ES2332380T3 - Genes grg23 y grg51 que confieren resistencia a los herbicidas. - Google Patents

Abstract

Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada entre: a) una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, o un complemento de la misma; b) una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, que codifica a una EPSPS de tolerancia al glifosato, o un complemento de la misma; c) la secuencia de nucleótidos de tolerancia al glifosato del inserto de ADN del plásmido depositado como el Acceso No. NRRL B-30888 o B-30949, o un complemento de la misma: d) una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido que contiene las secuencias de aminoácidos SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6; y e) una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato.

Description

Genes GRG23 y GRG51 que confieren resistencia a los herbicidas.

Campo de la invención

Esta invención proporciona nuevos genes que codifican tolerancia al glifosato que son útiles en biología de las plantas, reproducción de cultivos y cultivo de células de plantas.

Antecedentes de la invención

La N-fosfonometilglicina, comúnmente denominada glifosato, es un importante compuesto químico agronómico. El glifosato inhibe a la enzima que convierte al ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y al ácido 3-fosfoshiquímico (S3P) en ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico. La inhibición de esta enzima (5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa, denominada aquí como "EPSPS") mata las células de las plantas cerrando la ruta del shiquimato, inhibiendo así la biosíntesis del ácido aromático.

Ya que los herbicidas de la clase del glifosato inhiben la biosíntesis de aminoácidos aromáticos, no solamente matan células de plantas, sino que también son tóxicos para las células bacterianas. El glifosato inhibe muchas EPSP sintasas bacterianas, y por lo tanto es tóxico para estas bacterias. Sin embargo, ciertas EPSP sintasas bacterianas tienen una alta tolerancia al glifosato.

Las células de las plantas resistentes a la toxicidad del glifosato pueden ser producidas por medio de células de plantas transformantes para expresar EPSP sintasas bacterianas resistentes al glifosato. Notablemente el gen bacteriano de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens ha sido utilizado para conferir resistencia a los herbicidas en células de plantas después de la expresión en plantas. Una EPSP sintasa mutada de la cepa CT7 de Salmonella typhymurium confiere resistencia al glifosato en células bacterianas, y confiere resistencia al glifosato sobre células de plantas (patentes estadounidenses Nos. 4.535.060; 4.769.061 y 5.094.945). Sin embargo, existe la necesidad de otros genes resistentes a herbicidas.

Se puede analizar la actividad cinética de EPSPS midiendo la liberación de fosfato. Se detecta la liberación de fosfato utilizando un ensayo acoplado para la detección de fluorescencia del fosfato con base en la generación de N-acetil-3,7-dihidroxifenoxacina (Amplex® Red), como se conoce en el estado del arte (Vázquez y colaboradores (2003) Analytical Biochemestry 320: 292-298). Las condiciones publicadas del ensayo pueden conducir a saturación del ensayo en experimentos donde se libera fosfato muy rápidamente. Se requieren métodos adicionales para la medición de la actividad cinética de EPSPS.

Resumen de la invención

Se proporcionan composiciones y métodos para conferir a las bacterias, plantas, células de plantas, tejidos, semillas, tolerancia al glifosato. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos para tolerancia al glifosato, vectores que incluyen aquellas moléculas de ácido nucleico, y células huésped que contienen a tales vectores. Las composiciones también incluyen anticuerpos para los polipéptidos de tolerancia al glifosato. Como se ha señalado, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden ser utilizadas en construcciones de ADN o casetes de expresión para transformación y expresión en organismos, incluidos microorganismos y plantas. Las composiciones también incluyen bacterias, plantas, células de plantas, tejidos y semillas trasformados. Además, se proveen métodos para producir los polipéptidos codificados por los nucleótidos sintéticos de la invención.

Se proporcionan moléculas aisladas de ácido nucleico y variantes de las mismas que codifican polipéptidos para tolerancia al glifosato. Adicionalmente, están incluidas las secuencias de aminoácidos y las variantes de las mismas codificadas por lo polinucleótidos que confieren tolerancia al glifosato. La presente invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que contienen una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, a la secuencia de nucleótidos para tolerancia al glifosato depositada en un huésped bacteriano con los Números de Acceso NRRL B-30888 o NRRL B-30949, así como variantes y fragmentos de las mismas. Las secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de nucleótidos de la invención, o que hibridan a una secuencia de la invención están también incluidas.

Los métodos para medir la actividad cinética de la enzima que utilizan sustratos fluorogénicos son también suministrados.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico, una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada entre:

a)

una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, o un complemento de la misma;

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b)

una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, que codifica a una EPSPS de tolerancia al glifosato, o un complemento de la misma;

c)

la secuencia de nucleótidos de tolerancia al glifosato del inserto de ADN del plásmido depositado como el Acceso No. NRRL B-30888 o B-30949, o un complemento de la misma:

d)

una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido que contiene las secuencias de aminoácidos SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6; y

e)

una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato.

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La invención también proporciona:

-

un vector que contiene una molécula de ácido nucleico de la invención, conteniendo dicho vector opcionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido heterólogo.

-

una célula huésped que contiene a tal vector;

-

una planta transgénica que contiene a la célula huésped; o

-

una semilla transformada de tal planta.

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La invención proporciona adicionalmente un polipéptido aislado seleccionado entre:

a)

un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6;

b)

un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5;

c)

un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato;

d)

un polipéptido que es codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato; y

e)

un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleótidos para tolerancia al glifosato del inserto de ADN del plásmido depositado como el Acceso No. NRRL B-30888 o NRR B-30949;

dicho polipéptido comprende opcionalmente además una secuencia heteróloga de aminoácidos.

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La invención proporciona además un método para producir un polipéptido con actividad de tolerancia al glifosato, que comprende el cultivo de la célula huésped de la invención bajo condiciones en las cuales se expresa una molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido, siendo dio polipéptido seleccionado del grupo que consiste de:

a)

un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6;

b)

un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5;

c)

un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato;

d)

un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato; y

e)

un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleótidos para tolerancia al glifosato del inserto de ADN del plásmido depositado como el Acceso No. NRRL B-30888 o NRR B-30949.

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La invención proporciona además un método para conferir tolerancia al glifosato en una planta, comprendiendo dicho método la transformación de dicha planta con una construcción de ADN, conteniendo dicha construcción un promotor que dirige la expresión en una célula de una planta operativamente enlazada con una secuencia de ácido nucleico al menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5 que codifica una EPSPS para tolerancia al glifosato y la regeneración de una planta transformada.

La invención proporciona además una planta o célula de planta que tiene incorporada en forma estable dentro de su genoma una construcción de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína que tiene actividad de tolerancia la glifosato, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona de:

a)

una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5;

b)

una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad de tolerancia al glifosato;

c)

una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6;

d)

una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato; y

e)

la secuencia de nucleótidos de tolerancia al glifosato del inserto de ADN del plásmido depositado como el Acceso No. NRRL B-30888 o NRRL B-30949; en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión de una secuencia de codificación en una célula de una planta.

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Además, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a una enzima EPSPS de tolerancia al glifosato, en donde dicha enzima EPSPS de tolerancia al glifosato tiene una Km para el fosfoenolpiruvato (PEP) entre 1 y 150 uM y una K_{i} (glifosato)/K_{m} (PEP) entre 500 y 1000.

La invención proporciona además una planta que tiene incorporada en forma estable dentro de su genoma una construcción de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido EPSPS, teniendo dicho polipéptido EPSPS una Km para PEP aproximadamente entre 1 y aproximadamente 150 uM y un K_{i} (glifosato)/K_{m} (PEP) aproximadamente entre 500 y aproximadamente 1000, exhibiendo dicha planta tolerancia al herbicida glifo-
sato.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos ORF1 de GRG23 (SEQ ID NO: 2) y de GRG51 (SEQ ID NO: 6) con Bacillus clausiik (SEQ ID NO: 7), Rubrobace rxylanophilus (SEQ ID NO: 8), Escherichia coli (SEQ ID NO: 11), cepa CP4 de Agrobacterium sp. (SEQ ID NO: 10) y Zea mays (SEQ ID NO: 9).

La Figura 2 muestra una gráfica de dispersión de la actividad de la enzima GRG23 (eje y) en función de la concentración de PEP (eje x) con concentraciones de glifosato de 0, 3, 5 y 10 mM.

La Figura 3 muestra una gráfica de dispersión de K_{m} (app) (eje y) en función de la concentración de glifosato (eje x). El intercepto en X representa la K_{i} para el glifosato.

Descripción detallada

Se describirán ahora las presentes invenciones más completamente de aquí en adelante con referencia a los dibujos acompañantes, en los cuales, se muestran algunas pero no todas las modalidades de la invención. En realidad, estas invenciones pueden ser expresadas en muchas formas diferentes y no deben ser consideradas como limitadas a las modalidades expuestas aquí; en vez de eso, se proporcionan estas modalidades de tal manera que esta descripción satisfaga los requerimientos legales aplicables. Los números similares se refieren a elementos similares a todo lo largo de la descripción.

Muchas modificaciones y otras modalidades de las invenciones expuestas aquí vendrán a la mente de alguien capacitado en el arte a la cual pertenecen estas invenciones teniendo el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones anteriores y los dibujos asociados. Por lo tanto, se debe entender que las invenciones no están limitadas a las modalidades específicas divulgadas y se pretende que las modificaciones y otras modalidades estén incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque se empleen aquí términos específicos, se los utiliza únicamente en sentido genérico y descriptivo y no con el propósito de constituirse en una limitación.

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La presente invención está dirigida a composiciones y métodos para regular la resistencia a los herbicidas en organismos, particularmente en plantas o en células de plantas. Los métodos involucran la transformación de organismos con secuencias de nucleótidos que codifican al gen de tolerancia al glifosato de la invención. Las secuencias de nucleótidos de la invención son útiles para la preparación de plantas que muestren mayor tolerancia al herbicida glifosato. Por lo tanto, se proporcionan bacterias, plantas, células de plantas, tejidos de plantas y semillas transformadas. Las composiciones incluyen ácidos nucleicos y proteínas relacionados con tolerancia a los herbicidas en microorganismos y plantas así como en bacterias, plantas, tejidos de plantas y semillas transformados. Se describen las secuencias de nucleótidos del gen de tolerancia al glifosato (grg23 y grg51) y las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas de este modo. Las secuencias encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para la transformación posterior en plantas de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes de tolerancia al glifosato, como marcadores seleccionables, y similares. De este modo, por "gen de tolerancia al glifosato de la invención" se entiende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 ó 3, y variantes y fragmentos de la misma (SEQ ID Nos: 5, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32), que codifica un polipéptido de tolerancia al glifosato. Asimismo, un "polipéptido para el glifosato de la invención" es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID Nos: 2 ó 4, y variantes y fragmentos de las mismas (SEQ ID Nos: 6, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 y 33), que confieren tolerancia al glifosato a una célula huésped.

Los plásmidos que contienen las secuencias de nucleótidos de tolerancia al glifosato de la invención fueron depositados en la colección permanente de la Agricultural Research Service Culture Collection, Northern Regional Reserch Laboratory (NRRL) el 18 de noviembre de 2005, y con el Acceso asignado No. NRRL B-30888 (grg23), y el 26 de junio de 2006, y con el Acceso asignado No. NRRL B-30949 (grg51). Este depósito será mantenido bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos del Procedimiento de Patente. Este depósito fue hecho simplemente como una conveniencia para aquellos capacitados en el arte y no es una admisión de que se requiere un depósito bajo la regla 35 U.S.C. \NAK 112.

Por "glifosato" se entiende cualquier forma herbicida de N-fosfonometilglicina (incluida cualquier sal de la misma) y otras formas que resulten en la producción del anión glifosato en planta. Una "proteína de resistencia al herbicida" o una proteína resultante de la expresión de una "molécula de ácido nucleico que codifica para la resistencia al herbicida" incluyen proteínas que le confieren a una célula la habilidad para tolerar una concentración mayor de un herbicida que las células que no expresan la proteína, o para tolerar una cierta concentración de un herbicida durante un periodo de tiempo más largo que las células que no expresan la proteína. Una "proteína de resistencia al glifosato" incluye a una proteína que le confiere a una célula la habilidad para tolerar una mayor concentración de glifosato que las células que no expresan la proteína, o para tolerar una cierta concentración de glifosato durante un periodo de tiempo más largo que las células que no expresan la proteína. Por "tolerar" o "tolerancia" se entiende ya sea la supervivencia, o llevar a cabo funciones celulares esenciales tales como la síntesis de proteínas y respiración en una forma que no es fácilmente discernible a partir de las células no tratadas.

Moléculas Aisladas de Ácido Nucleico, y Variantes y Fragmentos de las Mismas

Un aspecto de la invención se relaciona con moléculas aisladas de ácido nucleico que contienen secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de tolerancia al glifosato o porciones biológicamente activas de las mismas, así como moléculas de ácido nucleico suficientes para ser usadas como sondas de hibridación para identificar ácidos nucleicos que codifican para la tolerancia al glifosato. Como se lo utiliza aquí, el término "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generado utilizando análogos de nucleótido. La molécula de ácido nucleico puede ser bicatenaria o monocatenaria.

Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la presente invención incluyen a las secuencias expuestas en las SEQ ID Nos.: 1, 3 y 5, a la secuencia de nucleótidos de tolerancia al glifosato depositada en un huésped bacteriano con los números de Acceso NRRL B-30888 y NRRL B-30949, y variantes, fragmentos, y complementos de las mismas. Por "complemento" se entiende una secuencia de nucleótidos que es suficientemente complementaria a una secuencia dada de nucleótidos de tal manera que pueda hibridar a la secuencia dada de nucleótido para formar así un dúplex estable. La secuencia correspondiente de aminoácidos para la proteína de tolerancia al glifosato codificada por estas secuencias de nucleótidos está expuesta en las SEQ ID Nos.: 2, 4 ó 6. La invención también abarca moléculas de ácido nucleico que contienen secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de tolerancia al glifosato de longitud parcial, y complementos de las mismas.

