ES2418843T3 - Glutamina sintetasas bacterianas y métodos de uso - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido variante es al menos98% idéntico a SEC ID Nº: 1, que codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutaminasintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2.

Description

Glutamina sintetasas bacterianas y métodos de uso

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a biología molecular de plantas, particularmente a una nueva clase de enzimas glutamina sintetasa que confieren resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas.

Antecedentes de la invención

Las plantas obtienen nitrógeno de su ambiente en forma de compuestos inorgánicos, concretamente nitrato y amoníaco captado desde las raíces, y N2 atmosférico reducido a amoníaco en nódulos de raíces que fijan nitrógeno. La primera etapa en la asimilación del nitrógeno inorgánico en forma orgánica implica predominantemente la

15 incorporación de amoníaco con glutamato para formar glutamina, catalizada por la enzima glutamina sintetasa.

Varios herbicidas actúan inhibiendo la glutamina sintetasa vegetal. Un ejemplo típico de dicho compuesto es el análogo de ácido glutámico, glufosinato (o fosfinotricina). Muchos de estos herbicidas inhiben la glutamina sintetasa presente en las plantas de cultivo así como en malas hierbas, limitando de este modo el uso de dichos compuestos como glufosinato. Puesto que la selectividad de herbicidas es importante en cualquier herbicida comercialmente útil, sería de gran interés poder conferir resistencia en plantas seleccionadas a dichos herbicidas no selectivos como glufosinato, así como a otros inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas.

Se conocen en la técnica enzimas que son resistentes a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas. La metiona

25 sulfoximina (MSO), un análogo de glutamato, es un inhibidor competitivo mixto de glutamina sintetasa de hoja de guisante (Leason et al. (1982) Phytochemistry 21:855). Se han presentado células de alfalfa resistentes a fosfinotricina (Newmark (1983) Nature 305:383-384). La resistencia se debió a amplificación del gen de glutamina sintetasa (Donn et al. (1984) Journal of Molecular and Applied Genetics 2: 621-635). El gen Bar, aislado de Streptomyces hygroscopicus, codifica la enzima fosfinotricina N-acetiltransferasa (PAT). Este gen puede conferir resistencia a herbicidas de glufosinato porque PAT detoxifica fosfinotricina por acetilación, lo que produce un compuesto inactivo.

Se necesitan genes adicionales que sean resistentes a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas cuando la resistencia se deba a una mutación funcional en la enzima glutamina sintetasa, en lugar de una amplificación o

35 inactivación por acetilación de la enzima.

Se reconocen los siguientes documentos:

-

El documento US 5.098.838 se refiere a la expresión de glutamina sintetasa natural y mutante en hospedadores ajenos; -Miller et al (1981) Journal of Biological Chemistry 256 (21): 11307-1131, que se refiere a glutamina sintetasa resistente a L metionina SR sulfoximina de mutantes de Salmonella typhimurium; y -McClelland et al (2001) Nature 413 (6858): 852-856 se refiere a la secuencia de genoma completa de Salmonella enterica serovar typhimurium LT2.

Sumario de la invención

Se describen composiciones y métodos para conferir resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas en plantas, células, tejidos y semillas vegetales. Los polinucleótidos empleados en los diversos métodos y composiciones confieren resistencia a glufosinato. Las composiciones incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos resistentes a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas, vectores que comprenden dichos polinucleótidos y células hospedadoras que comprenden los vectores. Se describen composiciones que comprenden una secuencia codificante de un polipéptido que confiere resistencia o tolerancia a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas. También se hace referencia a composiciones que comprenden una secuencia codificante de un

55 polipéptido que da como resultado utilización de nitrógeno mejorada y/o rendimiento potenciado en una planta. Las secuencias codificantes pueden usarse en construcciones de ADN o casetes de expresión para transformación y expresión en organismos, incluyendo microorganismos y plantas. Las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células, tejidos y semillas vegetales transformados.

La presente invención proporciona un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 1, que codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2.

65 La presente invención proporciona polinucleótidos aislados que comprenden SEC ID Nº: 1, así como variantes de la secuencia polinucleotídica expuesta en SEC ID Nº: 1 que son al menos 98% idénticos a SEC ID Nº: 1, que codifican un polipéptido que es resistente a inhibición por el inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2. Las variantes incluyen SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, y la secuencia de nucleótidos de glutamina sintetasa depositada en un hospedador bacteriano con el número de referencia NRRL B-30930, depositada el 8 de junio de

5 2006 en la Autoridad de Depósito Internacional Colección de Cultivo de Investigación Agrícola (NRRL), 1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604 Estados Unidos. La presente invención proporciona los polipéptidos correspondientes a esos polinucleótidos. En una realización, los polinucleótidos de la presente invención comprenden al menos una modificación entre los aminoácidos 125 a 175 o entre los aminoácidos 200 a 250 correspondientes a SEC ID Nº: 2, o al menos una modificación que da como resultado la pérdida de un sitio de adenilación.

La invención también proporciona

-

un vector que comprende un polinucleótido de la invención;

15 -una célula hospedadora que contiene dicho vector; -una planta transgénica que comprende dicha célula hospedadora; -una semilla transformada que comprende un polinucleótido de la invención; -un polipéptido que comprende una variante de SEC ID Nº: 2, donde dicho polipéptido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 2, es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2; y -el polipéptido de SEC ID Nº: 2.

La invención también proporciona un método para conferir resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas en una planta que comprende:

(i)

transformar dicha planta con un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 1, codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzimadeSECID Nº: 2; y

(ii)

regenerar una planta transformada.

La invención proporciona además una planta que tiene incorporada de forma estable en su genoma una construcción de ADN que comprende un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID N º: 1, codifica un polipéptido que es resistente a

35 inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima deSEC ID Nº: 2.

Adicionalmente, la invención proporciona un método para combatir de forma selectiva malas hierbas en un campo que contiene una planta que tiene semillas plantadas o plantas que comprende las etapas de:

a) plantar las semillas o plantas que son resistentes a inhibidor de glutamina sintetasa herbicida como un resultado de que un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1 se inserte en la semilla o planta, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 1, codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida, y que tiene actividad enzimática mayor

45 que la de la enzima de SEC ID Nº: 2; y b) aplicar a las plantas y malas hierbas en un campo una concentración eficaz de un inhibidor de glutamina sintetasa herbicida para combatir las malas hierbas sin afectar significativamente a las plantas.

La invención también proporciona un método para mejorar la utilización de nitrógeno en una planta que comprende introducir en dicha planta un polinucleótido de acuerdo con la invención.

Descripción de las figuras

Las Figuras 1A-1C muestran una alineamiento de la secuencia de nucleótidos de las variantes resistentes a

55 herbicida de glutamina sintetasa, incluyendo pAX3421m1 (SEC ID Nº: 4), pAX3422m2 (SEC ID Nº: 6), pAX3427m3 (SEC ID Nº: 8), pAX3428m4 (SEC ID Nº: 10), pAX3430m6 (SEC ID Nº: 12), pAX3431m7 (SEC ID Nº: 14), pAX3432m8 (SEC ID Nº: 16), pAX3433m9 (SEC ID Nº: 18), pAX3434m10 (SEC ID Nº: 20), pAX3435m11 (SEC ID Nº: 22), pAX3436m12 (SEC ID Nº: 24), pAX3437m13 (SEC ID Nº: 26), pAX3438m14 (SEC ID Nº: 28), pAX3426m15 (SEC ID Nº: 30) y pAX3439m16 (SEC ID Nº: 32) con la secuencia de aminoácidos ags1 natural (SEC ID Nº: 2).

Descripción detallada de la invención

I. Composiciones

65 Se describen composiciones y métodos para conferir resistencia o tolerancia a herbicidas, particularmente resistencia o tolerancia a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas, en organismos. Los métodos implican

transformar organismos con polinucleótidos que codifican un gen de tolerancia a herbicida que codifica un polipéptido que es resistente a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas. Los polinucleótidos codifican un gen de tolerancia a herbicidas que codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por glufosinato. Por gen de “resistencia a herbicida” o “tolerancia a herbicidas” se entiende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 5 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 o 47 y variantes de los mismos que codifican un polipéptido de resistencia o tolerancia a inhibidor de glutamina sintetasa (inhibidor de GS), donde las variantes son al menos 98% idénticas a SEC ID Nº: 1, que codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº:

2. De forma similar, un polipéptido de “resistencia a herbicida” o “de tolerancia a herbicida” de la invención es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, y variantes de la misma, que confiere resistencia o tolerancia a inhibidor de GS a una célula hospedadora, donde las variantes son al menos 98% idénticas a SEC ID Nº: 2, son resistentes a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y tienen actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2.

15 La presente invención proporciona polinucleótidos aislados que comprenden variantes de la secuencia de polinucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 1, donde las variantes son al menos 98% idénticas a SEC ID Nº: 1, que codifica polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida, que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2. En una realización, los polinucleótidos de la presente invención codifican polipéptidos que comprenden al menos una modificación entre los aminoácidos 125 y 175 o al menos una modificación entre los aminoácidos 200 a 250 correspondientes a SEC ID Nº: 2. Para los fines de la presente invención, “modificación” se entiende como un cambio en la secuencia de nucleótidos que da como resultado un cambio en el polipéptido codificado. Una modificación también puede abarcar una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido en una secuencia polipeptídica. Por “correspondiente a” se entiende que las

25 posiciones de aminoácidos enumeradas se relacionan con las posiciones de aminoácidos designadas en SEC ID Nº: 2, y que pueden encontrarse sustituciones que correspondan a estas posiciones de aminoácidos en secuencias variantes cuando estas secuencias variantes se alinean con SEC ID Nº: 2 usando métodos de alineamiento convencionales.

Se depositó un plásmido que contenía la secuencia de nucleótidos de resistencia a herbicida de la invención en la colección permanente de la Colección de Cultivos del Servicio de Investigación Agrícola, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), 1815 Noth University Street, Peoria, Illinois 61604, Estados Unidos de América, el 8 de junio de 2006 y se le asignó el número de referencia B-30930. Este depósito se mantendrá según los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines de

35 Procedimiento de Patente. Este depósito se realizó únicamente como una conveniencia para los expertos en la materia y no es una admisión de que se requiera un depósito según 35 U.S.C. § 112.

La definición de la enzima “glutamina sintetasa” o “glutamina sintasa” es funcional e incluye cualquier glutamina sintetasa capaz de actuar en un hospedador deseado dado, especialmente una bacteria o planta, para convertir ácido glutámico a glutamina. La expresión incluye por lo tanto no solamente la enzima de la especie vegetal específica implicada en la transformación, sino que puede incluir glutamina sintetasa de otras especies vegetales o microbios, si dicha glutamina sintetasa es capaz de actuar en la planta transformada o células bacterianas.

La expresión “inhibidor de glutamina sintetasa herbicida” o “inhibidor de glutamina sintasa herbicida” pretende incluir

45 cualquier inhibidor, competitivo o no competitivo, que reduzca significativamente la actividad glutamina sintetasa de una célula vegetal de una especie dada y, como consecuencia de ello, provoque efectos herbicidas en la célula vegetal. Son ejemplos de inhibidores de glutamina sintetasa glufosinato, fosfinotricina, metionina sulfoximina así como otros análogos de ácido glutámico.

El término “glufosinato” indica el compuesto conocido, en su forma biológicamente activa. Puede estar presente en cualquier forma enantiomérica y puede estar solo o en combinación con otros compuestos inertes o activos que no interfieran con la actividad glufosinato.

A. Glutamina sintetasa

55 En la presente invención, la clase de enzimas que confiere resistencia a herbicida es glutamina sintetasa (GS). La expresión “glutamina sintetasa” o “glutamina sintasa” o “GS” como se usa en el presente documento se refiere tanto a una glutamina sintetasa nativa como a una variante o fragmento de la misma.

La glutamina sintetasa es una enzima clave en el metabolismo del nitrógeno; tiene funciones duales en dos reacciones bioquímicas esenciales, la asimilación de amoníaco y la biosíntesis de glutamina. La glutamina producida por GS es esencial para la síntesis de proteínas, y su nitrógeno de amida se dona para sintetizar muchos metabolitos esenciales.

65 La forma común de GS es una enzima dodecamérica con subunidades idénticas de aproximadamente 55 kDa, codificada por glnA. La estructura cristalina de esta enzima reveló que está compuesta de 12 subunidades idénticas dispuestas como dos anillos hexagonales superpuestos que se mantienen juntos tanto por interacciones hidrófobas como por enlaces de hidrógeno entre las subunidades. (Yamashita et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17681-17690). La glutamina sintetasa cataliza la formación de glutamina de glutamato y amoníaco en una reacción dependiente de ATP. También cataliza la transferencia de gamma-glutamilo de glutamina a hidroxilamina produciendo gamma

5 glutamilhidroximato (Stadtman et al. (1974) en The Enzymes (Boyer, ed.) 3:755-807 (Academic Press, Nueva York)). La catálisis de glutamina sintetasa implica la formación inicial de un intermedio de gamma-glutamil fosfato, seguido del desplazamiento del grupo fosfato activado por amoníaco mediante la formación de un intermedio tetraédrico fosforilado. En E. coli, los restos altamente conservados Asp50 y Glu327 forman un bolsillo de unión cargado negativamente que constituye el sitio de unión del amoníaco (Liaw et al. (1995) Protein Sci. 4:2358-2365).

