JP4879969B2

JP4879969B2 - 新規なクラスのｅｐｓｐシンターゼの同定

Info

Publication number: JP4879969B2
Application number: JP2008505604A
Authority: JP
Inventors: ナディーンカロッジ，; ブライアンカール，; フィリップイーハマー，
Original assignee: アセニクスコーポレイション
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2006-04-07
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2026-04-07
Also published as: EP1871875A2; WO2006110586A2; US20100144530A1; MX2007012462A; EP2295548A1; CN101175850A; CA2603465A1; CN101175850B; AU2006235263A1; NZ563000A; AU2006235263B2; US7700842B2; BRPI0608940A2; JP2008535495A; CA2603465C; WO2006110586A3; US20100144529A1; AR053049A1; US20060253921A1

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００５年４月８日に出願された米国仮特許出願番号第６０／６６９，６８６；２００５年５月６日に出願された第６０／６７８，３４８；２００５年６月２９日に出願された第６０／６９５，１９３；２００５年１０月１１日に出願された第６０／７２５，１８２の利益を主張し、その内容は、本明細書中にその全体を参考として援用する。

（発明の分野）
発明は、植物分子生物学、特に除草剤であるグリフォセートに対する抵抗性を付与する新規なクラスのＥＰＳＰシンターゼに関する。

（発明の背景）
Ｎ−ホスホノメチルグリシンは一般にグリフォセートと呼ばれ、重要な農用化学物質である。グリフォセートは、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）および３−ホスホシキミ酸（Ｓ３Ｐ）を５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸に変換する酵素を阻害する。この酵素（５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ、本明細書において「ＥＰＳＰシンターゼ」または「ＥＰＳＰＳ」と呼ぶ）の阻害は、シキミ酸経路を妨害することにより芳香族アミノ酸の生合成を阻害することによって植物細胞を死滅させる。

グリフォセート系除草剤は、芳香族アミノ酸の生合成を阻害し、植物細胞を死滅させるだけでなく、細菌細胞にも有毒である。グリフォセートは、多数の細菌ＥＰＳＰシンターゼを阻害することから、これらの細菌に有毒である。しかし、ある種の細菌ＥＰＳＰシンターゼはグリフォセートに高度の耐性を有する。

グリフォセートの毒性に抵抗性の植物細胞は、植物細胞を形質転換してグリフォセート抵抗性の細菌ＥＰＳＰシンターゼを発現させることにより産生することができる。特に、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＣＰ４株由来の細菌遺伝子は、植物における発現に続いて、植物細胞に除草剤抵抗性を付与するために使用されてきた。ネズミチフス菌ＣＴ７株由来の突然変異ＥＰＳＰシンターゼは細菌細胞においてグリフォセート抵抗性を付与し、植物細胞にグリフォセート抵抗性を付与する（特許文献１、特許文献２、および特許文献３）。

ＥＰＳＰシンターゼ（Ｍｒ４６０００）は、それぞれβαβαββフォールディングユニットの３つのコピーを有する２つの類似のドメインに折り畳まれる（非特許文献１）。Ｌｙｓ−２２、Ａｒｇ−１２４、Ａｓｐ−３１３、Ａｒｇ−３４４、Ａｒｇ−３８６、およびＬｙｓ−４１１は、大腸菌由来ＥＰＳＰシンターゼの保存された残基である（非特許文献２）。ＥＰＳＰＳ活性に重要な保存された残基には、Ａｒｇ−１００、Ａｓｐ−２４２、およびＡｓｐ−３８４もある（非特許文献３）。Ａｒｇ−２７はＳ３Ｐに結合する（非特許文献４）。ＥＰＳＰＳのアミノ酸コード配列における改変の結果としてグリフォセート耐性な、野生型ＥＰＳＰＳ酵素の変異体が単離された（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。非特許文献８は、大腸菌ＥＰＳＰＳ遺伝子とネズミチフス菌ＥＰＳＰＳ遺伝子との間の突然変異誘発および組換えによりグリフォセート耐性が増加したＥＰＳＰシンターゼを開発した。そして、位置４２（Ｔ４２Ｍ）および位置２３０（Ｑ２３０Ｋ）での突然変異が、観察された抵抗性を担うと思われることが示唆されている。その後の研究（非特許文献９）は、Ｔ４２Ｍ突然変異（トレオニンからメチオニン）が大腸菌およびネズミチフス菌両方の酵素の耐性を向上させるために十分であることを示している。
米国特許第４５３５０６０号米国特許第４７６９０６１号米国特許第５０９４９４５号Ｓｔａｌｌｉｎｇｓら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８５０４６〜５０５０頁Ｓｃｈｏｎｂｒｕｎｎら（２００１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８巻：１３７６〜１３８０頁Ｓｅｌｖａｐａｎｄｉｙａｎら（１９９５年）ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ３７４巻：２５３〜２５６頁Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈら（１９９９年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８巻：２９６〜３０２頁ＫｉｓｈｏｒｅおよびＳｈａｈ（１９８８年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７巻：６２７〜６３頁Ｗａｎｇら（２００３年）Ｊ．ＰｌａｎｔＲｅｓ．１１６巻：４５５〜６０頁Ｅｓｃｈｅｎｂｕｒｇら（２００２年）Ｐｌａｎｔａ２１６巻：１２９〜３５頁Ｈｅら（２００１年）ＢｉｏｃｈｉｍｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ１５６８巻：１〜６頁Ｈｅら（２００３年）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７巻：１４０５〜１４０９頁

除草剤抵抗性植物がもたらす多くの利点の故に、グリフォセート抵抗活性を有する除草剤抵抗性遺伝子を同定する方法が望ましい。

（発明の要旨）
細菌、植物、植物細胞、組織、および種子にグリフォセート耐性を付与する組成物および方法が提供される。組成物には、クラスＩＩＩと呼ばれる新規なクラスのＥＰＳＰＳ酵素、当該酵素をコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを有するベクター、およびそのベクターを有する宿主細胞がある。この新規なタンパク質は、以下のドメイン（クラスＩＩＩドメイン）から選択される少なくとも１つの配列ドメインを有する：
ドメインＩ

（配列番号１３）（ここで、Ｘ_１はリシンまたはトレオニンを表し、Ｘ_２はアルギニンまたはヒスチジンを表し、Ｘ_３はセリンまたはトレオニンを表す）；
ドメインＩａ

（配列番号１４）（ここで、Ｘ_１はリシンまたはトレオニンを表す）；
ドメインＩｂ

（配列番号１５）（ここで、Ｘ_１はアルギニンまたはヒスチジンを表し、Ｘ_２はセリンまたはトレオニンを表す）；
ドメインＩｃ

（配列番号１６）；
ドメインＩＩ

（配列番号１７）（ここで、Ｘ_１はアスパラギン酸またはアラニンを表し、Ｘ_２はセリンまたはトレオニンを表し、Ｘ_３はバリンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_４はトレオニンまたはグルタミン酸またはリシンを表し、Ｘ_５はセリンまたはグリシンを表し、Ｘ_６はグルタミンまたはセリンまたはグルタミン酸またはトレオニンを表す）；
ドメインＩＩａ

（配列番号１８）（ここで、Ｘ_１はアスパラギン酸またはアラニンを表し、Ｘ_２はセリンまたはトレオニンを表し、Ｘ_３はバリンまたはイソロイシンを表す）；
ドメインＩＩｂ

（配列番号１９）（ここで、Ｘ_１はトレオニンまたはグルタミン酸またはリシンを表し、Ｘ_２はセリンまたはグリシンを表し、Ｘ_３はグルタミンまたはセリンまたはグルタミン酸またはトレオニンを表す）；
ドメインＩＩＩ

（配列番号２０）；
ドメインＩＶ

（配列番号２１）または

（ここで、Ｘ_１はグリシンまたはメチオニンまたはロイシンを表す）；
ドメインＶ

（配列番号２２）（ここで、Ｘ_１はトレオニンまたはセリンを表す）；
ドメインＶＩ

（配列番号２３）（ここで、Ｘ_１はアルギニンまたはリシンまたはロイシンを表し、Ｘ_２はイソロイシンまたはバリンを表す）；
ドメインＶＩＩ

（配列番号２４）（ここで、Ｘ_１はアルギニンまたはリシンを表し、Ｘ_２はアラニンまたはヒスチジンまたはグルタミン酸またはセリンを表し、Ｘ_３はプロリンまたはアラニンを表す）；
ドメインＶＩＩＩ

（配列番号２５）（ここで、Ｘ_１はアラニンまたはグリシンを表し、Ｘ_２はグルタミン酸またはグルタミンを表し、Ｘ_３はバリンまたはロイシンまたはアラニンを表す）；
ドメインＶＩＩＩａ

（配列番号２６）；
ドメインＩＸ

（配列番号２７）（ここで、Ｘ_１はイソロイシンまたはロイシンを表す）；
ドメインＸ

（配列番号２８）（ここで、Ｘ_１はトレオニンまたはセリンを表す）；
ドメインＸＩ

（配列番号２９）（ここで、Ｘ_１はグルタミンまたはリシンまたはセリンを表し、Ｘ_２はアスパラギンまたはヒスチジンを表し、Ｘ_３はメチオニンまたはロイシンを表し、Ｘ_４はプロリンまたはグルタミンを表し、Ｘ_５はトレオニンまたはグルタミン酸またはバリンを表し、Ｘ_６はバリンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_７はアスパラギン酸またはバリンを表し、Ｘ_８はロイシンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_９はロイシンまたはイソロイシンを表す）；
ドメインＸＩａ

（配列番号３０）（ここで、Ｘ_１はグルタミンまたはリシンまたはセリンを表し、Ｘ_２はアスパラギンまたはヒスチジンを表し、Ｘ_３はメチオニンまたはロイシンを表し、Ｘ_４はプロリンまたはグルタミンを表す）；
ドメインＸＩｂ

（配列番号３１）（ここで、Ｘ_１はトレオニンまたはグルタミン酸またはバリンを表し、Ｘ_２はバリンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_３はアスパラギン酸またはバリンを表し、Ｘ_４はロイシンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_５はロイシンまたはイソロイシンを表す）；
ドメインＸＩｃ

（配列番号３２）；
ドメインＸＩＩ

（配列番号３３）（ここで、Ｘ_１はバリンまたはトレオニンを表し、Ｘ_２はグルタミン酸またはグリシンを表し、Ｘ_３はロイシンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_４はアラニンまたはグルタミン酸を表し、Ｘ_５はイソロイシンまたはバリンを表す）；
ドメインＸＩＩａ

（配列番号３４）；
ドメインＸＩＩｂ

（配列番号３５）（ここで、Ｘ_１はバリンまたはトレオニンを表し、Ｘ_２はグルタミン酸またはグリシンを表し、Ｘ_３はロイシンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_４はアラニンまたはグルタミン酸を表し、Ｘ_５はイソロイシンまたはバリンを表す）；
ドメインＸＩＩｃ

（配列番号３６）；
ドメインＸＩＩＩ

（配列番号３７）（ここで、Ｘ_１はロイシンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_２はバリンまたはイソロイシンを表す）；
ドメインＸＩＶ

（配列番号３８）（ここで、Ｘ_１はアスパラギン酸またはアスパラギンを表し、Ｘ_２はアラニンまたはセリンまたはトレオニンを表す）；
ドメインＸＶ

（配列番号３９）（ここで、Ｘ_１はロイシンまたはセリンまたはグルタミン酸を表し、Ｘ_２はトレオニンまたはセリンを表し、Ｘ_３はヒスチジンまたはフェニルアラニンを表し、Ｘ_４はアラニンまたはセリンを表す）；
ドメインＸＶＩ

（配列番号４０）（ここで、Ｘ_１はグリシンまたはアラニンを表し、Ｘ_２はイソロイシンまたはバリンを表し、Ｘ_３はセリンまたはグリシンまたはアラニンまたはリシンを表す）；
ドメインＸＶＩａ

（配列番号４１）（ここで、Ｘ_１はグリシンまたはアラニンを表す）；
ドメインＸＶＩｂ

（配列番号４２）（ここで、Ｘ_１はイソロイシンまたはバリンを表し、Ｘ_２はセリンまたはグリシンまたはアラニンまたはリシンを表す）；
ドメインＸＶＩＩ

（配列番号４３）（ここで、Ｘ_１はアスパラギンまたはアスパラギン酸を表し、Ｘ_２はアラニンまたはアスパラギン酸を表し、Ｘ_３はアラニンまたはグリシンを表す）；および
ドメインＸＶＩＩＩ

（配列番号４４）（ここで、Ｘ_１はアラニンまたはセリンまたはプロリンを表す）。

配列番号１３〜４４に示す上記ドメインは、少なくとも５０％の配列同一性を共有するクラスＩＩＩの配列を整列させることによって同定された。これらの配列ドメインの少なくとも１つが存在することは、グリフォセート抵抗活性を予測するものである。

除草剤抵抗性付与核酸配列に対応する単離された核酸分子が提供される。そのうえ、そのポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列が包含される。特に、本発明は、配列番号９、１１、５５、５７、および５８に示すヌクレオチド配列、配列番号１０、１２、５６、および５９に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、受託番号Ｂ−３０８３３およびＢ−３０８３８として細菌受け入れ先に寄託された除草剤抵抗性ヌクレオチド配列、ならびにその変異体および断片を含めた、クラスＩＩＩドメインを有する単離された核酸分子を用意する。本発明のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列または本発明の配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた包含される。これらの配列は、関心対象の植物にその後形質転換するための発現ベクターの構築に、他のグリフォセート抵抗性遺伝子の単離のためのプローブとして、そして選択マーカーなどとして用途を見い出す。

組成物には、そのポリペプチドに対する抗体および除草剤抵抗性ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドもまたある。コード配列は、微生物および植物を含めた生物に形質転換して発現させるためのＤＮＡ構築物または発現カセットに使用することができる。組成物は、本発明の組成物を生物のゲノムに導入することによりグリフォセート耐性な形質転換された細菌、植物、植物細胞、組織、および種子もまた有する。その生物が植物である場合には、その配列の導入は、グリフォセート含有除草剤を作物に適用して、形質転換された生物ではなくグリフォセート感受性の雑草を選択的に死滅させることができるようにする。

