ácidos fenólicos, aminoácidos essen-ciais, e fitoestrogênios. Embora esforços consideráveis em reprodução deplanta tenham fornecido alguns ganhos nestas características desejadas, acapacidade de introduzir DNA não hospedeiro específico em um genoma deplanta fornece outras oportunidades de geração de plantas com estas carac-terísticas. Em particular, ao mesmo tempo em que a produção de milho con-vencional aumentou continuamente durante os anos, não houve um aumen-to similar na capacidade de plantas de milho assimilar nitrogênio mais efi-cazmente ou aumentar o teor de proteína da semente.

A disponibilidade de nitrogênio tem um impacto positivo signifi-cante na produtividade de planta, biomassa, e produção de colheita incluindoa produção de proteína de semente. Nas plantas, o nitrogênio inorgânico éassimilado do solo, reduzido à amônia, e incorporado em nitrogênio orgânicona forma da asparagina de aminoácidos transportando nitrogênio, glutamina,ácido aspártico e ácido glutâmico. A asparagina (Asn) é a molécula detransporte de amida preferida por causa de sua relação elevada de nitrogê-nio para carbono (2N:4C versus 2N:5C) e porque ela é relativamente inerte.Asn e outros aminoácidos também são empregados quando construindoblocos para síntese de proteína.

Em plantas, Asn é sintetizada de glutamina, aspartato e ATP, emuma reação catalisada pela enzima asparagina sintetase (AsnS). O glutama-to, AMP e pirofosfato são formados como subprodutos. Duas formas deAsnS foram descritas: uma forma dependente de glutamina e uma formadependente de amônia. A AsnS dependente de glutamina pode catalisarambas as reações dependentes de glutamine e dependentes de amôniaembora a glutamina seja a fonte de nitrogênio preferida.

A concentração elevada de proteína é considerada uma caracte-rística de qualidade importante para a maioria das colheitas principais, inclu-indo soja, milho, e trigo. As variedades de milho, trigo, e soja com alto teorde proteína, por exemplo, foram identificadas por reprodução tradicional.

Entretanto, a maioria das linhagens de alto teor de proteína desenvolvidadeste modo produziu retardamento ou outras desvantagens agronômicas.Seria desejável se o conteúdo de proteína de colheitas, especialmente mi-lho, pudesse ser aumentado acima dos níveis atualmente disponíveis, tantopara consumo humano quanto para uso do produto em alimentos de animal.

Isto ofereceria o benefício de valor de nutriente grandemente realçado quan-do a colheita for empregada como comida e alimento para os seres huma-nos e animais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece um método e composições paratratamento de colheitas e outros produtos de planta para aumentar o conte-údo de proteína e aminoácido em plantas. O método e composições aumen-tam o nível de proteína e aminoácidos livres em tecidos de milho, particular-mente em sementes. Mais especificamente, uma semente e planta de milhotransgênica são fornecidas as quais contenham em seu genoma uma com-posição de DNA heterologo que expresse um produto de gene envolvido emasparagina aumentada e biogenese de proteína aumentada. A expressão doproduto realça o valor nutricional de fontes de milho de alimento e milho co-mestível e produtos processados derivados da semente de milho transgêni-ca ou partes desta.

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para aumentar oconteúdo de proteína em uma planta de milho. Um constructo de DNA com-preendendo uma seqüência de polinucleotídeo selecionada do grupo queconsiste em SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, e 17 onde amolécula de polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de asparagina sinteta-se ou polipeptídeo tendo atividade de asparagina sintetase, também é inclu-ída.

Em uma modalidade, a presente invenção compreende uma cé-lula de planta de milho transformada com a composição de DNA heterólogoque codifica uma asparagina sintetase identificada como SEQ ID NO: 4.

Mais especificamente, a expressão da molécula de polinucleotídeo deAsnS2 de milho heterólogo (isozima 2 de asparagina sintetase) na planta demilho transgênica resulta em um nível elevado de asparagina e proteína naplanta transgênica, por exemplo, nas sementes da planta de milho compara-das a uma planta de milho da mesma variedade que não expressa a molécu-la de polinucleotídeo de AsnS2 de milho heterolólogo.

A presente invenção também refere-se ao alimento de animalque compreende a semente acima mencionada com conteúdo de aminoáci-do ou proteína aumentado, ou um produto processado de tal semente, porexemplo, uma farinha. Conseqüentemente, a presente invenção tambémabrange uma semente de milho que contém uma enzima de asparagina sin-tetase produzida por expressão de um constructo de DNA heterólogo com-preendendo uma molécula de DNA que codifica uma enzima de asparaginasintetase de milho. Uma modalidade de tal semente é grão colhido, a pre-sente invenção também abrange farinha, glúten e outros produtos de milhofeitos de tal grão.

A presente invenção inclui seqüências iniciadoras de ácido nu-cléico que compreendem uma ou mais das SEQ ID NOs 18-45, ou o com-plemento disto. A presente invenção inclui um método para detectar ou iden-tificar, no genoma de uma planta transformada ou progênie desta, uma mo-lécula de polinucleotídeo heteróloga que codifica um polipeptídeo de AsnSde planta, ou um polipeptídeo de planta que tem atividade de AsnS da pre-sente invenção, compreendendo uma molécula de polinucleotídeo selecio-nada do grupo que consiste em SEQ ID NOs 18-45, onde a referida molécu-la de polinucleotídeo é empregada como um iniciador de DNA em um méto-do de amplificação de DNA.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

FIG. 1 ilustra o mapa de plasmídeo de pMON79706.

FIG. 2 ilustra o mapa de plasmídeo de pMON66229.

FIG. 3 ilustra o mapa de plasmídeo de pMON66230.

FIG. 4 ilustra o mapa de plasmídeo de pMON66231.

FIG. 5 ilustra o mapa de plasmídeo de pMON66239.

FIG. 6 é a expressão de transgene em eventos de pMON79706.

As barras de erro representam 95% de intervalo de confiança, com n=5 paraeventos transgênicos e n=10 para controle congênito.

FIG. 7 é a expressão de transgene em eventos de pMON92870.

As barras de erro representam 95% de intervalo de confiança, com n>3 deplantas para eventos transgênicos e n=8 de planta para controle congênito.DESCRIÇÃO DO ÁCIDO NUCLÉICOE SEQÜÊNCIAS DE POLIPEPTÍDEO

SEQ ID NO: 1 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificaum AsnS1 de Zea mays.

SEQ ID NO: 2 é um polipeptídeo de AsnS1 de Zea mays.

SEQ ID NO: 3 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificaum AsnS1 de Zea mays.

SEQ ID NO: 4 é um polipeptídeo de AsnS2 de Zea mays.

SEQ ID NO: 5 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificaum AsnS3 de Zea mays.

SEQ ID NO: 6 é um polipeptídeo de AsnS3 de Zea mays.

SEQ ID NO: 7 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificaum AsnS de Glycine max

SEQ ID NO: 8 é um polipeptídeo de AsnS de Glycine max.

SEQ ID NO: 9 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificaum AsnS de Xylella fastidiosa.

SEQ ID NO: 10 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificaum AsnS de Xanthomonas campestris.

SEQ ID NO: 11 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificaum AsnS de Bacilo halodurans.

SEQ ID NO: 12 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificaum AsnS de Oryza sativa.

SEQ ID NO: 13 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificaum AsnS de Galdieria sulphuraria.

SEQ ID NO: 14 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificaum AsnS de Galdieria sulphuraria.

SEQ ID NO: 15 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificaum AsnS de Galdieria sulphuraria.

SEQ ID NO: 16 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificaum AsnS de Galdieria sulphuraria.

SEQ ID NO: 17 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificaum AsnS CGPG3913 de Saccharomyces cerevisiae.

SEQ ID NO: 18 é uma seqüência iniciadora de PCR de AsnS (f)dianteira.

SEQ ID NO: 19 é uma seqüência iniciadora de PCR de AsnS (f)dianteira.

SEQ ID NOs 20-43, são seqüências iniciadoras de PCR de AsnS® reversas e (f) dianteiras primárias e secundárias empregadas em um pro-cedimento de clonagem Gateway.

SEQ ID NO: 44, uma seqüência iniciadora de PCR de AsnS (f)dianteira.

SEQ ID NO: 45, uma seqüência iniciadora de PCR de AsnS (f)dianteira.

SEQ ID NO:46 iniciador de ZmAS de sentido.

SEQ ID NO:47 iniciador de ZmAS de anti-sentido.

SEQ ID NO: 48 iniciador dianteiro AsnS3 de milho.

SEQ ID NO: 49 iniciador reverso de AsnS3 de milho.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O seguinte é uma descrição detalhada da invenção fornecidapara ajudar aqueles versados na técnica na prática da presente invenção. Amenos que de outro modo definido aqui, os termos devem ser consideradosde acordo com uso convencional por aqueles de experiência ordinária natécnica relevante. As definições de termos comuns em biologia moleculartambém podem ser encontradas em Rieger e outros, 1991; e Lewin, 1994. Anomenclatura para bases de DNA apresentadas em 37 CFR § 1.822 é em-pregada. A nomenclatura de uma e três letras padrão para resíduos de ami-noácido é empregada. As modificações e variações nas modalidades descri-tas aqui podem ser feitas por aqueles de experiência ordinária na técnicasem afastar-se do espírito ou escopo da presente invenção.

A presente invenção fornece um método para aumentar o conte-údo de proteína em uma planta de milho introduzindo-se no genoma de umacélula de planta de milho um polinucleotídeo heterólogo que expresse umpolipeptídeo de AsnS na célula de planta transgênica. A presente invençãofornece constructos de DNA que compreendem (compreende significa "inclu-indo, porém não limitado a") moléculas de polinucleotídeo, ou segmentos deuma molécula de polinucleotídeo que codificam um polipeptídeo de AsnS,opcionalmente operavelmente ligados a um peptídeo de trânsito de cloro-plasto.

As moléculas de polinucleotídeo que codificam um polipeptídeode AsnS ou analógico ou alelo deste, ou moléculas de polinucleotídeo quecodificam um peptídeo de trânsito ou gene marcador/repórter são " isoladas"pelo fato de que elas foram pelo menos parcialmente preparadas in vitro, porexemplo, isoladas de seu estado nativo, de uma célula, purificada, e amplifi-cada, por exemplo, elas estão em combinação com elementos genéticosheterólogos àqueles encontrados normalmente associados com eles em seuestado nativo. Como empregado aqui, um constructo de DNA heterólogocompreendendo uma molécula de polinucleotídeo codificando AsnS que foiintroduzida em uma célula hospedeira, não é preferivelmente idêntica aqualquer molécula de polinucleotídeo presente na célula em seu estado nati-vo, não transformado e é isolada quanto às outras moléculas de DNA queocorrem no genome da célula hospedeira.

Como empregado aqui, níveis "alterados ou aumentados" deasparagina em uma planta, tecido de planta, ou célula de planta transforma-da, são os níveis que são maiores do que os níveis encontrados na planta,tecido de planta, ou células de planta correspondentes que não contêm oconstructo de DNA da presente invenção.

Os agentes da presente invenção também podem ser recombi-nantes. Como empregado aqui, o termo recombinante significa qualquer a-gente (por exemplo, DNA, peptídeo, etc), isto é, ou resulta, entretanto indire-tamente, de manipulação humana de uma molécula de polinucleotídeo.

Como empregado aqui em um aspecto preferido, um aumentona qualidade nutricional de uma semente, por exemplo, conteúdo de proteí-na de semente aumentado, é determinado pela capacidade de uma plantade produzir uma semente que tenha uma produção mais elevada de proteínaou um componente nutricional do que uma semente sem tal aumento naqualidade de proteína ou nutricional. Em um aspecto particularmente preferi-do da presente invenção, o aumento na qualidade nutricional é medido rela-tivo a uma planta com uma base genética similar à planta nutricionalmenterealçada exceto que a planta da presente invenção expresse ou superex-presse uma proteína ou fragmento desta descrito nos constructos de DNAheterólogo aqui.

Moléculas de Polinucleotídeo

A presente invenção inclui e fornece sementes e plantas de mi-lho transgênicas que compreendem em seu genoma um transgene quecompreende uma molécula de DNA heteróloga que codifica uma enzima deasparagina sintetase de milho (Zm.AsnS2), a molécula de DNA, por exem-plo, que compreende SEQ ID NO: 3 e seqüências que têm pelo menos 90%,95%, ou 99% de identidade com tais seqüências com atividade de asparagi-na sintetase funcional.

Um outro aspecto da invenção é um método para aumenta aproteína em uma planta de milho introduzindo-se em uma célula de milho umconstructo de DNA que fornece uma molécula de polinucleotídeo heteróloga,por exemplo, SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17 quecodificam uma enzima de asparagina sintetase. O polinucleotídeo pode dife-rir de quaisquer daqueles exemplos sem alterar o polipeptídeo para o qualcodifica. Por exemplo, é compreendido que os códons capazes de codificarpara tais substituições de aminoácido conservadoras são conhecidos natécnica. Adicionalmente, a invenção contempla que os polipeptídeos em queum ou mais aminoácidos foram deletados, substituídos, ou adicionados semalterar a função de asparagina sintetase, podem ser empregados na invenção.

Em um aspecto da presente invenção, o polinucleotídeo da pre-sente invenção é referido ser moléculas de polinucleotídeo introduzidas.Uma molécula de polinucleotídeo é dita ser "introduzida" se for inserida emuma célula ou organismo como um resultado de manipulação humana, dequalquer forma indireta. Os exemplos de moléculas de polinucleotídeo intro-duzidas incluem, sem limitação, polinucleotídeos que foram introduzidos emcélulas por transformação, transfecção, injeção, e projeção, e aquelas queforam introduzidas em um organismo por conjugação, endocitose, fagocito-se, etc. Preferivelmente, o polinucleotídeo é inserido no genoma da célula.

Um subgrupo das moléculas de polinucleotídeo da presente in-venção são as moléculas de polinucleotídeo de fragmento. As moléculas depolinucleotídeo de fragmento podem consistir em porção(s) significante de,ou realmente a maioria das moléculas de polinucleotídeo da presente inven-ção, tal como aquelas especificamente descritas. Alternativamente, os frag-mentos podem compreender oligonucleotídeos menores (tendo de cerca de15 a cerca de 400 resíduos de nucleotídeo e mais preferivelmente, cerca de15 a cerca de 30 resíduos de nucleotídeo, ou cerca de 50 a cerca de 100resíduos de nucleotídeo, ou cerca de 100 a cerca de 200 resíduos de nucle-otídeo, ou cerca de 200 a cerca de 400 resíduos de nucleotídeo, ou cerca de275 a cerca de 350 resíduos de nucleotídeo). Um fragmento de uma ou maisdas moléculas de polinucleotídeo da presente invenção pode ser uma sondae especificamente uma molécula iniciadora de PCR. Um iniciador de PCR éuma molécula de polinucleotídeo capaz de iniciar uma atividade de polime-rase ao mesmo tempo em que em uma estrutura de filamento duplo comoutro polinucleotídeo. Vários métodos por determinar a estrutura de sondasde PCR e técnicas de PCR existem na técnica.

Como empregado aqui, duas moléculas de polinucleotídeo sãoditas ser capazes de especificamente hibridizar a uma outra se as duas mo-léculas são capazes de formar uma estrutura de polinucleotídeo antiparalela,de filamento duplo.

Uma molécula de polinucleotídeo é dita ser o "complemento" deoutra molécula de polinucleotídeo se elas exibem complementaridade com-pleta. Como empregado aqui, as moléculas são ditas exibir "complementari-dade completa" quando todo nucleotídeo de uma das moléculas é comple-mentar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são ditas ser "minima-mente complementar" se eles podem hibridizar com uma outra com estabili-dade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas a uma outrasob condições de "baixa-severidade" pelo menos convencionais. Similar-mente, as moléculas são ditas serem "complementares" se elas podem hi-bridizar com uma outra com estabilidade suficiente para permitir que elaspermaneçam aneladas a uma outra sob condições de "alta-severidade" con-vencionais. As condições convencionais de severidade são descritas porSambrook e outros, (2001), e por Haymes e outros, (1985). As retiradas decomplementaridade completa são então permissíveis, contanto que tais reti-radas não impeçam completamente a capacidade das moléculas de formaruma estrutura de filamento duplo. Desse modo, para uma molécula de poli-nucleotídeo servir como um iniciador ou sonda ela precisa somente ser sufi-cientemente complementar em seqüência para ser capaz de formar umaestrutura de filamento duplo estável sob o solvente particular e concentra-ções de sal empregadas.

As condições de severidade apropriadas que promovem a hibri-dação de DNA são, por exemplo, 6,0 X de cloreto de sódio/ citrato de sódio(SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 X de SSC a 2025°C, são conhecidas por aqueles versados na técnica ou podem ser encon-tradas em Ausubel, e outros, eds. (1989), seção 6.3.1 6.3.6. Por exemplo, aconcentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma bai-xa severidade de cerca de 2,0 X de SSC a 50°C a uma severidade elevadade cerca de 0,2 X de SSC a 65°C. Além disso, a temperatura na etapa delavagem pode ser aumentada de condições de severidade baixa a tempera-tura ambiente, cerca de 22°C, a condições de severidade elevadas a cercade 65°C. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados, ou a tempe-ratura ou a concentração de sal pode ser mantida constante tal que um áci-do nucléico especificamente hibridize com uma ou mais das moléculas depolinucleotídeo fornecidas aqui, por exemplo, como apresentado nas: SEQID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18-45 e complementosdestas, sob condições moderadamente severas, por exemplo em cerca de2,0 X de SSC e cerca de 65°C.

Em uma modalidade de um método da presente invenção,quaisquer das seqüências de polinucleotídeo ou seqüências de polipeptídeo,ou fragmentos de qualquer uma das duas, da presente invenção podem serempregadas para pesquisar quanto às seqüências relacionadas. Como em-pregado aqui, "pesquisa quanto às seqüências relacionadas" significa qual-quer método,para determinar a relação entre duas seqüências, incluindo,porém não limitado a, pesquisas que comparam a homologia de seqüência:por exemplo, uma pesquisa de PBLAST de um banco de dados para relaçãocom uma única seqüência de polipeptídeo. Outras pesquisas podem serconduzidas empregando métodos com base no perfil, tal como o HMM (mo-delo Hidden Markov) META-MEME, que é mantido por South Dakota StateUniversity, SD, e PSI -BLAST que são mantidas pelo Centro Nacional paraInformação de Biotecnologia, Biblioteca Nacional de Medicina, Institutos Na-cionais de Saúde (NCBI).

