CN102399794A - 一种棉花epsp合成酶突变体基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种棉花EPSP合成酶突变体以及编码这种突变EPSP合成酶的人工突变体基因MC-EPSPS。根据文献资料及蛋白结构分析，设计突变位点，利用DNA序列的同源重组特性及PCR扩增法，以来自陆地棉的EPSP合成酶基因为模板，采用DNA序列多点突变的优化方法，获得两个氨基酸位点发生突变的、并具有抗草甘膦功能的突变体基因。其编码的合成酶与草甘膦的结合效率明显降低，并具有一定的酶催化效率。本发明所提供的EPSP合成酶突变体基因可应用于抗草甘膦转基因植物新品种培育。

Description

一种棉花EPSP合成酶突变体基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程研究领域，具体涉及棉花EPSP合成酶基因的改造及表达载体的构建，以及在抗草甘膦转基因植物品种研制中的应用。

背景技术

草甘膦是一种非选择性除草剂，具有广谱除草和土壤中迅速降解的优点，而且由于动物体内不存在这种酶，是对人、畜最安全的除草剂之一。草甘膦理化性质稳定、高效、广谱、低毒、低残留、易于被微生物分解，不破坏土壤环境等优点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的农药品种。自从1976年美国孟山都公司的草甘膦类除草剂-农达(Roundup)研制成功并得到广泛应用以来，作物抗草甘膦转基因研究成为抗除草剂基因工程研究的热点。随着抗草甘膦基因克隆的发展，抗草甘膦转基因作物也相继问世并大面积推广应用。

草甘膦的作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。该酶是真菌、细菌、藻类和高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键性的酶。草甘膦是磷酸稀醇式丙酮酸(PEP)的类似物，是EPSPS竞争性抑制剂，草甘膦、EPSPS和三磷酸莽草酸(S3P)结合形成EPSPS-S3P-草甘膦复合体(此复合体非常稳定)，抑制EPSPS的活性导致分支酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，最终导致一些激素和关键性代谢物如类黄酮、木质素和酚类化合物代谢失调，从而扰乱了生物体正常的氮代谢而使其死亡。

目前植物抗草甘膦转基因工程研究有四种方法：1)选用对草甘膦不敏感的EPSPS或通过氨基酸序列改变获得抗性EPSPS基因；2)将编码EPSPS在植物体中过量表达；3)导入降解草甘膦的基因(如编码草甘膦氧化还原酶的gox基因)；4)导入氮乙酰转移酶(GAT基因)使草甘磷乙酰化等(Barry et al.，1992；Padgetteet al.，1996；Dill，2005；Tan et al.，2006；Castle et al.，2004)。其中商业化使用最广泛的是在植物中过量表达对草甘膦不敏感或突变的EPSPS基因。

选用抗性EPSPS基因是获得转基因作物的关键因子。改变EPSPS功能区的氨基酸序列，降低其与草甘膦的亲和力，同时保持酶的催化活性。Stalker DM等(1985)应用化学诱变剂处理鼠伤寒沙门氏菌，从草甘膦抗性突变系中克隆了aroA基因的突变体，经DNA和蛋白质序列分析证实突变体中第101位的Ser取代了野生型中的Pro，将此突变体基因转入大肠杆菌中，获得了抗草甘膦特性；Sost D等(1990)克隆并测序了来自野生型Klebsiella pneumoniae和具有草甘膦抗性的突变型Klebsiella pneumoniae K1(它编码一个对草甘膦不敏感的EPSPS)的aroA基因，显示一个单碱基的不同导致在氨基酸序列中96位Gly变为Ala。Baerson SR等在马来群岛发现了一种具有草甘膦抗性的牛筋草(Eleusine indica)，该牛筋草比该地其它草甘膦敏感物种的LD50值要高出2-4倍，通过比较抗性牛筋草和感性牛筋草的EPSPS序列，发现有两个氨基酸不同，其中一个为有意突变，即抗性牛筋草EPSPS的第106的Pro被Ser替代。我国的向文胜等(2001)，筛选出的抗草甘膦菜豆与感性菜豆比较，抗性菜豆的513位为Gln，感性菜豆该位点为Glu。何鸣等(2002)获得抗性提高的鼠伤寒沙门氏杆菌和大肠杆菌的EPSPS基因，两个突变体在42位Met替换Thr。Monsanto公司将来自矮牵牛、番茄、拟南芥、大豆、玉米、鼠伤寒沙门氏菌的EPSPS基因的第80-120中的Gly替换为Ala，第170-210中的Ala替换为Thr，获得抗草甘膦的大豆、玉米、油菜等。

