MX2008015557A

MX2008015557A - Epsp sintasas mejoradas: composiciones y metodos de uso.

Info

Publication number: MX2008015557A
Application number: MX2008015557A
Authority: MX
Inventors: Volker Heinrichs
Original assignee: Athenix Corp
Priority date: 2006-06-13
Filing date: 2007-06-13
Publication date: 2009-01-13
Also published as: AU2007257704A1; RU2008152187A; EP2027270A2; AR061366A1; BRPI0712991A2; WO2007146980A3; NZ573399A; US20070295251A1; WO2007146980A2; CA2659556A1

Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos para conferir tolerancia a glifosato en bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen enzimas EPSP sintasas novedosas y moléculas de ácido nucleico que codifican tales enzimas, vectores que comprenden esas moléculas de ácido nucleico y células huésped que comprenden los vectores.

Description

EPSP SINTASAS MEJORADAS: COMPOSICIONES Y MÉTODOS PE USO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con biología molecular de plantas, particularmente polipéptidos novedosos de EPSP sintasa que confieren resistencia o tolerancia mejorada al herbicida glifosato.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La N-fosfonometilglicina, comúnmente referida como glifosato, es un químico agronómico importante. El glifosato inhibe la enzima que convierte ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y ácido 3-fosfoshiquímico (S3P) a ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico. La inhibición de esta enzima (5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa; referida en este documento como "EPSP sintasa", o "EPSPS") inactiva células vegetales al detener la ruta del shiquimato, inhibiendo en consecuencia la biosíntesis de aminoácidos aromáticos. Puesto que los herbicidas de la clase del glifosato inhiben la biosíntesis de aminoácidos aromáticos, no sólo inactivan células vegetales, sino también son tóxicos para las células bacterianas. El glifosato inhibe muchas EPSP sintasas bacterianas y, de esta manera, es tóxico para estas bacterias. Sin embargo, ciertas EPSP sintasas bacterianas tienen una alta tolerancia al glifosato. Las células vegetales resistentes a toxicidad por glifosato pueden producirse al transformar células vegetales para que expresen EPSP sintasas bacterianas resistentes a glifosato. De manera notable, el gen bacteriano de Agrobacterium tumefaciens cepa CP4 se ha usado para conferir resistencia a herbicidas en células vegetales después de la expresión en plantas. Una EPSP sintasa mutada de Salmonella typhimurium cepa CT7 confiere resistencia a glifosato en células bacterianas, y confiere resistencia a glifosato en células vegetales (Patentes Norteamericanas Nos. 4,535,060; 4,769,061 ; y 5,094,945). Se han aislado variantes de la enzima EPSP sintasa silvestre que son tolerantes a glifosato como resultado de alteraciones en la secuencia codificante de aminoácidos de EPSP sintasa (Kishore and Shah (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:627-63; Wang et al. (2003) J. Plant Res. 116:455-60; Eschenburg ef al. (2002) Planta 216: 129-35). La patente Norteamericana 6,040,497 reporta enzimas EPSP sintasas mutantes de maíz que tienen sustituciones de treonina a isoieucina en la posición 102 y prolina a serina en la posición 106 (la mutación "TIPS". Tales alteraciones confieren resistencia a glifosato a la enzima de maíz. Una EPSP sintasa mutada de Salmonella typhimurium cepa CT7 confiere resistencia a glifosato en células bacterianas, y se reporta que confiere resistencia a glifosato en células vegetales (Patentes Norteamericanas Nos. 4,535,060; 4,769,061 ; y 5,094,945). He et al. ((2001 ) Biochim et Biophysica Acta 1568:1-6) han desarrollado EPSP sintasas con tolerancia incrementada a glifosato por mutagénesis y recombinación entre los genes de EPSP sintasa de E. coli y Salmonella typhimurium, y sugieren que las mutaciones en la posición 42 (T42M) y posición 230 (Q230K) probablemente son responsables de la resistencia observada. Trabajo subsecuente (He ef al. (2003) Biosci. Biotech. Biochem. 67: 1405-1409) muestra que la mutación T42M (treonina a metionina) es suficiente para mejorar la tolerancia de las enzimas de E. coli y Salmonella typhimurium. Debido a las muchas ventajas que proporcionan las plantas con resistencia a herbicidas, los genes de resistencia a herbicidas que mejoran la actividad de resistencia a glifosato son deseables.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para conferir resistencia o tolerancia. Las composiciones incluyen enzimas EPSP sintasas que son resistentes al herbicida glifosato, y moléculas de ácido nucleico que codifican tales enzimas, vectores que comprenden esas moléculas de ácido nucleico y células huésped que comprenden los vectores. Las composiciones de la invención incluyen enzimas EPSP sintasas diferentes a las SEQ ID NO: 1 y 46 que tienen el dominio de secuencia X-C-X-E-S-G-L-S-X-R-X-F-X-P-X (SEQ ID NO: 44), donde X denota cualquier aminoácido. En algunas modalidades, las enzimas EPSP sintasas comprenden el dominio de secuencia D-C-X!^-S-G (SEQ ID NO: 76), en donde X! denota glutamina, valina, prolina, ácido glutámico, isoieucina, metionina o treonina y X2 denota cualquier aminoácido. En otras modalidades, las enzimas EPSP sintasas de la invención comprenden el dominio de secuencia X C-Xz-E-G-L-S-Xa-R-X^F-Xg-P-Xs (SEQ ID NO: 45) donde X1 denota D, K, E, S, G, P, R o N, y X2 denota G, Q, V, D, E, I, N, M, A, T, S o R, y X3 denota I, G, S, M, F o V, X4 denota M, A, S, G, Q, L, V o I, X5 denota T, P, L, G, A, V o I, y X6 denota I, L, C, A, F o M. Las composiciones también incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de resistencia a herbicidas, incluyendo aquellas que codifican polipéptidos diferentes a las SEQ ID NO: 1 y 46 que comprenden las SEQ ID NO: 5-43 y SEQ ID NO: 56-65, así como las secuencias de polinucleótidos de las SEQ ID NO: 3, 4, 66, 67, 74 y 75 y secuencias de polinucleótidos que comprenden las SEQ ID NO: 68-73. Las secuencias codificantes pueden usarse en construcciones de ADN o casetes de expresión para transformación y expresión en organismos, incluyendo microorganismos y plantas. Las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas transformadas que son resistentes a glifosato por la introducción de las composiciones de la invención en el genoma del organismo. En los casos donde el organismo sea una planta, la introducción de la secuencia permite que los herbicidas que contienen glifosato se apliquen a las plantas para inactivar selectivamente las malezas sensibles a glifosato u otras plantas no transformadas, pero no el organismo transformado. Las secuencias pueden usarse adicionalmente como marcador para la selección de células vegetales que crecen bajo condiciones con glifosato. Se proporcionan adicionalmente métodos para identificar una enzima EPSP sintasa con actividad de resistencia a glifosato. Los métodos comprenden identificar secuencias adicionales de EPSP sintasa que son resistentes a glifosato con base en la presencia del dominio de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra la estrategia de mutagénesis combinatoria para la región del asa Q de syngrgl-SB. La Figura 2 ilustra el diseño de la biblioteca de mutagénesis de permutación para la región del asa Q de syngrgl-SB. La traducción consenso y diseño de oligonucleótidos se muestran en la parte inferior de la Figura 2 y en la SEQ ID NO: 48 (traducción consenso) y SEQ ID NO: 49 (diseño de oligonucleótidos). La Figura 3 muestra la estrategia de mutagénesis combinatoria para la Biblioteca 3. "N" representa las bases de los nucleótidos A, T, C o G; "W" representa las bases de los nucleótidos A o T; y "S" representa las bases de los nucleótidos C o G. La Figura 4 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos en la región del núcleo del asa Q de los clones resistentes a glifosato. El corchete delinea la región del núcleo del asa Q. El sombreado gris designa las posiciones donde no se observan alteraciones. Las posiciones con alteraciones se muestran sin sombreado. También se incluye la secuencia de aminoácidos GRG1 silvestre en esta región (que corresponde a las posiciones de los aminoácidos 81 hasta 104 de la SEQ ID NO: 2). Las Figuras 5A y 5B muestran una ilustración de la estructura cristalina de GRG1 simulada al estratificar la secuencia de aminoácidos GRG1 sobre la estructura cristalina AroA de E. coli (Stallings eí al (1991 ) Proc Nati Acad Sci L/SA1 ;88(1 1 ):5046-50). La Figura 5A muestra la proteína completa respecto a los sustratos shiquimato-3-fosfato y PEP. La Figura 5B muestra solamente la región del asa Q de GRG1 respecto a los sustratos shiquimato-3-fosfato y PEP. La Figura 6 muestra una hibridación tipo Western de muestras de hojas de plantas transgénicas de maíz que expresan GRG1 (EV06), detectadas con un anticuerpo policlonal. La proteína total se aisló de muestras de hojas de maíz, y la expresión de la proteína GRG1 (EV06) se identificó usando análisis de hibridación tipo Western. La Línea A muestra 5ng de proteína GRG1 (EV06) purificada, la Línea B muestra 1 ng de proteína GRG1. Las Líneas B hasta J muestran plantas transgénicas independientes que expresan grg1(evo6). Las Líneas que contienen plantas de control negativo no muestran señal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Composiciones Se proporcionan secuencias de polipéptidos capaces de conferir tolerancia o resistencia a glifosato. Las composiciones incluyen polipéptidos de EPSP sintasa que tienen el dominio de secuencia X-C-X-E-S-G-L-S-X-R-X-F-X-P-X (SEQ ID NO: 44), donde X denota cualquier aminoácido, el dominio de secuencia (SEQ ID NO: 76), en donde denota glutamina, valina, prolina, ácido glutámico, isoleucina, metionina o treonina y X2 denota cualquier aminoácido, o el dominio de secuencia X C-Xa-E-S-G-L-S-Xa-R-X^F-Xs-P-Xe (SEQ ID NO: 45), y en donde X-? denota ácido aspártico, lisina, ácido glutámico, asparagina, serina, glicina, prolina o arginina; X2 denota asparagina, alanina, serina, glicina, glutamina, valina, prolina, ácido glutámico, isoleucina, metionina, treonina o arginina; donde X3 denota isoleucina, metionina, fenilalanina, glicina, serina o valina; donde X4 denota metionina, alanina, serina, glicina, glutamina, leucina, valina o isoleucina; donde X5 denota treonina, alanina, valina, isoleucina, prolina, leucina o glicina; y donde X6 denota isoleucina, leucina, cisteína, alanina, fenilalanina o metionina. Este dominio se ubica en la región del asa Q del polipéptido de EPSP sintasa. Se sabe que la región (en este documento referida como el "asa Q") que corresponde a los aminoácidos 80-105 del polipéptido de EPSP sintasa resistente a glifosato GRG1 (SEQ ID NO: 2; Solicitud de Patente Norteamericana No. 10/739,610) está implicada en el reconocimiento del sustrato de la EPSP sintasa, fosfoenoilpiruvato (PEP) (Schónbrunn eí al. (2001 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 1376-1380, Stauffer et al. (2001 ) Biochemistry 40:3951 -3957). En una modalidad, este dominio de secuencia corresponde a las posiciones de los aminoácidos 85 hasta 99 de la SEQ ID NO: 2 y se selecciona del grupo que consiste de las posiciones correspondientes de las SEQ ID NO: 5-43 y SEQ ID NO: 56-65. En otra modalidad, el polinucleótido que comprende el dominio de secuencia de la invención codifica un polipéptido de EPSP sintasa diferente a las SEQ ID NO: 1 y 46, que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos que corresponden a las posiciones 1 hasta 84 y posiciones 100 hasta 431 de la SEQ ID NO: 2. Como se usa en este documento, la frase "que corresponde a" o "corresponde a", cuando se refiere a números de posiciones de aminoácidos (o nucleótidos), significa que una o más secuencias de aminoácidos (o nucleótidos) se alinea con la secuencia de referencia en los números especificados de posiciones en la secuencia de referencia. Por ejemplo, para identificar una región del asa Q en una secuencia de aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 80-105 de la SEQ ID NO: 2, se puede alinear la secuencia de aminoácidos en cuestión con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 usando los métodos de alineamiento discutidos en otra parte en este documento, e identificar la región de la secuencia de aminoácidos en cuestión que se alinea con los residuos de aminoácidos 80-105 de la SEQ ID NO: 2. Se reconoce que la posición del aminoácido que ' designa el asa Q puede variar en aproximadamente más o menos 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácido o aminoácidos a cada lado de los aminoácidos que corresponden a las posiciones 80-105 de la SEQ ID NO: 2. La frase "diferente a las SEQ ID NO: 1 y 46" incluye fragmentos de la SEQ ID NO: 1 o 46, incluyendo fragmentos que comprenden al menos aproximadamente 340, al menos aproximadamente 350, al menos 400, al menos 401 , 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 41 1 , 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421 , 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429 o 431 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1 o 46. Adicionalmente, se reconoce que en la técnica anterior pueden estar disponibles secuencias que contienen un dominio de la invención (véase, por ejemplo, Publicaciones de Solicitud de Patente Norteamericana Nos. 20060143727, 20030049814, 20030079246, 20030200560, 2004148650, y 20050223436; Patentes Norteamericanas Nos. 5188642, 6040497, 7214535, 7169970, 6867293, 71831 10, 5094945, 6225114, 7141722, 7045684, 5312910, 6566587, y RE037287, cada una de las cuales se incorpora en este documento para referencia en su totalidad). Hasta la presente invención, puede no reconocerse en la técnica que tales secuencias tienen la capacidad de conferir resistencia a giifosato y aquellas secuencias se excluyen de las composiciones de la invención. Si no se sabe que aquellas secuencias confieren resistencia, se incluyen dentro de las reivindicaciones del método. Los métodos de la invención proporcionan una metodología novedosa para identificar y usar secuencias que tienen la capacidad de conferir resistencia a giifosato. El asa Q de EPSP sintasa forma una porción de la cavidad de unión para PEP y giifosato, y contiene una arginina invariable que se sabe que se enlaza con hidrógeno directamente con el fosfato de PEP (Shuttleworth et al. (1999) Biochemistry 38:296-302). Este dominio del asa Q se ha descrito como un indicador de resistencia a giifosato y los residuos clave dentro de este dominio se han identificado (Solicitud Norteamericana No. 60/658,320, incorporada en este documento para referencia en su totalidad). Las composiciones de la presente invención incluyen variantes de GRG1 que exhiben ya sea (1 ) capacidad continuada para tolerar giifosato, o (2) capacidad intensificada para tolerar glifosato. De esta manera, las secuencias de aminoácidos de estas variantes expanden y refinan los dominios clave del asa Q para EPSP sintasas de resistencia a glifosato.