Uma molécula de polinucleotídeo pode codificar para uma molé-cula de polipeptídeo substancialmente idêntica ou substancialmente homó-loga. O grau de identidade ou homologia pode ser determinado por uso desoftware de computador tal como o Programa de Abertura WISCONSINPACKAGE. O programa de Abertura na versão 10.0-UNIX de WISCONSINPACOTE de Genetics Computer Group, Inc. é com base no método de Nee-dleman e Wunsch, 1970. Usando o programa TBLASTN no conjunto desoftware BLAST 2.2.1 (Altschul e outros, (1997, ou empregando matrizBLOSUM62 (Henikoff e Henikoff, 1992). Uma molécula de polinucleotídeo dapresente invenção também pode codificar um polipeptídeo homólogo. Comoempregado aqui, uma molécula de polipeptídeo homóloga ou fragmento des-ta é uma molécula de proteína de contraparte ou fragmento desta ou emuma segunda espécie (por exemplo, subunidade pequena de rubisco de mi-lho é um homólogo da subunidade pequena de rubisco de Arabidopsis). Umhomólogo também pode ser gerado por evolução molecular ou técnicas em-baralhamento de DNA, de forma que a molécula retenha pelo menos umacaracterística de estrutura ou funcional do polipeptídeo original (veja, porexemplo, Patente dos Estados Unidos 5.811.238).

Em uma modalidade preferida, quaisquer das moléculas de poli-nucleotídeo da presente invenção podem ser operavelmente unidas a umaregião promotora que funciona em uma célula de planta para causar a pro-dução de uma molécula de mRNA, onde a molécula de polinucleotídeo queé unida ao promotor é heteróloga com respeito àquele promotor. Como em-pregado aqui, DNA "heterólogo" é qualquer seqüência de DNA que não énaturalmente encontrada próximo ao DNA adjacente. "Nativo" se refere auma seqüência de ácido nucléico de ocorrência natural. Seqüência "heteró-loga" geralmente se origina de uma fonte estrangeira ou espécies ou, se damesma fonte, é modificada de sua forma original e/ou local no genoma.

Como empregado aqui, os termos "proteína", "molécula de pep-tídeo", ou "polipeptídeo" incluem qualquer molécula que compreenda cincoou mais aminoácidos. Sabe-se na técnica que a proteína, peptídeo, ou mo-léculas de polipeptídeo podem sofrer modificação, incluindo modificaçõespós-translacionais, tal como, porém não limitado a, formação de ligação dedissulfeto, glicosilaçao, íosforilação ou oligomerização. Desse modo, comoempregado aqui, os termos "proteína", "molécula de peptídeo" ou "polipeptí-deo" incluem qualquer proteína que seja modificada por qualquer processobiológico ou não biológico. Os termos "aminoácido" e "aminoácidos" se refe-rem a todos os L-aminoácidos de ocorrência natural. Esta definição é signifi-cada incluir norleucina, norvalina, ornitina, homocisteína, e homosserina.

Um "fragmento de proteína" é uma molécula de polipeptídeo oupeptídeo cuja seqüência de aminoácido compreende um subgrupo da se-qüência de aminoácido daquela proteína. Uma proteína ou fragmento destaque compreende uma ou mais regiões de peptídeo adicionais não derivadasdaquela proteína é uma proteína de "fusão". Tais moléculas podem ser deri-vadas para conter carboidrato ou outras porções (tal como hemocianina delapa de buraco da fechadura). A proteína de fusão ou moléculas de peptídeoda presente invenção são preferivelmente produzidas por meios recombi-nantes.

Constructos de Planta e Transformantes de Planta

Uma ou mais dos constructos de DNA da presente invenção quecodificam para um asparagina sintetase podem ser empregadas na trans-formação ou transfecção de planta. O material genético exógeno pode sertransferido em uma célula de planta e a célula de planta regenerada em umaplanta inteira, fértil, ou estéril. O material genético exógeno é qualquer mate-rial genético, quer de ocorrência natural ou de outro modo, de qualquer fonteque seja capaz de ser inserida em qualquer organismo.

Em um outro aspecto da presente invenção, as seqüências depolinucleotídeo da presente invenção também codificam os peptídeos envol-vidos na localização, exportação, ou modificação pós-translacional intracelu-lar, por exemplo, os peptídeos de trânsito de cloroplasto.

Como usado nisto, o termo "gene" inclui uma molécula de ácidonucléico que fornece a regulação da transcrição que inclui um promotor quefunciona em plantas, moléculas 5' não transladadas, por exemplo, íntrons eseqüências líderes, uma molécula de ácido nucléico transcrito e uma molé-cula de terminação transcricional 3'.

As moléculas de ácido polinucléico que codificam um polipeptí-deo da presente invenção podem ser combinadas com outras seqüênciasheterólogas ou não nativas em uma variedade de modos. Por seqüências"heterólogas" é entendida qualquer seqüência que não seja naturalmenteencontrada unida à seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo dapresente invenção, incluindo, por exemplo, combinações de seqüências denucleotídeo da mesma planta que não são naturalmente encontradas juntas,ou as duas seqüências originam de duas espécies diferentes. O termo "ope-ravelmente unidas", como empregado em referência à disposição da funçãoe física de moléculas de polinucleotídeo reguladoras e estruturais que tor-nam a expressão regulada de uma molécula de polinucleotídeo estruturaloperavelmente ligada.

A expressão de um constructo de DNA ou transgene significa atranscrição e acumulação estável de RNA de sentido ou anti-sentido ou pro-teína derivada da molécula de polinucleotídeo da presente invenção outranslação desta. RNA de "sentido" significa transcrição de RNA que inclui omRNA e assim pode ser transladado em polipeptídeo ou proteína pela cela."RNA de anti-sentido" significa uma transcrição de RNA que é complementara toda ou parte de uma transcrição primária alvo ou mRNA e que bloqueia aexpressão de um gene alvo (Patente dos Estados Unidos 5.107.065, incor-porada aqui por referência). A complementaridade de um RNA de anti-sentido pode ser com qualquer parte da transcrição de gene específica, istoé, na seqüência de não codificação 5 ', seqüência não transladada 3', ín-trons, ou a seqüência de codificação. "Transcrição de RNA" significa o pro-duto resultante de transcrição catalisada por RNA polimerase de uma se-qüência de DNA. Quando a transcrição de RNA é uma cópia complementarperfeita da seqüência de DNA, ela é referida como a transcrição primária oupode ser uma seqüência de RNA derivada de processamento pós-transcricional da transcrição primária e é referido como o RNA maduro.

Como empregado aqui, o termo cassetes de expressão de plan-ta se refere a um constructo compreendendo as moléculas reguladoras deDNA necessárias operavelmente unidas à molécula alvo para fornecer ex-pressão em uma célula de planta.

O constructo de DNA da presente invenção pode, em uma mo-dalidade, conter um promotor que causa a superexpressao do polipeptídeoda presente invenção onde "superexpressao" significa a expressão de umpolipeptídeo ou não normalmente presente na célula hospedeira, ou presen-te na referida célula hospedeira a um nível mais elevado do que aquele nor-malmente expressado do gene endógeno codificando o referido polipeptí-deo. Os promotores que podem causar a superexpressão do polipeptídeo dapresente invenção são geralmente conhecidos na técnica, os exemplos detais que fornecem padrão de expressão constitutiva incluem promotor devírus 19S mosaico de couve-flor e promotor de vírus 35S mosaico de couve-flor (Patente dos Estados Unidos ng 5.352.605), promotor de vírus 35S mo-saico de escrofulária (Patente dos Estados Unidos n9 6.051.753), promotorde vírus em forma de bacilo de cana-de-açúcar (Patente dos Estados Unidosng 5.994.123), promotor de vírus de commelina yellow mottle (Medberry eoutros, 1992), subunidade pequena de promotor de ribulose-1,5-bisfosfatocarboxilase, promotor de triosefosfato citosólico isomerase de arroz, promo-tor de fosforibosiltransferase de adenina, promotor de actina 1 de arroz (Pa-tente dos Estados Unidos 5.641.876), promotor de ubiquitina de milho, pro-motor de manopina sintase e promotor de octopina sintase.

Tais constructos genéticos podem ser transferidos em plantasmonocotiledôneas ou dicotiledôneas incluindo, porém não limitado a alfafa,maçã, Arabidopsis, banana, Brassica campestris, óleo de colza, feijão derícino, café, milho, algodão, caroço de algodão, crisântemo, crambe, pepino,Dendrobium spp, Dioscorea spp., eucalipto, festuca, linho, gladíolo, liliacea,linhaça, milho miúdo, melão almiscarado, mostarda, aveia, dendezeiro, óleode semente de colza, amendoim, azevém perene, Phaseolus, semente decolza, arroz, sorgo, feijão-soja, centeio, tritordeum, turfgrass, trigo, açafroa,gergelim, beterraba-doce, cana-de-açúcar, oxicoco, mamão, cártamo, e gi-rassol (Christou, 1996). Em uma modalidade preferida, o material genético étransferido em uma célula de milho.

A transferência de uma molécula de polinucleotídeo que codificauma proteína pode resultar na expressão ou superexpressão daquele poli-peptídeo em uma célula transformada ou planta transgenica. Uma ou maisdas proteínas ou fragmentos destas codificadas por moléculas de polinucleo-tídeo da presente invenção podem ser superexpressadas em uma célulatransformada ou planta transformada.

Em uma modalidade, os constructos de DNA da presente inven-ção incluem uma molécula de polinucleotídeo que codifica uma seqüênciade polipeptídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs 1, 3, 5,7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17. A invenção fornece células de milhotransformadas onde, relativo a uma planta de milho não transformada semtal constructo de DNA, a célula tem um nível de asparagina realçado.

Em outra modalidade, os constructos de DNA da presente in-venção incluem uma molécula de DNA heteróloga operavelmente unida auma asparagina sintetase de milho que codifica a seqüência, por exemplo,SEQ ID NOs 1, 3, ou 5, e o constructo de DNA é transformado em célula demilho. Em uma modalidade preferida, os constructos de DNA da presenteinvenção compreendendo SEQ ID NO: 3 são fornecidas em uma célula demilho transformada, e a expressão do constructo de DNA fornece um tecidode planta de milho com asparagina aumentada ou uma semente de plantade milho com proteína aumentada relativo a uma planta de milho não trans-formada com o constructo de DNA.

Em algumas modalidades, os níveis de um ou mais produtos doAsnS podem ser aumentados em toda uma planta ou podem ser localizadosem um ou mais órgãos ou tecidos da planta específicos. Sem limitar o esco-po da presente invenção, várias seqüências promotoras são úteis para ex-pressar o gene da enzima acima. Por exemplo, milho C4 tipo promotor dePPDK (Glackin e outros, 1990), milho C4 tipo promotor de PEPC (Hudspethe Grula, 1989), promotor de subunidade pequena de arroz Rubisco (Kyozukae outros, 1993), e promotor de proteína de ligação a/b de clorofila de colheitaem luz (Sakamoto e outros, 1991), o promotor de P-FDA(US20040216189A1, a seqüência de polinucleotídeo da qual está aqui in-corporada por referência), e promotor de P-RTBV (Patente dos Estados Uni-dos 5.824.857, a seqüência de polinucleotídeo da qual está aqui incorporadapor referência). Por exemplo, os níveis de asparagina ou proteína podem seraumentados em um ou mais dos tecidos e órgãos de uma planta que incluisem limitação: raízes, tubérculos, talos, folhas, talos, fruta, bagas, nozes,cascas, casulos, sementes, e flores. Um órgão preferido é uma semente.

Com o propósito de expressão em tecidos de fonte da planta, talcomo a folha, semente, raiz, ou talo, é preferido que os promotores utilizadostenham expressão relativamente elevada nestes tecidos específicos. Ex-pressão específica de tecido de uma proteína da presente invenção é umamodalidade particularmente preferida.

Os constructos de DNA ou vetores também podem incluir, com aregião de codificação de interesse, uma seqüência de polinucleotídeo queatua, em todo ou em parte, para terminar a transcrição daquela região. Vá-rias tais seqüências foram isoladas, incluindo a região T-NOS 3' (Ingelbrechte outros, 1989; Bevan e outros, 1983). As regiões de terminação de transcri-ção reguladora podem ser fornecidas em constructos de expressão de plan-ta desta presente invenção também. As regiões de terminação de transcri-ção podem ser fornecidas pela seqüência de DNA que codifica o gene deinteresse ou uma região de terminação de transcrição conveniente derivadade uma fonte de gene diferente, por exemplo, a região de terminação detranscrição que é naturalmente associada com a região de iniciação detranscrição. O técnico versado reconhecerá que qualquer região de termina-ção de transcrição conveniente que é capaz de terminar a transcrição emuma célula de planta pode ser empregada nos constructos da presente in-venção.

Um vetor ou constructo também pode incluir elementos regula-dores, tal como íntrons. Os exemplos de tais incluem, o íntron 1 Adh (Callis eoutros, 1987), o íntron de sacarose sintase (Vasil e outros, 1989), intron dehsp70 (Patente dos Estados Unidos 5.859.347), e o elemento de ômegaTMV (Gallie e outros, 1989). Estes e outros elementos reguladores podemser incluídos quando apropriado.

Um vetor ou constructo também pode incluir um marcador sele-cionável. Os marcadores selecionáveis também podem ser empregados pa-ra selecionar quanto às plantas ou células de planta que contêm o materialgenético exógeno. Os exemplos de tais incluem, porém não estão limitados:um gene neo (Potrykus e outros, 1985), que codifica para resistência de ca-namicina e pode ser selecionado por empregar canamicina, nptll, G418, hpt,etc; um gene de barra, que codifica para resistência de bialafos; um gene deEPSP sintase mutante (Hinchee e outros, 1988; Reynaerts e outros, 1988;Jones e outros, 1987) que codifica resistência de glifosato; um gene de nitri-lase que confere resistência à bromoxinila (Stalker e outros, 1988); um genede acetolactato sintase mutante (ALS) que confere resistência à imidazolino-na ou sulfoniluréia (Patente dos Estados Unidos 4.761.373); D'Halluin e ou-tros, 1992); e um gene DHFR resistente a metotrexato (Thillet e outros,1988).

Transformação de Planta

Os métodos mais geralmente empregados para transformaçãode células de planta é o processo de transferência de DNA mediado por A-grobacterium e o processo mediado por bombardeio biolístico ou de micro-projétil (isto é, pistola de gene). Tipicamente, a transformação nuclear é de-sejada, porém se é desejável especificamente transformar os plastídeos, talcomo cloroplastos ou amiloplastos, os plastídeos de planta podem ser trans-formados utilizando uma liberação mediada por microprojétil do polinucleotí-deo desejado.

Os métodos para introduzir transgenes em plantas por transfor-mação mediada por Agrobacterium utilizam um T-DNA (DNA de transferên-cia) que incorpora os elementos genéticos do transgene e transfere esseselementos genéticos no genoma de uma planta. Geralmente, o transgene(s)limitado por uma molécula de DNA de borda direita (RB) e uma molécula deDNA de borda esquerda (LB) é transferido no genoma de planta em um úni-co lugar. A "molécula de T-DNA" se refere a uma molécula de DNA que inte-rage em um genoma de planta por um método de transformação mediadopor Agrobacterium. As extremidades da molécula de T-DNA são definidas napresente invenção como sendo flanqueadas pelas regiões de borda do T-DNA de plasmídeos de Ti de Agrobacterium. Estas regiões de borda geral-mente são referidas como as regiões de borda Direita (RB) e borda Esquer-da (LB) e existem como variações em seqüência de nucleotídeo e o compri-mento dependendo se elas são derivadas de filamentos de produção de no-palina ou octopina de Agrobacterium. As regiões de borda geralmente em-pregadas em constructos de DNA designadas para transferir transgenes emplantas são freqüentemente várias centenas de polinucleotídeos em com-primento e compreendem um sítio de corte onde uma endonuclease digere oDNA para fornecer um sítio para inserção no genoma de uma planta. As mo-léculas de T-DNA geralmente contêm um ou mais cassetes de expressão deplanta.

Com respeito ao bombardeio de microprojétil (Patentes dos Es-tados Unidos 5.550.318; 5.538.880; e 5.610.042; cada das quais especifica-mente está aqui incorporada por referência em sua totalidade), as partículassão revestidas com polinucleotídeos e liberadas em células por uma forçapropelente. As partículas exemplares incluem aquelas compreendidas detungstênio, platina, e preferivelmente, ouro. Um método útil para liberar DNAem células de planta por aceleração de partícula é o Sistema de Liberaçãode Partícula Biolístico (BioRad, Hercules, Califórnia), que pode ser empre-gado para propelir as partículas revestidas com DNA ou células através deuma tela, tal como uma tela de Nytex ou aço inoxidável, sobre uma superfí-cie de filtro coberta com células de planta monocotiledôneas cultivadas emsuspensão. As técnicas de bombardeio de microprojétil são amplamente a-plicáveis, e podem ser empregadas para transformar virtualmente qualquerespécie de planta. Os exemplos de espécies que foram transformadas porbombardeio de microprojétil incluem espécies monocotiledôneas tal comomilho (Publicação PCT WO 95/06128), cevada, trigo (Patente dos EstadosUnidos 5.563.055, incorporada aqui por referência em sua totalidade), arroz,aveia, centeio, cana-de-açúcar, e sorgo; bem como vários dicotilédones in-cluindo tabaco, soja (Patente dos estados Unidos 5.322.783, incorporadaaqui por referência em sua totalidade), girassol, amendoim, algodão, tomate,e legumes em geral (Patente dos estados Unidos 5.563.055, incorporadaaqui por referência em sua totalidade).

Para selecionar ou classificar quanto às células de planta trans-formadas independente da metodologia de transformação, o DNA introduzi-do na célula contém um gene que funciona em um tecido de planta regene-rável para produzir um composto que concede no tecido da planta resistên-cia a um composto de outro modo tóxico. Os genes de interesse para usocomo um marcador selecionável, avaliável ou classificável incluiriam, porémnão se limitariam a GUS, proteína fluorescente verde (GFP), luciferase(LUX), e genes de tolerância antibiótico ou herbicida. Os exemplos de genesde resistência antibiótica incluem aqueles concedendo resistência a canami-cina (e neomicina, G418), e bleomicina.

A regeneração, desenvolvimento, e cultivo de plantas de váriosexplantes transformados são bem documentados na técnica. Esta regenera-ção e processo de crescimento tipicamente incluem as etapas de selecionaras células transformadas e cultivar aquelas células individualizadas atravésdos estágios usuais de desenvolvimento embrionário através do estágio deplantinha arraigada. As sementes e embriões transgênicos similarmente re-generados. Os brotos arraigados transgênicos resultantes são plantadosdepois disso em um meio de crescimento de planta apropriado tal como ter-ra. As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou célulasque foram classificadas positivas em um ensaio de avaliação, podem sercultivadas em meios que suportam a regeneração de plantas. As plantinhasem desenvolvimento são transferidas para mistura de crescimento de plantacom menos terra, e endurecidas, antes da transferência para uma estufa oucâmara de crescimento para maturação.

