CN102776158A

CN102776158A - 一种抗草甘膦EPSP合成酶GmEPSPS-2及其编码基因与应用

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Publication number: CN102776158A
Application number: CN2012101966782A
Authority: CN
Inventors: 谢树章; 李新海; 雷开荣; 林清; 翁建峰; 杨小艳
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences; Chongqing Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences; Chongqing Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-06-14
Filing date: 2012-06-14
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2032-06-14
Also published as: CN102776158B

Abstract

本发明公开了一种抗草甘膦蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质，是如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表中序列1的第56-532位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）将（a）或（b）的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有草甘膦抗性的由序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的GmEPSPS-2蛋白及其编码基因对草甘膦除草剂具有显著的抗性效果，实验证明转GmEPSPS-2基因烟草和转GmEPSPS-2基因玉米在0.15%草甘膦作用下仍能正常生长，而未转基因的烟草或玉米生长明显受抑制，叶片出现发黄、枯萎。这表明GmEPSPS-2能够在植物中稳定高效表达，进而用于生产抗草甘膦转基因植物。

Description

一种抗草甘膦EPSP合成酶GmEPSPS-2及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种抗草甘膦EPSP合成酶及其编码基因与应用，特别涉及一种人工改造合成的抗草甘膦EPSP合成酶及其编码基因GmEPSPS-2，以及含有该基因的表达载体及其在抗除草剂转基因植物研制方面的应用。

背景技术

草甘膦是一种内吸传导非选择性、广谱灭生性除草剂，具有理化性质稳定、高效、低毒、低残留、易被微生物分解，不破坏土壤环境等优点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的农药品种。其相关作用机理是由于草甘膦是磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的类似物，因此草甘膦、莽草酸-3-磷酸、EPSP合成酶容易结合形成EPSP-S3P-草甘膦复合体（此复合体非常稳定），阻止PEP与EPSP合成酶的结合，这样草甘膦就竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）的活性，干扰生物体内芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，导致生物死亡。

植物可以通过转化导入对草甘膦具有耐受能力的EPSPS基因而获得抗草甘膦的能力。根癌农杆菌CP4、荧光假单胞菌G2和沙门氏菌CT7的EPSPS已经在植物中得到广泛的验证和应用。随着抗除草剂基因克隆的发展，抗草甘膦转基因作物也相继问世并大面积推广应用，这些转基因作物具有如下优点：（1）所用除草剂品种广谱、选择性强、对环境友好、使用方便，特别适用于少耕与免耕体系，加强了水分保持，大大减少了土壤流失，并形成了有机物质来锁住土壤碳并减少二氧化碳排放；同时减少机械耕作，节约燃料能源；（2）减少除草剂总使用量，使防治杂草费用下降，有效地降低农业成本，增加农产品的经济效益；（3）解决了常规除草剂难以防治的特殊杂草问题，如稻田的野生稻、赤稻、宽叶臂形草、圆叶牵牛；小麦田的雀麦、莎草；大豆田的鸭趾草、纯叶决明以及寄生杂草；（4）解决土壤长残留性除草剂对后茬作物的伤害。转基因作物所使用的草甘膦无土壤残留，故对后茬作物十分安全。

从1996年转基因作物首次商业化至今，耐除草剂性状始终是转基因作物的主要性状。在2011年，转基因作物耐除草剂性状被运用在了大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜以及苜蓿中，种植面积为9390万公顷，占全球转基因作物种植面积的59%，比占全球转基因作物面积15%的抗虫品种（2390万公顷）高出很多，这其中大部分为抗草甘膦转基因作物品种。因此近年来包括美国和中国在内的国家草甘膦产量急剧增加还与系列转基因抗草甘膦品种的选育和大面积推广有直接的关系。

我国在转基因草甘膦作物方面的研究已取得一定进展，但目前尚无转抗草甘膦基因作物进入商品化阶段的报道。中国发明专利03826892.2公开的一种来源于荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的抗草甘膦基因（EPSPS基因），但由于其来源于细菌，细菌密码子偏好性与植物有较大差异，将来自细菌的EPSPS基因直接转化植物，其表达效率较低，因此，本领域有必要对来自微生物的抗草甘膦基因进行人工改造，以保证抗草甘膦基因能够在植物体内高效稳定表达。