A. Polinucleótidos aislados, y variantes y fragmentos de los mismos En algunas modalidades, la presente invención comprende polinucleótidos aislados o recombinantes. Un polinucleótido o polipéptido "aislado" o "purificado", o porción biológicamente activa del mismo, se encuentra sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. Por "biológicamente activo" se quiere decir que posee la actividad biológica deseada del polipéptido nativo, es decir, retiene la actividad de resistencia a herbicidas. Un polinucleótido "aislado" o "recom binante" puede estar libre de secuencias (por ejemplo, secuencias que codifican proteínas) que flanquean en forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el polinucleótido. Para propósitos de la invención, "aislado", cuando se usa para referirse a polinucleótidos, excluye cromosomas aislados. Por ejemplo, en diversas modalidades, el polinucleótido aislado que codifica resistencia a glifosato puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de la secuencia de nucleótidos que flanquea en forma natural el polinucleótido en el ADN genómico de la célula de la cual se deriva el polinucleótido. • Los polinucleótidos de la invención incluyen aquellos que codifican polipéptidos de EPSP sintasa caracterizados por tener el dominio de secuencia de la invención. La información usada para identificar los dominios de la invención incluye alineamientos de secuencias de enzimas EPSP sintasas como se describe en otra parte en este documento. Los alineamientos de secuencias se usan para identificar regiones de homología entre las secuencias y para identificar los dominios que son característicos de estas enzimas EPSP sintasas. En algunas modalidades, los dominios de la invención se usan para identificar enzimas EPSP sintasas que son resistentes a glifosato. Modalidades adicionales incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos resistentes a glifosato que comprenden las SEQ ID NO: 5-43 y SEQ ID NO: 56-65, las secuencias de polinucleótidos de las SEQ ID NO: 3, 4, 66, 67, 74 y 75, y las secuencias de polinucleótidos que comprenden las SEQ ID NO: 68-73. Por "glifosato" se quiere decir cualquier forma herbicida de N-fosfonometilglicina (incluyendo cualquier sal de la misma) y otras formas que dan como resultado la producción del anión glifosato in planta. Una "proteína de resistencia a herbicidas", o una proteína que resulta de la expresión de una "molécula de ácido nucleico que codifica resistencia a herbicidas", incluye proteínas que confieren a una célula la capacidad para tolerar una concentración más alta de un herbicida que las células que no expresan la proteína, o para tolerar cierta concentración de un herbicida durante un tiempo más prolongado que las células que no expresan la proteína. Una "proteína de resistencia a glifosato" incluye una proteína que confiere a una célula la capacidad para tolerar una concentración más alta de glifosato que las células que no expresan la proteína, o para tolerar cierta concentración de glifosato durante un periodo de tiempo más prolongado que las células que no expresan la proteína. Por "tolerar" o "tolerancia" se quiere decir ya sea sobrevivir o llevar a cabo funciones celulares esenciales, tales como síntesis de proteínas y respiración, de manera que no pueda distinguirse fácilmente de las células sin tratar. La presente invención además contempla variantes y fragmentos de los polinucleótidos descritos en este documento. Un "fragmento" de un polinucleótido puede codificar una porción biológicamente activa de un polipéptido, o puede ser un fragmento que puede usarse como una sonda de hibridación o cebador de PCR usando los métodos descritos en otra parte en este documento. Los polinucleótidos que son fragmentos de un polinucleótido comprenden al menos aproximadamente 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1 100, 1 150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en un polinucleótido de longitud completa descrito en este documento, dependiendo del uso pretendido (por ejemplo, un polinucleótido de EPSP sintasa que comprende la SEQ ID NO: 1 ). Por nucleótidos "contiguos" se quiere decir residuos de nucleótidos que son inmediatamente adyacentes entre sí.

Los fragmentos de los polinucleótidos de la presente invención generalmente codificarán fragmentos de polipéptidos que retienen la actividad biológica de la proteína de longitud completa de resistencia a glifosato; es decir, actividad de resistencia a herbicidas. Por "retiene la actividad de resistencia a herbicidas" se quiere decir que el fragmento tendrá al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, al menos aproximadamente 300% o más de la actividad de resistencia a herbicidas de la proteína de longitud completa de resistencia a glifosato descrita en este documento como la SEQ ID NO: 2. Los métodos para medir la actividad de resistencia a herbicidas se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,535,060, y 5,188,642, cada una de las cuales se incorpora en este documento para referencia en su totalidad. Un fragmento de un polinucleótido que codifica una porción biológicamente activa de un polipéptido de la invención codificará al menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido de longitud completa de la invención. Las proteínas preferidas de resistencia a herbicidas de la presente invención se codifican por una secuencia de nucleótidos que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene un dominio de secuencia descrito en este documento. En una modalidad, este dominio de secuencia corresponde a las posiciones de los aminoácidos 85 hasta 99 de la SEQ ID NO: 2 y se selecciona del grupo que consiste de las posiciones correspondientes de las SEQ ID NO: 5-43 y SEQ ID NO: 56-65. En otra modalidad, el polinucleótido que comprende el dominio de secuencia de la invención codifica una EPSP sintasa que es suficientemente idéntica en los aminoácidos que corresponden a las posiciones 1 hasta 84 y posiciones 100 hasta 431 de la SEQ ID NO: 2. El término "suficientemente idéntica" quiere decir una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 60% o 65% de identidad de secuencia, aproximadamente 70% o 75% de identidad de secuencia, aproximadamente 80% o 85% de identidad de secuencia, o aproximadamente 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineamiento descritos en este documento, usando parámetros estándar. En otra modalidad, el polinucleótido que comprende el dominio de la invención codifica una EPSP sintasa que tiene una o más adiciones, sustituciones o eliminaciones en la región que corresponde a las posiciones de los aminoácidos 1 hasta 84 y posiciones 100 hasta 431 de la SEQ ID NO: 2, hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 100 o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos, al tomar en cuenta la degeneración de codones, similitud de aminoácidos, colocación de marcos de lectura y similares. Para determinar la identidad porcentual de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima. La identidad porcentual entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, identidad porcentual = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En una modalidad, las dos secuencias son de la misma longitud. La identidad porcentual entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a aquellas descritas posteriormente, con o sin permitir interrupciones. Para calcular la identidad porcentual, típicamente se cuentan las coincidencias exactas. Para los propósitos de la presente invención, cuando se calcula la identidad porcentual en las regiones que corresponden a las posiciones de los aminoácidos 1 hasta 84 y posiciones 100 hasta 431 , se mide el porcentaje a lo largo de la región completa (1 hasta 84 más 100 hasta 431 ). La determinación de la identidad porcentual entre dos secuencias puede conseguirse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin and Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como en Karlin and Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos de BLAST pueden realizarse con el programa BLASTN, puntuación = 100, largo de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a las moléculas de ácido nucleico resistentes a glifosato de la invención. Las búsquedas de proteínas de BLAST pueden realizarse con el programa BLASTX, puntuación = 50, largo de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de proteínas de resistencia a herbicidas de la invención. Para obtener alineamientos interrumpidos para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, puede usarse PSI-Blast para realizar una búsqueda repetitiva que detecta interrelaciones distantes entre las moléculas. Véase Altschul ef al. (1997) supra. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, pueden usarse los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). Véase www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins ef al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o ADN y, de esta manera, puede proporcionar datos acerca de la conservación de secuencia de la secuencia completa de aminoácidos. El algoritmo ClustalW se usa en varios paquetes de software comercialmente disponibles para análisis de ADN/aminoácidos, tal como el módulo ALIGNX del Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Después del alineamiento de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, puede valorarse la identidad porcentual de los aminoácidos. Un ejemplo no limitante de un programa de software útil para el análisis de alineamientos de ClustalW es GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite la valoración de la similitud e identidad de los aminoácidos (o ADN) entre múltiples proteínas. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers and Miller (1988) CABIOS 4: 1 1 -17. Tal algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete de software para alineamiento de secuencias GCG (disponible de Accelrys, Inc., 9865 Scranton Rd., San Diego, California, USA). Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de residuos ponderados PAM120, una penalización por longitud de huecos de 12, y una penalización por huecos de 4. A menos que se estipule de otra manera, GAP Versión 10, que usa el algoritmo de Needleman and Wunsch (1970) supra, se usará para determinar la identidad o similitud de secuencia usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos usando Ponderación GAP de 50 y Ponderación de Longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando ponderación GAP de 8 y ponderación de longitud de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62. Programas equivalentes también pueden usarse. Por "programa equivalente" se quiere decir cualquier programa para comparación de secuencias que, para dos secuencias cualesquiera en cuestión, genera un alineamiento que tiene coincidencias idénticas de residuos de nucleótidos y una identidad porcentual idéntica de secuencias cuando se compara con el alineamiento correspondiente generado por GAP Versión 10. La invención también abarca polinucleótidos variantes. Las "variantes" del polinucleótido incluyen aquellas secuencias que codifican los polipéptidos descritos en este documento, pero que difieren de manera conservativa a causa de la degeneración del código genético, así como aquellas que son suficientemente idénticas. Los genes bacterianos muy a menudo poseen múltiples codones de inicio de metionina cerca del comienzo del marco abierto de lectura. A menudo, el inicio de la traducción en uno o más de estos codones de inicio conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, bacterias tales como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como un codón de inicio, y las proteínas que inician la traducción en los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. Adicionalmente, no se determina a menudo a priori cuál de estos codones se usa en forma natural en la bacteria. De esta manera, se entiende que el uso de uno de los codones alternos de metionina puede conducir a la generación de variantes que confieren resistencia a herbicidas. Estas proteínas de resistencia a herbicidas se abarcan en la presente invención y pueden usarse en los métodos de la presente invención. Las variantes alélicas que se presentan en forma natural pueden identificarse con el uso de técnicas bien conocidas de biología molecular, tal como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como se detalla posteriormente. Los polinucleótidos variantes también incluyen polinucleótidos derivados de manera sintética que se han generado, por ejemplo, al usar mutagénesis dirigida u otras estrategias, pero que aún codifican el polipéptido que tiene la actividad biológica deseada. El experto apreciará además que pueden introducirse cambios por mutación adicional de los polinucleótidos de la invención, conduciendo en consecuencia a cambios adicionales en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados, sin alterar la actividad biológica de los polipéptidos. De esta manera, pueden crearse polinucleótidos variantes aislados al introducir una o más sustituciones, adiciones, o eliminaciones de nucleótidos adicionales en el polinucleótido correspondiente que codifica el dominio de EPSP sintasa descrito en este documento, de manera tal que una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos se introduzcan en el polipéptido codificado. Pueden introducirse mutaciones posteriores por técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR, o técnicas de recombinación hómóloga in vitro. Tales polinucleótidos variantes también se abarcan por la presente invención. Los polinucleótidos variantes pueden elaborarse al introducir mutaciones de manera aleatoria a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis por saturación, y las mutantes resultantes pueden seleccionarse por la capacidad de conferir actividad de resistencia a herbicidas para identificar mutantes que retienen la actividad. Los procedimientos de recombinación homologa in vitro o PCR sexual (por ejemplo, Smith (1994) Nature 370:324-325; Patentes Norteamericanas Nos. 5,837,458; 5,830,721 ; 5,81 1 ,238; y 5,733,731 , cada una de las cuales se incorpora en este documento para referencia) pueden usarse para modificar o aumentar además los polinucleótidos y polipéptidos que tienen el dominio de EPSP sintasa de la presente invención (por ejemplo, polipéptidos que confieren resistencia a glifosato). La recombinación homóloga in vitro implica la fragmentación aleatoria de varios ADNs mutantes, seguida por su reensamble por PCR en moléculas de longitud completa. Ejemplos de diversos procedimientos de recombinación homóloga in vitro incluyen, pero no se limitan a, ensamble después del tratamiento con DNasas, el proceso de extensión escalonada (STEP), y recombinación por cebadores aleatorios in vitro. En el método mediado por DNasas, segmentos de ADN aislados de una agrupación de mutantes positivas se escinden en fragmentos aleatorios con DNasal y se someten a múltiples rondas de PCR sin cebador agregado. Las longitudes de los fragmentos aleatorios se acercan a aquellas del segmento sin escindir a medida que proceden los ciclos de PCR, lo que da como resultado mutaciones en diferentes clones que llegan a mezclarse y se acumulan en algunas de las secuencias resultantes. Múltiples ciclos de selección y recombinación homóloga in vitro han conducido al perfeccionamiento funcional de varias enzimas (Stemmer (1994) Nature 370:389-391 ; Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 10747-10751 ; Crameri et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319; Zhang et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; y Crameri eí al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:436-438). Tales procedimientos podrían realizarse, por ejemplo, en polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen el dominio de secuencia de la presente invención para generar polipéptidos que confieren resistencia a glifosato. Usando métodos tales como PCR, hibridación y similares, pueden identificarse secuencias correspondientes de resistencia a herbicidas al buscar los dominios de EPSP sintasa de la presente invención. Véase, por ejemplo, Sambrook and Russell (2001 ) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis eí al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). En un método de hibridación, toda o parte de la secuencia de nucleótidos de resistencia a herbicidas puede usarse para analizar bibliotecas de cADN o genómicas. Los métodos para la construcción de tales bibliotecas de cADN y genómicas se conocen en general en la técnica y se describen en Sambrook and Russell, 2001 , supra. Las llamadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de cADN, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y pueden etiquetarse con un grupo detectable tal como P, o cualquier otro marcador detectable, tales como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Las sondas para hibridación pueden elaborarse al etiquetar oligonucleótidos sintéticos con base en las secuencias conocidas de nucleótidos que codifican resistencia a herbicidas, descritas en este documento. Cebadores degenerados, diseñados con base en nucleótidos o residuos de aminoácidos conservados en las secuencias de nucleótidos o secuencias codificadas de aminoácidos, pueden usarse adicionalmente. La sonda típicamente comprende una región de la secuencia de nucleótidos que híbrida bajo condiciones astringentes con al menos aproximadamente 12, preferiblemente alrededor de 25, al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1300 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos que codifica resistencia a herbicidas de la invención, o un fragmento o variante de la misma. Los métodos para la preparación de sondas para hibridación se conocen en general en la técnica y se describen en Sambrook and Russell, 2001 , supra y Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), ambas incorporándose en este documento para referencia. Por ejemplo, una secuencia completa de resistencia a herbicidas descrita en este documento, o una o más porciones de la misma, puede usarse como una sonda capaz de hibridar específicamente con secuencias correspondientes de resistencia a herbicidas y ARNs mensajeros. Para lograr una hibridación específica bajo una diversidad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y son de al menos aproximadamente 10 nucleótidos de largo, o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de largo. Tales sondas pueden usarse para amplificar secuencias correspondientes de resistencia a herbicidas a partir de un organismo elegido por PCR. Esta técnica puede usarse para aislar secuencias codificantes adicionales a partir de un organismo deseado, o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen identificación por hibridación de bibliotecas de ADN en placas (ya sea placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). La hibridación de tales secuencias puede llevarse a cabo bajo condiciones astringentes. Por "condiciones astringentes" o "condiciones astringentes de hibridación" se quiere decir condiciones bajo las cuales una sonda hibridará con su secuencia objetivo hasta un grado mayor de manera detectable que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces sobre el fondo). Las condiciones astringentes son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al controlar la astringencia de las condiciones de hibridación y/o de lavado, las secuencias objetivo que son 100% complementarias a la sonda pueden identificarse (sondeo homólogo). Alternativamente, las condiciones de astringencia pueden ajustarse para permitir algo de disimilitud en las secuencias, de modo que grados menores de similitud se detecten (sondeo heterólogo). Generalmente, una sonda es de menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de largo, preferiblemente menos de 500 nucleótidos de largo. Típicamente, las condiciones astringentes serán aquellas en que la concentración de sal es de menos de aproximadamente 1.5 M de ¡ón Na, típicamente alrededor de 0.01 a 1.0 M de concentración de ión Na (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayores a 50 nucleótidos). Las condiciones astringentes también pueden alcanzarse con la adición de agentes desestabilizantes tal como formamida. Condiciones ejemplares de baja astringencia incluyen hibridación con una solución reguladora de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCI, 1% de SDS (dodecilsulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en SSC 1X a 2X (SSC 20X = 3.0 M de NaCI/0.3 M de citrato trisódico) a 50 a 55°C. Condiciones ejemplares de astringencia moderada incluyen hibridación en 40 a 45% de formamida, 1.0 M de NaCI, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado en SSC 0.5X a 1X a 55 a 60°C. Condiciones ejemplares de alta astringencia incluyen hibridación en 50% de formamida, 1 M de NaCI, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado en SSC 0.1X a 60 a 65°C. Opcionalmente, los reguladores de lavado pueden comprender aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 1 % de SDS. La duración de la hibridación generalmente es de menos de aproximadamente 24 horas, usualmente alrededor de 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad típicamente es la función de los lavados después de hibridación, los factores críticos siendo la fuerza iónica y temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos ADN-ADN, el Tm puede aproximarse a partir de la ecuación de Meinkoth and Wahl (1984) Anal Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% de form) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. El Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) en que 50% de una secuencia objetivo complementaria híbrida con una sonda perfectamente compatible. El Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de disimilitud; de esta manera, el Tm, hibridación, y/o condiciones de lavado pueden ajustarse para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, el Tm puede disminuirse 10°C. Generalmente, las condiciones astringentes se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C menores al punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complemento en una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, condiciones severamente astringentes pueden utilizar una hibridación y/o lavado en 1 , 2, 3 o 4°C menores al punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente astringentes pueden utilizar una hibridación y/o lavado en 6, 7, 8, 9 o 10°C menores al punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de baja astringencia pueden utilizar una hibridación y/o lavado en 1 1 , 12, 13, 14, 15 o 20°C menores al punto de fusión térmica (Tm). Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado y el Tm deseado, los expertos entenderán que las variaciones en la astringencia de las soluciones de hibridación y/o lavado se describen de manera inherente. Si el grado deseado de disimilitud resulta en un Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), se prefiere incrementar la concentración de SSC, de modo que pueda usarse una temperatura más alta. Una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology — Hibridizatíon with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York); y Ausubel ef al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Véase Sambrook eí al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