A presente invenção pode ser empregada com qualquer célulaou tecido transformável. Por transformável como empregado aqui é signifi-cada uma célula ou tecido que seja capaz de outra propagação para dar ori-gem a uma planta. Aqueles de experiência na técnica reconhecem que vá-rias células ou tecidos de planta são transformáveis nos quais após a inser-ção de DNA exógeno e condições de cultura apropriadas, as células ou teci-dos de planta podem se formar em uma planta diferenciada. O tecido ade-quado para estes propósitos pode incluir, porém não está limitado a embri-ões imaturos, tecido scutellar, culturas de célula em suspensão, inflorescên-cia imatura, meristem de disparo, explantes nodais, tecido de calo, tecido dehipocotilédone, cotilédones, raízes, e folhas.Qualquer meio de cultura de planta adequado pode ser empre-gado. Os exemplos de meios adequados incluiriam, porém não estão limita-dos a meios com base em MS (Murashige e Skoog, 1962) ou meios combase em N6 (Chu e outros, 18:659, 1975) suplementados com reguladoresde crescimento de planta adicionais que incluem, porém não limitados a au-xinas, citocininas, ABA, e giberelinas. Aqueles de experiência na técnica es-tão familiarizados com a variedade de meios de cultura de tecido, que quan-do suplementado adequadamente, suportam o crescimento e desenvolvi-mento de tecido de planta e são adequados para transformação e regenera-ção de planta. Estes meios de cultura de tecido podem ser comprados comouma preparação comercial, ou preparados e modificados como costume.Aqueles de experiência na técnica estão atentos que os meios e suplemen-tos tal como nutrientes e reguladores de crescimento para uso na transfor-mação e regeneração e outras condições de cultura tal como intensidade deluz durante a incubação, pH, e temperaturas de incubação que podem serotimizados para a variedade particular de interesse.

Quaisquer das moléculas de polinucleotídeo da presente inven-ção podem ser introduzidas em uma célula de planta de uma maneira per-manente ou transitória em combinação com outros elementos genéticos talcomo vetores, promotores, realçadores, etc. Além disso, quaisquer das mo-léculas de polinucleotídeo da presente invenção podem ser introduzidas emuma célula de planta de uma maneira que isso permita a expressão ou su-perexpressão da proteína ou fragmento desta codificados pela molécula depolinucleotídeo.

A presente invenção também fornece partes das plantas, parti-cularmente partes reprodutivas ou de armazenamento, da presente inven-ção. As partes de planta, sem limitação, incluem semente, endosperma, óvu-lo, pólen, ou tuberculos. Em uma modalidade particularmente preferida dapresente invenção, a parte de planta é uma semente de milho. Em uma mo-dalidade a semente de milho (ou grão) é um componente de alimento animal.

Em uma modalidade preferida, o alimento de milho ou farinha demilho ou proteína da semente de milho é designado para animais de gadoou seres humanos, ou ambos. Os métodos para produzir alimento, farinha eproteína, são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, as Patentes dosEstados Unidos 4.957.748; 5.100.679; 5.219.596; 5.936.069; 6.005.076;6.146.669; e 6.156.227. Em uma modalidade preferida, a preparação de pro-teína é uma preparação de alto teor de proteína. Tal preparação de alto teorde proteína preferivelmente tem um conteúdo de proteína maior do que cer-ca de 5% (peso/volume), mais preferivelmente 10% (peso/volume), e atémesmo mais preferivelmente 15% (peso/volume).

As descrições de métodos de reprodução que são geralmenteempregadas para colheitas e características diferentes podem ser encontra-das em um dos vários livros de referência (por exemplo, Hayward, 1993; Ri-chards, 1997; Allard, 1999).

Outros Organismos

Um polinucleotídeo da presente invenção pode ser introduzidoem qualquer célula ou organismo tal como uma célula de mamífero, mamífe-ro, célula de peixe, peixe, célula de pássaro, pássaro, célula de algas, algas,célula de fungos, fungos, ou células bacterianas. Uma proteína da presenteinvenção pode ser produzida em uma célula ou organismo apropriado. Os hospedeiros e transformantes preferidos incluem: células de fungos tal comoAspergillus, leveduras, mamíferos, particularmente bovina e porcina, insetos,bactérias, e algas. As bactérias particularmente preferidas são Agrobacteri-um tumefaciens e E. coli.

Em um aspecto da presente invenção, uma ou mais das molécu-Ias de ácido nucleico da presente invenção são empregadas para determinaro nível de expressão (isto é, a concentração de mRNA em uma amostra,etc.) em uma planta (preferivelmente óleo de colza, milho, Brassica campes-tris, óleo de semente de colza, semente de colza, soja, crambe, mostarda,feijão de rícino, amendoim, gergelim, caroço de algodão, linhaça, açafroa,dendezeiro, linho ou girassol) ou padrão (isto é, os cinéticos de expressão,taxa de decomposição, perfil de estabilidade, etc.) da expressão de uma pro-teína codificada em parte ou inteira por uma ou mais das moléculas de poli-nucleotídeo da presente invenção. Vários métodos podem ser empregadospara comparar a expressão entre duas ou mais amostras de células ou teci-do. Estes métodos incluem ensaios de hibridação, tal como, ensaios de pro-teção de RNAase do norte, e hibridação in situ. Alternativamente, os méto-dos incluem ensaios tipo PCR. Em um método preferido, a expressão é ava-liada hibridizando-se polinucleotídeos das duas ou mais amostras para umadisposição de polinucleotídeos. A disposição contém uma pluralidade de se-qüências suspeitadas conhecidas ou suspeitas de estarem presentes emcélulas ou tecidos das amostras.

Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar os aspec-tos da invenção, aqueles de experiência na técnica devem, levando em con-ta a presente descrição, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nosaspectos específicos que são descritos e ainda obtêm um resultado igual ousemelhante sem afastar-se do espírito e escopo da invenção.

EXEMPLOS

Aqueles de experiência na técnica apreciarão as muitas vanta-gens dos métodos e composições fornecidos pela presente invenção. Osseguintes exemplos são incluídos para demonstrar as modalidades preferi-das da invenção. Deveria ser apreciado por aqueles de experiência na técni-ca que as técnicas descritas nos exemplos que seguem representam as téc-nicas descritas pelos inventores para funcionar bem na prática da invenção,e desse modo podem ser consideradas constituir os modos preferidos parasua prática. Entretanto, aqueles de experiência na técnica devem, levandoem conta a presente descrição, apreciar que muitas alterações podem serfeitas nas modalidades específicas que são descritas e ainda obtêm um re-sultado igual ou similar sem afastar-se do espírito e escopo da invenção.Todas as referências citadas aqui são incorporadas aqui por referência namedida em que elas suplementam, explicam, fornecem um fundamento pa-ra, ou ensinam a metodologia, técnicas, ou composições empregadas aqui.

Exemplo 1

Constructo de bibliotecas qenômicas e cDNA de planta milho e soia.

Este exemplo descreve a produção de bibliotecas de cDNA fei-tas de tecidos de planta de milho e soja dos quais as seqüências de AsnS demilho e polinucleotídeo de soja da presente invenção foram isoladas. As bi-bliotecas de cDNA foram geradas de tecido de Zea mays e Glycine max em-pregando técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, Alba, 2004. As bibli-otecas de cDNA de milho foram feitas de dois tecidos diferentes. Uma biblio-teca foi feita de caroços incipientes colhidos na fase demorada de linhagemcongênita 90DDD5. Uma segunda biblioteca de cDNA de milho foi feita detecido de seda no estágio de crescimento de seda de linha congênita de mi-lho H99 e germinação de pólen germinando de linhagem congênita de milhoM017. Paro constructo de uma biblioteca de cDNA de soja (Glycine max), otecido meristemático e parte do tecido de hipocotiledônea foram excisadosde sementes de soja secas rehidratadas de variedade A3237 (Asgrow). Osexplantes foram preparados primeiro germinando-se as sementes esteriliza-das na superfície em meios de cultura de tecido de sólido durante 6 dias a28 °C em 18 horas de luz / dia, e em seguida transferindo as sementes ger-minadas a 4°C durante pelo menos 24 horas. Para o tecido empregado napreparação de biblioteca os cotiledôneas foram removidos para enriquecerpara o tecido específico de interesse. 0,5 a 2 gramas de tecido foram em-pregados para a preparação de RNA total e poli A+ RNA. Para todas as bi-bliotecas de cDNA, os tecidos, de planta foram colhidos e imediatamentecongelados em nitrogênio líquido. O tecido colhido foi armazenado a -80°Caté a preparação de RNA total. O RNA total foi purificado empregando rea-gente Trizol de Invitrogen Corporation (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Ca-lifórnia, E.U.A.), essencialmente como recomendado pelo fabricante. Poli A+RNA (mRNA) foi purificado empregando contas de oligo dT magnéticas es-sencialmente como recomendado pelo fabricante (Dynabeads, Dynal Biote-ch, Oslo, Noruega).

O constructo de bibliotecas de cDNA de planta é bem conhecidana técnica e várias estratégias de clonagem existem. Vários kits de construc-to de biblioteca de cDNA são comercialmente disponíveis. As bibliotecas decDNA eram preparadas empregando o Sistema de Plasmídeo Superscript®para síntese de cDNA e Clonagem de Plasmídeo (Invitrogen Corporation),como descrito no protocolo de síntese de biblioteca de cDNA de SobrescritoII. As bibliotecas de cDNA foram verificadas para confirmar uma relação deinserção:vetor apropriada.

Uma biblioteca de DNA genômico foi construída empregandoDNA genômico isolado de Zea mays empregando um protocolo de isolamen-to de DNA genômico modificado descrito abaixo (Dellaporta e outros, 1983).As mudas de milho foram crescidas em solo ou em placas Petri, foram colhi-das, e mantidas congeladas em nitrogênio líquido até extração. O tecido foimoído para um pó fino empregando um almofariz e pilão ao mesmo tempoem que mantendo o tecido congelado com nitrogênio líquido. O tecido em pófoi transferido para um liqüidificador de Waring que contém 200 ml_ de tam-pão de extração de DNA frio (0°C) (350 mM de sorbitol; 100 mM de Tris; 5mM de EDTA; pH a 7,5 com HCI; bissulfito de sódio, 3,8 mg/mL) que foi adi-cionado exatamente antes do uso, e homogeneizado em alta velocidade du-rante 30-60 segundos. O homogeneizado foi filtrado através de uma camadade tecido de algodão e coletado em uma garrafa centrífuga. As amostrasforam então centrifugadas a 2500xg durante 20 minutos, e o sobrenadante equalquer material verde solto, foi descartado. O pélete foi então ressuspensoem 1,25 mL de tampão de extração de DNA e transferido para um tubo depolipropileno de 50 mL. O tampão de lise de núcleos (1,75 mL contendo 200mM de Tris; 50 mM de EDTA; 2 M de NaCI; 2,0% (peso/volume) de CTAB;pH ajustado a 7,5 com HCI) foi então adicionado, seguido por adição de 0,6mL de 5% (peso/volume) de sarcosila. Os tubos foram suavemente mistura-dos, e as amostras foram incubadas a 65°C durante 20 minutos. Um volumeigual de clorofórmio:álcool de isoamila (24:1) foi adicionado e os tubos foramnovamente suavemente misturados. Os tubos foram então centrifugados a2500xg durante 15 minutos, e o sobrenadante resultante foi transferido paraum tubo limpo. Um volume igual de isopropanol resfriado em gelo foi derra-mado sobre a amostra, e a amostra foi invertida várias vezes até que umprecipitado se formasse. O precipitado foi removido da solução empregandouma pipeta de vidro e o álcool residual removido permitindo-se o precipitadosecar em ar durante 2-5 minutos. O precipitado era ressuspenso em 400 uLde tampão TE (10mM de Tris-HCI, 1 mM de EDTA, pH ajustado para 8,0).

Exemplo 2

Isolamento de seqüências de polinucleotídeo de AsnS por ligação indepen-dente e métodos de clonagem de Gateway e transformação de milho.

Este exemplo ilustra o isolamento de moléculas de polinucleotí-deo que codificam AsnS empregando a ligação independente e métodos declonagem de Gateway® e a construção de constructos de DNA da presenteinvenção que compreende as moléculas de polinucleotídeo que codificam ospolipeptídeos de AsnS isolados de várias plantas e fontes de microorganis-mos como descrito na Tabela 1. As moléculas promotoras empregadas paradirecionar a expressão das moléculas de polinucleotídeo de codificação deAsnS unidas é o promotor de actina 1 de arroz, P-Os.Act1 (Patente dos Es-tados Unidos n9 5.641.876, aqui incorporada por referência); o PPDK de Zeamays (Matsuoka e outros, 1993), P-RTBV-1 (Patente dos Estados Unidos5.824.857, aqui incorporada por referência), e o P-Zm.NAS (molécula pro-motora da região genômica que codifica para um polipeptídeo de nicotiana-mina sintase 2 de milho).

Tabela 1. Fonte de seqüência de codificação de AsnS, promotor e construc-tos de DNA

<table>table see original document page 26</column></row><table> A clonagem independente de ligação foi desenvolvida para clo-nar os produtos de PCR e com base no anelamento de extremidades de fi-lamento único não palindrômicas. LIC é um método de clonagem eficiente,que não está limitado por sítios de restrição ou pela necessidade de reaçõesde ligação ou digestão de enzima de restrição e deixa junções sem costura

(Aslanidis e de Jong, 1990).

Os segmentos de DNA de filamento único terminais são produ-zidos no vetor através do uso de uma "endonuclease de corte" e endonucle-ase de restrição. Uma endonuclease de corte é uma endonuclease que cortaum filamento do dúplex de polinucleotídeo para criar filas de filamento únicono vetor de clonagem. O vetor é primeiro linearizado com uma endonucleasede restrição padrão. Isto é seguido então por digestão com uma endonucle-ase de corte. Após tratamento térmico, segmentos de DNA de filamento úni-co terminais são produzidos no vetor. Um conteúdo de GC de asperamente55% é recomendado para amplificação de PCR a jusante e anelamento efi-ciente. O promotor, rótulo, ou outro elemento de seqüência, podem ser adi-cionados às extremidades de 5' e 3' do produto amplificado por PCR paracriar um constructo linear que pode ser empregada em aplicações a jusante.

O pMON92870 de constructo de DNA foi montado do vetor debase, pMON82060, e uma molécula de polinucleotídeo de AsnS3 de milhoque codifica um polipeptídeo de AsnS fornecido como SEQ ID NO 5. OpMON82060 de cadeia principal de plasmídeo foi linearizado empregando aendonuclease de restrição, Hpal. A cadeia principal de plasmídeo foi entãotratada com a endonuclease de corte, N.BbvC IA (New England Biolabs, Be-verly, MA). Após a digestão, a reação foi aquecida a 65°C. Isto faz com queos filamentos cortados de DNA se desassociem dos seus filamentos de DNAcomplementares. A cadeia principal de plasmídeo linearizada resultante foideixada com dois segmentos de DNA de filamento único terminais disponí-veis para montagem.

A reação em cadeia de polimerase foi empregada para produziros segmentos de DNA de filamento único terminais no AsnS de codificaçãode molécula de DNA. A seqüência de polinucleotídeo de AsnS3 de milho(SEQ ID NO: 5) codificando o polipeptídeo de AsnS foi empregada para odesígnio do iniciador de PCR dianteiro (SEQ ID NO: 48) e do iniciador dePCR reverso (SEQ ID NO: 49):

SEQ ID NO:48: GCAGTCGCTGTCGTTACCCGGCATCATGTGTGGCATCSEQ ID NO:49: GCGAGTACCGCTGGGTTCTAACGTACTCTCGTCA-GACCGCG

A amplificação de reação em cadeia de polimerase foi realizadaempregando a polimerase térmica de alta fidelidade, a polimerase de DNAde começo quente KOD (Novagen, Madison, Wl). A reação em cadeia depolimerase foi realizada em um volume de 25 uL contendo, 1X de tampão depolimerase de DNA de começo quente de KOD, 1M de betaína (Sigma, St.,Louis, MO), 1 mM de MgS04, 250 uM de dNTPs, 5 pmols de cada iniciador e1 unidade de polimerase de DNA de começo quente de KOD. A reação emcadeia de polimerase foi realizada em uma circulador térmico PTC-225 DNAEngine Tetrad™ (MJ Researcho Inc., Waltham, MA) empregando os seguin-tes parâmetros do circulador:

1. 94°C durante 2 minutos

2. 94°C durante 15 segundos

3. 70°C durante 30 segundos (-1 °C por ciclo)

4. 72°C durante 5 minutos

5. Ir para a etapa 2, 9 vezes,

6. 94°C durante 15 segundos

7. 60°C durante 30 segundos

8. 72°C durante 5 minutos

9. Ir para a etapa 6, 24 vezes,

10. 72°C durante 10 minutos

11. 10°C mantido

12. fim

Uma segunda rodada de reação em cadeia de polimerase foirealizada para introduzir os resíduos de uridina na região onde os segmen-tos de DNA de filamento único terminais foram produzidos. Muitas polimera-ses de DNA são incapazes de ler os resíduos de uridina no filamento modelode DNA ou são incapazes de polimerizar os filamentos empregando os resí-duos de uridina. A reação em cadeia de polimerase foi, portanto realizadaempregando uma enzima capaz de incorporar e ler as uridinas (Expand HighFidelity® mais PCR System; Roche, Indianapolis, IN). A modificação destemétodo e uso de outros métodos que fornecem o resultado esperado é co-nhecido por aqueles versados na técnica.

O constructo de DNA montado foi transformado em células com-petentes de E. coli DH10B ElectroMAX® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Umaalíquota de 0,5uL (microlitro) da reação de montagem foi misturada com 20uL de células competentes DH10B ElectroMAX® em gelo e carregada emuma cubeta de eletroporação de 0,2 mm MicroPulser (Bio-Rad LaboratoriesInc., Hercules CA) para eletroporação. As células foram submetidas a ele-troporação em 1,8 kV empregando um Eletroporador 165-2100 MicroPulser(Bio-Rad Laboratories Inc.). As células eletroporadas foram incubadas em180 uL de meio SOC (Invitrogen Inc.) a 37°C durante 1 hora. As células fo-ram então semeadas em placas ágar LB chapeia contendo espectinomicina(75 mg/L) e desenvolvidas durante a noite a 37°C. As colônias foram sele-cionadas e crescidas durante a noite em meio LB a 37°C. O constructo deDNA de plasmídeo foi isolado empregando o kit QIAprep® Spin Miniprep(QIAgen Science, Valencia, CA). O seqüenciamento de DNA foi realizadoem um Analisador de DNA ABI 3730x1, empregando terminador BigDye®(Applied Biosystems, Foster City, CA).