发明内容

本发明的目的是提供抗草甘膦蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白质，名称是GmEPSPS-2，是如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列1的第56-532位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）将（a）或（b）的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有草甘膦抗性的由序列1衍生的蛋白质。

其中，（a）所限定的蛋白为GmEPSPS-2的成体蛋白，不含转运肽序列；（b）所限定的蛋白为5′端带有拟南芥CTP2叶绿体转运肽的GmEPSPS-2的中间体蛋白。

上述（c）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（c）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

序列表中序列1由532个氨基酸残基组成。

为了便于GmEPSPS-2蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（a）和（b）中的GmEPSPS-2蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（c）中的GmEPSPS-2蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2的自5′末端第472-2070位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。

编码所述GmEPSPS-2蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述GmEPSPS-2蛋白的基因（命名为GmEPSPS-2）；所述GmEPSPS-2基因是如下1）至5）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列2的第637-2070位核苷酸所示的DNA分子；

2）编码序列为序列表中序列2的第472-2070位核苷酸所示的DNA分子；

3）序列表中序列2的第7-2070位核苷酸所示的DNA分子；

4）序列表中序列2所示的DNA分子；

5）在严格条件下与1）-4）中任一限定DNA分子杂交且编码所述GmEPSPS-2蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列2由2076个核苷酸组成，第472-2070位为编码序列，编码序列表中序列1所示的蛋白质。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA3301、pCAMBIA1301-UbiN、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述GmEPSPS-2基因转录的启动子具体为35S启动子（如CaMV35S启动子）或玉米Ubi-1启动子。更为具体的，所述重组表达载体为如下（1）或（2）：

（1）在pCAMBIA3300-35S-pROII MCS-nos-bar（以下简称CPB）载体的多克隆位点处插入所述GmEPSPS-2基因得到的重组质粒；所述重组质粒中启动所述GmEPSPS-2基因转录的启动子是CaMV35S启动子。所述多克隆位点具体为XbaI和Sac I。

（2）在pCAMBIA3300-Ubi-pROKII MCS-nos-bar载体的多克隆位点处插入所述GmEPSPS-2基因得到的重组质粒；所述重组质粒中启动所述GmEPSPS-2基因转录的启动子是玉米Ubi-1启动子。所述多克隆位点具体为Xba I和Sac I。

所述CUB载体（pCAMBIA3300-Ubi-pROKII MCS-nos-bar）：李蓓.FLP_frt位点特异性重组系统在玉米中的应用及转TsVP抗旱玉米的获得.2008年山东大学博士论文。

所述CPB载体（pCAMBIA3300-35S-pROKII MCS-nos-bar）：是在CUB载体质粒基础上构建的质粒，通过Hind III和Xba I分别双酶切所述CUB载体和pBI121（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品号为MCV032），用凝胶回收纯化试剂盒分别回收酶切后的35S启动子片段，以及CUB载体的骨架片段，并进行连接反应，将得到的目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性单克隆，将阳性单克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行Hind III和Xba I双酶切鉴定，将经酶切鉴定初步判定正确的重组质粒送样测序，获得CPB载体（pCAMBIA3300-35S-pROKII MCS-nos-bar）。

所述表达盒由能够启动所述GmEPSPS-2基因表达的启动子，所述GmEPSPS-2基因，以及转录终止序列组成。

在本发明的一个实施例中，所述重组菌具体为携带有所述GmEPSPS-2基因的重组大肠杆菌。

所述GmEPSPS-2蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1）或a2）中的应用也属于本发明的保护范围：

a1）调控植物或微生物抗草甘膦功能；

a2）选育抗草甘膦植物或微生物品种。

在本发明的一个实施例中，所述调控植物或微生物抗草甘膦功能具体为提高植物或微生物抗草甘膦功能。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗草甘膦功能提高的转基因植物的方法。