Una molécula de ácido nucleico o proteína "aislada" o "purificada", o porción biológicamente activa de las mismas, está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se las produce por medio de técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se las sintetiza químicamente. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (preferiblemente secuencias que codifican proteína) que flanquean naturalmente al ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo a partir del cual se deriva el ácido nucleico. Para propósitos de la invención, "aislado" cuando se lo utiliza para referirse a moléculas de ácido nucleico excluye cromosomas aislados. Por ejemplo, en diferentes modalidades, la molécula aislada de ácido nucleico que codifica para la tolerancia al glifosato puede contener aproximadamente menos de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ó 0,1 kb de secuencia de nucleótido que flanquea naturalmente la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula a partir de la cual se deriva el ácido nucleico. Una proteína de tolerancia al herbicida que esté sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tengan aproximadamente menos del 30%, 20%, 10% ó 5% (en peso seco) de proteína sin tolerancia al herbicida (también denominada aquí como una "proteína contaminante").

Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos que codifican para la tolerancia al glifosato son también abarcadas por la presente invención. Por "fragmento" se entiende una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica a la proteína de tolerancia al glifosato. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína de tolerancia al glifosato, o puede ser un fragmento que puede ser utilizado como una sonda de hibridación o iniciador de PCR utilizando métodos descritos más abajo. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de tolerancia al glifosato incluyen aproximadamente al menos 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de longitud completa de nucleótidos que codifican para tolerancia al glifosato divulgada aquí (por ejemplo, 1892 nucleótidos para la SEQ ID No.: 1, 1259 nucleótidos para la SEQ ID No.: 3, y 1242 nucleótidos para la SEQ ID No.: 5). Por nucleótidos "contiguos" se entiende residuos de nucleótidos que están inmediatamente adyacentes entre sí.

Los fragmentos de las secuencias de nucleótidos de la presente invención generalmente codificarán fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína de longitud completa de tolerancia al glifosato, es decir, actividad de tolerancia al herbicida. Por "retiene la actividad de tolerancia al herbicida" se entiende que el fragmento tendrá aproximadamente al menos 30%, aproximadamente al menos 50%, aproximadamente al menos 750%, o aproximadamente al menos 80% de la actividad de tolerancia al herbicida de las proteínas de longitud completa de tolerancia al glifosato divulgadas aquí como las SEQ ID Nos.: 2, 4 ó 6. Los métodos para medir la actividad de resistencia al herbicida son bien conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 4.535.060, y 5.188.642, cada una de las cuales es incorporada aquí como referencia en su totalidad.

Un fragmento de secuencia de nucleótidos que codifica para la tolerancia al glifosato que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de la invención codificará aproximadamente al menos 15,25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína de longitud completa de tolerancia al glifosato de la invención (por ejemplo, 436 aminoácidos para la SEQ ID No.: 2, 413 aminoácidos para la SEQ ID No.: 4, y 413 aminoácidos para la SEQ ID No.: 6).

Las proteínas de tolerancia al glifosato de la presente invención son codificadas por una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos.: 1, 3 ó 5. El término "suficientemente idéntica" se refiere a una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que tiene aproximadamente al menos 60% ó 65% de identidad de secuencia, aproximadamente 70% ó 75% de identidad de secuencia, aproximadamente 80% u 85% de identidad de secuencia, aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia comparada con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineación descritos aquí utilizando parámetros estándar. Alguien capacitado en el arte reconocerá que estos valores se pueden ajustar apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración del codón, la similitud de aminoácidos, la ubicación del marco de lectura, y similares.

Para determinar el porcentaje de identidad d dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleico, se alinean las secuencias para propósitos de comparación óptima. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones de superposición) x 100). En una modalidad, las dos secuencias tienen la misma longitud. El porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias se puede determinar utilizando técnicas similares a aquellas descritas más adelante, con o sin permitir vacíos. En el cálculo del porcentaje de identidad, se cuentan típicamente las correspondencias exactas.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Tal algoritmo está incorporado en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul y colaboradores, (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. La búsqueda de nucleótidos por BLAST se puede llevar a cabo con el programa BLASTN, puntaje = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico tipo GDC de la invención. Las búsquedas de proteína por BLAST se pueden llevar a cabo con el programa BLASTX, puntaje = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína de resistencia al herbicida de la invención. Para obtener alineamientos de vacíos para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul y colaboradores, (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Alternativamente, se puede utilizar PSI-Blast para llevar a cabo una búsqueda reiterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Ver Altschul y colaboradores, (1997) más arriba. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST, y PSI-Blast, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). Ver www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins y colaboradores, (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680). ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o de ADN, y así puede proporcionar datos acerca de la conservación de la secuencia, de la secuencia completa de aminoácidos. El algoritmo ClustalW se utiliza en diferentes paquetes comercialmente disponibles de software para análisis de ADN/aminoácidos, tales como el módulo ALIGNX del Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Después de la alineación de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, se puede evaluar el porcentaje de identidad de los aminoácidos. Un ejemplo no limitante de un programa de software útil para el análisis de alineaciones ClustalW es GeneDoc^{TM}. Genedoc^{TM} (Karl Nicholas) permite la evaluación de la similitud e identidad de los aminoácidos (o ADN) entre múltiples proteínas. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 11-17. Tal algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que hace parte del paquete de software para alineación de secuencias GCG (que puede ser obtenido con Accelrys, Inc., San Diego, CA). Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla
de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de vacíos de 12, y una penalización por vacío de 4.

A menos que se establezca otra cosa, se utilizará GAP Versión 10, que utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3): 443-453, para determinar la identidad o similitud de secuencia utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando un GAP Weight de 50 y un Length Weight de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando un GAP Weight de 8 y una Length Weight de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62.Se pueden utilizar también programas equivalentes. Por "programa equivalente" se entiende cualquier programa de comparación de secuencia que, para dos secuencias cualesquiera bajo investigación, genera una alineación que tiene correspondencias idénticas de residuos de nucleótidos y un porcentaje idéntico de identidad de secuencia cuando se la compara con la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10.

La invención también abarca variantes de moléculas de ácido nucleico. Las "variantes" de las secuencias de nucleótidos que codifican para la tolerancia al glifosato incluyen a aquellas secuencias que codifican a la proteína de tolerancia al glifosato divulgadas allí pero que difieren conservativamente debido a la degeneración del código genético, así como aquellas que son suficientemente idénticas como se discutió anteriormente (por ejemplo, SEQ ID NO: 5, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, y 32 son variantes de la SEQ ID NO: 1). Las variantes alélicas de ocurrencia natural se pueden identificar con el uso de técnicas conocidas de biología molecular, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como se indica a continuación. Las variantes de secuencias de nucleótidos también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente que han sido generadas, por ejemplo, por medio del uso de mutagénesis dirigida al sitio pero la cual aún codifica a las proteínas de tolerancia al glifosato divulgadas en la presente invención como se discute más adelante. Las variantes de proteínas abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir que ellas retienen la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, la actividad de tolerancia al herbicida. Por "retiene la actividad de tolerancia al glifosato" se entiende que la variante tundra aproximadamente al menos 30%, aproximadamente al menos 50%, aproximadamente al menos 70%, o aproximadamente al menos 80% de la actividad de tolerancia al glifosato de la proteína nativa. Los métodos para medir la actividad de resistencia al herbicida son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 4.535.060, y 5.188.642, cada una de las cuales está incorporada aquí como referencia en su totalidad.

La persona capacitada se dará cuenta además que se pueden introducir cambios por mutación en las secuencias de nucleótidos de la invención conduciendo así a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas de tolerancia al glifosato, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. De este modo se pueden crear variantes de moléculas aisladas de ácido nucleico por medio de la introducción de una o más sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos en la correspondiente secuencia de nucleótidos descrita aquí, de tal manera que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos en la proteína codificada. Se pueden introducir mutaciones por medio de técnicas estándar, tal como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Tales variantes de las secuencias de nucleótidos son también abarcadas por la presente invención.

Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos predichos de aminoácidos no esenciales. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado a partir de la secuencia de tipo silvestre de la proteína de tolerancia al glifosato sin alterar la actividad biológica, mientras que se requiere de un residuo de aminoácido "esencial" para la actividad biológica. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual se reemplaza el residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en el estado del arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Pueden hacerse sustituciones de aminoácidos en regiones no conservadas que retiene la función. En general, no se harían tales sustituciones para residuos conservados de aminoácidos, o para residuos de aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado, donde tales residuos son esenciales para la actividad de la proteína. Sin embargo, alguien capacitado en el arte entendería que las variantes funcionales pueden tener alteraciones menores conservadas o no conservadas en los residuos conservados.

Lys-22, Arg-124, Asp-313, Arg-344, Arg-386, y Lys-411, son residuos conservados de la EPSP sintasa de E. coli (Schönbrunn y colaboradores, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1376-1380). Los residuos conservados importantes para la actividad de la EPSP sintasa también incluyen Arg-100, Asp-242, y Asp-384 (Selvapandiyan y colaboradores, (1995) FEBS Letters 374: 253-256). Arg-27 se enlaza a S3P (Shuttleworth y colaboradores, (1999) Biochemistry 38: 296-302).

Alternativamente, se pueden elaborar variantes de secuencias de nucleótidos por medio de la introducción aleatoria de mutaciones a lo largo de toda o de parte de la secuencia de codificación, por ejemplo por medio de mutagénesis por saturación, y se pueden seleccionar los mutantes resultantes por la habilidad para conferir actividad de tolerancia al glifosato para identificar mutantes que retienen actividad. Después de la mutagénesis, se puede expresar en forma recombinante la proteína codificada, y se puede determinar la actividad de la proteína utilizando técnicas estándar de ensayo.

Utilizando métodos tales como PCR, hibridación y similares se pueden identificar las correspondientes secuencias de tolerancia al glifosato, teniendo tales secuencias una identidad sustancial con las secuencias de la invención. Ver, por ejemplo, Sambrook y Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis, y colaboradores, (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, St. Louis, MO).

En un método de hibridación, se puede utilizar todo o parte de la secuencia de nucleótidos de tolerancia al glifosato para seleccionar bibliotecas genómicas o de ADNc. Los métodos para la construcción de tales bibliotecas genómicas y de ADN son generalmente conocidos en el arte y están descritos en Sambrook y Russell (2001), (ver más arriba). Las así llamadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y pueden ser marcados con un grupo detectable tal como ^{32}P, o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Se pueden elaborar sondas para hibridación marcando oligonucleótidos sintéticos con base en la(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifica(n) la resistencia al glifosato descrita(s) aquí. Pueden utilizarse adicionalmente los iniciadores degenerados diseñados con base en los nucleótidos conservados o en los residuos de aminoácidos en la secuencia de nucleótidos o en la secuencia codificada de aminoácidos. La sonda contiene típicamente una región de una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones estrictas al menos aproximadamente hasta 12, al menos aproximadamente hasta 25, al menos aproximadamente hasta 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, ó 1800 nucleótidos consecutivos de una secuencia(s) de nucleótidos de la invención o de un fragmento o una variante de los mismos que codifica(n) la resistencia al glifosato. Los métodos para la preparación de sondas para hibridación son generalmente conocidas en el arte y están descritas en Sambrook y Russell (2001) (ver más arriba), y Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), ambos incorporados aquí como referencia.

Por ejemplo, se puede utilizar una secuencia entera de resistencia al glifosato descrita aquí, o una o más porciones de la misma, como sonda capaz de hibridar específicamente a las correspondientes secuencias de resistencia al herbicida y los ARN mensajeros. Para lograr una hibridación específica bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y son aproximadamente de 10 nucleótidos de longitud, y aproximadamente al menos de 20 nucleótidos de longitud. Se pueden utilizar tales sondas para amplificar las correspondientes secuencias de tolerancia al glifosato de un organismo escogido por PCR. Se puede utilizar esta técnica para aislar secuencias adicionales de codificación de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen selección por hibridación de bibliotecas de ADN sembradas en placa (ya sea placas o colonias; ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Se puede llevar a cabo la hibridación de tales secuencias bajo condiciones estrictas. Por "condiciones estrictas" o "condiciones estrictas de hibridación" se entiende condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia objetivo hasta un grado de detección mayor que para otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces sobre el fondo). Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Controlando la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o de lavado, se pueden identificar secuencias objetivo que son 100% complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Alternativamente, se pueden ajustar las condiciones de rigurosidad para permitir alguna desalineación en las secuencias de tal manera que se detectan menores grados de similitud (sondeo heterólogo). Generalmente, una sonda es aproximadamente menor a 1000 nucleótidos de longitud, o aproximadamente menor a 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, condiciones estrictas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es aproximadamente menor a 1,5 M de ion Na, típicamente una concentración aproximadamente de 0,01 a 1,0 M de ion Na (o de otras sales) a pH 7,0-8,3 y la temperatura es aproximadamente al menos de 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y aproximadamente al menos 60ºC para sondas más largas (por ejemplo, superiores a 50 nucleótidos). Se pueden lograr también condiciones estrictas con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. Los ejemplos de condiciones de baja rigurosidad incluyen la hibridación con una solución amortiguadora de formamida al 30-35%, NaCl 1 M, SDS al 1% (dodecil sulfato de sodio) a 37ºC, y un lavado 1X a 2X con SSC (20 veces con SSC = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) a 50-55ºC. Los ejemplos de condiciones de rigurosidad moderadas incluyen hibridación en formamida al 40-45%, NaCl 1,0 M, SDS al 1% a 37ºC y lavado en 0,5X a 1X de SSC a 55-60ºC. Los ejemplos de condiciones altamente rigurosas incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 0,1X de SSC a 60º-65ºC. Opcionalmente, los amortiguadores de lavado pueden contener SDS aproximadamente al 0,1% hasta aproximadamente el 1%. La duración de la hibridación es generalmente aproximadamente menor a 24 horas, usualmente aproximadamente de 4 hasta aproximadamente 12 horas.