グリフォセート抵抗活性を有するＥＰＳＰシンターゼを同定する方法がそのうえ提供される。その方法は、ＥＰＳＰシンターゼについてのアミノ酸配列を得ること、およびそのアミノ酸配列が本発明の配列ドメインを少なくとも１つ有するかどうかを同定することを含む。

本明細書に記載するＥＰＳＰシンターゼは、以下にクラスＩＩＩＥＰＳＰＳ酵素として呼ぶ新しいクラスのＥＰＳＰＳ酵素に相当する。

（発明の詳細な説明）
本発明は組成物に向けられており、生物に除草剤耐性、特にグリフォセート耐性を付与する方法が提供される。その方法は、本発明のクラスＩＩＩグリフォセート耐性遺伝子をコードするヌクレオチド配列を用いて生物を形質転換することを伴う。特に、本発明は、グリフォセート耐性を付与するクラスの酵素およびその酵素をコードするヌクレオチド配列を認めている。その配列は、除草剤グリフォセートに対する耐性増大を示す植物を調製することに用途を見出している。したがって、形質転換された細菌、植物、植物細胞、植物組織、および種子が提供される。

クラスＩＩＩ酵素は、本明細書において以下に挙げる、クラスＩＩＩドメインと呼ぶドメインから選択されるドメインを少なくとも１つ有することを特徴とする：
ドメインＩ

（配列番号１６）；
ドメインＩＩ

（配列番号２０）；
ドメインＩＶ

（配列番号２１）または

（配列番号２６）；
ドメインＩＸ

（配列番号３２）；
ドメインＸＩＩ

（配列番号３４）；
ドメインＸＩＩｂ

（配列番号３６）；
ドメインＸＩＩＩ

配列番号１３〜４４に示す上記ドメインは、少なくとも５０％の配列同一性を共有するクラスＩＩＩ配列を整列させることにより同定された。いくつかの実施形態では、これらの配列ドメインの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２個が存在する。

本発明の方法および同定されたドメインを使用して、グリフォセート耐性を付与する追加的なタンパク質（例えば配列番号２、４、４６、および４８）を同定することができる。これらのタンパク質には、公知のタンパク質および新たに同定されたタンパク質（例えば配列番号１０、１２、５６、および５９）が含まれる。

「グリフォセート」により、任意の除草形態のＮ−ホスホノメチルグリシン（その任意の塩を含む）、および植物においてグリフォセート陰イオンの産生を招くその他の形態を意味する。「除草剤抵抗性タンパク質」、「除草剤耐性タンパク質」、または「除草剤抵抗性」もしくは「除草剤耐性」をコードするポリヌクレオチドの発現に起因するタンパク質には、そのタンパク質を発現していない細胞よりも高濃度の除草剤に耐える能力、またはそのタンパク質を発現していない細胞よりも長期間、ある濃度の除草剤に耐える能力を細胞に付与するタンパク質が含まれる。「グリフォセート抵抗性タンパク質」または「グリフォセート耐性タンパク質」には、そのタンパク質を発現していない細胞よりも高濃度のグリフォセートに耐える能力、またはそのタンパク質を発現していない細胞よりも長期間、ある濃度のグリフォセートに耐える能力を細胞に付与するタンパク質が含まれる。「耐える」または「耐性」により、未処理の細胞と容易に見分けが付かない方法で、生存するか、またはタンパク質合成および呼吸などの不可欠な細胞機能を行うかのいずれかを意味する。

単離されたポリヌクレオチド、ならびにその変異体および断片
本発明の一態様は、配列番号１、３、７、４５、４７、および５３に挙げられるポリヌクレオチド配列以外の、本発明のクラスＩＩＩ配列ドメインの少なくとも１つを有するＥＰＳＰシンターゼ酵素をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。「以外の」により、本発明が、配列番号に列挙するポリヌクレオチド配列を含まないことを意味する。

本発明の単離されたポリヌクレオチドは、除草剤抵抗性タンパク質およびそのポリペプチドまたは生物学的に活性な部分をコードするヌクレオチド配列、ならびに除草剤抵抗性をコードするポリヌクレオチドを同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するために十分なポリヌクレオチドを有する。本明細書に使用する用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチドアナログを使用して作製された、そのＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むことを意味する。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖ＤＮＡでありうる。

本発明のヌクレオチド配列には、上記に含まれるドメインを特徴とするヌクレオチド配列がある。これらのドメインの同定に使用される情報には、グリフォセート感受性ＥＰＳＰＳ分子の配列アラインメントがある。この配列アライメントは、配列間の相同性領域を同定するために、そしてクラスＩＩＩＥＰＳＰ酵素に特徴的なクラスＩＩＩドメインを同定するために使用された。

このドメインの変異体（例えば配列番号５５）もまた本発明の範囲内に包含される。当該変異体には、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を共有する配列があり、グリフォセート耐性を与えるＤＮＡ分子に含まれる。

「単離」もしくは「精製」されたポリヌクレオチドもしくはタンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、組換え技法により産生された場合に他の細胞物質または培地を実質的に有さず、また、化学合成された場合に化学前駆物質または他の化学物質を実質的に有さない。好ましくは、「単離された」ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡ中に、そのポリヌクレオチドに自然に隣接する配列（すなわちそのポリヌクレオチドの５’および３’末端に位置する配列）（例えばタンパク質をコードする配列）を有さない。本発明のために、ポリヌクレオチドを表すために使用する場合の「単離された」は、単離された染色体を除外する。例えば様々な実施形態において、グリフォセート抵抗性をコードする単離されたポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡ中に、そのポリヌクレオチドに自然に隣接するヌクレオチド配列を約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満含みうる。細胞物質を実質的に有さない除草剤抵抗性タンパク質には、除草剤非抵抗性タンパク質（本明細書において「混入タンパク質」とも呼ぶ）を（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、または５％未満有するタンパク質の調製物がある。

除草剤抵抗性をコードするこれらのヌクレオチド配列の断片であるポリヌクレオチド（例えば配列番号５７、５８、および６０）もまた、本発明に包含される。「断片」により、除草剤抵抗性タンパク質をコードするヌクレオチド配列の部分（例えば配列番号５９）を意味する。ヌクレオチド配列の断片は、除草剤抵抗性タンパク質の生物学的に活性な部分をコードすることがあるし、下記に開示される方法を使用したハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用することができる断片のことがある。除草剤抵抗性ヌクレオチド配列の断片であるポリヌクレオチドは、本明細書に開示する除草剤抵抗性をコードする完全長ヌクレオチド配列に存在する少なくとも約１５、２０、５０、７５、１００、２００、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０個の連続するヌクレオチド、または最長でその完全長配列のヌクレオチド数まで有する。「連続する」ヌクレオチドにより、相互に直接隣接したヌクレオチド残基を意味する。

本発明のヌクレオチド配列の断片は、一般に本明細書に記載するクラスＩＩＩドメインを少なくとも１つ有するであろうし、完全長グリフォセート抵抗性タンパク質の生物学的活性、すなわち除草剤抵抗活性を保持するタンパク質断片をコードするであろう。「除草剤抵抗活性を保持する」により、その断片が、配列番号６として本明細書に開示する完全長グリフォセート抵抗性タンパク質の除草剤抵抗活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％を有するであろうことを意味する。除草剤抵抗活性を測定する方法は、当技術分野において十分に公知である。例えば米国特許第４５３５０６０号および第５１８８６４２号を参照されたい。このそれぞれの特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

本発明のタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする、除草剤抵抗性をコードするヌクレオチド配列の断片は、本発明の完全長除草剤抵抗性タンパク質に存在する少なくとも約１５、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００個の連続するアミノ酸、または最長でその完全長タンパク質に存在するアミノ酸の総数をコードするであろう。重要なことに、この断片は、本明細書に記載するクラスＩＩＩドメインを少なくとも１つ有するであろう。

本発明の除草剤抵抗性タンパク質は、クラスＩＩＩと特徴付けられるタンパク質、または活性を保持するその断片もしくは変異体である。用語「十分に同一」は、本明細書に記載するアライメントプログラムの１つを使用して、標準的なパラメータを使用して、参照配列に対して少なくとも約６０％もしくは６５％の配列同一性、少なくとも約７０％もしくは７５％の配列同一性、少なくとも約８０％もしくは８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。当業者は、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置などを考慮することにより、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、これらの値を適切に調整することができることを認識しているであろう。

２つのアミノ酸配列または２つのポリヌクレオチドの同一率を決定するために、最適な比較を行う目的で配列が整列される。２つの配列の間の同一率は、それらの配列が共に同一である位置数の関数である（すなわち同一率＝同一である位置数／位置の総数（例えば重なる位置）×１００）。一実施形態において、これら２つの配列は同じ長さである。２つの配列の間の同一率は、下記の技法に類似した技法を使用して、ギャップを見込んで、またはギャップを見込まずに決定することができる。同一率を計算するにあたり、典型的には完全一致が計数される。

２つの配列の間の同一率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して実現することができる。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７巻：２２６４〜２２６８頁のアルゴリズムを、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０巻：５８７３〜５８７７頁のように変更したものである。当該アルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜４１０頁のＢＬＡＳＴＮプログラムおよびＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行って、本発明のＧＤＣ様ポリヌクレオチドに相同のヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行って、本発明の除草剤耐性タンパク質分子に相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のギャップ付きアライメントを得るために、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５巻：３３８９〜２４０２頁に記載されているように利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）、上記を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム（例えばＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメータを使用することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムである（Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９９４年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２巻：４６７３〜４６８０頁）。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列を比較し、アミノ酸またはＤＮＡ配列全体を整列させるので、アミノ酸配列全体の配列の保存についてのデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩＰｒｏｇｒａｍＳｕｉｔｅのＡＬＩＧＮＸモジュール（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）などのいくつかの市販されているＤＮＡ／アミノ酸分析ソフトウェアパッケージに使用されている。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアミノ酸配列を整列させた後に、アミノ酸同一率を評価することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアライメントの解析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例はＧＥＮＥＤＯＣ（商標）である。ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）（ＫａｒｌＮｉｃｈｏｌａｓ）は、多数のタンパク質間のアミノ酸（またはＤＮＡ）の類似性および同一性を評価できるようにする。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８年）ＣＡＢＩＯＳ４巻：１１〜１７頁のアルゴリズムである。当該アルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージ（カリフォルニア州サンディエゴのＡｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．から入手できる）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合には、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用することができる。

別に述べない限り、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻（３）：４４３〜４５３頁のアルゴリズムを使用しているＧＡＰバージョン１０を使用して、以下のパラメータを使用して配列の同一性または類似性が決定されるであろう：ＧＡＰ重み５０および長さ重み３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用したヌクレオチド配列についての同一％および類似％；ＧＡＰ重み８および長さ重み２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングプログラムを使用した、アミノ酸配列についての同一％または類似％。同等のプログラムもまた使用することができる。「同等のプログラム」により、ＧＡＰバージョン１０により生成した対応するアライメントに比べた場合に、問題となる任意の２つの配列について、同一のヌクレオチド残基の一致および同一の配列同一率を有するアライメントを作製する任意の配列比較プログラムを意味する。本発明は、変異体ポリヌクレオチドもまた包含する。除草剤抵抗性をコードするヌクレオチド配列の「変異体」には、本明細書に開示する除草剤抵抗性タンパク質をコードするが、遺伝子コードの縮重のせいで保存的に異なる配列、および上に論じるように十分に同一の配列がある。天然対立遺伝子変異体は、下記に概説するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技法などの十分に公知の分子生物学的技法を使用して同定することができる。変異体ヌクレオチド配列には、例えば下に論じるように部位特異的突然変異誘発を使用して作製されたが、本発明に開示する除草剤抵抗性タンパク質を依然としてコードする、合成により得られたヌクレオチド配列もまたある。本発明に包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわちその変異体タンパク質は天然タンパク質の所望の生物学的活性、すなわち除草剤抵抗活性を保持する。「除草剤抵抗活性を保持する」により、その変異体が、天然タンパク質の除草剤抵抗活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％を有するであろうと意味する。除草剤抵抗活性を測定するための方法は、当技術分野において十分に公知である。例えば、米国特許第４５３５０６０号および第５１８８６４２号を参照されたい。これら特許のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

当業者は、突然変異により本発明のヌクレオチド配列に変化を導入することにより、コードされる除草剤抵抗性タンパク質の生物学的活性を改変せずに、そのタンパク質のアミノ酸配列に変化を誘導することができることをさらに認識しているであろう。このように、単離された変異体ポリヌクレオチドは、本明細書に開示する対応するヌクレオチド配列に１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を、導入することにより生み出すことができ、それにより、コードされるタンパク質に１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、または欠失が導入される。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発などの標準的な技法により導入することができる。当該変異体ヌクレオチド配列もまた、本発明に包含される。

例えば、１つまたは複数の予測される可欠アミノ酸残基に保存的アミノ酸置換を行うことができる。「可欠」アミノ酸残基は、生物学的活性を改変せずに野生型配列の除草剤抵抗性タンパク質から改変することができる残基であり、「不可欠」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と交換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）がある。アミノ酸置換は、機能を保持する非保存的領域に行うことができる。一般に、当該置換は、保存されたアミノ酸残基について、または保存されたモチーフ内に存在するアミノ酸残基については行われないであろう（当該残基はタンパク質の活性に不可欠である）。しかし、当業者は、機能的変異体が、保存された残基に小さな保存的または非保存的改変を有しうることを了解しているであろう。

あるいは、変異体ヌクレオチド配列は、飽和突然変異誘発などにより、コード配列の全てまたは一部に沿って突然変異をランダムに導入することにより行うことができ、結果として生じた突然変異体を、除草剤抵抗活性を付与する能力についてスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後に、コードされるタンパク質を組換え発現させて、そのタンパク質の活性を標準的なアッセイ技法を使用して決定することができる。

ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法を使用して、本発明の保存されたドメインを探すことにより、対応する除草剤抵抗性配列を同定することができる。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）、ならびにＩｎｎｉｓら（１９９０年）ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、セントルイス、ミズーリ州）を参照されたい。