A clonagem de AsnS2 de milho, AsnS de soja, e AsnS1 de fer-mento seqüências de polinucleotídeo de codificação de AsnS foi concluídaempregando o "método de clonagem Gateway®" como descrito pelo fabri-cante (Invitrogen Corp.). O objetivo do método de clonagem Gateway® éfazer um clone de expressão. Este processo de duas etapas envolve primei-ro, a clonagem do gene de interesse em um vetor de entrada, seguido porsubclonagem do gene de interesse do vetor de entrada em um vetor de des-tino para produzir um vetor de expressão. A tecnologia de clonagem é combase no sistema de recombinação de sítio específico empregado por fagolambda para integrar seu DNA no cromossoma de E. coli.

Os constructos de DNA para uso em clonagem de recombinaçãosubseqüente, duas seqüências de recombinação de attR ou attB foram clo-nados em um vetor recombinante que flanqueia um gene de resistência deepectinomicina/Etreptomicina (SPC/STR) e uma seqüência de polinucléotí-deo de codificação de AsnS. As seqüências de polinucleotídeo de codifica-ção de AsnS foram isoladas de bibliotecas genômicas ou de cDNA feitas dassuas respectivas espécies empregando as seqüências iniciadoras primáriase secundárias (SEQ ID NOs 20-43). As seqüências contíguas af/B1/R1, ge-ne de SPC/STR, gene de AsnS, e seqüências de af/B2/R2 foram movidascomo uma única molécula de polinucleotídeo a um constructo recombinantepara a expressão em células de planta, os plasmídeos de DNA de filamentoduplo designados pMON79706 (AsnS1 de Zea mays), pMON79700 (AsnSde Glycine max) ou pMON79653 (AsnS de Saccharomyces cerevisiaé). Es-tes constructos de DNA compreendem as regiões da borda direita de Agro-bacterium (O-OTH. - RB) e regiões da borda esquerda (LB), e outras descri-tas por Herrera-Estrella e outros, 1983; Bevan, 1984; Klee e outros, 1985, opromotor e35S (P-CAMV.35S, realçador duplicado em série Patente dos Es-tados Unidos 5.322.938), o elemento genético afB1/R1 (0-Lam.aHB1/R1), ogene de SPC/STR, a região de codificação de AsnS respectiva (CR), o ele-mento genético de a«B2/R2 (0-Lam.ar/B2/R2), o terminador de inibidor II deprotease de batata (St.Pis), o promotor de NOS de Agrobacterium (P-AGRtu.. nos, Fraley e outros, 1983), a borda esquerda de Agrobacterium (O-OTH. - LB), o gene de resistência de canamicina (CR-OTH. - Kan, Patentedos Estados Unidos 6.255.560), e a origem de E. coli de replication(Ec.ori.ColE).

Os constructos de DNA foram ampliados em células de LibraryEfficiency® DB3.1™ (Invitrogen Corporation) sob seleção de cloranfenicol(25 ug/mL) e seleção de canamicina (50 ng/mL) para pMON79706,pMON79700 ou pMON79653. O DNA de vetor foi purificado a partir de cultu-ras bacterianas empregando-se um kit de Plasmídeo QIAGEN (QIAGENInc.).

DNA para pMON79700, pMON79706, e pMON79653 foi introdu-zido nos embriões de milho como descrito na Patente US NQ 5.015.580, em-pregando-se o dispositivo de liberação de gene de aceleração de partículade descarga elétrica. Para bombardeio de microprojetil de embriões imaturospré-cultivados de LH59, 35% a 45% de voltagem máxima foi preferivelmenteempregada. Seguindo o bombardeio de microprojetil, o tecido de milho foicultivado no escuro a 27°C. Métodos de transformação e materiais para pre-parar plantas transgênicas desta invenção, por exemplo, vários meios e cé-lulas alvo de recipiente, transformação de embriões imaturos e regeneraçãosubseqüente de plantas transgênicas férteis são descritos nas Patentes U.S.6.194.636 e 6.232.526 e Publicação de Pedido de Patente U.S.20040216189, que estão incorporados aqui por referência.

Plantas de milho transgênicas férteis foram produzidas a partirde células de milho transformadas cultivando-se calo transformado nos mei-os de regeneração apropriados para iniciar o desenvolvimento do broto eformação de plantinha. As plantinhas foram transferidas para o solo quandoelas estavam com o talo em torno de 7,62 cm e possuíam raízes (cerca dequatro a 6 semanas depois da transferência para o meio). As plantas forammantidas durante duas semanas em uma câmara de crescimento a 26°C,seguido por duas semanas em uma bancada de névoa em uma estufa. Asplantas foram subseqüentemente transplantadas em potes de 18,93 litros (5galões) e cultivadas até a maturidade na estufa. Polinizações recíprocas fo-ram feitas com a linhagem congênita de LH59 de milho. Semente foi coleta-da a partir de plantas de milho e empregada para análise de proteína e ou-tras atividades de procriação.

Exemplo 3

Construção de vetor e transformação de milho com seqüências de polinucle-otídeo dé AsnS

O AsnS2 de milho (SEQ ID NO: 3, pMON79706, FIG. 1) foi am-pliado por uso de PCR (reação em cadeia de polimerase). As condições dereação para a reação de PCR seguiram o protocolo do fabricante (PE Appli-ed Biossistems, Foster City, CA). Aproximadamente 100 ng de DNA de mi-lho, preparado como descrito acima, foram ampliados empregando-se 30nmols cada qual do iniciador dianteiro (f) (SEC ID NO: 32) e iniciador reverso(r) (SEQ ID NO: 33) e 10 micromols cada de dATP, dCTP, dGTP e TTP, 2,5unidades de TaKaRaLA Taq em 1X de Tampão de LA PCR II (Takara BioINC, Shiga, o Japan). Depois da incubação inicial a 94°C durante 1 minuto,35 ciclos de PCR foram realizados a 94°C durante 45 segundos, seguido porrecozimento a 60°C durante 45 segundos, 72°C durante 1 minuto e 15 se-gundos, seguido, por 1 ciclo de 72°C durante 7 minutos.Cinco constructos de DNA de AsnS2 foram feitos. O primeiroconstructo de AsnS2'de milho foi feita isolando-se um fragmento de AsnS2de 1821 pares de base de pMON79706 por PCR, como descrito acima, se-guido por digestão de restrição com enzimas de restrição de Xbal e EcoRI.O gene de AsnS2 resultante foi ligado em pMON61560, que foi da mesmaforma digerido por Xbal e EcoRI. O vetor de transporte (pMON66246) foidigerido por Notl e a inserção contendo o gene de AsnS2, em ligação operá-vel com o promotor de PPDK e terminador de RGLUT1, foi ligada empMON30167, que foi da mesma forma digerida por Notl. O plasmídeopMON30167, que contém o gene de EPSPS, fornece seleção com glifosato.

O plasmídeo final resultante foi designado pMON66230 (FIG. 3).

Um segundo constructo de AsnS2 foi feito empregando-se o ge-ne de AsnS2 anteriormente mencionado (pMON79706). O constructo foi feitopor inserção do gene AsnS2 digerido por Xbal/EcoRI em pMON61562, queda mesma forma foi digerido por Xbal e EcoRI, resultando no gene AsnS2sendo em ligação operável com o promotor de NAS e o terminador de R-GLUT1. O plasmídeo resultante foi digerido por Notl e ligado no pMON30167digerido por Notl. O plasmídeo resultante foi designado pMON66229 (FIG.2).

Um terceiro constructo de AsnS2 foi feito empregando-se o geneAsnS2 anteriormente mencionado (pMON79706). O promotor de P-FDA em-pregado neste constructo foi isolado a partir de pMON78810 por digestãocom enzimas de restrição de Notl e Xbal. O promotor de P-FDA foi em se-guida ligado em pMON66246, que foi previamente digerido por Notl e Xbalpara remover seu promotor de PPDK. O plasmídeo resultante foi digeridopor Notl e ligado no pMON30167 digerido por Notl. O plasmídeo resultantefoi designado pMON66231 (FIG. 4).

Um quarto constructo de AsnS2 foi feito empregando-se o geneAsnS2 anteriormente mencionado (pMON79706). O promotor de P-RTBV aser empregado neste constructo foi gerado por PCR de pMON74576. Ofragmento de 721 bp foi digerido por Notl e Xbal e ligado em pMON66246,que previamente foi digerido por Notl e Xbal. O plasmídeo resultante, con-tendo o gene AsnS2 em ligação operável com o promotor de P-RTBV e ter-minador de RGLUT1 foi digerido por Notl e ligado no pMON30167 digeridopor Notl. O plasmídeo resultante foi designado pMON66239 (FIG. 5).

Um quinto constructo de AsnS2 foi feito empregando-se o geneAsnS2 anteriormente mencionado (pMON79706). Um par de iniciador deZmASsense,

5TCCTAGACATGTCCGGCATACTTGCTG3' (SEQ ID NO:46) e ZmASanti-sense,

5TGCAGAATTCTATCCCTCGATGG; (SEQ ID NO:47),foi empregado para ampliar AsnS2 de milho de pMON66240. A organizaçãode PCR foi como segue: em um volume total de 50 ul de reação de PCR, 1uJ de 10 mM de cada iniciador de ZmASsense e ZmASantisense, 0,2 a 0,5u.g (1 uJ) de DNA de plasmídeo de pMON66240, 5 u.l de Mistura de Reaçãode 10X AccuPrime® Pfx, 1 de DNA Polimerase ACCuPrime® Pfx (Invitro-gen), e 41 uJ de água destilada. A reação de PCR foi realizada com os se-guintes parâmetros de ciclo: 94°C durante 1 minuto, seguido por 30 ciclos de94°C durante 15 segundos para desnaturação; 58°C durante 15 segundosde recozimento, e 68°C durante 4 minutos; seguido por 10 minutos de ex-tensão a 68°C. O produto de PCR foi purificado empregando-se um kit depurificação de PCR de QIAGEN (QIAGEN Inc.). Uma alíquota do produto deAsnS2 de milho de PCR foi digerida com enzima de restrição de Ncol e E-coRI e outra alíquota do produto de PCR foi digerida com Afllll e Ncol. Ofragmento de Ncol e EcoRI foi em seguida clonado em sítios de Ncol e Eco-Rl de pMON94901. O fragmento de extremidade 5' de Afllll e Ncol de AsnS2de milho foi clonado no Ncol e EcoRI do fragmento de AsnS2 de milho nosítio de Ncol. O plasmídeo resultante (pMON74940), contendo AsnS2 demilho em ligação operável com o promotor de e35S e o terminador deHsp17, foi digerido por Notl e ligado em pMON53616 digerido por Notl paraconstruir pMON74946.

Cado constructo descrito acima continha um cassete de expres-são para expressão de um EPSPS Tipo II insensível a glifosato como ummeio para selecionar eventos transgênicos (Patente U.S. 5.633.435). A se-qüência de ácido nucléico de cado constructo foi determinada empregando-se metodologia padrão como mencionado por terminador v.3.0 PE AppliedBiossistems (PE Applied Biossistems, Foster City, CA) e a integridade dasjunções de cloneagem confirmada. Os vetores pMON66229, pMON66230,pMON66231, pMON66239, e pMON74946 foram empregados na transfor-mação subseqüente de células de milho e regeneração destas células emplantas de milho intactas. Os constructos de interesse foram introduzidas emembriões imaturos de linhagem de milho LH244 por um método de transfor-mação mediado por Agrobacterium, por exemplo, como descrito no Pedidode Patente Publicado U.S. 20050048624.

Exemplo 4

Análise de proteína e aminoácido de amostras de semente de milho.

Este exemplo apresenta um método de análise de proteína eaminoácido para selecionar semente da presente invenção com proteína easparagina aumentada empregando-se HPLC e medidas de infravermelhopróximas. Para análise de proteína de semente, amostras de volume peque-nas consistindo em 50 - 100 sementes para cada tratamento foram medidasempregando-se espectroscopia de transmitância de infravermelho próxima(Infratec modelo 1221, Tecator, Hoganas Sweden). Este procedimento foibaseado na observação que uma relação linear existe entre a absorção deradiação infravermelha próxima e a quantidade de componentes químicoscompreendida em uma amostra de semente típica. Antes de analisar amos-tras desconhecidas, dados espectrais foram coletados com amostras de ca-libre que foram subseqüentemente analisadas empregando-se uma técnicade análise primária. A técnica primária empregada foi combustão de nitrogê-nio (Murray e Williams, 1987). Um modelo multivariado foi desenvolvido em-pregando-se os dados espectrais do espectrometro e os dados primários. Nopresente caso, um modelo multivariado PLS 1 (Partial Least Squares Re-gression Type I) foi construído empregando-se 152 amostras de calibre. Ca-da amostra desconhecida foi varrida no espectrometro pelo menos cincovezes e seu teor de proteína pré-dito com cada varredura. Cada tempo quea amostra foi varrida, foi adicionado outra vez a cubeta de amostra para for-necer uma representação exata da amostra testada. Os valores de proteínapré-ditos foram calculados para as varreduras múltiplas e em seguida relata-dos para cada amostra.

Análise de aminoácido livre foi realizada em tecidos de milho porHPLC. Para cada amostra, 20 - 50 mg de tecido de liofilizado foi extraídocom 1,5 ml_ de 10% de ácido tricloroacético em tubos de micrófogo de 2 ml_.

Amostras foram extraídas em temperatura ambiente durante a noite comagitação suave. Amostras extraídas foram clareadas por centrifugação e osobrenadante foi removido durante outra análise. Análise de aminoácido livrefoi realizada por HPLC em uma HPLC Agilent Serie 1100 com um detectorde fluorescência e autoamostrador de placa de 96 cavidades equipado comuma coluna Zorbax Eclipse AAA C18 (4,6 x 75 mm, 3,5 mícrons, Agilent Te-chnologies, Paio Alto, CA) e coluna protetora analítica Zorbax Eclipse AAA(4,6 x 12,5 mm, 5 mícrons). Amostras foram pré-derivatizadas com o-ftalaldeído imediatamente antes da separação. Aminoácidos livres foramresolvidos com um tampão de fosfato de 40 mM, pH 7,6 / gradiente de Me-tanol/Acetonitrilo seguido por detecção de fluorescência a 340 nm / 450 nm(excitação / emissão). Aminoácidos livres foram quantificados com base empadrões de aminoácido externos e picos foram integrados com softwareChemStation (Agilent). Desvios padrão relativos foram tipicamente menoresdo que 8%.

Exemplo 5

Avaliação de campo de níveis de asparaqina e teor de proteína de grão emplantas de milho transqênicas.

Este exemplo apresenta os resultados de uma avaliação decampo dos efeitos do constructo de AsnS de milho (pMON79706 epMON92870) em asparagina e níveis de proteína em semente e plantas demilho transformadas; e os efeitos dos constructos de AsnS de milho(pMON79700 e pMON79653) sobre o teor de proteína de grão. A concentra-ção relativa de asparagina livre em tecidos de milho foi obtida a partir de li-nhagens inatas derivadas de plantas de milho R0 transformadas compMON79706 ou pMON92870. Para pMON79706, transformantes de R0 fo-ram cruzados reversivelmente ao inato origem, LH59, para criar semente deBCi. A semente de BCi que segrega com o transgene, foi plantada em umasementeira de campo e plantas individuais foram marcadas quanto à pre-sença do gene marcador de NPTII. O tecido da folha foi coletado para análi-se de aminoácido livre de plantas positivas de transgene e negativas detransgene para cada evento transgênico para análise de aminoácido livre.

Aminoácidos livres de folha de plantas transgênicas de pMON79706 foramcomparados às plantas de isolina negativa dentro de cada evento e analisa-dos estatisticamente pelo teste T de Student com o software JMP 5.1 (SASInstitute, Cary, NC). Para pMON92870, transformantes de R0 foram cruza-dos reversivelmente ao inato de origem, LH244, para criar semente de BCi.

A semente de BC1 foi plantada em uma sementeira de campo e autopolini-zada para criar a semente de BC-iSl que subseqüentemente foi plantada emuma segunda sementeira congênita. Plantas positivas de transgene foramidentificadas para cada evento transgênico seguindo marcação quanto àpresença do gene marcador de NPTII. Tecido de folha foi coletado a partirde plantas de BC1S1 positivas de transgene e lotes inatos parentais planta-dos em intervalos regulares na sementeira. Aminoácidos livres de folha parapMON92870 foram analisados estatisticamente realizando-se análise de va-riação e comparando entradas transgênicas ao controle parenteral condu-zindo-se teste T Student empregando-se software SAS 9.1. Para análises deaminoácido livre para ambos os constructos, tecido de folha foi coletado porremoção de uma folha totalmente expandida superior em um ântese seguidopor congelamento em gelo seco. Amostras de folha foram moídas congela-das, liofilizadas, e medidas quanto ao teor de aminoácido livre por HPLC.

Eventos transgênicos múltiplos de pMON79706 e pMON92870foram observados para mostrar aumentos significativos no teor de asparagi-na na folha (Tabela 2). Quatro de sete eventos de pMON79706 testadosmostraram aumentos significantes na concentração de asparagina na folha,como indicado por um valor de p de 0,05 ou menor. Em eventos transgêni-cos de pMON92870, expressando um segundo gene de asparagina sinteta-se de milho, quatro de cinco eventos mostraram aumentos significantes emníveis de asparagina na folha (Tabela 2). Estes dados mostram que expres-são transgênica de AsnS2 de milho e AsnS3 de milho sob promotor de acti-na de arroz em pMON79706 e pMON92870, respectivamente, pode resultarem um aumento específico em asparagina livre, que é consistente com asuperexpressão de asparagina sintetase ativa.