B. Proteínas Aisladas y Variantes y Fragmentos de las Mismas También se abarcan polipéptidos de resistencia a herbicidas dentro de la presente invención. Un polipéptido de resistencia a herbicidas que se encuentra sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de polipéptidos que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de un polipéptido que no es de resistencia a herbicidas (también referido en este documento como una "proteína contaminante"). En la presente invención, "proteína de resistencia a herbicidas" quiere decir un polipéptido de EPSP sintasa que tiene el dominio de secuencia de la invención. Fragmentos, porciones biológicamente activas y variantes de los mismos también se proporcionan y pueden usarse para practicar los métodos de la presente invención. Los "fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos de polipéptidos que comprenden una porción de una secuencia de aminoácidos que codifica una proteína de resistencia a herbicidas y que retiene la actividad de resistencia a herbicidas. Una porción biológicamente activa de una proteína de resistencia a herbicidas puede ser un polipéptido que es, por ejemplo, de 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de largo. Esta proteína puede alterarse en diversas formas incluyendo sustituciones, eliminaciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos de uno o más aminoácidos de en la región que corresponde a las posiciones de los aminoácidos 85 hasta 99 de la SEQ ID NO: 2, incluyendo hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 100 o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos. Tales porciones biológicamente activas pueden prepararse por técnicas recombinantes y evaluarse para actividad de resistencia a herbicidas. Los métodos para medir la actividad de resistencia a herbicidas se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,535,060, y 5,188,642, cada una de las cuales se incorpora en este documento para referencia en su totalidad. Como se usa aquí, un fragmento comprende al menos 8 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO: 5-43 o 56-65. La invención abarca otros fragmentos, sin embargo, tal como cualquier fragmento en la proteína mayor a aproximadamente 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos. Por "variantes" se quiere decir proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 60%, 65%, aproximadamente 70%, 75%, aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a un polipéptido de EPSP sintasa que tiene el dominio de EPSP sintasa de la presente invención. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de los polipéptidos codificados por dos polinucleótidos al tomar en cuenta la degeneración de codones, similitud de aminoácidos, colocación de marcos de lectura y similares. Por ejemplo, pueden elaborarse sustituciones conservativas de aminoácidos en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse a partir de la secuencia silvestre de un polipéptido sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" se requiere para la actividad biológica. Una "sustitución conservativa de aminoácidos" es una en que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales alcalinas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Pueden elaborarse sustituciones de aminoácidos en regiones no conservadas que retienen la función. En general, tales sustituciones podrían no elaborarse para residuos de aminoácidos conservados, o para residuos de aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado, donde tales residuos son esenciales para la actividad del polipéptido. Sin embargo, un experto en la técnica podría entender que las variantes funcionales pueden tener alteraciones menores conservadas o no conservadas en los residuos conservados. También se abarcan anticuerpos para los polipéptidos de la presente invención, o para variantes o fragmentos de los mismos. Los métodos para producir anticuerpos se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow and Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente Norteamericana No. 4,196,265). En una modalidad de la presente invención, la enzima EPSPS resistente a glifosato tiene una Km para fosfoenolpiruvato (PEP) entre aproximadamente 1 y aproximadamente 150uM, incluyendo aproximadamente 2 uM, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 10, 120, 130 o aproximadamente 140 uM, y una K¡ (glifosato)/ Km (PEP) entre aproximadamente 50 y aproximadamente 2000, entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1000, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800, aproximadamente 900, aproximadamente 1000, aproximadamente 1 100, aproximadamente 1200, aproximadamente 1300, aproximadamente 1400, aproximadamente 1500, aproximadamente 1600, aproximadamente 1700, aproximadamente 1800, aproximadamente 1900, o hasta aproximadamente 2000. Como se usa en este documento, la Km y K¡ se miden bajo condiciones en que la enzima obedece la cinética de Michaelis-Menten, aproximadamente pH 7. Una técnica de medición no limitante usa la enzima en forma purificada en cloruro de potasio y regulador HEPES a pH 7 a temperatura ambiente y usa concentraciones de glifosato de 0 a 10mM. La actividad cinética de EPSP sintasa puede analizarse, por ejemplo, al medir la liberación de fosfato que resulta durante la catálisis de un sustrato de EPSP sintasa (por ejemplo, PEP y S3P) a su producto de reacción subsecuente (por ejemplo, ácido 5-enolpiruvil-3- fosfoshiquímico) usando un ensayo fluorescente descrito por Vázquez et al. (2003) Anal. Biochem. 320(2):292-298 y en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 1 1/605,824 titulada "Genes grg23 y grg51 que Confieren Resistencia a Herbicidas", presentada el 29 de noviembre de 2006 e incorporada en este documento para referencia en su totalidad.