ハイブリダイゼーション法では、除草剤抵抗性ヌクレオチド配列またはドメインの全てまたは一部を使用して、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。当該ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーを構築する方法は、当技術分野において一般的に公知であり、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年、上記）に開示されている。いわゆるハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、または他のオリゴヌクレオチドのことがあり、^３２Ｐなどの検出可能な基、または他の放射性同位体、蛍光化合物、酵素、もしくは酵素補因子などの他の任意の検出可能なマーカーで標識されていることがある。本明細書に開示する除草剤抵抗性をコードする公知のヌクレオチドに基づく合成オリゴヌクレオチドを標識することによって、ハイブリダイゼーション用プローブを作製することができる。そのヌクレオチド配列またはコードするアミノ酸配列中の保存されたヌクレオチド残基またはアミノ酸残基に基づいて設計した縮重プライマーをそのうえ使用することができる。このプローブは、典型的には除草剤抵抗性をコードする本発明のヌクレオチド配列またはその断片もしくは変異体の少なくとも約１２、少なくとも約２５、または少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００個の連続するヌクレオチドに、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を有する。ハイブリダイゼーション用のプローブを調製する方法は、当技術分野において一般に公知であり、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年、上記、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）に開示されており、これら文献の両方が参照により本明細書に組み込まれている。

当該配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件で行うことができる。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」により、プローブが、その標的配列と、他の配列よりも検出可能に大きな程度で（例えばバックグラウンドに比べて少なくとも２倍で）ハイブリダイズするであろう条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況では異なるであろう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄条件を制御することにより、プローブに１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同的プロービング（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｂｉｎｇ））。あるいは、配列にいくつかの不一致を可能にするようにストリンジェンシー条件を調整することにより、より低い程度の類似性を検出することができる（非相同的プロービング（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｂｉｎｇ））。一般に、プローブは長さ約１０００ヌクレオチド未満または長さ５００ヌクレオチド未満である。

典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０から８．３で塩濃度がＮａイオン濃度約１．５Ｍ未満、典型的にはＮａイオン（または他の塩）濃度０．０１から１．０Ｍで、短いプローブ（例えば１０から５０ヌクレオチド）について温度が少なくとも約３０℃で、そして長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドを超える）について少なくとも約６０℃の条件であろう。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により実現することもできる。低ストリンジェンシー条件の例は、３７℃で３０から３５％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いたハイブリダイゼーション、および５０から５５℃で１×から２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中での洗浄を含む。中程度のストリンジェンシー条件の例は、３７℃で４０から４５％ホルムアミド、１．０ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーション、および５５から６０℃で０．５×から１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。高ストリンジェンシー条件の例は、３７℃で５０％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０から６５℃で０．１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。場合により、洗浄緩衝液は、約０．１％から約１％のＳＤＳを含んでもよい。ハイブリダイゼーションの持続時間は、一般に約２４時間未満、通常は約４から約１２時間である。

特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重大な因子は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔ_ｍは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８巻：２６７〜２８４頁の式、すなわちＴ_ｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから近似することができ、式中、Ｍは一価陽イオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔ_ｍは、（所定のイオン強度およびｐＨで）相補的標的配列の５０％が完全一致のプローブとハイブリダイズする温度である。Ｔ_ｍはそれぞれ１％のミスマッチについて約１℃減少し、したがって、Ｔ_ｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件を調整して、所望の同一性の配列にハイブリダイズさせることができる。例えば、≧９０％の同一性を有する配列が探索されるならば、Ｔ_ｍは１０℃減少しうる。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨで、特異的配列およびその相補体についての熱融解温度（Ｔ_ｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかし、重度にストリンジェントな条件は、熱融解温度（Ｔ_ｍ）よりも１、２、３、または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、中程度にストリンジェントな条件は、熱融解温度（Ｔ_ｍ）よりも６、７、８、９、または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、低ストリンジェンシー条件は、熱融解温度（Ｔ_ｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。当業者は、この式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件、ならびに所望のＴ_ｍを使用して、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおける変動が説明されることを了解しているであろう。所望の程度の不一致が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴ_ｍを生じるならば、ＳＳＣ濃度を増加させることにより、高温を使用できるようにすることが好ましい。ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの詳細な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３年）ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ、第Ｉ部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら編、（１９９５年）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第２章（ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）を参照されたい。

単離されたタンパク質ならびにその変異体および断片
除草剤抵抗性タンパク質もまた本発明に包含される。「除草剤抵抗性タンパク質」により、例えば、上記ドメインの少なくとも１つを有する、配列番号１０、１２、５６、および５９を含めたクラスＩＩＩタンパク質を意味する。その断片、生物学的に活性な部分、および変異体もまた提供され、それらを使用して本発明の方法を実施することができる。

「断片」または「生物学的に活性な部分」には、除草剤抵抗性タンパク質をコードしており、除草剤抵抗活性を保持するアミノ酸配列の部分を有する、ポリペプチド断片がある。除草剤抵抗性タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば１０、２５、５０、１００、またはそれを超えるアミノ酸長のポリペプチドでありうる。そのような生物学的に活性な部分は、組換え技法により調製することができ、除草剤抵抗活性について評価することができる。除草剤抵抗活性を測定するための方法は、当技術分野において十分に公知である。例えば、米国特許第４５３５０６０号および第５１８８６４２号を参照されたい。これら特許のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

「変異体」により、クラスＩＩＩ酵素に少なくとも約６０％、６５％、約７０％、７５％、約８０％、８５％または少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを意味する。変異体には、ストリンジェントな条件でクラスＩＩＩ酵素をコードするポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまたある。変異体には、突然変異誘発によりアミノ酸配列が異なるポリペプチドがある。本発明に包含される変異体タンパク質は生物学的に活性で、すなわち、この変異体タンパク質は天然タンパク質の所望の生物学的活性を有し続け、すなわち除草剤抵抗活性を保持する。除草剤抵抗活性を測定する方法は、当技術分野において十分に公知である。例えば、米国特許第４５３５０６０号および第５１８８６４２号を参照されたい。これら特許のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

細菌遺伝子は、オープンリーディングフレームの開始部近くで多数のメチオニン開始コドンを有することが実に多い。多くの場合、これら開始コドンのうち１つまたは複数での翻訳開始が機能的タンパク質の発生をもたらすであろう。これらの開始コドンには、ＡＴＧコドンが含まれることがある。しかし、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）などの細菌は、開始コドンとしてコドンＧＴＧもまた認識し、ＧＴＧコドンで翻訳を開始するタンパク質は、最初のアミノ酸にメチオニンを有する。さらに、その細菌においてこれらのコドンのどれが自然に使用されるかは先験的にあまり多くは決定されていない。したがって、選択的メチオニンコドンの１つの使用が除草剤抵抗性を付与する変異体（例えば配列番号５８によりコードされる配列番号５９）の発生をもたらしうることが了解されている。これらの除草剤抵抗性タンパク質は、本発明に包含され、本発明の方法に使用することができる。

本発明のポリペプチドまたはその変異体もしくは断片に対する抗体もまた包含される。抗体を生産する方法は、当技術分野において十分に公知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州；米国特許４１９６２６５号参照）。

細菌細胞または植物細胞の形質転換
細菌細胞の形質転換は、エレクトロポレーションまたは化学的形質転換に限らない、当技術分野において公知のいくつかの技法の１つにより実現される（例えばＡｕｓｕｂｅｌ（編）（１９９４年）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．、インディアナポリス、インディアナ州）。毒性物質に対する抵抗性を付与するマーカーは、非形質転換細胞（被験ＤＮＡを含まず、発現もしていない）から形質転換された細胞（被験ＤＮＡを取り上げて発現している）を見分けるために有用である。本発明の一態様では、遺伝子は、細菌細胞または植物細胞の形質転換を評価するためのマーカーとして有用である。

植物細胞の形質転換は、類似の方法で実現することができる。「植物」により、植物全体、植物器官（例えば葉、茎、根など）、種子、植物細胞、繁殖体、胚、およびその後代を意味される。植物細胞は、分化または未分化（例えばカルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、篩部細胞、花粉）のことがある。「トランスジェニック植物」または「形質転換植物」または「安定に形質転換された」植物もしくは細胞もしくは組織は、植物細胞に取り込まれたか、または組み込まれた外来ポリヌクレオチド配列またはＤＮＡ断片を有する植物を表す。「安定形質転換」により、植物に導入されたヌクレオチド構築物がその植物のゲノムに組み込まれ、その後代に遺伝することができることを意味する。

本発明の遺伝子を変更して、植物細胞における発現を得るか、または高めることができる。本発明の除草剤抵抗性配列は、関心対象の植物に発現させるための発現カセット中に用意してもよい。「植物発現カセット」には、植物細胞においてオープンリーディングフレームからタンパク質の発現を生じることができるＤＮＡ構築物が含まれる。そのカセットは、５’から３’の転写方向、本発明のＤＮＡ配列に作動可能に連結した転写開始領域（すなわちプロモーター）、および植物において機能的な転写翻訳終止領域（すなわち終止領域）に含まれるであろう。いくつかの実施形態では、転写開始領域は、コードされるＥＰＳＰＳ酵素の十分な発現を見込んだＲＮＡ配列の産生を引き起こして、そのポリヌクレオチドを用いて形質転換された植物細胞のグリフォセート耐性を高めるであろう。「十分な発現」により、そのタンパク質を有さず、発現もしない植物もしくは細胞よりも高濃度のグリフォセートに耐える能力、またはそのタンパク質を有さず、発現もしない植物もしくは細胞よりも長期間ある濃度のグリフォセートに耐える能力を植物または細胞に付与するであろう量の本発明のグリフォセート抵抗性ポリペプチド（例えばクラスＩＩＩドメインを有するポリペプチド）の発現を、転写開始領域が与えるであろうということを意味する。

そのカセットは、そのうえ選択マーカー遺伝子などの、生物に同時形質転換するための少なくとも１つの追加の遺伝子を有してもよい。あるいは、その追加の遺伝子は多数の発現カセットに用意することができる。当該発現カセットは、調節領域の転写調節下にある除草剤抵抗性配列を挿入するための複数の制限部位を備える。

プロモーターは、植物宿主および／または本発明のＤＮＡ配列に対して天然または類似であってもよいし、外来または異種であってもよい。そのうえ、プロモーターは、天然配列または合成配列であってもよい。プロモーターが、植物宿主に対して「天然」または「同種」である場合には、そのプロモーターは、そのプロモーターが導入された天然植物に見出されることを意味する。プロモーターが、本発明のＤＮＡ配列に対して「外来」または「異種」である場合には、そのプロモーターは、作動可能に連結した本発明のＤＮＡ配列についての天然プロモーターでも自然発生的プロモーターでもないことを意味する。「異種」は一般に、細胞にも、ポリヌクレオチド配列が存在する天然ゲノムの部分にも内因性でなく、感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクションなどにより細胞に加えられたポリヌクレオチド配列を表す。「作動可能に連結した」により、プロモーターと第２配列との間の機能的連結を意味し、ここで、プロモーター配列は、第２配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始し仲介する。一般に、作動可能に連結したは、連結されつつあるポリヌクレオチド配列が連続的で、必要に応じて２つのタンパク質コード領域を連続して同じリーディングフレームに繋ぐことを意味する。

そのような構築物は、５’および３’未翻訳領域もまた有することが多いものである。当該構築物は、「シグナル配列」または「リーダー配列」を有し、関心対象のポリペプチドを、クロロプラスト（または他の色素体）、小胞体、もしくはゴルジ装置などのある種の細胞内構造に同時翻訳輸送または翻訳後輸送するのを容易にするか、または分泌される「シグナル配列」または「リーダー配列」を有しうる。例えば、遺伝子を操作して、ペプチドを小胞体に移入するのを促進するシグナルペプチドを有するようにすることができる。「シグナル配列」により、細胞膜を通過する同時翻訳ペプチド輸送または翻訳後ペプチド輸送を招くことが公知であるか、またはその疑いのある配列を意味する。真核生物では、この配列は、典型的にはゴルジ装置への分泌を伴い、結果としていくらかのグリコシル化が生じる。「リーダー配列」により、翻訳された場合に、細胞内小器官へのペプチド鎖の同時翻訳輸送の誘因となるのに十分なアミノ酸を生じる任意の配列を意味する。したがって、これには、小胞体内への運搬、液胞、クロロプラストを含めた色素体、およびミトコンドリアなどへの運搬により輸送および／またはグリコシル化を標的付けるリーダー配列が含まれる。植物発現カセットもまたイントロンを有するように操作することにより、発現にイントロンのｍＲＮＡプロセシングが必要となるようにすることもできる。

「３’非翻訳領域」により、コード配列下流に位置するヌクレオチド配列を意味する。ポリアデニル化シグナル配列（例えばポリアデニル化ヌクレオチド）、およびｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸区域の付加に影響することができる調節シグナルをコードするその他の配列は、３’非翻訳領域である。「５’非翻訳領域」により、コード配列上流に位置するヌクレオチド配列を意味する。

他の上流または下流の非翻訳エレメントにはエンハンサーがある。エンハンサーは、プロモーター領域の発現を増加させるように作用するヌクレオチド配列である。エンハンサーは当技術分野において十分に公知であり、エンハンサーには、ＳＶ４０エンハンサー領域および３５Ｓエンハンサーエレメントがあるが、それに限定されるわけではない。

終止領域は、転写開始領域と共に天然であってもよく、本発明の除草剤抵抗性配列と共に天然であってもよく、また別の起源に由来してもよい。好都合な終止領域は、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドから得ることができ、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼの終止領域などである。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら（１９９１年）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１〜１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１年）Ｃｅｌｌ６４巻：６７１〜６７４頁；Ｓａｎｆａｃｏｎら（１９９１年）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．５巻：１４１〜１４９頁；Ｍｏｇｅｎら（１９９０年）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２巻：１２６１〜１２７２頁；Ｍｕｎｒｏｅら（１９９０年）Ｇｅｎｅ９１巻：１５１〜１５８頁；Ｂａｌｌａｓら（１９８９年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７巻：７８９１〜７９０３頁；およびＪｏｓｈｉら（１９８７年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１５巻：９６２７〜９６３９頁も参照されたい。