植物中过量表达EPSPS基因可显著增强植株抗草甘膦的功能。Amrhein等对通过逐渐增加草甘膦的选择压筛选到一个耐草甘膦矮牵牛细胞系，分析该细胞系EPSPS基因结果发现，目的基因拷贝数增加了20倍左右。利用35S启动子启动该基因在转基因植株中大量表达，转基因植株对草甘膦施用量的耐受程度为杀死非转基因植株用量的4倍以上。Todd A等对大量使用草甘膦农田中的长芒苋研究发现，抗草甘膦植株中EPSPS酶活与敏感型一致，但基因拷贝数比敏感型增加了5～160倍，进一步分析发现，其抗性高低与蛋白表达量及基因拷贝数成正相关。

EPSPS只有运输到叶绿体中才能发挥作用。因此在构建植物表达载体时在基因前需添加一段导肽序列，形成融合表达，便于目的蛋白向叶绿体中的定向转移。构建植物表达载体时，本发明选择棉花EPSPS基因的叶绿体导肽(CTP)作为目的基因的融合表达导肽。

载体构建中启动子后面加了一段OK(Omega & Kozak)序列，在基因终止密码子后加PS(Processing & Splicing sequence)(已在ZL 95 119563.8中充分公开)，可促进外源基因在植物体内的高效转录和翻译。

发明内容

本发明的目的在于提供一种棉花5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)突变体基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二个目的在于提供一种棉花EPSPS突变体的氨基酸序列，如SEQID NO：2所示。

本发明的第三个目的在于提供一种棉花EPSPS突变体融合基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO：3所示。

本发明的第四个目的在于提供一种棉花EPSPS突变体融合基因的氨基酸序列，如SEQ ID NO：4所示。

本发明的第五个目的在于提供含有所述棉花EPSPS突变体基因或其融合基因的植物表达载体。

本发明的第六个目的在于提供用所述植物表达载体转化的植物细胞、组织或植株。

本发明的第七个目的在于所述棉花EPSPS突变体基因或其融合基因在抗草甘膦植物品种中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

1)提取陆地棉(鄂杂棉11F1)总RNA，利用Oligo dT反转录，获得cDNA，利用NCBI上已公布的序列设计引物，扩增棉花EPSPS及其融合导肽序列，分别命名为C-EPSPS，CTP。

2)利用多点突变技术对C-EPSPS基因进行修饰，获得突变体基因MC-EPSPS。

3)原核表达产物抗草甘膦功能鉴定：构建MC-EPSPS基因的原核表达载体，转化表达菌BL21(DE3)PlySs，在一浓度草甘膦选择压下培养，观察其生长情况，同时以转C-EPSPS及空载体的表达菌为对照。分析正常诱导条件下，MC-EPSPS与C-EPSPS的表达情况。

4)酶催化活性鉴定：分别将含有C-EPSPS及MC-EPSPS原核表达载体转化到EPSPS缺陷型菌株ER2799中，在M9培养基上观察其生长情况。

5)含有MC-EPSPS植物表达载体构建，所述方法包括：选择含双增强子的35S启动子及Tnos作为MC-EPSPS基因的启动子和终止子，在启动子后面加了一段OK序列，在基因的终止密码子后加PS序列。在目的基因的5’端加上棉花EPSPS基因的叶绿体导肽序列(CTP)，使两者在植物中获得融合表达。将整个表达框插入到经修饰的双元表达载体pBI121中，获得抗草甘膦植物表达载体pBI-MC-EPSPS。通过农杆菌介导法转化烟草及棉花。

6)转基因植物抗草甘膦功能鉴定：在经PCR鉴定为阳性的转基因植株叶片上涂抹或喷施0.2％的草甘膦，7天后观察结果。

附图说明

图1：分别含MC-EPSPS-pET30a、C-EPSPS-pET30a及pET30a的转化子在含100mM草甘膦的M9培养基中的生长曲线图

图2：分别含MC-EPSPS-pET30a、C-EPSPS-pET30a及pET30a的BL21(DE3)PlysS转化子在含150mM草甘膦的M9液体培养基中的生长曲线图