Se conocen varios inhibidores potentes para glutamina sintetasa que imitan la geometría del intermedio tetraédrico, incluyendo glufosinato (o fosfinotricina (PPT)) y L-metionina-DL-sulfoximida (MSX). La fosforilación de MSX y glufosinato es similar a la fosforilación de glutamato en la primera etapa de la reacción enzimática normal de glutamina sintetasa, y se requiere para que se produzca inhibición irreversible (Crespo et al. (1.999) Eur. J. Biochem.

15 266:1202-1209). En plantas, la inhibición de glutamina sintetasa da como resultado una acumulación de amoníaco fitotóxico y una ausencia de aminoácidos esenciales, y una inhibición de fotorrespiración y fotosíntesis y, en última instancia, la muerte de la planta.

El glufosinato es un compuesto natural aislado de dos especies de hongos Streptomyces que inhibe la actividad de glutamina sintetasa. La aplicación de glufosinato da como resultado niveles de glutamina reducidos y un aumento correspondiente de concentraciones de amoníaco en tejidos vegetales, lo que conduce a rotura de membrana celular y cese de la fotosíntesis, dando como resultado marchitamiento y muerte de la planta. Se conocen en la técnica varios análogos del glufosinato que inhiben la glutamina sintetasa vegetal. Véase, por ejemplo, Berlicki et al. (2005) J. Med. Chem. 48(20):6340-6349 y Forlani et al. (2006) J. Agric. Food Chem. 54 (3):796-802.

B. Glutamina sintetasa resistente a herbicida

Se ha indicado resistencia a L-fosfinotricina en células de alfalfa, después de una selección por etapas en niveles crecientes de L-PPT, dando como resultado amplificación génica (Donn et al. (1984) J. Mol. Appl. Genet. 2:621) y por introgresión en plantas de tabaco, patata y tomate, mediante transformación mediada por Agrobacterium del gen Bar, que codifica fosfinotricina acetiltransferasa (PAT), una enzima detoxificante (De Block et al. (1987) EMBO J. 6:2513). Se describen mutantes de enzimas glutamina sintetasa vegetales que son resistentes a fosfinotricina en la Patente de Estados Unidos Nº 5.145.777. Estos mutantes confieren resistencia por la sobreexpresión de glutamina sintetasa.

C. Actividad de glutamina sintetasa

Puede usarse una diversidad de métodos para medir la actividad glutamina sintetasa. Véase, por ejemplo, Crespo et al. (1.999) Eur. J. Biochem. 266:1202-1209, Gawronski et al. (2004) Anal. Biochem.327:114-118, y Patentes de Estados Unidos Nº 5.098.838, 5.145.777. La actividad puede medirse usando polipéptidos de glutamina sintetasa purificados, o ensayando la capacidad de organismos transformados con los polinucleótidos de la invención para crecer en presencia de inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas.

D. Polinucleótidos aislados, y variantes y fragmentos de los mismos

45 En algunas realizaciones, la presente invención comprende polinucleótidos aislados o recombinantes que codifican polipéptidos que son resistentes a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas. Un polinucleótido o polipéptido “aislado” o “purificado”, o parte biológicamente activa del mismo, está sustancialmente sin otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente sin precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se sintetizan químicamente. Por “biológicamente activo” se entiende que posee la actividad biológica deseada del polipéptido nativo, es decir, resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas. Un polinucleótido “aislado” puede estar sin secuencias (por ejemplo, secuencias codificantes de proteína) que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que deriva el polinucleótido. Para fines de la invención, “aislado”

55 cuando se usa para hacer referencia a polinucleótidos excluye cromosomas aislados. Por ejemplo, en diversas realizaciones, el polinucleótido que codifica resistencia a glifosato aislado puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de la secuencia de nucleótidos que flanquea de forma natural el polinucleótido en ADN genómico de la célula de la que deriva el polinucleótido.

La presente invención contempla además variantes y fragmentos de los polinucleótidos descritos en el presente documento que son al menos 98% idénticos a SEC ID Nº: 1, que codifican un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2.

65 Se conocen bien en la técnica métodos para medir la actividad de resistencia a herbicida. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 5.098.838 y 5.145.777. La actividad también puede referirse a la actividad enzimática de la enzima glutamina sintetasa como se ha descrito en otra parte en el presente documento.

La invención también abarca polinucleótidos variantes. Las ”variantes” del polinucleótido incluyen las secuencias que codifican los polipéptidos divulgados en el presente documento pero que difieren de forma conservativa debido a la 5 degeneración del código genético, así como las que son suficientemente idénticas. La expresión “suficientemente idéntica” se entiende como una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que tiene al menos 98% o 99% de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineamiento usando parámetros convencionales. Un experto en la materia reconocerá que estos valores pueden ajustarse de forma apropiada para determinar la identidad correspondiente de polipéptidos codificados por dos

10 polinucleótidos teniendo en cuenta la degeneración codónica, similitud de aminoácidos, posicionamiento de fase de lectura y similares.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos polinucleótidos, las secuencias se alinean para fines de comparación óptima. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias está

15 en función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones solapantes) x 100). En una realización, las dos secuencias son de la misma longitud. El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a las descritas posteriormente, permitiendo o no huecos. Al calcular el porcentaje de identidad, típicamente se cuentan las coincidencias exactas.

20 La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede conseguirse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX

25 de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos de BLAST con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener homólogos de polinucleótidos para polinucleótidos que codifican resistencia a herbicidas usados en métodos de la invención. Pueden realizarse búsquedas de polipéptidos BLAST con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a moléculas polipeptídicas expresadas usando los métodos de la invención.

30 Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparación, puede utilizarse BLAST con huecos como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como alternativa, puede usarse PSI-Blast para realizar una búsqueda por iteraciones que detecte relaciones distantes entre las moléculas. Véase Altschul et al. (1997) mencionado anteriormente. Cuando se utilizan los programas BLAST, BLAST con huecos y PSI-BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). Véase

35 www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o ADN, y de este modo puede proporcionar datos sobre la conservación de secuencia de la secuencia de aminoácidos completa. El algoritmo ClustalW se usa en varios paquetes de software de análisis de ADN/aminoácidos disponibles en el mercado, tales como el módulo

40 ALIGNX del conjunto de programas Vector NTI (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Después del alineamiento de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, puede evaluarse el porcentaje de identidad de aminoácidos. Un ejemplo no limitante de un programa de software útil para análisis de alineamientos de ClustalW es GENEDOC!. GENEDOC! (Karl Nicholas) permite la evaluación de la similitud de aminoácidos (o ADN) e identidad entre múltiples polipéptidos. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de

45 secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete de software de alineamiento de secuencia GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de restos de peso 120 PAM, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.

50 A no ser que se indique de otro modo, se usa GAP versión 10, que usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970)

J. Mol. Biol. 48 (3):443-453 para determinar la identidad o similitud de secuencia usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos usando peso de hueco de 50 y peso de longitud de 3, y la matriz de puntuación nwssgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando peso de hueco de 8 y peso de longitud de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62.

55 También pueden usarse programas equivalentes. Por “programa equivalente” se entiende cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualesquiera en cuestión, genere una alineamiento que tenga coincidencias de restos de nucleótidos idénticos y una identidad de porcentaje de secuencia idéntica cuando se compara con el alineamiento correspondiente generado por GAP versión 10.

60 Pueden identificarse variantes alélicas de origen natural con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como se describen posteriormente. Los polinucleótidos variantes también incluyen polinucleótidos derivados de forma sintética que se han generado, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida pero que todavía codifican el polipéptido que tiene la actividad biológica deseada.

65 El experto en la materia apreciará adicionalmente que pueden introducirse cambios mediante mutación en los polinucleótidos de la invención conduciendo de este modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados, sin alterar la actividad biológica de los polipéptidos. Por lo tanto, pueden crearse polinucleótidos aislados variantes introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en

5 el polinucleótido correspondiente divulgado en el presente documento, de modo que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en el polipéptido codificado. Pueden introducirse mutaciones por técnicas convencionales, tales como mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR, o técnicas de combinación de genes. Dichos polinucleótidos variantes también están abarcados por la presente invención.

Pueden realizarse polinucleótidos variantes introduciendo mutaciones de forma aleatoria a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden explorarse con respecto a la capacidad para conferir actividad de resistencia a herbicidas para identificar mutantes que conserven la actividad. Después de la mutagénesis, el polipéptido codificado puede expresarse de forma recombinante y puede determinarse la actividad del polipéptido usando técnicas de ensayo convencionales.

15 Combinaciones de genes o procedimientos de PCR sexual (por ejemplo, Smith (1994) Nature 370:324-325; Patentes de Estados Unidos Nº 5.837.458; 5.830.721; 5.811.238 y 5.733.731) pueden usarse para identificar polinucleótidos adicionales que codifican polipéptidos que realizan funciones similares a las descritas en el presente documento (por ejemplo, polipéptidos que son resistentes a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas). La combinación de genes implica fragmentación aleatoria de varios ADN mutantes seguido de su reensamblaje por PCR en moléculas de longitud completa. Los ejemplos de diversos procedimientos de combinación de genes incluyen, pero sin limitación, ensamblaje después de tratamiento de ADNasa, el procedimiento de extensión escalonado (STEP) y recombinación in vitro con cebadores aleatorios. En el método mediado por DNasa, los segmentos de ADN aislados de un grupo de mutantes positivos se escinden en fragmentos aleatorios con DNasa I y se someten a múltiples ciclos de PCR sin

25 cebador añadido. Las longitudes de fragmentos aleatorios se acercan a la del segmento no escindido a medida que avanzan los ciclos de PCR, dando como resultado que las mutaciones en diferentes clones se mezclen y se acumulen en algunas de las secuencias resultantes. Múltiples ciclos de selección y combinación han conducido a la potenciación funcional de varias enzimas (Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:10747-10751; Crameri et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:4504-4509; y Crameri et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:436-438). También pueden realizarse estrategias de mutagénesis permutacional. Véase, por ejemplo, Solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/813.095, presentada el 13 de junio de 2006. Dichos procedimientos pueden realizarse, por ejemplo, en polinucleótidos que codifiquen polipéptidos que sean resistentes a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas.

35 En un método de hibridación, toda o parte de la secuencia de polinucleótido de resistencia a herbicida o una secuencia que codifica un dominio de la invención puede usarse para explorar bibliotecas de ADNc o genómicas. Se conocen en general en la técnica métodos para la construcción de dichas bibliotecas de ADNc y genómicas y se desvelan en Sambrook y Russell, 2001, mencionado anteriormente. Las llamadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos, y pueden marcarse con un grupo detectable tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Pueden realizarse sondas para hibridación marcando oligonucleótidos sintéticos basándose en la secuencia de nucleótidos que codifica resistencia a herbicida conocida divulgada en el presente documento. Pueden usarse adicionalmente cebadores degradados diseñados basándose en restos de aminoácidos o nucleótidos conservados en la secuencia de nucleótidos o secuencia de

45 aminoácidos codificada. La sonda típicamente comprende una región de secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200 o 1400 nucleótidos consecutivos del polinucleótido que codifica resistencia a herbicida de la invención o un fragmento o variante del mismo. Se conocen en general métodos para la preparación de sondas para hibridación en la técnica y se desvelan en Sambrook y Russell (2001) mencionado anteriormente, y Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.).

La hibridación de dichas secuencias puede llevarse a cabo en condiciones rigurosas. Por “condiciones rigurosas” o “condiciones de hibridación rigurosas” se entienden condiciones en las que una sonda hibridará con su secuencia

55 diana en un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces sobre el fondo). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Controlando la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, las secuencias diana que son 100% complementarias de la sonda pueden identificarse (exploración homóloga). Como alternativa, las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para permitir algunos emparejamientos erróneos en secuencias de modo que se detecten grados menores de similitud (exploración heteróloga). En general, una sonda es de menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, o menos de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.

Las condiciones rigurosas pueden ser en las que la concentración salina es menor de aproximadamente 1,5 M de ión Na, o aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de ión Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura 65 es al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 ºC para sondas cortas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). También pueden conseguirse

condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. Las condiciones de baja rigurosidad ejemplares incluyen hibridación con una solución de tampón de formamida del 30 al 35%, NaCl 1 M, SDS 1% (dodecil sulfato sódico) a 37 °C y un lavado en SSC 1X a 2X (SSC 20X = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) de 50 a 55 °C. Las condiciones de rigurosidad moderada ejemplares incluyen hibridación en formamida del 40 al

5 45%, NaCl 1,0 M, SDS 1% a 37 °C y un lavado en SSC 0,5 X a 1X de 55 a 60 °C. Las condiciones de alta rigurosidad ejemplares incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37 °C y un lavado en SSC 0,1 X de 60 a 65 °C. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden comprender SDS de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1%. La duración de la hibridación es generalmente menor de aproximadamente 24 horas, habitualmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad es típicamente la función de lavados post-hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de ADN-ADN, la Tm puede aproximarse a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) -0,61 (% form) -500/l; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de 15 guanosina y citosina en la secuencia polinucleotídica, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (con fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Tm se reduce en aproximadamente 1 ºC por cada 1% de emparejamiento erróneo; por lo tanto, la Tm,las condiciones de hibridación y/o de lavado pueden ajustarse para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con ≥ 90% de identidad, la Tm puede reducirse 10 ºC. En general, se seleccionan condiciones rigurosas para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones fuertemente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3, o 4 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm); las condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, 25 o 10 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm); las condiciones de rigurosidad baja pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm). Usando la ecuación, las condiciones de hibridación y lavado y la Tm deseada, los expertos habituales en la materia entenderán que se describen de forma inherente variaciones en la rigurosidad de soluciones de lavado y/o hibridación. Si el grado deseado de emparejamiento erróneo da como resultado una Tm de menos de 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida), la concentración de SSC puede aumentarse de modo que pueda usarse una temperatura mayor. Se encuentra una guía exhaustiva para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York). Véase Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory

35 Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

E. Proteínas aisladas y variantes y fragmentos de las mismas

También están abarcados dentro de la presente invención polipéptidos de resistencia a herbicidas. Un polipéptido de resistencia a herbicidas que está sustancialmente sin material celular incluye preparaciones de polipéptidos que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de polipéptido no de resistencia a herbicida (también denominado en el presente documento “proteína contaminante”). En la presente invención, “proteína de resistencia a herbicida” se entiende como un polipéptido que es resistente a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas. En algunas realizaciones, la proteína de resistencia a herbicida confiere resistencia al

45 glufosinato.