適切な場合には、形質転換された宿主細胞での発現増大のために、遺伝子を最適化してもよい。すなわち、発現の向上のために宿主細胞に好まれるコドンを使用して遺伝子を合成することができるし、宿主に好まれるコドン利用頻度でコドンを使用して合成してもよい。一般に、遺伝子のＧＣ含量は増大するであろう。例えば、宿主に好まれるコドン利用の考察についてはＣａｍｐｂｅｌｌおよびＧｏｗｒｉ（１９９０年）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９２巻：１〜１１頁を参照されたい。宿主に好まれる遺伝子を合成するための方法は当技術分野において公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６３２０１００号；第６０７５１８５号；第５３８０８３１号；および第５４３６３９１号、米国出願公開第２００４０００５６００号および第２００１０００３８４９号、ならびにＭｕｒｒａｙら（１９８９年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７巻：４７７〜４９８頁を参照されたい。

一実施形態において、関心対象のポリヌクレオチドは、発現のためにクロロプラストに標的付けられる。このように、関心対象のポリヌクレオチドがクロロプラストに直接挿入されない場合には、発現カセットは、そのうえクロロプラストに関心対象の遺伝子産物を方向付ける輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するであろう。当該輸送ペプチドは、当技術分野において公知である。例えば、ＶｏｎＨｅｉｊｎｅら（１９９１年）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９巻：１０４〜１２６頁；Ｃｌａｒｋら（１９８９年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４巻：１７５４４〜１７５５０頁；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７年）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８４巻：９６５〜９６８頁；Ｒｏｍｅｒら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６巻：１４１４〜１４２１頁；およびＳｈａｈら（１９８６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３巻：４７８〜４８１頁を参照されたい。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、アミノ末端クロロプラスト輸送ペプチドおよびＥＰＳＰＳ酵素を有する融合ポリペプチドをコードする。「融合ポリペプチド」は、例えば第１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列から終止コドン除去すること、次に第２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をフレーム内に付属させることにより作製することができ、それにより、次に結果として生じたポリヌクレオチド配列が、単一ポリペプチドとして細胞により発現されるであろう。

植物の核とクロロプラストとの間のコドン利用の差を説明するために、クロロプラストに標的付けられた関心対象のポリヌクレオチドを、この小器官での発現について最適化してもよい。このようにして、関心対象のポリヌクレオチドをクロロプラストに好まれるコドンを使用して合成してもよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５３８０８３１号を参照されたい。

典型的には、この「植物発現カセット」は、「植物形質転換ベクター」に挿入されるであろう。「形質転換ベクター」により、細胞の効率的な形質転換に必要なＤＮＡ分子を意味する。当該分子は、１つまたは複数の発現カセットからなることがあり、１つを超える「ベクター」ＤＮＡ分子に組織化されうる。例えば、バイナリーベクターは、植物細胞の形質転換のために要求される全てのシス作用機能およびトランス作用機能をコードする２つの非連続ＤＮＡベクターを利用する植物形質転換ベクターである（ＨｅｌｌｅｎｓおよびＭｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００年）ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ５巻：４４６〜４５１頁）。「ベクター」は、異なる宿主細胞の間で移動させるように設計されたポリヌクレオチド構築物を表す。「発現ベクター」は、外来細胞に異種ＤＮＡ配列または断片を取り込み、組み込み、かつ発現させる能力を有するベクターを表す。

この植物形質転換ベクターは、植物形質転換を実現するために必要な１つまたは複数のＤＮＡベクターから構成されてもよい。例えば、１つを超える連続ＤＮＡセグメントから構成される植物形質転換ベクターを利用することは、当技術分野における慣行である。これらのベクターは、当技術分野において「バイナリーベクター」と呼ばれることが多い。バイナリーベクターおよびヘルパープラスミドを有するベクターは、ほとんどの場合アグロバクテリウム介在性形質転換に使用され、その形質転換では効率的な形質転換の実現に必要なＤＮＡセグメントのサイズおよび複雑性は極めて大きく、別々のＤＮＡ分子に機能を分離することが好都合である。バイナリーベクターは、典型的にはＴ−ＤＮＡ移入に必要なシス作用配列（左境界および右境界など）、植物細胞に発現できるように操作された選択マーカー、および「関心対象の遺伝子」（トランスジェニック植物の作製が望まれる植物細胞に発現できるように操作された遺伝子）を有するプラスミドベクターを有する。このプラスミドベクターには、細菌での複製に必要な配列もまた存在する。このシス作用配列は、植物細胞内へ効率的に移入させ、その細胞で発現させるように配列される。例えば、選択マーカー遺伝子および関心対象の遺伝子は、左境界と右境界との間に位置する。第２プラスミドベクターは、アグロバクテリウムから植物細胞へのＴ−ＤＮＡ移入を仲介するトランス作用因子を有することが多い。このプラスミドは、病原性機能（Ｖｉｒ遺伝子）を有することが多く、その機能は、当技術分野において了解されているようにアグロバクテリウムにより植物細胞を感染させ、境界配列の開裂およびｖｉｒ介在性ＤＮＡ移入によりＤＮＡを移入させる（ＨｅｌｌｅｎｓおよびＭｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００年）ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ、５巻：４４６〜４５１頁）。いくつかの種類のアグロバクテリウム株（例えばＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５など）を植物形質転換に使用することができる。マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコールなどの他の方法により植物を形質転換するために、第２プラスミドベクターは必要ではない。

植物形質転換
本発明の方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入することを伴う。「導入する」により、ヌクレオチド構築物が植物細胞の内部にアクセスする方法で、その植物にその構築物を提示することを意味する。本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を植物に導入する特定の方法を使用する必要がなく、植物の少なくとも１つの細胞の内部にヌクレオチド構築物がアクセスすることだけが必要である。植物にヌクレオチド構築物を導入する方法は、安定形質転換法、一過性形質転換法、およびウイルス介在法を含めて当技術分野において公知であるが、それに限定されるわけではない。

一般に、植物形質転換法は、標的植物細胞（例えば未熟または成熟胚、懸濁培養物、未分化カルス、プロトプラストなど）に異種ＤＮＡを移入し、続いて（選択マーカー遺伝子と、この場合は「グリフォセート」に応じて）最大閾値レベルの適切な選択を適用して、一群の未形質転換細胞塊から形質転換された植物細胞を回収することを伴う。この工程において、本発明の１つまたは複数のクラスＩＩＩドメインを有するグリフォセート抵抗性ポリペプチドは、選択マーカーとして使用してもよい。

外植片は、典型的には同じ培地の新鮮供給物に移植され、日常的に培養される。続いて、形質転換細胞は、最大閾値レベルの選択剤（例えば「グリフォセート」）を補充した再生培地上に置かれた後にシュートに分化する。次にシュートは、発根したシュートまたは小植物体を回収するための選択発根培地に移植される。次に、このトランスジェニック小植物体を成熟植物に生育させ、稔性種子を生産する（例えばＨｉｅｉら（１９９４年）ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ６巻：２７１〜２８２頁；Ｉｓｈｉｄａら（１９９６年）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４巻：７４５〜７５０頁）。外植片は、典型的には同じ培地の新鮮供給物に移植され、日常的に培養される。トランスジェニック植物を作製する技法および方法の一般的な説明は、ＡｙｒｅｓおよびＰａｒｋ（１９９４年）ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ１３巻：２１９〜２３９頁ならびにＢｏｍｍｉｎｅｎｉおよびＪａｕｈａｒ（１９９７年）Ｍａｙｄｉｃａ４２巻：１０７〜１２０頁に見出される。形質転換された材料が多数の細胞を有することから、形質転換細胞および非形質転換細胞の両方が、供された標的カルスまたは組織または細胞群の任意の一部分に存在する。非形質転換細胞を死滅させ、形質転換細胞に増殖させることができる結果として、形質転換植物の培養物が生じる。非形質転換細胞を除去できることは、形質転換された植物細胞の迅速な回収およびトランスジェニック植物の作製成功への制限となる。次に、トランスジェニック植物のゲノムに組み込まれた関心対象の異種遺伝子の存在を確認するために、分子法および生化学法が使用されるであろう。

トランスジェニック植物の作製は、アグロバクテリウムによる植物細胞への異種ＤＮＡの導入（アグロバクテリウム介在性形質転換）、粒子に接着した異種外来ＤＮＡを用いた植物細胞の衝撃、およびＤＮＡを移入するための様々な他の非粒子直接−介在法を含むが、それに限定されるわけではないいくつかの方法の１つによって行ってもよい（例えばＨｉｅｉら（１９９４年）ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ６巻：２７１〜２８２頁；Ｉｓｈｉｄａら（１９９６年）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４巻：７４５〜７５０頁；ＡｙｒｅｓおよびＰａｒｋ（１９９４年）ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ１３巻：２１９〜２３９頁；ＢｏｍｍｉｎｅｎｉおよびＪａｕｈａｒ（１９９７年）Ｍａｙｄｉｃａ４２巻：１０７〜１２０頁）。

クロロプラストの形質転換細胞のための方法は当技術分野において公知である。例えば、Ｓｖａｂら（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７巻：８５２６〜８５３０頁；ＳｖａｂおよびＭａｌｉｇａ（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０巻：９１３〜９１７頁；ＳｖａｂおよびＭａｌｉｇａ（１９９３年）ＥＭＢＯＪ．１２巻：６０１〜６０６頁を参照されたい。この方法は、選択マーカーを有するＤＮＡの粒子銃による送達、および相同組換えによる色素体ゲノムへのＤＮＡの標的付けに頼っている。そのうえ、色素体の形質転換は、核にコードされる色素体に特異的ＲＮＡポリメラーゼの組織選好的発現によるサイレントな色素体媒介導入遺伝子のトランス活性化により実現することができる。そのような系は、ＭｃＢｒｉｄｅら（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１巻：７３０１〜７３０５頁に報告されている。

形質転換された細胞は、従来方法により植物の中で生育させることができる。例えばＭｃＣｏｒｍｉｃｋら（１９８６年）ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ５巻：８１〜８４頁を参照されたい。次にこれらの植物を生育させ、同じ形質転換株または異なる株のいずれかを用いて受粉させ、結果として生じた、所望の表現型の特徴を構成的に発現する雑種を同定してもよい。２世代以上生育させて、所望の表現型の特徴の発現が安定に維持され、遺伝されることを確認し、次に種子を収穫して所望の表現型の特徴発現が実現されたことを確認してもよい。このようにして、本発明は、本発明のヌクレオチド構築物、例えば本発明の発現カセットがゲノムに安定に取り込まれた形質転換種子（「トランスジェニック種子」とも呼ばれる）を提供する。

植物
本発明は、単子葉類および双子葉類を非限定的に含めた任意の植物種の形質転換のために使用してもよい。関心対象の植物の例には、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネ、アブラナ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａｓｐ．）、アルファルファ、ライムギ、ミレット、サフラワー、ラッカセイ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、柑橘類植物、ココア、チャ、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ、野菜、観賞植物、および針葉樹があるが、それに限定されるわけではない。

野菜には、トマト、レタス、グリーンビーンズ、アオイマメ、エンドウ、およびクルクミス（Ｃｕｒｃｕｍｉｓ）属のメンバー（キュウリ、カンタロープ、およびマスクメロンなど）があるが、それに限定されるわけではない。観賞植物には、アザレア、アジサイ、フヨウ、バラ、チューリップ、スイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、およびキクがあるが、それに限定されるわけではない。好ましくは、本発明の植物は、作物植物（例えば、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネなど）である。

本発明は、トウモロコシ、イネ、オオムギ、カラスムギ、コムギ、モロコシ、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、ヤムイモ、タマネギ、バナナ、ココナッツ、およびナツメヤシを非限定的に含めた単子葉類植物の科の任意のメンバーに特に適する。

植物形質転換の評価
異種外来ＤＮＡを植物細胞に導入した後に、植物ゲノム中の異種遺伝子の形質転換または組み込みは、組み込まれた遺伝子に関連するポリヌクレオチド、タンパク質、および代謝物の分析などの様々な方法により確認される。

ＰＣＲ分析は、土壌に移植する前の初期段階に、取り込まれた遺伝子の存在について形質転換された細胞、組織、またはシュートをスクリーニングする迅速法である（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）。ＰＣＲは、関心対象の遺伝子またはアグロバクテリウムベクターのバックグラウンドなどに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行う。

植物形質転換は、ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年、上記）により確認してもよい。一般に、総ＤＮＡを形質転換体から抽出し、適切な制限酵素で消化し、アガロースゲルで分画し、ニトロセルロース膜またはナイロン膜に移行させる。次に、その膜すなわち「ブロット」は、例えば放射標識^３２Ｐ標的ＤＮＡ断片を用いて探査し、導入された遺伝子が植物ゲノムに組み込まれていることを標準技法により確認される（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年、上記）。

ノーザン分析では、ＲＮＡを形質転換体の特異的組織から単離し、ホルムアルデヒドアガロースゲルで分画し、当技術分野において日常的に使用されている標準的な手順によりナイロンフィルターにブロットする（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年、上記）。次に、当技術分野において公知の方法によりＧＤＣ由来の放射性プローブにフィルターをハイブリダイズすることにより、本発明の配列によりコードされるＲＮＡの発現を試験する（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年、上記）。

トランスジェニック植物に関してウエスタンブロットおよび生化学アッセイなどを行って、除草剤抵抗性タンパク質に存在する１つまたは複数のエピトープに結合する抗体を使用する標準的な手順（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年、上記）により、除草剤抵抗性遺伝子によりコードされるタンパク質の存在を決定してもよい。

本発明は、グリフォセート抵抗活性を有するＥＰＳＰシンターゼを同定する方法にもまた向けられている。その方法は、ある保存された配列ドメインがＥＰＳＰシンターゼのアミノ酸配列に存在するかどうかを決定することを伴う。上に挙げた１つまたは複数のドメインの存在である。