A concentração relativa de proteína em semente de milho foiobtida a partir de linhagens inatas derivadas a partir de plantas de milho Rotransformadas com pMON79706 ou pMON92870. Plantas transgênicas deBCi de pMON79706 (descritas acima) foram autopolinizadas e o grão deBC1S1 resultante foi cultivado até a maturidade e medido quanto ao teor deproteína por espigas únicas. Proteína foi medida como uma porcentagem empeso seco a 0% de umidade. Proteína de grão para plantas transgênicas depMON79706 foi comparada para plantas de isolina negativas dentro de cadaevento e estatisticamente analisadas pelo teste T de Student com softwareSAS 9.1. Para pMON98270, plantas de BC1S1 foram autopolinizadas e culti-vadas até a maturidade e medidas quanto ao teor de proteína por únicasespigas. Proteína de grão para pMON92870 foi estatisticamente analisadacom um método espacial desenvolvido de costume conduzindo-se uma aná-lise por localização. A análise por localização é um processo de duas eta-pas. A primeira etapa na análise envolveu estimar a autocorrelaçao espacialno campo ajustando-se um modelo de semivariograma esférico anisotrópicoempregando-se todos os lotes de teste espaciais que foram colocados sis-tematicamente no campo (cada 6Q lote). O segundo estágio de análise en-volveu ajustar os valores das entradas transgênicas para a variabilidade es-pacial empregando-se a estrutura de autocorrelaçao espacial estimada noprimeiro estágio da análise. Seguindo o ajuste para autocorrelaçao espacial,comparação média foi realizada onde o valor médio de uma entrada trans-gênica foi comparado ao controle parental para testar a significação estatís-tica da diferença entre um transgene e a média de controle.

Eventos múltiplos de ambos pMON79706 e pMON92870 mostra-ram aumentos significantes no teor de proteína de grão inato (Tabela 3).Três de cinco eventos de pMON79706 que foram estatisticamente analisa-dos mostraram aumentos significantes no teor de proteína de grão (p < 0,05)e dois outros eventos mostraram tendências para aumentos significantes (p< 0,15). Dois eventos não devolveram números suficientes de espigas parauma análise estatística. Três de quatro eventos transgênicos depMON92870 mostraram aumentos significantes em teor de proteína de grão(p < 0,1), com um evento não testado devido aos números insuficientes deespigas para análise. Estes dados confirmam que pMON79706 epMON92870 produzem eventos transgênicos que aumentam teor de proteí-na de grão no milho além do teor de asparagina na folha crescente.

Tabela 2. Concentrações de asparagina na folha relativas em milho inatotransformado com gene AsnS2 de milho (pMON79706) ou gene AsnS3 demilho (PMON92870).

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a Asparagina na folha foi determinada em duas experiências separadas parapMON79706 e pMON92870.

b Asparagina livre relativa medida como uma porcentagem de aminoácidoslivres totais no tecido da folhaTabela 3. Teor de proteína de grão no milho inato transformado com geneAsnS2 de milho (pMON79706) ou gene AsnS3 de milho (pMON92870).

<table>table see original document page 39</column></row><table>

a Proteína de grão foi determinada em duas experiências separadas parapMON79706 e pMON92870.

b Proteína de grão medida como uma porcentagem de composição de grãototal em uma base de umidade a 0%.

c nd; não determinado.

A asparagina elevada e fenótipo de proteína de grãopMON79706 foram confirmados em tecidos múltiplos em uma segunda ex-periência. Depois da geração de Bd, cinco eventos de pMON79706 foramautopolinizados em duas sementeiras seguintes para gerar a semente deBdS3 que foi homozigota para o transgene. A concentração relativa de as-paragina que é o resultado da expressão do constructo de pMON79706 foideterminada em um estudo no estágio de crescimento V8 do milho compa-rando-se as plantas BdS3 homozigotas e um controle de variedade de mi-lho LH59 (Tabela 4). Controles e entradas transgênicos foram plantados emum projeto de bloco completo aleatorizado com 5 blocos reproduzidos emum lote de campo. As folhas completamente expandidas superiores e se-ções de caule de duas plantas foram experimentadas e agrupadas, coloca-das em gelo seco, moídas, liofilizadas, e medidas quanto ao teor de aminoá-cido livre por HPLC. Os valores seguidos por " * " indicam uma diferençasignificante do controle de LH59 (teste de uma cauda de Dunnett; (SAS 9.1,Cary, NC). Medidas de asparagina tiradas tanto no estágio de crescimentoV8 quanto na geração de Ri mostraram que plantas de cinco eventos depMON79706 tiveram aumentos significantes em asparagina livre. Níveis deasparagina livre relativos em tecido de folha de V8 foram aumentados até13,9% quando comparados a 3,4% no controle de variedade de LH59, e as-paragina no talo foi aumentada até 39% quando comparada a 9,6 no contro-le (Tabela 4). Para análise de proteína de grão, 10 espigas foram experimen-tadas por lote, debulhadas e analisadas quanto a concentração de proteínade grão. Proteína de grão também foi aumentada significativamente nos cin-co eventos de pMON79706 (Tabela 4). Os resultados mostram que, comouma tendência geral, eventos que produzem um aumento significante emasparagina também produzido como aumento significante na proteína dasemente (Tabelas 2 a 4).

Tabela 4. Concentrações de asparagina relativas em estágio de crescimentoV8 e concentração de proteína de grão na maturidade em plantas de milhoBC1S3 transformadas com o gene AsnS2 de milho (pMON79706).

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* Significante em p<0,05

Aumentos significantes na proteína de grão híbrido foram obser-vados por três constructos diferentes que expressam genes de asparaginasintetase sob o promotor de actina de arroz. Linhagens de milho inatas ho-mozigotas foram produzidas de eventos transgênicos de R0 de pMON79706(AsnS2 de milho), pMON79700 (AsnS de soja), e pMON79653 (AsnS1 delevedura) primeiro por cruzamento reversível de eventos de Ro à origem re-petida, LH59, seguido por autopolinizações de seleções positivas de trans-gene em duas sementeiras inatas subseqüentes empregando-se o marcadorselecionável de NPTII para marcar quanto a zigosidade. Os eventos homo-zigotos para cado constructo foram, em seguida, empregados como um do-ador de pólen macho em um cruzamento com uma linhagem inata fêmeapara criar o híbrido de Fi. A semente híbrida de Fi foi plantada em uma ex-periência de múltiplas localizações e eventos transgênicos para cado cons-tructo foram analisados quanto a proteína de grão final e comparados aocontrole híbrido de origem repetida periódica seguindo uma análise de cor-reção espacial com base na proteína de grão em híbridos de controle queforam plantados em intervalos regulares ao longo do campo. O grão foi co-Ihido de cada lote, debulhado e analisado quanto ao teor de proteína. Osdados foram analisados empregando um método espacial desenvolvido decostume conduzindo-se uma análise por localização e uma de localizaçãoem cruz. A análise por localização é um processo de duas etapas. A primeiraetapa na análise envolveu estimar a autocorrelação espacial no campo ajus-tando-se um modelo de semivariograma esférico anisotrópico empregando-se todos os lotes de teste espaciais que foram colocados sistematicamenteno campo (cada 3g lote). O segundo estágio de análise envolveu ajustar osvalores das entradas transgênicas para a variabilidade espacial empregan-do-se a estrutura de autocorrelação espacial estimada no primeiro estágioda análise. Seguindo o ajuste para autocorrelação espacial em cada locali-zação separadamente, uma análise de localização em cruz foi conduzidaonde o valor médio de uma entrada transgenica foi extraída comparado aocontrole parental para testar a significação estatística (P=0,20) da diferençaentre um transgene e o meio de controle. Todos os cinco eventos depMON79706 mostraram aumentos significantes em proteína de grão na ex-periência híbrida, consistente com a observação que a proteína de grão foiaumentada nas linhagens inatas de eventos transgênicos desto constructo(Tabela 5). Dois outros constructos de asparagina sintetase, pMON79700(AsnS de soja) e pMON79653 (AsnS de levedura), também mostraram au-mentos significantes em níveis de proteína de grão em dois de cinco eventose dois de dois eventos, respectivamente.

Tabela 5. Teor de proteína de grão em milho híbrido transformado com ge-nes para asparagina sintetase de milho (Zea mavs), soja (Glycine max), elevedura (Saccharomyces cerevisiaeY.

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a Proteína de grão medida como uma porcentagem de composição de grãototal em uma base de umidade a 0%.

Exemplo 6

Avaliação de campo da expressão de transqene e atividade de enzima deasparagina sintetase devido à pMON79706 e pMON92870

Expressão de transgene foi confirmada em eventos transgênicosde pMON79706 e pMON92870. Para pMON79706, tecido empregado para adeterminação do teor de asparagina na folha na experiência de campo comlinhagens inatas homozigotas de BC1S3 foi, da mesma forma, empregadopara determinação da expressão de transgene com base na medida da ex-pressão da seqüência de terminador 3' (St.Pis4) de pMON79706 em ântese.Duas amostras de folha foram colhidas e agrupadas de cada dentre 5 lotesde réplica (10 para controle inato) e congeladas em gelo seco. Amostras defolha foram, em seguida, moídas congeladas para análise de expressão.

Para extração de RNA, 50 mg de tecido congelado foram aliquotadas emplacas de 96 cavidades. Cada amostra foi extraída com 500 \i\ de tampão delise contendo uma solução de 1:1 de solução de lise de ácido nucléico deABI (Applied Biosystems, Foster City, CA) para 1X de PBS ph 7,4 (sem MgCIou CaCI). RNA foi extraído de amostras de tecido congeladas frescas em-pregando-se placas de filtro para capturar ácidos nucléico de lisados crus, e50 (J.I de tampão de eluição de ABI foram empregados para eluir RNA ligado.PCR quantitativa foi realizada empregando-se um padrão de RNA com 5 (llIcom 5 jllí de reagente de RT-PCR de uma etapa de ABI. As reações foramrealizadas durante 40 ciclos de PCR em um instrumento de PCR ABI Taq-man 7900, com parâmetros de ciclagem de 48°C durante 30 minutos, 95°Cdurante 10 minutos, 95°C durante 10 segundos, 60°C durante 1 minuto. Me-didas fluorescentes foram tiradas de cada cavidade em cada dentre os 40ciclos igualmente para a seqüência de terminator derivada do inibidor de pro-tease de batata II (St.Pis4) e o controle endógeno (ubiquitina). Um subgrupode amostras foi conduzido sem transcriptase reversa para monitorar a con-taminação de DNA. As amostras foram marcadas quanto a expressão relati-va subtraindo-se os valores limiares de ciclo para St.Pis4 do valor limiar deciclo do controle endógeno. O limiar de ciclo (Ct) foi determinado, e o Ct dedelta foi calculado de St.Pis4 menos o valor de controle endógeno. Um tiposilvestre in situ foi criado calculando-se os sinais de controle endógeno mé-dio e fixando-se o valor de sinal de St.Pis4 em 40. O Ct de delta das amos-tras desconhecidas foi subtraído do Ct de delta do tipo silvestre in situ. Da-dos finais foi relatado como expressão de pinll (St.Pis4) relativos ao tipo sil-vestre. Análise de RT-PCR quantitativa confirmou a superexpressão dotransgene de seis de seis eventos de pMON79706 (FIG. 6).

Expressão de transgene também foi confirmada em eventos ina-tos que compreendem pMON92870. Expressão de RNA foi determinada dotecido de folha em ântese de plantas inatas cultivadas em uma sementeirade campo colhendo-se primeiro uma folha expandida superior de cada plan-ta (4-8 plantas por evento) e congelando-se em gelo seco. Plantas positivasde transgene foram previamente identificadas com base na presença do ge-ne marcador de NPTII. Tecido de folha foi moído enquanto congelado, eanalisado quanto a expressão da seqüência de terminador 3' (St.Pis4) depMON92870. Análise de RT-PCR quantitativa mostrou que cinco de seiseventos que compreendem pMON92870 mostraram expressão de transgeneaumentada quando comparados a um controle inato (FIG. 7). A baixa ex-pressão de RNA no evento de pMON92870 ZM_M103316 é consistente como baixo teor de asparagina na folha e teor de proteína de grão neste evento.

O efeito de expressão de genes de asparagina sintetase sobre aatividade de asparagina sintetase foi medido em eventos transgênicos depMON79706 e pMON92870. Tecido de folha moído, congelado foi aliquota-do (200 - 400 mg) em cavidades de uma placa de 96 cavidades profundaspré-resfriadas. Proteína foi extraída em Tampão A (100 mM de Hepes-OH,pH 8,0, 0,1 mM de EDTA, 10 mM de MgCI2, 2 mM de aspartato, 0,5 mM deDTT, 67 mM de mercaptoetanol, 20% (v/v) de glicerol, 0,1 mM de ATP, 1%(v/v) de P9599 (Sigma Company), 25 mM de KCI). Uma quantidade pequenade areia foi adicionada a cada cavidade. Tampão A foi, em seguida, adicio-nado ao tecido da folha nas cavidades em uma relação de 4:1 (tam-pão:tecido). As placas foram, em seguida, agitados em um agitador de pintu-ra durante 2 minutos para misturar a amostra e, em seguida, centrifugadasem 5000 x g durante 10 minutos. O sobrenadante (100 - 200 (iL) foi dessali-nizado em uma placa macro giratória de 96 cavidades (SNS S025L, TheNest Group Inc., Southboro, MA) equilibrada em tampão A. O sobrenadantefoi, em seguida, analisado imediatamente ou congelado em nitrogênio líqui-do e mantido a -80°C até empregado. Para analisar a atividade de asparagi-na sintetase, extratos de proteína dessalinizados (10-50 ui.) foram adiciona-dos às cavidades contendo 100 de solução de ensaio (100 mM de He-pes, pH 8,0, 10 mM de MgCI2, 2 mM de aspartato, 5 mM de DTT, 10 mM deATP, 1 mM de ácido amino(oxi)acético (inibidor de aspartato amino transfe-rase), 1 mM de semialdeído aspártico (inibidor de asparaginase). Paracomeçar a reação, glutamina (concentração final de 2 mM para ensaio pa-drão) foi adicionada à solução, que foi em seguida misturada. A mistura deensaio foi, em seguida, incubada durante 1 a 2 horas. A reação foi, em se-guida, interrompida pela adição de um volume igual de 20% (p/v) de ácidotricloroacético. A mistura foi, em seguida, filtrada para remover o precipitadoe asparagina foi medido por HPLC. Tamanho da amostra foi aumentado de0,5 U.L para 2,5 \iL para HPLC, comprimento de onda de excitação foi redu-zido de 340 nm para 235 nm, e o ganho de fluorímetro foi aumentado de 10para 13. Isto resulta em uma sensibilidade de detecção de 0,5 para 100 \Mde asparagina e permite a medida de níveis de atividade nos 100s microuni-dades.

Para pMON79706, tecido empregado para a determinação daatividade de enzima de asparagina sintetase na folha foi de uma experiênciade campo com linhagens inatas homozigotas de BC1S3 colhidas no estágiode crescimento de V7. Eventos de pMON79706 foram mostrados para exibiratividade de asparagina sintetase de folha aumentada (Tabela 6). A ativida-de de asparagina sintetase foi aumentada até 5 vezes sobre o controle devariedade inata. Atividade de enzima de asparagina sintetase também foideterminada para eventos transgenicos de pMON92870 em uma sementeirade campo inato no momento de ântese. Quatro de cinco eventos depMON92870 também mostraram atividade de enzima aumentada (Tabela 6).

A atividade de enzima de asparagina sintetase aumentada em plantas demilho que expressam o AsnS2 de milho (pMON79706) ou AsnS3 de milho(pMON92870) sob o promotor de actina de arroz é consistente com o au-mento na expressão de gene e aumentos de asparagina de folha observa-dos com estes constructos.Tabela 6. Atividade de asparagina sintetase em linhagens inatas de eventostransoênicos de pMON79706 e pMON92870a

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a Atividades de enzima para pMON79706 e pMON92870 foram determina-das a partir de duas experiências de campo diferentes.

Exemplo 7

Avaliação de campo dos efeitos de pMON66231, PMON66239, epMON74946 sobre asparagina e teor de proteína de grão

O teor relativo de asparagina livre em tecidos de milho foi obtidode linhagens híbridas derivadas de plantas de milho de R0 (base de LH244)transformadas com pMON66231 (FIG. 4), onde AsnS2 de milho está sob ocontrole do promotor de FDA de milho. Híbridos foram feitos cruzando asplantas de R0 à linhagem inata masculina LH59, que cria uma população deF-i segregadora (1:1). A semente Fi resultante foi plantada em três localiza-ções do meio-oeste com duas replicações em cada localização. Lotes forampulverizados com glifosato no estágio de crescimento V3 para eliminar se-gregantes nulos. Um controle híbrido foi semeado no perímetro e compara-ções foram feitas ao controle híbrido. Folhas superiores foram coletadas eagrupadas de três plantas dentro de cada lote no momento de ântese, duashoras depois do pôr-do-sol, em todos as três localizações. As folhas foramcolocadas imediatamente sobre gelo seco e, em seguida, armazenadas a -80°C até o processo. As folhas foram moídas congeladas, e uma porção foiliofilizada para análise de aminoácido livre por HPLC. Os dados foram pri-meiro avaliados quanto aos valores discrepantes com o método de duaspassagens para resíduos estudados deletados empregando-se valores de pajustados por Bonferroni. Valores discrepantes foram identificados e removi-dos do grupo de dados antes que a análise dos cálculos de variação discre-pância fosse iniciada. Os dados foram analisados de acordo com projeto debloco completo aleatorizado de localizações em cruz. Combinações de cons-tructo-evento foram modeladas com efeitos fixos, e as localizações e repsdentro de localizações foram modelados com efeitos aleatórios. Compara-ções de tratamento foram feitas realizando-se contrastes dos meios de mí-nimos quadrados das combinações de constructo-evento. Asparagina defolha relativa foi aumentada significativamente em 11 de 12 eventos depMON66231, com níveis de asparagina tão altos quanto 16% quando com-parados a 3% no controle (Tabela 7). Proteína de grão madura foi da mesmaforma medida depois da colheita de 10 espigas por lote seguido por debu-Ihamento e agrupamento da semente para cada lote, que foi em seguidamedido quanto ao teor de proteína de grão. Nove de 12 eventos foram en-contrados para significativamente aumentar o teor de proteína no grão ma-duro sobre o controle híbrido de LH244/LH59.

Tabela 7. Asparagina na folha relativa e teor de proteína de grão maduro emeventos transgênicos de pMON66231.

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a Asparagina livre relativa medida como uma porcentagem de aminoácidoslivres totais no tecido da folha

bComparado ao controle híbrido.

