MX2007012462A

MX2007012462A - Identificacion de una nueva clase de cintasas epsp.

Info

Publication number: MX2007012462A
Application number: MX2007012462A
Authority: MX
Inventors: Nadine Carozzi; Philip E Hammer
Original assignee: Athenix Corp
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2006-04-07
Publication date: 2007-11-07
Also published as: BRPI0608940A2; AR053049A1; CN101175850B; CN101175850A; JP4879969B2; AU2006235263A1; US20100144529A1; CA2603465C; NZ563000A; US20100144530A1; US20060253921A1; EP1871875A2; AU2006235263B2; US7700842B2; WO2006110586A3; JP2008535495A; CA2603465A1; WO2006110586A2; EP2295548A1

Abstract

Se proporcionan composiciones y metodos para conferir tolerancia al glifosato en las bacterias, plantas, celulas de plantas, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen una clase novedosa de enzimas EPSPS, designadas Clase III y polinucleotidos que codifican dichas enzimas vectores que comprenden aquellos polinucleotidos y celulas huesped que comprenden los vectores. Las proteinas novedosas comprenden al menos un dominio de secuencia seleccionado de los dominios de Clase HI proporcionados en este documento. Estos dominios de secuencia pueden usarse para identificar la sintasas EPSP con la actividad resistente al glifosato.

Description

IDENTIFICACIÓN DE UNA NUEVA CLASE DE SINTASAS EPSP CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la biología molecular de plantas, particularmente a una clase novedosa de sintasas EPSP que confieren resistencia al g fosato herbicida ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La N-fosfonometiIglicina, comunmente referida como g fosato, es un químico agronómico importante El ghfosato inhibe la enzima que convierte el ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y el ácido 3-fosfoshiquímico (S3P) a ácido 5-enolp?ruv?l-3-fosfosh?quím?co La inhibición de esta enzima smtasa (5-enolp?ruv?lsh?qu?mato-3-fosfato, referida en este documento como "sintasa EPSP", o "EPSPS") elimina las células de las plantas mediante cerrar la ruta del shiquimato, por lo tato inhibe la biosíntesis del aminoácido aromático Dado que los herbicidas de clase glifosato inhiben la biosintesis del aminoácido aromático, ellos no solamente eliminan las células de las plantas, sino también las células bacteriales a tóxicas El glifosato inhibe muchas sintasas EPSP bacteriales y además es tóxico para estas bacterias Sin embargo, ciertas sintasas EPSP bacteriales tienen una alta tolerancia al ghfosato Las células de las plantas resistentes a la toxicidad del ghfosato pueden producirse mediante la transformación de las células de las plantas para expresar las sintasas EPSP bacteriales resistentes al glifosato Notablemente, el gen bacterial de la hebra CP4 Agrobacterium tumefaciens se ha usado para conferir resistencia herbicida en las células de plantas después de la expresión en las plantas Una smtasa EPSP mutada de la hebra CT7 Salmonella typhimunum confiere resistencia al glifosato en las células bacteriales y confiere resistencia al glifosato en las células de las plantas (Patentes Estadounidenses Nos 4, 535,060, 4, 769,061 y 5, 094,945) La sintasa EPSP (MR 46,000) se duplica en dos dominios similares, cada uno comprendiendo tres copias de una unidad de duplicación ßaßaßß (Stallings et al. (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 885046-5050). Lys-22, Arg-124, Asp-313, Arg-344, Arg-386 y Lys-411 son residuos conservados de la sintasa EPSP de E. coli (Schónbrunn et al. (2001 ) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 5 98:1376-1380). Los residuos conservados importantes para la actividad EPSPS también incluyen Arg-100, Asp-242 y Asp-384 (Selvapandiyan ef al. (1995) FEBS Letters 374:253-256). El Arg-27 se une al S3P (Shuttleworth ef al. (1999) Biochemistry 38:296-302). Las variantes de la enzima EPSPS tipo natural se han aislado, las cuales son tolerantes al glifosato como un resultado de alteraciones en la secuencia de codificación del aminoácido EPSPS (Kishore y Shah (1988) Ann?. 10 Rev. Biochem. 57:627-63; Wang ef al. (2003) J. Plant Res. 116:455-60; Escherburg ef al (2002) Planta 216:129-35). He ef al. (2001 , Biochim et Biophysica Acta 1568:1-6) han desarrollado sintasas EPSP con tolerancia al glifosato incrementadas mediante la mutagénesis y la recombinación entre los genes de E. coli y la Salmonella Typhimurium EPSPS y sugiere que las mutaciones en la posición 42 (T42M) y la posición 230 (Q230K) son comúnmente responsables de 15 la resistencia observada. El trabajo subsecuente (He et al (2003) Biosci. Biotech. Brochem. 67:1405-1409) muestran que la mutación T42M (treonina a metionina) es suficiente para mejorar la tolerancia de ambas enzimas de E. coli y Salmonella typhimurium.

Debido a las muchas ventajas que proporcionan las plantas resistentes a herbicidas, son 20 deseables los métodos para identificar los genes con resistencia a los herbicidas con actividad resistente al glifosato.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para conferir la tolerancia al glifosato en las 25 bacterias, plantas, células de plantas, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen una clase novedosa de enzimas EPSPS, Clase lll designadas y los polinucleótidos que codifican dichas enzimas, vectores que comprenden aquellos polinucleótidos y las células huésped comprenden los vectores Las proteínas novedosas comprenden al menos un dominio de secuencia seleccionado de los dominios siguientes (dominios Clase lll) Dominio I 5 L-A-K-G-X^S-Xz-L-Xa-G-A-L-K-S-D-D-T (SEC ID NO 13) en donde X denota sina o treonina, en donde X2 denota arginina o histidina, en donde X3 denota serina o treonma, Dominio la L-A-K-G-X1 t (SEC ID NO 14), en donde X, denota hsina o treonina, Dominio Ib 10 S-X?-L-X2 (SEC ID NO 15), en donde X^ denota arginina o histidina, en donde X2 denota sepna o treonina, Dominio le G-A-L-K-S-D-D-T (SEC ID NO 16), Dominio II 15 E-P-D-X1-X2-T-F-X3-V-X4-X5-X6-G (SEC ID NO 17), en donde Xi denota ácido aspártico o alanina, en donde X2 denota sepna o treonina, en donde X3 denota valina o isoleucina, en donde X4 denota treonina o acido glutamico o lisina, en donde X5 denota serina o glicina, en donde X6 denota glutamina o sepna o acido glutámico o treonina, Dominio lla 20 E-P-D-Xi-Xj-T-F-Xa-V (SEC ID NO 18), en donde X, denota ácido aspártico o alanina, en donde X2 denota sepna o treonina, en donde X3 denota valina o isoleucina, Dominio llb X^-Xr-Xs-G (SEC ID NO 19), en donde X^ denota treonina o ácido glutámico o lisina, en donde X2 denota serina o glicina, en donde X3 denota glutamina o serina o ácido glutámico o treonina, 25 Dominio lll RFLTAA (SEC ID NO 20), Dominio IV KRPI(G/M)P (SEC ID NO 21 ) K-R-P-l-X P, en donde X-, denota glicina o metionina o leucina; Dominio V: X G-C-P-P-V (SEC ID NO:22), en donde X, denota treonina o serina; Dominio VI: l-G-A-XrG-YJ^-D-L-T (SEC ID NO:23), en donde X, denota arginina o lisina o leucina y en donde X2 denota isoleucina o valina; Dominio Vil: W-X1-V-X2-X3-T-G (SEC ID NO:24), en donde X1 denota arginina o lisina, en donde X2 denota alanina o histidina o ácido glutámico o serina, en donde X2 denota prolina o alanina; Dominio VIII: E-P-D-A-S-A-A-T-Y-L-W-X1-A-X2-X3-L (SEC ID NO:25), en donde X1 denota alanina o glicina, en donde X2 denota ácido glutámico o glutamina, en donde X3 denota valina o leucina o alanina; Dominio Villa: E-P-D-A-S-A-A-T-Y-L-W (SEC ID NO:26); Dominio IX: l-D-X G (SEC ID NO:27), en donde X denota isoleucina o leucina; Dominio X: F-XrQ-P-D-A-K-A (SEC ID NO:28), en donde X, denota treonina o serina; Dominio XI: XÍ-F-P-X2-X3-X4-A-X5-X6-X7-G-S-Q-M-Q-D-A-I-P-T-X8-A-V-X9A-A-F- (SEC ID NO:29), en donde X, denota glutamina o lisina o serina, en donde X2 denota asparagina o histidina, en donde X3 denota metionina o leucina, en donde X4 denota prolina o glutamina, en donde X5 denota treonina o ácido glutámico o valina, en donde X6 denota valina o isoleucina, en donde X7 denota ácido aspártico o valina, en donde X8 denota leucina o isoleucina, en donde X9 denota leucina o isoleucina; Dominio Xla: XrF-P-X2-X3-X4-A (SEC ID NO:30), en donde X-\ denota glutamina o lisina o serina, en donde X2 denota asparagina o histidina, en donde X3 denota metionina o leucina, en donde X4 denota prolina o glutamina; Dominio Xlb X X2-X3-G-S-Q-M-Q-D-A-l-P-T-X4-A-V-X5-A-A-F-N (SEC ID NO 31 ), en donde X, denota treonma o ácido glutámico o vahna, en donde X2 denota valina o isoleucina, en donde X3 denota acido aspártico o valma, en donde X4 denota leucma o isoleucina, en donde X5 denota leucina o isoleucina, Dominio XIc G-S-Q-M-Q-D-A-l-P-T (SEC ID NO 32), Dominio XII P-V-R-F-XÍ-X2-X3-X4-N-L-R-V-K-E-C-D-R-X5 (SEC ID NO 33), en donde X, denota valina o treonma, en donde X2 denota ácido glutámico o glicina, en donde X3 denota leucma o isoleucina, en donde X4 denota alanma o ácido glutámico, en donde X5 denota isoleucina o vahna, Dominio Xlla P-V-R-F (SEC ID NO 34), Dominio Xllb XrXz-XsJ -N-L-R-V-K-E-C-D-R-Xs (SEC ID NO 35), en donde X, denota valina o treonma, en donde X2 denota ácido glutámico o glicina, en donde X3 denota leucma o isoleucina, en donde X4 denota alanma o ácido glutámico, en donde X5 denota isoleucina o valma, Dominio Xllc N-L-R-V-K-E-C-D-R (SEC ID NO 36), Dominio Xlll E-G-D-D-L-X!-X2 (SEC ID NO 37), en donde X, denota leucina o isoleucina, en donde X2 denota va na o isoleucina, Dominio XIV Xi-P-X?-L-A-G (SEC ID NO 38), en donde X denota ácido aspártico o asparagina, en donde X2 denota alanina o sepna o treonina, Dominio XV A-X.-I-D-X2-X3-X4-D-H-R (SEC ID NO:39), en donde Xi denota leucina o serina o ácido glutámico, en donde X2 denota treonina o serina, en donde X3 denota histidina o fenilalanina, en donde X4 denota alanina o serina; Dominio XVI: F-A-L-A-X1-L-K-X2-X3-G-I (SEC ID NO:40), en donde X1 denota glicina o alanina, en donde X2 denota isoleucina o valina, en donde X3 denota serina o glicina o alanina o lisina; Dominio XVIa: F-A-L-A-XrL-K (SEC ID NO:41), en donde Xi denota glicina o alanina; Dominio XVIb: L-K-X1-X2-G-I (SEC ID NO:42), en donde X1 denota isoleucina o valina, en donde X2 denota serina o glicina y Dominio XVlll: -X1-P-X2-C-V-X3- (SEC ID NO:43), en donde X1 denota asparagina o ácido aspártico, en donde X2 denota alanina o ácido aspártico, en donde X3 denota alanina o glicina. Dominio XVlll: Xi-S-L-G-V (SEC ID NO:44), en donde X1 denota alanina o serina o prolina.

Los dominios anteriores establecidos en las SEC ID NOS:13-14 se identificaron mediante la alineación de las secuencias Clase lll que comparten al menos 50% de la identidad de secuencia. La presencia de al menos uno de estos dominios de secuencia es predictiva de la actividad con resistencia al glifosato.

Se proporcionan las moléculas de ácido nucleico aisladas correspondientes a las secuencias de ácido nucleico que confieren resistencia a los herbicidas. Adicionalmente, se contemplan las secuencias de aminoácidos correspondientes a los polinucleótidos. En particular, la presente invención proporciona las moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un dominio de Clase lll, ¡ncluyendo la secuencia de nucleótidos establecida en las SEC ID NOS:9, 11 , 55, 57 y 58, una secuencia de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No:10, 12, 56 y 59, la secuencia de nucleótidos resistente al herbicida depositada en un huésped bacterial como los Nos. de acceso B-30833 y B-30838, así como las variantes y fragmentos de las mismas. Las secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de nucleótidos de la invención o que hibridan una secuencia de la invención también se contemplan. La secuencia encuentra uso en la construcción de los vectores de expresión para la transformación subsecuente en las plantas de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes resistentes al glifosato, como marcadores selectivos y los similares.

Las composiciones también incluyen anticuerpos para los polipéptidos así como polinucleótidos sintéticos que codifican los polipéptidos resistentes a los herbicidas. Las secuencias de codificación pueden usarse en las construcciones de ADN o los casetes de expresión para la transformación y expresión en organismos, incluyendo los microorganismos y las plantas. Las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células de plantas, tejidos y semillas transformadas que son tolerantes al glifosato mediante la introducción de las composiciones de la invención en el genoma del organismo. En donde el organismo es una planta, la introducción de la secuencia permite el glifosato que contiene herbicidas para aplicarse a la cosecha para matar selectivamente las malas hierbas sensibles al glifosato pero no el organismo transformado.

Los métodos para identificar una sintasa EPSP con actividad resistente al glifosato se proporcionan adicionalmente. Los métodos comprenden obtener una secuencia de aminoácidos para una sintasa EPSP e identificar si la secuencia de aminoácido comprende al menos un dominio de secuencia de la invención.

Las sintasas EPSP descritas en este documento representan una nueva clase de enzimas EPSPS, referidas en este documento como enzimas EPSPS Clase lll.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una alineación de las secuencias de aminoácido de la sintasa EPSP.

Los residuos conservados que se han identificado como importantes para el enlace del sustrato y para la actividad EPSPS se colocan en un recuadro. Los recuadros delinean las ubicaciones de aminoácidos de los dominios Clase lll. Los números romanos arriba de los recuadros corresponden a los dominios de la Clase lll.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se infiere a proporcionar composiciones y métodos para conferir tolerancia a los herbicidas, particularmente tolerancia al glifosato en los organismos. Los métodos involucran la transformación de organismos con secuencias de nucleótidos que codifican un gen de tolerancia al glifosato de Clase lll de la invención. En particular, la presente invención reconoce una clase de enzimas que confieren tolerancia al glifosato y secuencias de nucleótidos que codifican dichas enzimas. Las secuencias encuentran uso en la preparación de plantas que muestran tolerancia incrementada para el glifosato herbicida. Además, se proporcionan la bacteria transformada, las plantas, las células de plantas, los tejidos de las plantas y las semillas.