该方法包括将编码所述GmEPSPS-2蛋白的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗草甘膦功能提高。

本发明的再一个目的是提供一种培育抗草甘膦功能提高的转基因微生物的方法。

该方法包括将编码所述GmEPSPS-2蛋白的基因导入目的微生物中的步骤；所述转基因微生物与所述目的微生物相比，抗草甘膦功能提高。

在上述两个方法中，编码所述GmEPSPS-2蛋白的基因即为所述GmEPSPS基因，是如下1）至5）中任一所述的DNA分子：

3）序列表中序列2的第7-2070位核苷酸所示的DNA分子；

4）序列表中序列2所示的DNA分子；

所述GmEPSPS-2基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物或所述目的微生物中，得到所述转基因植物或转基因微生物。导入所述目的植物具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

所述植物可为单子叶植物，也可为双子叶植物。在本发明中，所述单子叶植物具体为玉米，如玉米品种郑58等；所述双子叶植植物具体为烟草，如烟草品种W38等。

在本发明的一个实施例中，所述微生物具体为大肠杆菌，如大肠杆菌DH5α。

本发明根据来源于荧光假单胞菌的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyrul-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）突变基因，去掉原始基因ORF序列5’端147bp和3’端531bp的两段碱基序列，只留下中间核心结构域序列的654bp的一段碱基序列，与来自根癌农杆菌CP4菌株中EPSPS基因的636bp的一段碱基序列进行拼接；在保证拼接改造的EPSP合成酶蛋白氨基酸序列组成总体不变的情况下，用植物偏爱的密码子进行碱基置换，初步获得一个改造的DNA序列；排除DNA序列中存在的造成植物转录不稳定的富含AT序列以及常用限制性酶切位点（BamH I、EcoRI、HindIII、Nco I、Xho I、Xba I等），然后通过置换密码子的方法进行改正消除；并在5’端添加玉米Adh1-1S内含子、拟南芥CTP2叶绿体转运肽和根癌农杆菌CP4菌株中EPSPS基因的前端序列，确定并化学合成改造的EPSPS基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，命名为GmEPSPS-2。

将本发明基因GmEPSPS-2与表达载体可操作地连接，并转化大肠杆菌，能够快速初步检测本发明合成的GmEPSPS-2基因表达产物对草甘膦的耐受性。将本发明基因GmEPSPS-2与植物表达载体可操作地连接，并将表达载体导入相应的农杆菌中，进而通过农杆菌介导法进行遗传转化，培育抗草甘膦转基因烟草、抗草甘膦转基因玉米。也可以对其它农作物或者果树等进行遗传转化，使其具备抗草甘膦性。

本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明人工改造合成的抗草甘膦基因GmEPSPS-2序列与原始EPSPS基因序列相比，大大增强了其在植物中的表达。使用植物偏爱性密码子，减少了原始DNA序列中的富含AT序列和存在的反向重复序列以及不明确的真核DNA内含子序列，改造后的GmEPSPS-2基因G+C含量为64.6%，与原始两个EPSPS基因（荧光假单胞菌EPSPS突变基因和根癌农杆菌CP4的EPSPS基因）的DNA序列的同源性分别为30.92%和27.82%。本发明的抗草甘膦基因GmEPSPS-2可在植物细胞中高效稳定的表达。

将抗草甘膦基因GmEPSPS-2导入烟草和玉米后，都可以得到稳定遗传的GmEPSPS-2转化体，提高植物的草甘膦抗性。此外，该基因也可以转化大豆、棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗草甘膦活性，从而适用与少耕与免耕体系，加强了水分保持，大大减少了土壤流失，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1为人工拼接改造的GmEPSPS-2基因合成序列构成图。

图2为植物表达载体CPB-GmEPSPS-2-Bar构建示意图。

图3为植物表达载体CUB-GmEPSPS-2-Bar构建示意图。

图4为T₀代转化体中目的基因GmEPSPS-2的PCR检测结果。其中，M：100bp DNAMark；1-3：转CPB-GmEPSPS-2-Bar烟草植株CPB-G2B-1到CPB-G2B-3；CK1：CPB-GmEPSPS-2-Bar质粒；CK2：转入CPB空载体的转基因烟草；CK3：未转基因烟草。