C. Construcciones de Polinucleótidos Los polinucleótidos que codifican el dominio de EPSP sintasa de la presente invención pueden modificarse para obtener o aumentar la expresión en células vegetales. Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos identificados por los métodos de la invención pueden proporcionarse en casetes de expresión para la expresión en la planta de interés. Un "cásete de expresión vegetal" incluye una construcción de ADN, tal como una construcción recombinante de ADN, que es capaz de dar como resultado la expresión de un polinucleótido en una célula vegetal. El cásete puede incluir, en la dirección de transcripción 5'-3', una región de inicio transcripcional (es decir, promotor) enlazado de manera operable a uno o más polinucleótidos de interés, y una región de terminación de traducción y/o transcripcional (es decir, región de terminación) funcionales en plantas. El cásete adicionalmente puede contener al menos un polinucleótido adicional para introducirse en el organismo, tal como un gen marcador seleccionare. Alternativamente, el o los polinucleótidos adicionales pueden proporcionarse en múltiples casetes de expresión. Tal cásete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción del o los polinucleótidos para estar bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. "Heterólogo" generalmente se refiere al polinucleótido o polipéptido que no es endógeno para la célula o no es endógeno para la ubicación en el genoma nativo en que se presenta, y se ha agregado a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección o similares. Por "enlazado de manera operable" se quiere decir un enlace funcional entre dos polinucleótidos. Por ejemplo, cuando un promotor se enlaza de manera operable a una secuencia de ADN, la secuencia del promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN. Se reconoce que los polinucleótidos enlazados de manera operable pueden o pueden no ser contiguos y, cuando se usan en referencia al empalme de dos regiones codificantes de polipéptidos, los polipéptidos se expresan en el mismo marco de lectura. El promotor puede ser cualquier secuencia de polinucleótidos que muestra actividad transcripcional en las células vegetales, partes de la planta o plantas elegidas. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo, para el huésped vegetal y/o para la secuencia de ADN de la invención. En los casos donde el promotor es "nativo" o "análogo" al huésped vegetal, se quiere decir que el promotor se encuentra en la planta nativa en la que el promotor se introduce. En los casos donde el promotor es "extraño" o "heterólogo" para la secuencia de ADN de la invención, se quiere decir que el promotor no es el promotor nativo o que se presenta en forma natural para la secuencia de ADN enlazada de manera operable de la invención. El promotor puede ser inducible o constitutivo. Puede presentarse en forma natural, puede componerse de porciones de diversos promotores que se presentan en forma natural, o puede ser parcial o totalmente sintético. Una guía para el diseño de promotores se proporciona por los estudios de estructura de promotores, tal como aquel de Harley and Reynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15:2343-2361. También, la ubicación del promotor respecto al inicio de la transcripción puede optimizarse. Véase, por ejemplo, Roberts et al. (1979) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 76:760-764. Muchos promotores adecuados para su uso en plantas se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, los promotores constitutivos adecuados para su uso en plantas incluyen: los promotores de los virus vegetales, tal como el promotor del caulimovirus del rayado clorótico del cacahuate (PC1 SV) (Patente Norteamericana No. 5,850,019); el promotor 35S del virus del mosaico de coliflor (CaMV) (Odell ef al. (1985) Nature 313:810-812); promotores de los genes de metiltransferasa del virus Chiorella (Patente Norteamericana No. 5,563,328) y el promotor del transcrito de longitud completa del virus del mosaico del higo (FMV) (Patente Norteamericana No. 5,378,619); los promotores de genes semejantes como actina de arroz (McEIroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171 ); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen ef al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991 ) Theor. Appl. Genet. 81 :581 -588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); histona H3 de maíz (Lepetit eí al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231 :276-285 y Atanassova et al. (1992) Plant J. 2(3):291 -300); ALS3 de Brassica napus (solicitud PCT WO 97/41228); y promotores de diversos genes de Agrobacterium (véase Patentes Norteamericanas Nos. 4,771 ,002; 5,102,796; 5,182,200; y 5,428,147). Promotores inducibles adecuados para su uso en plantas incluyen: el promotor del sistema ACEI que responde a cobre (Mett et al. (1993) PNAS 90:4567-4571 ); el promotor del gen In2 de maíz que responde a safeners herbicidas de bencensulfonamida (Hershey ef al. (1991 ) Mol. Gen. Genetics 227:229-237 y Gatz ef al. (1994) Mol. Gen. Genetics 243:32-38); y el promotor del represor Tet de Tn10 (Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237). Otro promotor inducible para su uso en plantas es uno que responde a un agente inductor al que las plantas no responden normalmente. Un promotor inducible ejemplar de este tipo es el promotor inducible de un gen de hormona esteroide, la actividad transcripcional del cual se induce por una hormona glucocorticosteroide (Schena et al. (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 10421 ) o la aplicación reciente de un activador quimérico de transcripción, XVE, para su uso en un sistema inducible de expresión en plantas basado en el receptor de estrógenos, activado por estradiol (Zuo eí al. (2000) Plant J., 24:265-273). Otros promotores inducibles para su uso en plantas se describen en EP 332104, PCT WO 93/21334 y PCT WO 97/06269 que se incorporan en este documento para referencia en su totalidad. Los promotores compuestos de porciones de otros promotores y promotores parcial o totalmente sintéticos también pueden usarse. Véase, por ejemplo, Ni eí al. (1995) Plant J. 7:661 -676 y PCT WO 95/14098 que describen tales promotores para su uso en plantas. El promotor puede incluir, o modificarse para incluir, uno o más elementos potenciadores. En algunas modalidades, el promotor puede incluir una pluralidad de elementos potenciadores. Los promotores que contienen elementos potenciadores permiten niveles más altos de transcripción en comparación con los promotores que no los incluyen. Los elementos potenciadores adecuados para su uso en plantas incluyen el elemento potenciador PC1 SV (Patente Norteamericana No. 5,850,019), el elemento potenciador CaMV 35S (Patentes Norteamericanas Nos. 5,106,739 y 5,164,316) y el elemento potenciador FMV (Maiti eí al. (1997) Transgenic Res. 6: 143-156). Véase también PCT WO 96/23898. A menudo, tales construcciones pueden contener regiones 5' y 3' no traducidas. Tales construcciones pueden contener una "secuencia señal" o "secuencia líder" para facilitar el transporte cotraduccional o postraduccional del péptido de interés hacia ciertas estructuras intracelulares, tal como el cloroplasto (u otro plástido), retículo endoplásmico o aparato de Golgi, o para secretarse. Por ejemplo, la construcción puede diseñarse para contener un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplásmico. Por "secuencia señal" se quiere decir una secuencia que se sabe o sospecha que resulta en el transporte cotraduccional o postraduccional del péptido a lo largo de la membrana celular. En eucariotes, esto típicamente implica la secreción hacia el aparato de Golgi, con algo de glicosilación resultante. Por "secuencia líder" se quiere decir cualquier secuencia que, cuando se traduce, resulta en una secuencia de aminoácidos suficiente para activar el transporte cotraduccional de la cadena peptídica a un orgánulo subcelular. De esta manera, esta incluye secuencias líder que orientan el transporte y/o glicosilación por el paso hacia el retículo endoplásmico, paso a vacuolas, plástidos incluyendo cloroplastos, mitocondria y similares. También puede preferirse diseñar el cásete de expresión vegetal para contener un intrón, de manera tal que el procesamiento del mARN del intrón se requiera para la expresión. Por "región 3' no traducida" se quiere decir un polinucleótido ubicado corriente abajo de una secuencia codificante. Las secuencias señal de poliadenilación, y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar la adición de extensiones de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de mARN, son regiones 3' no traducidas. Por "región 5' no traducida" se quiere decir un polinucleótido ubicado corriente arriba de una secuencia codificante. Otros elementos no traducidos corriente arriba o corriente abajo incluyen potenciadores. Los potenciadores son polinucleótidos que actúan para incrementar la expresión de una región promotora. Los potenciadores se conocen bien en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, la región potenciadora SV40 y el elemento potenciador 35S. La región de terminación puede ser nativa con la región de inicio transcripcional, puede ser nativa con la secuencia de la presente invención, o puede derivarse de otra fuente. Las regiones convenientes de terminación se encuentran disponibles del plásmldo Ti de A tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Véase también Guerineau eí al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 262: 141 -144; Proudfoot (1991 ) Ce// 64:671 -674; Sanfecon et al. (1991 ) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen ef al. (1990) Plant Cell 2: 1261 -1272; Munroe ef al. (1990) Gene 91 : 151 -158; Bailas eí al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891 -7903; y Joshi ef al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639. En un aspecto de la invención, se diseñan secuencias de ADN sintético para un polipéptido dado, tales como los polipéptidos de la invención. La expresión del marco abierto de lectura de la secuencia de ADN de sintético en una célula da como resultado la producción del polipéptido de la invención. Las secuencias de ADN sintético pueden ser útiles para simplemente remover sitios ¡ndeseados de endonucleasas de restricción, para facilitar las estrategias de clonación de ADN, para alterar o remover cualquier predilección potencial de codones, para alterar o mejorar el contenido de GC, para remover o alterar marcos de lectura alternos y/o para alterar o remover sitios de reconocimiento para edición de intrones/exones, sitios de poliadenilación, secuencias Shine-Dalgarno, elementos promotores indeseados y similares, que pueden presentarse en una secuencia de ADN nativo. También es posible que puedan utilizarse secuencias de ADN sintético para introducir otras mejoras a una secuencia de ADN, tales como introducción de una secuencia intrónica, creación de una secuencia de ADN que se expresa como una fusión proteica para secuencias que se orientan a orgánulos, tales como péptidos de tránsito en cloroplastos, péptidos que se orientan a apoplastos/vacuolares, o secuencias peptídicas que resultan en la retención del péptido resultante en el retículo endoplásmico. También pueden sintetizarse genes sintéticos usando los codones preferidos por la célula huésped para una expresión mejorada, o pueden sintetizarse usando codones en una frecuencia de utilización de codones preferida por el huésped. Véase, por ejemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1 -1 1 ; Patentes Norteamericanas Nos. 6,320,100; 6,075,185; 5,380,831 ; y 5,436,391 , Solicitudes Norteamericanas Publicadas Nos. 20040005600 y 20010003849, y Murray eí al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporadas en este documento para referencia. En una modalidad, los polinucleótidos de interés se dirigen al cloroplasto para la expresión. De esta forma, en los casos donde el polinucleótido de interés no se inserta directamente en el cloroplasto, el cásete de expresión adicionalmente contendrá un polinucleótido que codifica un péptido de tránsito para dirigir el nucleótido de interés a los cloroplastos. Tales péptidos de tránsito se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991 ) Plant Mol Biol. Rep. 9: 04-126; Clark ef al. (1989) J. Biol Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421 ; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Los polinucleótidos de interés que se dirigirán al cloroplasto pueden optimizarse para la expresión en el cloroplasto, para dar cuenta de las diferencias en la utilización de codones entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De esta forma, los polinucleótidos de interés pueden sintetizarse usando los codones preferidos por los cloroplastos. Véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,380,831 , incorporada en este documento para referencia. Este cásete de expresión vegetal puede insertarse en un vector para transformación en plantas. Por "vector para transformación" se quiere decir una molécula de ADN que permite la transformación de una célula. Tal molécula puede consistir de uno o más casetes de expresión, y puede organizarse en más de una molécula de ADN del vector. Por ejemplo, los vectores binarios son vectores para transformación en plantas que utilizan dos vectores de ADN no contiguo para codificar todas las funciones requeridas que actúan en cis y trans para la transformación de células vegetales (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451 ). "Vector" se refiere a una construcción de polinucleótidos diseñada para la transferencia entre diferentes células huésped. "Vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar, integrar y expresar secuencias o fragmentos de ADN heterólogo en una célula extraña. El vector para transformación en plantas comprende uno o más vectores de ADN para lograr la transformación en plantas. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar vectores para transformación en plantas que comprenden más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores a menudo se refieren en la técnica como vectores binarios. Los vectores binarios, así como los vectores con plásmidos auxiliares, se usan más a menudo para la transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr una transformación eficiente es bastante grande, y es favorable separar funciones sobre moléculas separadas de ADN. Los vectores binarios típicamente contienen un vector plásmido que contiene las secuencias que actúan en cis requeridas para la transferencia del T- ADN (tales como borde izquierdo y borde derecho), un marcador seleccionable que se diseña para que sea capaz de expresión en una célula vegetal, y un "polinucleótido de interés" (un polinucleótido diseñado para que sea capaz de expresión en una célula vegetal para la que se desea la generación de plantas transgénicas). También presentes en este vector plásmido se encuentran secuencias requeridas para la replicación bacteriana. Las secuencias que actúan en cis se disponen en una forma que permite una transferencia eficiente hacia las células vegetales y la expresión en las mismas. Por ejemplo, la secuencia del marcador seleccionable y la secuencia de interés se ubican entre los bordes izquierdo y derecho. A menudo un segundo vector plásmido contiene los factores de trámite que median la transferencia del T-ADN de Agrobacterium a las células vegetales. Este plásmido a menudo contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de células vegetales por Agrobacterium, y la transferencia de ADN por la escisión en las secuencias limítrofes y la transferencia de ADN mediada por vir, como se entiende en la técnica (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5:446-451 ). Varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101 , EHA101 , EHA105, etc.) pueden usarse para la transformación en plantas. El segundo vector plásmido no es necesario para la introducción de los polinucleótidos en las plantas por otros métodos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

D. Transformación en Plantas Los métodos de la invención implican introducir una construcción de nucleótidos en una planta. Por "introducir" se quiere decir presentar a la planta la construcción de nucleótidos de tal forma que la construcción obtenga acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren que se use un método particular para introducir una construcción de nucleótidos a una planta, sólo que la construcción de nucleótidos obtenga acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir construcciones de nucleótidos en las plantas se conocen en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus. En general, los métodos de transformación en plantas implican transferir ADN heterólogo hacia células vegetales objetivo (por ejemplo embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callo indiferenciado, protoplastos, etc.), seguido por aplicar un nivel de umbral máximo de selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable y en este caso "glifosato") para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa de células no transformadas. Los explantes típicamente se transfieren a una provisión fresca del mismo medio y se cultivan de manera rutinaria. Subsecuentemente, las células transformadas se diferencian a retoños después de colocarse en medio de regeneración suplementado con un nivel de umbral máximo de agente selectivo (por ejemplo "glifosato"). Los retoños entonces se transfieren a un medio selectivo para raíces para recuperar el retoño o plántula enraizada. La plántula transgénica entonces crece a plantas maduras y produce semillas fértiles (por ejemplo Hiei ef al. (1994) The Plant Journal 6:271 -282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Los explantes típicamente se transfieren a una provisión fresca del mismo medio y se cultivan de manera rutinaria. Una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas transgénicas se encuentran en Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Puesto que el material transformado contiene muchas células; tanto células transformadas como no transformadas se presentan en cualquier pedazo de callo o tejido o grupo de células objetivo sometido. La capacidad para inactivar células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen, da como resultado cultivos vegetales transformados. A menudo, la capacidad para remover células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de células vegetales transformadas y la generación exitosa de plantas transgénicas. Métodos moleculares y bioquímicos pueden usarse para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica. La generación de plantas transgénicas puede realizarse por uno de varios métodos, incluyendo, pero sin limitarse a, introducción de ADN heterólogo por Agrobacterium en las células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células vegetales con ADN extraño heterólogo adherido a partículas, y varios otros métodos mediados por partículas no directas (por ejemplo Hiei eí al. (1994) The Plant Journal 6:271 -282; Ishida eí al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750; Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239; Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120) para transferir ADN. Los métodos para la transformación de cloroplastos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método depende de la distribución de partículas por pistola de ADN que contiene un marcador seleccionare y orientación del ADN al genoma del plástido a través de recombinación homologa. Adicionalmente, la transformación de plástidos puede conseguirse por transactivación de un transgen silencioso transportado por plástidos, por la expresión preferida en tejidos de una ARN polimerasa codificada en el núcleo y dirigida por el plástido. Tal sistema se ha reportado en McBride eí al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :7301 -7305. Las células que se han transformado pueden hacerse crecer a plantas de acuerdo con formas convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick eí al. (1986) Plant Cell Reports 5:81 -84. Estas plantas entonces pueden hacerse crecer, y polinizarse con la misma cepa o diferentes cepas transformadas, e identificarse el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Dos o más generaciones pueden hacerse crecer para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene y hereda de manera estable y entonces las semillas pueden cosecharse para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se ha logrado. De esta forma, la presente invención proporciona una semilla transformada (también referida como "semilla transgénica") que tiene una construcción de nucleótidos de la invención, por ejemplo, un cásete de expresión de la invención, incorporado de manera estable en su genoma.