Las enzimas de Clase lll se caracterizan por tener al menos un dominio seleccionado de los dominios listados postepormente, en este documento referidos como dominios de Clase lll: Dominio I: L-A-K-G-X?-S-X2-L-X3-G-A-L-K-S-D-D-T (SEC ID NO: 13), en donde Xi denota lisina o treonina, en donde X2 denota arginina o histidina, en donde X3 denota serina o treonina; Dominio la: L-A-K-G-X?, (SEC ID NO:14), en donde X, denota lisina o treonina; Dominio Ib: S-X L-X2 (SEC ID NO:15), en donde Xi denota arginina o histidina, en donde X2 denota serina o treonina; Dominio le: G-A-L-K-S-D-D-T (SEC ID N0:16); Dominio II: E-P-D-X?-X2-T-F-X3-V-X4-X5-X6-G (SEC ID NO: 17), en donde X, denota ácido aspártico o alanina, en donde X2 denota serina o treonina, en donde X3 denota valina o isoleucina, en donde X6 denota glutamina o serina o ácido glutámico o treonina; Dominio lla: E-P-D-XrX?-T-F-Xs-V (SEC ID NO: 18), en donde X? denota ácido aspártico o alanina, en donde X2 denota serina o treonina, en donde X3 denota valina o isoleucina; Dominio llb: XrX2-X3-G (SEC ID NO:19), en donde X, denota treonina o ácido glutámico o lisina; en donde X2 denota serina o glicina, en donde X3 denota glutamina o serina o ácido glutámico o treonina; Dominio lll: RFLTAA (SEC ID NO:20); Dominio IV: KRPI(G/M)P (SEC ID NO:21 ) K-R-P-l-XrP, en donde Xi denota glicina o metionina o leucina; Dominio V: Xi-G-C-P-P-V (SEC ID NO:22), en donde X, denota treonina o serina; Dominio VI: l-G-A-X G-Y-X2-D-L-T (SEC ID NO:23), en donde Xi denota arginina o lisina o leucina y en donde X2 denota isoleucina o valina; Dominio Vil: W-X?-V-X2-X3-T-G (SEC ID NO:24), en donde X, denota arginina o lisina, en donde X2 denota alanina o histidina o ácido glutámico o serina, en donde X3 denota prolina o alanina; Dominio VIII: E-P-D-A-D-A-A-T-Y-L-W-X A-X2-X3-L (SEC ID NO:25), en donde X denota alanina o glicina, en donde X2 denota ácido glutámico o glutamina, en donde X3 denota valina o leucina o alanina; Dominio Villa: E-P-D-A-S-A-A-T-Y-L-W (SEC ID NO:26); Dominio IX: l-D-X G (SEC ID NO:27), en donde Xi denota isoleucina o leucina; Dominio X: F-Xi-Q-P-D-A-K-A (SEC ID NO:28), en donde Xi denota treonina o serina; Dominio XI: X?-F-P-X2-X3-X4-A-X5-X6-X7-G-S-Q-M-Q-D-A-I-P-T-X8-A-V-X9-A-A-F-N (SEC ID NO:29), en donde Xi denota glutamina o lisina o serina, en donde X2 denota asparagina o histidina, en donde X3 denota metionina o leucina, en donde X4 denota prolina o glutamina, en donde X5 denota treonina o ácido glutámico o valina, en donde X6 denota valina o isoleucina, en donde X7 denota ácido aspártico o valina, en donde X8 denota leucina o isoleucina, en donde X9 denota leucina o isoleucina; Dominio Xla: X?-F-P-X2-X3-X4-A (SEC ID NO:30), en donde Xi denota glutamina o lisina o serina, en donde X2 denota asparagina o histidina, en donde X3 denota metionina o leucina, en donde X4 denota prolina o glutamina; Dominio Xlb: Xi-Xz-Xs-G-S-Q-M-Q-D-A-I-P-T^-A-V-Xj-A-A-F-N (SEC ID NO:31 ), en donde X denota treonina o ácido glutámico o valina, en donde X2 denota valina o isoleucina, en donde X3 denota ácido aspártico o valina, en donde X4 denota leucina o isoleucina, en donde X5 denota leucina o isoleucina; Dominio XIc: G-S-Q-M-Q-D-A-l-P-T (SEC ID NO:32); Dominio XII: P-V-R-F-X Xz-XaJ -NJ-R-V-K-E-C-D-R-Xj (SEC ID NO:33), en donde X, denota valina o treonina, en donde X2 denota ácido glutámico o glicina, en donde X3 denota leucina o isoleucina, en donde X4 denota alanina o ácido glutámico, en donde X5 denota isoleucina o valina; Dominio Xlla: P-V-R-F (SEC ID NO:34); Dominio Xllb: XrX2-X3-X4-N-L-R-V-K-E-C-D-R-X5 (SEC ID NO:35), en donde X, denota valina o treonina, en donde X2 denota ácido glutámico o glicina, en donde X3 denota leucina o isoleucina, en donde X denota alanina o ácido glutámico, en donde X5 denota isoleucina o valina; Dominio Xllc: N-L-R-V-K-E-C-D-R (SEC ID NO:36); Dominio Xlll: E-G-D-D-L-X X2 (SEC ID NO:37), en donde X, denota leucina o isoleucina, en donde X2 denota valina o isoleucina; Dominio XIV: X P-X?-L-A-G (SEC ID NO:38), en donde X^ denota ácido aspártico o asparagina, en donde X2 denota alanina o serina o treonina; Dominio XV: A-X \-D-X2-X3-XA-D-H-R (SEC ID NO:39), en donde X, denota leucina o serina o ácido glutámico, en donde X2 denota treonina o serina, en donde X3 denota histidina o fenilalanina, en donde X4 denota alanina o serina; Dominio XVI: F-A-L-A-X L-K-X2-X3-G-l (SEC ID NO:40), en donde X^ denota glicina o alanina, en donde X2 denota isoleucina o valina, en donde X3 denota serína o glicina o alanina o lisina; Dominio XVIa: F-A-L-A-X,-L-K (SEC ID NO:41 ), en donde X denota glicina o alanina; Dominio XVIb: L-K-XrX2-G-l (SEC ID NO:42), en donde Xi denota isoleucina o valina, en donde X2 denota serina o glicina o alanina o lisina y Dominio XVII: -X P-X2-C-V-X3-K (SEC ID NO:43), en donde X, denota asparagina o ácido aspártico, en donde X2 denota alanina o ácido aspártico, en donde X3 denota alanina o glicina.

Dominio XVlll: XrS-L-G-V (SEC ID NO:44), en donde X^ denota alanina o serina o prolina.

Los dominios anteriores establecidos en las SEC ID NOS: 13-44 se identificaron por la alineación de las secuencias de la Clase lll que comparten al menos 50% de la identidad de secuencia. En algunas modalidades al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ó 32 de estos dominios de secuencias están presentes.

Usando los métodos de la invención y los dominios identificados, pueden identificarse las proteínas adicionales (por ejemplo SEC ID NOS:2, 4, 46 y 48) que confieren la tolerancia al glifosato. Estas proteínas incluyen proteínas conocidas así como proteínas recientemente identificadas (por ejemplo, SEC ID NOS:10, 12, 56 y 59).

Por "glifosato" se intenta cualquier forma de herbicida de N-fosfonometilglicina (incluyendo cualquier sal de la misma) y otras formas que resultan en la producción del anión de glifosato en la planta. Una "proteína con resistencia herbicida", "proteína con tolerancia al herbicida", o una proteína que resulta de la expresión de una "resistencia al herbicida" o "tolerancia al herbicida" que codifica el polinucléotido que incluye las proteínas que confieren en una célula la habilidad de una concentración mayor de un herbicida que las células que no expresan la proteína o para la tolerancia a una cierta concentración de un herbicida por un largo periodo de tiempo que las células no expresan la proteína. Una "proteína con resistencia al glifosato" o una "proteína con tolerancia al glifosato" incluye una proteína que confiere en una célula la habilidad para tolerar una concentración mayor del glifosato que las células que no expresan la proteína o para tolerar una cierta concentración de glifosato por un tiempo mayor que las células que no expresan la proteína. Por "tolerar" o "tolerancia" se intenta que sobreviva o lleve a cabo funciones celulares esenciales tal como síntesis de proteínas y respiración en una manera que no es rápidamente discernible de las células no tratadas.

Polinucleótidos Aislados y Variantes y Fragmentos de los Mismos Un aspecto de la invención pertenece a polinucleótidos aislados más que las secuencias de polinucleótidos listados en las SEC ID NOS:1 , 3, 7, 45, 47 y 53 que codifican las enzimas de sintasa EPSP que tienen al menos un dominio de secuencia de Clase lll de la invención. Por "otro que" se intenta que la invención no incluya las secuencias de polinucléotido establecidas en las SEC ID NOS mencionadas.

Los polinucleótidos aislados de la presente invención comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas con resistencia a los herbicidas y los polipéptidos o las porciones biológicamente activas de los mismos, así como los polinucleótidos suficientes para usarse como sondas de hibridación para identificar los polinucleótidos que codifican la resistencia a los herbicidas. Como se usa en este documento, el término "polinucléotido" se intenta que incluye las moléculas de ADN (es decir, cADN o ADN genómico) y las moléculas de ARN (es decir mARN) y los análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos. El polinucléotido puede ser ADN de doble hebra o de hebra simple.

Las secuencias de nucleótidos de la invención incluyen aquellos caracterizados por los dominios anteriormente incluidos. La información usada para identificar estos dominios incluye la alineación de secuencia de las moléculas EPSPS sensibles al glifosato. Las alineaciones de secuencia se usan para identificar la homología entre las secuencias y para identificar los dominios Clase lll que son característicos de las enzimas EPSPS Clase lll.

Las variantes de los dominios también se incluyen dentro del alcance de la invención (por ejemplo SEC ID NO:35). Dichas variantes incluyen las secuencias que se comparten en al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia y están contenidas en una molécula de ADN que imparte la tolerancia al glifosato.

Un polinucléotido o proteína "aislada" o "purificada" o porción biológicamente activa del mismo, está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce por las técnicas recombinantes, o está sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. De preferencia un polinucléotido "aislado" está libre de secuencias (por ejemplo, secuencias que codifican la proteína), que naturalmente flanquean el polinucléotido (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del polinucléotido) en el ADN genómico del organismo del cual el polinucléotido se deriva. Para propósitos de la invención, "aislado" cuando se refiere a polinucleótidos excluye los cromosomas aislados. Por ejemplo, en varias modalidades, el polinucléotido que codifica resistencia al glifosato aislado puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb ó 1 kb de la secuencia de nucleótidos que naturalmente flanquean el polinucléotido en el ADN genómico de la célula de la cual el polinucléotido se deriva. Una proteína con resistencia al herbicida que está sustancialmente libre de material celular incluye la preparación de la proteína que tiene menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% ó 5% (por peso en seco) de proteína de resistencia no herbicida (también referida en este documento como una "proteína de contaminación").

Los polinucleótidos que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos que codifican la resistencia herbicida también se incluyen por la presente invención (por ejemplo, SEC ID NOS:57, 58 y 60). Por "fragmento" se intenta una porción de las secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de resistencia al herbicida (por ejemplo, SEC ID NO:59). Un fragmento de una secuencia de nucleótido puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína con resistencia al herbicida o puede ser un fragmento que puede usarse como una sonda de hibridación o iniciador PCR usando los métodos posteriormente descritos. Los polinucleótidos que son fragmentos de una secuencia de nucleótido con resistencia herbicida comprenden al menos aproximadamente 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 nucleótidos contiguos o más del número de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos que codifican la resistencia al herbicida de longitud completa descritos en este documento. Por nucleótidos "contiguos" se intentan los residuos de nucleótidos que están inmediatamente adyacentes uno al otro.

Los fragmentos de las secuencias de nucleótidos de la presente invención generalmente comprenderán al menos uno de los dominios de Clase lll descritos en este documento y codificarán los fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína con resistencia al glifosato de longitud completa, es decir, actividad con resistencia al glifosato. Por "actividad que retiene resistencia al herbicida" se intenta que el fragmento tendrá al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70% o al menos aproximadamente 80% de la actividad con resistencia al herbicida de la proteína con resistencia al glifosato de longitud completa descrita en este documento como SEC ID NO:6. Los métodos para medir la actividad con resistencia al herbicida son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 4,535,060 y 5,188,642, cada una de las cuales se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica la resistencia al herbicida que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de la invención codificará al menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 aminoácidos contiguos o más del número total de aminoácidos presentes en una proteína con resistencia al herbicida de longitud completa de la invención. Importantemente, el fragmento comprenderá al menos un dominio de la Clase lll descrita en este documento.

Las proteínas con resistencia al herbicida de la presente invención también son aquellas caracterizadas como Clase lll o fragmentos o variantes de las mismas que retienen actividad. El término "suficientemente idéntico" se intenta un aminoácido o secuencia de nucleótido que tiene al menos 60% ó 65% de identidad de secuencia, al menos 70% ó 75% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 80% ó 85% de identidad de secuencia, o al menos aproximadamente 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia comparada con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineación descritos en este documento usando parámetros estándares. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos mediante tomar en cuenta la degeneración de los codones, la similitud de aminoácido, el posicionamiento del cuadro de lectura y los similares.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácido o de dos polinucleótidos, las secuencias se alinean para propósitos óptimos de comparación. La identidad de porcentaje entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (es decir, posiciones de traslapo) x 100). En una modalidad, las dos secuencias son de la misma longitud. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a aquellas posteriormente descritas con o sin huecos de tolerancia. En el cálculo del porcentaje de identidad, típicamente se cuentan las igualaciones exactas.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede llevarse a cabo usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático usado para la comparación de las dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul ef al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Las búsquedas de nucleótido BLAST pueden realizarse con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener las secuencias de nucleótidos homólogos para los polinucleótidos similares a GDC de la invención. Las búsquedas de proteína BLAST pueden realizarse con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener las secuencias de aminoácidos homólogos para las moléculas de proteína resistentes al herbicida de la invención. Para obtener las alineaciones huecas para propósitos de comparación, puede usarse el Gapped BLAST como se describe en Altschul ef al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:33-89-2402. Alternativamente, el PSI-Blast puede usarse para realizar una búsqueda repetida que detecta las relaciones distantes entre las moléculas. Ver Altschul ef al (1997) supra. Cuando se usan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, los parámetros predefinidos de los programas respectivos (es decir, BLASTX y BLASTN) pueden usarse. Ver www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático usado par ala comparación de las secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins ef al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). El clustalW compara las secuencias y alinea la totalidad del aminoácido o secuencia de ADN y además puede proporcionar datos acerca de la conservación de secuencia de aminoácido. El algoritmo ClutalW se usa en varios paquetes de programas de análisis de aminoácido/ADN comercialmente disponibles, tal como el módulo ALIGNX del Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Después de la alineación de las secuencias de aminoácido con el ClustalW, puede valorarse la identidad del porcentaje de aminoácido. Un ejemplo no limitante de un programa de software útil para el análisis de las alineaciones ClustalW es GENEDOC™, GENEDOC™ (Kart Nicholas) permite la valoración de la similitud e identidad el aminoácido (o ADN) entre las proteínas múltiples. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático usado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Millar (1988) CABIOS 4:11-17. Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete del programa de alineación de secuencia GCG (disponible en Accelrys, Inc. San Diego, CA). Cuando se usa el programa de alineación para comparar las secuencias de aminoácido, una tabla de residuos de peso PAM 120, una penalidad de longitud hueca 12 y una penalidad hueca de 4 puede usarse.

A menos que se establezca de otra manera, GAP versión 10, que usa el algoritmo de Needlman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, se usará para determinar la identidad de secuencia o similitud usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos usando GAP peso de 50 y peso de longitud de 3 y la matriz de puntuación nwsgadna.cmp, % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácido usando el peso GAP de 8 y el peso de longitud de 2 y el programa de puntuación BLOSUM62.

También pueden usarse los programas equivalentes. Por "programa equivalente" se entiende cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene igualaciones de residuo de nucleótidos idénticas y un porcentaje de identidad idéntico cuando se compara a la alineación correspondiente generada por el GAP versión 10. La invención también comprende los polinucleótidos variantes. Las "variantes" de las secuencias de nucleótidos que codifican la resistencia al herbicida descritos en este documento pero que difieren conservadoramente debido a la degeneración del código genético, así como aquellos que son suficientemente idénticos como se describió anteriormente. Las variantes alélicas de ocurrencia natural pueden identificarse con el uso de técnicas de biología molecular bien definidas, tales como la reacción de cadena de polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación como se señalaron anteriormente. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen las secuencias de nucleótidos sintéticamente derivadas que se han generado, por ejemplo, mediante el uso de la mutagénesis dirigida en sitio pero que aún codificará a las proteínas con resistencia al herbicida descritas en la presente invención como se describe posteriormente. Las proteínas variantes contempladas por la presente invención son biológicamente activas, esto es retienen actividad biológica deseada de la proteína nativa, esto es, actividad con resistencia al herbicida. Por "retiene actividad con resistencia al herbicida" se intenta que la variante tenga al menos aproximadamente 30%, en al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70% o al menos aproximadamente 80% de la actividad de resistencia al herbicida de la proteína nativa. Los métodos para medir la actividad de resistencia al herbicida son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 4,535,060 y 5,188,642 cada una de las cuales se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.

El experto en la técnica además apreciará que los cambios pueden introducirse mediante la mutación en las secuencias de nucleótidos de la invención por lo tanto conduciendo a cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas con resistencia al herbicida codificadas sin alterar la actividad biológica de las proteínas. Además, los polinucleótidos aislados variantes pueden crearse mediante la introducción de una o más sustituciones, adiciones u omisiones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos correspondientes descritos en este documento, tal como una o más sustituciones, adiciones u omisiones de aminoácidos se introducen en la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse mediante técnicas estándares, tal como la mutagénesis dirigida en sitio y la mutagénesis mediada PCR. Dichas secuencias de nucleótidos variantes también se contemplan por la presente invención.

Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos variantes pueden hacerse en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Un residuo aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse a partir de la secuencia de tipo natural de una proteína con resistencia al herbicida sin alterar la actividad biológica, en vista de que un residuo de aminoácido "esencial" se requiere para la actividad biológica. Una "sustitución de aminoácido conservador" es una en el cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de los residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen los aminoácidos con cadenas laterales básicas (es decir, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (es decir, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (es decir, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisterna), cadenas laterales no polares (es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta-ramificadas (es decir, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (es decir, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Las sustituciones de aminoácido pueden hacerse en regiones no conservadas que retienen la función. En general, dichas sustituciones no se harán para los residuos de aminoácidos conservados o para los residuos de aminoácidos residiendo dentro de una porción conservada, en donde dichos residuos son esenciales para la actividad de proteínas. Sin embargo, un experto en la técnica entenderá que las variantes funcionales pueden tener alteraciones menores conservadas o no conservadas en los residuos conservados.

Alternativamente, las secuencias de nucleótidos variantes pueden hacerse mediante introducir las mutaciones aleatoriamente entre toda o parte de la secuencia de codificación, tal como mediante la mutagénesis por saturación y los mutantes resultantes pueden analizarse por la habilidad para conferir la actividad con resistencia al herbicida para identificar los mutantes que retienen la actividad. Siguiendo la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse recombinantemente y la actividad de la proteína puede determinarse usando técnicas de prueba estándares.

Usando los métodos tales como hibridación PCR y las secuencias con resistencia al herbicida correspondientes similares pueden identificarse mediante observar los dominios conservados de la invención. Ver, por ejemplo Sambrook y Russell (2001 ) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis ef al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, St Louis, MO).

En un método de hibridación, todo o parte de la secuencia de nucleótidos con resistencia al herbicida o un dominio pueden usarse para analizar las bibliotecas genómicas o cADN. Los métodos para la construcción de dichas bibliotecas genómicas y cADN se conocen generalmente en la técnica y se describen en Sambrook y Russell, 2001 , supra. Las sondas de hibridación así llamadas pueden ser fragmentos de ADN genómicos, fragmentos cADN, fragmentos ARN u otros oligonucleótidos, y pueden etiquetarse con un grupo detectable tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor enzima. Las sondas para la hibridación pueden hacerse mediante marcar los oligonucleótidos sintéticos basados en la secuencia de nucleótidos que codifica la resistencia al herbicida conocida descrita en este documento. La degeneración de iniciadores designada en la base de nucleótidos conservados o residuos de aminoácidos en la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos codificada puede usarse adicionalmente. La sonda típicamente comprende una región de secuencia de nucleótido que se hibrida bajo condiciones severas a al menos 12, en al menos aproximadamente 25 o al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos de codificación con resistencia al herbicida de la invención o un fragmento o variante del mismo. Los métodos para la preparación de las sondas para la hibridación se conocen generalmente en la técnica y se describen en Sambrook y Russell, 2001 , supra y Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) ambas de las cuales se incorporan en este documento como referencia.

La hibridación de dichas secuencias puede llevarse a cabo bajo condiciones severas. Por "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" se entienden las condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia blanco a un grado detectablemente mayor que las otras secuencias (es decir, al menos 2 veces sobre el antecedente). Las condiciones severas son secuencias dependientes y serán diferentes en diferentes circunstancias. Mediante controlar la severidad de la hibridación y/o condiciones de lavado, las secuencias blanco que son 100% complementarias para la sonda pueden identificarse (sondeo homólogo). Alternativamente, las condiciones de severidad pueden ajustarse para permitir alguna desigualación en las secuencias de manera que los grados menores de similitud se detectan (sondeo heterólogo). Generalmente una sonda de menos de aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud, o menos de 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M de ion de Na, típicamente aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ion de Na (u otras sales) en un pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (es decir 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas grandes (es decir, mayores que 50 nucleótidos). Las condiciones severas también pueden lograrse con la adición de agentes de desastibilización tal como formamida. Las condiciones de baja severidad ejemplarizadoras incluyen la hibridación con una solución de estabilizador de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCI, 1 % de SDS (sulfato dodecil de sodio) a 37°C y un lavado en 1X para 2X SSC (20X SSC = 3.0 M de NaCI/0.3 M de citrato de trisodio) a 50 hasta 55°C. Las condiciones de severidad moderada ejemplarizadoras incluyen la hibridación en 40 a 45% de formamida, 1.0 M de NaCI, 1% de SDS a 37°C y un lavado en 0.5X a 1X SSC a 55 hasta 60°C. Las condiciones de alta severidad ejemplarizadoras incluyen hibridación en 50% de formamida, 1 M de NaCI, 1% de SDS a 37°C y un lavado en 0.1 X SSC a 60 hasta 65°C. Opcionalmente, los estabilizadores de lavado pueden comprender aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 1 % de SDS. La duración de la hibridación es generalmente menor que aproximadamente 24 horas. Usualmente aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad es típicamente la función de los lavados post-hibridación, los factores críticos siendo la resistencia iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos de ADN-ADN, el Tm puede aproximarse desde la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal Biochem 138:267-284: Tm = 81.5°c + 16.6 (log M) + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC)- 0.61 (% de forma) -500/L; en donde M es la molaridad de los cationes monovalentes; % de GC es el porcentaje de los nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN; % de forma es el porcentaje de la formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en los pares base. El Tm es la temperatura (bajo la resistencia iónica definida y el pH) en el cual 50% de la secuencia blanco complementaria hibrida a una sonda perfectamente igualada. El Tm se reduce mediante aproximadamente 1 °C por cada 1 % de desigualdad; además Tm, la hibridación y/o las condiciones de lavado pueden ajustarse para hibridar las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si las secuencias con = 90% de identidad se seleccionan, el Tm puede disminuirse 10°C. Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmico Tm para la secuencia específica y su complemento en una resistencia iónica definida y el pH. Sin embargo, las condiciones severamente severas pueden usar una hibridación y/o lavado en 1 , 2, 3 ó 4°C menores que el punto de fusión térmico (Tm); las condiciones moderadamente severas pueden usar una hibridación y/o lavado en 6, 7, 8, 9 ó 10°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de baja severidad pueden usar una hibridación y/o lavado en 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 20°C menos que el punto de fusión térmico (Tm). Usando la ecuación, la hibridación y las composiciones de lavado y el Tm deseado, aquellos ordinarios de la técnica entenderán que las variaciones en la severidad de la hibridación y/o las soluciones de lavado son inherentemente descritas. Si el grado deseado de la desigualdad resulta en un Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), se prefiere incrementar a la concentración SSC de manera que una temperatura mayor puede usarse. Una guía extensiva para la hibridación de polinucleótidos se encuentra en Tijseen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York) y Ausubel ef al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York). Ver Sambrook ef al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da. edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Proteínas Aisladas y Variantes y Fragmentos de los Mismos Las proteínas con resistencia a los herbicidas también se contemplan dentro de la presente invención. Por "proteína con resistencia a herbicidas" se intenta una proteína de Clase lll que tiene al menos uno de los dominios establecidos anteriormente, por ejemplo SEC ID NOS: 10, 12, 56 y 59. Los fragmentos, las porciones biológicamente activas y las variantes de los mismos también se proporcionan y pueden usarse para practicar los métodos de la presente invención.

"Fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos de polipéptido que comprenden una porción de una secuencia de aminoácido que codifica una proteína con resistencia al herbicida y que retiene la actividad de resistencia al herbicida. Una porción biológicamente activa de una proteína de resistencia a herbicida puede ser un polipéptido esto es, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos en longitud. Dichas porciones biológicamente activas pueden prepararse mediante técnicas recombinantes y evaluarse para la actividad de resistencia a herbicidas. Los métodos para medir la actividad con resistencia a herbicidas son bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 4,535,060 y 5,188,642, cada una de las cuales se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.

Por "variantes" se intentan las proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente 60%, 65%, aproximadamente 70%, 75%, aproximadamente 80%, 85% o aproximadamente al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a una enzima Clase lll. Las variantes también incluyen polipéptidos codificados por un polinucleótido que hibrida al polinucleótido que codifica una enzima Clase lll o un complemento del mismo, bajo condiciones severas. Las variantes incluyen los polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácido debido a la mutagénesis. Las proteínas variantes contempladas por la presente invención son biológicamente activas, esto es, continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, esto es, reteniendo actividad con resistencia a herbicidas. Los métodos para medir la actividad con resistencia a herbicidas son bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 4,535,060 y 5,188,642, cada una de las cuales se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.

Los genes bacteriales comúnmente poseen codones de iniciación a la metionina múltiples en la proximidad al inicio del cuadro de lectura abierto. Comúnmente, la iniciación de la traducción en uno o más de estos codones de inicio conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones pueden incluir codones ATG. Sin embargo, la bacteria tal como Bacillus sp. también reconoce el codón GTG como un codón de inicio y las proteínas que inician la traducción en los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. Además, no es común determinar a priori que estos codones se usen naturalmente en las bacterias. Así, se entiende que el uso de los codones de metionina alternos puede conducir a la generación de variantes que confieren resistencia a los herbicidas (por ejemplo, SEC ID NO:59 codificada por la SEC ID NO:58). Estas proteínas con resistencia a herbicidas se contemplan en la presente invención y pueden usarse en los métodos de la presente invención.

Los anticuerpos para los polipéptidos de la presente invención o para las variantes o fragmentos de los mismos también se contemplan. Los métodos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Patente Estadounidense No. 4,196,265).

Transformación Bacterial o Células de Plantas La transformación de las células bacteriales se lleva a cabo por una de varias técnicas conocidas en la técnica, no se limita a electroporación o transformación química (Ver, por ejemplo Ausubel (ed) (1994) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, Inc. Indianápolis, IN). Los marcadores que confieren resistencia a las sustancias tóxicas que son útiles en la identificación de las células transformadas (siendo tomadas y expresadas en el ADN de prueba) de las células no transformadas (aquellas que no contienen o no expresan el ADN de prueba). En un aspecto de la invención, los genes son útiles como un marcador para valorar la transformación de las bacterias o las células de las plantas.

La transformación de las células de las plantas se lleva a cabo en un diseño similar. Por "planta" se entienden las plantas totales, órganos de plantas (es decir hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células de plantas, propagule, embriones o progenitura de los mismos. Las células de plantas pueden diferenciarse y no diferenciarse (es decir, callo, células de cultivo de suspensión, protoplastos, células de las hojas, células de las raíces, células del phloem, polen). Las "plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o plantas o células o tejidos "establemente transformadas" se refieren a plantas que se han incorporado o las secuencias de polinucleótido exógeno integradas o los fragmentos de ADN en la célula de la planta. Por "transformación estable" se entiende que la construcción de nucleótido introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredada por la progenitura del mismo. Los genes de la invención pueden modificarse para obtener o mejorar la expresión en las células de plantas. Las secuencias con resistencia herbicida de la invención pueden proporcionarse en las cintas de expresión para la expresión en la planta de interés. La "cinta de expresión de la planta" incluye las construcciones de ADN que son capaces de resultar en la expresión de una proteína desde un cuadro de lectura abierta en una célula de la planta. La cinta incluirá en la dirección 5'-3' de transcripción, una región de iniciación transcripcional (es decir, promotor) operablemente unida a una secuencia de ADN de la invención y una región de terminación transcripcional y trasnacional (es decir región de terminación) funcional en plantas. En algunas modalidades, la región de iniciación transcripcional causará la producción de una secuencia de ARN que permite la expresión suficiente de la enzima EPSPS codificada para mejorar la tolerancia al glifosato de una célula de planta transformada con el polinucleótido. Por "expresión suficiente" se intenta que la región de iniciación de transcripción se proporcione para la expresión de una cantidad del polipéptido resistente al glifosato de la invención (es decir, aquellas que contienen un dominio Clase lll) que conferirán en una planta o una célula la habilidad para tolerar una mayor concentración de glifosato que las plantas o células que no contienen o expresan la proteína o para tolerar una cierta concentración de glifosato por un mayor tiempo que las plantas o células que no contienen o expresan la proteína.

La cinta puede contener adicionalmente al menos un gen adicional para ser co-transformado en el organismo, tal como un gen marcador seleccionable. Alternativamente, el gen adicional puede proporcionarse en cintas de expresión múltiples. Dicha cinta de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia con resistencia al herbicida para estar debajo de la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

El promotor puede ser nativo o análogo o extraño o heterólogo para el huésped de la planta y/o la secuencia de ADN de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. En donde el promotor es "nativo" o "heterólogo" para el huésped de la planta, se intenta que el promotor se encuentre en la planta nativa en la cual el promotor se introduce. En donde el promotor es "extraño" o "heterólogo" para la secuencia de de ADN operablemente unida de la invención. "Heterólogo" generalmente se refiere a las secuencias de polinucleótidos que no son endógenas para la célula o parte del genoma nativo en el cual están presentes y se han agregado a la célula mediante infección, transfección, microinyección, electroporación, microinyección o los similares. Por "operablemente unida" se intenta una unión funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia del promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, operablemente unida significa que las secuencias de polinucleótido estando unidas son contiguas y en donde es necesario para unir dos regiones de codificación de las proteínas contiguas y en el mismo cuadro de lectura abierta.

Comúnmente, dichas construcciones también contendrán regiones no traducidas 5' y 3'. Dichas construcciones puede contener una "secuencia de señal" o "secuencia conductora" para facilitar el transporte co-translacional o post-translacional del péptido de interés para ciertas estructuras intracelulares tal como el cloroplasto (u otro plástico), retículo endoplásmico o aparato de Golgi o para analizarse. Por ejemplo, el gen puede tratarse para contener un péptido de señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplásmico. Por "secuencia de señal" se intenta una secuencia que es conocida o se sospecha que resulta en transporte cotranslacional o post-translacional a través de la membrana celular. En las eucariotas, esto típicamente involucra la secreción en el aparato de Golgi con alguna glicosilación resultante. Por "secuencia líder" se intenta cualquier secuencia que traducida, resulta en una secuencia de aminoácido suficiente para impulsar el transporte co-translacional de la cadena de péptido para un organelo sub-celular. Además, esto incluye las secuencias líderes que señalan el transporte y/o la glicosilación mediante el pasaje en el retículo endoplásmico, pasaje a las vacuolas, los plásticos incluyendo los cloroplastos, la mitocondria y los similares. La cinta de expresión de las plantas también puede tratarse para contener un intrón, de manera que el procesamiento de mARN del intrón se requiere para la expresión.

Por "región 3' no traducida" se intenta una secuencia de nucleótidos ubicada descendente de una secuencia de codificación. Las secuencias de señal de poliadenilación (por ejemplo, nucleótidos poliadenilados) y otras secuencias que codifican las señales reguladoras capaces de afectar la adición de los tractos de ácido poliadenílico para el extremo 3' del precursor de mARN que son regiones 3' no traducidas. Por "región 5' no traducida" se intenta una secuencia de nucleótidos ubicada ascendente de una secuencia de codificación.

Otros elementos no traducidos ascendentes o descendentes incluyen mejoradores. Los mejoradores son secuencias de nucleótidos que actúan para incrementar la expresión de una región del promotor. Los mejoradores son bien conocidos en la técnica e incluyen pero no se limitan a la región del mejorador SV40 y el elemento mejorador 35S.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la secuencia con resistencia al herbicida de la presente invención o puede derivarse de otra fuente. Las regiones de terminación convenientes están disponible del Ti-plásmido de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de sintasa nopalina y sintasa octopina. Ver también Guerineau et al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991 ) Cell 64:671-674; Sanfacon ef al. (1991 ) Genes Dev. 5:141-149; Mogen ef al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe ef al. (1990) Gene 91 :151-158; Bailas ef al (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 y Joshi ef al (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

En donde es apropiado, el gen puede optimizarse para la expresión incrementada en la célula huésped transformada. Esto es, los genes pueden sintetizarse usando los codones de células preferidas del huésped para la expresión mejorada o pueden sintetizarse usando codones en una frecuencia de uso de codón de huésped preferido. Generalmente, el contenido de GC del gen se incrementará. Ver, por ejemplo Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92.1-11 para una discusión del uso del codón de huésped preferido. Los métodos son conocidos en la técnica para sintetizar los genes de huésped preferidos. Ver, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 6,320,100; 6,075,185; 5,380,831 y 5,436,391 , las Solicitudes Estadounidenses Publicadas Nos. 20040005600 y 20010003849 y Murria et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporadas en este documento como referencias.