图3：A是含MC-EPSPS-pET30a质粒的EPSPS缺陷型菌株ER2799在M9固体培养基中的生长情况；B是含C-EPSPS-pET30a质粒的EPSPS缺陷型菌株ER2799在M9固体培养基中的生长情况；C是含pET30a质粒的EPSPS缺陷型菌株ER2799在M9固体培养基中的生长情况

图4：分别含MC-EPSPS-pET30a、C-EPSPS-pET30a及pET30a的BL21(DE3)PlysS转化子的蛋白表达情况

图5：植物表达载体pBI-MC-EPSPS构建路线图

图6：A是转MC-EPSPS基因的烟草涂抹0.2％草甘膦7天后结果；B是非转基因烟草涂抹0.2％草甘膦7天后结果

图7：A是转MC-EPSPS基因棉花喷施0.2％草甘膦7天后结果；B是非转基因棉花喷施0.2％草甘膦7天后结果

具体实施方式

以下优选的实施例可对本发明的技术路线做进一步说明，但不构成对本发明的限制。

实施例1MC-EPSPS基因的获得：

1、棉花总RNA的提取

A.取0.1g棉花叶片液氮研磨后，加0.5ml植物RNA提取液(购自invitrogen)，振荡至彻底混匀。

B.室温放置5分钟。

C.4℃12,000rpm离心1分钟，上清转入新的无RNase离心管。

D.加入0.1ml 5M NaCl，温和混匀。

E.加入0.3ml氯仿，上下颠倒混匀。

F.4℃12,000rpm离心10分钟，取上层水相转入新的无RNase离心管。

G.加与所得水相等体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟。

H.4℃12,000rpm离心10分钟。弃掉上清，注意不要倒出沉淀。加1ml 75％乙醇。

I.4℃5,000rpm离心3分钟。倒出液体，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，室温晾干2-3分钟。

J.加50μl无RNase水，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。

2、RNA样品中DNA污染的去除

A.在RNase-free的Eppendorf管中依次加入16μl总RNA、2μl 10×Buffer、1μl RnaseOUT、1μl RNase-free DNaseI(2U/μl)；

B.室温放置15min；

C.加入2μl 25mM EDTA，65℃保温15min。

3、逆转录

A.在0.2ml tube中，加入下列成分：

总RNA(0.1μg/μl)2.0μl

Oligo(dT12-18)(2μM)2.0μl

B.70℃水浴10分钟。立即放置在冰浴中；

C.加入下列成分：

2.0μl 10×RT buffer；

2.0μl 250μM dNTP mix；

2.0μl 100mM DTT；

9.8μl DEPC H2O；

0.2μl 200Uμ/l SuperScriptIII；

D.进行下列反应：42℃90分钟；70℃15分钟；-20℃保存。

4、棉花EPSPS基因的获得

以cDNA为模板，扩增得到包括棉花EPSPS基因的5端非翻译区、叶绿体导肽(CTP)、EPSPS基因和3端非翻译区在内的基因组序列，棉花EPSPS基因命名为C-EPSPS。

扩增引物序列如附录SEQ ID No：5，SEQ ID No：6：

PCR条件：94℃5min、94℃45s、56℃45s、72℃4min，5个循环；94℃45s、60℃45s、72℃4min，25个循环；72℃7min。

扩增产物经EcoR I和Sac I酶切后构建到克隆载体pBulescript，载体命名为pBulescript-C-EPSPS。

5、定点突变

对C-EPSP合成酶基因进行定点突变，将其N端第三个α螺旋中的苏氨酸改变为异亮氨酸(如SEQ ID No：2中第102位氨基酸所示)，脯氨酸改变为丝氨酸(如SEQ ID No：2中第106位氨基酸所示)。为了表达载体构建需要，将C-EPSPS中第208位的脯氨酸及第406位的丙氨酸进行同义突变，消除了原基因中存在的Nde I(CATATG突变为CTTATG)和Nco I(CCATGG突变为CTATGG)两酶切位点对后续构建的影响。突变体基因命名为MC-EPSPS。突变引物分别见附录SEQID No：7，SEQ ID No：8，SEQ ID No：9。