Por “variantes” se entienden proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 98% o 99% idéntica a SEC ID Nº: 2, donde uno o más aminoácidos correspondientes a las posiciones 125 a 175 y/o posiciones 200-250 de SEC ID Nº: 2 se han modificado de modo que el polipéptido sea resistente a inhibidor de glutamina sintetasa herbicida o donde uno o más aminoácidos se han modificado de modo que haya una pérdida de uno o más sitios de adenilación en el polipéptido resultante. Esta proteína puede alterarse de diversos modos incluyendo sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos e inserciones de uno o más aminoácidos de SEC ID Nº: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o 46, incluyendo hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5,

55 aproximadamente 6, aproximadamente 7 o aproximadamente 8 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. Un experto en la materia reconocerá que estos valores pueden ajustarse de forma apropiada para determinar la identidad correspondiente de polipéptidos codificados por dos polinucleótidos teniendo en cuenta la degeneración codónica, similitud de aminoácidos, posicionamiento en fase de lectura y similares. Las variantes de la invención tienen al menos 98% de identidad de secuencia con SEC ID Nº: 2, son resistentes a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y tienen actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2.

Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos conservativas en uno o más restos de aminoácidos no esenciales. Un resto de aminoácido “no esencial” es un resto que puede modificarse de la secuencia natural de un polipéptido sin alterar la actividad biológica, mientras que un resto de aminoácido “esencial” se requiere para la 65 actividad biológica. Una “sustitución de aminoácido conservativa” es una en la que el resto de aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de

restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina,

5 fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos en regiones no conservadas que conservan la función. En general, dichas sustituciones no se realizarán para restos de aminoácidos conservados o para restos de aminoácidos que residan dentro de un motivo conservado, donde dichos restos son esenciales para la actividad polipeptídica. Sin embargo, un experto en la materia entendería que las variantes funcionales pueden tener alteraciones o modificaciones conservadas o no conservadas menores en los restos conservados.

Las variantes también incluyen polipéptidos codificados por un polinucleótido que hibrida con el polinucleótido que codifica un polipéptido que es resistente a inhibidor de glutamina sintetasa herbicida, o un complemento del mismo,

15 en condiciones rigurosas. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a mutagénesis. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, conservan la actividad de resistencia a herbicida. Se conocen bien en la técnica métodos para medir la actividad de resistencia a herbicida. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 5.098.838 y 5.145.777.

Los genes bacterianos con mucha frecuencia poseen múltiples codones de inicio de metionina en proximidad al inicio de la fase abierta de lectura. Con frecuencia, el inicio de la traducción en uno o más de estos codones de partida conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de partida pueden incluir codones ATG. Sin embargo, bacterias tales como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como un codón de partida, y las

25 proteínas que inician la traducción en codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. Además, no se determina con frecuencia a priori cuáles de estos codones se usan de forma natural en la bacteria. Por lo tanto, se entiende que el uso de uno de los codones de metionina alternativos puede conducir a la generación de variantes que confieren resistencia a herbicidas. Estas proteínas de resistencia a herbicidas están abarcadas en la presente invención y pueden usarse en los métodos de la presente invención.

También se describen anticuerpos para los polipéptidos de la presente invención o para variantes o fragmentos de los mismos. Se conocen bien en la técnica métodos para producir anticuerpos (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York; Patente de Estados Unidos Nº 4.196.265).

F. Construcciones polinucleotídicas

Los polinucleótidos empleados en los métodos y composiciones de los descritos pueden modificarse para obtener o potenciar la expresión en células vegetales. Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención pueden proporcionarse en casetes de expresión para su expresión en la planta de interés. Un “casete de expresión vegetal” incluye una construcción de ADN que puede dar como resultado la expresión de un polinucleótido en una célula vegetal. El casete puede incluir en la dirección 5'-3' de transcripción, una región de inicio de la transcripción (es decir, promotor) unida operativamente con uno o más polinucleótidos de interés y una región de terminación de la traducción y la transcripción (es decir, región de terminación) funcional en plantas. El casete puede contener

45 adicionalmente al menos un polinucleótido adicional para introducir en el organismo, tal como un gen marcador seleccionable. Como alternativa, el polinucleótido o los polinucleótidos adicionales pueden proporcionarse en múltiples casetes de expresión. Dicho casete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción del polinucleótido o los polinucleótidos sea bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

“Heterólogo” generalmente se refiere al polinucleótido o polipéptido que no es endógeno para la célula o no es endógeno para la localización en el genoma nativo en el que está presente, y se ha añadido a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección o similares. Por “unido operativamente” se entiende un enlace funcional entre dos polinucleótidos. Por ejemplo, cuando un promotor está unido operativamente con una

55 secuencia de ADN, la secuencia promotora inicia y media en la transcripción de la secuencia de ADN. Se reconoce que los polinucleótidos unidos operativamente pueden ser o no contiguos y, cuando se usa para hacer referencia a la unión de dos regiones codificantes de polipéptidos, los polipéptidos se expresan en la misma fase de lectura.

El promotor puede ser cualquier secuencia polinucleotídica que muestre actividad transcripcional en la célula vegetal, partes vegetales o plantas seleccionadas. El promotor puede ser nativo o análogo, o ajeno o heterólogo, para el hospedador vegetal y/o a la secuencia de ADN de la invención. Cuando el promotor es “nativo” o “análogo” para el hospedador vegetal, se entiende que el promotor se encuentra en la planta nativa en la que se introduce el promotor. Cuando el promotor es “ajeno” o “heterólogo” para la secuencia de ADN de la invención, se entiende que el promotor no es el promotor nativo o de origen natural para la secuencia de ADN unida operativamente de la 65 invención. El promotor puede ser inducible o constitutivo. Puede ser de origen natural, puede estar compuesto de partes de diversos promotores de origen natural, o puede ser parcial o totalmente sintético. Se proporcionan

directrices para el diseño de promotores por estudios de la estructura del promotor, tales como el de Harley y Reynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15:2343-2361. Además, la localización del promotor en relación con el inicio de la transcripción puede optimizarse. Véase, por ejemplo, Roberts et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:760

764. Se conocen bien en la técnica muchos promotores adecuados para su uso en plantas.

5 Por ejemplo, los promotores constitutivos adecuados para uso en plantas incluyen: los promotores de virus vegetales, tales como el promotor de caulimovirus de bandas cloróticas de cacahuete (PClSV) (Patente de Estados Unidos Nº 5.850.019); el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); promotores de los genes de metiltransferasa de virus Chlorella (Patente de Estados Unidos Nº 5.563.328) y el promotor de transcrito de longitud completa de virus del mosaico de la Scrophularia (FMV) (Patente de Estados Unidos Nº 5.378.619); los promotores de dichos genes tales como actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol.. 12:619-632 y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); Histona H3 de maíz (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-285 y Atanassova et al.

15 (1992) Plant J. 2 (3):291-300); ALS3 de Brassica napus (solicitud de PCT WO 97/41228), y promotores de diversos genes de Agrobacterium (véase Patentes de Estados Unidos Nº 4.771.002; 5.102.796; 5.182.200 y 5.428.147).

Los promotores inducibles adecuados para su uso en plantas incluyen: el promotor del sistema ACE1 que responde a cobre (Mett et al. (1993) PNAS 90:4567-4571); el promotor del gen In2 de maíz que responde a protectores herbicidas de bencenosulfonamida (Hershey et al. (1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-237 y Gatz et al. (1994) Mol. Gen. Genetics 243:32-38); y el promotor del represor Tet de Tn10 (Gatz et al. (1991) Mol.Gen. Genet. 227:229-237). Otro promotor inducible para su uso en plantas es uno que responde a un agente inductor al que las plantas normalmente no responden. Un promotor inducible ejemplar de este tipo es el promotor inducible de un gen de hormona esteroidea, cuya actividad transcripcional se induce por una hormona glucocorticosteroide (Schena et al. 25 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421) o la aplicación reciente de un activador de la transcripción quimérico, XVE, para su uso en un sistema de expresión vegetal inducible basado en receptor de estrógenos activado por estradiol (Zuo et al. (2000) Plant J., 24:265-273). Otros promotores inducibles para su uso en plantas se describen en los documentos EP 332104, PCT WO 93/21334 y PCT WO 97/06269. También pueden usarse promotores compuestos de partes de otros promotores y promotores parcial o totalmente sintéticos. Véase, por ejemplo, Ni et al. (1995) Plant J. 7:661-676 y documento PCT WO 95/14098 que describen dichos promotores para su uso en plantas.

El promotor puede incluir, o modificarse para incluir, uno o más elementos potenciadores. En algunas realizaciones, el promotor puede incluir una pluralidad de elementos potenciadores. Los promotores que contienen elementos potenciadores proporcionan niveles mayores de transcripción en comparación con promotores que no los incluyen.

35 Los elementos potenciadores adecuados para uso en plantas incluyen el elemento potenciador PClSV (Patente de Estados Unidos Nº 5.850.019), el elemento potenciador 35S de CaMV (Patentes de Estados Unidos Nº 5.106.739 y 5.164.316) y el elemento potenciador FMV (Maiti et al. (1997) Transgenic Res. 6:143-156). Véase también el documento PCT WO 96/23898.

Con frecuencia, dichas construcciones pueden contener regiones no traducidas 5' y 3'. Dichas construcciones pueden contener una “secuencia señal” o “secuencia líder” para facilitar el transporte co-traduccional o posttraduccional del péptido de interés a ciertas estructuras intracelulares tales como el cloroplasto (u otro plástido), retículo endoplásmico, o aparato de Golgi, o para que se secrete. Por ejemplo, la construcción puede modificarse por ingeniería genética para contener un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo

45 endoplásmico. Por “secuencia señal” se entiende una secuencia que se sabe o se sospecha que da como resultado transporte del péptido co-traduccional o post-traduccional a través de la membrana celular. En eucariotas, esto implica típicamente secreción al aparato de Golgi, con algo de glicosilación resultante. Por “secuencia líder” se entiende cualquier secuencia que, cuando se traduzca, dé como resultado una secuencia de aminoácidos suficiente para desencadenar el transporte co-traduccional de la cadena peptídica a un orgánulo subcelular. Por lo tanto, este incluye secuencias líderes que se dirigen al transporte y/o glicosilación por pase al retículo endoplásmico, pase a vacuolas, plástidos incluyendo cloroplastos, mitocondrias y similares. También puede ser preferible modificar por ingeniería genética el casete de expresión vegetal para que contenga un intrón, de modo que se requiere procesamiento de ARNm del intrón para su expresión.

55 Por “región no traducida 3’” se entiende un polinucleótido localizado cadena abajo de una secuencia codificante. Las secuencias señal de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar a la adición de tramos de ácido poliadenílico al extremo 3’ del precursor de ARNm son regiones no traducidas 3’. Por “región no traducida 5’” se entiende un polinucleótido localizado cadena arriba de una secuencia codificante.

Otros elementos no traducidos cadena arriba o cadena abajo incluyen potenciadores. Los potenciadores son polinucleótidos que actúan para aumentar la expresión de una región promotora. Los potenciadores se conocen bien en la técnica e incluyen, pero sin limitación, la región potenciadora SV40 y el elemento potenciador 35S.

La región de terminación puede ser nativa con la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa con la

65 secuencia de la presente invención o puede derivar de otra fuente. Están disponibles regiones de terminación convenientes del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Véase también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.