En una modalidad, los polinucleótidos de interés se señalan para el cloroplasto para la expresión. De esta manera, en donde el polinucleótido de interés no se inserta directamente en el cloroplasto, las cintas de expresión adicionalmente contendrán un polinucleótido que codifica un péptido transitorio para dirigirse al producto de gen de interés para los cloroplastos. Dichos péptidos transitorios se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Von Heijne ef al. (1991 ) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark ef al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol 84:965-968; Romer ef al (1993); Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421 y Shan ef al. (1986) Science 233:478-481. En algunas modalidades, los polinucleótidos de la invención codifican un polipéptido de fusión que comprende un péptido de tránsito de cloroplasto amino terminal y la enzima EPSPS. Un "polipéptido de fusión" puede generarse, por ejemplo, mediante remover el codón de detención desde la secuencia del polinucleótido que codifica un primer polipéptido, entonces adjuntando la secuencia de polinucleótido que codifica un segundo polipéptido en el recuadro de manera que la secuencia de polinucleótido resultante posteriormente se expresará por una célula como un polipéptido simple.

Los polinucleótidos de interés a señalarse para el cloroplasto pueden optimizarse para la expresión en el cloroplasto para contar para la diferencias de uso en el codón entre el núcleo de la planta y este organelo. De esta manera, los polinucleótidos de interés pueden sintetizarse usando los codones de cloroplasto preferidos. Ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,380,831 incorporada en este documento como referencia.

Típicamente esta "cinta de expresión de plantas" se insertará en un "vector de transformación de plantas". Por "vector de transformación" se intenta una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficiente de una célula. Dicha molécula puede consistir de una o más cintas de expresión y pueden organizarse en más de una molécula de ADN del "vector". Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación de plantas que usan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones trans- y cis-acción de requisito para la transformación de las células de las plantas (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451 ). "Vector" se refiere a una construcción de polinucleótido designada para la transferencia entre las células de huésped diferentes. "Vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la habilidad de incorporar, integrar y expresar las secuencias de ADN heterólogas o fragmentos de una célula extraña.

Este vector de transformación de plantas puede comprenderse de uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación de las plantas. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica usar vectores de transformación de planas que están comprendidas de más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores comúnmente son referidos en la técnica como'Vectores binarios". Los vectores binarios así como los vectores con plásmidos de ayuda son comúnmente usados para la transformación mediada con Agrobacterium, en donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr la transformación eficiente son muy grandes, y es ventajoso separar las funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios típicamente contienen un vector plásmido que contiene las secuencias de cis-acción requeridas para la transferencia de ADN (tal como el borde izquierdo y el borde derecho), un marcador seleccionable que se trata para ser capaz de la expresión en una célula de planta y un "gen de interés" (un gen tratado por se capaz de la expresión en una célula de plata para la cual la generación de plantas transgénicas se desea). También presentes en este vector plásmido están las secuencias requeridas para la replicación bacterial. Las secuencias de cis-acción se colocan en un diseño para permitir la transferencia eficiente en las células de las plantas y la expresión en las mismas. Por ejemplo, el marcador seleccionable y el gen de interés se colocan entre los bordes izquierdo y derecho. Comúnmente un segundo vector plásmido contiene los factores de transacción que median la transferencia T-ADN de Agrobacterium para las células de plantas. Este plásmido comúnmente contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de las células de las plantas por el Agrobacterium y la transferencia del ADN mediante la penetración en las secuencias del borde y la transferencia de ADN vir-mediada como se entiende en la técnica (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5:446-451 ). Varios tipos de hebras Agrobacterium (es decir, LBA4404, GV3101 , EHA101 , EHA105, etc.) pueden usarse para la transformación de las plantas. El segundo vector plásmido no es necesario para transformar las plantas por otros métodos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

Transformación de Plantas Los métodos de la invención involucran la introducción de una construcción de nucleótidos en una planta. Por "introducción" se entiende presentar a la planta la construcción de nucleótidos en dicha manera que la construcción gane acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren que un método particular para la introducción de una construcción de nucleótido a la planta se use, solamente que la construcción de nucleótido gane acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir las construcciones de nucleótidos en las plantas se conocen en la técnica incluyendo pero no limitados a métodos de transformación estables, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.

En general, los métodos de transformación involucran la transferencia del ADN heterólogo en las células de plantas blanco (es decir embriones maduros e inmaduros, cultivos de suspensión, callos no diferenciado, protoplastos, etc.), seguidos por la aplicación de un nivel de inicio máximo de selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable y en este caso "glifosato") para recuperar las células de plantas transformadas de un grupo de masa de células no transformadas. En dichos procesos, los polipéptidos resistentes al glifosato comprendiendo uno o más dominios de Clase lll de la presente invención pueden usarse como marcador seleccionable.

Las explantas se transfieren típicamente a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan rutinariamente. Subsecuentemente, las células transformadas se diferencian en los brotes después de que se colocan en un medio de regeneración suplementado con un nivel de inicio máximo del agente de selección (es decir, "glifosato"). Los brotes posteriormente se transfieren a un medio de raíces selectivo para recuperar las plantas pequeñas o los brotes con raíces. Las plantas pequeñas transgénicas posteriormente se cultivan en plantas maduras y producen semillas fértiles (por ejemplo Hiei ef al (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida ef al (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Las explantas se transfieren típicamente a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan rutinariamente. Una descripción general de las técnicas y métodos para generar las plantas transgénicas se encuentra en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Dado que el material transformado contiene muchas células, ambas células no transformadas y transformadas están presentes en cualquier pieza del callo o tejido blanco sometido o grupo de células. La habilidad para eliminar las células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen resulta en cultivos de plantas transformadas. Comúnmente, la habilidad para remover las células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de las células de plantas transformadas y la generación exitosa de las plantas transgénicas. Posteriormente los métodos bioquímicos y moleculares se usarán para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica.

La generación de las plantas transgénicas puede realizarse por uno de los varios métodos, incluyendo pero no limitados a la introducción de ADN heterólogo por Agrobacterium en las célula de plantas (transformación mediada por Agrobacterium), el bombardeo de las células de plantas con ADN extraño heterólogo adherido a las partículas y varios otros métodos mediados con no partículas directas (es decir, Hiei et al (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida ef al (1996) Nature Biotechnology 14:745-750; Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239; Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120) para transferir el ADN.

Los métodos para la transformación de los cloroplastos se conocen en la técnica. Ver, pro ejemplo, Svab ef al (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc.

Nati. Acad. Sci. EUA 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método confía en la liberación de pistola de partículas de ADN conteniendo un marcador seleccionable y la señalización del ADN para el genoma del plástido a través de la recombinación homologa.

Adicionalmente, la transformación del plástido puede llevarse a cabo por la transactivación de un transgen nacido en plástido mediante la expresión de tejido preferida de una polimerasa de ARN dirigida en plástido y nuclear codificada. Dicho sistema se ha reportado en McBride ef al (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91 :7301-7305.

Las células que se han transformado pueden cultivarse dentro de las plantas de conformidad con las rutas convencionales. Ver, por ejemplo McCormick ef al (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas posteriormente se cultivan y se polinizan con la misma hebra transformada o diferentes hebras y el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada identificada. Dos o más generaciones pueden cultivarse para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene establemente y se hereda y posteriormente las semillas se cultivan para asegurar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esa manera, la presente invención proporciona semillas transformadas (también referidas como "semilla transgénica") que tiene una construcción de nucleótidos de la invención, por ejemplo, una cinta de expresión de la invención, establemente incorporada en su genoma.

Plantas La presente invención puede usarse para la transformación de cualquier especie de planta, ¡ncluyendo pero no limitadas a monocotiledones y dicotiledones. Los ejemplos de plantas de interés incluyen pero no se limitan a trigo (maíz), sorgo, trigo, girasol, jitomate, crucifer, pimiento, papa, algodón, arroz, soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada y aceite de semilla de repollo, Brassica sp. alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuates, papa dulce, tapioca, café, coco, piña, árboles cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, aceitunas, papaya, nuez de cajú, nuez comestible, almendras, avena, vegetales, ornamentales y coniferas.

Los vegetales incluyen pero no se limitan a jitomates, lechuga, ejotes, habichuelas, chícharos y miembros del género Curcumis tal como el pepino, melón y melón verde. Las ornamentales incluyen pero no se limitan a azalea, hidrangea, hibisco, rosas, tulipanes, narciso, petunia, clavel, flor de pascua y crisantemo. De preferencia, las plantas de la presente invención son plantas de cosecha (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, jitomate, crucifers, pimientos, papas, algodón, arroz, soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada, aceite de semilla de repollo, etc.).

Esta invención es particularmente apropiada para cualquier miembro de la familia de las plantas monocotiledonas incluyendo pero no limitas a maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, peña, camote, cebolla, plátano, cono y dátiles.

Evaluación de la Transformación de la Planta Siguiendo la introducción del ADN extraño heterólogo en las células de las plantas, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta se confirmó mediante varios métodos tales como el análisis de polinucleótidos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

El análisis PCR es un método rápido para analizar las células transformadas, el tejido o los brotes para la presencia del gen incorporado en el estado temprano antes de la transplantación en la tierra (Sambrook y Russell, 2001. Molecular Cloning: A Laboratoy Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY). La PCR se lleva a cabo usando los iniciadores oligonucleótidos específicos para el gen de interés o el fondo del vector Agrobacterium, etc.

La transformación de la planta puede confirmarse por el análisis de hibridación Southern del ADN genómico (Sambrook y Russell, 2001 , supra). En general, el ADN total se extrae del transformante digerido con las enzimas de restricción apropiadas, fraccionadas en un gel de agarosa y transferidas a una nitrocelulosa o membrana de nylon. La membrana o "hibridación" entonces se prueba con, por ejemplo, fragmento de ADN blanco 32P para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de las plantas de conformidad con las técnicas estándares (Sambrook y Russell, 2001 , supra).

En el análisis de hibridación Northern, el ARN se aisla de tejidos específicos del transformante, se fracciona en un gel de agarosa de formaldehído, se hibridan en un filtro de nylon de conformidad con los procedimientos estándares que se usan rutinariamente en la técnica (Sambrook y Russell, 2001 , supra). La expresión del ARN codificado por la secuencia de la invención posteriormente se prueba mediante del filtro a una sonda radiactiva derivada de un GDC, por los métodos conocidos en la técnica (Sambrool y Russell, 2001 , supra).

La hibridación Western y las pruebas bioquímicas y las similares se llevan a cabo en las plantas transgénicas para determinar la presencia de la proteína codificada por el gen con resistencia al herbicida mediante los procedimientos estándares (Sambrook y Russell, 2001 , supra) usando los anticuerpos que se unen a uno o más epítopes presentes en la proteína con resistencia al herbicida.

La presente invención también se dirige a métodos para identificar una sintasa EPSP con actividad con resistencia al glifosato. Los métodos involucran determinar si ciertos dominios de secuencia conservada están presentes en la secuencia de aminoácido de una sintasa EPSP. La presencia de uno o más de los dominios anteriormente listados.

Predicción de la Función de Proteína de la Secuencia Usando los métodos de la invención y los dominios identificados, pueden identificarse los polipéptidos adicionales (por ejemplo SEC ID NOS:2, 4, 46 y 48) que confieren la tolerancia al glifosato. Estos polipéptidos adicionales pueden identificarse mediante la búsqueda de las bases de datos de secuencia que contienen las secuencias de sintasa EPSP, y/o mediante la alineación de las secuencias de polipéptido de la sintasa EPSP para la búsqueda de la presencia de dominios de Clase lll. Estos polipéptidos incluyen los polipéptidos conocidos así como los polipéptidos recientemente identificados. Se entiende que algunas modificaciones de estos dominios son toleradas en naturaleza sin interrumpir la resistencia al glifosato que confiere la naturaleza de estos dominios y por lo tanto son equivalentes a los dominios listados en este documento.

En general, existen cuatro niveles de estructura de proteína: la estructura primaria, que consiste de la cadena lineal de aminoácidos o la secuencia de polipéptidos; la segunda estructura, que se da por las hélices a, las hebras ß y las veces que la proteína se dobla en ellas, la estructura terciaria, que se hace de porciones simples que se han combinado para formar los dominios globulares compactos y la estructura cuaternaria, que puede comprender varias cadenas de aminoácidos o subunidades. Cuando se predice la función de la secuencia es importante identificar las porciones o plantillas funcionalmente importantes. Los dominios de las proteínas con dobleces similares comúnmente comparten la misma función molecular (Hegyi y Gerstein (1999) J. Mol. Biol. 288:147-164; Moult y Melamud (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:384-389; Shakhnovich ef al. (2003) J. Mol. Biol. 326:1-9). La identificación de los dominios importantes para la proteína puede hacerse mediante alineación de secuencia múltiple.

La estructura de tres dimensiones puede predecirse por el modelado de homología, es decir, mediante el uso de un homologo de secuencia (>25% de identidad de secuencia) con una estructura de 3D experimentalmente determinada. La estructura tridimensional de, por ejemplo la sintasa EPSP E. Coli (AroA) es bien conocida (Shonbrum ef al. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 98:1375-1380). Esta estructura se basa en la cristalización de AroA con el glifosato y el shiquimato 3-f osf ato.

Los siguientes ejemplos se ofrecen por medio de ilustración y no por medio de limitación.

EXPERIMENTAL Eiemplo 1. Aislamiento de los Genes EPSPS La codificación de los genes de las enzimas EPSPS Clase lll se han aislado de siete bacterias diferentes (Klebsiella pneumoniae, Agrobacterium radiobacter, Rhizobium sp., Brevundomonas vesicularis, Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas syringae y Brucilla/Ochrobacturm) .

La secuencia de codificación de ADN y la secuencia de aminoácido del cuadro de lectura abierta grgß se proporcionan en la Solicitud de Patente Estadounidense No. 60/640,195 presentada el 29 de Diciembre, 2004 y se proporciona en la SEC ID NO:7 y la SEC ID NO:8 de esta solicitud respectivamente.

La secuencia de codificación de ADN y la secuencia de aminoácido del cuadro de lectura abierta grg12 se proporcionan en las SEC ID NOS:57 y 10 y las SEC ID NOS:58 y 59 de esta aplicación, respectivamente.

La secuencia de codificación de ADN y la secuencia de aminoácido del cuadro de lectura abierta grg15 se proporcionan en la SEC ID NO:11 y la SEC ID NO:12 de esta solicitud, respectivamente.

La secuencia de codificación de ADN y la secuencia de aminoácido del cuadro relectura abierta grgß se proporcionan en el número de Acceso GenBank AE016853, bases 1 ,140,091 hasta 1 ,141 ,347 y proporcionados en la SEC ID NO:1 y la SEC ID NO:2 de esta solicitud, respectivamente.

La secuencia de codificación de ADN y la secuencia de aminoácido del cuadro de lectura abierta grg9 se proporcionan en el Número de Acceso GenBank NC_003304 bases 628,398 hasta 629,675 y se proporcionan en SEC ID NO:3 y SEC ID NO:4 de esta solicitud respectivamente.

La secuencia de codificación de ADN y la secuencia de aminoácido del cuadro de lectura abierta grg7 se proporcionan en la SEC ID NO:45 y la SEC ID NO-46 de esta solicitud, respectivamente.

La secuencia de codificación de ADN y la secuencia de aminoácido del cuadro de lectura abierta grgd se proporcionan en el Número de Acceso GenBank NC_005773, bases 1 hasta 1257 y se proporcionan en la SEC ID NO-47 y la SEC ID NO-48 de esta solicitud, respectivamente.

La secuencia de codificación de ADN y la secuencia de aminoácido del cuadro de lectura abierta EPSPS de maíz se proporcionan en el Número de Acceso GenBank X63374 (gi: 1524383), bases 1 hasta 1335 y la secuencia de proteína se proporciona en la SEC ID NO:50 de esta solicitud.

La secuencia de codificación de ADN y la secuencia de aminoácido de un EPSPS bacterial descrito en la Solicitud de Patente Internacional WO2005014820 se proporciona en la SEC ID NO:53 y la SEC ID NO:54 de esta solicitud, respectivamente.

La secuencia de codificación de ADN y la secuencia de aminoácido del cuadro de lectura abierta grg7ml se proporcionan en la SEC ID NO:55 y SEC ID NO:56 de esta solicitud, respectivamente.

Eiemplo 2: Clonación del gen de sintasa EPSP de jitomate Pseudomonas syrinqae py hebra DC3000 La secuencia de codificación de la sintasa EPSP fue PCR amplificada del ADN genómico del jitomate Pseudomonas syringae pv. hebra DC3000 (ATCC BAA-871 ) usando los iniciadores siguientes: CAGAGATCTGGCATGCGACCTCAAGCCACTCTC (superior, SEC ID NO:61 ) y CAGGGCGCGCCTCAGCGCTGAACACTCACCC (inferior, SEC ID NO:62). El producto PCR 1.3 kb resultante se digirió con Bgl II y Ase I, ligados en el pUC18 modificado que se ha digerido con BamH I y Ase I, posteriormente electroforazo en las células DH5a. El ADN del plásmido se preparó de las colonias resistentes a la ampicilina y se analizó mediante la digestión de restricción. Un clon se seleccionó para análisis adicional. La secuencia de ADN de la inserción se determinó usando las técnicas bien conocidas en la técnica y se encontró para ser 100% idénticas a la secuencia publicada para la hebra DC3000 (Número de acceso GenBank AE016853 bases 1 ,140,091 hasta 1 ,141 ,347). Este plásmido se nombró pAX703 y el EPSPS ORF se nombró grgß.