图5为T0代玉米转化体目的基因GmEPSPS-2的PCR检测结果。其中，M：100bpDNA Mark；1-4：转CUB-GmEPSPS-2-Bar玉米植株CUB-G2B-1到CUB-G2B-4；CK1：CUB-GmEPSPS-2-Bar质粒；CK2：转入CUB空载体的转基因玉米；CK3：未转基因玉米。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

CUB载体（pCAMBIA3300-Ubi-pROKII MCS-nos-bar）：李蓓.FLP_frt位点特异性重组系统在玉米中的应用及转TsVP抗旱玉米的获得.2008年山东大学博士论文。

农杆菌LBA4404：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品号为MCC026。

烟草W38（Nicotiana tobacum cv.Wisconsin 38）：眭顺照,李琳莉,祝钦泷等.蜡梅凝集素基因克隆及其对蚜虫、蛞蝓抗性分析.中国农业科学,2011（2）：358-368）

玉米自交系郑58：曹国辉,石红良,王帮太等.玉米抗灰斑病基因的分子标记.分子植株育种,2009（4）：709-715

实施例1、GmEPSPS-2基因的改造合成

根据来源于荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyrul-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）突变基因，去掉原始基因ORF序列5’端147bp和3’端531bp的两段碱基序列，只留下中间核心结构域序列的654bp的一段碱基序列，与来自根癌农杆菌CP4的EPSPS基因636bp的一段碱基序列进行拼接；在保证拼接改造的EPSP合成酶蛋白氨基酸序列组成总体不变的情况下，用植物偏爱的密码子进行碱基置换，初步获得一个改造的DNA序列；排除DNA序列中存在的造成植物转录不稳定的富含AT序列以及常用限制性酶切位点（BamH I、EcoR I、Hind III、Nco I、Xho I、Xba I等），然后通过置换密码子的方法进行改正消除；并在5’端添加玉米Adh1-1S内含子序列（序列2的第7-471位）、拟南芥CTP2叶绿体转运肽序列（序列2的第472-636位）和根癌农杆菌CP4菌株中EPSPS基因的前端序列（序列2的第637-771位），为了方便后续重组表达载体的构建，同时在序列两端分别引入Xba I和Sac I酶切位点，确定并化学合成改造的EPSPS基因（GmEPSPS-2基因合成序列构成图见图1），其核苷酸序列如序列表中序列2所示，命名为GmEPSPS-2，序列2的第637-2070位为所述GmEPSPS-2基因的编码序列，编码序列表中序列1的第56-532位氨基酸所示的蛋白质（GmEPSPS-2成体蛋白，不含转运肽氨基酸序列）；序列2的第472-2070位编码序列表中序列1所示的蛋白质（GmEPSPS-2中间体蛋白，5’端含有拟南芥CTP2叶绿体转运肽的氨基酸序列）。

改造后的GmEPSPS-2基因G+C含量为64.6%，与原始两个EPSPS基因（荧光假单胞菌EPSPS突变基因和薤白EPSPS基因）的DNA序列的同源性分别为32.36%和27.46%。改造后的GmEPSPS-2基因编码的氨基酸序列（其氨基酸序列如序列表中序列1所示）与原始两个EPSPS基因（荧光假单胞菌EPSPS突变基因和根癌农杆菌CP4的EPSPS基因）的DNA序列的同源性分别为30.92%和27.82%。

新EPSPS基因GmEPSPS-2（序列2）的合成工作由北京天恩泽基因科技有限公司完成。

实施例2、抗草甘膦融合基因植物表达载体的构建

人工合成序列表中序列2所示的GmEPSPS-2基因，用Xba I和Sac I分别双酶切所述GmEPSPS-2基因，同时用Xba I和Sac I分别双酶切植物表达载体CPB和CUB，用凝胶回收纯化试剂盒分别回收酶切后的GmEPSPS-2片段，以及CPB载体和CUB载体的骨架片段。GmEPSPS-2片段分别与CPB载体和CUB载体的骨架片段进行连接反应，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性单克隆，将阳性单克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行Xba I和Sac I双酶切鉴定，将经酶切鉴定初步判定正确的重组质粒送样测序。