5 En un aspecto de la invención, se diseñan secuencias de ADN sintéticas para un polipéptido dado, tales como los polipéptidos de la invención. La expresión de la fase abierta de lectura de la secuencia de ADN sintética en una célula da como resultado producción del polipéptido de la invención. Las secuencias de ADN sintéticas pueden ser útiles para retirar simplemente sitios de endonucleasas de restricción no deseados, para facilitar estrategias de clonación de ADN, para alterar o retirar cualquier preferencia codónica potencial, para alterar o mejorar el contenido de GC, para retirar o alterar las fases de lectura alternativas y/o para alterar o retirar sitios de reconocimiento de corte y empalme de intrones/exones, sitios de poliadenilación, secuencias Shine-Delgarno, elementos promotores no deseados y similares que pueden estar presentes en una secuencia de ADN nativa. También es posible que puedan utilizarse secuencias de ADN sintéticas para introducir otras mejoras en una secuencia de ADN, tales como la

15 introducción de una secuencia de intrones, creación de una secuencia de ADN que se exprese como una proteína de fusión con secuencias de dirección a orgánulos, tales como péptidos de tránsito de cloroplastos, péptidos de dirección de apoplastos/vacuolares, o secuencias peptídicas que den como resultado la retención del péptido resultante en el retículo endoplásmico. También pueden sintetizarse genes sintéticos usando codones preferidos para células hospedadoras para expresión mejorada, o pueden sintetizarse usando codones en una frecuencia de uso codónico preferido para el hospedador. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11; Patentes de Estados Unidos Nº 6.320.100; 6.075.185; 5.380.831; y 5.436.391, Solicitud Publicada de Estados Unidos Nº 20040005600 y 20010003849 y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498.

En una realización, los polinucleótidos de interés se dirigen al cloroplasto para expresión. De esta manera, cuando el

25 polinucleótido de interés no se inserta directamente en el cloroplasto, el casete de expresión contendrá adicionalmente un polinucleótido que codifica un péptido de tránsito para dirigir el núcleo de interés a los cloroplastos. Dichos péptidos de tránsito se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233: 478-481.

Los polinucleótidos de interés para dirigir al cloroplasto pueden optimizarse con respecto a expresión en el cloroplasto para explicar las diferencias en el uso codónico entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De esta manera, los polinucleótidos de interés pueden sintetizarse usando codones preferidos por cloroplastos. Véase, por

35 ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 5.380.831.

Este casete de expresión vegetal puede insertarse en un vector de transformación de plantas. Por “vector de transformación” se entiende una molécula de ADN que permite la transformación de una célula. Dicha molécula puede consistir en uno o más casetes de expresión, y puede organizarse en más de una molécula de ADN de vector. Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación de plantas que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones de actuación en cis y trans requeridas para transformación de células vegetales (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5: 446-451). “Vector” se refiere a una construcción polinucleotídica diseñada para transferirse entre diferentes células hospedadoras. “Vector de expresión” se refiere a un vector que tiene la capacidad para incorporar, integrar y expresar secuencias de ADN

45 heterólogas o fragmentos en una célula ajena.

El vector de transformación de plantas comprende uno o más vectores de ADN para conseguir la transformación de plantas. Por ejemplo, es una práctica habitual en la técnica utilizar vectores de transformación de plantas que comprenden más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores se denominan con frecuencia en la técnica vectores binarios. Se usan más frecuentemente vectores binarios así como vectores con plásmidos auxiliares para transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y complejidad de los fragmentos de ADN necesarios para conseguir transformación eficaz es bastante grande, y es ventajoso separar funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios típicamente contienen un vector plasmídico que contiene las secuencias de actuación en cis requeridas para transferencia de ADN-T (tales como límite izquierdo y límite derecho), un marcador 55 seleccionable que se modifica por ingeniería genética para poder expresarse en una célula vegetal y un “polinucleótido de interés” (un polinucleótido modificado por ingeniería genética para poder expresarse en una célula vegetal para la que se desea generación de plantas transgénicas). También están presentes en este vector plasmídico secuencias requeridas para la replicación bacteriana. Las secuencias de actuación en cis se disponen de una manera que permita la transferencia eficaz en células vegetales y expresión en las mismas. Por ejemplo, la secuencia marcadora seleccionable y la secuencia de interés se localizan entre los límites izquierdo y derecho. Con frecuencia un segundo vector plasmídico contiene los factores de actuación en trans que median en la transferencia de ADN-T de Agrobacterium a células vegetales. Este plásmido con frecuencia contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten infección de células vegetales por Agrobacterium, y transferencia de ADN por escisión en secuencias límite y transferencia de ADN mediada por Vir, como se entiende en la técnica (Hellens y Mullineaux 65 (2000) Trends in Plant Science, 5: 446-451). Pueden usarse varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para transformación de plantas. El segundo vector plasmídico no es

necesario para la introducción de polinucleótidos en plantas por otros métodos tales como microproyeción, microinyeción, electroporación, polietilenglicol, etc.

G. Expresión de genes de tolerancia a herbicidas y tolerancia a insectos.

5 Las plantas tolerantes de inhibidores de glutamina sintetasa descritos en el presente documento pueden mostrar además resistencia o tolerancia a uno más herbicidas (además de inhibidores de GS) y/o una o más plagas tales como insectos, nematodos u hongos. En algunas realizaciones, una o más de las plantas descritas en el presente documento muestran tolerancia o resistencia a uno o más herbicidas además de inhibidores de GS. Están

10 disponibles varios genes, tanto transgénicos como no transgénicos, que confieren resistencia a herbicidas. Los genes que confieren resistencia a un herbicida que inhibe el punto de crecimiento o meristemo, tales como una imidazolinona o una sulfonilurea pueden ser adecuados. Genes ejemplares en esta categoría codifican las enzimas ALS y AHAS mutantes como se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.767.366 y 5.928.937. Las patentes de Estados Unidos Nº 4.761.373 y 5.013.659 se dirigen a plantas resistentes a diversos herbicidas de

15 imidazolinona o sulfonamida.

Son particularmente útiles en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento genes para resistencia a glifosato, tales como genes de EPSP sintasa de resistencia a glifosato. Véase, por ejemplo, Solicitudes de Patente de Estados Unidos Nº 11/500.718, 11/185.342, 11/185.560, 11/315.678, 11/312.866, 11/400.598,

20 11/605,824, y 11/651,752, Patente de Estados Unidos Nº 4.940.835 y Patente de Estados Unidos Nº 4.769.061. La Patente de Estados Unidos Nº 5.554.798 divulga plantas de maíz resistentes a glifosato transgénico, cuya resistencia está conferida por un gen de 5-enolpiruvil-3-fosfosiquimato (EPSP) sintasa alterado.

También son adecuados genes para resistencia a compuestos fosfono tales como glufosinato de amonio o

25 fosfinotricina y ácidos piridinoxi o fenoxi propiónicos y ciclohexonas. Véase Solicitud Europea Nº 0 242 246. Véase también, Patentes de Estados Unidos Nº 5.879.903, 5.276.268 y 5.561.236. Otros herbicidas adecuados incluyen los que inhiben la fotosíntesis, tales como una triazina y un benzonitrilo (nitrilasa) (véase Patente de Estados Unidos Nº 4.810.648) así como herbicidas tales como ácido 2,2-dicloropropiónico, setoxidim, haloxifop, herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfonilurea, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de s-triacina y bromixinilo.

30 Las proteínas insecticidas útiles para la invención pueden expresarse en una o más plantas divulgadas en el presente documento. Los genes útiles para resistencia a insectos o plagas incluyen, por ejemplo, genes de endotoxina que codifican toxinas identificadas en organismos de Bacillus. Se han clonado genes que codifican toxinas de Bacillus thuringiensis (Bt) de varias subespecies y se han descubierto que los clones recombinantes son

35 tóxicos para larvas de insectos lepidópteros, dípteros y coleópteros. Véase, por ejemplo, Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 10/782.020, 10/782.141, 10/782.570, 10/783.417, 10/781.979, 10/782.096, 10/926.819 y 11/343.533. Diversos otros genes de delta-endotoxina tales como Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1Ea, Cry1Fa, Cry3A, Cry9A, Cry9C y Cry9B; así como genes que codifican proteínas insecticidas vegetativas tales como Vip1, Vip2 y Vip3, también son útiles en los métodos y composiciones divulgados en el presente

40 documento. Puede encontrase una lista completa de toxinas de Bt en internet en www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/.

H. Plantas y partes de plantas

45 Por “planta” se entiende plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y descendencia de los mismos. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o indiferenciadas (por ejemplo, callos, células en cultivo en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíces, células del floema, polen). La presente invención puede usarse para introducción de polinucleótidos en cualquier especie vegetal, incluyendo, pero sin limitación, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los

50 ejemplos de plantas de interés incluyen, pero sin limitación, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza. Brassica sp., alfalfa, centeno, cártamo, cacahuetes, boniato, mandioca, café, coco, piña, árboles de cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, oliva, papaya, anacardo, macadamia, almendra, avena, verduras, ornamentales y coníferas.

55 Las verduras incluyen, pero sin limitación, tomates, lechuga, judías verdes, alubias de Lima, guisantes y miembros del género Curcumis tales como pepino, cantalupo y melón. Las ornamentales incluyen, pero sin limitación, azalea, hortensia, hibiscos, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, flor de Pascua y crisantemo. Las plantas de cultivo también son de interés, incluyendo, por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza, etc.

60 La presente invención es adecuada para cualquier miembro de la familia de plantas monocotiledóneas incluyendo, pero sin limitación, maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, piña, ñames, cebolla, plátano, coco y dátiles.

II.

Métodos

A.

Métodos para aumentar propiedades agrícolamente importantes en plantas

5 También se proporcionan métodos para mejorar propiedades vegetales agrícolamente importantes. Los métodos comprenden introducir en una planta o célula vegetal una secuencia de nucleótidos que codifique una enzima glutamina sintetasa derivada de bacterias. Por “enzima glutamina sintetasa derivada de bacterias” se entiende una enzima glutamina sintetasa aislada de una bacteria, o una variante biológicamente activa o fragmento de la misma. La secuencia de nucleótidos comprende una variante de SEC ID Nº 1, donde el polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº 1, que codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº 2. En otra realización, la secuencia de nucleótidos comprende un polinucleótido que tiene al menos una modificación entre los aminoácidos 125 a 175, al menos una modificación entre los aminoácidos 200 a 250 correspondientes a SEC ID Nº 2 o al menos una modificación que da como resultado la pérdida de uno o más sitios de adenilación. En otra realización, el

15 polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 o 47. La expresión de estas enzimas en una planta da como resultado potenciación de las capacidades de utilización y/o asimilación de nitrógeno de la planta, así como características agrícolas mejoradas tales como rendimiento vegetal.

Como se define en el presente documento, el “rendimiento” de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. Por “biomasa” se entiende cualquier producto vegetal medido. Un aumento de la producción de biomasa es cualquier mejora de la producción del producto vegetal medido. El método comprende introducir en una planta de interés un polinucleótido que codifique una enzima glutamina sintetasa derivada de bacterias. En una realización, la enzima glutamina sintetasa es resistente a inhibidor de glutamina sintetasa

25 herbicida, aunque la resistencia no es necesaria para conseguir propiedades agrícolas potenciadas. En otra realización, la enzima glutamina sintetasa ha aumentado la actividad enzimática en relación con una enzima glutamina sintetasa de control como se define posteriormente.

Aunque sin quedar ligado a ninguna teoría o mecanismo particular, la expresión de una enzima glutamina sintetasa derivada de bacterias en una planta puede conducir a actividad potenciada (dando como resultado utilización de nitrógeno y/o rendimiento potenciado) en comparación con una glutamina sintetasa derivada de planta (incluyendo la glutamina sintetasa endógena en la que se expresa de forma heteróloga la sintetasa derivada de bacterias) debido a diferentes mecanismos reguladores para la GS bacteriana en comparación con la GS vegetal. La actividad enzimática de enzimas GS bacterianas está regulada de una manera que es diferente a la de las enzimas GS

35 vegetales (Moorhead y Smith (2003) Plant Physiol 133: 492-498). En sistemas bacterianos, el estado del nitrógeno en la célula se detecta por la proteína PII. En condiciones de alto nitrógeno, PII inicia una cascada de señales que provoca la adenilación de subunidades individuales de enzimas GS bacterianas. La adenilación de GS bacteriana provoca una reducción de la actividad enzimática. Por lo tanto, la actividad enzimática de enzimas GS bacterianas puede modularse por el grado de adenilación del dodecámero de GS. Por el contrario, puesto que las plantas no poseen una cascada de señales de PII análoga, es poco probable que las células vegetales provoquen adenilación de una enzima GS bacteriana.

El desarrollo de variedades vegetales que usen nitrógeno más eficazmente reducirá la necesidad de aportaciones excesivas de nitrógeno, ahorrará costes de producción para los granjeros, beneficiará a los granjeros de países en

45 desarrollo que no tengan acceso a aportaciones de fertilizantes y reducirá la polución asociada con la aplicación de fertilizantes de nitrógeno excesivos. Adicionalmente, proporcionar plantas con rendimiento mejorado como resultado de una actividad glutamina sintetasa mejorada tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, aumentar la biomasa de hojas de plantas puede aumentar el rendimiento de hortalizas de hojas para consumo humano o animal. Además, el aumento de la biomasa de hojas puede usarse para aumentar la producción de productos industriales o farmacéuticos derivados de plantas.