El plásmido pAX703 se transformó en las células ?aro.E. coli y se encontró para completar la eliminación. Esto demuestra que el grgß codifica una sintasa EPSP funcional.

Eiemplo 3. Clonación del gen de sintasa de la hebra C58 EPSP Agrobacterium radiobacter La secuencia de codificación de la sintasa EPSP fue PCR amplificada del ADN genómico de la hebra C58 Agrobacterium tumefaciens (ATCC 33970) usando los siguientes iniciadores: CAGGGATCCGGCATGATCGAACTGACCATCACCC (superior, SEC ID NO:63) y CAGGGCGCCTCAGTGCTGCGGCTCGGCAGCG (inferior, SEC ID NO:64). El producto PCR 1.3 kb resultante se digirió con BamH I y Ase I, se ligó en el pUC18 modificado que se ha digerido con BamH I y Ase I, posteriormente se electroporó en las células DH5a. El ADN plásmido se preparó de las colonias resistentes a la ampicilina y se analizó la digestión de restricción. Un clon se seleccionó para análisis adicional. La secuencia de ADN de la inserción se determinó usando las técnicas bien conocidas en la técnica y se encontró para ser 100% idéntica a la secuencia publicada para la hebra C58 (Número de Acceso Genbank NC_003304 bases 628398 hasta 629675). Este plásmido se nombro pAX702 y la C58 EPS "PS ORF se nombró grg9.

El plásmido pAX702 se transformó en células ?aronA E. coli y se encontró para completar la eliminación. Esto demuestra que el grg9 codifica una sintasa EPSP funcional.

Eiemplo 4. Prueba de graß y grg? para la resistencia al qlifosato Los plásmidos pAX703 y pAX702, conteniendo grgß y grg?, respectivamente, se transforman en células E. coli y se listan en el medio agar M63 que contiene varias concentraciones de glifosato. El plásmido del vector pUC18 se usa como un control sensible al glifosato. Los resultados se presentan en la Tabla 1 y demuestran que la expresión grgß o grg9 confiere resistencia a altos niveles de glifosato.

Tabla 1 Eiemplo 5. Clonación del gen de sintasa EPSP de la hebra B728a. Pseudomonas syrinaae py syringae La secuencia de codificación sintasa EPSP fue PCR amplificada de una colonia aislada de pozo simple de la hebra B728 Pseudomonas syringae pv syringae usando los siguientes iniciadores: CAGGGATCCGGCATGCGACCTCAAGCCACCCTC (superior, SEC ID NO:65) y CAGGGCGCGCCTCAGCGCTGAACACTCACAC (inferior, SEC ID NO:66). El producto PCR 1.26 kb resultante se digirió con enzimas de restricción apropiadas y se ligaron en el vector pRSF1 b, posteriormente se electroporó en las células E. coli. El ADN plásmido se preparó de las colonias resistentes a la ampicilina y se analizó por digestión de restricción. Un clon se seleccionó para el análisis adicional y se designó como pAX1923. La secuencia de ADN del cuadro de lectura abierta en pAX1923 se determinó y se encontró para ser idéntico para la secuencia publicada del EPSPS de la hebra B728a Pseudomonas syringae pv. Syringae. Además, se designó este cuadro de lectura abierta como grg7.

Similarmente, un producto PCR 1.26 kb separado se digirió con BamH I y Ase I ligados en pUC18 modificados que se han digerido con BamH I y 4sc I, posteriormente se electroporaron en células DH5a. El ADN plásmido se preparó de las colonias resistentes a la ampicilina y se analizaron mediante la digestión de restricción. Un clon se seleccionó para análisis adicional. La secuencia de ADN de la inserción del pAX712 se determinó usando técnicas bien conocidas en la técnica y se encontró que contiene 3 cambios de nucleótido cuando se comparó con la secuencia de ADN publicada de la hebra B728a Pseudomonas syringae pv synringae (Número de Acceso GenBank NZ_AABP02000003, bases 39,901 hasta 41 ,400). Estos tres cambios del nucleótido del ADN resultaron en una proteína con un cambio de aminoácido relativo a la proteína hipotética codificada por la secuencia publicada. El cuadro de lectura abierta de la hebra B728a que codifica un EPSPS como se identificó en el plásmido pAX712 se designó grg7ml (SEC ID NO:55; secuencia de proteína grg7ml establecida en la SEC ID NO:56).

Eiemplo 6. Clonación del gen de sintasa EPSP de la hebra 1448a Pseudomonas syrinaae py phaseolicola Los datos de secuencia para la EPSPS de la hebra 1448a Pseudomonas syringae pv phaseolicola se obtuvo del sitio de internet del Instituto para la Búsqueda Genómica en www.tiqr.org. La secuencia de codificación de sintasa EPSP de la hebra 1448a Pseudomonas syringae pv phaseolicola fue PCR amplificada del ADN genómico de la hebra 1448a Pseudomonas syringae pv phaseolicola (ATCC BAA-978) usando los siguientes iniciadores: CAGGGATCCGGCATGCGACCTCAAGCCACCCTC (superior, SEC ID NO:67) y AGAGGCGCGCCTCAGCGCTGAACACGCACC (inferior, SEC ID NO:68), designado con base en la secuencia de ADN disponible del Instituto para la Búsqueda Genómica (comunicación personal "TIGR"). El producto PCR 1.26 kb resultante se digirió con BamH I y Ase I, se ligó en pUC18 modificado que se había digerido con BamH I y Ase I, posteriormente se electroporó en las células DH5a. El ADN plásmido se preparó de las colonias resistentes a la ampicilina y se analizaron mediante la digestión por restricción. Un clon se seleccionó para análisis adicional y se designó pAX713. La secuencia de ADN de la inserción de pAX713 se determinó usando las técnicas bien conocidas en la técnica y se encontró para ser 100% idéntica a la secuencia de ADN publicada de la hebra 1448a Pseudomonas syringae pv. Phaseolicola (realizada por el Instituto para Búsqueda Genómica (TIGR) y disponibles en línea en formato electrónico en www.tiqr.org). Este plásmido se nombró pAX713 y el cuadro de lectura abierta de la hebra 1448a que codifica un EPSPS como identificada en el plásmido pAX713 se designó grgß.

Eiemplo 7: Prueba de argß y grg7 para la resistencia al glifosato Los plásmidos pAX713, pAX1923 y pAX712 conteniendo grg5, grg7 y grg7ml, respectivamente, se transformaron en células E. coli y se listaron en el medio agar M63 conteniendo varias concentraciones de glifosato. El plásmido del vector pUC18 se usó como un control sensible al glifosato. Los resultados se presentaron en la Tabla 2 posterior y demostraron que la expresión grgd, grg7 o grg7ml confiere resistencia a los altos niveles de glifosato.

Tabla 2 Eiemplo 8: Aislamiento de ATX20019 El ATX20019 se aisló mediante las muestras en placas de tierra en el Medio de Sales Minerales HEPES (HMSM) conteniendo glifosato como la única fuente de fósforo. Dado que el HMSM no contiene aminoácidos aromáticos, una hebra deberá ser resistente al glifosato para cultivar en este medio.

Dos gramos de tierra se suplementan en aproximadamente 10 ml de agua, se giraron por 15 segundos y ser permitió establecerse por 15 minutos. Un loopful de 10 µl de esta suspensión se agregó a 3 ml de HMSM suplementado con 10 mM de glifosato (pH 7.0). El HMSM contiene (por litro): 10 g de glucosa, 2 g de NH4S04, 9.53 g de HEPES, 1.0 ml 0.8 M de MgS04, 1.0 ml 0.1 M CaCI?, 1.0 ml de Solución de Oligoelementos (en 100 ml de solución 1000x:0.1 g FeS04.7H20, 0.5 mg de CuS04.5H20, 1.0 mg de H3B03, 1.0 mg de MnS04.5H20, 7.0 mg de ZnS04.7H20, 1.0 mg de Mo03, 4.0 g de KCl). El cultivo se cultivó en un incubador agitador por cuadro días a 28°C y posteriormente 20 µl se usó para inocular 2.5 ml de HMSM fresco conteniendo 10 mM de glifosato como la única fuente de fósforo. Después de dos días, 20 µl se usaron para inocular otro cultivo de 2.5 ml fresco. Después de 5 días, 20 µl se usaron para inocular un cultivo de 2.5 ml fresco. Después de un crecimiento suficiente, el cultivo se colocó en placas en medio sólido mediante listar un loop de 1 µl en la superficie de la placa de agar conteniendo agar de HMSM conteniendo 10 mM de glifosato como la única fuente de fósforo y se almacenó a 28°C. El cultivo posteriormente se colocó en placas para aislamiento. Una hebra particular, designada ATX20019, se seleccionó debido a su habilidad para crecer en la presencia de altas concentraciones de glifosato. El ATX20019 se determinó por se un miembro de Ochrobactrum sp./Brucella sp. mediante la secuenciación del rADN 16S y la comparación en contra de la base de datos.

Eiemplo 9. Preparación v Análisis de Las Bibliotecas del Cósmico El ADN total se extrajo del cultivo de ATX20019 usando los métodos comúnmente conocidos en la técnica. El ADN se digirió parcialmente con la enzima de restricción Sau3A1 y se ligó con el fragmento del vector (Stratagene) SuperCos de conformidad con las direcciones del fabricante. Los productos de ligación se empacaron en las partículas del fago usando el extracto de empaque GigaPack lll XL (Stratagene), se transfectaron en las células E. Coli aro A. El E. coli aroA es una hebra en la cual el aroA gen nativo, que codifica la sintasa EPSP se ha eliminado. Esta hebra no puede crecer en el medio M63 porque requiere proporcionar exógenamente aminoácidos aromáticos. La presencia de un cósmico que contiene un gen de sintasa EPSP puede complementar genéticamente el fenotipo aroA, esto es, permitir que la hebra crezca en el medio M63 sin proporcionar exógenamente los aminoácidos aromáticos.

Las células transfectadas se colocaron en placas en el medio agar M63 conteniendo 50 µg/ml de kamamicina del medio agar M63 conteniendo 100 mM de KH2P04, 15 mM de (NH4)2S04, 50 µM de CaCI2, 1 µM de FeS04, 50 µM de MgCI2, 55 mM de glucosa, 25 mg/litro de L-prolina, 10 mg/litro de HCl de tiamina, NaOH suficiente para ajustar el pH a 7.0 y 15 g/litro de agar. Dos colonias que crecieron en este medio se identificaron. El ADN cosmido se preparó de cada una de estas colonias y se re-transformaron en células E. coli aroA. En cada caso, las células re-transformadas con el ADN cosmido crecieron en el medio M63 en la presencia de 0 o 10 mM de glifosato mientras que las células que contienen el vector SuperCos vacío no crecieron. Esto confirma que los cosmidos son capaces de complementar el fenotipo aroA y son capaces de conferir la resistencia al glifosato. Estos cosmidos se nombran pAX1100 y pAX1101. Los cosmidos parecen ser idénticos por el análisis de digestión por restricción usando dos enzimas diferentes. Un cosmido, pAX1101 se seleccionó para caracterización adicional.

Eiemplo 10. Identificación de grg12 en el Cosmido pAX1101 Para identificar el gen responsable para la resistencia con el glifosato mostrada por el cosmido pAX1101 , el ADN de este clon se muto con elementos transportables. En este método, uno identifica los clones que han sufrido inserciones transposon y tienen pérdida en la habilidad de conferir resistencia al glifosato. La ubicación de las inserciones del transposon identifica el cuadro de lectura abierta responsable del fenotipo con resistencia al glifosato.

El cosmido pAX1 101 se sometió a mutagénesis de transposon in vitro usando un Equipo de Inserción EZ::TN (Epicentro, Madison, Wl) y el protocolo del fabricante. Este proceso aleatoriamente inserta el fragmento transposon en el ADN cosmido y además aleatoriamente interrumpe la función de los genes en el cosmido. Los transposons contienen un gen que codifica la resistencia a un antibiótico, de manera que los clones de inserción transposon pueden seleccionarse por la habilidad para crecer en la presencia de ese antibiótico. Las ubicaciones de las inserciones del transposon pueden determinarse mediante el mapeo por el fragmento de restricción o mediante la secuenciación con los iniciadores que se endurecen en el transposon.

Los clones de inserción del transposon de pAX1101 se transformaron en la hebra E. coli DH5a y se colocaron en placas en el medio M63 conteniendo glifosato. Los clones múltiples se encontraron que tienen la habilidad para crecer en la presencia del glifosato, indicando que el transposon ha interrumpido el gen responsable para la resistencia.

La secuencia de ADN se determinó para la región de pAX1101 conteniendo las inserciones de transposon usando los métodos de secuenciación bien conocidas en la técnica y está presente como SEC ID N0:9. Un cuadro de lectura abierta (ORF) se identificó en las bases 46 hasta 1380 de la SEC ID NO:9. Esta secuencia de nucleótido se proporciona como SEC ID NO:57 y la secuencia de aminoácido correspondiente se proporciona como SEC ID NO:58. El análisis de los datos de secuencia de ocho picos de inserción de transposon que ha perdido la resistencia al glifosato reveló que todos están dentro de ORF. Esto indica que el ORF codifica la resistencia al glifosato conferido por el cosmido. Este gen se nombró grg12. El cosmido pAX1101 conteniendo el ORF grg12 se depositó en la Colección de Cultivo de Servicio de Búsqueda Agrícola (NRRL) Abril 4, 2005 y se asignó con el Número de Acceso B-30833.

Eiemplo 11. Homología de GRG12 con Otras Proteínas El GRG12 tiene homología para las enzimas de sintasa EPSP. Una alineación de la secuencia de aminoácido GRG12 (SEC ID NO:10) con las secuencias de aminoácido de otras sintasas EPSP se muestra en la Figura 1. La Tabla 3 lista el porcentaje de identidad de GRG12 para varias sintasas EPSP. El examen de la secuencia de aminoácido (SEC ID NO. O) reveló que no contiene los cuatro dominios típicos de las enzimas de sintasa EPSP de Clase II. Además es una sintasa EPSP resistente al glifosato de no Clase II novedoso.

El GRG12 tiene homología de aminoácido mayor a un EPSPS descrito en WO2005014820 (SEC ID NO:54). GRG12 (SEC ID NO:10) tiene 92% de identidad de aminoácido para el EPSOS descrito en WO2005014820.

Tabla 3. Identidad del Aminoácido de GRG12 para Otras Sintasas EPSP El análisis adicional para la secuencia de ADN grg12 (SEC ID NO:9) reveló la presencia de un segundo cuadro de lectura abierta más pequeño (SEC ID NO:58) iniciando con un codón de inicio GRG en el nucleótido de la SEC ID NO:9. La traducción de este cuadro de lectura abierta resulta en una proteína (SEC ID NO:59) que es idéntica para los residuos 33-444 de la SEC ID NO:10, excepto que el codón inicial de la SEC ID NO:59 es una metionina en lugar de la valina presente en la SEC ID NO: 10. La alineación de la SEC ID NO:59 con las proteínas EPSPS conocidas indican que esta proteína contiene todos los residuos conocidos para ser críticos para la función como un EPSPS. Además, esta proteína comúnmente es para comprender una enzima EPSPS resistente al glifosato funcional, en donde una proteína que resulta de la iniciación de la traducción de un codón inicial interno para los dominios altamente conservados sería poco probable para ser funcional. La SEC ID NO:59 es 97% idéntica al EPSPS descrito en WO2005014820 (SEC ID NO:54).

La habilidad de ambos cuadro de lectura (SEC ID NO:57 y 58) para codificar la actividad EPSPS funcional puede probarse mediante amplificar cada cuadro de lectura mediante el PCR, la clonación de los fragmentos PCR resultantes en un vector plásmido bajo el control de un promotor apropiado, induciendo la expresión de la proteína del cuadro de lectura abierto como se conoce en la técnica y comparando la habilidad de la proteína expresada para el complemento del fenotipo aroA en E. coli y para conferir la resistencia al glifosato.