E. Evaluación de la Transformación en Plantas Después de la introducción de ADN extraño heterólogo en las células vegetales, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma vegetal se confirma por diversos métodos tales como análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado. El análisis por PCR es un método rápido para analizar células, tejido o retoños transformados para la presencia del gen incorporado en la fase previa antes de transplantarse al suelo (Sambrook and Russell (2001 ) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY)). La PCR se lleva a cabo usando cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen de interés o antecedentes de vectores de Agrobacterium, etc. La transformación en plantas puede confirmarse por análisis de hibridación tipo Southern de ADN genómico (Sambrook and Russell (2001 ) supra). En general, se extrae ADN total de la transformante, se digiere con enzimas de restricción apropiadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nylon. La membrana o "blot" entonces puede sondearse, por ejemplo, con un fragmento de ADN objetivo con 32P radioetiquetado para confirmar la integración del gen introducido en el genoma vegetal de conformidad con técnicas estándar (Sambrook and Russell, 2001 , supra). En el análisis Northern, se aisla ARN de tejidos específicos de la transformante, se fracciona en un gel de agarosa con formaldehído y se emborrona sobre un filtro de nylon de conformidad con procedimientos estándar que se usan de manera rutinaria en la técnica (Sambrook and Russell (2001 ) supra). La expresión de ARN codificado por secuencias grg de la invención entonces se prueba al hibridar el filtro con una sonda radioactiva derivada de una GDC por métodos conocidos en la técnica (Sambrook and Russell (2001 ) supra) La hibridación tipo Western y ensayos bioquímicos y similares, pueden llevarse a cabo en las plantas transgénicas para determinar la presencia de proteina codificada por el gen de resistencia a herbicidas por procedimientos estándar (Sambrook and Russell (2001 ) supra) usando anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en la proteína de resistencia a herbicidas.

F. Plantas y Partes de Plantas Por "planta" se quiere decir plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de los mismos. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o indiferenciadas (por ejemplo, callo, células en cultivo en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíces, células de floema, polen). La presente invención puede usarse para la introducción de polinucleótidos en cualquier especie vegetal, incluyendo, pero sin limitarse a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, elote (maíz), sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soya, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y semilla de colza, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuates, camote, yuca, café, coco, piña, cítricos, cocoa, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, oliva, papaya, anacardo, macadamia, almendra, avena, vegetales, ornamentales y coniferas. Los vegetales incluyen, pero no se limitan a, tomates, lechuga, ejotes, judías de lima, chícharos y miembros del género Curcumis tales como pepino, cantalupo y melón. Las ornamentales incluyen, pero no se limitan a, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, clavel, noche buena y crisantemo. Las plantas de cultivo también son de interés, incluyendo, por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soya, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, semilla de colza, etc. Esta invención es adecuada para cualquier miembro de la familia de plantas monocotiledóneas incluyendo, pero sin limitarse a, maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, piña, batatas, cebolla, plátano, coco y dátiles.

G. Métodos para Incrementar el Rendimiento Vegetal Se proporcionan métodos para incrementar el rendimiento vegetal. Los métodos comprenden introducir en una planta o célula vegetal un polinucleótido que comprende una secuencia de EPSP sintasa que tiene un dominio de secuencia descrito en este documento. Como se define en este documento, el "rendimiento" de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. Por "biomasa" se quiere decir cualquier producto vegetal medido. Un incremento en producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto vegetal medido. El rendimiento vegetal creciente tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, la biomasa creciente de las hojas de la planta puede incrementar el rendimiento de vegetales con hojas para consumo humano o animal. Adicionalmente, la biomasa creciente de las hojas puede usarse para incrementar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un incremento en el rendimiento puede comprender cualquier incremento significativo incluyendo, pero sin limitarse a, por lo menos un 1 % de incremento, al menos un 3% de incremento, al menos un 5% de incremento, al menos un 10% de incremento, al menos un 20% de incremento, al menos un 30%, al menos un 50%, al menos un 70%, al menos un 100% o un incremento mayor. En métodos específicos, la planta se trata con una concentración efectiva de un herbicida, donde la aplicación de herbicidas da como resultado un rendimiento vegetal potenciado. Por "concentración efectiva" se quiere decir la concentración que permite el rendimiento incrementado en la planta. Tales concentraciones efectivas para los herbicidas de interés se conocen en general en la técnica. El herbicida puede aplicarse ya sea antes o después de la emergencia de acuerdo con técnicas usuales para la aplicación de herbicidas a campos que comprenden cultivos que se han vuelto resistentes al herbicida por la expresión heteróloga de un gen de EPSP sintasa de la invención. También se proporcionan métodos para conferir resistencia a herbicidas en una planta o parte de la planta. En tales métodos, un polinucieótido de EPSP sintasa descrito en este documento se introduce en la planta, en donde la expresión del polinucieótido da como resultado tolerancia o resistencia a giifosato. Las plantas producidas mediante este método pueden tratarse con una concentración efectiva de un herbicida y mostrar una tolerancia incrementada al herbicida. Una "concentración efectiva" de un herbicida en esta solicitud es una cantidad suficiente para desacelerar o detener el crecimiento de plantas o partes de la planta que no son resistentes o se hacen resistentes en forma natural al herbicida.

H. Métodos para controlar malezas en un campo También se proporcionan métodos para controlar malezas selectivamente en un campo que contiene una planta. En una modalidad, las semillas de la planta o plantas son resistentes a giifosato como resultado de que un polinucieótido que tiene un dominio de secuencia descrito en este documento se inserte en la semilla de la planta o planta. En métodos específicos, la planta se trata con una concentración efectiva de un herbicida, donde la aplicación de herbicidas resulta en un control selectivo de malezas u otras plantas no transformadas. Por "concentración efectiva" se quiere decir la concentración que controla el crecimiento o diseminación de malezas u otras plantas no transformadas sin afectar significativamente la planta o semilla de- la planta resistente a glifosato. Tales concentraciones efectivas para los herbicidas de interés se conocen en general en la técnica. El herbicida puede aplicarse ya sea antes o después de la emergencia de acuerdo con técnicas usuales para la aplicación de herbicidas a campos que comprenden plantas o semillas de plantas que se han vuelto resistentes al herbicida. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación.

PARTE EXPERIMENTAL Ejemplo 1 . Diseño y expresión de syngrql Una secuencia génica novedosa que codifica la proteína GRG1 (SEQ ID NO: 2; Solicitud de Patente Norteamericana No. 10/739,610) se diseñó y sintetizó. Esta secuencia se proporciona como la SEQ ID NO: 3. Este marco abierto de lectura, designado "syngrg en este documento, se clonó en el vector de expresión pRSFI b (Invitrogen), por métodos conocidos en la técnica.

Ejemplo 2. Mutaqénesis Dirigida de GRG1 La solicitud de patente norteamericana número 1 1 /651 ,752 presentada el 12 de enero de 2006 (incorporada en este documento para referencia) describe el asa Q como una región importante para conferir resistencia a glifosato a las EPSP sintasas. El asa Q se define como la región desde la valina que corresponde a la posición del aminoácido 80 de la SEQ ID NO: 2 (GRG1 ) hasta la glutamina que corresponde a la posición del aminoácido 105 de la SEQ ID NO: 2. Para los propósitos de la presente invención, la discusión del asa Q se restringirá además a una región que comprende la región "núcleo" del asa Q que abarca desde la isoleucina que corresponde a la posición del aminoácido 84 de la SEQ ID NO: 2 hasta la isoleucina que corresponde a la posición del aminoácido 99 de la SEQ ID NO: 2. En este documento se asigna un número de posición a los aminoácidos en esta región del núcleo para simplificar la remisión a cada residuo de aminoácido en esta región. De esta manera, las posiciones del núcleo del asa Q corresponden a los aminoácidos 84 hasta 99 de la SEQ ID NO: 2 (l-D-C-G-E-S-G-L-S-l-R-M-F-T-P-l) y se designan en este documento como sigue: Tabla 1. Designación de Puntos de Referencia de Posiciones para los aminoácidos del Núcleo del asa Q Aminoácido en GRG1 Posición designada en (SEQ ID NO: 2) (código el Núcleo del asa Q de letra única) I Posición 1 D Posición 2 C Posición 3 G Posición 4 E Posición 5 S Posición 6 G Posición 7 L Posición 8 S Posición 9 I Posición 10 R Posición 11 M Posición 12 F Posición 13 T Posición 14 P Posición 15 I Posición 16 Para facilitar la mutagénesis del gen syngrgl, se generó una variante de syngrgl que creó sitios de restricción convenientes que flanquean el asa Q. Esta secuencia de ADN variante codifica una proteína idéntica a la proteína GRG1. La mutagénesis de syngrgl se realizó usando el equipo QUIKCHANGE® Multisite (Stratagene, La Jolla, CA) usando los oligonucleótidos GATGGCAGCCTCCAGATCACTAGTGAAGGCGTTAAGCCAGTGGC (SEQ ID NO: 52) y GTTCACACCAATCGTGGCGCTTTCGAAGGAAGAAGTGACAATCAAG (SEQ ID NO: 53) para introducir simultáneamente dos sitios de restricción que flanquean la región del asa Q de GRG1 ; un sitio 5' Spe I del asa, y un sitio 3' BstB I a la región del asa Q. La secuencia de ADN del clon resultante, 'syngrgl -SB' (SEQ ID NO: 4) se confirmó por secuenciación de ADN.

Ejemplo 3. Mutagénesis combinatoria de svnara1-SB Una biblioteca de clones mutantes (Biblioteca 1 ) se desarrolló por mutagénesis combinatoria dentro de la región del núcleo del asa Q de GRG1 con un conjunto de 32 oligonucleótidos. Estos oligonucleótidos se diseñaron para introducir mutaciones en cuatro de los residuos del asa Q, en las posiciones 4, 5, 7 y 12 del Núcleo del asa Q (Tabla 1 y Figura 1 ). Los oligonucleótidos se resuspendieron en 10 mM de Tris-HCI pH 8.5 a una concentración de 10 µ?. Para formar moléculas de ADN de doble hebra, oligonucleótidos complementarios se mezclaron e incubaron como sigue: 95°C durante 1 minuto; 80°C durante 1 minuto; 70°C durante 1 minuto; 60°C durante 1 minuto; y 50°C durante 1 minuto. Las moléculas de ADN de doble hebra que contienen codones degenerados se digirieron con las enzimas de restricción Spe I y BstB I como se especifica por el fabricante. Después de la digestión de restricción, el ADN se cargó en un gel de agarosa al 4% y se sometió a electroforesis. El ADN se escindió del gel y se eluyó usando un equipo de extracción en geles QIAQUICK® (Qiagen, Valencia, CA). Los oligonucleótidos alineados por temperatura se ligaron en el pRSFI b-syngrg-SB, se digirieron con Spe I y BstB I, se trataron con fosfatasa alcalina bovina, se transformaron en células BL21 *DE3 (Invitrogen), y se colocaron en placas sobre placas de LB que contenían kanamicina. A partir de estas transformaciones de prueba, se estimó que la biblioteca contenía aproximadamente 140,000 clones. Para confirmar la diversidad de la biblioteca, 20 clones se escogieron de manera aleatoria de las placas de LB-kanamicina y se secuenciaron en la región del asa Q. Este análisis de secuencias confirmó la alta diversidad de la biblioteca, y demostró que 75% de los clones fueron de longitud completa y poseían un marco abierto de lectura intacto en la región del asa Q (datos no mostrados).

Ejemplo 4. Mutagénesis de permutación de svngrgl-SB El método de mutagénesis de permutación (Solicitud de Patente Norteamericana No. 60/813,095, presentada el 13 de junio de 2006 e incorporada en este documento para referencia en su totalidad) se usó para generar una segunda biblioteca de variantes en el asa Q. Las secuencias de aminoácidos de GRG1 , GRG20 (SEQ ID NO: 54; Solicitud de Patente Norteamericana No. 60/658,320) y GRG21 (SEQ ID NO: 55; Solicitud de Patente Norteamericana No. 60/658,320) se alinearon, y se desarrolló un conjunto de aminoácidos consenso (Figura 2). Una serie de oligonucleótidos se diseñó para introducir la diversidad representada en la Figura 2, que cubre la diversidad total de la traducción consenso del núcleo del asa Q como se muestra en la Tabla 3. Las posiciones 1 , 6, 1 1 , y 15 se conservan absolutamente entre GRG1 , GRG20, y GRG21. La diversidad potencial generada por esta metodología se muestra como la traducción consenso en la Figura 2 y en la SEQ ID NO: 48. Los oligonucleótidos se resuspendieron en 10 mM de Tris-HCI pH 8.5 a una concentración de 10 uM. Para formar moléculas de ADN de doble hebra, oligonucleótidos complementarios se mezclaron e incubaron como sigue: 95°C durante 1 minuto; 80°C durante 1 minuto; 70°C durante 1 minuto; 60°C durante 1 minuto; y 50°C durante 1 minuto. Los oligonucleótidos alineados por temperatura se ligaron a pRSF1 b-syngrgl-SB digerido con Spe I y BstB I, y se trataron con fosfatasa alcalina bovina. Las ligaciones de prueba se transformaron en BL21 *DE3 (Invitrogen) y se colocaron en placas en LB-kanamicina. A partir de estas transformaciones de prueba, se estimó que la biblioteca contenía aproximadamente 180,000 clones. Veinte clones se seleccionaron de manera aleatoria a partir de los clones que crecieron en LB y se secuenciaron. Se encontró que diecinueve de los 20 clones codificaban proteínas en fase de marco de lectura, de longitud completa, en la región del asa Q, a pesar de la generación de una gran cantidad de diversidad en la región. Altos grados de variación se observaron (en la totalidad de las 13 posiciones objetivo) en los veinte clones secuenciados, lo que sugiere que la diversidad de las bibliotecas alcanzó su nivel teórico (datos no mostrados).