Las plantas que expresan una glutamina sintetasa derivada de bacterias pueden mostrar contenidos de nitrógeno mejorados, composiciones de aminoácidos o proteínas alteradas, características de crecimiento vigoroso, rendimientos vegetativos aumentados o mejores rendimientos de semillas y calidades. Estas plantas pueden 55 identificarse examinando cualquiera de los siguientes parámetros: 1) la tasa de crecimiento, medida con respecto a la tasa de aumento de peso seco o húmedo; 2) rendimiento vegetativo de la planta madura, con respecto a peso seco o húmedo; 3) el rendimiento de fruto o semilla; 4) el peso del fruto o semilla; 5) el contenido en nitrógeno total de la planta; 6) el contenido de nitrógeno total del fruto o semilla; 7) el contenido de aminoácidos libres de la planta; 8) el contenido de aminoácidos libres del fruto o semilla; 9) el contenido de proteína total de la planta y 10) el contenido de proteína total del fruto o semilla. Los procedimientos y métodos para examinar estos parámetros se conocen bien por los expertos en la materia. Estos métodos pueden implicar ensayos enzimáticos e inmunoensayos para medir niveles de proteínas/enzimas; ensayos para medir la composición de aminoácidos, grupo de aminoácidos libres o contenido en nitrógeno total de diversos tejidos vegetales; medición de las tasas de crecimiento con respecto a aumento de peso en fresco a lo largo del tiempo; o medición del rendimiento vegetal con respecto a peso seco y/o

65 peso de la semilla total.

La medición puede ser in vitro en una célula que exprese la enzima glutamina sintetasa o en material vegetal recogido de una planta que exprese la enzima, o puede ser in vivo en una planta que exprese la enzima. La exploración puede realizarse en condiciones de deficiencia de nitrógeno o en condiciones no limitantes de nitrógeno. Las condiciones de nitrógeno se describen con respecto al nutriente de nitrógeno disponible. Las condiciones

5 deficientes de nitrógeno incluyen las que provocan que el crecimiento de una planta de control se detenga o disminuya de tal modo que se reduzca significativamente el tamaño o calidad de la planta de control. Las condiciones no limitantes de nitrógeno incluyen las que tienen suficientes cantidades de nutrientes de nitrógeno para mantener el crecimiento vegetal sano. Se conocen en la técnica condiciones de nitrógeno que constituyen no limitantes o deficientes para la mayoría, sino todas, las variedades vegetales de interés. Pueden encontrase directrices adicionales en, por ejemplo, Hewitt (1966) Sand and Water Culture Methods Used in the Study of Plant Nutrition, 2ª ed., Farnham Royal (Bucks), Commonwealth Agricultural Bureaux; y, Hewitt (1975) Plant Mineral Nutrition, Londres, English University Press.

Para los fines de la presente invención, una mejora de cualquiera de las características anteriores es en relación con

15 una planta o célula vegetal de control cultivada en condiciones similares. Una planta o célula vegetal de “control” es una que exprese una enzima glutamina sintetasa que no sea una glutamina sintetasa derivada de bacterias. Una mejora de cualquiera de estos parámetros puede comprender cualquier aumento incluyendo, pero sin limitación, al menos un aumento del 1%, al menos un aumento del 3%, al menos un aumento del 5%, al menos un aumento del 10%, al menos un aumento del 20%, al menos un 30%, al menos un 50%, al menos un 70%, al menos un 100% o mayor aumento en uno o más de estos parámetros.

En diversas realizaciones, la enzima GS derivada de bacterias tiene actividad enzimática mejorada en comparación con otras enzimas glutamina sintetasa derivadas de bacterias o plantas. Una enzima glutamina sintetasa con actividad mejorada es una con actividad por encima mayor que la enzima AGS1 divulgada en el presente documento

25 como SEC ID Nº 2. En algunas realizaciones, la enzima GS derivada de bacterias tiene actividad mejorada debido a una mutación funcional en la enzima, en lugar de sobre-expresión de la enzima en un sistema. La actividad puede medirse por cualquier método conocido en la técnica. A no ser que se especifique de otro modo, la enzima glutamina sintetasa derivada de bacterias con actividad mejorada es una que tiene actividad mejorada en comparación con la actividad de la misma o sustancialmente la misma concentración de SEC ID Nº 2 cuando se expresa en un sistema bacteriano (por ejemplo, en E. coli).

B. Transformación de plantas

Los métodos de la invención implican introducir uno o más polinucleótidos en una planta. Por “introducir” se entiende

35 presentar a la planta el polinucleótido de tal manera que el polinucleótido consiga acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren que se use un método particular para introducir un polinucleótido en una planta, solamente que el polinucleótido consiga acceso al interior de al menos una célula de la planta.

La introducción de un polinucleótido en células vegetales se consigue por una de varias técnicas conocidas en este campo, incluyendo pero sin limitación electroporación o transformación química (véase, por ejemplo, Ausubel, ed. (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., Indianapolis, IN)). Los marcadores que confieren resistencia a sustancias tóxicas son útiles en la identificación de células transformadas (que han captado y expresado la secuencia polinucleotídica de ensayo) de células no transformadas (las que no contienen o no expresan la secuencia polinucleotídica de ensayo). En un aspecto de la invención, las secuencias polinucleotídicas

45 divulgadas en el presente documento son útiles como un marcador para evaluar la introducción de ADN en células vegetales. Se conocen bien en la técnica métodos para detectar la presencia de un transgén en una planta, órgano vegetal (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semilla, célula vegetal, propágulo, embrión o descendencia de los mismos. “Plantas transgénicas” o “plantas transformadas” o plantas, células, tejidos o semillas “transformados de forma estable” se refieren a plantas que han incorporado o integrado polinucleótidos exógenos en la célula vegetal. Por “transformación estable” se entiende que la construcción polinucleotídica introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y puede heredarse por la descendencia de la misma.

En general, los métodos de transformación de plantas implican transferir ADN heterólogo a células vegetales diana (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos de suspensión, callos indiferenciados, protoplastos, etc.), 55 seguido de la aplicación de un nivel umbral máximo de selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa celular no transformada. Se transfieren típicamente explantes a un aporte nuevo del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Posteriormente, las células transformadas se diferencian en brotes después de situarlas en medio de regeneración complementado con un nivel de umbral máximo de agente selector (es decir, herbicida). Los brotes se transfieren después a un medio de enraizamiento selectivo para recuperar brote enraizado o plántula. La plántula transgénica después se cultiva hasta plantas maduras y produce semillas fértiles (por ejemplo, Hiei et al. (1994) Plant J. 6:271282; Ishida et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 745-750). Se encuentra una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas transgénicas en Ayres y Park (1994) CRC Crit. Rev. Plant Sci. 13: 219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120. Puesto que el material transformado contiene muchas células, 65 están presentes células tanto transformadas como no transformadas en cualquier trozo de callo, tejido o grupo de células objeto. La capacidad para matar células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen

da como resultado cultivos vegetales transformados. Con frecuencia, la capacidad para retirar células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de células vegetales transformadas y generación exitosa de plantas transgénicas. Pueden usarse métodos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del polinucleótido o los polinucleótidos de interés integrados en el genoma de plantas transgénicas.

5 La generación de plantas transgénicas puede realizarse por uno de varios métodos, incluyendo pero sin limitación la introducción de ADN heterólogo por Agrobacterium en células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células vegetales con ADN ajeno heterólogo adherido a partículas y diversos otros métodos mediados de forma directa sin partículas (por ejemplo, Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271-282; Ishida et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 745-750; Ayres y Park (1994) CRC Crit. Rev. Plant Sci. 13: 219-239; Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120) para transferir ADN.

Existen tres métodos habituales para transformar células vegetales con Agrobacterium. El primer método es cultivo de Agrobacterium con protoplastos aislados cultivados. Este método requiere un sistema de cultivo establecido que

15 permita cultivar protoplastos y regeneración vegetal a partir de protoplastos cultivados. El segundo método es transformación de células o tejidos con Agrobacterium. Este método requiere (a) que las células o tejidos vegetales puedan transformarse por Agrobacterium y (b) que las células o tejidos transformados puedan inducirse para regenerar plantas completas. El tercer método es la transformación de semillas, ápices o meristemos con Agrobacterium. Este método requiere micropropagación.

La eficacia de transformación por Agrobacterium puede potenciarse usando varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se ha mostrado que la inclusión de una molécula de respuesta a herida natural tal como acetosiringona (AS) en el cultivo de Agrobacterium potencia la eficacia de transformación con Agrobacterium tumefaciens (Shahla et al. (1987) Plant Molec. Biol. 8: 291-298). Como alternativa, la eficacia de transformación puede potenciarse

25 hiriendo el tejido diana para transformar. La herida de tejido vegetal puede conseguirse, por ejemplo, por perforación, maceración, bombardeo con microproyectiles, etc. Véase, por ejemplo, Bidney et al. (1992) Plant Molec. Biol. 18: 301-313.

En más realizaciones adicionales, las células vegetales se transfectan con vectores mediante bombardeo de partículas (es decir, con una pistola génica). Se conocen en la técnica métodos de transferencia génica mediados por partículas, están disponibles en el mercado e incluyen, pero sin limitación, el instrumento de suministro génico impulsado por gas descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.584.807. Este método implica usar la secuencia polinucleotídica de interés para revestir partículas de metales pesados y acelerar las partículas recubiertas bajo la presión del gas comprimido para suministro al tejido diana.

35 Otros métodos de bombardeo de partículas también están disponibles para la introducción de secuencia polinucleotídica heteróloga en células vegetales. En general, estos métodos implican depositar la secuencia polinucleotídica de interés sobre la superficie de partículas pequeñas, densas de un material tal como oro, platino o tungsteno. Las partículas recubiertas se usan a su vez para recubrir después una superficie rígida, tal como una placa metálica, o una lámina transportadora compuesta de un material frágil tal como mylar. La lámina recubierta se acelera después hacia el tejido biológico diana. El uso de la lámina plana genera una propagación uniforme de las partículas aceleradas que maximiza el número de células que reciben partículas en condiciones uniformes, dando como resultado la introducción de la muestra polinucleotídica en el tejido diana.

45 También pueden usarse señales de inicio específicas para conseguir traducción más eficaz de secuencias que codifican el polipéptido de interés. Dichas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. En casos en los que se insertan secuencias que codifican el polipéptido de interés, su codón de inicio y secuencias cadena arriba en el vector de expresión apropiado, pueden no necesitarse señales de control de la traducción o la transcripción adicionales. Sin embargo, en casos en los que se inserta solamente la secuencia codificante, o una parte de la misma, deberían proporcionarse señales de control de la traducción exógenas, incluyendo el codón de inicio ATG. Además, el codón de inicio debería estar en la fase de lectura correcta para asegurar la traducción del inserto completo. Los elementos traduccionales exógenos y codones de inicio pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores que sean apropiados para el sistema de células particular que se use, tal como los descritos en la

55 bibliografía (Scharf et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125).

Pueden cultivarse células que se han transformado con un polinucleótido que codifique un dominio polipeptídico de la invención hasta obtener plantas de acuerdo con medios convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Rep. 5: 81-84. Estas plantas pueden después cultivarse y polinizarse con la misma cepa transformada o cepas diferentes, e identificarse el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantenga de forma estable y se herede y después se recojan las semillas para asegurar que se ha conseguido expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona semillas transformadas (también denominadas “semillas transgénicas”) que tienen un

65 polinucleótido de acuerdo con un dominio polipeptídico de la invención, por ejemplo, un casete de expresión de la invención, incorporado de forma estable en su genoma.

C. Evaluación de la transformación de plantas

Después de la introducción de ADN en células vegetales, la transformación e integración del polinucleótido en el genoma de la planta se confirma por diversos métodos tales como análisis de polinucleótidos, polipéptidos y 5 metabolitos asociados con la secuencia integrada.

El análisis por PCR es un método rápido para explorar células, tejido o brotes con respecto a la presencia de gen incorporado en el estadio más temprano antes de trasplantar al suelo (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)). Se lleva a cabo PCR usando cebadores oligonucleotídicos específicos del nucleótido de interés o fondo de vector de Agrobacterium, etc.

La introducción de ADN puede confirmarse por análisis de transferencia de Southern de ADN genómico (Sambrook y Russell (2001) mencionado anteriormente). En general, se extrae ADN total de la célula u organismo, se digiere con enzimas de restricción apropiadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una membrana de

15 nitrocelulosa o nylon. La membrana o “mancha de transferencia” se explora después, por ejemplo, con fragmento de ADN diana 32P radiomarcado para confirmar la integración de ADN introducido en el genoma vegetal de acuerdo con técnicas convencionales (Sambrook y Russell (2001) mencionado anteriormente).

En análisis de Northern, se aísla ARN de tejidos específicos de la célula u organismo, se fracciona en un gel de agarosa de formaldehído y se transfiere a un filtro de nylon de acuerdo con procedimientos convencionales que se usan de forma rutinaria en la técnica (Sambrook y Russell (2001) mencionado anteriormente). La expresión de ARN codificado por el polinucleótido de la presente invención se ensaya después hibridando el filtro con una sonda radiactiva derivada de la secuencia de interés por métodos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell (2001) mencionado anteriormente).

25 Pueden llevarse a cabo transferencia de Western, ensayos bioquímicos y similares en las plantas transgénicas para determinar la presencia de un polipéptido o polipéptidos codificados por el polinucleótido o los polinucleótidos de interés por procedimientos convencionales (Sambrook y Russell (2001) mencionado anteriormente) usando anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en el polipéptido de resistencia a herbicida.