La especificidad es típicamente la función de lavados posteriores a la hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución final de lavado. Para híbridos ADN-ADN, se puede aproximar la T_{m} a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284: T_{m} = 81,5ºC + 16,6 (log M) + 0,41 (% de GC) - 0,61 (% de form.) - 500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % e GC es el porcentaje de los nucleótidos guanosina y citosina en el ADN, % de form. es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La T_{m} es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos) a la cual 50% de la secuencia objetivo complementaria hibrida a una sonda perfectamente alineada. T_{m} se reduce aproximadamente en 1ºC por cada 1% de desalineación; de este modo, se pueden ajustar las condiciones de T_{m}, hibridación, y/o lavado para hibridar hasta secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con identidad \geq90%, se puede disminuir la T_{m} en 10ºC. Generalmente se seleccionan las condiciones rigurosas para ser aproximadamente 5ºC menores que el punto térmico de fusión T_{m} para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 1, 2, 3 ó 4ºC por debajo del punto térmico de fusión (T_{m}); las condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 ó 10ºC por debajo del punto térmico de fusión (T_{m}); las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15 ó 20ºC por debajo del punto térmico de fusión (T_{m}). Utilizando la ecuación, las composiciones e hibridación y de lavado, y la T_{m} deseada, aquellos normalmente capacitados entenderán que están inherentemente descritas las variaciones en la rigurosidad de las soluciones de hibridación y/o de lavado. Si el grado deseado de desalineación resulta en una T_{m} de menos de 45ºC (solución acuosa) ó 32ºC (solución de formamida), se prefiere incrementar la concentración de SSC de modo que se puede utilizar una mayor temperatura. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I. Chapter 2 (Elsevier, New York); y en Ausubely colaboradores, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Ver Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY).

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Proteínas Aisladas y Variantes y Fragmentos de las Mismas

Las proteínas de tolerancia al glifosato están también comprendidas dentro de la presente invención. Por proteína de tolerancia al glifosato se entiende una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID Nos.: 2, 4 ó 6. También se suministran fragmentos, porciones biológicamente activas, y variantes de las mismas, y pueden ser utilizadas para practicar los métodos de la presente invención.

Los "fragmentos" o las "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos de polipéptidos que contienen una porción de una secuencia de aminoácidos que codifican una proteína de tolerancia al glifosato como la expuesta en las SEQ ID Nos.: 2, 4 ó 6 y que retiene la actividad de tolerancia al glifosato. Una porción biológicamente activa de proteína de tolerancia al glifosato puede ser un polipéptido que sea, por ejemplo, de 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud. Tales porciones biológicamente activas pueden ser preparadas por medio de técnicas recombinantes y evaluadas por la actividad de tolerancia al glifosato. Los métodos para medir la actividad de resistencia al herbicida son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 4.535.060 y 5.188.642 las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Como se lo utiliza aquí, un fragmento contiene al menos 8 aminoácidos contiguos de las SEQ ID Nos.: 2, 4 ó 6. Sin embargo, la invención comprende otros fragmentos, tal como cualquier fragmento en la proteína aproximadamente superior a 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, ó 400 aminoácidos.

Por "variantes" se entiende proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 60%, 65%, aproximadamente al menos 70%, 75%, aproximadamente al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, ó 6 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 6, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, y 33 son variantes de la SEQ ID NO: 2). Las variantes también incluyen polipéptidos codificados por una molécula de ácido nucleico que hibrida a la molécula de ácido nucleico de las SEQ ID Nos.: 1, 3 ó 5, o un complemento de la misma, bajo condiciones estrictas. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a mutagénesis. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, que aún poseen la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, retienen la actividad de tolerancia al glifosato. Los métodos para medir la actividad de resistencia al herbicida son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos.: 4.535.060 y 5.188.642, las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Los genes bacterianos, tales como los genes grg23 o grg51 de esta invención, muy a menudo poseen múltiples codones de iniciación de metionina en la proximidad del inicio del marco de lectura abierta. A menudo, la iniciación de la traducción en uno o más de estos codones de inicio conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, bacterias tales como Bacillus sp. También reconocen al codón GTG como un codón de inicio, y las proteínas que inician la traducción en los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. Además, a menudo no se determina a priori cuál de estos codones son utilizados naturalmente en la bacteria. Por lo tanto, se entiende que el uso de uno de los codones alternos de metionina puede conducir a la generación de variantes de grg23 o grg51 que confieran tolerancia al glifosato. Estas proteínas de tolerancia al glifosato son abarcadas por la presente invención y pueden ser utilizadas en los métodos de la presente invención.

Anticuerpos para los polipéptidos de la presente invención, o para variantes o fragmentos de los mismos, son también abarcados. Los métodos para la producción de anticuerpos son conocidos en el arte (ver, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY); la patente estadounidense No. 4.196.265).

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Variantes Alteradas o Mejoradas

Se reconoce que la secuencia de ADN de grg23 o grg51 puede ser alterada por diferentes métodos, y que estas alteraciones pueden resultar en secuencias de ADN que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes que aquellas codificadas por grg23 o grg51. Esta proteína puede ser alterada en diferentes formas incluyendo sustituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en el arte. Por ejemplo, se pueden preparar variantes de la secuencia de aminoácidos de la proteína GRG23 o GRG51 por medio de mutaciones en el ADN. Esto se puede lograr también por medio de una de varas formas de mutagénesis y/o por medio de evolución dirigida. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectará sustancialmente la función de la proteína. Tales variantes poseerán la actividad deseada de tolerancia al glifosato. Sin embargo, se entiende que la habilidad de GRG23 o GRG51 para conferir tolerancia al glifosato puede ser mejorada por medio del uso de tales técnicas en las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, GRG23 o GRG51 se pueden expresar en células huésped que exhiben altas tasas de incorporación errada de bases durante la replicación del ADN, tal como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Después de la propagación en tales cepas, se puede aislar el ADN de grg23 o grg51 (por ejemplo por medio de la preparación de ADN de plásmido, o por medio de amplificación por PCR y clonación del fragmento resultante por PCR en un vector) y cultivarlo en cepas no mutagénicas. Los clones que contienen mutaciones en grg23 o grg51 pueden ser identificados midiendo la resistencia mejorada a un herbicida tal como el glifosato, por ejemplo cultivando células en cantidades crecientes de glifosato y analizando los clones que confieran tolerancia a concentraciones crecientes de glifosato.

Alternativamente, se pueden hacer alteraciones a la secuencia de la proteína de muchas proteínas en el terminal amino o carboxilo sin afectar sustancialmente la actividad. Estas alteraciones pueden incluir inserciones, supresiones o alteraciones introducidas por medio de métodos moleculares modernos, tales como PCR, incluidas amplificaciones por PCR que alteran o extienden la secuencia de codificación de la proteína en virtud de la inclusión de secuencias que codifican aminoácidos en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación por PCR. Alternativamente, las secuencias de proteína añadidas pueden incluir secuencias enteras que codifican proteína, tal como aquellas utilizadas comúnmente en el arte para generar fusiones de proteína. Tales proteínas de fusión son utilizadas a menudo para (1) incrementar la expresión de una proteína de interés; (2) introducir un dominio de enlazamiento, actividad enzimática o un epítopo para facilitar o bien la purificación de proteína, la detección de proteína u otros usos experimentales conocidos en el arte; o, (3) secreción objetivo o traducción de una proteína a un organelo subcelular, tal como el espacio periplasmático de bacterias gram negativas, o el retículo endoplasmático de células eucariotas, el último de los cuales a menudo resulta en glicosilación de la proteína.

Las variantes de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de la presente invención también abarcan secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos y recombinogénicos tales como el arrastre de ADN. Con tal procedimiento, una o más regiones diferentes de proteínas que codifican proteína de tolerancia al glifosato pueden ser utilizadas para crear una nueva proteína de tolerancia al glifosato que posee las propiedades deseadas. En esta forma, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas que contienen regiones de secuencia que tienen una identidad sustancial de secuencia y pueden ser recombinadas en forma homóloga in vitro o in vivo. Por ejemplo, utilizando esta aproximación, se pueden arrastrar motivos de secuencia que codifican un dominio de interés entre el gen de tolerancia al glifosato de la invención y otros genes de resistencia al herbicida para obtener un nuevo gen que codifica para una proteína con una propiedad mejorada de interés, tal como una mayor actividad de resistencia al glifosato. Las estrategias para tal arrastre del ADN son conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370: 389-391; Crameri y colaboradores, (1997) Nature Biotech. 15: 436-438; Moore y colaboradores, (1997) J. Mol. Biol. 272: 336-347; Zhang y colaboradores, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509; Crameri y colaboradores, (1998) Nature 391: 288-291; y las patentes estadounidenses Nos. 5.605.793 y 5.837.458.

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Transformación de Células Bacterianas o de Plantas

Se proporcionan aquí nuevos genes aislados que confieren tolerancia al glifosato. También se proporcionan secuencias de aminoácidos de las proteínas GRG23 y GRG51. La proteína resultante de la traducción de este gen permite que las células funcionen en presencia de concentraciones de un herbicida que son por lo demás tóxicas para las células de plantas y células bacterianas. En un aspecto de la invención, el gen grg23 o grg51 es útil como marcador para evaluar la transformación de células bacterianas o de plantas.

Por medio de una modificación por ingeniería genética de grg23 o grg51 para que (1) se expresen a partir de un promotor bacteriano que se sabe que estimula la transcripción en el organismo que va a ser analizado, (2) sean adecuadamente traducidos para generar un péptido intacto GRG23 o GRG51, y (3) colocando las células en una concentración por lo demás tóxica de herbicida, se pueden identificar las células que han sido transformadas con ADN en virtud de su resistencia al herbicida. Por "promotor" se entiende una secuencia de ácido nucleico que sirve para transcripción directa de una secuencia de codificación secuencia abajo. El promotor, junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de transcripción y de traducción (también llamadas "secuencias de control"), es necesario para la expresión de una secuencia de ADN de interés.

La transformación de células bacterianas se logra por medio de una de varias técnicas conocidas en el arte, incluyendo, pero sin limitarse a, electroporación o transformación química (ver, por ejemplo, Ausubel (ed.) (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., Indianapolis, IN)). Los marcadores que confieren resistencia a sustancias tóxicas son útiles en la identificación de células transformadas (habiendo incorporado y expresado el ADN de prueba), de células no transformadas (aquellas que no contienen o no expresan el ADN de prueba). En un aspecto de la invención, el gen grg23 o grg51 es útil como marcador para evaluar la transformación de células bacterianas o de plantas.

La transformación de células de plantas se puede lograr en una forma similar. Por "planta" se entienden plantas enteras, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células de plantas, propágulos, embriones y progenie de los mismos. Las células de las plantas pueden ser diferenciadas o no diferenciadas (por ejemplo, callos, células en un cultivo en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíz, células de floema, polen). "Plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o plantas "transformadas en forma estable", células o tejidos se refieren a plantas que han incorporado o integrado secuencias exógenas de ácido nucleico o fragmentos de ADN en la célula de la planta. Por "transformación estable" se entiende que la construcción de nucleótido introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y puede ser heredada por la progenie de la misma.

El gen grg23 o grg51 de la invención puede ser modificado para obtener una expresión mejorada en células de plantas. Las secuencias de tolerancia al glifosato de la invención pueden ser suministradas en casetes de expresión para expresión en la planta de interés. El "casete de expresión de la planta" incluye construcciones de ADN que pueden dar como resultado la expresión de una proteína de un marco de lectura abierto en una célula de una planta. El casete incluirá en la dirección 5'-3' de transcripción, una región de iniciación de la transcripción (es decir, promotora) operativamente enlazada a una secuencia de ADN de la invención, y una región de terminación de la transcripción y de la traducción (es decir, una región de terminación) funcionales en las plantas. El casete puede contener adicionalmente al menos un gen adicional que va a ser transformado conjuntamente en el organismo, tal como un gen marcador seleccionable. Alternativamente, se puede(n) suministrar un gen(es) adicional(es) sobre múltiples casetes de expresión. Tal casete de expresión cuenta con una pluralidad de sitios de restricción para inserción de la secuencia de tolerancia al glifosato que está bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

El promotor puede ser nativo o análogo, o exterior o heterólogo, a la planta huésped y/o a la secuencia de ADN de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Donde el promotor es "nativo" u "homólogo" a la planta huésped, se entiende que el promotor se encuentra en la planta nativa dentro de la cual se introduce el promotor. Donde el promotor es "exterior" o "heterólogo" a la secuencia de ADN de la invención, se entiende que el promotor no es el promotor nativo o de ocurrencia natural para la secuencia de ADN operativamente enlazada de la invención. "Heterólogo" generalmente se refiere a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas a la célula o parte del genoma nativo en el cual están presentes, y han sido añadidas a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, o similares. Por "operativamente enlazado" se entiende un enlazamiento funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en done la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, operativamente enlazado significa que las secuencias de ácido nucleico que va a ser enlazadas son contiguas y, donde sea necesario unir dos regiones de codificación de proteína, en forma contigua y en el mismo marco de lectura.