经测序表明在载体CPB载体的Xba I和Sac I酶切位点间插入了序列表中序列2所示的GmEPSPS-2基因片段，证明质粒构建正确，将其命名为CPB-GmEPSPS-2-Bar，构建过程如图2所示，所述真核重组表达载体CPB-GmEPSPS-2-Bar中启动所述GmEPSPS-2基因转录的启动子为CaMV35S启动子，标记基因为吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar。

经测序表明在载体CUB载体的Xba I和Sac I酶切位点间插入了序列表中序列2所示的GmEPSPS-2基因片段，证明质粒构建正确，将其命名为CUB-GmEPSPS-2-Bar，构建过程如图3所示，所述植物重组表达载体CUB-GmEPSPS-2-Bar中启动所述GmEPSPS-2基因转录的启动子为玉米Ubi-1启动子，标记基因为吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar。

实施例3、草甘膦除草剂耐受实验

M9培养基的配制：

(1)先配制1M的MgSO₄：称取MgSO₄·7H₂O 2.46g加双蒸水10mL溶解，高压灭菌备用；

(2)配制1M的CaCl₂：CaCl₂·6H₂O 2.191g加双蒸水10mL溶解，高压灭菌备用；

(3)再配制5×M9盐溶液：

Na₂PO₄·7H₂O 12.8g

KH₂PO₄ 3.0g

NaCl 0.5g

NH₄Cl 1.0g

加双蒸水200ml溶解，121℃灭菌15分钟，

备注：以上三样分别配制，分别装瓶，可以一起送去高压。

(4)配制20%的葡萄糖溶液：4g葡萄糖加双蒸水20ml溶解，0.22微米滤器过滤除菌；

(5)无菌操作配制M9培养基

5×M9盐溶液200ml

1M的MgSO₄2ml

20%的葡萄糖溶液20ml

1M的CaCl₂0.1ml

加灭菌双蒸水至1000ml。

将实施例2构建的植物重组表达载体CPB-GmEPSPS-2-Bar转入大肠杆菌DH5α，挑取单菌落接种到30ml的LB培养基中，37℃、250r/min过夜培养；以1%的接种量分别接种到含0mM、60mM草甘膦的M9液体培养基中，经过37℃、48h的振荡培养后，测定培养物的OD₆₀₀值。同时设置转入CPB空载体的大肠杆菌DH5α作为阴性对照。实验重复三次，结果取平均值。

结果如表1所示，经过37℃、250r/min、48h的振荡培养后，在不含草甘膦的M9培养基上，三种大肠杆菌都正常生长；在含有60mM草甘膦的M9培养基中，阴性对照几乎不能生长，OD₆₀₀值为0.06；阳性对照的OD₆₀₀值为1.09，转入CPB-GmEPSPS-2-Bar的大肠杆菌DH5α的OD₆₀₀值为1.47。这一结果说明改造合成的新基因GmEPSPS-2具有提高转化宿主大肠杆菌抗草甘膦的能力。

表1两种大肠杆菌的OD₆₀₀值

	重复1	重复2	重复3	平均值
					阴性对照	0.035	0.05	0.95	0.06
DH5α-GmEPSPS-2	1.08	1.57	1.76	1.47

注：表中的DH5α-GmEPSPS-2即表示转入CPB-GmEPSPS-2-Bar的大肠杆菌DH5α。

实施例4、GmEPSPS-2基因在转基因烟草中的表达及功能验证

一、转GmEPSPS-2基因烟草的获得

1、重组农杆菌的制备

将实施例2构建好的植物重组表达载体CPB-GmEPSPS-2-Bar（或CPB空载体）通过冻融法（参考Holsters M,de Waele D,Depicker A.Transfection and transformation ofAgrobacterium tumefaciens.Mol Gen Genet,1978,183:181-187）转入农杆菌LBA4404。对转化后的重组农杆菌用由5’-CCCGTCCTCTACTGCTTTCCC-3’（序列2的第1434-1454位）和5’-TCTCACCTTCATCGCAATCAACA-3’（序列2的第1809-1831位的反向互补序列）组成的引物对进行PCR鉴定（目的条带大小为398bp）。将经鉴定表明含有GmEPSPS-2基因的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/CPB-GmEPSPS-2-Bar；将转入CPB空载体的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/CPB。