D. Métodos para combatir de forma selectiva malas hierbas en un campo de cultivo

También se proporcionan métodos para combatir de forma selectiva malas hierbas en un campo que contiene una planta. En una realización, las semillas vegetales o plantas son resistentes a inhibidores de glutamina sintetasa

35 herbicidas como resultado de que se inserte un polinucleótido de la presente invención en la semilla vegetal o planta. En métodos específicos, la planta se trata con una concentración eficaz de un herbicida, donde la aplicación de herbicida da como resultado un control selectivo de malas hierbas u otras plantas no transformadas. Por “concentración eficaz” se entiende la concentración que combate el crecimiento o proliferación de malas hierbas u otras plantas no transformadas sin afectar significativamente a la semilla vegetal o planta resistente a herbicida. Por lo tanto, la cantidad puede ser suficientemente pequeña para simplemente retardar o suprimir el crecimiento o desarrollo, o la cantidad puede ser suficientemente grande para destruir de forma irreversible la planta sensible. Dichas concentraciones eficaces para herbicidas de interés se conocen generalmente en la técnica. El herbicida puede aplicarse bien antes o bien después de la emergencia de acuerdo con técnicas habituales para aplicación de herbicidas a campos que comprenden plantas o semillas vegetales que se han hecho resistentes al herbicida.

45 Los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustración y no como limitación.

Experimental

Ejemplo 1. Cepa resistente a glufosinato

Se aisló una cepa bacteriana resistente a glufosinato (ATX 20345) de una muestra de suelo mediante una suspensión de suelo colocando aproximadamente 0,01 gramos de suelo en 500 ∀l de agua estéril. La suspensión de suelo se agitó con vórtex y se usaron 20 ∀l para inocular un cultivo de medio mínimo de 2,5 ml complementado con 55 glufosinato 5 mM (Riedel-de Haën, disponible a través de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). El medio mínimo contiene los siguientes ingredientes (por 1 litro): 10 gramos de sacarosa, 1 ml de MugSO4 0.8 M, 1 ml de CaCl2 0,1 M, 1 ml de oligoelementos, 2,38 gramos de KH2PO4, 5,64 gramos de K2HPO4. El pH se ajusta a 7,0, y la solución se esteriliza con un filtro de 0,2 ∀m. Los oligoelementos consisten en (por 100 ml) 0,1 g de FeSO4·7H2O, 0,5 mg de CuSO4·5H2O, 1,0 mg de H3BO3, 1,0 mg de MnSO4·5H2O, 7,0 mg de ZnSO4·7H2O, 1,0 mg de MoO3, 4,0 g de KCl. No se proporcionó ninguna fuente de nitrógeno adicional en el medio. Los cultivos se dejaron crecer a 21 ºC en un agitador rotatorio durante 3 días, después se transfirieron a medio mínimo nuevo que contenía glufosinato 5 mM y se incubaron a 21 ºC. Después de 2 días, los cultivos se usaron para inocular medio mínimo medio nuevo con glufosinato 5 mM. Después de 2 días, los cultivos se sembraron en placas de agar Luria Bertani (LB) y después se conformaron para aislamiento. ATX20345 se seleccionó por su capacidad para crecer en presencia de glufosinato 5 65 mM. Las colonias en agar LB son rojo rosado, elevadas, circulares y de 1-2 mm de diámetro. ATX20345 se tipificó por análisis de ácidos grasos (como se conoce en la técnica) y se determinó que era una cepa de Serratia

marcescens.

ATX 20345 fue capaz de crecer hasta densidad óptica alta en presencia de glufosinato en las condiciones descritas anteriormente, pero fue incapaz de crecer en las mismas condiciones en ausencia de glufosinato. Estos datos 5 sugieren que el glufosinato está proporcionando nitrógeno a la bacteria, por medio de una escisión de glufosinato para liberar una forma utilizable de nitrógeno o mediante la complementación de amonio en el complejo de glufosinato-amonio proporcionado por el proveedor. El reemplazo de glufosinato con cloruro de amonio como fuente de nitrógeno, sin embargo, permite el crecimiento, lo que sugiere que el amonio es una fuente de nitrógeno adecuada para la cepa. A concentraciones mayores (5-50 mM), ATX 20345 crece bien hasta 50 mM y, de hecho,

10 parece crecer mejor a medida que la concentración de glufosinato aumenta de glufosinato 5 mM hasta 50 mM. El crecimiento por encima de 50 mM no se ensayó.

Ejemplo 2. Clonación de una glutamina sintasa de ATX 20345

15 Para obtener el gen o los genes responsables de la resistencia de la cepa a glufosinato, se preparó una biblioteca genómica de plásmidos de inserto pequeños a partir de la cepa de ATX 20345. Se extrajo ADN genómico de un cultivo en LB de una noche, nuevo, usando SDS, lisis de células con proteinasa K seguido de extracciones con fenol-cloroformo, CTAB/NaCl. Se realizaron digestiones parciales en el ADN genómico usando 0,1 unidades de Sau3A I a 37 ºC durante 30 minutos seguido de la adición de EDTA e incubación a 65 ºC durante 20 minutos para

20 detener la reacción. El ADN resultante fue de aproximadamente 4-12 kb de tamaño. El ADN se purificó en gel, se trató con polinucleótido quinasa T4, después se ligó en vector pUC 18 digerido con BamH I. Las ligaciones se transformaron en DH5a y se sembraron directamente en placas de medio mínimo M63 que contenían glufosinato 20 mM, carbenicilina 100 ∀g/ml e IPTG 0,1 mM. Después de varios días, habían aparecido 4 colonias, llamadas provisionalmente TKH1-4. Se dejaron crecer y se aisló ADN plasmídico y se analizó por digestión con EcoR I+ Hind

25 IIIy Pst I/ Sac I para comparar insertos. Aunque los cuatros clones contenían insertos, TKH2 y TKH3 fueron idénticos por análisis de digestión de restricción y ambos contenían insertos de aproximadamente 4,9 kb.

Para determinar si cualquiera de los cuatro clones codificaba una glutamina sintetasa, todos se transformaron en la línea celular glnA-M5004 (E. coli Genetic Stock Center Nº 5531, Mayer (1975) Mol. Gen. Genet. 137: 131-142), junto

30 con el vector de control pUC18 y se sembraron en placas con LB/carbenicilina. Las colonias resultantes para cada uno se aplicaron a placas mínimas M63 con o sin la adición de glutamina. En ausencia de glutamina solamente deberían crecer clones que contuvieran una glutamina sintetasa funcional. TKH2 y TKH3 rescataron el fenotipo glnA, mientras que TKH1 y TKH4 no (Tabla 1). La capacidad de TKH2 y TKH3 para rescatar completamente el fenotipo glnA-demuestra que cada uno de ellos contiene una glutamina sintetasa funcional.

35 Tabla 1. Complementación de fenotipo glnA-por TKH2 y TKH3

Crecimiento en células glnA-

Glutamina añadida

Sin glutamina

TKH1

+++ -

TKH2

+++ +++

TKH3

+++ +++

TKH4

+++ -

Para reconfirmar que TKH2 y TKH3 confieren resistencia a glufosinato 20 mM, los plásmidos purificados se retransformaron en células DH5#. pUC18 se volvió a transformar como un control negativo. Las mezclas de

40 transformación se sembraron directamente en placas mínimas M63 con y sin glufosinato 20 mM. Aunque pUC18, TKH2 y TKH3 crecieron cada uno en ausencia de glufosinato, solo TKH2 y TKH3 crecieron en presencia de glufosinato.

La secuenciación del ADN plasmídico de TKH2 y TKH3 con los cebadores M13 directo y M13 inverso, y el análisis

45 posterior de las secuencias, revelaron que TKH2 y TKH3 son clones idénticos. Basándose en la complementación, análisis de secuencia y demostración de la capacidad para conferir resistencia a glufosinato en E. coli, los inventores concluyen que TKH2 y TKH3 codifican una glutamina sintetasa idéntica.

Ejemplo 3. Secuencia de glutamina sintetasa ags1

50 Se determinó la secuencia de ADN del clon de TKH (denominado en el presente documento ags1), y se identificó una fase abierta de lectura con homología para la familia de glutamina sintetasa. Esta fase abierta de lectura se amplificó por PCR usando polimerasa de alta fidelidad y se clonó en pUC19 para producir pAX685. La proteína codificada (AGS1) muestra alta identidad de aminoácidos con glutamina sintetasas de bacterias Gram negativas

55 incluyendo E. coli (90% de identidad de aminoácidos), Erwinia (94%), Pantoa (93%) y Yersinia (96%).

Ejemplo 4. Mutagénesis de glutamina sintetasa ags1 natural

Se crearon mutantes del gen de glutamina sintetasa bacteriana ags1 (SEC ID Nº 1) por mutagénesis propensa a errores usando el kit de Mutagénesis Aleatoria GENEMORPH®, y usando también mutagénesis dirigida a oligo

5 como se conoce en la técnica. Sin embargo, están disponibles muchos métodos para crear bibliotecas de mutantes. Los mutantes resultantes se clonaron en un vector pUC19, se introdujeron por electroporación en células E. coli XL1 o DH5 alfa, y se seleccionaron con respecto a crecimiento en medio de agar M63+ que contenía antibiótico y glufosinato 2, 10 o 20 mM. Se identificó que 22 clones crecían en glufosinato 20 mM, y se seleccionaron para análisis posterior.

10 Se determinaron las secuencias de los clones resistentes a glufosinato. Tras el análisis de secuencia, se descubrió que los clones 1 y 15; clones 2 y 3; clones 5 y 6; clones 9, 10 y 12; y clones 16, 17, 19 y 20 eran idénticos. Por lo tanto, no se analizaron adicionalmente los clones 1, 3, 5, 7, 9, 12, 16, 19 y 20.

15 Se mostró que los clones 2, 10, 15, 17 y 21 crecían en medio de agar M63+ mínimo de glufosinato 2, 10, 20, 50 y 100 mM después de electroporación en células E. coli DH5#.

Las secuencias de ADN de los clones resistentes a glufosinato se tradujeron y se alinearon las secuencias proteicas resultantes con la secuencia de proteína AGS I natural. Se observaron las sustituciones de aminoácidos 20 correspondientes a la posición de aminoácido de AGS 1 natural (SEC ID Nº 2) en estos clones resistentes a glufosinato. Estas sustituciones se representan en la Figura 1 e incluyen S2T, V391, S54A, G56A, A72V, F80S, F81S, E82D, D102M, V125M, V150M, A151T, D166N, G168C, P185S, V207I, H212N, V214M, V214A, V214E, G218S, V222M, D264V, S276Y, G289S, I303N, R345S, K395R, A420V, R447C. Son de interés particular las mutaciones en torno al ácido glutámico en la posición 213, que está en el sitio catalítico de la glutamina sintetasa.

25 Otro grupo de mutaciones de interés aparece en torno al aminoácido 150.

Tabla 2. Clones resistentes a glufosinato derivados de ags1

Gen

pAX Nº Nucleótidos SEC ID Nº: Aminoácidos SEC ID Nº: Designación del clon original Crecimiento en glufosinato 20 mM Crecimiento en glufosinato 100 mM

ags1(w.t.)

pAX685 1 2 N/D - -

ags1m1

pAX3421 3 4 Clon Nº 2 +++ +++

ags1m2

pAX3422 5 6 Selección Nº 6 +++ +++

ags1m3

pAX3427 7 8 Clon Nº 4 +++ NE

ags1m4

pAX3428 9 10 Clon Nº 6 +++ NE

ags1m6

pAX3430 11 12 Clon Nº 10 +++ NE

ags1m7

pAX3431 13 14 Clon Nº 2 +++ +++

ags1m8

pAX3432 15 16 Clon Nº 11 +++ NE

ags1m9

pAX3433 17 18 Clon Nº 13 +++ NE

ags1m10

pAX3434 19 20 Clon Nº 14 +++ NE

ags1m11

pAX3435 21 22 Clon Nº 15 +++ +++

ags1m12

pAX3436 23 24 Clon Nº 17 +++ +++

ags1m13

pAX3437 25 26 Clon Nº 18 +++ NE

ags1m14

pAX3438 27 28 Clon Nº 21 +++ +++

ags1m15

pAX3426 29 30 Clon Nº 22 +++ NE

ags1m16

pAX3439 31 32 N/D +++ +++

NE = no ensayado

Ejemplo 5. Complementación de un mutante de glutamina sintasa

30 Se seleccionaron clones que contenían ags1m1 (pAX3421) y ags1m2 (pAX3422) para trabajo adicional. Se mostró que ambos clones complementaban E. coli mutante para ags1 con ags1m1 que crecía a una velocidad mayor que ags1m2.

35 Ejemplo 6. Cinética de glutaminas sintasas resistentes a glufosinato

Se subclonaron ags1m1 (pAX3421) y ags1m2 (pAX3422) en el vector de expresión de E. coli pRSF1B (Invitrogen) para crear un extremo N-terminal que codificara un marcador 6Xhis, se purificaron y se caracterizaron cinéticamente.

AGS1m2 (“selección 6”) tuvo relativamente poca actividad enzimática en un ensayo de 5 minutos en comparación con AGS1 natural, pero parecía llegar hasta la compleción durante una noche. AGS1m1 (“selección 2”) fue indistinguible de la enzima natural en ausencia de glufosinato, pero mostró actividad en presencia de glufosinato 100 ∀M, una concentración que inhibió completamente la enzima glutamina sintetasa ags1 natural.