Eiemplo 12. Preparación del grg12 para la Expresión de la proteína GRG12 en E. coli El cuadro de lectura abierta grg12 (ORF) se amplificó por PCR, se clonó en una versión ligeramente modificada del vector plásmido pUC18 y se transformó en la hebra DH5a E. coli. Las modificaciones para pUC18 fueron como sigue: un codón de detención se insertó en el cuadro de lectura abierta lacZ y un sitio de enlace ribosoma (para optimizar la iniciación de la traducción del grg12 insertado ORF) se insertó ascendente del sitio de restricción Samll. El ADN del plásmido se preparó y la presencia y orientación de la inserción grg12 se determinó por la digestión de restricción. Un clon que contiene el ORF en la orientación delantera con respecto al promotor lac en el vector se nombró pAX1 106 y se probó para la habilidad de conferir resistencia a las células E. coli del glifosato protegiendo el pAX1 106 o el plásmido de vector vacío se alineo en las placas de agar M63 conteniendo 0 a 200 mM de glifosato. Los resultados se presentaron en la Tabla 4 posterior. Estos resultados demostraron que el grg12 confiere resistencia a los altos niveles de glifosato.

Tabla 4. Crecimiento de pAX1106 en el Agar del Glifosato M63 Eiemplo 13. Purificación de GRG12 Expresado como una proteína señalada 6xHis en E. coli La región de codificación grg12 se amplificó mediante PCR usando la polimerasa de ADN PFUULTRATM (Stratagene). Los oligonucleótidos usados para iniciar la PCR se designan para introducir los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción cerca de los extremos 5' y 3' del producto PCR resultante. El producto PCR resultante se digirió con las enzimas de restricción apropiadas y el producto digerido se clonó en el vector de expresión 6xHis-tag pRSFIb (Novagen). El clon resultante contiene grg12 en el mismo cuadro de lectura de translación como e inmediatamente la terminal C para el 6xHis tag. Las estrategias generales para generar dicho clones y para expresar las proteínas que contienen el 6xHis tag son bien conocidas en la técnica.

El nivel de expresión de la proteína GRG12 puede determinarse en un gel de proteína SDS-PAGE. La proteína GRG12 puede aislarse mediante la purificación de la proteína GRG12 inducida mediante cromatografía en por ejemplo, la Resina Ni-NTA Superflow (Qiagen) como por las instrucciones del fabricante.

Eiemplo 14: Aislamiento de ATX4150 El ATX4150 se aisló mediante las muestras en placas de tierra en un Medio Mínimo Enriquecido (EMM) conteniendo glifosato como la única fuente de fósforo. Dado que el EMM no contiene aminoácidos aromáticos, una hebra puede ser resistente al glifosato para cultivarse en este medio.

Dos gramos de tierra se suspendieron en aproximadamente 30 ml de agua y se sonicaron por 30 segundos en un baño de agua del sonicador Acuasónico. La muestra se agitó por vórtex por 5 segundos y se permitió establecer por 60 segundos. Este proceso se repitió 3 veces. 100 µl de esta suspensión se agregaron a 3 ml de EMM suplementado con 4 mM de glifosato (pH 6.0). El EMM contiene (por 900 mols): 10 g de sucrosa, 2 g de NaN03, 1.0 ml 0.8 M de MgS04, 1.0 ml 0.1 M de CaCI2, 1.0 ml de Solución de Oligoelementos (en 100 ml de solución 1000x: 0.1 g FeS04.7H20, 0.5 mg de CuS04.5H20, 1.0 mg H3B03, 1.0 mg de MnS04.5H20, 7.0 mg ZnS0 .7H20, 1.0 mg Mo03, 4.0 g (KCl). El cultivo se agitó en un tambor de rodillo en un cultivo de tejido por dieciséis días a 21 °C y posteriormente 100 µl se usaron para inocular 3 ml de EMM fresco conteniendo 4 mM de glifosato como la única fuente de fósforo. Después de cinco días, 100 µl se usaron para inocular otros 3 ml frescos de cultivo. Después de pocos días, el cultivo se colocó en placas en el medio sólido mediante listar un 1 µl del loop en la superficie de la placa de agar conteniendo agar EMM conteniendo 5 mM de glifosato como la única fuente de fósforo. Después de pocos días, las colonias se volvieron a poner en placas para el asilamiento en EMM conteniendo 5 mM de glifosato como la única fuente de fósforo. Una hebra particular, designada ATX4150 se seleccionó debido a su habilidad para crecer en la presencia de altas concentraciones de glifosato.

Eiemplo 15. Preparación y Análisis de las Bibliotecas de Cosmido El ADN total se extrajo del cultivo de ATX4150 usando los métodos comúnmente conocidos en la técnica. El ADN parcialmente se digirió con enzima de restricción Sau3A1 y se ligó con el fragmento del vector SuperCos (Stratagene) de conformidad con las direcciones del fabricante. Los productos de ligación se empacaron en partículas fago usando el extracto de empaquetamiento GigaPack lll XL (Stratagene), se transfectaron en las células E. coli aroA, E. coli aroA, es una hebra en la cual el gen nativo aroA, que codifica la sintasa EPSP se ha eliminado. Esta hebra no puede crecer en el medio M63 porque requiere aminoácidos aromáticos exógenamente suplementados. La presencia de un cosmido que contiene un gen de sintasa EPSP puede completar genéticamente el fenotipo aroA, esto es, permite que la hebra crezca en el medio M63 sin aminoácidos aromáticos exógenamente suplementados.

Las células transfectadas se colocaron en placas en el medio agar M63 conteniendo 50 µg/ml de kanamicina, el medio agar M63 contiene 100 mM de KH2P04, 15 mM de (NH4)2S04, 50 µM de CaCI2, 1 µM de FeS04, 50 µM de MgCI2, 55 mM de glucosa, 25 mg/litro de L-prolina, 10 mg/litro de HCl de tiamina, NaOH suficiente par ajustar el pH a 7.0 y 15 g/litro de agar. Las cinco colonias que crecieron en este medio se identificaron. El ADN del cosmido se preparó de cada una de estas colonias y se re-transformó en las células E. coli aroA. En cada caso las células retransformadas con el ADN cosmido creció en el medio M63 en la presencia de 0 ó 10 mM de glifosato mientras las células que contiene el vector SuperCos vacío no. Esto confirma que los cósmidos son capaces de complementar el fenotipo aroA y capaces de conferir resistencia al glifosato. Un cosmido se seleccionó para caracterización adicional y se nombró pAX305.

Eiemplo 16. Identificación de grgld en el Cosmido pAX305 Para identificar los genes responsables para la resistencia al glifosato mostrada por el cosmido pAX305, el ADN de este clon se mutó con elementos transportables. El cosmido pAX305 se sometió a mutagénesis de transposon in vitro usando un Equipo de Inserción EZ::TN (Epicentre, Madison, Wl) y el protocolo del fabricante. Los clones de inserción transposon de pAX305 se transformaron en E. coli y se colocaron en placas en el medio M63 conteniendo glifosato. Los clones múltiples se encontraron que tienen pérdida de la habilidad para crecer en presencia del glifosato indicando que el transposon ha interrumpido el gen responsable para la resistencia.

La secuencia de ADN se determinó para la región de pAX305 conteniendo las inserciones del transposon usando los métodos de secuenciación bien conocidos en la técnica y se presentan en la SEC ID NO:61. Un cuadro de lectura abierta (ORF, bases de nucleótido 77 hasta 1354 de la SEC ID NO:61 ) se identificó. El análisis de los datos de la secuencia de ocho picos de inserción de transposon que conducen a la resistencia al glifosato revela que todos están dentro del ORF. Esto indica que el ORF codifica la resistencia al glifosato conferida por el cosmido. Este gen se nombra grgld. El cosmido pAX305 conteniendo el grgld ORF (SEC ID NOJ 1) se depositó en la Colección de Cultivo del Servicio de Búsqueda Agrícola (NRRL) en Abril 20, 2005 y se asignó al Número de Acceso NRRL-30838.

Eiemplo 17: Homología de GRG15 con las Otras Proteínas El GRG15 tiene homología para las enzimas de la sintasa EPSP. Una alineación de la secuencia de aminoácido GRG15 (SEC ID NO:12) con las secuencias de aminoácido de las otras sintasas EPSP se muestra en la Figura 1. La Tabla 5 lista el porcentaje de identidad del GRG15 para varias sintasas EPSP. El examen de la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO:12) reveló que no contiene los cuatro dominios típicos de las enzimas de sintasa EPSP Clase II. Además, esta es una sintasa EPSP resistente al glifosato de no Clase II novedosa.

Tabla 5. Identidad del Aminoácido de GRG15 para Otras Sintasas EPSP Eiemplo 18. Blogues de Homología entre las enzimas no clase II resistentes al Glifosato (Clase lll) La comparación de las secuencias de aminoácido de las proteínas GRG (proteínas resistentes al Glifosato no clase II) muestran que las proteínas GRG tienen homología significante unas con otras y son distintas de las sintasas EPSP resistentes al glifosato previamente identificadas (ver la Figura 1 ).

Eiemplo 19. Identificación de los Dominios Conservados Las secuencias de aminoácidos de siete sintasas EPSP conocidas se analizaron para los dominios conservados que no están presentes en las sintasas EPSP clase I o clase II: Los siguientes dominios se encontraron en estas sintasas EPSP: el tipo en negritas denota los residuos conservados solamente entre esta clase y las cursivas denotan los residuos conservados en todas las enzimas EPSPS.

Dominio I: L-A-K-G-X S-X2-L-X3-G-A-L-K-S-D-D-T (SEC ID NO: 13), en donde X denota lisina o treonina, en donde X2 denota arginina o histidina, en donde X3 denota serina o treonína.

Dominio la: L-A-K-G-Xi (SEC ID NO: 14), en donde X! denota lisina o treonina.

Dominio Ib: S-Xi-L-X? (SEC ID NO: 15), en donde X denota arginina o histidina, en donde X2 denota serina o treonina.

Dominio le: G-A-L-K-S-D-D-T (SEC ID NO.16) Dominio II: E-P-D-XrXz-T-F-Xa-VJ -Xs-Xe-G (SEC ID NO: 17), en donde X denota ácido aspártico o alanina, en donde X2 denota serina o treonina, en donde X3 denota valina o isoleucina, en donde X4 denota treonina o ácido glutámico o lisina, en donde X5 denota serina o glicina, en donde X6 denota glutamina o serina o ácido glutámico o treonina.

Dominio lla: E-P-D-Xi-X?-T-F-Xa (SEC ID NO:18), en donde X denota ácido aspártico o alanina, en donde X2 denota serina o treonina, en donde X3 denota valina o isoleucina.

Dominio llb: XrX2-X3-G (SEC ID NO: 19), en donde X^ denota treonina o ácido glutámico o lisina, en donde X2 denota serina o glicina, en donde X3 denota glutamina o serina o ácido glutámico o treonina.

Dominio lll: RFLTAA (SEC ID NO:20) Dominio IV: KRPI(G/M)P (SEC ID NO:21 ) K-R-P-l-XrP, en donde X denota glicina o metionina o leucina.

Dominio VI: l-G-A-XrG-Y-X2-D-L-T (SEC ID NO:23), en donde X^ denota arginina o lisina o leucina, y en donde X2 denota isoleucina o valina.

Dominio Vil: WJ V-X2-X3-T-G (SEC ID NO:24), en donde X denota arginina o lisina, en donde X2 denota alanina o histidina o ácido glutámico o serina, en donde X3 denota prolina o alanina.

Dominio VIII: E-P-D-A-S-A-A-T-Y-L-W-X A-Xz-Xa-L (SEC ID NO:25), en donde X, denota alanina o glicina, en donde X2 denota ácido glutámico o glutamina, en donde X3 denota valina o leucina o alanina.

Dominio Villa: E-P-D-A-S-A-A-T-Y-L-W (SEC ID NO:26) Dominio IX: l-D-XrG (SEC ID NO:27), en donde X denota isoleucina o leucina.

Dominio X: F-XrQ-P-D-A-K-A (SEC ID NO:28), en donde X1 denota treonina o serina, Dominio XI: X1-F-P-X2-X3-X4-A-X5-X6-X7-G-S-Q-M-Q-D-A-l-P-T-X8-A-V-X9-A-A-F-N (SEC ID NO:29), en donde Xi denota glutamina o lisina o serina, en donde X2 denota asparagina o histidina, en donde X3 denota metionina o leucina, en donde X4 denota prolina o glutamina, en donde X5 denota treonina o ácido glutámico o valina, en donde X6 denota valina o isoleucina, en donde X7 denota ácido aspártico o valina, en donde X8 denota leucina o isoleucina, en donde X9 denota leucina o isoleucina.

Dominio Xla: X F-P-Xz-Xs- t-A (SEC ID NO:30), en donde X! denota glutamina o lisina o serina, en donde X2 denota asparagina o histidina, en donde X3 denota metionina o leucina, en donde X denota prolina o glutamina.

Dominio Xlb: X Xz-Xa-G-S-Q-M-Q-D-A-l-P-T^-A-V-Xs-A-A-F-N (SEC ID NO:31 ), en donde X denota treonina o ácido glutámico o valina, en donde X2 denota valina o isoleucina, en donde X3 denota ácido aspártico o valina, en donde X4 denota leucina o isoleucina, en donde X5 denota leucina o isoleucina.

Dominio XIc: G-S-Q-M-Q-D-A-l-P-T (SEC ID NO:32) Dominio XII: P-V-R-F-X Xz-Xa^-N-L-R-V-K-E-C-D-R-Xg (SEC ID NO:33), en donde X denota valina o treonina, en donde X2 denota ácido glutámico o glicina, en donde X3 denota leucina o isoleucina, en donde X4 denota alanina o ácido glutámico, en donde X5 denota isoleucina o valina.

Dominio Xlla: P-V-R-F (SEC ID NO:34) Dominio Xllb: X Xz-Xa^-N-L-R-V-K-E-C-D-R-Xs (SEC ID NO:35), en donde X, denota valina o treonina, en donde X2 denota ácido glutámico o glicina, en donde X3 denota leucina o isoleucina, en donde X4 denota alanina o ácido glutámico, en donde X5 denota isoleucina o valina.

Dominio Xllc: N-L-R-V-K-E-C-D-R (SEC ID NO:36) Dominio Xlll: E-G-D-D-L-XrX? (SEC ID NO:37), en donde X1 denota leucina o isoleucina, en donde X2 denota valina o isoleucina.

Dominio XIV: X P-X2-L-A-G (SEC ID NO:38), en donde X denota ácido aspártico o asparagina, en donde X2 denota alanina o serina o treonina.

Dominio XV: A-X1-l-D-X2-X3-X4-D-/-/-R (SEC ID NO:39), en donde X denota leucina o serina o ácido glutámico, en donde X2 denota treonina o serina, en donde X3 denota histidina o fenilalanina, en donde X4 denota alanina o serina.

Dominio XVI: F-A-L-A-X L-K-X2-X3-G-l (SEC ID NO:40), en donde X denota glicina o alanina, en donde X2 denota isoleucina o valina, en donde X3 denota serina o glicina o alanina o lisina.

Dominio XVIa: F-A-L-A-X L-K (SEC ID NO:41 ), en donde X, denota glicina o alanina.

Dominio XVIb: L-K-XrXz-G-l (SEC ID NO:42), en donde X! denota isoleucina o valina, en donde X2 denota serina o glicina o alanina o lisina.

Dominio XVII: (SEC ID NO:43) en donde X, denota asparagina o ácido aspártico, en donde X2 denota alanina o ácido aspártico, en donde X3 denota alanina o glicina.

Dominio XVlll: XrS-L-G-V (SEC ID NO:44), en donde X! denota alanina o serina o prolina.

Eiemplo 20: Tratamiento del grg12 para la Transformación de Plantas El cuadro de lectura abierta grg12 (ORF) se amplificó por PCR de una plantilla de cADN de longitud completa. Los sitios de restricción Hind lll se agregaron a cada extremo del ORF durante el PCR. Adicionalmente, la secuencia de nucleótido ACC se agregó inmediatamente 5' al codón inicial del gen para incrementar la eficiencia translacional (Kozak (1987) Nucleic Acids Research 15:8125-8148; Joshi (1987) Nucleic Acids Research 15:6643-6653). El producto PCR se clonó y se secuenció, usando las técnicas bien conocidas en la técnica, para asegurar que las no mutaciones se introdujeron durante la PCR.