将引物5’端磷酸化，利于后续PCR产物的连接、环化。磷酸化过程如下：

反应体系：

                            引物(10μM)：5μl

10×T4 DNA Polynucleotide Kinase Buffer：3μl

           T4 DNA Polynucleotide Kinase：1μl

                              ATP(10mM)：3μl

                                  补水至30μl

反应条件：37℃反应45min。

多点突变以含棉花EPSP合成酶基因的克隆载体pBulescript-C-EPSPS为模板，反应过程参照STRATAGENE的QuikChange Multi突变试剂盒中的说明书操作。突变后载体命名为pBulescript-MC-EPSPS。

突变子核苷酸序列如附录SEQ ID No：1，氨基酸序列如附录SEQ ID No：2，与原基因的核苷酸同源性为99.55％，氨基酸水平上只有第102位、106位的氨基酸发生改变，同源性也为99.55％。突变克隆子经PCR及测序鉴定正确后保存备用。

实施例2MC-EPSPS基因原核表达构建：

设计引物扩增MC-EPSPS基因，使其5’端加Nde I酶切位点，3’端加Sac I酶切点，以突变后的pBulescript-MC-EPSPS为模板，引物序列见附录SEQ IDNo：10，SEQ ID No：11。PCR条件：94℃5min、94℃45s、54℃45s、72℃4min，30个循环；72℃7min。PCR产物经Nde I和Sac I酶切后构建到原核表达载体pET30a中，获得重组表达载体MC-EPSPS-pET30a，转化至原核表达菌株BL21(DE3)PlysS。

实施例3MC-EPSPS基因原核表达产物抗草甘膦特性分析

MC-EPSPS基因的抗草甘膦功能分析：将转化子BL21(MC-EPSPS-pET30a)、BL21(C-EPSPS-pET30a)及BL21(pET30a)分别接种到液体M9基础培养基(含卡那霉素50μg/mL)，37℃下活化过夜后，按1∶100稀释，取300μL接种到30mL液体M9基础培养基(含卡那霉素50μg/mL)中，以200rpm，37℃空气浴的条件培养。培养到OD₆₀₀＝0.100左右，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，加入草甘磷至终浓度100或150mM，以200rpm，37℃空气浴的条件培养，培养至14或16小时开始，每隔2小时测定一次培养液OD600，记录其生长情况，测定结果如附图中图1、图2所示。从图1、图2的生长曲线可以看出，携带突变体基因的转化子在含有150mM草甘膦的M9基本培养基上仍能生存，而携带有野生型基因的转化子在含有150mM的草甘磷的M9基本培养基上的生长已受到严重的抑制。由此可见，突变子的抗草甘膦能力比野生型有了明显提高。

原核表达情况分析：挑取含BL21(MC-EPSPS-pET30a)、BL21(C-EPSPS-pET30a)及BL21(pET30a)单菌落接种到液体LB(含卡那霉素50μg/mL)中，37℃下活化过夜后，按1∶100稀释，取50μL接种到5mL液体LB(含卡那霉素50μg/mL)中，37℃下培养到OD₆₀₀＝0.6左右，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，于37℃振荡诱导表达3h。离心收集菌液，用0.2倍体积凝胶上样缓冲液重悬菌体，沸水中煮5min，分别取15μL上样，SDS-PAGE电冰分析参考Sambrook等(1989)方法，10％SDS-PAGE电泳分离蛋白，0.25％考马斯亮蓝R-250染色。电泳结果如附图中图3所示，第1～3泳道为BL21(C-EPSPS-pET30a)三个克隆子的蛋白粗提物，第4～6泳道为BL21(MC-EPSPS-pET30a)三个克隆子的蛋白粗提物，第7、8泳道为BL21(pET30a)两个克隆子蛋白粗提物。由电泳图可以看出，经IPTG诱导的携带有EPSPS基因的克隆子均可表达出大小约为47kDa的目的蛋白。表明在相同的表达条件下，野生型和突变体基因均可获得有效表达，并且表达水平没有明显差异。