A menudo, tales construcciones contendrán también regiones no traducidas 5' y 3'. Tales construcciones pueden contener una "secuencia de señal" o "secuencia líder" para facilitar el transporte en forma conjunta con la traducción o posterior a la traducción del péptido de interés para ciertas estructuras intracelulares tales como el cloroplasto (u otro plástido), el retículo endoplasmático, o el aparato de Golgi, o son secretadas. Por ejemplo, se puede modificar por ingeniería genética el gen para contener un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplasmático. Por "secuencia de señal" se entiende una secuencia que se sabe o se sospecha que resulta en el transporte de un péptido en forma conjunta con la traducción o posterior a la traducción a través de la membrana de la célula. En eucariotas, este transporte involucra típicamente secreción dentro del aparato de Golgi, resultando en alguna glicosilación. Por "secuencia líder" se entiende cualquier secuencia que cuando es traducida, resulta en una secuencia de aminoácidos suficiente para activar el transporte en forma conjunta con la traducción de la cadena peptídica a un organelo subcelular. Por lo tanto, esto incluye secuencias líder que dirigen el transporte y/o la glicosilación por medio de un pasaje al retículo endoplasmático, a las vacuolas, plástidos incluidos cloroplastos, mitocondria y similares. Se puede modificar también por ingeniería genética el casete de expresión de la planta para contener un intrón, de tal manera que se requiere el procesamiento del ARNm del intrón para expresión.

Por "región 3' no traducida" se entiende una secuencia de nucleótido localizada secuencia debajo de una secuencia de codificación. Las secuencias de la señal de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar la adición de tramos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm son regiones 3' no traducidas. Por "región 5' no traducida" se entiende una secuencia de nucleótidos localizada secuencia arriba de una secuencia de codificación.

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Otros elementos no traducidos secuencia arriba o secuencia abajo incluyen reforzadores. Los reforzadores son secuencias de nucleótidos que actúan para incrementar la expresión de una región promotora. Los reforzadores son conocidos en el arte e incluyen, pero no se limitan a, la región reforzadora del SV40 y al elemento reforzador 35S.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de tolerancia al glifosato de la presente invención, o se puede derivar de otra fuente. Las regiones convenientes de terminación están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de la octopina sintasa y la nopalina sintasa. Ver también, Guerineau y colaboradores, (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon y colaboradores, (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen y colaboradores, (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe y colaboradores, (1990) Gene 91: 151-158; Ballas y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; y Joshi y colaboradores, (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.

Cuando sea apropiado, se puede(n) optimizar el(los) gen(es) para una mayor expresión en la célula huésped transformada. Esto es, se pueden sintetizar los genes utilizando codones preferidos de la célula huésped para una expresión mejorada, o se los puede sintetizar utilizando codones con una frecuencia de uso del codón preferida para el huésped. Generalmente, se incrementará el contenido de GC del gen. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11 para una discusión del uso del codón preferido para el huésped. Se conocen métodos en el estado del arte para sintetizar genes preferidos para el huésped. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 6.320.100; 6.075.185; 5.380.831; y 5.436.391, las solicitudes estadounidenses publicadas Nos. 20040005600 y 20010003849, y Murray y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498, incorporados aquí como referencia.

En una modalidad, los ácidos nucleicos de interés están dirigidos al cloroplasto para expresión. En esta forma, cuando el ácido nucleico de interés no es insertado directamente en el cloroplasto, el casete de expresión contendrá adicionalmente un ácido nucleico que codifica un péptido de transito para dirigir al producto génico de interés a los cloroplastos. Tales péptidos de transito son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Von Heijne y colaboradores, (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark y colaboradores, (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa y colaboradores, (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer y colaboradores, (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; y Shah y colaboradores, (1986) Science 233: 478-481.

Los ácidos nucleico de interés que son dirigidos al cloroplasto se pueden optimizar para expresión en el cloroplasto para explicar las diferencias en el uso del codón entre el núcleo de la planta y este organelo. En esta forma, se pueden sintetizar los ácidos nucleicos de interés utilizando codones preferidos para los cloroplastos. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.380.831, incorporada aquí como referencia.

Típicamente, se insertará este "casete de expresión de la planta" en un "vector de transformación de la planta". Por "vector de transformación" se entiende una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficiente de una célula. Tal molécula puede consistir de uno o más casetes de expresión, y puede ser organizada en más de una molécula "vector" de ADN. Por ejemplo, los vectores binarios son vectores para transformación de una planta que utilizan dos vectores no contiguos de ADN para codificar todas las funciones requisito que actúan en forma cis y trans para transformación de células de plantas (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5: 446-451). "Vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para transferencia entre diferentes células huésped. "Vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la habilidad para incorporar, integrar y expresar secuencias heterólogas de ADN o fragmentos en una célula foránea.

Este vector para transformación de una planta puede contener uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación de la planta. Por ejemplo, es una práctica común en el arte utilizar vectores para transformación de una planta que contengan más de un segmento contiguo de ADN. Estos vectores a menudo son denominados en el arte como "vectores binarios". Los vectores binarios así como los vectores con plásmidos auxiliares son más comúnmente utilizados para la transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr la transformación eficiente es muy grande, y es conveniente separar funciones en moléculas separadas de ADN. Los vectores binarios típicamente contienen un vector de plásmido que contiene las secuencias que actúan en forma cis necesarias para la transferencia de ADN-T (tales como el borde izquierdo y el borde derecho), un marcador seleccionable que es modificado por ingeniería genética que sea capaz de expresión en la célula de una planta, y un "gen de interés" (un gen modificado por ingeniería genética para que sea capaz de expresión en una célula de una planta para la cual se desea la generación de plantas transgénicas). También están presentes sobre este vector de plásmido las secuencias requeridas para replicación bacteriana. Las secuencias que actúan en forma cis están dispuestas en una forma para permitir la transferencia eficiente en células de plantas y la expresión allí dentro. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen de interés se localizan entre los bordes izquierdo y derecho. A menudo un segundo vector de plásmido contiene los factores que actúan en forma trans que median la transferencia de ADN-T de Agrobacterium a células de plantas. Este plásmido contiene a menudo las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de células de planta por Agrobacterium, y la transferencia de ADN por escisión en las secuencias del borde y la transferencia de ADN mediada por vir, como se entiende en el arte (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5: 446-451). Se pueden utilizar diferentes tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación de una planta. El segundo vector de plásmido no es necesario para la transformación de las plantas por otros métodos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilén glicol, etc.

Transformación de una Planta

Los métodos de la invención involucran la introducción de una construcción de nucleótido dentro de una planta. Por "introducción" se entiende presentar a la planta la construcción de nucleótido de tal manera que la construcción tenga acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren de la utilización de un método particular para la introducción de una construcción de nucleótido a una planta, únicamente que la construcción del nucleótido gane acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducción de construcciones de nucleótido dentro de plantas son conocidos en el arte, incluyendo, pero sin limitarse a, métodos de transformación estable, métodos d transformación transitoria, y métodos mediados por virus.

En general, los métodos para transformación de plantas involucran la transferencia de ADN heterólogo en células objetivo de plantas (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callos no diferenciados, protoplastos, etc.) seguido por la aplicación de un nivel máximo de umbral de selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable y en este caso "glifosato") para recuperar las células transformadas de las plantas de un grupo de una masa de células no transformadas. Típicamente se transfieren los explantes a un suministro fresco del mismo medio y se los cultiva en forma rutinaria. Posteriormente, se diferencian las células transformadas en brotes después de colocarlos sobre medio de regeneración suplementado con un nivel máximo de umbral de agente de selección (por ejemplo, "glifosato"). Se transfieren luego los brotes a un medio selectivo de enraizamiento para recuperar los brotes con raíces o plántulas. Las plántulas transgénicas crecen luego hasta plantas maduras y producen semillas maduras (por ejemplo, Hiei y colaboradores, (1994) The Plant Journal 6: 271-282; Ishida y colaboradores, (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750). Típicamente se transfieren los explantes a un suministro fresco del mismo medio y se los cultiva en forma rutinaria. Una descripción general de las técnicas y métodos para la generación de plantas transgénicas se encuentra en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13: 219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120. Ya que el material transformado contiene muchas células, están presentes tanto células transformadas como no transformadas en cualquier pedazo de callo objetivo sometido o tejido o grupo de células. La habilidad para matar células no transformadas y permitir que proliferen las células transformadas resulta en cultivos de plantas transformadas. A menudo, la habilidad para remover células no transformadas es una limitación para una recuperación rápida de células de plantas transformadas y la generación exitosa de plantas transgénicas. Se pueden utilizar métodos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de plantas transgénicas.

La generación de plantas transgénicas se puede realizar por medio de uno de varios métodos, incluyendo, pero sin limitarse a, la introducción de ADN heterólogo por medio de Agrobacterium en células de plantas (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células de plantas con ADN foráneo heterólogo adherido a partículas, y diferentes otros métodos no mediados directamente por partículas (por ejemplo, Hiei y colaboradores, (1994) The Plant Journal 6: 271-282; Ishida y colaboradores, (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750; Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13: 219-239; Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120) para transferir ADN.

Los métodos para transfroamción e cloroplastosson conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Svab y colaboradores, (1990) Proc. Natl. Acad Sci. USA 87: 8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12: 601-606. El método se basa en una pistola de partículas para el suministro de ADN que contiene un marcador seleccionable y dirigir el ADN al genoma del plástido a través de recombinación homóloga. Adicionalmente, se puede lograr la transformación del plástido por medio de transactivación de un transgén silencioso soportado por el plástido por medio de expresión preferida por el tejido de una ARN polimerasa dirigida al plástido y codificada en el núcleo. Tal sistema ha sido reportado en McBride y colaboradores, (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 7301-7305.

Las células que han sido transformadas pueden ser cultivadas en plantas de acuerdo con medios convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick y colaboradores, (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Se pueden cultivar luego estas plantas, y o bien polinizadas con la misma cepa trasformada o con cepas diferentes, y el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva de la característica fenotípica identificada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada sea mantenida y heredada en forma estable y luego se cosechan las semillas para garantizar que se ha logrado la expresión de las características fenotípicas deseadas. De esta forma, la presente invención proporciona semilla transformada (también denominada como "semilla transgénica") que tiene una construcción de nucleótidos de la invención, por ejemplo, un casete de expresión de la invención, incorporado en forma estable en su genoma.

Medición de la actividad de EPSPS

En una modalidad de la presente invención, la enzima EPSPS de tolerancia al glifosato tiene una K_{m} para fosfoenolpiruvato (PEP) aproximadamente entre 1 y aproximadamente 150 uM, incluyendo aproximadamente 2 uM, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 o aproximadamente 140 uM, y un K_{i} (glifosato)/K_{m} (PEP) aproximadamente entre 500 y aproximadamente 1000, aproximadamente 550, aproximadamente 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, o aproximadamente hasta 1000.Como se utiliza aquí, K_{m} y K_{i} se miden bajo condiciones en las cuales la enzima obedece la cinética de Michaelis-Menten, alrededor de pH 7. Una técnica de medición no limitante utiliza la enzima en forma purificada en cloruro de potasio amortiguador HEPES a pH 7 a temperatura ambiente y utiliza concentraciones de glifosato de 0 a 10 mM.

Se puede analizar la actividad cinética de EPSPS, por ejemplo, midiendo la liberación de fosfato que resulta durante la catálisis de un sustrato de EPSPS (por ejemplo, PEP y S3P) hasta su posterior producto de reacción (por ejemplo, ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico utilizando un ensayo fluorescente descrito por Vázquez y colaboradores, (2003) Anal. Biochem. 320(2): 292-298. Este ensayo se basa en la oxidación del compuesto no fluorescente N-acetil-3,7-dihidroxifenoxacina (Amplex® Red, Invitrogen, Carlsbad, CA) hasta el compuesto fluorescente resorufina por medio de peróxido de hidrógeno (Zhou y Panchuk-Voloshina (1997) Anal. Biochem. 253: 169-174). La reacción se basa en la utilización de fosfato por la purina nucleósido fosforilasa (PNP), xantina oxidasa (XOD), y peroxidasa de rábano (HRP). La liberación de fosfato está enlazada con el nivel de fluorescencia que resulta de la conversión de Amplex® Red en resorufina. Se puede medir la fluorescencia, por ejemplo, utilizando un filtro fluorométrico, un lector de placas, un espectrofluorómetro, un espectrofotómetro, o similares, utilizando métodos bien conocidos en el arte. La fluorescencia generada por la reacción puede ser detectada utilizando un fluorómetro para excitación en el rango aproximadamente de 530 hasta aproximadamente 560 nm y una emisión aproximadamente de 590 nm. Se puede detectar la absorbancia (por ejemplo, utilizando un espectrofotómetro un lector de placas) aproximadamente a 565 nm.

En una modalidad, la presente invención abarca una alteración de las condiciones de ensayo previamente reportadas para extender el rango dinámico del ensayo para acomodar un rango más amplio de concentraciones de sustrato. Las alteraciones incluyen una concentración de XOD de al menos 1 U/ml, aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1,25 U/ml, aproximadamente 1,25 hasta aproximadamente 1,5 U/ml, aproximadamente 1,5 hasta aproximadamente 2 U/ml, o superior a 2 U/ml; una concentración de PNP superior a 0,1 U/ml, aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 0,5 U/ml, aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 1 U/ml, aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1,5 U/ml, aproximadamente 1,5 hasta aproximadamente 2 U/ml, o superior a 2 U/ml; y una concentración de Amplex® Red superior a 100 \muM, aproximadamente 100 hasta aproximadamente 200 \muM, aproximadamente 200 hasta aproximadamente 300 \muM, aproximadamente 300 hasta aproximadamente 400 \muM, aproximadamente 400 hasta aproximadamente 500 \muM, aproximadamente 500 hasta aproximadamente 600 \muM, aproximadamente 700 hasta aproximadamente 800 \muM, aproximadamente 800 hasta aproximadamente 900 \muM, aproximadamente 900 hasta aproximadamente 1000 \muM, o aproximadamente superior a 1000 \muM. Esta modificación se puede aplicar a ensayos que miden la actividad cinética de cualquier enzima en los cuales se libera fosfato durante una reacción catalizada por la enzima.