El plásmido conteniendo el producto PCR grg12 se digirió con, por ejemplo, Hind lll y el fragmento conteniendo el ORF intacto se aisló. En este ejemplo, el fragmento se clonó en el sitio Hind lll de un plásmido, tal como pAX200, que es un vector de expresión de la planta conteniendo el promotor de la actina del arroz (McEIroy ef al (1991 ) Molec. Gen. Genet. 231 :150-160) y el terminador Pinll (An ef al (1989) The Plant Cell 1 :115-122). El fragmento terminador del gen promotor de este plásmido intermedio posteriormente se subclonó en un plásmido tal como pSB11 (Japan Tobacco, Ine), para formar un plásmido final, con referencia a este documento como pSB11 GRG12. El pSB11GRG12 se organizó de manera que el fragmento de ADN conteniendo la construcción del terminador del promotor grg12 puede ejercitarse mediante las enzimas de restricción apropiadas y también usarse para la transformación en plantas, por ejemplo, por inyección de haz de aerosol. La estructura de pSB11GRG12 se verificó por la digestión de restricción y la electroforesis en gel y mediante la secuenciación a través de varias uniones de clonación.

El plásmido se inmovilizó en la hebra Agrobacterium tumefaciens LBA4404 que también encubre el plásmido pSB1 (Japan Tobacco, Inc.) usando los procedimientos de igualación triparenteral bien conocidos en la técnica y colocándolos en placas o medio que contiene el antibiótico. El plásmido pSB11 GRG12 lleva la resistencia a la espectinomicina pero es un plásmido de rango angosto en el huésped y no puede replicarse en Agrobacterium. Las colonias resistentes a los antibióticos surgen cuando el pSB11GRG12 se integra en el plásmido de amplio rango en el huésped pSB1 a través de la recombinación homologa. El producto cointegrado resultante se verifica mediante la hibridación Southern. La hebra Agrobacterium alojando el cointegrado puede usarse para transformar el maíz, por ejemplo mediante el método Purelntro (Japan Tobacco).

Ejemplo 21. Transformación de grg12 en las Células de las Plantas Las hojas del maíz son bien colectadas 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aislaron de las orejas y aquellos embriones de 0.8-1.5 mm en tamaño se prefirieron para usarse en la transformación. Los embriones se colocaron en placas scutellum en el lado superior en un medio de incubación apropiado, tal como medio DN62A5S (3.98 g/L N6 de Sales; 1 mL/L (de 1000x de Existencia) N6 Vitaminas, 800 mg/L L-Asparagina; 100 mg/L Mio-inositol; 1.4 g/L de L-Prolina, 100 mg/L de ácidos casamino; 50 g/L de sucrosa, 1 mL/L (de 1 mg/mL de Existencia) 2,4-D). Sin embargo, el medio y las sales más que el DN62A5S son apropiados y se conocen en la técnica. Los embriones se incubaron durante la noche a 25°C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se para incubar los embriones durante la noche.

Las explantas resultantes se transfirieron a los cuadrados de malla (30-40 por placa), se transfirieron en medio osmótico por aproximadamente 30-45 minutos, posteriormente se transfirieron a una placa de luz (ver, por ejemplo la Publicación de PCT No. WO/0138514 y la Patente Estadounidense 5,240,842).

Las construcciones de ADN designadas para expresar el GRG12 en las células de plantas se aceleraron en el tejido de la planta usando un acelerador de haz en aerosol, usando las condiciones esencialmente como se describen en la Publicación de PCT No. Wo/0138514. Después del haz, los embriones se incubaron por aproximadamente 30 minutos en el medio osmótico y se colocaron en el medio de incubación durante la noche a 25°C en la oscuridad. Para evitar que las plantas con luz se dañen indebidamente, se incubaron por al menos 24 horas antes de la transferencia al medio de recuperación. Los embriones posteriormente se esparcieron en el medio del periodo de recuperación por aproximadamente 5 días, 25°C en la oscuridad, posteriormente se transfirieron a un medio de selección. Las explantas se incubaron en el medio de selección por más de ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, el callo resultante se transfirió al medio de maduración del embrión hasta que la formación de los embriones somáticos maduros se observó. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocaron bajo luz baja y el proceso de regeneración se inició por los métodos conocidos en la técnica. Los brotes resultantes se permitieron para la raíz en el medio de enraizado, y las plantas resultantes se transfirieron a las ollas de crianza y se propagaron como plantas transgénicas.

Materiales Tabla 6. Medio DN62A5S El pH de la solución se ajustó a un pH 5.8 con 1 N de KOH/1 N de KCl, Gertite (Sigma) se agregó en una concentración mayor de 3 g/L y el medio se auto-penetró. Después del enfriamiento a 50°C, se agregaron 2 ml/L de una solución madre de 5 mg/ml de nitrato de plata (Phytotechnology Labs).

Eiemplo 22. Transformación de grg12 en las Células de Plantas de Maíz mediante la Transformación Mediada con Agrobacterium Las orejas se colectaron mejor 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aislaron de las orejas, y aquellos embriones de 0.8-1.5 mm en tamaño se prefirieron para usarse en la transformación. Los embriones se colocaron en placas en el lado superior del scutellum en un medio de incubación apropiado y se incubaron durante la noche a 25°C en la oscuridad. Los embriones se contactaron con una hebra Agrobacterium conteniendo los vectores apropiados para la transferencia del plásmido Ti mediado por aproximadamente 5-10 min y posteriormente se colocaron en placas en el medio de co-cultivo por aproximadamente 3 días (25°C en la oscuridad). Después del co-cultivo, las explantas se transfirieron al medio del periodo de recuperación por aproximadamente cinco días (en 25°C en la oscuridad). Las explantas se incubaron en el medio de selección por más de ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, el callo resultante se transfirió al medio de maduración del embrión, hasta que se observó la formación de los embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes posteriormente se colocaron bajo luz baja y el proceso de regeneración se inició como se conoce en la técnica. A los brotes resultantes se les permitió que echaran raíces en el medio de enraizado y las plantas resultantes se transfirieron a las cacerolas nodrizas y se propagaron como plantas transgénicas.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de los expertos en la técnica a los cuales esta invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en este documento como referencia a la misma extensión como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera indicada específica e individualmente para incorporarse como referencia.

Aunque la invención precedente se ha descrito en algún detalla por medio de ilustración y ejemplo para los propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden practicarse dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido aislado diferente a la secuencia de polinucleótido listada en las SEC ID NOS:1 , 3, 7, 45, 47 y 53 que codifican una enzima EPSPS que tiene al menos un dominio de secuencia seleccionado del grupo que consiste de: Dominio I: L-A-K-G-X S-Xz-L-Xa-G-A-L-K-S-D-D-T (SEC ID NO:13) en donde X, denota lisina o treonina, en donde X2 denota arginina o histidina, en donde X3 denota serina o treonina; Dominio la: L-A-K-G-X,, (SEC ID NO: 14), en donde X^ denota lisina o treonina; Dominio Ib: S-X?-L-X2 (SEC ID NO: 15), en donde X, denota argínina o histidina, en donde X2 denota serina o treonina; Dominio le: G-A-L-K-S-D-D-T (SEC ID NO:16); Dominio II: (SEC ID NO: 17), en donde X, denota ácido aspártico o alanina, en donde X2 denota serina o treonina, en donde X3 denota valina o isoleucina, en donde X, denota treonina o ácido glutámico o lisina, en donde X5 denota serina o glicina, en donde X6 denota glutamina o serina o ácido glutámico o treonina; Dominio lla: E-P-D-XÍ-X2-T-F-X3-V (SEC ID NO:18), en donde X^ denota ácido aspártico o alanina, en donde X2 denota serina o treonina, en donde X3 denota valina o isoleucina; Dominio llb: X1-X2-X3-G (SEC ID NO:19), en donde X^ denota treonina o ácido glutámico o lisina, en donde X2 denota serina o glicina, en donde X3 denota glutamina o serina o ácido glutámíco o treonina; Dominio lll: RFLTAA (SEC ID NO:20); Dominio IV: KRPI(G/M)P (SEC ID NO:21 ) K-R-P-l-XrP, en donde Xi denota glicina o metionina o leucina; Dominio V: XrG-C-P-P-V (SEC ID NO:22), en donde X, denota treonina o serina; Dominio VI: l-G-A-Xi-G-Y-X?-D-L-T (SEC ID NO:23), en donde X, denota arginina o lisina o leucina y en donde X2 denota isoleucina o valina; Dominio Vil: (SEC ID NO:24), en donde X! denota arginina o lisina, en donde X2 denota alanina o histidina o ácido glutámico o serina, en donde X denota prolina o alanina; Dominio VIII: E-P-D-A-S-A-A-T-Y-L-W-X A-X2-X3-L (SEC ID NO:25), en donde X, denota alanina o glicina, en donde X2 denota ácido glutámico o glutamina, en donde X3 denota valina o leucina o alanina; Dominio Villa: E-P-D-A-S-A-A-T-Y-L-W (SEC ID NO:26); Dominio IX: |-D-X G (SEC ID NO:27), en donde X denota isoleucina o leucina; Dominio X: F-X Q-P-D-A-K-A (SEC ID NO:28), en donde X, denota treonina o serina; Dominio XI: Xi-F-P-Xz-Xs^-A-Xs-Xe^-G-S-Q-M-Q-D-A-l-P-T-Xß-A-V-XgA-A-F-N (SEC ID NO:29), en donde X, denota glutamina o lisina o serina, en donde X2 denota asparagina o histidina, en donde X3 denota metionina o leucina, en donde X4 denota prolina o glutamina, en donde X5 denota treonina o ácido glutámico o valina, en donde X6 denota valina o isoleucina, en donde X7 denota ácido aspártico o valina, en donde X8 denota leucina o isoleucina, en donde X9 denota leucina o isoleucina; Dominio Xla: X-1-F-P-X2-X3-X4-A (SEC ID NO:30), en donde X^ denota glutamina o lisina o serina, en donde X2 denota asparagina o histidina, en donde X3 denota metionina o leucina, en donde X denota prolina o glutamina; Dominio Xlb: X Xz-Xs-G-S-Q-M-Q-D-A-l-P-T^-A-V-Xs-A-A-F-N (SEC ID NO:31 ), en donde X, denota treonina o ácido glutámico o valina, en donde X2 denota valina o isoleucina, en donde X3 denota ácido aspártico o valina, en donde X4 denota leucina o isoleucina, en donde X5 denota leucina o isoleucina; Dominio XIc: G-S-Q-M-Q-D-A-l-P-T (SEC ID NO:32); Dominio XII: P-V-R-F-X1-X2-X3-X4-N-L-R-V-K-E-C-D-R-X5 (SEC ID NO:33), en donde X! denota valina o treonina, en donde X2 denota ácido glutámico o glicina, en donde X3 denota leucina o isoleucina, en donde X4 denota alanina o ácido glutámico, en donde X5 denota isoleucina o valina; Dominio Xlla: P-V-R-F (SEC ID NO:34); Dominio Xllb: XrXz-Xs -N-L-R-V-K-E-C-D-R-Xs (SEC ID NO:35), en donde X, denota valina o treonina, en donde X2 denota ácido glutámico o glicina, en donde X3 denota leucina o isoleucina, en donde X4 denota alanina o ácido glutámico, en donde X5 denota isoleucina o valina; Dominio Xllc: N-L-R-V-K-E-C-D-R (SEC ID NO:36); Dominio Xlll: E-G-D-D-L-X^Xz (SEC ID NO:37), en donde X! denota leucina o isoleucina, en donde X2 denota valina o isoleucina; Dominio XIV: X1-P-X2-L-A-G (SEC ID NO:38), en donde X^ denota ácido aspártico o asparagina, en donde X2 denota alanina o serina o treonina; Dominio XV: A-Xrl-D-X2-X3-X4-DJ7-R (SEC ID NO:39), en donde X, denota leucina o serina o ácido glutámico, en donde X2 denota treonina o serina, en donde X3 denota histidina o fenilalanina, en donde X4 denota alanina o serina; Dominio XVI: F-A-L-A L-K-X2-X3-G-I (SEC ID NO:40), en donde X, denota glicina o alanina, en donde X2 denota isoleucina o valina, en donde X3 denota serina o glicina o alanina o lisina; Dominio XVIa: F-A-L-A-X^L-K (SEC ID NO:41), en donde X, denota glicina o alanina; Dominio XVIb: L-K-X Xz-G-l (SEC ID NO:42), en donde X^ denota isoleucina o valina, en donde X2 denota serina o glicina y Dominio XVlll: -X,-P-X2-C-V-X3-K (SEC ID NO:43), en donde X1 denota asparagina o ácido aspártico, en donde X2 denota alanina o ácido aspártico, en donde X3 denota alanina o glicina. Dominio XVlll: Xi-S-L-G-V (SEC ID NO:44), en donde X! denota alanina o serina o prolina.

2. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de: a) la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO:9, 11 , 55, 57, 58 ó 60 o un complemento del mismo; b) una secuencia de nucleótido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia para la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO:9, 1 1 , 57 ó 59 ó 61 o un complemento de la misma; c) la secuencia de nucleótido con resistencia herbicida de la inserción de ADN del plásmido depositada como los Nos. de Acceso B-30833 ó B-30838 o un complemento de la misma; d) una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:10, 12, 56 ó 59 y e) una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de la secuencia del aminoácido para la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10, 12 ó 59.

3. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho polinucleótido se une a un promotor que funciona en las células de las plantas para causar la producción de una secuencia de ARN que permite la expresión suficiente de la enzima EPSPS codificada para mejorar la tolerancia al glifosato de una célula de planta transformada con el polinucleótido.

4. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, que además comprende una región 3' no traducida que funciona en las células de las plantas para causar la adición de una extensión de los nucleótidos poliadenilados para el extremo 3' de la secuencia de ARN.

5. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, en donde dicho promotor es heterólogo con respecto al polinucleótido.

6. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , en el cual el polinucleótido codifica un polipéptido de fusión que comprende un péptido de tránsito de cloroplasto amino terminal y la enzima EPSPS.