配列からタンパク質の機能を予測
本発明の方法および同定されたドメインを使用して、グリフォセート耐性を付与する追加的なポリペプチド（例えば配列番号２、４、４６、および４８）を同定することができる。これらの追加的なポリペプチドは、ＥＰＳＰシンターゼ配列を有する配列データベースを検索することにより、および／またはクラスＩＩＩドメインの存在を検索するためのＥＰＳＰシンターゼのポリペプチド配列のアライメントにより同定することができる。これらのポリペプチドには、公知のポリペプチドおよび新たに同定されたポリペプチドがある。これらのドメインの幾分かの変更は、これらのドメインがグリフォセート抵抗性を付与する性質を破壊せずに事実上許容されるため、本明細書に挙げるドメインと等価であることが了解されている。

一般に、４つのレベルのタンパク質構造、すなわちアミノ酸直鎖配列すなわちポリペプチド配列からなる一次構造、αヘリックス、βストランド、およびタンパク質が折り畳まれるターンにより示される二次構造、組み合わされて小型球状ドメインを形成する単純なモチーフから構成される三次構造、ならびに数個のアミノ酸鎖またはサブユニットを含みうる四次構造がある。配列から機能を予測する場合には、機能的に重要なモチーフまたはパターンを同定することが重要である。類似の折畳みを有するタンパク質ドメインは、同じ分子機能を共有することが多い（ＨｅｇｙｉおよびＧｅｒｓｔｅｉｎ（１９９９年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８８巻：１４７〜１６４頁；ＭｏｕｌｔおよびＭｅｌａｍｕｄ（２０００年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０巻：３８４〜３８９頁；Ｓｈａｋｈｎｏｖｉｃｈら（２００３年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２６巻：１〜９頁）。タンパク質の機能に重要なドメインの同定は、多配列アライメントにより行うことができる。

ホモロジーモデリング、すなわち実験的に決定された３Ｄ構造を有する配列ホモログ（同一性＞２５％）を使用することによって、三次元構造を予測することができる。例えば大腸菌ＥＰＳＰシンターゼ（ＡｒｏＡ）の三次元構造は十分に公知である（Ｓｈｏｎｂｒｕｎｎら（２００１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８巻：１３７５〜１３８０頁）。この構造は、ＡｒｏＡとグリフォセートおよびシキミ酸３−リン酸との結晶化に基づく。

以下の実施例は、限定としてではなく例証として提供されるものである。

（実施例１）
ＥＰＳＰＳ遺伝子の単離
クラスＩＩＩＥＰＳＰＳ酵素をコードする遺伝子は、７つの異なる細菌（肺炎桿菌、アグロバクテリウムラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．）、ブレブンドモナスベシキュラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｏｍｏｎａｓｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）、アグロバクテリウムツメファシエンス、シュードモナスシリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ）、およびブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）／オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）から単離されている。

ｇｒｇ８オープンリーディングフレームのＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列は、２００４年１２月２９日に出願された米国特許出願第６０／６４０１９５号に提供され、本出願のそれぞれ配列番号７および配列番号８に提供される。

ｇｒｇ１２オープンリーディングフレームのＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列は、本出願のそれぞれ配列番号５７および１０、ならびに配列番号５８および５９に提供される。

ｇｒｇ１５オープンリーディングフレームのＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列は、本出願のそれぞれ配列番号１１および配列番号１２に提供される。

ｇｒｇ６オープンリーディングフレームのＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ０１６８５３の塩基１１４００９１から１１４１３４７に提供され、本出願のそれぞれ配列番号１および配列番号２に提供される。

ｇｒｇ９オープンリーディングフレームのＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３３０４の塩基６２８３９８から６２９６７５に提供され、本出願のそれぞれ配列番号３および配列番号４に提供される。

ｇｒｇ７オープンリーディングフレームのＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列は、本出願のそれぞれ配列番号４５および配列番号４６に提供される。

ｇｒｇ５オープンリーディングフレームのＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００５７７３の塩基１から１２５７に書いてあり、本出願のそれぞれ配列番号４７および配列番号４８に提供される。

トウモロコシＥＰＳＰＳオープンリーディングフレームのＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６３３７４（ｇｉ：１５２４３８３）の塩基１から１３３５に提供され、タンパク質の配列は本出願の配列番号５０に提供される。

国際特許出願ＷＯ２００５０１４８２０に開示されている細菌ＥＰＳＰＳのＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列は、本出願のそれぞれ配列番号５３および配列番号５４に提供される。

ｇｒｇ７ｍ１オープンリーディングフレームのＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列は、本出願のそれぞれ配列番号５５および配列番号５６に提供される。
（実施例２）
シュードモナスシリンゲｐｖトマト（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｐｖｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００株由来ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子をクローニングする
次のプライマーを使用して、シュードモナスシリンゲｐｖトマトＤＣ３０００株（ＡＴＣＣＢＡＡ−８７１）のゲノムＤＮＡからＥＰＳＰシンターゼのコード配列をＰＣＲ増幅した：

（上流、配列番号６１）および

（下流、配列番号６２）。結果として生じた１．３ｋｂのＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＡｓｃＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＡｒｃＩで消化した変更ｐＵＣ１８に連結し、次にＤＨ５α細胞にエレクトロポレーションした。アンピシリン耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、制限消化により分析した。さらに分析するために１つのクローンを選択した。当技術分野において十分に公知の技法を使用して挿入部のＤＮＡ配列を決定し、ＤＣ３０００株について公表された配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＥ０１６８５３の塩基１１４００９１から１１４１３４７）と１００％同一であることを見出した。このプラスミドをｐＡＸ７０３と名付け、ＥＰＳＰＳのＯＲＦをｇｒｇ６と名付けた。

プラスミドｐＡＸ７０３をΔａｒｏＡ大腸菌細胞に形質転換し、欠失を相補することを見出した。これにより、ｇｒｇ６が機能的ＥＰＳＰシンターゼをコードすることを実証した。
（実施例３）
アグロバクテリウムラジオバクターＣ５８株からＥＰＳＰシンターゼ遺伝子をクローニングする
次のプライマーを使用して、アグロバクテリウムツメファシエンスＣ５８株（ＡＴＣＣ３３９７０）のゲノムＤＮＡからＥＰＳＰシンターゼのコード配列をＰＣＲ増幅した：

（上流、配列番号６３）および

（下流、配列番号６４）。結果として生じた１．３ｋｂのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＡｓｃＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＡｒｃＩで消化した変更ｐＵＣ１８に連結し、次にＤＨ５α細胞にエレクトロポレーションした。アンピシリン耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、制限消化により分析した。さらに分析するために１つのクローンを選択した。当技術分野において十分に公知の技法を使用して挿入部のＤＮＡ配列を決定し、Ｃ５８株について公表された配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３３０４の塩基６２８３９８から６２９６７５）と１００％同一であることを見出した。このプラスミドをｐＡＸ７０２と名付け、Ｃ５８ＥＰＳＰＳのＯＲＦをｇｒｇ９と名付けた。

プラスミドｐＡＸ７０２をΔａｒｏＡ大腸菌細胞に形質転換し、欠失を相補することを見出した。これにより、ｇｒｇ９が機能的ＥＰＳＰシンターゼをコードすることを実証した。
（実施例４）
グリフォセート抵抗性についてｇｒｇ６およびｇｒｇ９を試験する
大腸菌細胞にそれぞれｇｒｇ６およびｇｒｇ９を有するプラスミドｐＡＸ７０３およびｐＡＸ７０２を形質転換し、様々な濃度のグリフォセートを含有するＭ６３寒天培地に画線した。ベクタープラスミドｐＵＣ１８をグリフォセート感受性対照として使用した。結果を下の表１に示す。この結果は、ｇｒｇ６またはｇｒｇ９の発現が高レベルのグリフォセートに対する抵抗性を付与することを実証している。

表１

（実施例５）
シュードモナスシリンゲｐｖシリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｐｖｓｙｒｉｎｇａｅ）Ｂ７２８ａ株からＥＰＳＰシンターゼ遺伝子をクローニングする
次のプライマーを使用して、シュードモナスシリンゲｐｖシリンゲＢ７２８ａ株の単一ウェル単離コロニーからＥＰＳＰシンターゼコード配列をＰＣＲ増幅した：

（上流、配列番号６５）および

（下流、配列番号６６）。結果として生じた１．２６ｋｂのＰＣＲ産物を適切な制限酵素で消化し、ベクターｐＲＳＦ１ｂに連結し、次に大腸菌細胞にエレクトロポレーションした。アンピシリン耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、これを制限消化により分析した。さらに分析するために１つのコロニーを選択し、ｐＡＸ１９２３と名付けた。ｐＡＸ１９２３のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列を決定し、シュードモナスシリンゲｐｖシリンゲＢ７２８ａ株由来ＥＰＳＰＳの公表された配列と同一であることを見出した。したがって、このオープンリーディングフレームをｇｒｇ７と名付けた。

同様に、別の１．２６ｋｂのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＡｓｃＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＡｓｃＩで消化した変更ｐＵＣ１８に連結し、次に、ＤＨ５α細胞にエレクトロポレーションした。アンピシリン抵抗性コロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、制限消化により分析した。さらに分析するために１つのコロニーを選択した。当技術分野において十分に公知の技法を使用してｐＡＸ７１２の挿入部のＤＮＡ配列を決定し、シュードモナスシリンゲｐｖシリンゲＢ７２８ａ株（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＺ＿ＡＡＢＰ０２０００００３の塩基３９９０１から４１４００）の公表されたＤＮＡ配列と比べた場合に３つのヌクレオチド変化を有することを見出した。これらの３つのヌクレオチド変化は、公表された配列にコードされる仮説的タンパク質に対して１つのアミノ酸変化を有するタンパク質を生じる。プラスミドｐＡＸ７１２において同定された、ＥＰＳＰＳをコードするＢ７２８ａ株由来のオープンリーディングフレームをｇｒｇ７ｍ１（配列番号５５、ｇｒｇ７ｍ１のタンパク質配列は配列番号５６に示す）と名付けた。
（実施例６）
シュードモナスシリンゲｐｖファセオリコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｐｖｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ）１１４８ａ株からのＥＰＳＰシンターゼ遺伝子のクローニング
シュードモナスシリンゲｐｖファセオリコラ１１４８ａ株のＥＰＳＰＳについての配列データは、ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇのＴｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＧｅｎｏｍｉｃＲｅｓｅａｒｃｈのホームページから得た。ＴｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＧｅｎｏｍｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ（「ＴＩＧＲ」）から入手できるＤＮＡ配列（個人的に得た情報）に基づき設計された次のプライマーを使用して、シュードモナスシリンゲｐｖファセオリコラ１１４８ａ株（ＡＴＣＣＢＡＡ−９７８）のゲノムＤＮＡからシュードモナスシリンゲｐｖファセオリコラ１１４８ａ株のＥＰＳＰシンターゼのコード配列をＰＣＲ増幅した：

（上流、配列番号６７）および

（下流、配列番号６８）。結果として生じた１．２６ｋｂのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＡｓｃＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＡｓｃＩで消化した変更ｐＵＣ１８に連結し、次にＤＨ５α細胞にエレクトロポレーションした。アンピシリン抵抗性コロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、制限消化により分析した。さらに分析するために１つのコロニーを選択し、ｐＡＸ７１３と名付けた。当技術分野において十分に公知の技法を使用してｐＡＸ７１３の挿入部のＤＮＡ配列を決定し、シュードモナスシリンゲｐｖファセオリコラ１１４８ａ株の公表されたＤＮＡ配列と１００％同一であると見出した（ＴｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＧｅｎｏｍｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）が実施し、ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇからオンラインで電子形態として入手できる）。このプラスミドをｐＡＸ７１３と命名し、プラスミドｐＡＸ７１３において同定されたＥＰＳＰＳをコードする、１４４８ａ株由来のオープンリーディングフレームをｇｒｇ５と名付けた。
（実施例７）
グリフォセート抵抗性についてのｇｒｇ５およびｇｒｇ７の試験
それぞれｇｒｇ５、ｇｒｇ７、およびｇｒｇ７ｍ１を有するプラスミドｐＡＸ７１３、ｐＡＸ１９２３、およびｐＡＸ７１２を大腸菌細胞に形質転換し、様々な濃度のグリフォセートを含有するＭ６３寒天培地に画線した。ベクタープラスミドｐＵＣ１８をグリフォセート感受性対照として使用した。結果を下の表２に示す。この結果は、ｇｒｇ５、ｇｒｇ７、またはｇｒｇ７ｍ１の発現が高レベルのグリフォセートに対する抵抗性を付与することを実証している。

表２

（実施例８）
ＡＴＸ２００１９の単離
唯一のリン源としてグリフォセートを含有するＨＥＰＥＳ無機塩培地（ＨＭＳＭ）のプレートに土壌試料を蒔くことによりＡＴＸ２００１９を単離した。ＨＭＳＭは芳香族アミノ酸を有さないことから、この培地上で成長するためには、株はグリフォセートに抵抗性でなければならない。