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Plantas

La presente invención puede ser utilizada para la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero sin limitarse a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza oleaginosa, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, maní, batata, yuca, café, coco, piña, árboles de cítricos, cacao, té, banano, aguacate, higo, guayaba, mango, oliva, papaya, marañón, macadamia, almendro, avena, vegetales, plantas ornamentales y coníferas.

Los vegetales incluyen, pero no se limitan a, tomates, lechuga, judías verdes, habas, guisantes, y los miembros del género Curcumis tales como pepino, melón cantalupo y melón almizcle. Las plantas ornamentales incluyen, pero no se limitan a, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, clavel, flor de pascua, y crisantemo. Preferentemente, las plantas de la presente invención son las plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, chile, papa, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza oleaginosa, etc.).

Esta invención es especialmente adecuada para cualquier miembro de la familia de las plantas monocotiledóneas, incluyendo pero sin limitarse a, maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, piña, hilazas, cebolla, banano, coco, y dátiles.

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Evaluación de la Transformación de la Planta

Después de la introducción de ADN foráneo heterólogo en células de plantas, se confirma la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta por medio de diferentes métodos tales como el análisis de los ácidos nucleico, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

El análisis por PCR es un método rápido para seleccionar células transformadas, tejido o brotes por la presencia del gen incorporado en la etapa anterior antes de la trasplantación en el suelo (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)). Se lleva a cabo la PCR utilizando iniciadores oligonucleótidos específicos para el gen de interés o el ambiente de un vector de Agrobacterium, etc.

Se puede confirmar la transformación de la planta por medio de un análisis de transferencias tipo Southern de ADN genómico (Sambrook y Russell (2001), (ver más arriba)). En general, se extrae el ADN total del transformante, digerido con enzimas de restricción apropiadas, fraccionado en un gel de agarosa y transferido a una membrana de nylon o de nitrocelulosa. La membrana o "transferencia" puede ser sondeada luego, por ejemplo, con un fragmento de ADN objetivo marcado en forma radioactiva con ^{32}P para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas estándar (Sambrook y Russell (2001), (ver más arriba)).

En el análisis tipo Northern, se aísla ARN de tejidos específicos de transformante, fraccionado en un gel de agarosa de formaldehido, y se lo transfiere sobre un filtro de nylon de acuerdo con procedimientos estándar que son rutinariamente utilizados en el arte (Sambrook y Russell (2001), (ver más arriba)). La expresión del ARN codificado por grgr23 o grg51 es luego analizada por medio de hibridación del filtro a una sonda radioactiva derivada de un GDC por medio de métodos conocidos en el arte (Sambrook y Russell (2001), (ver más arriba)).

Se pueden llevar a cabo una transferencia tipo Western y ensayos bioquímicos y similares sobre las plantas transgénicas para determinar la presencia de proteína codificada por el gen de resistencia al herbicida por medio de procedimientos estándar (Sambrook y Russell (2001), (ver más arriba)) utilizando anticuerpos que se enlazan a uno o más epítopos presentes sobre la proteína de resistencia al herbicida.

Se ofrecen los siguientes ejemplos a manera de ilustración y no como una limitación.

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Experimental Ejemplo 1 Aislamiento de ATX21308

Se aisló ATX21308 sembrando muestras de suelo en placa sobre Medio Mínimo Enriquecido 3 (EMM3) que contiene fosfatos y glifosato 50 mM. Ya que EMM3 contiene aminoácidos no aromáticos, una cepa debe ser resistente al glifosato con el propósito de crecer sobre este medio.

Se suspende aproximadamente un gramo de suelo en aproximadamente 10 ml de agua, y se mezcla en un agitador de vórtice durante 5 segundos. Se añaden 100 \mul de esta suspensión a 1 ml de EMM3 con fosfato pero sin glifosato. EMM3 contiene (por litro, pH 7,0): 10 g de sacarosa, 1 g de NH_{4}Cl, 0,2 g de MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O, 0,01 g de FeSO_{4} \cdot 7H_{2}O, 0.007 g de MnSO_{4} \cdot H_{2}O y 10 ml de solución de fosfato que contiene (por litro, pH 7,0) 210 g de Na_{2}HPO_{4} y 90 g de NaH_{2}PO_{4}. Se agita el cultivo sobre un tambor de rodillos para cultivo de tejidos a 21ºC durante la noche y luego se siembra en placas sobre agar EMM3 que contiene glifosato 50 mM. Después de tres días, se siembra en placa lo aislado sobre agar Luria Bertani (LB) agar para confirmarla morfología única. Después de seis días, se siembra una sola colonia en agar EMM3 que contiene glifosato 50 mM. Lo aislado creció durante la noche sobre placas de glifosato 50 mM. Se seleccionó una cepa particular, denominada ATX21308, debido a su habilidad para crece en presencia de altas concentraciones de glifosato. Se analiza esta cepa por su habilidad para crecer en presencia de glifosato en un cultivo líquido y es capaz de crecer aproximadamente hasta una concentración de glifosato de 300 mM bajo las condiciones analizadas.

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Ejemplo 2 Preparación y Selección de Bibliotecas de Cósmidos

Se extrajo el ADN total de un cultivo de ATX21308 utilizando métodos comúnmente conocidos en el arte. Se digirió parcialmente el ADN con la enzima de restricción Sau3A1 y se lo ligó con un fragmento del vector SuperCos (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se empacaron los productos de la ligación en partículas de fago utilizando el extracto de empaquetamiento GigaPack III XL (Stratagene), se transfectó en células de E. coli, y se sembró en placa sobre Agar LB que contiene 50 \mug/ml de kanamicina para seleccionar las colonias que contienen cósmidos.

Se recogieron las colonias individuales en placas de 384 pozos que contienen caldo LB y 50 \mug/ml de kanamicina, y cultivadas hasta saturación. Se diluyeron las células de estos cultivos 1:10, luego se las depositó sobre placas de agar M63 que contenían 50 \mug/ml de kanamicina, y o bien 0 mM, 10 mM, 20 mM, ó 50 mM de glifosato. [medio de agar M63, KH_{2}PO_{4} 100 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 15 mM, CaCl_{2} 50 \muM, FeSO_{4} 1 \muM, MgCl_{2} 50 \muM, glucosa 55 mM, 25 mg/litro de L-prolina, 10 mg/litro de clorhidrato de tiamina, suficiente NaOH para ajustar el pH en 7,0, y 15 g/litro de agar]. Se aislaron los transformantes que crecieron más rápidamente con las concentraciones más altas de glifosato y se las digirió con enzima de restricción EcoRI para identificar cósmidos con patrones de restricción compartidos. Se identificaron diferentes clones que crecieron en presencia de glifosato y que comparten patrones de restricción similares con EcoRI. Se seleccionó uno de estos clones cósmidos, pAX1924, para experimentos adicionales.

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Ejemplo 3 Identificación de grg23 en el cósmido pAX1924

Para identificar al gen(es) responsable(s) por la resistencia al glifosato mostrada por el cósmido pAX1924, se hace mutar al ADN de este clon con elementos transponibles. En este método, se identifican los clones que han sufrido inserciones de transposones y que han perdido la habilidad para conferir resistencia al glifosato. La ubicación de las inserciones de transposones identifica al marco de lectura abierta responsable por el fenotipo de resistencia al glifosato.

Se somete al cósmido pAX1924 a mutagénesis del transposón in vitro utilizando un Kit de Inserción EZ::TN (Epicentre, Madison, WI) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Este proceso inserta en forma aleatoria un fragmento de transposón dentro del ADN del cósmido y por lo tanto perturba aleatoriamente la función de los genes en el cósmido. Este transposón particular contiene un gen que codifica la resistencia al trimetoprim, de ese modo se pueden seleccionar los clones de inserción del transposón por medio de la habilidad para crecer en presencia de ese antibiótico. Las ubicaciones de las inserciones de transposón se pueden determinar por medio del mapeo del fragmento de restricción o por medio de la secuenciación con iniciadores que se aparean en el transposón. Los clones para inserción del transposón de pAX1924 se siembran en placa sobre medio M63 que contiene glifosato. Se identifican múltiples clones que contienen al transposón que han perdido la habilidad para crecer en presencia de glifosato, indicando que el transposón ha perturbado al gen responsable de la resistencia.

Se determina la secuencia de ADN para la región de pAX1924 que contiene las inserciones de transposón utilizando métodos de secuenciación conocidos en el arte. Utilizando esta información de la secuencia, se sintetizan iniciadores de ADN y se los utiliza para determinar la secuencia de ADN de pAX1924 en la región que abarca las inserciones de transposón. El análisis de la secuencia resultante de ADN muestra que esta región contiene un único gen. Este gen es denominado aquí como grg23. El análisis de grg23 muestra que es capaz de producir dos posibles proteínas en células bacterianas debido a la presencia de sitios alternos potenciales de inicio de la traducción. El primer ORF (ORF1) inicia con un codón de inicio GTG en las posiciones 109-111 de la SEQ ID NO: 1, y termina en el codón de detención TAG en los nucleótidos 1417-1419 de la SEQ ID NO: 1. El segundo ORF (ORF2) inicia en un codón de inicio ATG en los nucleótidos 178-180 de la SEQ ID NO: 1, y termina en el codón de detención TAG en los nucleótidos 1417-1419 de la SEQ ID NO: 1. La traducción de ORF1 produce la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2. La traducción de ORF2 produce la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4.

El análisis de la región de ADN que rodea a grg23 sugiere que ORF2 está precedido por un sitio de enlazamiento del ribosoma, mientras que no existe un sitio obvio de enlazamiento del ribosoma precediendo el inicio de la traducción de ORF1. Además, la alineación de ambos marcos de lectura abierta con enzimas representativas EPSPS muestra que pocas enzimas EPSPS contienen esta extensión en el terminal N codificada dentro de ORF1.En consecuencia, el ORF funcional codificado por grg23 en bacterias es ORF2. Por lo tanto, como se lo utiliza aquí, GRG23 se refiere a aquella que s codificada por ORF2 (nucleótidos 178-1419 de la SEQ ID NO: 1). Sin embargo, se sabe en el arte que las enzimas EPSPS son bastante tolerantes a aminoácidos adicionales en su terminal N. Por lo tanto, la expresión de ORF1 (nu-
cleótidos 109-1419 de la SEQ ID NO: 1) debe producir también una EPSPS que confiera resistencia al glifosato.

Para analizar la habilidad de ORF2 para funcionar como una EPSPS y conferir resistencia al glifosato sobre las células, se puede subclonar este marco de lectura abierta y expresarlo en E. coli.

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Ejemplo 4 Subclonación de grg23 en vectores para expresión en E. coli

El gen que codifica al ORF2 de la GRG23 (iniciando con ATG (posiciones 178-180 de la SEQ ID NO: 1), que expresa una proteína de 413 aminoácidos) fue subclonado en pUC 18 y pRSF1b utilizando la misma estrategia de clonación esbozada anteriormente. Se sintetizó un iniciador para PCR [5' CAGGGATCCGGCATGGAAACT
GATCGACTAGTG 3'] que añade un sitio BamHI seguido por GGC (5'-GGATCCGGC-3') inmediatamente 5' del sitio de inicio. Se sintetizó un 2do iniciador [5' ATTGGCGCGCCCTAGCCGGGGAGCGTAAG 3'] que añade un sitio AscI inmediatamente 3' de la secuencia de detención (5'-GGCGCGCC-3'). Se amplifica la región de codificación de grg23 por PCR utilizando la ADN polimerasa PFUULTRA^{TM} (Stratagene). Después de la amplificación por PCR de grg23 utilizando estos iniciadores y de la digestión de restricción con BamHI/AscI, se ligó el producto de la PCR dentro de pUC 19 (digerido con BamHI y AscI) y pRSF1b (digerido con BamHI y AscI), y se obtuvieron colonias que contienen inserto. Se confirmó al clon pUC18-grg23 (denominado aquí como pAX1927) por medio de digestión de restricción y por secuenciación del ADN.

En forma similar, se digirió el vector de expresión pAX1909 con BamHI y AscI, y se purificó por gel al vector que contiene al fragmento por medio de métodos conocidos en el arte. pAX1909 es un derivado de PRSF-1b (Novagen, San Diego, CA), modificado para contener un sitio BamHI directamente 3' de la región que codifica a la histidina rica en "His-Tag". De este modo, las proteínas clonadas dentro de pAX1909 son fusiones en el marco que contienen los aminoácidos adicionales MAHHHHHHGSG. Se desarrollan típicamente vectores tales como pAX1909 para expresión y purificación de proteína, y estos métodos son conocidos en el arte.

Se ligó el producto PCR digerido que resultó más arriba dentro del vector digerido pAX1909, y se obtuvieron las colonias que contienen el inserto. Se confirmó el clon pAX1909-grg23 (denominado aquí como pAX1926) por medio de digestión de restricción y por secuenciación de ADN. La forma de construcción de pAX1926 es tal que el producto predicho de la traducción GRG23 contiene una extensión del terminal amino que consta de. Esta extensión del terminal N contiene una "etiqueta de histidina" o una "etiqueta de seis residuos de His" que son útiles para facilitar la purificación de la proteína GRG23, como se sabe en el arte.