5 Ejemplo 7. Mutagénesis de ags1m2

ags1m2 se mutó por mutagénesis propensa a errores usando el kit de Mutagénesis Aleatoria GENEMORPH® II (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El producto de PCR mutado se digirió con Sac I y Hind 10 III, y se ligó en un vector pUC, digerido de forma similar con Sac I y Hind III. Las ligaciones se transformaron en células E. coli y se sembraron en placas M63+ que contenían antibiótico y glufosinato 125 mM. Los clones que crecieron en placas de glufosinato 125 mM se volvieron a ensayar en placas de glufosinato 200 mM y se compararon con siembras en placas similares de ags1m1 y ags1m2. Aunque las células que expresaban AGS1m1 y AGS1m2 no crecieron en glufosinato 200 mM, se aisló un clon individual, designado pAX3439, según su capacidad 15 para crecer en placas de glufosinato 200 mM. La secuencia de ADN de la fase abierta de lectura de ags en pAX3439 se secuenció y el gen se designó ags1m16. La secuencia de AND de ags1m16 se representa en el presente documento como SEC ID Nº 31, y la secuencia de aminoácidos se representa en el presente documento como SEC ID Nº 32. AGS1m16 difiere de AGS1m2 en un único aminoácido de la posición H212 de la proteína, que se modifica de Histidina (“H”) a Asparagina (“N”), y contiene un total de cinco cambios de aminoácidos en relación con el AGS1

20 natural (véase Figura 1 y Tabla 3).

Tabla 3. Variantes de ags1

Gen

Cambios de aminoácidos en proteína codificada en relación con AGS1

ags1(natural)

ags1m1

V39I, V214M

ags1m2

F81S, P185S, G218S, I303N

ags1m3

E82D, V214A

ags1m4

A151T, V214M, S276Y

ags1m6

V222M, D264V, R345S

ags1m7

G168C, V214M, K395R

ags1m8

R345S, R447C

ags1m9

S2T, A72V

ags1m10

V150M

ags1m11

G56A, V214E

ags1m12

V2071, V214M

ags1m13

D102N, V125M, V214M

ags1m14

V150M, D166N, V214M, G289S, A420V

ags1m15

S54A

ags1m16

F81S, P185S, H212N, G218S, 1303N

ags1m17

F81S, P185S, H212T, V214A, G218S, I303N

ags1m18

F81S, P185S, H212T, V214S, G218S, I303N

ags1m19

F81S, P185S, H212S, V214A, G218S, I303N

ags1m20

F81S, P185S, H212M, V214H, G218S, I303N

ags1m21

N160S, G167R, V214M

AGS1m16 confiere la mayor resistencia a E. coli. Las células que contienen AGS1m16 son capaces de crecer a

25 concentraciones de glufosinato de hasta 200 mM. Las colonias de células que contienen AGS1m2, AGS1m11 y AGS1m4 crecen más rápidamente en glifosato 50 mM que las otras variantes, excepto AGS1m16.

Ejemplo 8. Variantes ags1m17, ags1m18, ags1m19, ags1 m20 y ags1m21

30 Basándose en el conocimiento del mecanismo de reacción de GS conocido en la técnica, y el alineamiento de AGS1 con otras enzimas GS, se puede predecir la localización del centro de reacción de la GS en AGS1 y variantes. ags1(m16) se mutó en la región de la proteína que se ha sugerido que es el centro de reacción de la GS, y se identificaron varias variantes que conferían crecimiento mejorado en placas de glufosinato 225 mM a las células hospedadoras E. coli. ag1m17 (SEC ID Nº: 33) codifica la proteína AGS1m17 (SEC ID Nº: 34). ags1m18 (SEC ID Nº: 35) codifica la proteína AGS1m18 (SEC ID Nº: 36). ags1m19 (SEC ID Nº: 37) codifica la proteína AGS1m19 (SEC ID Nº: 38). ags1m20 (SEC ID Nº: 39) codifica la proteína AGS1m20 (SEC ID Nº: 40). Se descubrió que todos los clones que expresaban AGS1m17, AGS1m18, AGS1m19 o AGS1m20 eran capaces de crecer en placas que contenían glufosinato 375 mM, mientras que no se observó crecimiento de clones que expresaban AGS1m16 en placas que

5 contenían glufosinato 375 mM.

ags1m21 (SEC ID Nº: 41) codifica la proteína AGS1m21 (SEC ID Nº: 42). AGS1m21 es una variante de AGS1 que contiene un cambio de aminoácidos similar identificado en otras variantes (V214M), así como dos mutaciones nuevas (N160S y G167R). Esta enzima se expresó en E. coli, se purificó y se midieron los valores cinéticos Km (glutamato) y Ki (glufosinato) de la variante por ensayo enzimático. Se descubrió que la enzima mutada poseía resistencia aumentada a glufosinato, como se muestra en la siguiente tabla.

Tabla 4. Cinética de AGS1m21

Enzima Km, mM Ki, uM

GlnA 2,7 nd

AGS1 3,4 13,0

AGS1m21 12,0 2000

15 Ejemplo 9. Retirada de sitios de desadenilación de AGS1 y variantes

Se conoce bien en la técnica (Mehta et al. (2004) J. Biol. Chem. 279: 22477-22482, incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad) que en células bacterianas, las enzimas GS bacterianas se someten con frecuencia a regulación negativa por adenilación de un resto de tirosina particular.

ags1(ad-) (SEC ID Nº: 43) que codifica la proteína AGS1(AD-) (SEC ID Nº: 44), es una variante de ags1 en la que el sitio de adenilación potencial se ha retirado mutando la tirosina en la posición 398 de AGS1 a una fenilalanina por mutagénesis dirigida.

25 ags1m17(ad-) (SEC ID Nº: 45) que codifica la proteína AGS1m17(AD-) (SEC ID Nº: 46), es una variante de ags1m17 en la que el sitio de adenilación potencial se ha retirado mutando la tirosina en la posición 398 de AGS1 a una fenilalanina por mutagénesis dirigida.

La enzima no modificada (AGS1) se comparó con AGS1(AD-) y AGS1m17(AD-) llevando a cabo ensayos enzimáticos en ambas enzimas después de la purificación de E. coli. También se ensayó una enzima glutamina sintetasa de E. coli (GlnA). Los valores cinéticos obtenidos para cada enzima se muestran en la Tabla 5 a continuación.

Tabla 5. Cinética de AGS1(AD-)

Enzima Km, mM Ki, c Vmáx, nmol/min/mg Kcat, sec-1 (Kcat*Ki) /Km PM (kD)

GlnA (E, coli) 2,7 ND 0,24 0,21 -52 AGS1 3,4 13,0 0,10 0,08 0,32 52 AGS1(AD-) 3,4 13,0 3,8 3,29 12,59 52

AGS1m17(AD-) 14,1 23.000 ,0078 0,07 110,04

35 Ejemplo 8. Se mutan clones resistentes a glufosinato cerca del sitio activo.

Un número sorprendente de variantes, y todos los clones más resistentes, contienen mutaciones en el sitio activo de la sintetasa. Los dos ácidos glutámicos en el centro catalítico (correspondientes a las posiciones 213 y 221 de AGS1, SEC ID Nº: 2) son claves para la actividad glutamina sintetasa. La Valina en la posición 214 varía en 13 de las variantes, y puede mutarse a metionina (M), alanina (A), serina (S), histidina (H) y ácido glutámico (E). Tres variantes adicionales, incluyendo AGS1m16, tienen restos modificados en esta región.

Ejemplo 9. Identificación de enzimas glutamina sintetasa nuevas adicionales que son resistentes a glutamina 45 sintetasa herbicida.

Usando los métodos de la invención, se pueden identificar glutamina sintetasas resistentes a herbicida adicionales buscando en bases de datos que contienen enzimas glutamina sintetasa, y/o mediante alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las enzimas glutamina sintetasa y análisis de al menos una sustitución de aminoácido dentro de posiciones correspondientes a las posiciones 125 a 175 de SEC ID Nº: 2 o entre las posiciones 200 a 250 de SEC ID Nº: 2. Se entiende que se tolera alguna modificación de estas regiones en la naturaleza sin alterar la naturaleza que confiere la resistencia a herbicida de estas regiones, y son por lo tanto equivalentes a las secuencias enumeradas en el presente documento. Por lo tanto, se reconoce que las enzimas que tienen aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de homología con los polipéptidos de la invención podrían conferir resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas.

Ejemplo 10. Transformación de plantas por bombardeo de partículas.

5 Las mazorcas de maíz se recogen mejor 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las mazorcas, y los embriones de 0,8-1,5 mm de tamaño se prefieren para su uso en transformación. Los embriones se siembran en placas con el escutelo hacia arriba en medios de incubación adecuados, tales como medios DN62A5S (Sales de N6 3,98 g/l; Vitaminas de N6 1 ml/l (de una reserva 1000x); L-Asparagina 800 mg/l; Mioinositol 100 mg/l;

10 L-Prolina 1,4 g/l; ácidos Casamino 100 mg/l; sacarosa 50 g/l; 2,4-D 1 ml/l (de una reserva de 1 mg/ml)). Sin embargo, son adecuados y se conocen en la técnica medios y sales distintas de DN62A5S. Se incuban embriones durante una noche a 25 ºC en oscuridad. Sin embargo, no es necesario en sí mismo incubar los embriones durante una noche.

15 Los explantes resultantes se transfieren a cuadrados de malla (30-40 por placa), se transfieren a medios osmóticos durante aproximadamente 30-45 minutos, después se transfieren a una placa de aceleración (véase, por ejemplo, Publicación de PCT Nº WO/0138514 y Patente de Estados Unidos Nº 5.240.842).

Las construcciones de ADN diseñadas para expresar enzimas glutamina sintetasa de la presente invención en

20 células vegetales se introducen por aceleración en tejido vegetal usando un acelerador de haz de aerosol, usando condiciones esencialmente como se describen en la Publicación de PCT Nº WO/0138514. Después de la transmisión, los embriones se incuban durante aproximadamente 30 minutos en medio osmótico, y se sitúan en medio de incubación durante una noche a 25 ºC en oscuridad. Para evitar dañar indebidamente los explantes transmitidos, estos se incuban durante al menos 24 horas antes de su transferencia a medio de recuperación. Los

25 embriones se distribuyen después en medio de periodo de recuperación, durante aproximadamente 5 días, 25 ºC en oscuridad, después se transfieren a un medio de selección. Los explantes se incuban en medio de selección durante hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, el callo resultante se transfiere a medio de maduración de embriones hasta que se observe formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se sitúan después con

30 luz baja, y se inicia el proceso de regeneración por métodos conocidos en la técnica. Se permite que los brotes resultantes enraícen en medio de enraizamiento, y las plantas resultantes se transfieren a macetas de vivero y se propagan como plantas transgénicas. Las plantas se ensayan con respecto a resistencia mejorada a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas.

35 Materiales

Medios DN62A5S

Componentes

por litro Fuente

Mezcla Salina Basal N6 de Chu (Prod. Nº C 416)

3,98 g/l Phytotechnology Labs

Solución de Vitaminas N6 de Chu (Prod. Nº C 149)

1 ml/l (de reserva 1000x) Phytotechnology Labs

L-Asparagina

800 mg/l Phytotechnology Labs

Mioinositol

100 mg/l Sigma

L-Prolina

1,4 g/l Phytotechnology Labs

Ácidos casamino

100 mg/l Fisher Scientific

Sacarosa

50 g/l Phytotechnology Labs

2,4-D (Prod. Nº D-7299)

1 ml/l (de reserva 1 mg/ml) Sigma

40 Ajustar el pH de la solución a pH 5,8 con KOH 1N/KCl 1N, añadir Gelrite (Sigma) a 3g/l, y esterilizar por autoclave. Después de enfriar a 50 ºC, añadir 2 ml/l de una solución de reserva de 5 mg/ml de Nitrato de Plata (Phytotechnology Labs). La receta produce aproximadamente 20 placas.

Ejemplo 11. Transformación de células vegetales por transformación mediada por Agrobacterium

45 Las mazorcas se recogen mejor 8-12 días después de la polinización. Se aíslan embriones de las mazorcas, y los embriones de 0,8-1,5 mm de tamaño se prefieren para su uso en transformación. Los embriones se siembran con el escutelo hacia arriba en placas con medio de incubación adecuado y se incuban durante una noche a 25 ºC en oscuridad. Sin embargo, no es necesario en sí mismo incubar los embriones durante una noche. Los embriones se

ponen en contacto con una cepa de Agrobacterium que contiene los vectores apropiados que tienen una secuencia de la presente invención para transferencia mediada por plásmido Ti durante aproximadamente 5-10 minutos, y después se siembran en placas con medio de cocultivo durante aproximadamente 3 días (25 ºC en oscuridad). Después del cocultivo, los explantes se transfieren a medio de periodo de recuperación durante aproximadamente 5 cinco días (a 25 ºC en oscuridad). Los explantes se incuban en medio de selección durante hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, el callo resultante se transfiere a medio de maduración de embriones, hasta que se observe la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se sitúan después en luz baja, y se inicia el proceso de regeneración como se conoce en la técnica. Se permite que los brotes resultantes enraícen en

10 medio de enraizamiento, y se transfieren las plantas resultantes a macetas de vivero y se propagan como plantas transgénicas.