Ejemplo 5. Selección para resistencia a glifosato en placas Las ligaciones de las bibliotecas se transformaron en células competentes BL21 *DE3 de E. coli (Invitrogen). Las transformaciones se realizaron de conformidad con las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones. Después de la incubación durante 1 hora a 37°C en medio SOC, las células se sedimentaron por centrifugación (5 minutos, 1000 x g, 4°C). Las células se lavaron con 1 mi de M63+, se centrifugaron nuevamente, y el sobrenadante se decantó. Las células se lavaron una segunda vez con 1 mi de M63+ y se resuspendieron en 200 ul de M63+. Para la selección de enzimas GRG1 mutantes que confieren resistencia a glifosato en E. coli, las células se colocaron en placas sobre placas de medio agar M63+ que contenía 50 mM de glifosato, 0.05 mM de IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido), y 50 ug/ml de kanamicina. El medio M63+ contiene 100 mM de KH2P04, 15 mM de (NH4)2S04, 50 µ? de CaCI2, 1 µ? de FeS04, 50 µ? de MgCI2> 55 mM de glucosa, 25 mg/litro de L-prolina, 10 mg/litro de tiamina HCI, suficiente NaOH para ajusfar el pH a 7.0, y 15 g/litro de agar. Las placas se incubaron durante 36 horas a 37°C.

Ejemplo 6. Preparación de extractos que contienen mutantes GRG- resistentes a glifosato Células BL21 *DE3 transformadas con mutantes GRG-1 , creciendo en placas de glifosato, se hicieron crecer en medio LB suplementado con 50 ug/ml de kanamicina a 37°C. Cuando los medios de cultivo alcanzaron una densidad óptica (600 nm) de 0.5, se agregó 0.5 mM de IPTG, y los cultivos se incubaron durante 16 horas a 20°C. Los cultivos se centrifugaron a 12,000 x g durante 15 minutos a 4°C, el sobrenadante se removió y las células se resuspendieron en 50 mM de Hepes/KOH pH 7.0, 300 mM de NaCI, 1 mg/ml de lisozima, 0.04 mi de DNasal. Las células resuspendidas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se sometieron a sonicación 3 veces durante 10 segundos usando un Misonix Sonicator 3000 en ajuste 7.5. Entre impulsos de sonicación, las células se incubaron en hielo durante 30 segundos. Los lisados de células se centrifugaron a 27000 x g durante 15 minutos a 4°C, y se recuperó el sobrenadante que comprende el extracto de células. Los extractos de células se dializaron 2x durante 4 horas contra 50 mM de Hepes/KOH pH 7.0, 300 mM de NaCI y se almacenaron a 4°C.

Ejemplo 7. Cuantificación de extractos que contienen mutantes GRG-1 resistentes a glifosato La expresión de proteínas variantes de GRG-1 en extractos de células se determinó por una hibridación cuantitativa en puntos con anticuerpos. Dos láminas de papel filtro 3MM se empaparon en regulador PBS 1x (20 mM de fosfato de potasio pH 7.2, 150 mM de NaCI) y se colocaron en uh colector de hibridación en puntos de 96 pozos (Schleicher and Schuell, Keene, NH). Una lámina de membrana de nitrocelulosa Optitran BA-S 83 (Schleicher and Schuell) se empapó en regulador PBS 1x y se colocó en la parte superior del papel filtro 3MM. Diluciones seriadas de extractos de células, así como diluciones de proteína GRG-1 silvestre purificada de concentración conocida ("estándares de proteína"), se prepararon en un volumen final de 100 ul de PBS 1x. Las muestras se cargaron en los pozos para hibridación en puntos y se aplicó un vacío de 0 cm de Hg. Los pozos se lavaron 3x veces con 300 ul de PBS. La membrana de nitrocelulosa se removió y bloqueó durante una hora en 3% de leche en polvo en PBS. La solución de bloqueo se removió y la membrana de nitrocelulosa se incubó con un anticuerpo monoclonal anti-6xHis conjugado con peroxidasa de rábano (Serotec, Raleigh, NC) diluida 1 :5000 en 3% de leche en polvo en PBS. Después de una hora incubación a temperatura ambiente, la membrana se lavó cuatro veces durante cinco minutos con PBS-T (0.05 % de Tween20 en PBS). La membrana se incubó con reactivo de detección para hibridación western ECL PLUS™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) durante cinco minutos a temperatura ambiente. La solución de detección se removió y una película Biomax Light (Kodak) se colocó en la parte superior de la membrana y se expuso durante diez minutos. La película se escaneó y la cuantificación de la señal se realizó usando el software Phoretlx Array (Nonlinear Dynamics, Durham, NC) por comparación con los estándares de proteína GRG1.

Ejemplo 8. Determinación de la actividad de EPSPS de variantes de GRG-1 Extractos que contienen proteínas GRG1 variantes se analizaron para actividad de EPSP sintasa usando ensayos como se describe previamente (Solicitud de Patente Norteamericana No. 60/741 ,166, incorporada en este documento para referencia en su totalidad). Los ensayos típicamente se llevaron a cabo en un volumen final de 50 ul que contenía 0.5 mM de shiquimato-3-fosfato, 0-500 uM de fosfoenolpiruvato (PEP), 1 U/ml de xantina oxidasa, 2 U/ml de nucleósido fosforilasa, 2.25 mM de inosina, 1 U/ml de peroxidasa de rábano, 0-2 mM de glifosato, 50 mM de Hepes/KOH pH 7.0, 100 mM de KCI, y AMPLEX® Red (Invitrogen) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los extractos típicamente se incubaron con todos los componentes del ensayo excepto shiquimato-3-fosfato y AMPLEX®Red durante 5 minutos a temperatura ambiente, y los ensayos se iniciaron al agregar shiquimato-3-fosfato y AMPLEX® Red. La actividad de EPSP sintasa se midió usando un espectrómetro de fluorescencia Spectramax Gemini XPS (Molecular Dynamics, excitación: 555 nm; emisión: 590 nm). Para la determinación inicial de los parámetros cinéticos, se realizaron ensayos en una sola concentración de PEP de 50uM, y la actividad de las enzimas se valoró a 0, 1 mM, y 2mM de glifosato. Los clones cuyos extractos mostraron poca o ninguna diferencia en actividad en 2mM vs. 1 mM de glifosato se seleccionaron para análisis cinético completo. Después de la determinación completa de los parámetros cinéticos, las constantes cinéticas se determinaron como sigue, ajusfando para la cantidad de proteína determinada ya sea por análisis de hibridación en puntos con anticuerpos como se describe en este documento, o por Ensayo de Bradford, como se conoce en la técnica. Para cualquier concentración de glifosato, la actividad de EPSP sintasa se midió como una función de un amplio intervalo de concentraciones de PEP. Los datos se adaptaron a la ecuación de Michaelis-Menten usando el software KALEIDAGRAPH® (Synergy Software) y se usaron para determinar la Km (Km aparente) de la EPSP sintasa en esa concentración de glifosato. Los valores de la Km aparente se determinaron no menores a 3 concentraciones de glifosato, y la K¡ de la EPSPS para glifosato se calcularon a partir de la gráfica de Km aparente vs. concentración de glifosato, usando la ecuación (m1 *x/(m2+x); m1 = 1 ; m2 = 1 ) como se conoce en la técnica.

Ejemplo 9. Determinación de residuos variantes de la Biblioteca 1 Para la Biblioteca 1 , 23 clones se identificaron por crecimiento en placas de glifosato 50mM. Se aisló ADN de estos veintitrés clones, y se determinó la secuencia de ADN de las regiones del asa Q de los clones. El análisis cinético se realizó en extractos sin purificar de la totalidad de los 23 clones (Figura 4 y SEQ ID NO: 5-43). De los clones identificados a partir de la Biblioteca 1 , se determinó que el clon L1 -C tenía el nivel más alto de resistencia a glifosato, y se realizó el análisis cinético completo. Este clon en este documento se designa syngrg1{evo2) y la proteína codificada se designa GRG1 (EV01 ) (SEQ ID NO: 5). La comparación de las secuencias resultantes de ADN contra las secuencias de ADN de los clones muestreados de manera aleatoria reveló que, de los cuatro residuos del núcleo alterados en la Biblioteca 1 , dos de los cuatro fueron intolerantes de la variación. Por ejemplo, para la posición 5 de la región del núcleo, sólo los clones que codifican ácido glutámico se representaron en la Biblioteca 1 bajo las condiciones usadas en este ensayo (por ejemplo, crecimiento en glifosato 50mM). Esto sugiere que la sustitución de los otros aminoácidos por ácido glutámico en esta posición no dio como resultado un clon resistente a glifosato detectabíe. A partir de este análisis se determina que, para la posición 5, el ácido glutámico es el residuo preferido, y para la posición 7, la glicina es el aminoácido preferido para el aumento de la resistencia a glifosato bajo las condiciones del ensayo descrito. Es posible que clones resistentes adicionales, que representan una diversidad adicional en esta región, pudieran identificarse a partir de una selección en concentraciones menores de glifosato (por ejemplo, 20 mM, 15 mM, 10 mM, o menos) o después de tiempos de incubación más prolongados (por ejemplo, mayores a 16 horas). De hecho, el Ejemplo 12, infra, demuestra que, a medida que la concentración de glifosato se incrementa, el número de clones resistentes disminuye.

Tabla 2. Mutagénesis de la Biblioteca 1 Ejemplo 10. Determinación de residuos variantes de la Biblioteca 2 La Biblioteca 2 tiene una diversidad teórica de más de 2,000,000 de clones, y aproximadamente 180,000 clones se probaron para resistencia a glifosato. Nueve clones se identificaron por crecimiento en placas de glifosato 50mM. Se aisló ADN de estos nueve clones y se determinó la secuencia de ADN de las regiones del asa Q de los clones. La comparación de las secuencias resultantes de ADN contra las secuencias de ADN de los clones muestreados de manera aleatoria mostró que muchos de los 13 residuos del núcleo alterados en la Biblioteca 2 fueron intolerantes de la variación (véase Tabla 3). Por ejemplo, la posición 8 de la región del núcleo se representó por los aminoácidos leucina, isoleucina, serina, arginina, metionina y prolina en la Biblioteca 2. Sin embargo, todo clon resistente a glifosato (que crece en glifosato 50mM) aislado contenía una Leucina en esta Posición 8. De esta manera, este método es útil para "mapear" los aminoácidos mutables en la región de) núcleo. De los clones identificados a partir de la Biblioteca 2, se determinó con base en análisis cinético que el clon 2-5 tenía la resistencia más alta a glifosato bajo las condiciones de este ensayo, y en este documento se designa syngrg1(evo1) y la proteína codificada se designa GRG1 (EV01 ) (SEQ ID NO: 28).

Tabla 3. Mutagénesis de la Biblioteca 2.

Ejemplo 1 1. Generación y aislamiento de evo3 v evo4 Una tercera biblioteca se generó usando los métodos anteriores, sacando provecho de la información de las Bibliotecas 1 y 2 de tal manera que sólo se utilizaron los residuos conocidos como mutables. La Biblioteca 3 se generó usando poblaciones de oligonucleótidos que codifican toda posibilidad de aminoácidos en las posiciones 2, 10, 14 y 16 (véase Figura 3). La Biblioteca 3 se generó como se describe anteriormente para la Biblioteca 1 , se transformó en E. coli, y se probó para clones que confieren resistencia a glifosato de manera similar a aquella para las Bibliotecas 1 y 2. Aproximadamente 150,000 bibliotecas se analizaron para crecimiento en placas de M63+ con glifosato 50mM, kanamicina e IPTG como en lo anterior. Se identificó que doscientos noventa y dos clones crecen en este glifosato 50mM. Estos doscientos noventa y dos clones entonces se recultivaron sobre placas similares que contenían glifosato 100 mM o 200 mM. Siete clones se identificaron por su crecimiento en 200 mM de glifosato, y los siete se analizaron directamente para sus propiedades cinéticas. La secuencia de ADN de la región del asa Q de estos clones se determinó entonces. Dos clones, syngrg1{evo3) (SEQ ID NO: 37; también referido en este documento como evo3), y syngrg1(evo4) (SEQ ID NO: 43; también referido en este documento como evo4), se identificaron por tener la mejora más grande en los parámetros cinéticos.

Tabla 4. Muestreo de variantes del asa Q en la Biblioteca 3.

Ejemplo 12. EVQ1 . EVQ2. EVQ3 y EVQ4 tienen propiedades cinéticas mejoradas El análisis cinético de EV01 , EV02, EV03 y EV04 demuestra que las cuatro proteínas exhiben resistencia mejorada a glifosato respecto a GRG1 (Tabla 5). Las cuatro proteínas exhiben una K¡ mejorada para glifosato y retienen una Km razonable para PEP por debajo de 200 mM. EV03 exhibe resistencia muy alta a glifosato, y una Km para PEP que es virtualmente idéntica a GRG1 . EV04 tiene resistencia muy alta a glifosato, y una Km razonable, aunque de alguna manera elevada, para PEP.