O teor relativo de asparagina livre em tecidos de milho foi obtidode linhagens híbridas derivadas de plantas de milho de Ro (base de LH244)transformadas com pMON66239 e pMON74946, onde AsnS2 de milho estásob o controle do promotor de RTBV ou e35S, respectivamente. Híbridosforam feitos cruzando-se as plantas de R0 à linhagem inata masculina, LH59,que cria uma população de F<[ segregadora (1:1). A semente de Fi resultantefoi plantada em uma localização no Havaí com três replicações para cadaevento transgênico. Os lotes foram pulverizados com glifosato no estágio decrescimento V3 para eliminar os segregantes nulos. Um controle híbrido quenecessita de-gene de AsnS2 de milho foi incluído para comparação. Folhassuperiores foram coletadas e agrupadas de três plantas dentro de cada lotena hora de ântese, duas horas depois de pôr-do-sol. As folhas foram coloca-das imediatamente sobre gelo seco e, em seguida, armazenadas a -80°Caté o processo. As folhas foram moídas congeladas, e uma porção foi liofili-zada para análise de aminoácido livre por HPLC. Os dados foram primeiroavaliados quanto aos valores discrepantes com o método de duas passa-gens para resíduos estudados deletados empregando-se valores de p ajus-tados por Bonferroni. Valores discrepantes foram identificados e removidosdo grupo de dados antes que a análise de cálculos de variação fosse inicia-da. Os dados foram analisados de acordo com um projeto de bloco completoaleatorizado. Combinações de constructo-evento foram modeladas com efei-tos fixos, e reps foram modelados com efeitos aleatórios. Comparações detratamento foram feitos realizando-se contrastes dos meios de mínimos qua-drados das combinações de constructo-evento. Asparagina na folha relativafoi aumentada significativamente em 10 de 13 eventos de pMON74946, comníveis de asparagina tão altos quanto 16% quando comparados a 2% nocontrole (Tabela 8). Proteína de grão maduro também foi medida depois dacolheita de todas as espigas por lote seguida por debulhamento e agrupa-mento da semente para cada lote, que foi em seguida medida quanto ao teorde proteína de grão e analisada estatisticamente quanto à característica deasparagina na folha. Dez de treze eventos foram encontrados para possuirteor de proteína significativamente aumentado no grão maduro quando com-parado ao controle híbrido, e os mesmos 10 eventos com asparagina na fo-lha aumentada também mostraram proteína aumentada na experiência dehíbrido. Para eventos transgênicos de pMON66239, 11 de 15 eventos mos-traram aumentos no teor de asparagina na folha, e 3 de 15 eventos mostra-ram aumentos significantes na proteína de grão no nível alfa de 0,05, embo-ra cinco eventos transgênicos adicionais mostraram proteína aumentada emp < 0,15, indicando que a expressão de AsnS2 de milho sob o promotor deRTBV (pMON66239) pode aumentar o teor de asparagina na folha e teor deproteína de semente, mas em uma extensão menor que sob o promotor dee35s (pMON74946) (Tabela 8).

Tabela 8. Asparaqina na folha relativa e teor de proteína de grão maduro emPMON74946 e eventos transgênicos de PMON66239.

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a Asparagina livre relativa medida como uma porcentagem de aminoácidoslivres totais no tecido da folha

bComparado ao controle híbrido.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patente estão aquiincorporados por referência a mesma extensão como se cada publicaçãoindividual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente in-dicado para ser incorporado por referência.

REFERÊNCIAS

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<170> Patentln versão 3.3

<210> 1

<211> 1869<212> DNA<213> Zea mays

<400> 1

atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagacc gcgggatatc 60

acaagtttgt acaaaaaagc aggctcctgc aggaccatgt gcggcafccct cgctgtcctc 120

ggcgtcgctg aggtctccct cgccaagcgc tcccgcabca ttgagctctc gcgcaggtta 180

cggcaccgag ggcctgattg gagtggtttg cactgtcatg aggattgtta ccttgcacac 240

cagcggttgg ctattatcga tcctacatct ggagaccagc ctttgtacaa tgaggataaa 300

acagttgttg taacggtgaa cggagagatc tataaccatg aagaattgaa agctaagttg 360

aaaactcatg agttccaaac tggcagtgat tgtgaagtta tagcccatct ttacgaagaa 420

tatggcgaag aatttgtgga tatgttggab ggaatgttct cctttgttct tcttgataca 480

cgtgataaaa gcttcatcgc agctcgtgat gctattggca tctgcccttt atacatggga 540

tggggtcttg atggatcagt otggttttct tcagagatga aggcattgag tgatgattgt 600

gaacgcttca taacatttcc cccagggcat ctctactcca gcaagacagg tggtctaagg 660

agatggtaca acccaccatg gttttcagag acggtccctt caacccctta caatgctctc 720

ttcctccggg agatgtttga gaaggctgtt attaagaggc tgatgactga tgtgccattt 780ggtgtgcttt tatctggtgg actcgactct tctttggttg catctgttgc ttcgcggcac 840ttaaacgaaa caaaggttga caggcagtgg ggaaataaat tgcatacttt ctgtataggc 900ttgaagggtt ctcctgatct taaagctgct agagaagttg ctgattacct cagcactgta 960catcatgagt tccacttcac agtgcaggag ggcattgatg ccttggaaga agtcatctac 1020catattgaga catatgatgt tacaacaatc agagcaagta ccocaatgtt tttgatgtca 1080cgcaaaatca aatctttggg tgtgaagatg gttatttctg gcgaaggttc agatgaaatt 1140tttggtggtt acctttattt tcacaaggca ccaaacaaga aagaattcca tgaggaaaca 1200tgtcggaaga taaaagcact acatctgtat gactgcttga gagctaacaa agcaacttct 1260gcctggggtg ttgaggctcg tgttccattc cttgacaaaa gtttcatcag tgtagcaatg 1320gacattgatc ctgaatggaa gatgataaaa cgtgacctcg gtcgaattga gaaatgggtt 1380atccgtaatg catttgatga tgatgagagg ccctatttac ctaagcacat tctctacagg 1440caaaaggaac agttcagtga tggtgttggg tatagttgga tcgatggatt gaaggaccat 1500gccagccaac atgtctccga ttccatgatg atgaatgctg gctttgttta cccagagaac 1560acacccacaa caaaagaagg gtactactac agaatgatat tcgagaaatt ctttcccaag 1620cctgcagcaa ggtcaactgt tcctggaggt cctagtgtgg cctgcagcac tgccaaagct 1680gttgaatggg acgcatcctg gtccaagaac cttgatcctt ctggccgtgc tgctttgggt 1740gttcacgatg ctgcgtatga agacactgca gggaaaactc ctgcctctgc tgatcctgtc 1800tcagacaagg gccttcgtcc agctattggc gaaagcctag ggacacccgt tgctfccagcc 1860acagctgtc 1869<210> 2<211> 623<212> PRT<213> Zea mays

<400> 2

Met lie Cys Asp Lys Cys Ser Leu Vai Arg Ser Phe Phe Vai Gly Arg

15 10 15

Pro Arg Asp lie Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Ser 'Cys Arg Thr

20 25 30

Met Cys Gly lie Leu Ala Vai Leu Gly Vai Ala Glu Vai Ser Leu Ala

35 40 45

Lys Arg Ser Arg lie lie -Glu Leu Ser Arg Arg Leu Arg His Arg Gly50 55 60P-ro Asp Trp Ser65

Gln Arg Leu Ala

Asn Glu Asp Lys100

His Glu Glu Leu115

Ser Asp Cys Glu130

Phe Vai Asp Met145

Arg Asp Lys Ser

Leu Tyr Met Gly180

Met Lys Ala Leu195

Gly His Leu Tyr210

Pro Pro Trp Phe225

Phe Leu Arg Glu

Asp Vai Pro Phe260

Vai Ala Ser Vai275

Gln Trp Gly Asn290

Pro Asp Leu Lys305

Gly Leu His Cys70

lie lie Asp Pro85

Thr Vai Vai Vai

Lys Ala Lys Leu120

Vai lie Ala His135

Leu Asp Gly Met150

Phe lie Ala Ala165

Trp Gly Leu Asp

Ser Asp Asp Cys200

Ser Ser Lys Thr215

Ser Glu Thr Vai230

Met Phe Glu Lys245

Gly Vai Leu Leu

Ala Ser Arg His280

Lys Leu His Thr295

Ala Ala Arg Glu310

54

His Glu Asp Cys75

Thr Ser Gly Asp90

Thr Vai Asn Gly105

Lys Thr His Glu

Leu Tyr Glu Glu140

Phe Ser Phe Vai155

Arg Asp Ala lie170

Gly Ser Vai Trp185

Glu Arg Phe lie

Gly -Gly Leu Arg220

Pro Ser Thr Pro235

Ala Vai lie Lys250

Ser Gly Gly Leu265

Leu Asn Glu Thr

Phe Cys lie Gly300

Vai Ala Asp Tyr315

Tyr Leu Ala His80

Gln Pro Leu Tyr95

Glu lie Tyr Asn110

Phe Gln Thr Gly125

Tyr Gly Glu Glu

Leu Leu Asp Thr160

Gly lie Cys Pro175

Phe Ser Ser Glu190

Thr Phe Pro Pro205

Arg Trp Tyr Asn

Tyr Asn Ala Leu240

Arg Leu Met Thr255

Asp Ser Ser Leu270

Lys Vai Asp Arg285

Leu Lys Gly Ser

Leu Ser Thr Vai320His His Glu Phe His Phe Thr Vai Gln Glu Gly lie Asp Ala Leu Glu

325 330 335

Glu Vai lie Tyr His lie Glu Thr Tyr Asp Vai Thr Thr lie Arg Ala

340 345 3S0

Ser Thr Pro Met Phe Leu Met Ser Arg Lys lie Lys Ser Leu Gly Vai

355 360 365

Lys Met Vai lie Ser Gly Glu Gly Ser Asp Glu lie Phe Gly Gly Tyr

370 375 380

Leu Tyr Phe His Lys Ala Pro Asn Lys Lys Glu Phe His Glu Glu Thr385 390 395 400

Cys Arg Lys lie Lys Ala Leu His Leu Tyr Asp Cys Leu Arg Ala Asn

405 410 415

Lys Ala Thr Ser Ala Trp Gly Vai Glu Ala Arg Vai Pro Phe Leu Asp

420 425 430

Lys Ser Phe lie Ser Vai Ala Met Asp lie Asp Pro Glu Trp Lys Met

435 440 445

lie Lys Arg Asp Leu Gly Arg lie Glu Lys Trp Vai lie Arg Asn Ala

450 455 460

Phe Asp Asp Asp Glu Arg Pro Tyr Leu Pro Lys His lie Leu Tyr Arg465 470 475 480

Gln Lys Glu Gln Phe Ser Asp Gly Vai Gly Tyr Ser Trp lie Asp Gly

485 490 495

Leu Lys Asp His Ala Ser «Gln His Vai Ser Asp Ser Met Met Met Asn

500 505 510

Ala Gly Phe Vai Tyr Pro Glu Asn Thr Pro Thr Thr Lys Glu Gly Tyr

515 520 525

Tyr Tyr Arg Met lie Phe Glu Lys Phe Phe Pro Lys Pro Ala Ala Arg

530 535 540

Ser Thr Vai Pro Gly Gly Pro Ser Vai Ala Cys Ser Thr Ala Lys Ala545 550 555 560

Vai "Glu Trp Asp Ala Ser Trp Ser Lys Asn Leu Asp Pro Ser Gly Arg565 570 575Ala Ala Leu Gly Vai His Asp Ala Ala Tyr Glu Asp Thr Ala Gly Lys

560 585 590

Thr Pro Ala Ser Ala Asp Pro Vai Ser Asp Lys Gly Leu Arg Pro Ala

595 600 605

lie Gly Glu Ser Leu Gly Thr Pro Vai Ala Ser Ala Thr Ala Vai

610 615 620

<210> 3<211> 1818<212> DNA<213> Zea mays

<400> 3

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<400> 4

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15 10 15

Ser Ser Lys Arg Ser Arg Vai Leu Glu Leu Ser Arg Arg Leu Lys His

20 25 30

Arg Gly Pro Asp Trp Ser Gly Leu Arg Gln Vai Gly Asp Cys Tyr Leu

35 40 45

Ser His Gln Arg Leu Ala lie lie Asp Pro Ala Ser Gly Asp <3ln Pro

50 55 60

Leu Tyr Asn Glu Asp Gln Ser Vai Vai Vai Ala Vai Asn Gly Glu lie65 70 75 80

Tyr Asn His Leu Asp Leu Arg Ser Arg Leu Ala Gly Ala <31y His Ser

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Leu Leu Asp Thr Arg His -Gly Asp Arg Ala Gly Ser Ser Phe Phe MetAla Ala Arg Asp145

Vai Asp Gly Ser

Glu Cys Glu His180

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Asp Asp Asp Glu210

Leu Ala Leu Arg225

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Leu Vai Ala Thr260

Arg Arg Trp Gly275

Ser Pro Asp Leu290

Leu His His Glu305

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Ala Ser Thr Pro340

Vai Lys Met Vai355

Tyr Leu Tyr Phe370

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135

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Vai Trp lie Ser165

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Phe Ser Arg Trp200

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Vai Ala Vai Arg

Thr Lys Leu His280

Lys Ala Ala Arg295

Phe His Phe Thr310

Tyr His Thr Glu325

Met Phe Leu Met

lie Ser Gly Glu360

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58

140

Thr Pro Leu Tyr155

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Tyr Asn Pro Pro

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Leu Ser Gly Gly250

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Gly Ser Asp Glu

Asn Lys Glu Glu380

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lie Gly Trp Gly160

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Leu Tyr Ser Ser190

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Pro Tyr Asp Pro

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Leu Asp Ser Ser255

Thr Glu Ala Ala270

Gly Leu Glu Gly285

Tyr Leu Gly Thr

lie Asp Ala lie320

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Lys Ser Leu Gly350

Leu Phe Gly Gly365

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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Gly Leu Lys Ala His Ala Thr Ser Asn Vai Thr Asp Lys Met Leu Ser

485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

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565 570 575

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580 585 590

Arg Thr lie Arg Vai Ala Pro Pro Gly Vai Ala lie Glu Gly

595 600 605

<210> 5<211> 1764<212> DNA<213> Zea mays

<400> 5atgtgtggca tcttagccgt gctcggttgc tccgactggt ctcaggcaaa gagggctcgc 60atcctcgcct gctccagaag gttgaagcac aggggccccg actggtcggg cctttaccag 120cacgagggca acttcctggc gcagcagcgg ctcgccgtcg tctccccgct gtccggcgac 180cagccgctgt tcaacgagga ccgcaccgtc gtggtggtgg ccaatggaga gatctacaac 240cacaagaacg tccggaagca gttcaccggc acacacaact tcagcacggg cagtgactgc 300gaggtcatca tgcccctgta cgagaagtac ggcgagaact tcgtggacat gctggacggg 360gtgttcgcgt tcgtgctcta cgacacccgc gacaggacct acgtggcggc gcgcgacgcc 420atcggcgtca acccgctcta catcggctgg ggcagtgacg gttccgtctg gatcgcgtcc 480gagatgaagg cgctgaacga ggactgcgtg cgcttcgaga tcttcccgcc gggccacctc 540tactccagcg ccggcggcgg gttccggcgg tggtacaccc cgcactggtt ccaggagcag 600gtgccccgga cgccgtacca gccgctcgtc ctcagagagg ccttcgagaa ggcggtcatc 660aagaggctca tgactgacgt cccgttcggg gtcctcctct ccggcggcct cgactcctcg 720ctagtcgcct ccgtcaccaa gcgccacctc gtcgagaccg aggccgccga gaagttcggc 780accgagctcc actcctttgt cgtcggcctc gagggctccc ctgacctgaa ggccgcacga 840gaggtcgctg actacctcgg aaccatccat cacgagttcc acttcaccgt acaggacggc 900atcgacgcga tcgaggaggt gatctaccac gacgagacgt acgacgtgac gacgatccgg 960gccagcacgc ccatgttcct gatggctcgc aagatcaagt cgctgggcgt gaagatggtg 1020ctgtccgggg agggctccga cgagctcctg ggcggctacc tctacttcca cttcgccccc 1080aacaaggagg agttccacag ggagacctgc cgcaaggtga aagccctgca ccagtacgac 1140tgcctgcgcg ccaacaaggc cacgtcggcg tggggcctgg aggtccgcgt gccgttcctc 1200gacaaggagt tcatcaacgt cgccatgggc atggaccccg aatggaaaat gtacgacaag 1260aacctgggcc gcatcgagaa gtgggtcatg aggaaggcgt tcgacgacga cgagcaccct 1320tacctgocca agcatattct ctac-cggcag aaagaacagt tcagtgacgg cgttggctac 1380aactggatcg atggccttaa atccttcact gaacagcagg tgacggatga gatgatgaac 1440aacgccgccc agatgttocc ctacaacacg cccgtcaaca aggaggccta ctactaccgg 1500atgatattcg agaggctctt -ccctcaggac tcggcgaggg agacggtgcc gtggggcccg 1560agcat-cgcct -gcagcacgcc cgcggccatc gagtgggtgg agcagtggaa ggcctccaac 1620gacccctccg gccgcttcat ctcctcccac gactccgccg ccaccgacca caccggcggt 1680aagccggcgg tggccaacgg cggcggccac ggcgcggcga acggcacggt caacggcaag 1740gacgtcgcag tcgcgatcgc ggtc 1764<210> 6<211> 588<212> PRT<213> Zea mays

<400> 6

Met Cys Gly lie Leu Ala Vai Leu Gly Cys Ser Asp Trp Ser Gln Ala

15 1-0 15

Lys Arg Ala Arg lie Leu Ala Cys Ser Arg Arg Leu Lys His Arg Gly

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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230

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Lys Ala Ala Arg280

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Leu Ser Gly Glu

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62

235

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240

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Leu Leu Gly Gly350

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Vai Pro Phe Leu400

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500 505 510

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530 535 540

Arg Phe lie Ser Ser His Asp Ser Ala Ala Thr Asp His Thr Gly Gly545 550 555 560

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565 570 575

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<210> 7<211> 1743<212> DNA<213> Glicina max