土壌２ｇを水約１０ｍｌに懸濁し、１５秒間ボルテックスし、１５分間沈降させた。１０ｍＭグリフォセート（ｐＨ７．０）を補充したＨＭＳＭ３ｍｌにこの懸濁液１白金耳（１０μｌ）を加えた。ＨＭＳＭは、（１リットルあたり）グルコース１０ｇ、ＮＨ_４ＳＯ_４２ｇ、ＨＥＰＥＳ９．５３ｇ、０．８ＭＭｇＳＯ_４１．０ｍｌ、０．１ＭＣａＣｌ_２１．０ｍｌ、微量元素溶液１．０ｍｌ（１０００×溶液１００ｍｌ中にＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．１ｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．５ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３１．０ｍｇ、ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ１．０ｍｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ７．０ｍｇ、ＭｏＯ_３１．０ｍｇ、ＫＣｌ４．０ｇ）を含有する。培養物を振盪培養器で２８℃で４日間生育させ、次に２０μｌを使用して、唯一のリン源として１０ｍＭグリフォセートを含有する新鮮ＨＭＳＭ２．５ｍｌに接種した。２日後に、２０μｌを使用して別の新鮮２．５ｍｌ培養物に接種した。５日後に２０μｌを使用して新鮮培養液２．５ｍｌに接種した。十分に生育した後で、唯一のリン源として１０ｍＭグリフォセートを含有するＨＭＳＭ寒天が入った寒天プレート表面に１白金耳（１μｌ）を画線することにより、固形培地上に培養物を蒔き、２８℃で保管した。次に、単離するために培養物をもう一度プレートに蒔いた。高グリフォセート濃度の存在下で生育できる能力が原因で、ＡＴＸ２００１９と呼ばれる特定の一株を選択した。１６ＳｒＤＮＡの配列決定およびデータベースとの比較により、ＡＴＸ２００１９はオクロバクトラム種（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｓｐ．）／ブルセラ種（Ｂｒｕｃｅｌｌａｓｐ．）のメンバーであると決定した。
（実施例９）
コスミドライブラリーの調製およびスクリーニング
当技術分野において一般に公知の方法を使用して、ＡＴＸ２００１９の培養物から総ＤＮＡを抽出した。制限酵素Ｓａｕ３Ａ１でＤＮＡを部分消化し、製造業者の指示に従ってＳｕｐｅｒＣｏｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベクター断片に連結した。ＧｉｇａＰａｃｋＩＩＩＸＬパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して連結産物をファージ粒子にパッケージし、大腸菌ａｒｏＡ−細胞にトランスフェクトした。大腸菌ａｒｏＡ−は、ＥＰＳＰシンターゼをコードする天然ａｒｏＡ遺伝子が欠失した株である。この株は、外部から供給した芳香族アミノ酸を必要とするため、Ｍ６３培地上では生育できない。ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子を有するコスミドが存在すると、ＡｒｏＡ−表現型を遺伝的に相補でき、すなわち、外部から供給した芳香族アミノ酸なしにこの株をＭ６３培地上で生育させる。

１００ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、１５ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５０μＭＣａＣｌ_２、１μＭＦｅＳＯ_４、５０μＭＭｇＣｌ_２、５５ｍＭグルコース、２５ｍｇ／ｌＬ−プロリン、１０ｍｇ／ｌチアミンＨＣｌ、ｐＨを７．０に調整するのに十分なＮａＯＨ、および１５ｇ／ｌ寒天を含有する、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＭ６３寒天培地のプレートにトランスフェクトされた細胞を蒔いた。この培地上で生育した２つのコロニーを確認した。これらのコロニーのそれぞれからコスミドＤＮＡを調製し、大腸菌ＡｒｏＡ−細胞にもう一度形質転換した。それぞれの場合で、コスミドＤＮＡを用いてもう一度形質転換した細胞は、０または１０ｍＭグリフォセート存在下でＭ６３培地上で生育したが、空のＳｕｐｅｒＣｏｓベクターを有する細胞は生育しなかった。これは、コスミドがａｒｏＡ−表現型を相補することができ、グリフォセートに対する抵抗性を付与することができることを確認している。これらのコスミドをｐＡＸ１１００およびＡＸ１１０１と命名した。２つの異なる酵素を使用した制限消化分析によると、これらのコスミドは同一と思われた。さらに特徴付けるために、一方のコスミドであるｐＡＸ１１０１を選択した。
（実施例１０）
コスミドｐＡＸ１１０１におけるｇｒｇ１２の同定
コスミドｐＡＸ１１０１により示されるグリフォセート抵抗性を担う遺伝子を同定するために、このクローン由来のＤＮＡを転移因子を用いて突然変異誘発した。この方法では、トランスポゾンの挿入を受け、グリフォセート抵抗性を付与する能力を失ったクローンが同定される。トランスポゾン挿入部の位置により、グリフォセート抵抗性表現型を担うオープンリーディングフレームが同定される。

ＥＺ：：ＴＮＩｎｓｅｒｔｉｏｎＫｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、マディソン、ウィスコンシン州）および製造業者のプロトコールを使用したｉｎｖｉｔｒｏトランスポゾン突然変異誘発にコスミドｐＡＸ１１０１を供した。この工程により、コスミドＤＮＡにトランスポゾン断片がランダムに挿入され、したがって、コスミド中の遺伝子の機能がランダムに破壊される。トランスポゾンは、抗生物質に対する抵抗性をコードする遺伝子を有するので、その抗生物質の存在下で生育できる能力により、トランスポゾン挿入クローンを選択することができる。トランスポゾン挿入部の位置は、制限断片のマッピングにより、またトランスポゾン中でアニールするプライマーを用いた配列決定により決定することができる。

トランスポゾン挿入クローンｐＡＸ１１０１を大腸菌株ＤＨ５αに形質転換し、グリフォセート含有Ｍ６３培地のプレートに蒔いた。グリフォセート存在下で生育できる能力を失った多数のクローンが見出され、これは、トランスポゾンが抵抗性を担う遺伝子を破壊したことを示している。

当技術分野において十分に公知の配列決定法を使用して、トランスポゾン挿入部を有するｐＡＸ１１０１の領域についてＤＮＡ配列を決定した。それを配列番号９として提示する。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、配列番号９の塩基４６から１３８０に同定した。このヌクレオチド配列は配列番号５７として提供され、対応するアミノ酸配列は配列番号５８として提供される。グリフォセート抵抗性を失ったえり抜きの８つのトランスポゾン挿入部からの配列データの解析により、全てがＯＲＦ内であることが明らかになった。これは、そのＯＲＦがコスミドにより付与されたグリフォセートに対する抵抗性をコードすることを示す。この遺伝子をｇｒｇ１２と命名した。ｇｒｇ１２のＯＲＦを有するコスミドｐＡＸ１１０１は、２００５年４月４日にｔｈｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）に寄託され、受託番号Ｂ−３０８３３を割り当てられた。
（実施例１１）
他のタンパク質とのＧＲＧ１２の相同性
ＧＲＧ１２は、ＥＰＳＰシンターゼ酵素と相同性を有する。ＧＲＧ１２のアミノ酸配列（配列番号１０）と、他のＥＰＳＰシンターゼのアミノ酸配列とのアライメントを図１に示す。表３に様々なＥＰＳＰシンターゼとのＧＲＧ１２の同一率を挙げる。アミノ酸配列（配列番号１０）の調査により、それがクラスＩＩＥＰＳＰシンターゼ酵素に典型的な４つのドメインを有さないことが明らかとなった。したがって、ＧＲＧ１２は新規な、クラスＩＩではないグリフォセート抵抗性ＥＰＳＰシンターゼである。

ＧＲＧ１２は、ＷＯ２００５０１４８２０（配列番号５４）に記載されたＥＰＳＰＳと最高のアミノ酸相同性を有する。ＧＲＧ１２（配列番号１０）は、ＷＯ２００５０１４８２０に記載されたＥＰＳＰＳと９２％のアミノ酸同一性を有する。

表３．他のＥＰＳＰシンターゼとのＧＲＧ１２のアミノ酸同一性

ｇｒｇ１２のＤＮＡ配列（配列番号９）のさらなる解析から、配列番号９のヌクレオチド１４２のＧＴＧ開始コドンで始まる第２の短いオープンリーディングフレーム（配列番号５８）の存在が明らかとなった。このオープンリーディングフレームの翻訳の結果としてタンパク質（配列番号５９）が生じ、そのタンパク質は、配列番号１０に存在するバリンの代わりに配列番号５９の開始コドンがメチオニンである以外は、配列番号１０の残基３３〜４４４と同一である。公知のＥＰＳＰＳタンパク質との配列番号５９のアライメントにより、このタンパク質がＥＰＳＰＳとしての機能に重大であることが公知である全ての残基を有することが示された。したがって、このタンパク質は機能的なグリフォセート抵抗性ＥＰＳＰＳ酵素を含むと思われる一方で、高度に保存されたドメイン内部の開始コドンからの翻訳開始に起因するタンパク質は機能的ではなさそうに思われる。配列番号５９は、ＷＯ２００５０１４８２０に記載されたＥＰＳＰＳ（配列番号５４）と９７％同一である。

両方のオープンリーディングフレーム（配列番号５７および５８）が機能的ＥＰＳＰＳ活性をコードする能力は、ＰＣＲにより各オープンリーディングフレームを増幅すること、適切なプロモーターの制御下で結果として生じたＰＣＲ断片をプラスミドベクターにクローニングすること、当技術分野において公知のオープンリーディングフレームからのタンパク質発現を誘導すること、および発現したタンパク質が大腸菌におけるａｒｏＡ−表現型を相補し、グリフォセート抵抗性を付与する能力を比較することにより試験することができる。
（実施例１２）
大腸菌にＧＲＧ１２タンパク質を発現させるためのｇｒｇ１２の操作
ｇｒｇ１２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＰＣＲにより増幅し、やや変更したバージョンのプラスミドベクターｐＵＣ１８にクローニングし、大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した。ｐＵＣ１８への変更は次の通りであった：ストップコドンをｌａｃＺオープンリーディングフレームに挿入し、（挿入したｇｒｇ１２ＯＲＦの翻訳開始を最適化するための）リボソーム結合部位をＢａｍＨＩ制限部位上流に挿入した。プラスミドＤＮＡを調製し、ｇｒｇ１２挿入部の存在および方向を制限消化により決定した。ベクター中でｌａｃプロモーターに関して順方向にＯＲＦを有する一クローンをｐＡＸ１１０６と名付け、グリフォセートに対する抵抗性を付与できる能力について試験した。０から２００ｍＭグリフォセートを含有するＭ６３寒天プレート上に、ｐＡＸ１１０６または空のベクタープラスミドを有する大腸菌細胞を画線した。結果を下の表４に示す。これらの結果は、ｇｒｇ１２が高レベルのグリフォセートに対する抵抗性を付与することを実証している。

表４．Ｍ６３グリフォセート寒天上でのｐＡＸ１１０６の成長

（実施例１３）
大腸菌に６×Ｈｉｓタグ付きタンパク質として発現したＧＲＧ１２の精製
ＰＦＵＵＬＴＲＡ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用したＰＣＲによりｇｒｇ１２のコード領域を増幅する。ＰＣＲを刺激するために使用するオリゴヌクレオチドは、結果として生じるＰＣＲ産物の５’末端および３’末端近くに制限酵素認識部位を導入するように設計する。適切な制限酵素を用いて、結果として生じるＰＣＲ産物を消化し、消化産物を６×Ｈｉｓタグ発現ベクターｐＲＳＦ１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングする。結果として生じるクローンは、６×Ｈｉｓタグと同じ翻訳リーディングフレーム中に、そして６×Ｈｉｓタグに直接隣接するＣ末端にｇｒｇ１２を有する。当該クローンを作製するための、そして６×Ｈｉｓタグを有するタンパク質を発現させるための一般的な戦略は、当技術分野において十分に公知である。

ＧＲＧ１２タンパク質の発現レベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲル上で決定することができる。ＧＲＧ１２タンパク質は、例えばＮｉ−ＮＴＡＳｕｐｅｒｆｌｏｗＲｅｓｉｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の説明書通りに用いたクロマトグラフィーにより、誘導されたＧＲＧ１２タンパク質を精製することにより単離することができる。
（実施例１４）
ＡＴＸ４１５０の単離
ＡＴＸ４１５０は、唯一のリン源としてグリフォセートを含有する強化最少培地（ＥＭＭ）のプレートに土壌試料を蒔くことにより単離した。ＥＭＭは芳香族アミノ酸を含有しないことから、この培地上で生育するためには、株はグリフォセートに抵抗性でなければならない。

土壌２ｇを水約３０ｍｌに懸濁し、Ａｑｕａｓｏｎｉｃ超音波処理器の水浴中で３０秒間超音波処理した。この試料を５秒間ボルテックスし、６０秒間沈降させた。この工程を３回繰り返した。４ｍＭグリフォセート（ｐＨ６．０）を補充したＥＭＭ３ｍｌにこの懸濁液１００μｌを加えた。ＥＭＭは、（９００ｍｌあたり）スクロース１０ｇ、ＮａＮＯ_３２ｇ、０．８ＭＭｇＳＯ_４１．０ｍｌ、０．１ＭＣａＣｌ_２１．０ｍｌ、微量元素溶液１．０ｍｌ（１０００×溶液１００ｍｌ中にＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．１ｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．５ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３１．０ｍｇ、ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ１．０ｍｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ７．０ｍｇ、ＭｏＯ_３１．０ｍｇ、ＫＣｌ４．０ｇ）を含有する。培養物を組織培養用ローラードラムで２１℃で１６日間振盪し、次に１００μｌを使用して、唯一のリン源として４ｍＭグリフォセートを含有する新鮮ＥＭＭ３ｍｌに接種した。５日後に、１００μｌを使用して別の新鮮培養物３ｍｌに接種した。２、３日後に、唯一のリン源として５ｍＭグリフォセートを含有するＥＭＭ寒天が入った寒天プレート表面に１白金耳（１μｌ）を画線することにより、固形培地のプレートに培養物を蒔いた。２、３日後に、唯一のリン源として５ｍＭグリフォセートを有するＥＭＭのプレートに、単離するためにコロニーをもう一度蒔いた。高グリフォセート濃度の存在下で生育できる能力から、ＡＴＸ４１５０と呼ばれる特定の一株を選択した。
（実施例１５）
コスミドライブラリーの調製およびスクリーニング
当技術分野において一般に公知の方法を使用して、ＡＴＸ４１５０の培養物から総ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａ１で部分消化し、ＳｕｐｅｒＣｏｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベクター断片を製造業者の指示通りに用いて連結した。ＧｉｇａＰａｃｋＩＩＩＸＬパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して連結産物をファージ粒子にパッケージし、大腸菌ａｒｏＡ−細胞にトランスフェクトした。大腸菌ａｒｏＡ−は、ＥＰＳＰシンターゼをコードする天然ａｒｏＡ遺伝子が欠失した株である。この株は、外部から供給した芳香族アミノ酸を必要とするため、Ｍ６３培地上では生育できない。ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子を有するコスミドが存在すると、ＡｒｏＡ−表現型を遺伝的に相補でき、すなわちコスミドは外部から供給した芳香族アミノ酸なしにこの株をＭ６３培地上で生育させる。