Tabla 5. Cinética de EV01 -EV04 vs. GRG1. CRG-1 wt EV01 EV02 EV03 EV04 Ki (µ?) vs. GRG1 ++ +++ +++ ++++ ++++ Ejemplo 13. Combinaciones Adicionales de Variantes del Asa Q; Biblioteca 4 Dada la identificación de residuos funcionales en el núcleo del asa Q, y dada la identificación de clones con función mejorada, puede generarse una biblioteca adicional que combina los residuos alterados identificados en los clones mejorados. Un método para lograr esta biblioteca es generar una biblioteca combinatoria usando oligonucleótidos, de manera similar a la Biblioteca 1 . Alternativamente, puede generarse una biblioteca de permutación como en la Biblioteca 2. Las secuencias de aminoácidos de EV01 , EV02, EV03 y EV04 se alinearon, la traducción consenso se derivó (SEQ ID NO: 50) y se diseñaron oligonucleótidos para generar una biblioteca de permutación. Esta biblioteca tiene una diversidad teórica de aproximadamente 1500 clones. Los oligonucleótidos se acoplaron por temperatura como se describe en este documento y se ligaron a pRSF1 b-syngrg 1 -SB que se digirió con Spe I y BstB I, y se trataron con fosfatasa alcalina bovina. La biblioteca resultante se colocó en placas, en placas de M63+ (como se describe anteriormente) conteniendo glifosato 50mM. Catorce clones se identificaron por su crecimiento en glifosato 50mM. La proteína expresada a partir de estos catorce clones se probó para (1 ) resistencia mejorada a glifosato y (2) afinidad sin perturbación por PEP. Seis de estos catorce clones [grg1(4S-10) (SEQ ID NO: 66), grg1 (4S-16) (SEQ ID NO: 69); grg1(4S-28) (SEQ ID NO: 70); grg1 (4S-3) (SEQ ID NO: 71 ); grg1 (4S-39) (SEQ ID NO: 72); y grg1(4S-60) (SEQ ID NO: 73)] que codifican las proteínas GRG1 (4S-10) (SEQ ID NO: 56); GRG1 (4S-16) (SEQ ID NO: 59); GRG1 (4S-28) (SEQ ID NO: 60); GRG1 (4S-3) (SEQ ID NO: 61 ); GRG1 (4S-39) (SEQ ID NO: 62); y GRG1 (4S-60) (SEQ ID NO: 63), respectivamente, demostraron resistencia mejorada a glifosato y buena afinidad por PEP. grg1 {4s-10) se renombró grg1(evo5) (SEQ ID NO: 66), y la proteína que codifica se designó como GRG1 (EV05) (SEQ ID NO: 56). El análisis cinético de la proteína GRG1 (EV05) (Tabla 6), determinó que GRG1 (EV05) tiene una relación k¡/km de 1769.

Tabla 6. Cinética de las variantes seleccionadas.

Los cambios de aminoácidos identificados en estas seis variantes proporcionan una delineación adicional de los residuos clave en el asa Q que contribuyen a la resistencia a glifosato.

Tabla 7. Muestreo de variantes del asa Q en la Biblioteca 5.

Ejemplo 14. Mutaqénesis aleatoria para incrementar la solubilidad de GRGKEVQ5); Biblioteca 5. El ADN de grg1(evo5) se mutagenizó por PCR como se conoce en la técnica, y se clonó en pRSFI b (Invitrogen), y una biblioteca de clones mutagenizados se identificó en virtud del crecimiento en glifosato 50mM. Estos clones entonces se analizaron por hibridación cuantitativa en puntos como se describe en este documento, y dos clones con modificaciones respecto a grg1(evo5) [(grg1(5.2.A 10) (SEQ ID NO: 67) y grg1(5.2.B6) (SEQ ID NO: 68)], que codifican GRG1 (5.2.A10) (SEQ ID NO: 57) y GRG1 (5.2.B6) (SEQ ID NO: 58), respectivamente, se seleccionaron en virtud de la demostración de un incremento sustancial en la proteína soluble. GRG1 (5.2.A10) (SEQ ID NO: 57) y GRG1 (5.2.B6) (SEQ ID NO: 58) tienen cada una un solo cambio de aminoácido respecto a GRG1 (EV05). Estos cambios se muestran en la Tabla 8. La región codificante de EPSPS de 5.2.A10 se renombró como grg1(evo6) (SEQ ID NO: 67), y su proteína codificada como GRG1 (EV06) (SEQ ID NO: 57).

Tabla 8. Resumen de mutaciones en las Variantes 5.2.A10 (GRG1 (EV06)) y Ejemplo 15. ara evo7) y ara1(evo8) grg1(evo7) (SEQ ID NO: 74), que codifica la proteína GRG1 (EV07) (SEQ ID NO: 64), y grg1(evo8) (SEQ ID NO: 75), que codifica la proteína GRG1 (EV08) (SEQ ID NO: 65), se aislaron como clones resistentes a glifosato después de la mutagénesis de grg1(evo6) en la región del asa Q. El análisis cinético de GRG1 (EV07) y GRG1 (EV08) muestra que ambos clones tienen además propiedades cinéticas mejoradas sobre GRG1 (EV06).

Tabla 9. Cinética de las variantes seleccionadas GRG1 (EV06) GRG1 (EV07) GRG1 (EV08) k¡ (µ?) 7,21 1 16,200 1 ,426 Km (pM) 16 13 20 Vmax (nmol/min/ug) 7 15 6 k¡/km 451 1 ,246 71 Ejemplo 16. Resumen de la Mutaqénesis de la Región del Núcleo del Asa Q Dada la mutagénesis extensiva de la región del núcleo del asa Q, el aislamiento de variantes que continúan exhibiendo resistencia a glifosato, y el aislamiento de variantes mejoradas, pueden inferirse los aminoácidos clave responsables de conferir resistencia mejorada a glifosato en una cadena principal de GRG1. Los datos se resumen en la Tabla 10.

Tabla 10. Resumen de mutagénesis de GRG1 Ejemplo 17. Delineación Adicional de aminoácidos clave in asa Q. La secuencia de aminoácidos de las variantes aisladas aquí expande y delinea además los aminoácidos clave tolerados y deseados en esta región. De esta manera, las variaciones del dominio del núcleo del asa Q (posiciones 2-16, que corresponden a las posiciones 85-99 de la SEQ ID NO: 2) que confieren resistencia a glifosato pueden resumirse por la expresión X-C-X-E-S-G-L-S-X-R-X-F-X-P-X (SEQ ID NO: 44), (donde X es cualquier aminoácido).

En una modalidad, el dominio se representa por X^C-XrE-S-G-L-S-Xa-R-X^F-Xs-P-X6 (SEQ ID NO: 45), y en donde X1 denota D, K, E, S, G, P, o R o N, y X2 denota G, Q, V, D, E, I, N, M, A, T, S o R, y X3 denota I, G, S, M, F o V, X4 denota M, A, S, G, Q, L, V o I, X5 denota T, P, L, G, A, V o I, y X6 denota I, L, C, A, F o M. En otra modalidad, el dominio se representa por (SEQ ID NO: 76), en donde t denota glutamina, valina, prolina, ácido glutámico, isoleucina, metionina o treonina y X2 denota cualquier aminoácido.

Ejemplo 18. Clonación de svnaral, evol, evo2. evo3. evo4. evo5. evo6. evo7 y evo8 en un cásete de expresión vegetal. Para cada uno de syngrgl, evol, evo2, evo3, evo4, evo5, evo6, evo 7 y evo8, el marco abierto de lectura (ORF) se amplifica por PCR a partir de una plantilla de ADN de longitud completa. Sitios de restricción Hind III se agregan a cada extremo de los ORFs durante la PCR. Adicionalmente, la secuencia de nucleótidos ACC se agrega inmediatamente 5' al codón de inicio del gen para incrementar la eficiencia de traducción (Kozak (1987) Nucleic Acids Research 15:8125-8148; Joshi (1987) Nucleic Acids Research 15:6643-6653). El producto de PCR se clona y se secuencia usando técnicas bien conocidas en el arte para garantizar que no se introduzcan mutaciones durante la PCR. El plásmido que contiene el producto de PCR se digiere con Hind III y se aisla el fragmento que contiene el ORF intacto. Este fragmento se clona en el sitio Hind III de un plásmido tal como pAX200, un vector de expresión vegetal que contiene el promotor de actina de arroz (McEIroy et al. (1991 ) Molec. Gen. Genet. 231 :150-160) y el terminador Pinll (An ef al. (1989) The Plant Cell 1 : 1 1 5-122). El fragmento promotor - gen - terminador de este plásmido intermedio se subclona entonces en el plásmido pSB1 1 (Japan Tobacco, Inc.) para formar un plásmido final basado en pSB1 1 . En algunos casos, puede preferirse generar una construcción alterna en que una secuencia líder de cloroplasto se codifica como una fusión al extremo terminal N de las construcciones syngrgl, evol, evo2, evo3, evo4, evo5, evo6, evo7 y evo8. Estos plásmidos basados en pSB1 1 típicamente se organizan de tal manera que el fragmento de ADN que contiene la construcción promotor - gen - terminador, o construcción promotor-líder de cloroplasto-gen-terminador puede escindirse por doble digestión por enzimas de restricción, tales como Kpn I y Pme I, y usarse para la transformación en plantas por inyección por haces en aerosol. La estructura de los clones basados en pSB1 1 resultantes se verifica por digestión de restricción y electroforesis en gel, y por secuenciación a lo largo de los diversos empalmes de clonación. El plásmido se moviliza hacia Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404 que también alberga el plásmido pSB1 (Japan Tobacco, Inc.), usando procedimientos de apareamiento de tres progenitores bien conocidos en la técnica, y colocando en placas en medios que contienen espectinomicina. El clon con el plásmido basado en pSB1 1 lleva resistencia a espectinomicina pero es un plásmido de amplitud estrecha de huéspedes y no puede replicarse en Agrobacterium. Las colonias resistentes a espectinomicina surgen cuando los plásmidos basados en pSB1 1 se integran en el plásmido pSB1 de amplitud amplia de huéspedes a través de recombinación homologa. El producto cointegrado de pSB1 y el plásmido basado en pSB1 1 se verifican por hibridación Southern. La cepa de Agrobacterium que alberga el cointegrado se usa para transformar maíz por métodos conocidos en la técnica, tal como, por ejemplo, el método Purelntro (Japan Tobacco).

Ejemplo 19. Transformación de Células de Maíz por Haz en Aerosol Las mazorcas de maíz se recolectan mejor 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aislan de las mazorcas, y aquellos embriones de 0.8-1 .5 mm de tamaño se prefieren para su uso en la transformación. Los embriones se colocan en placas, escudete hacia arriba, en un medio adecuado de incubación, tales como medios DN62A5S (3.98 g/L de Sales N6; 1 ml/L (de Reserva 1000x) de Vitaminas N6; 800 mg/L de L-Asparagina; 100 mg/L de Mio-inositol; 1 .4 g/L de L-Prolina; 100 mg/L de Casaminoácidos; 50 g/L de sacarosa; 1 ml/L (de reserva 1 mg/ml) de 2,4-D). Sin embargo, medios y sales diferentes a DN62A5S son adecuados y se conocen en la técnica. Los embriones se incuban durante la noche a 25°C en oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones durante la noche. Los explantes resultantes se transfieren a cuadros de malla (30-40 por placa), se transfieren sobre medios osmóticos durante aproximadamente 30-45 minutos, entonces se transfieren a una placa radiante (véase, por ejemplo, Publicación PCT No. WO/0138514 y Patente Norteamericana No. 5,240,842). Las construcciones de ADN diseñadas para expresar las proteínas GRG de la presente invención en células vegetales se aceleran hacia el tejido vegetal usando un acelerador de haces en aerosol, usando condiciones esencialmente como se describe en la Publicación PCT No. WO/0138514. Después de dirigir las emisiones, los embriones se incuban durante aproximadamente 30 min en medios osmóticos, y se colocan sobre medios de incubación durante la noche a 25°C en oscuridad. Para evitar que los explantes radiados se dañen indebidamente, se incuban durante al menos 24 horas antes de transferirse a medios de recuperación. Los embriones entonces se diseminan sobre medios para periodo de recuperación, durante aproximadamente 5 días, 25°C en oscuridad, entonces se transfieren a un medio de selección. Los explantes se incuban en medios de selección durante hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, el callo resultante se transfiere a medios para maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes entonces se colocan bajo luz baja, y el proceso de regeneración se inicia por los métodos conocidos en la técnica. Los retoños resultantes se dejan enraizar en medios para raíces, y las plantas resultantes se transfieren a macetas para invernadero y se propagan como plantas transgénicas.

Materiales Medios DN62A5S Ajustar el pH de la solución a pH 5.8 con KOH 1 N/KCI 1 N, agregar Gelrite (Sigma) a 3 g/L y esterilizar con autoclave. Después de enfriar a 50°C, agregar 2 ml/L de una solución de reserva 5 mg/ml de Silver Nitrate (Phytotechnology Labs). La fórmula rinde aproximadamente 20 placas.

Ejemplo 20. Transformación de enzimas EPSP sintasas en Células Vegetales de Maíz por Transformación Mediada por Agrobacterium Las mazorcas se recolectan mejor 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aislan de las mazorcas, y aquellos embriones de 0.8-1 .5 mm de tamaño se prefieren para su uso en la transformación. Los embriones se colocan en placas, escudete hacia arriba, en un medio adecuado de incubación, y se incuban durante la noche a 25°C en oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones durante la noche. Los embriones se ponen en contacto con una cepa de Agrobacterium que contiene los vectores apropiados que tienen una enzima EPSP sintasa con una región del dominio del asa Q de la presente invención para transferencia mediada por el plásmido Ti durante aproximadamente 5-10 min, y entonces se colocan en placas sobre medios de co-cultivo durante aproximadamente 3 días (25°C en oscuridad). Después del co-cultivo, los explantes se transfieren a medios para periodo de recuperación durante aproximadamente cinco días (a 25°C en oscuridad). Los explantes se incuban en medios de selección durante hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, el callo resultante se transfiere a medios para maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes entonces se colocan bajo luz baja, y el proceso de regeneración se inicia como se conoce en la técnica. Los retoños resultantes se dejan enraizar en medios para raíces, y las plantas resultantes se transfieren a macetas para invernadero y se propagan como plantas transgénicas.