El plásmido pAX1926 que contiene el ORF2 de grg23 ha sido depositado en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL) el 18 de noviembre de 2005, y al que se le asignó el número de acceso NRRL B-30888.

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Ejemplo 5 grg23 Confiere Resistencia a Altos Niveles de Glifosato

La construcción pUC18-Grg23 (pAX1927) fue transformada dentro de la cepa DH5\alpha de E. coli y sembrada sobre placas de agar LB suplementado con carbenicilina (0,1 mg/mL). Se seleccionaron dos colonias, se las resuspendió en agua estéril, y se las sembró sobre placas M63 que contenían glifosato ya sea 0 mM, 25 mM, 50 mM ó 100 mM. Se añadió también a las placas isopropil-B-D-tiogalactopiranósido (IPTG; 0,1 mM). Como control, se transformaron células que contenían únicamente al vector pUC 18 y se las sembró sobre placas de glifosato. Después de dos días de desarrollo, se examinó el crecimiento en estas placas (Tabla 1).

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TABLA 1

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Este resultado confirma que la expresión de grg23 para producir GRG23-ORF2 confiere resistencia al glifosato en E. coli al menos hasta 100 mM. Adicionalmente, el crecimiento de E. coli que contenía pAX1927 es más fuerte en presencia de glifosato que en ausencia de glifosato.

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Ejemplo 6 Homología de GRG23 con Otras Proteínas

La secuencia deducida de aminoácidos de GRG23 tiene homología con las enzimas EPSPS, indicando que grg23 codifica una EPSPS.

El examen de la secuencia deducida de aminoácidos de GRG-ORF2 (SEQ ID NO: 4) revela que no contiene los cuatro dominios típicos de las enzimas EPSPS Clase II. Por lo tanto es una nueva EPSPS resistente al glifosato que no es de Clase II.

La búsqueda en bases de datos públicamente disponibles de proteína, tales como SWISSPROT, revela que GRG23 tiene una similitud de aminoácidos con la amplia clase de enzimas EPSPS. Sin embargo, ninguna proteína en ninguna base de datos tiene más de un 50% de identidad con la secuencia de aminoácidos de GRG23. En la Figura 1 se muestra una alineación representativa de GRG23 con otras enzimas EPSPS.

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Ejemplo 7 Purificación de GRG23

La construcción pRSF1b-grg23 (pAX1926) fue expresada en E. coli después de la inducción con IPTG, y purificada en una sola etapa utilizando una columna cromatográfica de cobalto como se conoce en el arte. Después de la elución de la columna, se dializó la GRG23 purificada contra HEPES 50 mM/KCl 100 mM, pH 7,0. La proteína era más de un 95% pura según lo evaluado por PAGE. Se cuantificó la cantidad de GRG23 utilizando el método de Bradford, como se conoce en el arte (Bradford (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254).

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Ejemplo 8 Análisis Cinéticos de la Actividad de GRG23

Se analizaron las muestras de proteínas purificadas por la actividad de EPSPS utilizando un análisis cinético que involucra la incubación de PEP (Sigma, St. Louis, MO) y S3P en un amortiguador que contiene cloruro de potasio y HEPES a pH 7,0. Se detectó la liberación de fosfato utilizando un ensayo acoplado para la detección fluorescente de fosfato con base en la generación de Amplex Red, como se conoce en el arte (Vázquez y colaboradores (2003) Anal. Biochem. 320: 292-298).

Las condiciones publicadas del ensayo pueden conducir a saturación del ensayo en experimentos en donde se libera fosfato muy rápidamente. Esta saturación limita un poco el rango dinámico del ensayo, y requiere de un rango definido de concentraciones de enzima. Se determinó que la limitación cinética del ensayo de fosfato fluorescente es aparentemente debida a una combinación de factores, incluida una limitación de inosina y PNP. En la presente invención, se han desarrollado condiciones del ensayo que producen un rango dinámico sustancialmente mejorado y permiten el uso de un rango más amplio de concentraciones de enzima y de sustrato. Las condiciones del ensayo que han sido significativamente cambiadas incluyen las concentraciones de la purina nucleósido fosfatasa (PNP), xantina oxidasa (XOD), AMPLEX® Red, e inosina, cada una de las cuales se incrementó en concentración en el ensayo para acomodar mayores tasas de renovación de fosfato. Se adaptó este ensayo para usarlo para medir la actividad de EPSPS en un formato de 96 pozos con las siguientes mejoras:

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TABLA 2 Un ensayo fluorescente mejorado

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Los ensayos enzimáticos fueron llevados a cabo en placas de 96 pozos en un volumen total de 50 uL. Las reacciones fueron llevadas a cabo a temperatura ambiente a pH 7,0. Se combinaron todos los componentes del ensayo excepto PEP, EPSPS, y S3P en un Master Mix y se colocaron alícuotas en una placa de 96 pozos utilizando un pipeteador de múltiples canales. Se añadieron luego concentraciones apropiadas de PEP a cada pozo. Se prepararon diluciones frescas de EPSPS y fueron añadidas a los pozos respectivos. Se inició cada ensayo por medio de la adición de S3P.

Se graficaron los datos de velocidad y se determinaron los parámetros cinéticos K_{m} y K_{cat} por medio del uso de la aplicación de la ecuación de Michaelis-Menten utilizando un programa no lineal de ajuste de la curva
(KALEIDAGRAPH®, Synergy Software). Se determinaron los datos de K_{i} por medio de la medición de la K_{m}(app) con múltiples concentraciones de glifosato, y graficando K_{m}(app) como función de la concentración del inhibidor.

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TABLA 3 Efecto del Glifosato sobre la K_{m}(app) de GRG23

3

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Graficando la K_{m}(app) como función de la concentración de glifosato, se puede obtener una representación lineal de la resistencia al glifosato de GRG23. El intercepto X de la línea resultante representa la -K_{i}. Graficando esta línea con los datos mostrados en la tabla 3 produce los siguientes datos:

TABLA 4 Valores cinéticos para GRG23

4

GRG23 es muy resistente al glifosato, con una K_{i} por encima de 9 mM, y una proporción de K_{i}/K_{m} por encima de 800.

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Ejemplo 9 Aislamiento de ATX21313

Para la cepa ATX 21313, se suspendió aproximadamente un gramo de suelo en 10 ml de agua, y se utilizaron 100 \mul para inocular 1 ml de cultivo de medio A de sales minerales (MSMA) y sin glifosato. MSMA contiene (por litro, pH 7,0) 1 g de NH_{4}Cl, 10 g de sacarosa, 0,2 de MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O, 0,01 g de FeSO_{4} \cdot 7H_{2}O, 0,007 g de MnSO_{4} \cdot H_{2}O suplementado con fosfatos. Después de incubación durante la noche, se sembró el cultivo en placas sobre un medio sólido que contiene MSMA y glifosato 50 mM, se incubó durante unos pocos días, y se inoculó sobre placas de agar Luria Bertani para confirmar un tipo único de colonia. Se reconfirmó el crecimiento en presencia de glifosato 50 mM cultivando nuevamente sobre MSMA, placas de agar 50 mM. Este método de aislamiento produjo la cepa ATX21313, que fue capaz de crecer bien bajo estas condiciones.

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Ejemplo 10 Clonación de EPSP Sintasas resistentes al glifosato

Se extrajo ADN genómico de la cepa ATX21313 y el ADN resultante fue parcialmente digerido con la enzima de restricción Sau3A 1 para producir fragmentos de ADN de aproximadamente 5 kilobases de tamaño. Estas moléculas de ADN fueron seleccionadas por tamaño sobre geles de agarosa, purificadas, y ligadas dentro de las ramas del vector LAMBDA ZAP® predigeridas con BamHI. Las ramas ligadas fueron empacadas luego en partículas de fago, y se determinaron los títulos del fago como se conoce en el arte. Las bibliotecas resultantes fueron amplificadas por medio de métodos conocidos en el arte para generar un título de biblioteca entre 3 x 10^{7} y 3 x 10^{8} PFU/mL. Para cada biblioteca independiente se cotransfectó luego E. coli (XL1 Blue MRF') con el fago de una biblioteca amplificada así como dentro del fago auxiliar M13 para permitir la extirpación de la masa de la biblioteca en la forma de un ADNss circular infeccioso como se conoce en el arte (Short y colaboradores, (1988) Nucleic Acids Research 16: 7583-7600). Después de la centrifugación de las células coinfectadas, se calentó el sobrenadante que contiene al fago a 65-70ºC durante 15-20 minutos para incapacitar cualquiera de las partículas residuales el fago lambda. Las diluciones de la biblioteca resultante del plásmido de ADNss fueron transfectadas en un cultivo fresco de células competentes XL1 Blue MRF' de E. coli y también células XL-Blue MRF' (\DeltaaroA) (XL1 Blue MRF'). Se sembraron en placa las células transfectadas resultantes sobre placas M63 que contenían Kanamicina, IPTG 0,1 mM y glifosato ya sea 0 mM, 20 mM ó 50 mM. Este método de selección permite la identificación de clones que contienen EPSP sintasas tolerantes al glifosato, así como clones que portan la tolerancia al glifosato. Se recolectaron las colonias que crecen sobre glifosato 20 mM ó 50 mM en la cepa \DeltaaroA o XL-Blue MRF' y se analizaron sus plásmidos por medio de digestión de restricción para identificar plásmidos con patrones de restricción compartidos. Se secuenciaron los plásmidos individuales por medio de métodos conocidos en el arte, dando preferencia a los plásmidos que confieren resistencia a glifosato 50 mM.

Utilizando este enfoque, algunas veces modificado para cada biblioteca como se conoce y se aprecia en el arte, se identificaron clones de biblioteca que contienen genes para la EPSP sintasa.

Se determinaron las secuencias de las regiones de los clones resultantes en la región de la EPSP sintasa.

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Ejemplo 11 Secuencias de proteína y de ADN de las EPSP sintasas

Se determinó la secuencia d ADN de la EPSP sintasa resistente al glifosato para pAX1967 por medio de métodos conocidos en el arte. Se proporciona aquí la secuencia de ADN de grg51 como la SEQ ID NO: 5. Se proporción aquí el producto predicho de la traducción de grg51 (GRG51) como la SEQ ID NO: 6. GRG51 muestra 97% de identidad de aminoácidos con GRG23 (SEQ ID NO: 2).

El plásmido pAX1967 que contiene grg51 ha sido depositado en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL) el 26 de junio de 2006, y se le asignó el número de acceso NRRL B-30949.

La Tabla 5 resume la homología de GRG23 y GRG51 con otras enzimas EPSP sintasa.

TABLA 5 Identidad de aminoácidos de GRG23-ORF1 y GRG51 para enzimas representativas EPSPS

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Ejemplo 12 Clonación de nuevas EPSP sintasas resistentes al Glifosato en un vector de Expresión de E. coli

Se subclonó el gen grg51 contenido en pAX1967 en el vector de expresión pRSF1b de E. coli (Invitrogen). Se confirmaron los clones resultantes por medio de la secuenciación de ADN, y se los utilizó para inducir la expresión de grg51 en E. coli. La proteína expresada etiquetada con His fue luego purificada como se conoce en el arte.

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Ejemplo 13 Resistencia al glifosato de las EPSP sintasas

Se sembraron en placa células que contenían pAX1967 sobre placas de M63+ que contenían antibiótico y glifosato ya sea 0 mM ó 20 mM. Se anotó el crecimiento después de dos días de crecimiento a 37ºC. Se observó que GRG51 confiere resistencia a glifosato 20 mM en células de E. coli (Tabla 6).

6

Ejemplo 14 Diseño y expresión de syngrg23

Se diseñó y sintetizó una nueva secuencia génica que codifica la proteína GRG23 (SEQ ID NO: 2; solicitud de patente estadounidense No. 60/741.166 presentada el 1 de diciembre de 2005). Esta secuencia es suministrada como la SEQ ID NO: 12. Este marco de lectura abierto, denominado aquí "syngrg23", fue clonado en el vector de expresión pRFS1b (Invitrogen), por medio de métodos conocidos en el arte.

El gen syngrg23 que codifica a GRG23 fue clonado en un vector pUC 19 para crear pAX748. Se utilizaron iniciadores para PCR que flanquean a syngrg23 en este vector para amplificar a syngrg23 a partir de pAX748 utilizando el sistema MUTAZYME® II (Stratagene) para introducir mutaciones aleatorias dentro de la región de codificación de syngrg23. Se diluyó el molde 1:50 en la reacción PCR propensa a error, y se llevó a cabo la amplificación durante 30 ciclos. Se digirió el producto PCR resultante con las enzimas de restricción BamHI y SgsI, purificado por gel, y ligado dentro del vector pRSF1b para crear una biblioteca mutagenizada de syngrg23.

Se transformaron las bibliotecas mutagenizadas de syngrg23 dentro de la cepa BL21*DE3 estrella de E. coli (Invitrogen). Después de la transformación, se sembraron en placa colonias individuales sobre medio 1x M63 que contiene glifosato 150 mM para seleccionar los clones que tenían actividad enzimática retenida y tolerancia al crecimiento.

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Ejemplo 15 Selección para la resistencia al glifosato sobre placas

Se transformaron ligaciones de bibliotecas dentro de células de E. coli competentes con BL21*DE3 (Invitrogen). Se llevaron a cabo las transformaciones de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones. Después de incubar durante 1 hora a 37ºC en medio SOC, se sedimentaron las células por centrifugación (5 minutos, 1000 x g, 4ºC). Se lavaron las células con 1 ml de M63+, se centrifugó nuevamente, y se decantó el sobrenadante. Se lavaron las células una segunda vez con 1 ml de M63+ y se las resuspendió en 20 \mul de M63+.