Ejemplo 12. Plantas transgénicas que expresan AGS I m 16

15 synags1m16 (SEC ID Nº: 47) es una secuencia de ADN alternativa que codifica la proteína AGS1m16 (SEC ID Nº: 32). synags1m16 se clonó en un vector lanzadera para guiar la sobreexpresión de AGS1m16 en maíz. El vector sitúa la sobreexpresión de synags1m16 bajo el control del promotor Trp5 (solicitud de Estados Unidos 11/377.318, presentada el 16 de marzo de 2006 e incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad).

20 Se generaron nueve plantas de maíz transgénicas que contenían ags1m16. La expresión proteica de la proteína AGS1m16 se confirmó por transferencia de Western para cada uno de estos acontecimientos. Como controles, se generaron seis acontecimientos que no contenían ags1m16. Se evaluó la eficacia de uso del nitrógeno para estos acontecimientos determinando el contenido de proteína de muestras de la hoja aisladas de las plantas T0 después de cuatro semanas de crecimiento en el invernadero.

25 La proteína en muestras de hojas se cuantificó como sigue: se liofilizaron cincuenta miligramos de material de hoja (peso en fresco, sin nervio central) para la determinación de peso seco. El tejido de hoja deshidratado se molió después en presencia de agua Milli Q nueva usando un MiniBeadbeater-96™ y perlas de acero inoxidable de 2,3 mm. El tejido de hoja molido se filtró a través de un filtro de Fluoruro de Polivinilideno (PVDF) de 0,45 ∀m. Se añadió

30 Colorante de Proteínas Bio-Rad a muestras de hojas diluidas en agua, y se realizó un ensayo de proteína de Bradford y se leyó en el espectrofotómetro a 595 nm frente a patrones de proteínas internos incluidos en el ensayo.

Las concentraciones de proteína soluble se dividieron por el peso seco de cada muestra para obtener la masa de proteína por unidad de peso seco. Sorprendentemente, se descubrió que las plantas que contenían ags1m16 tienen 35 una medida de 24% más contenido de proteína que las plantas de control que no contenían ags1m16.

Tabla 6. Proteína Aumentada en plantas AGS1m16 Nº de Genotipo Proteína total (mg/g seco) acontecimiento

1 ags1m16 28,1 2 ags1m16 8,0 3 ags1m16 13,2 4 ags1m16 18,4 5 ags1m16 9,8 6 ags1m16 13,9 7 ags1m16 28,6 8 ags1m16 10,9 9 ags1m16 20,5

Media 16,8

C1 control 16,0 C2 control 14,1 C3 control 18,7

C4 control 10,1 C5 control 13,0 C6 control 9,1

Media 13,5

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Athenix Corporation Nicholas B. Duck

5 Todd K. Hinson Vadim Beilinson Laura Cooper Schouten Daniel John Tomso

10 <120> Glutamina Sintetasas Bacterianas y Métodos de Uso

<130> 45600/329367

<150> 60/812.000 15 <151>

<160> 47

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 20

<210> 1

<211> 1410

<212> ADN

<213>

Serratia marcescens 25

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(1410)

<210> 2

<211> 469

<212> PRT

<213> Serratia marcescens

<400> 2

<210> 3

<211> 1410

<212> ADN

<213>

Secuencia artificial 5

30 <400> 1

<220>

<223> ags1m1

<221> CDS 10 <222> (1)...(1410)

<400> 3

<210> 4

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M1 10

<400> 4

<210> 5

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m2

<221> CDS

<222> (1)..(1410) 10

<400> 5

<210> 6

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M2 10

<400> 6

<210> 7

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m3

<221> CDS 10 <222> (1)...(1410)

<400> 7

<210> 8

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M3 10

<400> 8

<210> 9

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m4

<221> CDS 10 <222> (1)...(1410)

<400> 9

<210> 10

<211> 469

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M4

<400> 10

<210> 11

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m6

<221> CDS 10 <222> (1)...(1410)

<400> 11

<210> 12

<211> 469

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> AGS1M6

<400> 12

10

<210> 13

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m7

<221> CDS

<222> (1)...(1410) 10

<400> 13

<210> 14

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M7 10

<400> 14

<210> 15

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m8

<221> CDS 10 <222> (1)...(1410)

<400> 15

<210> 16

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M8 10

<400> 16

<210> 17

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m9

<221> CDS

<222> (1)...(1410) 10

<400> 17

<210> 18

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M9 10

<400> 18

<210> 19

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m10

<221> CDS

<222> (1)...(1410) 10

<400> 19

<210> 20

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M10 10

<400> 20

<210> 21

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m11

<221> CDS 10 <222> (1)...(1410)

<400> 21

<210> 22

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M11 10

<400> 22

<210> 23

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m12

<221> CDS 10 <222> (1)...(1410)

<400> 23

<210> 24

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M12 10

<400> 24

<210> 25 <211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> ags1m13

<221> CDS

<222> (1)...(1410) 10

<400> 25

<210> 26

<211> 469

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> AGS1M13

<400> 26

10

<210> 27

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m14

<221> CDS 10 <222> (1)...(1410)

<400> 27

<210> 28

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M14 10

<400> 28

<210> 29

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m15

<221> CDS 10 <222> (1)...(1410)

<400> 29

<210> 30

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M15 10

<400> 30

<210> 31

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m16

<221> CDS 10 <222> (1)...(1410)

<400> 31

<210> 32

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M16 10

<400> 32

5

<210> 33 <211> 1410 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> ags1m17 <221> CDS <222> (1)...(1410)

15

<400> 33

<210> 34

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M17 10

<400> 34

<210> 35

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m18

<221> CDS 10 <222> (1)...(1410)

<400> 35

<210> 36

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M18 10

<400> 36

<210> 37

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m19

<221> CDS 10 <222> (1)...(1410)

<400> 37

<210> 38

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M19 10

<400> 38

<210> 39

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m20

<221> CDS 10 <222> (1)...(1410)

<400> 39

<210> 40

<211> 469

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M20

<400> 40

<210> 41

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m21

<221> CDS 10 <222> (1)...(1410)

<400> 41

<210> 42

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M21 10

<400> 42

<210> 43

<211> 1543

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1(ad-)

<221> CDS 10 <222> (1) ... (1410)

<400> 43

<210> 44

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1(AD-) 10

<400> 44

<210> 45

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> ags1m17(ad-)

<221> CDS 10 <222> (1)...(1410)

<400> 45

<210> 46

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AGS1M17(AD-) 10

<400> 46

<210> 47

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> synags1m16

<400> 47

10

Claims (50)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 1, que codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2.

2. 2.

   El polinucleótido de la reivindicación 1, donde dicho polipéptido comprende al menos una modificación entre los aminoácidos 125 y 175 o al menos una modificación entre los aminoácidos 200 a 250 correspondientes a SEC ID Nº: 2.

3. 3.

   El polinucleótido de la reivindicación 2 que se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 47 o la secuencia de nucleótidos de resistencia a herbicida del inserto de ADN del plásmido depositado con el Nº de Referencia NRRL B-30930.

4. 4.

   El polinucleótido de la reivindicación 1, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene al menos una modificación que da como resultado la pérdida de un sitio de adenilación en dicho polipéptido.

5. 5.

   El polinucleótido de la reivindicación 4 que se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 43 y 45.

6. 6.

   El polinucleótido de la reivindicación 1, donde dicho inhibidor de glutamina sintetasa herbicida comprende glufosinato.

7. 7.

   El polinucleótido de la reivindicación 1, donde dicho polinucleótido es una secuencia sintética que se ha diseñado para expresión en una planta.

8. 8.

   El polinucleótido de SEC ID Nº: 1.

9. 9.

   Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1.

10. 10.

    El vector de la reivindicación 9, que comprende además un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo.

11. 11.

    Una célula hospedadora que contiene el vector de la reivindicación 9.

12. 12.

    La célula hospedadora de la reivindicación 11 que es una célula hospedadora bacteriana.

13. 13.

    La célula hospedadora de la reivindicación 11 que es una célula vegetal.

14. 14.

    Una planta transgénica que comprende la célula hospedadora de la reivindicación 13.

15. 15.

    La planta de la reivindicación 14, que comprende además uno o más de un polinucleótido que codifica un gen de tolerancia a herbicida o un polinucleótido que codifica un gen de tolerancia a insectos.

16. 16.

    La planta de la reivindicación 15, donde dicho gen de tolerancia a herbicida es un gen de EPSP sintasa.

17. 17.

    La planta de la reivindicación 15, donde dicho gen de tolerancia a insectos es una endotoxina.

18. 18.

    La planta de la reivindicación 14, donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza.

19. 19.

    Una semilla transformada que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1.

20. 20.

    Un polipéptido que comprende una variante de SEC ID Nº: 2, donde dicho polipéptido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 2, es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2.

21. 21.

    El polipéptido de la reivindicación 20, donde dicho polipéptido comprende al menos una modificación entre los aminoácidos 125 y 175 o al menos una modificación entre los aminoácidos 200 a 250 correspondientes a SEC ID Nº: 2.

22. 22.

    El polipéptido de la reivindicación 19 que se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, o un polipéptido que está codificado por la secuencia de nucleótidos de resistencia a herbicida del inserto de ADN del plásmido depositado con el Nº de Referencia NRRL B30930.

23. 23.

    El polipéptido de la reivindicación 20, donde dicho polipéptido comprende al menos una modificación que da como resultado la pérdida de un sitio de adenilación en dicho polipéptido.

24. 24.

    El polipéptido de la reivindicación 23 que se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 44 y 46.

25. 25.

    El polipéptido de la reivindicación 22, donde dicho inhibidor de glutamina sintetasa herbicida comprende glufosinato.

26. 26.

    El polipéptido de SEC ID Nº: 2.

27. 27.

    Un método para conferir resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas en una planta que comprende:

    (i)

    transformar dicha planta con un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 1, codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2; y

    (ii)

    regenerar una planta transformada.

28. 28.

    Un planta que tiene incorporada de forma estable en su genoma una construcción de ADN que comprende un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 1, codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2.

29. 29.

    La planta de la reivindicación 28, donde dicho polipéptido comprende al menos una modificación entre los aminoácidos 125 y 175 o al menos una modificación entre los aminoácidos 200 a 250 correspondientes a SEC ID Nº: 2.

30. 30.

    La planta de la reivindicación 29, donde dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 47.

31. 31.

    La planta la reivindicación 28, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene al menos una modificación que da como resultado la pérdida de un sitio de adenilación en dicho polipéptido.

32. 32.

    La planta de la reivindicación 31, donde dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 43 y45.

33. 33.

    La planta de la reivindicación 28, donde dicho inhibidor de glutamina sintetasa herbicida comprende glufosinato.

34. 34.

    La planta de la reivindicación 28, que comprende además uno o más de un polinucleótido que codifica un gen de tolerancia a herbicida o un polinucleótido que codifica un gen de tolerancia a insectos.

35. 35.

    La planta de la reivindicación 34, donde dicho gen de tolerancia a herbicida es un gen de EPSP sintasa.

36. 36.

    La planta de la reivindicación 34, donde dicho gen de tolerancia a insectos es una endotoxina.

37. 37.

    La planta de la reivindicación 28, donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza.

38. 38.

    Un método para combatir de forma selectiva malas hierbas en un campo que contiene una planta que tiene semillas plantadas o plantas que comprende las etapas de:

    a) plantar las semillas o plantas que son resistentes a inhibidor de glutamina sintetasa herbicida como resultado de que un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1 se inserte en la semilla o planta, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 1, codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2; y, b) aplicar a las plantas y malas hierbas en un campo una concentración eficaz de un inhibidor de glutamina sintetasa herbicida para combatir malas hierbas sin afectar significativamente a las plantas.

39. 39.

    El método de la reivindicación 27 o 38, donde dicho polipéptido comprende al menos una modificación entre los aminoácidos 125 y 175 o al menos una modificación entre los aminoácidos 200 a 250 correspondientes a SEC ID Nº: 2.

40. 40.

    El método de la reivindicación 39, donde dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 47.

41. 41.

    El método de la reivindicación 27 o 38, donde dicho inhibidor de glutamina sintetasa herbicida comprende glufosinato.

42. 42.

    El método de la reivindicación 27 o 38, donde dicha planta o semilla comprende además uno o más de un polinucleótido que codifique un gen de tolerancia a herbicida o un polinucleótido que codifique un gen de tolerancia a insectos.

43. 43.

    El método de la reivindicación 42, donde dicho gen de tolerancia a herbicida es un gen de EPSP sintasa.

44. 44.

    El método de la reivindicación 42, donde dicho gen de tolerancia a insectos es una endotoxina.

45. 45.

    Un método para mejorar el rendimiento en una planta en relación con un control que comprende introducir en dicha planta un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1.

46. 46.

    El método de la reivindicación 45, donde dicho polinucleótido comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 47, o la secuencia de nucleótidos de resistencia a herbicida del inserto de ADN del plásmido depositado con el Nº de Referencia NRRL B-30930.

47. 47.

    Un método para mejorar la utilización de nitrógeno en una planta que comprende introducir en dicha planta un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1.

48. 48.

    El método de la reivindicación 47, donde dicho polinucleótido comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47,

    o la secuencia de nucleótidos de resistencia a herbicida del inserto de ADN del plásmido depositado con el Nº de Referencia NRRL B-30930.

49. 49.

    El método de la reivindicación 27, 38, 45 o 47, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene al menos una modificación que da como resultado la pérdida de un sitio de adenilación en dicho polipéptido.

50. 50.

    El método de la reivindicación 49, donde dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 43y 45.

    FIG. 1C