7. Un método para producir las plantas genéticamente transformadas que se toleran hacia el herbicida glifosato, que comprende las etapas de: a) insertar en el genoma de una célula de planta un polinucleótido que comprende: i) un promotor que funciona en las células de plantas para causar la producción de una secuencia de ARN, ii) un polinucleótido más que la secuencia de polinucleótido listada en las SEC ID NOS:7 ó 53 que causa la producción de una secuencia de ARN que codifica una enzima EPSPS que tiene al menos un dominio de secuencia seleccionado del grupo que consiste de: Dominio I: L-A-K-G-X S-Xz-L-Xs-G-A-L-K-S-D-D-T (SEC ID NO: 13) en donde X, denota lisina o treonina, en donde X2 denota arginina o histidina, en donde X3 denota serina o treonina; Dominio la: L-A-K-G-XL (SEC ID NO: 14), en donde X, denota lisina o treonina; Dominio Ib: S-Xi-L-Xz (SEC ID NO: 15), en donde X, denota arginina o histidina, en donde X2 denota serina o treonina; Dominio le: G-A-L-K-S-D-D-T (SEC ID NO: 16); Dominio II: E-P-D-X X2-T-F-X3-V-X4-X5-X6-G (SEC ID NO: 17), en donde X, denota ácido aspártico o alanina, en donde X2 denota serina o treonina, en donde X3 denota valina o isoleucina, en donde X, denota treonina o ácido glutámico o lisina, en donde X5 denota serina o glicina, en donde X6 denota glutamina o serina o ácido glutámico o treonina; Dominio lla: E-P-D-X X2-T-F-X3-V (SEC ID NO: 18), en donde X denota ácido aspártico o alanina, en donde X2 denota serina o treonina, en donde X3 denota valina o isoleucina; Dominio llb: Xi-Xz-Xs-G (SEC ID NO:19), en donde X-) denota treonina o ácido glutámico o lisina, en donde X2 denota serina o glicina, en donde X3 denota glutamina o serina o ácido glutámico o treonina; Dominio lll: RFLTAA (SEC ID NO:20); Dominio IV: KRPI(G/M)P (SEC ID NO:21 ) K-R-P-1-X?-P, en donde X-i denota glicina o metionina o leucina; Dominio V: X G-C-P-P-V (SEC ID NO:22), en donde X! denota treonina o serina; Dominio VI: 1-G-A-XrG-Y-Xz-D-L-T (SEC ID NO:23), en donde X, denota arginina o lisina o leucina y en donde X2 denota isoleucina o valina; Dominio Vil: W-Xi-V-Xz-Xs-T-G (SEC ID NO:24), en donde Xi denota arginina o lisina, en donde X2 denota alanina o histidina o ácido glutámico o serina, en donde X2 denota prolina o alanina; Dominio VIII: E-P-D-A-S-A-A-T-Y-L-W-X A-Xz-Xa-L (SEC ID NO:25), en donde X, denota alanina o glicina, en donde X2 denota ácido glutámico o glutamina, en donde X3 denota valina o leucina o alanina; Dominio Villa: E-P-D-A-S-A-A-T-Y-L-W (SEC ID NO:26); Dominio IX: 1-D-X?-G (SEC ID NO:27), en donde X, denota isoleucina o leucina; Dominio X: F-X^Q-P-D-A-K-A (SEC ID NO:28), en donde X^ denota treonina o serina; Dominio XI: XrF-P-X2-X3-X4-A-X5-X6-X7-G-S-Q-M-Q-D-A-l-P-T-X8-A-V-X9A-A-F-N (SEC ID NO:29), en donde X, denota glutamina o lisina o serina, en donde X2 denota asparagina o histidina, en donde X3 denota metionina o leucina, en donde X4 denota prolina o glutamina, en donde X5 denota treonina o ácido glutámico o valina, en donde X6 denota valina o isoleucina, en donde X7 denota ácido aspártico o valina, en donde Xß denota leucina o isoleucina, en donde X9 denota leucina o isoleucina; Dominio Xla: X F-P^-XsO -A (SEC ID NO:30), en donde X, denota glutamina o lisina o serina, en donde X2 denota asparagina o histidina, en donde X3 denota metionina o leucina, en donde X4 denota prolina o glutamina; Dominio Xlb: Xi-Xz-Xs-G-S-Q-M-Q-D-A-l-P-T-XcA-V-Xs-A-A-F-N (SEC ID NO:31 ), en donde Xi denota treonina o ácido glutámico o valina, en donde X2 denota valina o isoleucina, en donde X3 denota ácido aspártico o valina, en donde X4 denota leucina o isoleucina, en donde X5 denota leucina o isoleucina; Dominio XIc: G-S-Q-M-Q-D-A-l-P-T (SEC ID NO:32); Dominio XII: p.V-R-F-X1-X2-X3-X4-N-L-R-V-K-E-C-D-R-X5 (SEC ID NO:33), en donde Xi denota valina o treonina, en donde X2 denota ácido glutámico o glicina, en donde X3 denota leucina o isoleucina, en donde X» denota alanina o ácido glutámico, en donde X5 denota isoleucina o valina; Dominio Xlla: P-V-R-F (SEC ID NO:34); Dominio Xllb: Xi-Xz-Xs-X^N-L-R-V-K-E-C-D-R-Xg (SEC ID NO:35), en donde X, denota valina o treonina, en donde X2 denota ácido glutámico o glicina, en donde X3 denota leucina o isoleucina, en donde X denota alanina o ácido glutámico, en donde X5 denota isoleucina o valina; Dominio Xllc: N-L-R-V-K-E-C-D-R (SEC ID NO:36); Dominio Xlll: E-G-D-D-L-XrXz (SEC ID NO:37), en donde Xi denota leucina o isoleucina, en donde X2 denota valina o isoleucina; Dominio XIV: XrP-Xz-L-A-G (SEC ID NO:38), en donde Xi denota ácido aspártico o asparagina, en donde X2 denota alanina o serina o treonina; Dominio XV: A-XH-D-X2-X.3-X4-DJ-/-R (SEC ID NO:39), en donde X^ denota leucina o serina o ácido glutámico, en donde X2 denota treonina o serina, en donde X3 denota histidina o fenilalanina, en donde X4 denota alanina o serina; Dominio XVI: F-A-L-A-X L-K-X2-X3-G-l (SEC ID NO:40), en donde X denota glicina o alanina, en donde X2 denota isoleucina o valina, en donde X3 denota serina o glicina o alanina o lisina; Dominio XVIa: F-A-L-A-X1-L-K (SEC ID NO:41 ), en donde X, denota glicina o alanina; Dominio XVIb: L-K-X Xz-G-l (SEC ID NO:42), en donde X! denota isoleucina o valina, en donde X2 denota serina o glicina y Dominio XVlll: -X P-X?-C-V-Xs-K (SEC ID NO:43), en donde X1 denota asparagina o ácido aspártico, en donde X2 denota alanina o ácido aspártico, en donde X3 denota alanina o glicina. Dominio XVlll: XrS-L-G-V (SEC ID NO:44), en donde X, denota alanina o serina o prolina. iii) un polinucleótido no traducido 3' que funciona en las células de plantas para causar la adición de una extensión de nucleótidos poliadenilados para el extremo 3' de la secuencia de ARN; b) obtener una célula de planta transformada y c) regenerar de la célula de planta transformada una planta genéticamente transformada que ha incrementado la tolerancia al herbicida glifosato.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, en donde obtener la planta transformada comprende analizar una tolerancia mejorada para el herbicida glifosato.

9. Un método de conformidad con la reivindicación 7, en el cuál el polinucleótido codifica un polipéptido de fusión que comprende un péptido de tránsito de cloroplasto amino terminal y la enzima EPSPS.

10. Una célula de planta tolerante al glifosato que comprende un polinucleótido heterólogo de conformidad con la reivindicación 1.

11. Una célula de planta tolerante al glifosato de conformidad con la reivindicación 10 seleccionada del grupo que consiste de maíz, arroz, cebada, soja, algodón, remolacha, aceite de semilla de repollo, cañóla, lino, girasol, papa, jitomate, alfalfa, álamo, pino, eucalipto, manzana, lechuga, chícharos, lentejas, uvas y pasto.

12. Una planta tolerante al glifosato que comprende células de planta de conformidad con la reivindicación 10.

13. Semilla transformada de la planta de conformidad con la reivindicación 12.

14. La planta tolerante al glifosato de conformidad con la reivindicación 12, seleccionada del grupo que consiste de maíz, trigo, arroz, cebada, soja, algodón, remolacha, aceite de semilla de repollo, cañóla, lino, girasol, papa, tabaco, jitomate, alfalfa, álamo, pino, eucalipto, manzana, lechuga, chícharos, lentejas, uva y pasto.

15. Un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste de: a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:10, 12, 56 ó 59; b) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO:9, 1 1 , 55, 57, 58 ó 60; c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia para la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10, 12 ó 59, en donde dicho polipéptido tiene actividad de resistencia al herbicida; d) un polipéptido que se codifica por una secuencia de nucleótido esto es al menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO:9, 11 , 57, 58 ó 60, en donde dicho polipéptido tiene actividad con resistencia herbicida y e) un polipéptido que se codifica por la secuencia de nucleótido con resistencia al herbicida de la inserción de ADN del plásmido depositado con los Nos. de Acceso B-30833 ó B-30838.

16. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 15, que además comprende una secuencia de aminoácido heterólogo.

17. Un método para controlar selectivamente la mala hierba en un campo que tiene semillas de plantas o plantas que comprende las etapas de: a) plantar las semillas o plantas que son tolerantes al glifosato, dichas semillas o plantas teniendo integrado en su genoma un polinucleótido que comprende un polinucleótido heterólogo que tiene: i) un promotor que funciona en las células de las plantas para causar la producción de una secuencia de ARn; ii) un polinucleótido diferente a la secuencia de polinucleótido listada en la SEC ID NOJ ó 53 que causa la producción de una secuencia de ARN que codifica una enzima EPSPS que tiene al menos un dominio de secuencia seleccionado del grupo que consiste de: Dominio I: L-A-K-G-XrS-Xz-L-Xa-G-A-L-K-S-D-D-T (SEC ID NO: 13) en donde X^ denota lisina o treonina, en donde X2 denota arginina o histidina, en donde X3 denota serina o treonina; Dominio la: L-A-K-G-XL (SEC ID NO: 14), en donde Xi denota lisina o treonina; Dominio Ib: S-XrL-X2 (SEC ID NO:15), en donde Xi denota arginina o histidina, en donde X2 denota serina o treonina; Dominio le: G-A-L-K-S-D-D-T (SEC ID NO:16); Dominio II: E-P-D-XrX?-T-F-Xa-V-X^- Xs-Xe-G (SEC ID NO: 17), en donde X denota ácido aspártico o alanina, en donde X2 denota serina o treonina, en donde X3 denota valina o isoleucina, en donde X, denota treonina o ácido glutámico o lisina, en donde X5 denota serina o glicina, en donde X6 denota glutamina o serina o ácido glutámico o treonina; Dominio lla: E-P-D-XrXz-T-F-X3-V (SEC ID NO:18), en donde Xi denota ácido aspártico o alanina, en donde X2 denota serina o treonina, en donde X3 denota valina o isoleucina; Dominio llb: X X?-Xs-G (SEC ID NO:19), en donde X, denota treonina o ácido glutámico o lisina, en donde X2 denota serina o glicina, en donde X3 denota glutamina o serina o ácido glutámico o treonina; Dominio lll: RFLTAA (SEC ID NO:20); Dominio IV: KRPI(G/M)P (SEC ID NO:21 ) K-R-P-l-X P, en donde X^ denota glicina o metionina o leucina; Dominio V: X G-C-P-P-V (SEC ID NO:22), en donde X, denota treonina o serina; Dominio VI: l-G-A-XrG-Y-Xz-D-L-T (SEC ID NO:23), en donde X^ denota arginina o lisina o leucina y en donde X2 denota isoleucina o valina; Dominio Vil: W-X V-X?-Xs-T-G (SEC ID NO:24), en donde X! denota arginina o lisina, en donde X2 denota alanina o histidina o ácido glutámico o serina, en donde X2 denota prolina o alanina; Dominio VIII: E-P-D-A-S-A-A-T-Y-L-W-X A-X2-X3-L (SEC ID NO:25), en donde X, denota alanina o glicina, en donde X2 denota ácido glutámico o glutamina, en donde X3 denota valina o leucina o alanina; Dominio Villa: E-P-D-A-S-A-A-T-Y-L-W (SEC ID NO:26); Dominio IX: l-D-X G (SEC ID NO:27), en donde X-\ denota isoleucina o leucina; Dominio X: F-XrQ-P-D-A-K-A (SEC ID NO:28), en donde X, denota treonina o serina; Dominio XI: X F-P-Xz-Xa^-A-Xs-Xe^-G-S-Q-M-Q-D-A-l-P-T-Xg-A-V-XgA-A-F-N (SEC ID NO:29), en donde X-denota glutamina o lisina o serina, en donde X2 denota asparagina o histidina, en donde X3 denota metionina o leucina, en donde X4 denota prolina o glutamina, en donde X5 denota treonina o ácido glutámico o valina, en donde Xß denota valina o isoleucina, en donde X7 denota ácido aspártico o valina, en donde X8 denota leucina o isoleucina, en donde X9 denota leucina o isoleucina; Dominio Xla: X F-P-X2-X3-X4-A (SEC ID NO:30), en donde X^ denota glutamina o lisina o serina, en donde X2 denota asparagina o histidina, en donde X3 denota metionina o leucina, en donde X4 denota prolina o glutamina; Dominio Xlb: X X2-X3-G-S-Q-M-Q-D-A-l-P-T-X4-A-V-X5-A-A-F-N (SEC ID NO:31 ), en donde X denota treonina o ácido glutámico o valina, en donde X2 denota valina o isoleucina, en donde X3 denota ácido aspártico o valina, en donde X4 denota leucina o isoleucina, en donde X5 denota leucina o isoleucina; Dominio XIc: G-S-Q-M-Q-D-A-l-P-T (SEC ID NO:32); Dominio XII: P-V-R-F-X1-X2-X3-X4-N-L-R-V-K-E-C-D-R-X5 (SEC ID NO:33), en donde X, denota valina o treonina, en donde X2 denota ácido glutámico o glicina, en donde X3 denota leucina o isoleucina, en donde X4 denota alanina o ácido glutámico, en donde X5 denota isoleucina o valina; Dominio Xlla: P-V-R-F (SEC ID NO:34); Dominio Xllb: X Xz-XaJ N-L-R-V-K-E-C-D-R-Xg (SEC ID NO:35), en donde X, denota valina o treonina, en donde X2 denota ácido glutámico o glicina, en donde X3 denota leucina o isoleucina, en donde X4 denota alanina o ácido glutámico, en donde X5 denota isoleucina o valina; Dominio Xllc: N-L-R-V-K-E-C-D-R (SEC ID NO:36); Dominio Xlll: E-G-D-D-L-Xi-Xz (SEC ID NO:37), en donde X, denota leucina o isoleucina, en donde X2 denota valina o isoleucina; Dominio XIV: XrP-X2-L-A-G (SEC ID NO:38), en donde X, denota ácido aspártico o asparagina, en donde X2 denota alanina o serina o treonina; Dominio XV: A-Xr\-D-X2-X3-X4-D-H-R (SEC ID NO:39), en donde X^ denota leucina o serina o ácido glutámico, en donde X2 denota treonina o serina, en donde X3 denota histidina o fenilalanina, en donde X, denota alanina o serina; Dominio XVI: F-A-L-A-X L-K-Xz-X3-G-l (SEC ID NO:40), en donde Xt denota glicina o alanina, en donde X2 denota isoleucina o valina, en donde X3 denota serina o glicina o alanina o lisina; Dominio XVIa: F-A-L-A-X L-K (SEC ID NO:41 ), en donde X! denota glicina o alanina; Dominio XVI b: L-K-X X2-G-l (SEC ID NO:42), en donde X! denota isoleucina o valina, en donde X2 denota serina o glicina y Dominio XVlll: -X?-P-X2-C-V-X3-K (SEC ID NO:43), en donde X1 denota asparagina o ácido aspártico, en donde X2 denota alanina o ácido aspártico, en donde X3 denota alanina o glicina. Dominio XVlll: XrS-L-G-V (SEC ID NO:44), en donde X! denota alanina o serina o prolina. iii) un polinucleótido no traducido que funciona en las células de la planta para causar la adición de una resistencia de nucleótidos poliadenilados para el extremo 3' de la secuencia ARN y b) aplicar a las plantas y mala hierba en el campo una cantidad suficiente de herbicida glifosato para controlar la mala hierba sin afectar significativamente a las plantas.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde dicha planta o semillas de plantas comprende una planta de cosecha.

19. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde dicho promotor es heterólogo con respecto al polinucleótido y adaptado para causar suficiente expresión de la enzima EPSPS para mejorar la tolerancia al glifosato de la planta transformada con el polinucleótido.

20. Un método para producir una planta genéticamente transformada que es tolerante hacia el herbicida glifosato, que comprende las etapas de: a) insertar en el genoma de una célula de la planta el polinucleótido de la reivindicación 1 ; b) obtener las célula de las plantas transformadas y c) regenerar de la célula de la planta transformada una planta genéticamente transformada que tiene tolerancia incrementada hacia el herbicida glifosato.

21. Un método para producir plantas genéticamente transformadas que son tolerantes al glifosato, comprendiendo la transformación de las células de las plantas con una construcción de ADN que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOS:1 , 3, 9, 11 , 45, 47, 55, 57, 58 ó 60 y regenerar una planta transformada.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21 , en donde dicha construcción de ADN además comprende un promotor que funciona en las células de las plantas para causar la producción de una secuencia ARN que permite la expresión suficiente de la enzima EPSPS codificada para mejorar la tolerancia al glifosato de una célula de planta transformada con el polinucleótido.

23. El método de conformidad con la reivindicación 21 , en la cual el polinucleótido codifica un polipéptido de fusión que comprende un péptido de tránsito de cloroplasto amino terminal y la enzima EPSPS.

24. Una célula de planta tolerante al glifosato que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEC ID NOS:1 , 3, 9, 11 , 45, 47, 55, 57, 58 y 60.

25. La célula de planta tolerante al glifosato de conformidad con la reivindicación 24 seleccionada del grupo que consiste de maíz, trigo, arroz, cebada, soja, algodón, remolacha, aceite de semilla de repollo, cañóla, lino, girasol, papa, tabaco, jitomate, alfalfa, álamo, pino, eucalipto, manzana, lechuga, chícharos, lentejas, uvas y pasto.

26. Una planta tolerante al glifosato que comprende células de plantas de conformidad con la reivindicación 24.

27. La planta tolerante al glifosato de conformidad con la reivindicación 26, seleccionada del grupo que consiste de maíz, trigo, arroz, cebada, soja, algodón, remolacha, aceite de semilla de repollo, cañóla, lino, girasol, papa, tabaco, jitomate, alfalfal, álamo, pino, eucalipto, manzana, lechuga, chícharos, lentejas, uva y pasto.

28. Semillas transformadas de la planta de conformidad con la reivindicación 26.

29. Un método para controlar selectivamente la mala hierba en un campo que tiene semillas o plantas plantadas que comprende las etapas de: a) plantar las plantas de la reivindicación 26 o la semilla transformada derivada de las mismas y b) aplicar a las plantas y mala hierba en el campo una cantidad suficiente de herbicida glifosato para controlar la mala hierba sin afectar significativamente las plantas.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, en donde dicha planta o semillas de planta comprende una planta de cosecha.

31. Un método de conformidad con la reivindicación 29, en el cual el polinucleótido codifica un polipéptido de fusión que comprende un péptido de tránsito de cloroplasto amino terminal y la enzima EPSPS.