Para la selección de enzimas GRG23 mutantes que confieren resistencia al glifosato en E. coli, se sembraron las células sobre placas con medio agar M63+ que contenía glifosato 150 mM, IPTG 0,05 mM (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido), y 50 \mug/ml de kanamicina. El medio M63+ contiene KH_{2}PO_{4} 100 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 15 mM, CaCl_{2} 50 \muM, FeSO_{4} 1 \muM, MgCl_{2} 50 \muM, glucosa 55 mM, 25 mg/litro de L-prolina, 10 mg/litro de clorhidrato de tiamina, suficiente NaOH para ajustar el pH en 7,0, y 15 g/litro de agar. Se incubaron las placas durante 36 horas a 37ºC.

Se recogieron colonias individuales y se las colocó en placas de 384 pozos. Se crearon de esta forma placas de 384 pozos. Se recogió una tercera placa de 384 clones a partir de las colonias que crecieron sobre placas que carecían de glifosato.

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Ejemplo 16 Aislamiento y análisis de variantes de GRG23 resistentes al glifosato

Se identificaron las células BL21*DE3 transformadas con syngrg23 mutagenizado y/o variantes de grg23 por medio del crecimiento sobre placas de glifosato. Se prepararon extractos de syngrg23 mutagenizado y variantes de grg23 y se analizó la actividad enzimática mejorada. Las colonias identificadas sobre placas de glifosato fueron colocadas en bloques de 96 pozos que contenían medio LB y crecieron hasta un O. D. aproximadamente de 0,6. Se añadió luego IPTG (0,5 mM) y se incubaron los bloques durante la noche a 20ºC para inducir la expresión de la proteína. Se prepararon extractos de proteína a partir de los precipitados celulares utilizando un reactivo de cultivo POP (Novagen) y Lysonase (Novagen), y se midió la actividad enzimática en los lisados crudos después de calentar los extractos durante 30 min a 37ºC. Se seleccionaron los extractos con actividad superior a dos desviaciones estándar por encima del promedio
de un conjunto de extractos que contienen la proteína apropiada de control (por ejemplo GRG23) para otros análisis.

Los clones que muestran mayor actividad después de la incubación como extractos crudos fueron cultivados en cultivos de 250 mL de LB, y expresión de proteína inducida con IPTG. Después de la inducción, se purificó proteína mutante GRG23 de cada cultivo por medio de cromatografía de afinidad utilizando una resina de cobalto (Novagen). Se analizaron luego las proteínas purificadas para actividad enzimática después de calentamiento durante 0, 2, 4, y aproximadamente 16 horas a 37ºC.

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Ejemplo 17 Variantes GRG23 mejoradas

A partir de una biblioteca de ADN de syngrg23 mutagenizada, se identificaron diferentes clones con actividad mejorada. Se determinaron las secuencias de ADN de los clones correspondientes a estos extractos. La Tabla 7 muestra los cambios de aminoácidos identificados en seis variantes de GRG23 que retuvieron la resistencia al glifosato: grg23 (L3P1.B20) (SEQ ID NO: 26) que codifica la secuencia de aminoácidos de GRG23 (L3P1.B20) (SEQ ID NO: 27); grg23 (L3P1.B23) (SEQ ID NO: 28) que codifica la secuencia de aminoácidos de GRG23 (L3P1.B3) (SEQ ID NO: 29); grg23 (L3P1.F18) (SEQ ID NO: 30) que codifica la secuencia de aminoácidos de GRG23 (L3P1.F18) (SEQ ID NO: 31); y grg23 (L3P1.O23) SEQ ID NO: 31, que codifica la secuencia de aminoácidos de GRG23 (L3P1.O23) (SEQ ID NO:32).

TABLA 7 Mutaciones identificadas en variantes de GRG23 resistentes al glifosato

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Se cultivaron los clones en 250 mL de cultivos LB, y la expresión de la proteína inducida y aislada como se describió anteriormente. Se analizó luego la actividad enzimática de las proteínas purificadas después del calentamiento durante 0, 2, 4, y aproximadamente 16 horas a 37ºC. Se encontró que uno de estos clones, llamado "M5", retiene una mayor proporción de su actividad enzimática después de una incubación prolongada a 37ºC (Tabla 8). Se determinó la secuencia de ADN de este clon, y el gen denominado aquí como grg23 (ace1) (SEQ ID NO: 14). La proteína expresada a partir de grg23 (ace1) es denominada GRG23 (ACE1) (SEQ ID NO: 15).

TABLA 8 Vida media de GRG23 (ACE1) versus GRG23 a temperatura elevada

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GRG23 (ACE1) contiene 2 sustituciones de aminoácidos con relación a la proteína GRG23 de tipo silvestre: A49\rightarrowT y S276\rightarrowT. El vector pRSF1b que contiene este gen es denominado pAX3801. La Figura 1 muestra la estabilidad relativa de GRG23 (ACE1) versus GRG23 a temperaturas elevadas.

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Ejemplo 18 Determinación de la actividad de EPSPS de las variantes de GRG-23

Se analizó la actividad de la EPSP sintasa de los extractos que contienen proteínas variantes de GRG23 como se describe en la solicitud de patente estadounidense No. 60/741.166, presentada el 1 de diciembre de 2005, incorporada aquí como referencia en su totalidad. Se llevaron a cabo los ensayos en un volumen final de 50 \mul que contiene shikimato-3-fosfato 0,5 mM, fosfoenolpiruvato 200 uM (PEP), 1 U/ml de xantina oxidasa, 2 U/ml de nucleósido fosforilasa, inosina 2,25 mM, 1 U/ml de peroxidasa de rábano, glifosato 0-2 mM, HEPES/KOH 50 mM, pH 7,0, KCI 100 mM, y AMPLEX® Red (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se incubaron los extractos con todos los componentes del ensayo excepto shikimato-3-fosfato durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se iniciaron los ensayos por medio de la adición de shikimato-3-fosfato. Se midió la actividad de la EPSP sintasa utilizando un espectró-
metro de fluorescencia Spectramax Gemini XPS (Molecular Dynamics, excitación: 555 nm; emisión: 590 nm).

Después se llevó a cabo la plena determinación de los parámetros cinéticos sobre proteína purificada como se describió anteriormente (solicitud de patente estadounidense número 60/ 741.166 presentada el 1 de diciembre de 2005), ajustando la cantidad de proteína determinada por medio del ensayo de Bradford como se conoce en el arte. Para cualquier concentración de glifosato, se midió la actividad de la EPSP sintasa como función de un amplio rango de concentraciones de PEP. Se ajustaron los datos a la ecuación de Michaelis-Menten utilizando el software KALEIDAGRAPH® (Synergy Software) y se la usó para determinar la K_{m} (K_{m} aparente) de la EPSP sintasa con esa concentración de glifosato. Se determinaron los valores de K_{m} aparente con concentraciones de glifosato no menores a 4, y se calcularon los K_{i} de la EPSPS para glifosato a partir de la gráfica de K_{m} aparente versus la concentración de glifosato, utilizando la ecuación (m1*x/(m2+x); m1 = 1; m2 = 1) como se conoce en el arte.

TABLA 9 Cinéticas de GRG23 (ACE1) versus GRG23

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Ejemplo 19 Identificación de grg23 (ace2)

GRG23 (ACE1) contiene dos cambios de aminoácidos con relación a GRG23. Para determinar si sustituciones adicionales en estas posiciones podrían mejorar más la actividad, se generó una biblioteca de ADN que resultó en clones que expresan proteínas que fueron sustancialmente mutadas y ambas posiciones 49 y 276 de GRG23. Se seleccionaron los clones que confieren resistencia al glifosato por medio del crecimiento sobre placas de glifosato, y se los cultivó y analizaron las propiedades cinéticas como se describió.

Sorprendentemente, se identificó un clon, denominado aquí como grg23 (ace2) (SEQ ID NO: 16) que codifica a la proteína GRG23 (ACE2) (SEQ ID NO: 17) por tener mejor estabilidad térmica. La secuencia de ADN de grg23 (ace2) muestra que GRG23 (ACE2) contiene un solo cambio de aminoácidos (residuo 276 de GRG23 por arginina).

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Ejemplo 20 Comparación de GRG23 y GRG51, y mutagénesis de diferentes residuos

Se generaron dos bibliotecas para evaluar las permutaciones de las posibles secuencias de aminoácidos a partir de la comparación de las secuencias de aminoácidos de GRG23 y GRG51. La primera biblioteca introdujo una variación de la secuencia de aminoácidos de GRG51 dentro de una región de codificación de grg23 (ace2). La segunda biblioteca introdujo la variación de la secuencia de aminoácidos de GRG (ACE2) dentro de la región de codificación de grg51.

Se evaluaron los clones de las bibliotecas resultantes por (1) la habilidad para conferir resistencia al glifosato en una célula, y (2) la actividad después de incubación prolongada a 37ºC. Se secuenciaron un total de diez clones y se los analizó con más detalle. Un clon particular, denominado aquí grg51.4 (SEQ ID NO: 18), que codifica la proteína GRG51.4 (SEQ ID NO: 19), contiene varios cambios de aminoácidos con relación tanto a GRG23 (ACE2) como a GRG51. Se introdujeron posteriormente los cambios de aminoácidos presentes en GRG51.4 con relación a GRG23 (ACE2) dentro del gen grg23 (ace2), para producir grg23 (ace3) (SEQ ID NO: 20), que codifica a la proteína GRG23 (ACE3) (SEQ ID NO: 21). GRG23 (ACE3) exhibe una actividad y estabilidad térmica superiores con relación a GRG23, y GRG23 (ACE2).

Se mutagenizó GRG23 (ace1), y se analizaron los clones para identificar a aquellos que expresan variantes con mayor estabilidad térmica y/o actividad. Se identificó un clon, grg23 (L5P2.J2) (SEQ ID NO: 22), que codifica GRG23 (LSP2.J2) (SEQ ID NO: 23), en virtud de sus propiedades cinéticas mejoradas. GRG23 (L5P2.J2) contiene tres cambios de aminoácidos con relación a GRG23 (ACE1), como se muestra en la Tabla 10 siguiente.

TABLA 10 Cambios de aminoácidos en GRG23 (L5P2.J2)

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Se utilizó mutagénesis de oligonucleótidos para crear clones que contienen cada uno de los cambios de aminoácidos identificados en GRG23 (L5P2.J2) dentro de la región de codificación de grg23 (ace3). Se identificó un clon como codificando una proteína que tiene propiedades cinéticas mejoradas sobre GRG23 (ACE3), y denominado grg23 (ace4) (SEQ ID NO: 24). La proteína codificada por grg23 (ace4) es denominada como GRG23 (ACE4) (SEQ ID NO: 25) que contiene un solo cambio de aminoácidos con relación a GRG23 (ACE3) (Valina 101 por fenilalanina). Con base en este resultado, se llevó a cabo una mutagénesis separada de oligonucleótidos para analizar las cinéticas de cada una de las posibles sustituciones de aminoácidos en la posición 101. Ninguno de los cambios de aminoácidos resultó en una mejora adicional en las propiedades cinéticas comparado con GRG23 (ACE4).

TABLA 11 Cinéticas de variantes mejoradas

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Ejemplo 21 Modificación por ingeniería genética de grg23 y grg51 para Transformación de Plantas

Se amplifica el marco de lectura abierta (ORF) de grg23 y grg51 por medio de PCR a partir de un molde de ADNc de longitud completa. Se añaden sitios de restricción HindIII a cada extremo del ORF durante la PCR. Adicionalmente, se añade la secuencia de nucleótidos ACC inmediatamente 5' al codón de inicio del gen para incrementar la eficacia de la traducción (Kozak (1987) Nucleic Acids Research 15: 8125-8148; Joshi (1987) Nucleic Acids Research 15: 6643-6653). Se clona el producto PCR y se lo secuencia utilizando técnicas conocidas en el arte para garantizar que no se introducen mutaciones durante la PCR.

Se digiere al plásmido que contiene al producto PCR de grg23 o grg51 con HindIII y se aísla el fragmento que contiene al ORF intacto. Se clona este fragmento dentro del sitio HindIII del plásmido pAX200, un vector de expresión de la planta que contiene al promotor de la actina del arroz (McElroy y colaboradores, (1991) Molec. Gen. Genet. 231: 150-160) y al terminador PinII (An y colaboradores, (1989) The Plant Cell 1: 115-122). El fragmento promotor-gen-terminador de este plásmido intermedio se subclona dentro del plásmido pSB 11 (Japan Tobacco, Inc.) para formar un plásmido final, por ejemplo, pSB 11 GRG23. Se organiza pSB11GRG23 de tal manera que el fragmento de ADN de 3,91 kb que contiene la construcción promotor-grg23-terminador pueda ser cortado por medio de digestión doble con KpnI y PmeI y utilizado para la transformación dentro de plantas por medio de una inyección de un haz de aerosol. Se verifica la estructura de pSB11GRG23 por medio de digestión de restricción y electroforesis en gel, y por medio de secuenciación a través de las diferentes uniones de la clonación.

Se inmoviliza el plásmido dentro de la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens que también hospeda al plásmido pSB 1 (Japan Tobacco, Inc.), utilizando procedimientos de apareamiento triparental conocidos en el arte, y sembrando en placa sobre un medio que contiene estreptomicina. El plásmido pSB11GRG23 porta la resistencia a la estreptomicina pero es un plásmido de rango estrecho de huéspedes y no se puede replicar en Agrobacterium. Las colonias resistentes a la Estreptomicina surgen cuando pSB11GRG23 se integra dentro del plásmido pSB 1 de rango más amplio de huéspedes a través de recombinación homóloga. Se verifica el producto integrado conjuntamente por pSB 1 y pSB11GRG23 por medio de hibridación tipo Southern. Se utiliza la cepa de Agrobacterium que hospeda al producto integrado conjuntamente para transformar maíz por medio del método de PureIntro (Japan Tobacco).