Ejemplo 21 . Plantas Transqénicas que expresan arq1(evo5) y grq1(evo6) El gen grg1(evo5) gen y los genes grg1(evo6) se clonaron cada uno en un vector de expresión vegetal adecuado para la transformación mediada por Agrobacterium, tal vector conteniendo al menos (1 ) un promotor capaz de expresión en una célula vegetal, (2) una secuencia codificante líder para péptidos en cloroplastos, (3) un terminador transcripcional. Los clones resultantes, pAX4014 y pAX4032 respectivamente, se transfirieron a Agrobacterium como se conoce en la técnica y se describe en este documento, y la cepa resultante de Agrobacterium se usó para desarrollar callo de maíz transgénico y, en última instancia, plantas transgénicas de maíz. El análisis de hibridación tipo Western de las plantas transgénicas mostró la expresión de GRG1 (EV05) en el tejido vegetal transgénico grg1(evo5), y la expresión de GRG1 (EV06) en el tejido vegetal transgénico grg1(evo6). Las plantas transgénicas T0 se asperjaron con formulaciones de glifosato de glifosato 14mM después de la adaptación al suelo, y la resistencia al herbicida se calificó después de dos semanas respecto a controles no transgénicos.

Tabla 11. Plantas Resistentes a Glifosato Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en este documento para referencia al mismo grado como si se indicara específica e individualmente que cada publicación o solicitud de patente individual se incorpora para referencia. Aunque la invención precedente se ha descrito en cierto detalle a manera de Ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden practicarse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Un polinucleótido aislado diferente a las SEQ ID NO: 1 y 46 que codifica un polipéptido de EPSP sintasa para tolerancia a glifosato, que tiene un dominio de secuencia seleccionado del grupo que consiste de: a) X-C-X-E-S-G-L-S-X-R-X-F-X-P-X (SEQ ID NO: 44), en donde X denota cualquier aminoácido; y, b) D-C-X X2-S-G (SEQ ID NO: 76), en donde denota glutamina, valina, prolina, ácido glutámico, isoleucina, metionina o treonina y X2 denota cualquier aminoácido. 2. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el dominio de secuencia es X C-Xa-E-S-G-L-S-Xa-R-X -F-Xs-P-Xe (SEQ ID NO: 45), y en donde X1 denota ácido aspártico, lisina, ácido glutámico, asparagina, serina, glicina, prolina o arginina; X2 denota asparagina, alanina, serina, glicina, glutamina, valina, prolina, ácido glutámico, isoleucina, metionina, treonina o arginina; donde X3 denota isoleucina, metionina, fenilalanina, glicina, serina o valina; donde X4 denota metionina, alanina, serina, glicina, glutamina, leucina, valina o isoleucina; donde X5 denota treonina, alanina, valina, isoleucina, prolina, leucina o glicina; y donde X6 denota isoleucina, leucina, cisteína, alanina, fenilalanina o metionina. 3. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido de EPSP sintasa que es resistente al herbicida glifosato. 4. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el dominio de secuencia corresponde a las posiciones de los aminoácidos 85 hasta 99 de la SEQ ID NO: 2 y se selecciona del grupo que consiste de las posiciones correspondientes de las SEQ ID NO: 5-43 y SEQ ID NO: 56-65. ' 5. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 4, en donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido de EPSP sintasa que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos que corresponden a las posiciones 1 hasta 84 y posiciones 100 hasta 431 de la SEQ ID NO: 2, en donde dicho polipéptido de EPSP sintasa es resistente al herbicida glifosato. 6. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , en que el polinucleótido codifica un polipéptido de fusión que comprende un péptido amino-terminal de tránsito en cloroplastos y la enzima EPSP sintasa. 7. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho polinucleótido es una secuencia sintética que se ha diseñado para su expresión en una planta. 8. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 7, en donde dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 3, 4, 66, 67, 74 y 75. 9. Un método para producir una planta transformada genéticamente que exhibe tolerancia a glifosato, que comprende las etapas de: a) insertar en el genoma de una célula vegetal un polinucleótido diferente a las SEQ ID NO: 1 y 46 que codifica un polipéptido de EPSP sintasa para tolerancia a glifosato, que tiene un dominio de secuencia seleccionado del grupo que consiste de: i) X-C-X-E-S-G-L-S-X-R-X-F-X-P-X (SEQ ID NO: 44), en donde X denota cualquier aminoácido; y, ii) D-C-X X2-S-G (SEQ ID NO: 76), en donde Xi denota glutamina, valina, prolina, ácido glutámico, isoleucina, metionina o treonina y X2 denota cualquier aminoácido; b) obtener una célula vegetal transformada; y, c) regenerar a partir de la célula vegetal transformada una planta transformada genéticamente que tiene tolerancia incrementada al herbicida glifosato. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde el dominio de secuencia es X C-Xj-E-S-G-L-S-Xa-R-Xí-F-Xs-P-Xe (SEQ ID NO: 45), y en donde denota ácido aspártico, lisina, ácido glutámico, asparagina, serina, glicina, prolina o arginina; X2 denota asparagina, alanina, serina, glicina, glutamina, valina, prolina, ácido glutámico, isoleucina, metionina, treonina o arginina; donde X3 denota isoleucina, metionina, fenilalanina, glicina, serina o valina; donde X4 denota metionina, alanina, serina, glicina, glutamina, leucina, valina o isoleucina; donde X5 denota treonina, alanina, valina, isoleucina, prolina, leucina o glicina; y donde X6 denota isoleucina, leucina, cisteína, alanina, fenilalanina o metionina. 1 1 . El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde el dominio de secuencia corresponde a las posiciones 85 hasta 99 de la SEQ ID NO: 2 y se selecciona del grupo que consiste de las posiciones correspondientes de las SEQ ID NO: 5-43 y SEQ ID NO: 56-65. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el polinucleótido codifica un polipéptido de EPSP sintasa que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos que corresponden a las posiciones 1 hasta 84 y posiciones 100 hasta 431 de la SEQ ID NO: 2, en donde dicho polipéptido de EPSP sintasa es resistente al herbicida glifosato. 13. El método de conformidad con la reivindicación 9, en que el polinucleótido codifica un polipéptido de fusión que comprende un péptido amino-terminal de tránsito en cloroplastos y la enzima EPSP sintasa. 14. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde dicho polinucleótido es una secuencia sintética que se ha diseñado para su expresión en una planta. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 3, 4, 66, 67, 74 y 75. 16. Una célula vegetal tolerante a glifosato que comprende un polinucleótido heterólogo diferente a las SEQ ID NO: 1 y 46 que codifica un polipéptido de EPSP sintasa para tolerancia a glifosato, que tiene un dominio de secuencia seleccionado del grupo que consiste de: a) X-C-X-E-S-G-L-S-X-R-X-F-X-P-X (SEQ ID NO: 44), en donde X denota cualquier aminoácido; y, b) D-C-X X2-S-G (SEQ ID NO: 76), en donde X^ denota glutamina, valina, prolina, ácido glutámico, isoleucina, metionina o treonina y X2 denota cualquier aminoácido. 17. La célula vegetal tolerante a glifosato de conformidad con la reivindicación 16, en donde el dominio de secuencia es X C^-E-S-G-L-S-Xs-R-X^F-Xs-P-Xe (SEQ ID NO: 45), y en donde X^ denota ácido aspártico, lisina, ácido glutámico, asparagina, serina, glicina, prolina o arginina; X2 denota asparagina, alanina, serina, glicina, glutamina, valina, prolina, ácido glutámico, isoleucina, metionina, treonina o arginina; donde X3 denota isoleucina, metionina, fenilalanina, glicina, serina o valina; donde X4 denota metionina, alanina, serina, glicina, glutamina, leucina, valina o isoleucina; donde X5 denota treonina, alanina, valina, isoleucina, prolina, leucina o glicina; y donde X6 denota isoleucina, leucina, cisteína, alanina, fenilalanina o metionina. 18. La célula vegetal tolerante a glifosato de conformidad con la reivindicación 17, en donde el dominio de secuencia corresponde a las posiciones 85 hasta 99 de la SEQ ID NO: 2 y se selecciona del grupo que consiste de las posiciones correspondientes de las SEQ ID NO: 5-43 y SEQ ID NO: 56-65. 19. La célula vegetal tolerante a glifosato de conformidad con la reivindicación 18, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido de EPSP sintasa que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos que corresponden a las posiciones 1 hasta 84 y posiciones 100 hasta 431 de la SEQ ID NO: 2, en donde dicho polipéptido de EPSP sintasa es resistente al herbicida glifosato. 20. La célula vegetal tolerante a glifosato de conformidad con la reivindicación 16, en que el polinucleótido codifica un polipéptido de fusión que comprende un péptido amino-terminal de tránsito en cloroplastos y la enzima EPSP sintasa. 21. La célula vegetal tolerante a glifosato de conformidad con la reivindicación 16, en donde dicho polinucleótido es una secuencia sintética que se ha diseñado para su expresión en una planta. 22. La célula vegetal tolerante a glifosato de conformidad con la reivindicación 21 , en donde dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 3, 4, 66, 67, 74 y 75. 23. La célula vegetal tolerante a glifosato de conformidad con la reivindicación 16, seleccionada del grupo que consiste de elote, trigo, arroz, cebada, soya, algodón, remolacha azucarera, semilla de colza, cañóla, lino, girasol, papa, tabaco, tomate, alfalfa, álamo, pino, eucalipto, manzana, lechuga, chícharos, lentejas, uva y hierbas de césped. 24. Una planta tolerante a glifosato que comprende la célula vegetal de conformidad con la reivindicación 16. 25. Una semilla transformada que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1. 26. La planta tolerante a glifosato de conformidad con la reivindicación 25, seleccionada del grupo que consiste de elote, trigo, arroz, cebada, soya, algodón, remolacha azucarera, semilla de colza, cañóla, lino, girasol, papa, tabaco, tomate, alfalfa, álamo, pino, eucalipto, manzana, lechuga, chícharos, lentejas, uva y hierbas de césped. 27. Un método para controlar malezas selectivamente en un campo que contiene una planta que tiene semillas plantadas o plantas, que comprende las etapas de: a) plantar las semillas o plantas que son tolerantes a glifosato como resultado de que un polinucleótido diferente a las SEQ ID NO: 1 y 46 se inserte en la semilla o planta, dicho polinucleótido codificando un polipéptido de EPSP sintasa para tolerancia a glifosato, que tiene un dominio de secuencia seleccionado del grupo que consiste de: i) X-C-X-E-S-G-L-S-X-R-X-F-X-P-X (SEQ ID NO: 44), en donde X denota cualquier aminoácido; y, ii) D-C-XrX2-S-G (SEQ ID NO: 76), en donde X denota glutamina, valina, prolina, ácido glutámico, isoleucina, metionina o treonina y X2 denota cualquier aminoácido; y, b) aplicar, a las plantas y malezas en un campo, una concentración efectiva del herbicida glifosato para controlar las malezas sin afectar significativamente a las plantas. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde dicho dominio de secuencia es XrC^-E-S-G-L-S-Xa-R Q-F-Xs-P-Xe (SEQ ID NO: 45), y en donde X1 denota ácido aspártico, lisina, ácido glutámico, asparagina, serina, glicina, prolina o arginina; X2 denota asparagina, alanina, serina, glicina, glutamina, valina, prolina, ácido glutámico, isoleucina, metionina, treonina o arginina; donde X3 denota isoleucina, metionina, fenilalanina, glicina, serina o valina; donde X4 denota metionina, alanina, serina, glicina, glutamina, leucina, valina o isoleucina; donde X5 denota treonina, alanina, valina, isoleucina, prolina, leucina o glicina; y donde X6 denota isoleucina, leucina, cisteína, alanina, fenilalanina o metionina. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, en donde el dominio de secuencia corresponde a las posiciones 85 hasta 99 de la SEQ ID NO: 2 y se selecciona del grupo que consiste de las posiciones correspondientes de las SEQ ID NO: 5-43 y SEQ ID NO: 56-65. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido de EPSP sintasa que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos que corresponden a las posiciones 1 hasta 84 y posiciones 100 hasta 431 de la SEQ ID NO: 2, en donde dicho polipéptido de EPSP sintasa es resistente al herbicida glifosato. 31. El método de conformidad con la reivindicación 28, en que el polinucleótido codifica un polipéptido de fusión que comprende un péptido amino-terminal de tránsito en cloroplastos y la enzima EPSP sintasa. 32. El método de conformidad con la reivindicación 28, en donde dicho polinucleótido es una secuencia sintética que se ha diseñado para su expresión en una planta. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, en donde dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 3, 4, 66, 67, 74 y 75. 34. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una enzima EPSPS de tolerancia a glifosato, en donde dicha enzima EPSPS de tolerancia a glifosato tiene una K¡ (glifosato)/ Km (PEP) entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1700. 35. Una planta que tiene incorporada, de manera estable en su genoma, una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido EPSPS de tolerancia a glifosato, dicho polipéptido EPSPS teniendo una K¡ (glifosato)/ Km (PEP) entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1700, dicha planta exhibiendo tolerancia al herbicida glifosato. 36. La planta de conformidad con la reivindicación 35, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste de elote, trigo, arroz, cebada, soya, algodón, remolacha azucarera, semilla de colza, cañóla, lino, girasol, papa, tabaco, tomate, alfalfa, álamo, pino, eucalipto, manzana, lechuga, chícharos, lentejas, uva y hierbas de césped.