由以上结果表明，MC-EPSPS抗性提高不是由于基因的过量表达引起的，而是由于蛋白结构改变决定的。

实施例4MC-EPSPS基因原核表达产物酶活鉴定

为进一步验证突变体基因酶催化活性，将转化子BL21(MC-EPSPS-pET30a)、BL21(C-EPSPS-pET30a)及BL21(pET30a)分别接种到分别接种到液体LB培养基中，37℃，200rpm，培养12h。利用碱裂解法提取质粒，取0.1μg质粒转化到EPSP合成酶缺陷型菌株大肠杆菌ER2799中，转化子在含1mM IPTG、卡那霉素50ug/ml的M9固体培养基上培养36h后观察生长情况，如图4A、图4B、图4C。从附图中图4A、图4B、图4C转化子的生长情况可以看出，ER2799(MC-EPSPS-pET30a)和ER2799(C-EPSPS-pET30a)转化子的数量及大小基本一致，而ER2799(pET30a)没有转化子出现。说明突变蛋白仍具有一定酶催化活性。

实施例5MC-EPSPS基因植物表达载体构建

选择双元表达载体pBI121作为植物表达载体，从载体pCambia2300扩增含双增强子的35S启动子，两端分别带Hind III和BamH I，引物序列如SEQ IDNo：12及SEQ ID No：13所示，PCR产物经酶切后克隆到pUC18中。根据公布的OK(Omega & Kozak)序列及PS(Processing & Splicing sequence)序列(两者已在ZL 95 119563.8中充分公开)合成OK-Pst I-Xho I-PS片段，两端分别带BamHI和Sac I酶切位点，在OK与PS之间以Pst I、Xho I两酶切位点相连，两个酶切位点间插入保护碱基便于后续的酶切构建，利用BamH I和Sac I将OK-PstI-Xho I-PS克隆到重组质粒35S-pUC18中，获得重组质粒35S-OK-PS-pUC18。以pBulescript-MC-EPSPS为模板扩增CTP-MC-EPSPS片段，基因序列如SEQ IDNo：3所示，在融合序列两端分别加Pst I，Xho I酶切位点，引物序列如SEQ IDNo：14及SEQ ID No：15所示，利用两端的酶切位点将CTP-MC-EPSPS连入35S-OK-PS-pUC18中，获得重组质粒35S-OK-CTP-MC-PS-pUC18。利用Hind III和Sac I将35S-OK-CTP-MC-PS-pUC18中35S至PS的片段克隆到pBI121中，替换原来的35S-GUS，获得重组植物表达载体pBI-MC-EPSPS，具体构建流程如附图中图5所示。

实施例6利用农杆菌介导的转化法获得抗草甘膦烟草

用75％酒精浸泡烟草种子30s，再用0.1％升汞浸泡8min，进行表面消毒。将消过毒的烟草种子置于MS培养基(加蔗糖30g/L)上无菌发芽，制备无菌苗。取无菌苗叶片剪成5mm×5mm大小的叶盘，用处于对数生长期的含表达载体的农杆菌浸染叶盘10min，吸干菌液，在黑暗条件下共培养2天(MS培养基)。将叶片转到分化培养基(MS+1mg/L BA+0.1mg/L NAA+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)上，光照条件下培养45天左右，待芽长大后切下转移到生根培养基(MS+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)中培养30天左右，待根系发达后将小苗转入仅加有500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行编号保存。

取获得的转基因烟草叶片，提取DNA后进行PCR鉴定，用0.2％的草甘膦喷PCR鉴定为阳性的烟草叶片，7天后观察实验结果，如附图中图6A和6B所示，转MC-EPSPS基因的转基因烟草均能正常生长(图6A)，而非转基因烟草生长显著受抑制，叶片发黄、萎蔫(图6B)。

以上结果表明，转pBI-MC-EPSPS质粒的烟草具有较好的草甘膦抗性。

实施例7利用农杆菌介导法转化棉花获得抗除草剂转基因棉花

农杆菌介导法是本领域科研人员熟知的植物遗传转化方法。具体操作程序为：

1.菌株培养

将所构建的pBI-MC-EPSPS质粒电激转化到农杆菌菌株LBA4404中，农杆菌单菌落接种于含卡那霉素50mg/L、利福平25mg/L的LB或YEB液体培养基中。28℃振荡暗培养过夜到细菌生长对数期。用LB或YEB液体培养基稀释菌液，再振荡培养4～6h，将菌液稀释至OD600值0.3～0.35。