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Ejemplo 22 Transformación de grg23 o grg51 en Células de Plantas

Se recolectan espigas de maíz 8-12 días después de la polinización. Se aíslan los embriones de las espigas, y se utilizan aquellos embriones de 0,8-1,5 mm de tamaño para la transformación. Se siembran en placa los embriones con el escutelo hacia arriba sobre un medio de incubación adecuado, tal como el medio DN62A5S (3,98 g/L de Sales N6; 1 mL/L (de Patrón 1000x) de Vitaminas N6; 800 mg/L de L-Asparagina; 100 mg/L de Myo-inositol; 1,4 g/L de L-Prolina; 100 mg/L de ácidos Casamino; 50 g/L de sacarosa; 1 mL/L (de Patrón de 1 mg/mL) de 2,4-D).

Se transfieren los explantes resultantes a cuadrados de malla (30-40 por placa), luego se los transfiere sobre medio osmótico durante 30-45 minutos, luego se los transfiere sobre una placa radiante (ver, por ejemplo, la publicación PCT No. WO/0138514 y la patente estadounidense No. 5.240.842).

Se aceleran las construcciones de ADN diseñadas para expresar GRG23 en células de plantas dentro del tejido de la planta utilizando un acelerador de un haz de aerosol, usando condiciones esencialmente como las descritas en la publicación PCT No. WO/0138514. Después de la radiación, se incuban los embriones durante 30 min sobre medio osmótico, y se colocan sobre medio de incubación durante la noche a 25ºC en la oscuridad. Para evitar dañar en forma indebida los explantes radiados, se los incuba al menos durante 24 horas antes de transferirlos a un medio de recuperación. Se esparcen luego los embriones sobre medios para el período de recuperación durante 5 días a 25ºC en la oscuridad, luego se los transfiere a un medio de selección. Se incuban los explantes en medio de selección hasta por ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y de las características de la selección particular utilizada. Después del período de selección, se transfiere el callo resultante a un medio para maduración de embriones hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Se colocan luego los embriones somáticos maduros resultantes bajo luz tenue y se inicia el proceso de regeneración por medio de métodos conocidos en el arte. Se le permite a los brotes resultantes la formación de raíces sobre medio de enraizamiento, y se transfieren las plantas resultantes a macetas vivero y se propagan como plantas transgénicas.

12

Ajustar el pH de la solución hasta pH 5,8 con KOH 1 N/KCl 1 N, añadir Gelrita (Sigma) hasta 3 g/L, y autoclavar. Después de enfriar hasta 50ºC, añadir 2 ml/L de una solución patrón d 5 mg/ml de Nitrato de Plata (Phytotechnology Labs). La receta produce aproximadamente 20 placas.

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Ejemplo 23 Transformación de grg23 o grg51 en Células de Plantas de Maíz por Medio de una Transformación Mediada por Agrobacterium

Se recolectan las espigas 8-12 días después de la polinización. Se aíslan los embriones de las espigas, y se utilizan aquellos embriones para transformación. Se colocan los embriones con el escutelo hacia arriba sobre un medio de incubación adecuado, y se incuba durante la noche a 25ºC en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario de por sí incubar los embriones durante la noche. Se ponen en contacto los embriones con una cepa de Agrobacterium que contiene los vectores apropiados para la transferencia mediada por el plásmido Ti durante 5-10 min, y luego se los siembra en placa sobre un medio para cultivo conjunto durante 3 días (25ºC en la oscuridad). Después del cultivo conjunto, se transfieren los explantes al medio para el período de recuperación durante 5 días (a 25ºC en la oscuridad). Se incuban los explantes en medio de selección hasta por ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y de las características de la selección particular utilizada. Después del período de selección, se transfiere el callo resultante al medio para maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Se colocan luego los embriones somáticos maduros resultantes bajo luz tenue y se inicia el proceso de regeneración por medio de métodos conocidos en el arte. Se le permite a los brotes resultantes la formación de raíces sobre medio de enraizamiento, y se transfieren las plantas resultantes a macetas vivero y se propagan como plantas transgénicas.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la descripción son indicativas del nivel de destreza de aquellos capacitados en el arte a los cuales les atañe esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente son incorporadas aquí como referencia en la misma medida como si cada publicación individual o solicitud de patente estuviera específica e individualmente indicada para ser incorporada como referencia.

Aunque la invención anterior ha sido descrita con algún detalle a manera de ilustración y de ejemplo para propósitos de claridad en su comprensión, será obvio que pueden hacerse ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 4535060 A [0004] [0027] [0033] [0045] [0046]

\bullet US 5436391 B [0062]

\bullet US 4769061 A [0004]

\bullet US 20040005600 A [0062]

\bullet US 5094945 A [0004]

\bullet US 20010003849 A [0062]

\bullet US 5188642 A [0027] [0033] [0045] [0046]

\bullet US 5380831 A [0064]

\bullet US 4196265 A [0048]

\bullet US 74116605 P [0116] [0127] [0128]

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\bullet WO 0138514 A [0139] [0140]

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\bullet US 60741166 B [0145]

\bullet US 6075185 B [0062]

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<110> Cheryl Peters

\hskip1cm

Jill Burdette

\hskip1cm

Philip E. Hammer

\hskip1cm

Brian Vande Berg

\hskip1cm

Laura Cooper Schouten

\hskip1cm

Brian Carr

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<120> Genes Grg23 y Grg51 que Confieren Resistencia a los Herbicidas

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<130> 45600/320129

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<150> 60/741.166

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<151> 2005-12-01

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/817.799

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<151> 2006-06-30

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<160> 33

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 1892

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<212> ADN

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<213> Arthrobacter globiformis

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<220>

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<221> características diversas

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<222> (0)...(0)

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<223> Cepa ATX21308

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<221> CDS

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<222> (109)...(1419)

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<221> características diversas

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<222> 1801

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<223> n = A,T,C o G

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<221> características diversas

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<222> 1801

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<223> n = A,T,C o G

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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13

14

15

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<210> 2

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<211> 436

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<212> PRT

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<213> Arthrobacter globiformis

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<400> 2

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16

17

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<210> 3

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<211> 1892

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<212> ADN

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<213> Arthrobacter globiformis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (178)...(1419)

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<221> características diversas

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<222> 1801

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<223> n = A,T,C o G

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<400> 3

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18

19

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<210> 4

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<211> 413

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<212> PRT

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<213> Arthrobacter globiformis

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<400> 4

20

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<210> 5

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<211> 1242

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<212> ADN

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<213> Desconocido

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<220>

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<223> Aislado a partir de la muestra de suelo

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<221> CDS

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<222> (1)...(1242)

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<400> 5

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21

22

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<210> 6

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<211> 413

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<212> PRT

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<213> Desconocido

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<220>

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<223> aislado de la muestra de suelo

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<400> 6

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23

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<210> 7

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<211> 446

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<212> PRT

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<213> Bacillus clausii

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<400> 7

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24

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<210> 8

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<211> 447

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<212> PRT

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<213> Rubrobacer xylanophilus

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<400> 8

25

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<210> 9

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<211> 444

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<212> PRT

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<213> Zea mays

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<400> 9

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26

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<210> 10

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<211> 455

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<212> PRT

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<213> Agrobacterium sp.

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<400> 10

27

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<210> 11

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<211> 427

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<212> PRT

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<213> E. coli

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<400> 11

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28

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<210> 12

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<211> 1242

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> grg23 sintético

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<221> CDS

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<222> (1)...(1242)

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<400> 12

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29

30

31

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<210> 13

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<211> 413

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> grg23 sintético

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<400> 13

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32

33

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<210> 14

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<211> 1242

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> grg23 (ace1)

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<221> CDS

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<222> (1)...(1242)

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<400> 14

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34

35

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<210> 15

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<211> 413

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> grg23 (ace1)

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<400> 15

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<210> 16

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<211> 1242

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> grg23 (ace2)

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<221> CDS

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<222> (1)...(1242)

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<400> 16

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40

41

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 413

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> grg23 (ace2)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

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42

43

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<210> 18

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<211> 1242.

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> grg51.4

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<221> CDS

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<222> (1)...(1242)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

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44

45

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<210> 19

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<211> 413

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> grg51.4

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

46

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<210> 20

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<211> 1242

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> grg23 (ace3)

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<221> CDS

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<222> (1)...(1242)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

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47

48

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<210> 21

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<211> 413

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> grg23 (ace3)

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<400> 21

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49

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<210> 22

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<211> 1242

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> grg23 (L5P2.J2)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)...(1242)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

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50

51

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<210> 23

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<211> 413

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> grg23 (L5P2.J2)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

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52

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<210> 24

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<211> 1242

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> grg23 (ace4)

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<221> CDS

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<222> (1)...(1242)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

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53

54

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<210> 25

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<211> 413

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> grg23 (ace4)

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<400> 25

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55

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<210> 26

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<211> 1244

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> grg23 (L3P1.B20)

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<221> CDS

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<222> (1)...(1242)

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<400> 26

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56

57

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<210> 27

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<211> 413

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> grg23 (L3P1.B20)

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<400> 27

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58

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<210> 28

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<211> 1244

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> grg23 (L3P1.B3)

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<221> CDS

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<222> (1)...(1242)

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<400> 28

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59

60

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<210> 29

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<211> 413

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> grg23 (L3P1.B3)

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<400> 29

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61

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<210> 30

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<211> 1244

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> grg23 (L3P1.F18)

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<221> CDS

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<222> (1)...(1242)

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<400> 30

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62

63

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<210> 31

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<211> 413

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> grg23 (L3P1.F18)

\newpage

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<400> 31

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64

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<210> 32

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<211> 1244

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> grg23 (L3P1.023)

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<221> CDS

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<222> (1)...(1242)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

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65

66

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<210> 33

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<211> 413

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> grg23 (L3P1.023)

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<400> 33

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67

Claims (14)

1. Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada entre:

a)

una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, o un complemento de la misma;

b)

una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, que codifica a una EPSPS de tolerancia al glifosato, o un complemento de la misma;

c)

la secuencia de nucleótidos de tolerancia al glifosato del inserto de ADN del plásmido depositado como el Acceso No. NRRL B-30888 o B-30949, o un complemento de la misma:

d)

una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido que contiene las secuencias de aminoácidos SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6; y

e)

una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato.

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2. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que ha sido diseñada para expresión en una planta.

3. Un vector que comprende a la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1; dicho vector comprendiendo opcionalmente adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

4. Una célula huésped que contiene al vector de la reivindicación 3.

5. Una célula huésped de la reivindicación 4 que es una célula huésped bacteriana o una célula de una planta.

6. Una planta transgénica que comprende a la célula huésped de la planta de la reivindicación 5, o una semilla transformada de dicha planta.

7. Un polipéptido aislado seleccionado entre:

a)

un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6;

b)

un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5;

c)

un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato;

d)

un polipéptido que es codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato; y

e)

un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleótidos para tolerancia al glifosato del inserto de ADN del plásmido depositado como el Acceso No. NRRL B-30888 o NRR B-30949;

dicho polipéptido comprende opcionalmente además una secuencia heteróloga de aminoácidos.

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8. Un método para la producción de un polipéptido con actividad de tolerancia al glifosato, que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 4 bajo condiciones en las cuales se expresa una molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido, siendo dicho polipéptido seleccionado del grupo que consiste de:

a)

un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6;

b)

un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5;

c)

un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato;

d)

un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato; y

e)

un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleótidos para tolerancia al glifosato del inserto de ADN del plásmido depositado como el Acceso No. NRRL B-30888 o NRR B-30949.

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9. Un método para conferir tolerancia al glifosato en una planta, dicho método comprendiendo la transformación de dicha planta con una construcción de ADN, dicha construcción comprendiendo un promotor que dirige la expresión en una célula de una planta operativamente enlazada con una secuencia de nucleótidos al menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos.: 1, 3 ó 5 que codifican una EPSPS de tolerancia al glifosato y que regeneran una planta transformada.

10. Una planta o célula de una planta que tiene incorporada en forma estable en su genoma una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad de tolerancia al glifosato, en donde dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada de:

a)

una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5;

b)

una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad de tolerancia al glifosato;

c)

una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6;

d)

una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato; y

e)

la secuencia de nucleótidos de tolerancia al glifosato del inserto de ADN del plásmido depositado como el Acceso No. NRRL B-30888 o NRRL B-30949; en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión de una secuencia de codificación en una célula de una planta.

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11. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a una enzima EPSPS de tolerancia al glifosato, en donde dicha enzima EPSPS de tolerancia al glifosato tiene una Km para el fosfoenolpiruvato (PEP) entre 1 y 150 uM y una K_{i} (glifosato)/K_{m} (PEP) entre aproximadamente 500 y aproximadamente 1000.

12. Una planta que tiene incorporada en forma estable en su genoma una construcción de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido EPSPS, teniendo dicho polipéptido EPSPS una Km para PEP entre 1 y 150 uM y una K_{i} (glifosato)/K_{m} (PEP) entre 500 y 1000, exhibiendo dicha planta tolerancia al herbicida glifosato.

13. La planta de la reivindicación 12, donde dicha planta es una planta de soja o una planta de maíz.

14. La planta de la reivindicación 6 u 11, en donde dicha planta es una planta de maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, o colza oleaginosa.