１００ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、１５ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５０μＭＣａＣｌ_２、１μＭＦｅＳＯ_４、５０μＭＭｇＣｌ_２、５５ｍＭグルコース、２５ｍｇ／ｌＬ−プロリン、１０ｍｇ／ｌチアミンＨＣｌ、ｐＨを７．０に調整するために十分なＮａＯＨ、および１５ｇ／ｌ寒天を含有する、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＭ６３寒天培地のプレートに、トランスフェクトされた細胞を蒔いた。この培地上で生育した５つのコロニーを確認した。これらのコロニーのそれぞれからコスミドＤＮＡを調製し、大腸菌ａｒｏＡ−細胞にもう一度形質転換した。それぞれの場合で、コスミドＤＮＡを用いてもう一度形質転換した細胞は、０または１０ｍＭグリフォセート存在下でＭ６３培地上で生育したが、空のＳｕｐｅｒＣｏｓベクターを有する細胞は生育しなかった。これは、コスミドがａｒｏＡ−表現型を相補することができ、グリフォセートに対する抵抗性を付与することができることを確認している。さらに特徴付けるために、１つのコスミドを選択し、ｐＡＸ３０５と名付けた。
（実施例１６）
コスミドｐＡＸ３０５中のｇｒｇ１５の同定
コスミドｐＡＸ３０５により示されるグリフォセート抵抗性を担う遺伝子を同定するために、転移因子を用いてこのクローン由来のＤＮＡを突然変異誘発した。ＥＺ：：ＴＮＩｎｓｅｒｔｉｏｎＫｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、マディソン、ウィスコンシン州）および製造業者のプロトコールを使用したｉｎｖｉｔｒｏトランスポゾン突然変異誘発にコスミドｐＡＸ３０５を供した。ｐＡＸ３０５のトランスポゾン挿入クローンを大腸菌に形質転換し、グリフォセートを含有するＭ６３培地のプレートに蒔いた。グリフォセートの存在下で生育できる能力を失った多数のクローンが見出された。これは、トランスポゾンが、抵抗性を担う遺伝子を破壊したことを示している。

当技術分野において十分に公知の配列決定法を使用して、トランスポゾン挿入部を有するｐＡＸ３０５の領域についてＤＮＡ配列を決定し、それを配列番号６１に示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、配列番号６１のヌクレオチド塩基７７から１３５４）を同定した。グリフォセート抵抗性を失ったえり抜きの全部で８つのトランスポゾン挿入部からの配列データの解析は、全てがＯＲＦ内であることを明らかにした。これは、そのＯＲＦがコスミドにより付与されたグリフォセートに対する抵抗性をコードすることを示す。この遺伝子をｇｒｇ１５と命名した。ｇｒｇ１５のＯＲＦ（配列番号１１）を有するコスミドｐＡＸ３０５は、２００５年４月２０日にｔｈｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）に寄託され、受託番号ＮＲＲＬＢ−３０８３８を割り当てられた。
（実施例１７）
ＧＲＧ１５と他のタンパク質との相同性
ＧＲＧ１５はＥＰＳＰシンターゼ酵素に相同性を有する。ＧＲＧ１５のアミノ酸配列（配列番号１２）と、他のＥＰＳＰシンターゼのアミノ酸配列とのアライメントを図１に示す。表５に様々なＥＰＳＰシンターゼとのＧＲＧ１５の同一率を挙げる。アミノ酸配列（配列番号１２）の調査により、それがクラスＩＩＥＰＳＰシンターゼ酵素に典型的な４つのドメインを有さないことが明らかとなった。したがって、ＧＲＧ１５は新規な、クラスＩＩではないグリフォセート抵抗性ＥＰＳＰシンターゼである。

表５．他のＥＰＳＰシンターゼとのＧＲＧ１５のアミノ酸同一性

（実施例１８）
グリフォセート抵抗性非クラスＩＩ酵素（クラスＩＩＩ）間の相同性ブロック
ＧＲＧタンパク質（非クラスＩＩグリフォセート抵抗性タンパク質）のアミノ酸配列の比較は、ＧＲＧタンパク質が相互に有意な相同性を有し、以前に同定されたグリフォセート抵抗性ＥＰＳＰシンターゼとは別個であることを示している（図１参照）。
（実施例１９）
保存されたドメインの同定
７つの公知のＥＰＳＰシンターゼのアミノ酸配列を、クラスＩまたはクラスＩＩＥＰＳＰシンターゼのいずれにも存在しない保存されたドメインについて解析した。これらのＥＰＳＰシンターゼに次のドメインが見出される（太字はこのクラスの間だけに保存されている残基を表し、斜体字は全てのＥＰＳＰＳ酵素で保存されている残基を表す）。
ドメインＩ

（配列番号１３）（ここで、Ｘ_１はリシンまたはトレオニンを表し、Ｘ_２はアルギニンまたはヒスチジンを表し、Ｘ_３はセリンまたはトレオニンを表す）。
ドメインＩａ

（配列番号１４）（ここで、Ｘ_１はリシンまたはトレオニンを表す）。
ドメインＩｂ

（配列番号１５）（ここで、Ｘ_１はアルギニンまたはヒスチジンを表し、Ｘ_２はセリンまたはトレオニンを表す）。
ドメインＩｃ

（配列番号１６）。
ドメインＩＩ

（配列番号１７）（ここで、Ｘ_１はアスパラギン酸またはアラニンを表し、Ｘ_２はセリンまたはトレオニンを表し、Ｘ_３はバリンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_４はトレオニンまたはグルタミン酸またはリシンを表し、Ｘ_５はセリンまたはグリシンを表し、Ｘ_６はグルタミンまたはセリンまたはグルタミン酸またはトレオニンを表す）。
ドメインＩＩａ

（配列番号１８）（ここで、Ｘ_１はアスパラギン酸またはアラニンを表し、Ｘ_２はセリンまたはトレオニンを表し、Ｘ_３はバリンまたはイソロイシンを表す）。
ドメインＩＩｂ

（配列番号１９）（ここで、Ｘ_１はトレオニンまたはグルタミン酸またはリシンを表し、Ｘ_２はセリンまたはグリシンを表し、Ｘ_３はグルタミンまたはセリンまたはグルタミン酸またはトレオニンを表す）。
ドメインＩＩＩ

（配列番号２０）。
ドメインＩＶ

（配列番号２１）または

（ここで、Ｘ_１はグリシンまたはメチオニンまたはロイシンを表す）。
ドメインＶ

（配列番号２２）（ここで、Ｘ_１はトレオニンまたはセリンを表す）。
ドメインＶＩ

（配列番号２３）（ここで、Ｘ_１はアルギニンまたはリシンまたはロイシンを表し、Ｘ_２はイソロイシンまたはバリンを表す）。
ドメインＶＩＩ

（配列番号２４）（ここで、Ｘ_１はアルギニンまたはリシンを表し、Ｘ_２はアラニンまたはヒスチジンまたはグルタミン酸またはセリンを表し、Ｘ_３はプロリンまたはアラニンを表す）。
ドメインＶＩＩＩ

（配列番号２５）（ここで、Ｘ_１はアラニンまたはグリシンを表し、Ｘ_２はグルタミン酸またはグルタミンを表し、Ｘ_３はバリンまたはロイシンまたはアラニンを表す）。
ドメインＶＩＩＩａ

（配列番号２６）。
ドメインＩＸ

（配列番号２７）（ここで、Ｘ_１はイソロイシンまたはロイシンを表す）。
ドメインＸ

（配列番号２８）（ここで、Ｘ_１はトレオニンまたはセリンを表す）。
ドメインＸＩ

（配列番号２９）（ここで、Ｘ_１はグルタミンまたはリシンまたはセリンを表し、Ｘ_２はアスパラギンまたはヒスチジンを表し、Ｘ_３はメチオニンまたはロイシンを表し、Ｘ_４はプロリンまたはグルタミンを表し、Ｘ_５はトレオニンまたはグルタミン酸またはバリンを表し、Ｘ_６はバリンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_７はアスパラギン酸またはバリンを表し、Ｘ_８はロイシンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_９はロイシンまたはイソロイシンを表す）。
ドメインＸＩａ

（配列番号３０）（ここで、Ｘ_１はグルタミンまたはリシンまたはセリンを表し、Ｘ_２はアスパラギンまたはヒスチジンを表し、Ｘ_３はメチオニンまたはロイシンを表し、Ｘ_４はプロリンまたはグルタミンを表す）。
ドメインＸＩｂ

（配列番号３１）（ここで、Ｘ_１はトレオニンまたはグルタミン酸またはバリンを表し、Ｘ_２はバリンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_３はアスパラギン酸またはバリンを表し、Ｘ_４はロイシンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_５はロイシンまたはイソロイシンを表す）。
ドメインＸＩｃ

（配列番号３２）。
ドメインＸＩＩ

（配列番号３３）（ここで、Ｘ_１はバリンまたはトレオニンを表し、Ｘ_２はグルタミン酸またはグリシンを表し、Ｘ_３はロイシンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_４はアラニンまたはグルタミン酸を表し、Ｘ_５はイソロイシンまたはバリンを表す）。
ドメインＸＩＩａ

（配列番号３４）。
ドメインＸＩＩｂ

（配列番号３５）（ここで、Ｘ_１はバリンまたはトレオニンを表し、Ｘ_２はグルタミン酸またはグリシンを表し、Ｘ_３はロイシンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_４はアラニンまたはグルタミン酸を表し、Ｘ_５はイソロイシンまたはバリンを表す）。
ドメインＸＩＩｃ

（配列番号３６）。
ドメインＸＩＩＩ

（配列番号３７）（ここで、Ｘ_１はロイシンまたはイソロイシンを表し、Ｘ_２はバリンまたはイソロイシンを表す）。
ドメインＸＩＶ

（配列番号３８）（ここで、Ｘ_１はアスパラギン酸またはアスパラギンを表し、Ｘ_２はアラニンまたはセリンまたはトレオニンを表す）。
ドメインＸＶ

（配列番号３９）（ここで、Ｘ_１はロイシンまたはセリンまたはグルタミン酸を表し、Ｘ_２はトレオニンまたはセリンを表し、Ｘ_３はヒスチジンまたはフェニルアラニンを表し、Ｘ_４はアラニンまたはセリンを表す）。
ドメインＸＶＩ

（配列番号４０）（ここで、Ｘ_１はグリシンまたはアラニンを表し、Ｘ_２はイソロイシンまたはバリンを表し、Ｘ_３はセリンまたはグリシンまたはアラニンまたはリシンを表す）。
ドメインＸＶＩａ

（配列番号４１）（ここで、Ｘ_１はグリシンまたはアラニンを表す）。
ドメインＸＶＩｂ

（配列番号４２）（ここで、Ｘ_１はイソロイシンまたはバリンを表し、Ｘ_２はセリンまたはグリシンまたはアラニンまたはリシンを表す）。
ドメインＸＶＩＩ

（配列番号４３）（ここで、Ｘ_１はアスパラギンまたはアスパラギン酸を表し、Ｘ_２はアラニンまたはアスパラギン酸を表し、Ｘ_３はアラニンまたはグリシンを表す）。
ドメインＸＶＩＩＩ

（配列番号４４）（ここで、Ｘ_１はアラニンまたはセリンまたはプロリンを表す）。
（実施例２０）
植物形質転換のためのｇｒｇ１２の操作
完全長ｃＤＮＡテンプレートからＰＣＲによりｇｒｇ１２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅する。ＰＣＲの間にＯＲＦの各末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を付加する。そのうえ、この遺伝子の開始コドンの５’に直接、ヌクレオチド配列ＡＣＣを付加して、翻訳効率を増大させる（Ｋｏｚａｋ（１９８７年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１５巻：８１２５〜８１４８頁；Ｊｏｓｈｉ（１９８７年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１５巻：６６４３〜６６５３頁）。当技術分野において十分に公知の技法を使用してＰＣＲ産物をクローニングおよび配列決定し、ＰＣＲの間に突然変異が導入されていないことを確認する。

例えばＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ｇｒｇ１２のＰＣＲ産物を有するプラスミドを消化し、無傷のＯＲＦを有する断片を単離する。この実施例では、イネアクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙら（１９９１年）Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３１巻：１５０〜１６０頁）およびＰｉｎＩＩターミネーター（Ａｎら（１９８９年）ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ１巻：１１５〜１２２頁）を有する植物発現ベクターであるｐＡＸ２００などのプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ部位にこの断片をクローニングする。次に、この中間体プラスミドからのプロモーター−遺伝子−ターミネーター断片をｐＳＢ１１（ＪａｐａｎＴｏｂａｃｃｏ，Ｉｎｃ．）などのプラスミドにサブクローニングし、本明細書においてｐＳＢ１１ＧＲＧ１２と呼ぶ最終プラスミドを形成させる。プロモーター−ｇｒｇ１２−ターミネーター構築物を有するＤＮＡ断片を適切な制限酵素により切断できるようにｐＳＢ１１ＧＲＧ１２は構成されており、このプラスミドは例えばエアロゾルビーム入射による植物への形質転換にも使用される。ｐＳＢ１１ＧＲＧ１２の構造は、制限消化およびゲル電気泳動により、そして様々なクローニング接合部を経て配列決定することにより検証される。