<400> 7

atgtgtggta ttcttgctgt tcttggttgt tctgatgact ctcgagccaa aagggtccgc 60gtgcttgagc tctctcgcag attgaagcac cgtggccctg actggagtgg gctccatcaa 120catggtgact gctttttggc acatcaacgg ttagccatag ttgatcctgc ttctggggat 180caacctctct ttaacgagga caaatccgtc attgttacgg taaatggaga gatttacaac 240catgaagagc tcaggaaaca gctgcctaat cacaactfccc gaactggaag tgattgtgat 3-00gttattgcac acctgtacga ggaacatgga gaagactttg tggacatgct ggatggtatc 360ttctcatttg tfcctactgga cacccgtgac aacagtttta tagtggctcg ggatgctatt 420ggggtcactt ccttgtacat tggatggggg ttagatggct ctgtttggat ttcatcagaa 480atgaaaggcc tgaatgatga ttgtgaacac tttgagtgtt ttocacctgg tcacttgtac 540tctagcaaag aaagagggtt ccgcagatgg tacaatcctc cttggttctc tgaggctatt 600ccatctgccc cttatgatcc t-cttgttt-ta agacacgcct ttgagcaggc agtcataaaa 660aggt-tgatga ctgatgtgcc ttttggtgtt ctactctctg gaggtttgga ctcttctttg 720gttgcatcca tcacttcbcg ttacttggcc aacacaaagg ctgctgagca gtggggatca 780aagttacatt cattctgtgt aggccttgag ggctcaccag atttgaaggc tgcaaaagag 840gttgctgact atctaggcac tgtccaccat gagtttacct tcactgttca ggatggaata 900gatgccattg aagatgttat ctaccatatt gaaacatatg atgtgactac aattagagca 960agcacaccta tgtttctcat gtctcggaag attaaatcac t-tggtgtcaa atgggtta-fcc 1O20tcaggagaag gatctgatga gatcttt-gga gggtatttgt acttccacaa -ggcacccaac 1080aaggaggagt tccacagaga aacatgccgc aagatcaaag cacttcacca atatgattgc 1140ttgcgagcca ataaatcaac atttgcttgg ggtctagaag cccgtgtacc atttttggac 12O0aaggcgttta tcaatgctgc aatgagtatt gaccctgagt ggaagatgat aaaaagagat 1260gaaggacgaa ttgagaagtg gattctgagg agagcctttg atgatgaaga gcatccttat 1320ctgccaaagc acattttata caggcagaaa gaacaattca gtgatggagt tggctatagt 1380tggattgatg gccttaaggc ccatgctgca aaacatgtga ctgaaaaaat gatgcttaat 1440gctggtaaca tttaccccca caacacccca aaaaccaagg aagcatatta ctacagaatg 1500atctttgaga ggttcttccc tcagaactca gctaggctca ctgttcctgg aggagcaagt 1560gttgcatgta gcacagccaa agctgttgag tgggatgctg cttggtctaa caaccttgat 1620ccctctggta gagcagcact tggagtgcac atttcagcct atgaaaacca gaacaacaag 1680ggtgtagaaa ttgagaagat aatacctatg gatgctgctc cccttggtgt tgccatccag 1740ggc 1743<210> 8<211> 581<212> PRT<213> Glicina max

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

Gln Arg Leu Ala lie Vai Asp Pro Ala Ser Gly Asp Gln Pro Leu Phe

S0 55 60

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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325 330 335

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Leu Tyr Phe His Lys Ala Pro Asn Lys Glu Glu Phe His Arg Glu Thr

355 360 365

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370 375 380

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405 410 415

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420 425 430

Phe Asp Asp Glu Glu His Pro Tyr Leu Pro Lys His lie Leu Tyr Arg

435 440 445

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450 455 460

Leu Lys Ala His Ala Ala Lys His Vai Thr Glu Lys Met Met Leu Asn465 470 475 480

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485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

Ala Ala Leu Gly Vai His lie Ser Ala Tyr Glu Asn Gln Asn Asn Lys545 550 555 560

Gly Vai Glu lie Glu Lys lie lie Pro Met Asp Ala Ala Pro Leu Gly

565 570 575

Vai Ala lie Gln Gly580

<210> 9<211> 1785<212> DNA

<213> Xylella fastidiosa

<400> 9

atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagacc gcgggatatc 60acaagtttgt acaaaaaagc aggctcctgc aggaccatgt gttccatttt tggaatcttc 120aacctgcaac ccagtgacaa cctacagata ctgcgtcacc aagcattgga gtgctcgcaa 180cggcaacggc atcgcggacc cgattggagc ggcgtttacg ttgatgtggg tgcgattctg 240gtgcacgaac gtcttgctat cgttgatcca gctggcggtg cccagccact gctctccgag 300gatggcaccc tggcgttggc ggtcaacggc gaaatctata accacgctgt actcaaagga 360acattgcagc agccctatgc gttccaaact cattctgatt gcgaagtgat taatgcgctt 420taccgcgaag aaactccaac ctcgtttctg aatcgcttaa atgggatttt tgcattcgta 480ttatgggaca agactaccgg acgtggcctc atcgcacgcg atccaatggg tgtggtgccg 540ctgtactggg ggcacgatca ggacggtcgc ttacgtgtcg cgtcagagat gaaagcattg 600gttgagcatt gctccgacgt tgcacaattc ccacccggcc attggtacga caccacaacg 660ggcacgctgg tgaagtatta cgaacgcccc tggaaaaact attctgcagt ggaaggagtg 720caggtctcac tacaggaact gcgtgaagcg tt-cgagcggg ccgtccatcg tcaactcatg 780acagatgttc catacggtgt actgctttct ggtggattgg attcttccct ggtggctgcg 840gtggccgcac gctacgcacg ccatcgcatc gaaaccaatg atcagagcga agcatggtgg 900ccacgtctgc actcatttgc gattggactg aaagactcgc cagatttgag tgcggcgaac 960gtggctgctg aggcgttgaa taccgtccac catcgtttcg agtacacctt ccaggagggg 1020ctggatgttc tacctgaagt gattcgtcac attgaaactt acgatgtcac gacgattcgc 1080gcatctacac caatgttcct gctggcacgt cgcattaagg cgatgggagt gaagatggtc 1140ttgtcaggtg aaggtagcga tgaaattttt ggcggttacc tgtacttcca caaagcgccg 1200aacgcacgcg agttccacga agaattggtc cgtaagctca acgccctgta ttactacgac 1260tgcttgcgcg ccaacaaagc gatgatggcg tggggtgtcg agccgcgcgt gccgtttttg 1320gaccgtgaat ttctcgatgt ggctatgcgg atggatgctc agcataagat ggtcgacaag 1380accagcaacg gcccacaacg gatggagaaa ggcatcctgc gtgcagcgtt tgacggctat 1440ttgccgccat caatcctgtg gcgacagaag gagcagttca gt-gatggtgt tggctacggt 1500tggatcgacg gactgaaagc acacgctgaa acgcaagtgt ctgaccatgc gctggcaact 1560gccgagacac gtttccaggt gaatcctccc cagaccaaag aagcctatta ctaccgcagc 1620atatttgagc gcttcttccc aagcccggcg gcggctgaga cggtaccggg cggtaaatca 1680attgcctgtt cctcaccggc ggcgattgcc tgggatgcca gcttcgccac aatggctgac 1740

ccatccggtc gtgcagtcag cggggttcat caacaagcac tgctg 1785<210> 10<211> 1779<212> DNA

<213> Xanthomonas campestris

<400> 10

atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagacc gcggaocggt 60

cgcgcctcag cagtcgctgt cgttaccatg tgttccatct tcggtatctt cggcctgcaa 120

cccggcgacg acctgcaggc cctgcgccgg caggccctgg aatgttcgca gcggcaacgc 180

catcgcgggc cggactggag cggcgtgtac gtcgatgccg gtgccatcct ggtgcacgag 240

cgcctggcca tcgtcgaccc ggcgggcggt tcgcagccgc tgttgtcgga ggacggcagc 300

ctggcgttgg cagtcaacgg cgagatctat aaccatcgcg aactcaaggc cgagctactg 360

cagccgtacg cttttcagac cggctcggac tgcgaagtga tcaacgcgct gtaccgcgaa 420

gatgcgccgg cctcctatct caaccgcctc aatggcàtct tcgcctttgc gttgtgggac 480

aaggccgcgg ggcgggtgat catcgcgcgc gacccgattg gcgtggtgcc gttgtactgg 540

ggacacgacc gcgaaggccg tctgcgcgtg gcgtccgaac tcaagtcgct ggtggacgat 600

tgcgccgatg ctgcgcagtt tccgcctggt cattggtacg acagcgccac cggcgcattg 660

agccgctact acgagcgctc gtggcgcgaa tacagcgaag tggaaaatgt gcaggtgccg 720

ctgcaggaac tgcgcgaggc gttcgagcgc gcggtgcatc gccagctgat gaccgacgtg 780

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gccgcgctcg gtaccgtgca ccacggcttc gaatacagct ttgaagaagg cctggatgca 1020

ttgccggaag tgatccgcca catcgaaacc tacgacgtca ccacgattcg tgcgtccacg 1-080

ccgatgttcc -tgctggcgcg gcgcatcaag gcgatgggcg tcaagatggt gctgtccggc 1140

gaaggcagcg acgagafcctt cggtggctac <:tgtacttcc acaaggcacc gaacgcccgc 1200

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ggtgccacce gcatcgagaa gggcatcttg cgcgaggcat ttgccggcta tctgccggaa 1440

tcgatcctgt ggcggcagaa ggagcaattc agcgatggcg ttggttat-gg ctggatcgac 1500ggcctcaagg cacatgccgc cgcgcacgtg agcgaccgcg aactcgcagc ggccgaccgg 1560cgcttcccgg tgaacccgcc gcagaccaag gaagcctatt tctaccgcag tctgttcgag 1620cagttcttcc ccagccaggc ogctgcggag aoggtgccgg gtggtaaatc catcgcgtgt 1680tcgtcgccga cggccatfcgc ctgggacgcg agctttgcgg cgatggccga tccgtcgggc 1740cgtgcgattg ccggcgtgca cgcgcaggcg ttggcgtcc 1779

<210> 11<211> 1941<212> DNA

<213> Bacillus halodurans

<400> 11

atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagacc gcgggatatc 60acaagtttgt acaaaaaagc aggctcctgc aggaccatgt gtggaattac aggctgggta 120gattggcgac gcaacttgca aaatgagacg gaaacgatca aacagatggc ggaaacgcaa 180acacatcgag ggcccgatga tttgaacgtt tggacagaga agcatgctgc cttaggccac 240tcgcggctca ttgtcgttga tccggaaggc ggttgtcagc cgatgatgag ggagaggaat 300ggcaaacgct atacgatcgt gtataacggc gaattataca atacagaaga tttacggaaa 360gagcttatag taaaaggtta ccaatttcaa ggccattcgg atacggaagt attactcgtg 420tcttatatcg aatggggtta ccaatgtgtg gagaagttca atggcatttt tgcgtttgcg 480atttggaatg ataaagatca gagcttgttt atggcccgcg accgattagg ggtaaagccg 540ctattttata ctgttcgcca tggattttta cttttfcgcaa ctgagataaa agcgctgctt 600gctcatcctg aaatcgagcc ggttcttacc gaagaagggc tatcggaagt gctcgggctt 660gggccatcac gttcaccggg taatggcgtt tttgatgata ttcaagagtt gcgaccagct 720catcttttga catacgatcg caatggggca aaagtgagcc gttattggag attaaaatca 780atggctcatt «ctgaagatgc gatggaaacg gccgcccatc ttcgogactt attagaagat 840actgtcgaac gtcagctatt tgcagatgtt ccagttggaa tgtttctttc gggtggagtc 900gattcgagtg ctttaacggc aattgcggcg ctgatttacg agcgagaagg gaagggcctg 960attcggacgt actcgattga ttatgacgaa aatgataagt attttaaagc gaatgacttt 1020caaccgaatg ccgatggacc ttgggttgaa aaagtttcaa ctacttttcg aacgaaccac 1080cacaatgctg tcatctcgat cgaggagttg gctaatcaat taaagcgagc ggtagagctt 1140cgtgacttac ctggaa-tggc cgatgtagac tcttcattgt attggttttg taagcaaatc 1200aaaaaagatg ttaccgttgg cttatcgggt gaatgtgctg acgaaatttt tggtgggtat 1260cctt-ggttcc ataagccaga ggtcatgaat tttaatgggt ttccttggat gagatcagcg 1320gatgaacgtc aggagcttct tcatgaacga tggcgccaaa agttaaattt gcccaaatac 1380

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cttatgacag gcccgcagct ccttgcccac ttcatccaaa tggagcattg gcttaagcat 1920

tacaatatca aattaattgg t 1941

<210> 12

<211> 1869

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 12

atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagacc gcgggatatc 60

acaagtttgt acaaaaaagc aggctcctgc aggaccatgt gtggcatcct cgccgtgctc 120

ggcgtcgcag acgtctccct cgtcaagcgc tcccgcatca tcgagctatc ccgccggtta 180

cgtcatagag gccctgattg gagtggtata cactgctatc aggattgcta tcttgcacac 240

cagcggttgg ctattgttga tcccacatcc ggagaccagc •cgttgtacaa tgaggacaaa 300

tctgttgttg tgacggtgaa tggagagatc tataaccatg aagaattgaa agctaacctg 360

aaatctcata aattccaaac tgctagcgat •tgtgaagtta ttgctcatct gtatgaggaa 420

tatggggagg aatttgtgga tatgttggat gggatgttcg •cttttgttct tcttgacaca 480

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tggggtcttg atggttcggt ttggttttcg tcagagatga aggcattaag •tgatgattgc 600

gagcgattca tatc<rttccc ccctgggcac ttgtactcca gcaaaacagg tggcc.taagg 660

agatggtaca acccaccatg gttttctgaa agcattccct ccaccccgta caatcctctt 720

cttctccgac agagctttga gaaggctatt attaagaggc taatgacaga tgtgccattt 780

ggtgttctct tgtctggtgg actggactct tctttggttg catctgttgt ttcgcggcac 840

ttggcagagg eaaaagttgc cgcacagtgg ggaaacaaac tgcatacatt ttgcattggt 900

ttgaaaggtt ctcctgatct tagagctgct aaggaagttg cagactacct tggtactgtt 960catcacgaac tccacttcac agtgcaggaa ggcattgatg cactggagga agtcatttac 1020catgttgaga catatgatgt aacgacaatt agagcaagca ccccaatgtt cttgatgtca 1080cgtaaaatta aatctttggg ggtgaagatg gttctttcgg gagaaggttc tgatgaaata 1140tttggcggtt acctttattt tcacaaggca ccaaacaaga aggaattcca -tgaggaaaca 1200tgtcggaaga taaaagccct tcatttatat gattgcttga gagcgaacaa atcaacttct 1260gcatggggtg ttgaggcccg tgttccgttc cttgacaaaa acttcatcaa tgtagctatg 1320gacattgatc ctgaatggaa aatgataaaa cgtgatcttg gccgtattga gaaatgggtt 1380ctccggaatg catttgatga tgaggagaag ccctatttac ctaagcacat tctatacagg 1440caaaaggagc aattcagtga tggtgttggg tacagttgga ttgatggatt gaaggatcat 1500gcaaatgaac atgtatcaga ttccatgatg atgaacgcta gctttgttta cccagaaaac 1560actccagtta caaaagaagc gtactattat aggacaatat tcgagaaatt ctttcccaag 1620aatgctgcta ggttgacagt acctggaggt cctagcgtcg cgtgcagcac tgctaaagct 1680gttgaatggg acgcagcctg gtccaaaaac cttgatccat ctggtcgtgc tgctcttggt 1740gttcatgatg ctgcatatga agatactcta caaaaatctc ctgcctctgc caatcctgtc 1800ttggataacg gctttggtcc agcccttggg gaaagcatgg tcaaaaccgt tgcttcagcc 1860actgccgtt 1869<210> 13<211> 1764<212> DNA

<213> -Galdieria sulphuraria

<400> 13

atgatttgtg acaaa-tgcag cctGgtgcgg agcttttttg taggtagacc gcggaccggt 60cgcgcctcag cagtcgctgt cgttaccatg tgtgggattc ttgcggtgtt gggctcgtcg 120ttaccggtcg aagagcttag agagttggtt aaaagctgca ccaaaaaact atatcacaga 180ggtccagatg aagaacaata tttcattagt gaagatgggt ggtgtggttt aggctttgcc 240aggttgaaga ttgttgatcc tgagcacggt gtccagccta tgttcaacga ccaacggaca 300gtttggagtg tcactaatgg cgagctttac aaccatgaag agatccgaaa aacggaattg 360aacaatatga cactccattc tcattctgac tgcgaaataa tgataccttt gtatgagaaa 420tatgtttcta gtcagcgtta tgatcatgac attcaatatg tttataatct tctccgtgga 480gtctttgctt cttgcctggt tgatttgaaa cgtggttttt tcatggctgg aagagatcct 540atcggggtcc gagctctttt ttatgggaca agtaáagatg gtgctgtttg gtttgcttca 600gaggcaaaag <:aat-tgtgga tgtttgtgat tatgtgacag cattcatacc aggtaccttt 660gtgaaaggat acagaggccg cgaacaagca ttttctttta cgagatatta cgaaccagtg 720tactggcatg atcactggat gccggtttct ccagttgact atcaactttt acatgacacc 780tttgtgttgt cttgtaagcg tcgtttaatg tccgacgtgc ctattggagt atttatctct 840ggtggtttgg gttcttctct tgtggcctcc gtcgccaaac gcttactgga tcccaactat 900gattttcatt cttttgcttg tggtcttgaa ggagcaccag atgttgctgc agcgcaaaga 960gttgccgatt tcttaggaac aaagcaccac gtattaacat ttactgtgga ggagggtatc 1020caagcactag accaagtaat atatcacttg gaaacgtacg atgttaccac agttagagca 1080tcgacgccga tgtatttgtt atcaggtttg tgcaaaaagt atgtcaaagt agtgttatca 1140ggtgaaggag cagatgaaat cttcggtgga tatctctatt tccacaatgc accaaatgag 1200attgcatttc atcaagaagt tgttcgccga gtgaaacttt tatacacagc cgacgtattg 1260cgtggagata gagcaacggc agcacaaagt ttagaacttc gagttccgtt tcttgataga 1320gactttctgg atgttgcaat gagtattcat ccgcgtgaaa aggttacttc taagcataga 1380atcgagaaat atatcattcg ctatgccttt tccaaggagt tttgtggtga agagtatctt 1440cctgacgata ttctttggag acaaaaagaa cagttttcgg atggcgtggg ctatagctgg 1500atcgatggtt taaaggcgta ttgtgaaaag gccgtttccg atgcagactt gcaaaatgcc 1560gctcagcgtt ttccgcacga tactccaaca accaaagagg catatgttta ccgagctata 1620ttcgaaaaac attttgggaa ttgcaaggca gtacaaggtc ttcgtgaatc agttgcaaga 1680tgggtaccta tgtggagtga cagcacggat cctagcggtc gtgcacaaaa agttcatgtg 1740gctgcatatt caaatggagg agac 1764