2.无菌苗制备

(1)棉花种子用硫酸(H₂SO₄)脱去短绒，自来水洗掉种子表面的硫酸，晾干后用70％乙醇对种子进行表面消毒1min，再用10％～15％过氧化氢(H₂O₂)处理2～4h，用无菌水冲洗2～3次；

(2)在无菌水中浸泡18～24h，待种子露白，再在无菌条件下剥去种皮，种入种苗培养基(1/2MS+琼脂6g/L，pH 6.8)中；

(3)25℃～28℃光培养3～5d时备用。

3.棉花外植体与农杆菌的共培养

取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5～0.6cm小段，浸入稀释好的菌液中5～10min，然后取出胚轴段，用灭菌滤纸吸干多余的菌液，放在共培养培养基上(MS+2.4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+葡萄糖30g/L+乙酰丁香酮200mg/L+琼脂6g/L，pH5.0，表面铺一层灭菌滤纸)，用封口膜封口。22℃～25℃共培养2天。

4.诱导愈伤组织及抗性愈伤组织的筛选

(1)愈伤组织的诱导

经共培养后的下胚轴段放入愈伤组织诱导培养基中(MS+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+MgCl₂ 0.91g/L+Gelrite 2.0g/L+卡那霉素50～100mg/L+头孢霉素500mg/L+葡萄糖30g/L，pH 5.8)，在常规条件下(25℃)培养2个月(一个月换一次相同的培养基)。

(2)抗性愈伤组织的检测

无菌条件下挑取愈伤组织少许进行选择标记基因nptII的检测，检测结果为阳性的愈伤组织继续继代，非阳性的愈伤组织淘汰。通过对nptII表达的检测，获得棉花抗性愈伤组织的频率为50％～76％。

5.愈伤组织的增殖继代

诱导出的抗性愈伤组织接入增殖培养基(MS培养基+MgCl₂ 0.91g/L+Gelrite 2.0g/L+葡萄糖30g/L，pH 5.8)中，常规条件下(25℃)培养，每隔一个月继代一次，直到愈伤组织分化。在第一次和第二次转入增殖培养基后有部分愈伤组织褐化死亡，正常愈伤组织增殖也不快，第二次继代后，愈伤组织增殖速度才加快。

6.愈伤组织的分化及转基因苗移栽

愈伤组织经继代几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基中(无NH₄+、且KNO₃加倍的MS+谷氨酰胺1.0g/L+天门冬酰胺0.5g/L+MgCl₂ 0.91～1.35g/L+Gelrite 2.0～3.0g/L+葡萄糖20～30g/L，pH 5.8)，进一步分化成胚状体，胚状体长成为小植株后再转入大的三角瓶中，待根长好后练苗移栽。洗去再生棉株根部的培养基，栽到灭菌蛭石中，浇足营养液。栽好的再生棉苗放入控温22℃、控湿80～85％的人工培养箱中5～7d，再在温室中培养10～20d后移栽到土盆或大田中。

利用上述方法，抗除草剂基因植物表达载体导入棉花中获得了转基因棉花。鉴定方法如实施例6，结果如附图中图7A和7B所示，转MC-EPSPS基因的转基因棉花均能正常生长(图7A)，而非转基因烟草生长显著受抑制，叶片发黄、萎蔫(图7B)。

以上结果表明，转pBI-MC-EPSPS质粒的棉花具有较好的草甘膦抗性。

Claims (7)

1.一种棉花EPSP合成酶突变体基因，其具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的棉花EPSP合成酶突变体基因所编码的蛋白质，具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.一种棉花EPSP合成酶突变体融合基因，其具有如SEQ ID No：3所示的核苷酸序列。

4.权利要求3所述的棉花EPSP合成酶突变体融合基因所编码的蛋白质，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

5.含有权利要求1、3所述棉花EPSP合成酶突变体基因或其融合基因的植物表达载体。

6.用权利要求5所述植物表达载体转化的植物细胞、组织或植株。

7.权利要求1、3所述棉花EPSP合成酶突变体基因或其融合基因在抗草甘膦植物品种中的应用。

Images