当技術分野において十分に公知の３親交配（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌｍａｔｉｎｇ）手順を使用して、抗生物質を含有する培地の平板に蒔いて、プラスミドｐＳＢ１（ＪａｐａｎＴｏｂａｃｃｏ，Ｉｎｃ．）もまた有するアグロバクテリウムツメファシエンスＬＢＡ４４０４株にこのプラスミドを動員する。プラスミドｐＳＢ１１ＧＲＧ１２はスペクチノマイシン抵抗性を有するが、宿主範囲の狭いプラスミドであり、アグロバクテリウムでは複製することができない。ｐＳＢ１１ＧＲＧ１２が相同組換えにより広宿主範囲のプラスミドｐＳＢ１に組み込まれる場合に抗生物質抵抗性コロニーが生じる。結果として生じた共組み込み産物をサザンハイブリダイゼーションにより検証する。共組み込み体を有するアグロバクテリウム株は、例えばＰｕｒｅＩｎｔｒｏ法（ＪａｐａｎＴｏｂａｃｃｏ）によりトウモロコシを形質転換するために使用することができる。
（実施例２１）
植物細胞へのｇｒｇ１２の形質転換
受粉の８〜１２日後にトウモロコシの穂を最もよく採集する。穂から胚を単離する。形質転換に使用するためには大きさ０．８〜１．５ｍｍの胚が好ましい。ＤＮ６２Ａ５Ｓ培地（３．９８ｇ／ＬＮ６塩類、１ｍＬ／ＬＮ６ビタミン類（１０００×原液）、８００ｍｇ／ＬＬ−アスパラギン、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、１．４ｇ／ＬＬ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌカザミノ酸、５０ｇ／Ｌスクロース、１ｍＬ／Ｌ２，４−Ｄ（１ｍｇ／ｍＬ原液））などの適切なインキュベーション培地のプレート上に胚を胚盤側を上にして蒔く。しかし、ＤＮ６２Ａ５Ｓ以外の培地および塩類も当技術分野において公知である。暗条件で２５℃で一晩胚をインキュベートする。しかし、胚を一晩インキュベートすることは本質的に必要ない。

結果として生じた外植片を網目状の区画（プレート１枚あたり３０〜４０区画）に移し、約３０〜４５分間、浸透圧培地上に移し、次にビーム照射プレートに移す（例えばＰＣＴ公報ＷＯ／０１３８５１４および米国特許第５２４０８４２号を参照されたい）。

エアロゾルビーム加速器を使用して、本質的にＰＣＴ公報ＷＯ／０１３８５１４に記載された条件を使用して、植物細胞にＧＲＧ１２を発現するように設計されたＤＮＡ構築物を加速して、植物組織に入れる。ビーム照射後に、浸透圧培地上で胚を約３０分間インキュベートし、暗条件で２５℃で一晩インキュベーション培地上に置く。ビーム照射された外植片が過度に損傷することを避けるために、外植片を少なくとも２４時間インキュベートしてから回復培地に移す。すると、胚は暗条件で２５℃で５日間、回復期培地上で伸展するので、次にこれを選択培地に移す。利用する特定の選択の性質および特徴に応じて、外植片を選択培地中で最長８週間インキュベートする。選択期の後に、成熟体細胞胚の形成が観察されるまで、結果として生じたカルスを胚成熟培地に移す。次に、結果として生じた成熟体細胞胚を微光下に置き、当技術分野において公知の方法により再生過程を開始する。結果として生じたシュートを発根培地上で発根させ、結果として生じた植物を育苗ポットに移植し、トランスジェニック植物として繁殖させる。

（材料）
表６．ＤＮ６２Ａ５Ｓ培地

溶液のｐＨを１ＮＫＯＨ／１ＮＫＣｌでｐＨ５．８に調整し、ゲルライト（Ｓｉｇｍａ）を最高３ｇ／Ｌの濃度まで添加し、培地をオートクレーブ処理する。５０℃に冷却後に、５ｍｇ／ｍｌ硝酸銀原液（ＰｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬａｂｓ）を２ｍｌ／Ｌで添加する。
（実施例２２）
アグロバクテリウム介在性形質転換によるトウモロコシ植物細胞へのｇｒｇ１２の形質転換
受粉の８〜１２日後にトウモロコシの穂を最もよく採集する。穂から胚を単離する。形質転換に使用するためには大きさ０．８〜１．５ｍｍの胚が好ましい。適切なインキュベーション培地のプレート上に胚を胚盤側を上にして蒔き、暗条件で２５℃で一晩インキュベートする。しかし、胚を一晩インキュベートすることは本質的に必要ではない。Ｔｉプラスミド介在導入を約５〜１０分間行うために、適切なベクターを有するアグロバクテリウム株と胚を接触させ、次に同時培養培地のプレート上にその胚を約３日間蒔く（２５℃暗条件）。同時培養後に、外植片を回復期培地に約５日間（２５℃暗条件）移す。利用する特定の選択の性質および特徴に応じて、外植片を選択培地中で最長８週間インキュベートする。選択期の後に、結果として生じたカルスを、成熟体細胞胚の形成が観察されるまで胚成熟培地に移す。次に、結果として生じた成熟体細胞胚を微光下に置き、当技術分野において公知の再生過程を開始させる。結果として生じたシュートを発根培地上で発根させ、結果として生じた植物を育苗ポットに移植し、トランスジェニック植物として繁殖させる。

本明細書に言及する全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野の技術者の熟練度を示すものである。全ての刊行物および特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれていると示されたかの如く、それと同程度に参照により本明細書に組み込まれている。

理解を明確にするための例証および例として、上述の発明を幾分詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲の範囲内で、ある種の変化および変更を実施できることは明らかであろう。

図１は、ＥＰＳＰシンターゼのアミノ酸配列のアライメントを示す。基質の結合およびＥＰＳＰＳ活性に重要であると確認された保存された残基を四角で囲む。この囲みは、クラスＩＩＩドメインのアミノ酸位置を表す。囲み上部のローマ数字はクラスＩＩＩドメインに対応する。図１は、ＥＰＳＰシンターゼのアミノ酸配列のアライメントを示す。基質の結合およびＥＰＳＰＳ活性に重要であると確認された保存された残基を四角で囲む。この囲みは、クラスＩＩＩドメインのアミノ酸位置を表す。囲み上部のローマ数字はクラスＩＩＩドメインに対応する。

Claims

グリフォセート耐性５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素をコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下：
ａ）配列番号９、１１、５５、５７、５８、もしくは６０のヌクレオチド配列、またはその相補体、
ｂ）配列番号９、１１、５７、５８、もしくは６０のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体、
ｃ）受託番号Ｂ−３０８３３もしくは受託番号Ｂ−３０８３８として寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物の除草剤抵抗性ヌクレオチド配列またはその相補体であって、該受託番号Ｂ−３０８３３として寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列は配列番号５７であり、該受託番号Ｂ−３０８３８として寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列は配列番号１１である、ヌクレオチド配列またはその相補体、
ｄ）配列番号１０、１２、５６、または５９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および
ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、または、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、ポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、植物細胞における該ポリヌクレオチドの発現を指向させ得るプロモーターに連結している、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、植物細胞において機能するプロモーターに連結しており、コードされるＥＰＳＰＳ酵素の十分な発現を可能にするＲＮＡ配列の産生を引き起こし、前記ポリヌクレオチドを用いて形質転換された植物細胞のグリフォセート耐性を高める、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
植物細胞において前記ＲＮＡ配列の３’末端へのひと続きのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を引き起こすように機能する３’非翻訳領域をさらに含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
前記プロモーターが、前記ポリヌクレオチドに対して異種である、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
アミノ末端クロロプラスト輸送ペプチドおよび前記ＥＰＳＰＳ酵素を含む融合ポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
ａ）植物細胞のゲノムに、
ｉ）植物細胞においてＲＮＡ配列の産生を引き起こすように機能するプロモーター、
ｉｉ）グリフォセート耐性５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素をコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下：
１）配列番号９、１１、５５、５７、５８、もしくは６０のヌクレオチド配列、またはその相補体、
２）配列番号９、１１、５７、５８、もしくは６０のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体、
３）受託番号Ｂ−３０８３３もしくは受託番号Ｂ−３０８３８として寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物の除草剤抵抗性ヌクレオチド配列またはその相補体であって、該受託番号Ｂ−３０８３３として寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列は配列番号５７であり、該受託番号Ｂ−３０８３８として寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列は配列番号１１である、ヌクレオチド配列またはその相補体、
４）配列番号１０、１２、５６、または５９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および
５）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、または、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、ポリヌクレオチド、および
ｉｉｉ）植物細胞において前記ＲＮＡ配列の３’末端へのひと続きのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を引き起こすように機能する３’非翻訳ポリヌクレオチド
を含むポリヌクレオチドを挿入する工程と、
ｂ）形質転換された植物細胞を得る工程と、
ｃ）前記形質転換された植物細胞から、グリフォセート除草剤に対して増大した耐性を有する遺伝的に形質転換された植物を再生する工程と
を含む、グリフォセート除草剤に対して耐性を有する、遺伝的に形質転換された植物を作出する方法。
前記形質転換された植物を得る工程が、グリフォセート除草剤に対する耐性の増強についてスクリーニングすることを含む、請求項７に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが、アミノ末端クロロプラスト輸送ペプチドおよびＥＰＳＰＳ酵素を含む融合ポリペプチドをコードする、請求項７に記載の方法。
請求項１に記載の異種ポリヌクレオチドを含む、グリフォセート耐性植物細胞。
トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、ワタ、サトウダイコン、ナタネ、カノーラ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウ、レンズマメ、ブドウ、およびシバクサからなる群から選択される、請求項１０に記載のグリフォセート耐性植物細胞。
請求項１０に記載の植物細胞を有するグリフォセート耐性植物。
請求項１２に記載の植物の形質転換された種子。
トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、ワタ、サトウダイコン、ナタネ、カノーラ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウ、レンズマメ、ブドウ、およびシバクサからなる群から選択される、請求項１２に記載のグリフォセート耐性植物。
ａ）配列番号１０、１２、５６、または５９のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号９、１１、５５、５７、５８、または６０のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド；
ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、または、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであって、除草剤抵抗活性を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号９、１１、５７、５８、または６０のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドであって、除草剤抵抗活性を有するポリペプチド；および
ｅ）受託番号Ｂ−３０８３３または受託番号Ｂ−３０８３８として寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物の除草剤抵抗性ヌクレオチド配列またはその相補体によりコードされるポリペプチドであって、該受託番号Ｂ−３０８３３として寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列は配列番号５７であり、該受託番号Ｂ−３０８３８として寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列は配列番号１１である、ポリペプチド
からなる群から選択される、ポリペプチド。
異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
植物種子または植物を有する圃場での雑草を選択的に制御する方法であって、
ａ）ｉ）植物細胞においてＲＮＡ配列の産生を引き起こすように機能するプロモーター、
ｉｉ）グリフォセート耐性５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素をコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下：
１）配列番号９、１１、５５、５７、５８、もしくは６０のヌクレオチド配列、またはその相補体、
２）配列番号９、１１、５７、５８、もしくは６０のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体、
３）受託番号Ｂ−３０８３３もしくは受託番号Ｂ−３０８３８として寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物の除草剤抵抗性ヌクレオチド配列またはその相補体であって、該受託番号Ｂ−３０８３３として寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列は配列番号５７であり、該受託番号Ｂ−３０８３８として寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列は配列番号１１である、ヌクレオチド配列またはその相補体、
４）配列番号１０、１２、５６、または５９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および
５）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、または、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、ポリヌクレオチド、および
ｉｉｉ）植物細胞において前記ＲＮＡ配列の３’末端にひと続きのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を引き起こすように機能する３’非翻訳ポリヌクレオチド
を有する異種ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれている、グリフォセート耐性の前記種子または植物を定植する工程ならびに、
ｂ）前記植物に有意に影響を与えずに、前記雑草を制御するために十分な量のグリフォセート除草剤を、前記圃場の前記植物および前記雑草に適用する工程
を含む方法。
前記植物または植物種子が作物植物を含む、請求項１７に記載の方法。
前記プロモーターが、前記ポリヌクレオチドに対して異種であり、前記ポリヌクレオチドを用いて形質転換された植物のグリフォセート耐性を高めるために前記ＥＰＳＰＳ酵素の十分な発現を引き起こすように適合されている、請求項１７に記載の方法。
ａ）植物細胞のゲノムに請求項１に記載のポリヌクレオチドを挿入する工程、
ｂ）形質転換された植物細胞を得る工程、および
ｃ）前記形質転換された植物細胞から、グリフォセート除草剤に対して増大した耐性を有する、遺伝的に形質転換された植物を再生する工程
を含む、グリフォセート除草剤に対して耐性を有する、遺伝的に形質転換された植物を作出する方法。
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物を用いて植物細胞を形質転換すること、および形質転換された植物を再生することを含む、グリフォセートに耐性の、遺伝的に形質転換された植物を作出する方法。
前記ＤＮＡ構築物が、植物細胞において機能するプロモーターをさらに含み、コードされるＥＰＳＰＳ酵素の十分な発現を可能にするＲＮＡ配列の産生を引き起こし、前記ポリヌクレオチドを用いて形質転換された植物細胞のグリフォセート耐性を高める、請求項２１に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが、アミノ末端クロロプラスト輸送ペプチドおよびＥＰＳＰＳ酵素を含む融合ポリペプチドをコードする、請求項２１に記載の方法。
配列番号９、１１、５５、５７、５８、および６０からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、グリフォセート耐性植物細胞。
トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、ワタ、サトウダイコン、ナタネ、カノーラ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウ、レンズマメ、ブドウ、およびシバクサからなる群から選択される、請求項２４に記載のグリフォセート耐性植物細胞。
請求項２４に記載の植物細胞を含むグリフォセート耐性植物。
トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、ワタ、サトウダイコン、ナタネ、カノーラ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウ、レンズマメ、ブドウ、およびシバクサからなる群から選択される、請求項２６に記載のグリフォセート耐性植物。
請求項２６に記載の植物の形質転換された種子。
定植された種子または植物を有する圃場における雑草を選択的に制御する方法であって、
ａ）請求項２６に記載の植物、またはそれから得られた形質転換された種子を定植する工程、および
ｂ）前記植物に有意に影響を与えずに、前記雑草を制御するために十分量のグリフォセート除草剤を、前記圃場の前記植物および雑草に適用する工程
を含む方法。
前記植物または植物種子が作物植物を含む、請求項２９に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが、アミノ末端クロロプラスト輸送ペプチドおよびＥＰＳＰＳ酵素を含む融合ポリペプチドをコードする、請求項２９に記載の方法。