<21-0> 14

<211> 1905

<212> DNA

<213> -Galdieria sulphuraria

<400> 14

atgtgttgct ctocttacct cctgatggta tctagtatct accaactgac actatattgc 60

ttctctttac atacgtatct tgctcgatgc cttctcccta gtgttgacca gtgttactca 120

catagtcttt gctcatttca ttgtaatgca gataccaagc ggggtaccag atctgagctc 180

ccgcgggata tcacaagttt gtacaaaaaa gcaggctcct gcaggaccat gtgtgggatt 240

cttgcggtgt tgggctcgtc gttaccggtc gaagagctta gagagttggt taaaagctgc 300

accaaaaaac tatatcacag aggt<:cagat gaagaacaat atttcattag tgaagatggg 360

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<210> 15

<211> 1851

<212> DNA

<213> Galdieria sulphuraria

<400> 15

atggtatcta gtatctacca actgacactacgatgccttc tccctagtgt tgaccagtgtaatgcagata ccaagcggga gctcgacgfcc

acactccatt ctcattctga ctgcgaaata 540agtcagcgtt atgatcatga cattcaatat 600tctfcgcctgg ttgatttgaa acgtggtttt £60cgagctcttt tttatgggac aagtaaagat 720gcaattgtgg atgtttgtga ttatgtgaca 780tacagaggcc -gcgaacaagc attttctttt 840gatcactgga tgccggtttc tccagttgac 900tcttgtaagc gtcgtttaat gtcegacgtg 960ggttcttctc ttgtggcctc cgtcgccaaa 1020tcttttgctt gtggtcttga aggagcacca 1080ttcttaggaa caaagcacca cgtattaaca 1140gaccaagtaa tatatcactt ggaaacgtac 1200atgtatttgt tatcaggttt gtgcaaaaag 1260gcagatgaaa tcttcggtgg atatctctat 1320catcaagaag ttgttcgccg agtgaaactt 1380agagcaacgg cagcacaaag tttagaactt 1440gatgttgcaa tgagtattca tccgcgtgaa 1500tatatcattc gctatgcctt ttccaaggag 1560attctttgga gacaaaaaga acagttttcg 1620ttaaaggcgt attgtgaaaa ggccgtttcc 1680tttccgcacg atactccaac aaccaaagag 1740cattttggga attgcaaggc agtacaaggt 1800atgtggagtg acagcacgga tcctagcggt 1860tcaaatggag gagac 1905

tattgcttct ctttacatac gtatcttgct 60tactcacata gtctttgctc atttcattgt 120cctcagcagt cgctgtgcga taccatgtgt 180gggattcttg cggtgttggg ctcgtcgtta ccggtcgaag agcttagaga gttggttaaa 240

agctgcacca aaaaactata tcacagagg-t ccagatgaag aacaatattt cattagtgaa 300

gatgggfcggt gtggtttagg ctttgccagg ttgaagattg ttgatcctga gcacggtgtc 360

cagcctatgt tcaacgacca acggacagtt tggagtgtca ctaatggcga gctttacaac 420

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aaagatggtg ctgtttggtt tgcttcagag gcaaaagcaa ttgtggatgt ttgtgattat 720

gtgacagcat tcataccagg tacctttgtg aaaggataca gaggccgcga acaagcattt 780

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gcaccagatg ttgctgcagc gcaaagagtt gccgatttct taggaacaaa gcaccacgta 1080

ttaacattta ctgtggagga gggtatccaa gcactagacc aagtaatata tcacttggaa 1140

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ttttcggatg gcgtgggcta tagctggatc gatggtttaa aggcgtattg tgaaaaggcc 1620

gtttccgatg cagacttgca aaatgccgct cagcgttttc cgcacgatac tccaacaacc 1680

aaagaggcat atgtttaccg agctatattc gaaaaacatt ttgggaattg caaggcagta 1740

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<213> Galdieria sulphuraria<4O0> 16

atggtatcta gtatctacca actgacactacgatgccttc tccctagtgt fcgaccagtgtaatgcagata ccaagcggga gct-cgacgtcgggattcttg cggtgttggg ctcgtcgttaagctgcacca aaaaactata tcacagaggtgatgggtggt gtggtttagg ctttgccaggcagcctatgt tcaacgacca acggacagttcatgaagaga tccgaaaaac ggaattgaacgaaataatga tacctttgta tgagaaatatcaatatgttt ataatcttct ccgtggagtcggttttttca tggctggaag agatcctatcaaagatggtg ctgtttggtt tgcttcagaggtgacagcat tcataccagg tacctttgtgtcttttacga gatattacga accagtgtacgttgactatc aacttttaca tgacacctttgacgtgccta ttggagtatt tatctctggtgccaaacgct tactggatcc caactatgatgcaccagatg ttgctgcagc gcaaagagttttaacattta ctgtggagga gggtatccaaacgtacgatg ttaccacagt tagagcatcgaaaaagtatg tcaaagtagt gttafccaggtctctatttcc acaatgcacc aaa-tgagattaaacttttat acacagccga cgtattgc^tgaacttcgag ttocgt-ttct tgatagagaccgtgaaaagg ttacttctaa gca-tagaatcaaggagtttt gtggtgaaga gtatcttcctttttcggatg gcgtgggcta tagc-tggatcgtttccgatg cagacttgca aaatgccgctaaagaggcat atgtttaccg agctatattccaaggtcttc gtgaatcagt tgcaagatggagcggtcgtg cacaaaaagt -tcatgtggct

tattgcttct ctttacatac gtatcttgct 60tact-cacata gtctttgctc atttcattgt 120cctcagcagt cgctgtgcga taccatgtgt 180ccggtcgaag agcttagaga gt-tggttaaa 240ccagatgaag aacaatattt cattagtgaa 300ttgaagattg ttgatcctga gcacggtgtc 360tggagtgtca ctaatggcga gctttacaac 420aatatgacac tccattctca ttcfcgactgc 480gtttctagtc agcgttatga tcatgacatt 540tttgcttctt gcctggttga tttgaaacgt 600ggggtccgag ctctttttta tgggacaagt 660gcaaaagcaa ttgtggatgt ttgtgattat 720aaaggataca gaggccgcga acaagcattt 780tggcatgatc actggatgcc ggtttctcca 840gtgttgtctt gtaagcgtcg tttaatgtcc 900ggtttgggtt cttctcttgt ggcctccgtc 960tttcattctt ttgcttgtgg tcttgaagga 1020gccgatttct taggaacaaa gcaccacgta 1080gcactagacc aagtaatata tcacttggaa 1140acgccgatgt atttgttatc aggtttgtgc 1200gaaggagcag atgaaatctt cggtggatat 1260gcatttcatc aagaagttgt tcgccgagtg 1320ggagatagag caacggcagc acaaagttta 1380tttctggatg ttgcaatgag tattcatccg 1440gagaaatata tcattcgcta tgccttttcc 1500gacgatattc tttggagaca aaaagaacag 1560gatggtttaa aggcgtattg tgaaaaggcc 1620cagcgttttc cgcacgatac tccaacaacc 1680gaaaaacatt ttgggaattg caaggcagta 1740gtacctatgt ggagtgacag cacggatcct 1800gcatattcaa atggaggaga c 1851<210> 17<211> 1803<212> DNA

<213> Saccharomyces cer-evisiae

<400> 17

atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagacc gcggaccggt 60cgcgcctcag cagtcgctgt cgttaccatg tgtggtatct ttgcagcctt caagcatgaa 120gatattcaca acttcaaacc aaaagctcta caactatcta aaaaaatcag acaccgtggc 180ccagattggt caggaaatgc cgttafcgaat tccaccattt tcgttcacga gaggttggct 240attgttggtt tagactccgg tgcccagcca atcacttcag ctgatggcga atatatgctt 300ggcgttaatg gtgagatcta -caaccacatc caactaaggg agatgtgctc tgattacaag 3 60tttcaaactt tcagtgactg tgaacccatc ataccgttat atttggaaca tgatatcgat 420gctccaaaat atctggacgg tatgttcgca ttttgtctgt atgattccaa gaaagaccgt 480attgtcgctg caagagaccc tatcggtgtt gtcactttat acatggggcg ttcttctcag 540tctccagaga ccgtttattt tgcctccgaa ttaaaatgtc taactgacgt ttgtgacagt 600atcatttcgt tccctcctgg tcatgtctac gattctgaaa cggacaagat tactcgttac 660tttaccccag actggttgga tgaaaagcgt atcccatcca ccccagttga ctaccatgct 720atcagacaca gtttagaaaa ggccgttaga aagaggctaa tggctgaagt tccatacggt 780gttcttctat ccggtgggct ggactcttct ttgattgctg cgattgctgc tcgtgaaacg 840gaaaaagcta atgctgatgc taacgaagac aacaatgttg ac-gagaagca acttgcaggt 900atcgatgacc aaggccatct acacacatcc ggttggtctc gtttgcattc gtttgcgatt 960ggtctaccaa atgcacctga tttacaagcg gctagaaaag tcgccaaatt cattggttct 1020atccaccatg aacacacttt tacattacaa gaaggtttgg atgctttgga cgacgtgatc 1080taccatttgg aaacttacga cgttaccact atcagagctt ctacaccaat gttcttacta 1140tctagaaaga ttaaggccca aggtgtcaaa atggttcttt ct^gtgaagg ctcggacgaa 1200atattcggtg -gctatctata tttcgcacaa gcaccttctg ctgcagaatt tcacaccgaa 1260t-ctgtgcaac gtgtcaagaa ctt-gcatttg gcagattgtt tgagagctaa taagtccacg 1320atggcttggg gtctagaagc tcgtgttccc ttcttagaca aagacttttt gcagctatgt 1380atgaacattg atccaaatga aaagatgatc aagccaaagg aaggacgtat cgaaaaatac 1440attttaagaa aggcattcga cactacagat gaaccagatg ttaagccata cctacctgaa 1500gaaatcttat ggagacaaaa ggaacaattt tccgatggtg ttggctactc atggattgac 1560ggcctaagag acactgctga aagggccatt tctgacgcca tgtttgccaa tccaaaggct 1620gattggggcg acgatattcc aaccaccaaa gaagcttact ggtacaggct gaagtttgat 1680gcttggtttc ctcaaaagac tgcggcagac actgtcatga gatggattcc aaaggccgat 1740tggggttgtg ccgaagatcc ttcaggtaga tacgccaaaa tacacgaaaa gcacgtcagt 1800gct 1803

<210> 18<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 18

gcagucgctg ucgtuaccat g 21<210> 19<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 19

gcgaguaocg cugggtucta 20<210> 20<211> 39<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 20

gctcctgcag gaccatgtgt tccatttttg gaatcttca 3 9

<210> 21<211> 37<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 21

ctgggtctcg agctacagca gtgcttgttg atgaacc

<210> 22

<211> 53

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 22

ccccttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggctc ctgcaggacc atg

<210> 23

<211> 48

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 23

ggggtcttat aatgccaact ttgtacaaga aagctgggtc tcgagcta

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 24

gctcctgcag gaccatgtgt ggaattacag gctggg

<210> 25

<211> 47

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 25

ctgggtctcg agctaaccaa ttaatttgat attgtaatgc ttaagcc

<210> 26

<211> 53

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 26

ccccttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggctc ctgcaggacc atg

<210> 27

<211> 48

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 27

ggggtcttat aatgccaact ttgtacaaga aagctgggtc tcgagcta

<210> 28

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> -Seqüência do ini-ciador sintético

<400> 28

gctcctgcag gaccatgtgc ggcat-cctcg c

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 29

ctgggtctcg agctagacag ctgtggctga agcaac 36

<210> 30

<211> 53

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 30

ccccttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggctc ctgcaggacc atg 53

<210> 31

<211> 48<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 31

ggggtcttat aatgccaact ttgtacaaga aagctgggtc tcgagcta 48

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 32

gctcctgcag gaccatgtgc ggcatacttg ctgtg 35

<210> 33

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 33

ctgggtctcg agctatccct cgatggcaac gc

<210> 34

<211> 53

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 34

ccccttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggctc ctgcaggacc atg

<210> 35

<211> 48

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 35

ggggtcttat aatgccaact ttgtacaaga aagctgggtc tcgagcta

<210> 36

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 36

gctcctgcag gaccatgtgt ggcatcctcg ccgt

<210> 37

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 37

ctgggtctcg agctaaacgg cagtggctga agca

<210> 38

<211> 53

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 38

ccccttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggctc ctgcaggacc atg

<210> 39

<211> 48

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 39

ggggtcttat aatgccaact ttgtacaaga aagctgggtc tcgagcta

<210> 40

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 40

gctcctgcag gaccatgtgt ggtattcttg ctgttcttgg

<210> 41

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 41

ctgggtctcg agctagccct ggatggcaac acc

<210> 42

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 42

ctgggtctcg agctagccct ggatggcaac acc

<210> 43

<211> 48

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 43

ggggtcttat aatgccaact ttgtacaaga aagctgggtc tcgagcta

<210> 44

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 44

cctctagatg tgcggcatac ttgctg

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador sintético

<400> 45

cgaattctat ccctcgatgg caacg

<210> 46

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador Sintético

<400> 46

tcctagacat gtccggcata cttgctg

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador Sintético

<400> 47

tgcagaattc tatccctcga tgg

<210> 48

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador Sintético

<400> 48

gcagtcgctg tcgttacccg gcatcatgtg tggcatc

<210> 49

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Iniciador Sintético

<400> 49

gcgagtaccg ctgggttcta acgtactctc gtcagaccgc

Claims (18)

1. Semente de milho transgênica com um nível de proteína au-mentado, caracterizada pelo fato de que compreende em seu genoma umconstructo de DNA heterolóloga compreendendo um promotor operavelmen-te ligado a um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de asparaginasintetase heterólogo, em que a referida semente tem um nível de proteínaaumentado relativo ao nível de proteína de uma semente da mesma varie-dade não contendo o referido constructo de DNA em seu genoma, em que oreferido polinucleotídeo compreende uma seqüência de ácido nucléico sele-cionada a partir do grupo consistindo em:(a) uma seqüência de ácido nucléico compreendendo uma se-qüência pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID 5,SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, ou SEQ IDNO:17;(b) uma seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüênciade polipeptídeo de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ou SEQ IDNO:8;e(c) uma seqüência de ácido nucléico da que hibridiza para a se-qüência (a) ou (b) ou um complemento desta sob condições de severidadealta de cerca de 0,2 x SSC e 65°C.

2. Semente de milho transgênica de acordo com a reivindicação-1, caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo de asparagina sinte-tase heterólogo compreende SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ouSEQ ID NO:8.

3. Semente de milho transgênica de acordo com a reivindicação-1, caracterizada pelo fato de que o referido polinucleotídeo compreende aseqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID 5, SEQID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, ou SEQ IDNO:17.

4. Semente de milho transgênica de acordo com a reivindicação-1, caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo de asparagina sinte-tase heterólogo é um polipeptídeo de AsnS2de milho.

5. Semente de milho transgênica de acordo com a reivindicação-1, caracterizada pelo fato de que o referido o promotor é um promotor deactina 1 de arroz.

6. Planta de milho transgênica com um nível de asparagina au-mentado, caracterizada pelo fato de que compreende em seu genoma umconstructo de DNA heteróloga compreendendo um promotor operavelmenteligado a um polinucleotídeo codificando uma asparagina sintetase heterólo-ga, em que a referida planta tem nível de asparagina aumentado relativo aonível de asparagina de uma planta da mesma variedade não contendo a re-ferido constructo de DNA em seu genoma, em que o referido polinucleotídeocodificando uma asparagina sintetase compreende uma seqüência de ácidonucléico selecionada a partir do grupo consistindo em:(a) uma seqüência de ácido nucléico compreendendo a seqüên-cia pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID 5, SEQID N0:7, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, ou SEQ IDN0:17;(b) uma seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüênciade polipeptídeo de SEQ ID N0:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:6 ou SEQ IDN0:8; e(c) uma seqüência de ácido nucléico da que hibridiza para a se-qüência de (a) ou (b) ou um complemento desta sob condições de severida-de alta de cerca de 0,2 x SSC e 65°C.

7. Planta de milho transgênica de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de que a referida asparagina sintetase compreendeSEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6 ou SEQ ID N0:8.

8. Planta de milho transgênica de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de que o referido polinucleotídeo compreende a se-qüência de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID 5, SEQ ID NO:7, SEQ IDNO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, ou SEQ ID NO:17.

9. Planta de milho transgênica de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de que o referido o promotor é um promotor de actina-1 de arroz.

10. Método de produzir uma planta de milho transgênica comasparagina, caracterizado pelo fato de que compreende:a) transformar uma célula de milho com um constructo de DNAheteróloga compreendendo uma molécula de promotor funcional em umacélula de milho operavelmente ligada a uma molécula de DNA codificandoum polipeptídeo de asparagina sintetase;b) regenerar a célula de milho em e planta de milho intata;c) selecionar uma planta de milho que tem asparagina aumenta-da em um tecido relativo a um tecido de planta de milho não transformadocom a referido constructo de DNA;d) cultivar a planta de milho até a maturidade; ee) colher uma semente da planta de milho,em que a referida molécula de DNA compreende uma seqüência de ácidonucléico selecionada a partir do grupo consistindo em:(a) uma seqüência de ácido nucléico compreendendo uma se-qüência pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID 5,SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, ou SEQ IDNO:17;(b) uma seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüênciade polipeptídeo de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ou SEQ IDNO:8; e(c) uma seqüência de ácido nucléico que hibridiza para a se-qüência de (a) ou (b) ou um complemento desta sob condições de severida-de alta de cerca de 0,2 x SSC e 65°C.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe-lo fato de que o referido polipeptídeo de asparagina sintetase compreende aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ouSEQ ID N0:8.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe-lo fato de que a referida molécula de DNA compreende a seqüência de ácidonucléico de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID 5, SEQ ID NO:7, SEQ IDNO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:17.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe-lo fato de que também compreendendo a etapa de:f) selecionar uma semente com proteína aumentada.

14. Farinha de milho com proteína aumentada relativa a outrasfarinhas de milho, caracterizada pelo fato de que a farinha de milho compre-ende um constructo de DNA heterologa compreendendo uma molécula depromotor operavelmente ligada a uma molécula de DNA codificando um po-lipeptídeo de asparagina sintetase heterólogo.

15. Farinha de milho de acordo com a reivindicação 14, caracte-rizada pelo fato de que o referido polipeptídeo de asparagina sintetase demilho é um polipeptídeo de AsnS2de milho.

16. Farinha de milho de acordo com a reivindicação 14, caracte-rizada pelo fato de que a referida molécula de DNA compreende a seqüênciade SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID 5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ IDNO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:17.

17. Farinha de milho de acordo com a reivindicação 14, caracte-rizada pelo fato de que a referida molécula de DNA codifica um polipeptídeode SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:8.

18. Alimento, caracterizado pelo fato de que é feito a partir dafarinha de milho como definida na reivindicação 13.