2、农杆菌转化烟草

共培养基：在MS培养基的基础上，添加终浓度为1mg/L的6-BA，以及终浓度为0.1mg/L的NAA，pH 5.8。

分化培养基：在MS培养基的基础上，添加终浓度为1mg/L的6-BA，终浓度为0.1mg/L的NAA，终浓度为5mg/L的草丁膦，以及终浓度为400mg/L的头孢霉素，pH 5.8。

生根培养基：在1/2MS培养基的基础上，添加终浓度为0.5mg/L的NAA，以及终浓度为5mg/L的草丁膦，pH 5.8。

1）选取生长旺盛的烟草W38（Nicotiana tobacum cv.Wisconsin38）的无菌苗（转接后10-15天）叶片，用锋利手术刀片切成1cm²小片，弃去中脉。

2）将切好的烟草叶片浸泡于备好的OD₆₀₀为0.6-0.8的步骤1制备的农杆菌菌液（LBA4404/CPB-GmEPSPS-2-Bar和LBA4404/CPB）中，确保叶片切伤边缘完全与菌液接触，浸泡5min。

3）倾去菌液，将感染叶片转移到灭菌吸水纸上吸去多余菌液。

4）将叶片转移到共培养基中，叶片背面朝上黑暗中共培养两天。

5）将共培养后的叶片转接到分化培养基上，光照培养。

6）待分化出的小芽长至2-3cm，将其切下转接到生根培养基上。为确保得到的植株属于不同的转化株系，每个外植体只取一个不定芽。7-10d内可生根成苗。

7）转基因烟草移栽：将生根苗转入温室中，晚上揭去封口膜，白天封上，炼苗2-3d后，将苗取出，在水中洗去附着于根上的培养基，小心栽入预备好的花盆中，置于阴凉处3-5d即可成活。获得具有草丁膦抗性的T₀代转基因烟草植株。

3、转基因烟草植株的分子鉴定

对步骤2获得的T₀代转入CPB-GmEPSPS-2-Bar重组表达载体的转基因烟草）进行PCR检测，以转基因烟草苗的基因组DNA为模板，PCR检测用的引物为5’-CCCGTCCTCTACTGCTTTCCC-3’（序列2的第1434-1454位）和5’-TCTCACCTTCATCGCAATCAACA-3’（序列2的第1809-1831位的反向互补序列）。同时以未转基因的烟草品种W38作为阴性对照，以步骤2获得的T₀代转入CPB空载体烟草作为另一对照。

PCR检测结果如图4所示，转入CPB-GmEPSPS-2-Bar重组表达载体的转基因烟草的不同株系均扩增得到了长度约为398bp的目的片段；而转入CPB空载体的转基因烟草与作为阴性对照的未转基因烟草相同，均未扩增出目的片段

二、转基因烟草的功能验证

用0.15%（0.15g/100ml）的草甘膦水溶液喷施步骤一得到的T₀代转GmEPSPS-2基因烟草阳性植株的叶片，2周后观察植株生长状态及叶片形态。同时设置转入CPB空载体的转基因烟草植株，以及非转基因烟草作为对照。每种烟草植株各选取10株进行实验。实验重复三次。

结果显示，转GmEPSPS-2基因烟草均能正常生长，而转入CPB空载体的转基因烟草植株和非转基因烟草的生长明显受抑制，叶片出现不同程度发黄、枯萎。

实施例5、GmEPSPS-2基因在转基因玉米中的表达及功能验证

一、转GmEPSPS-2基因玉米的获得

1、重组农杆菌的制备

所用植物重组表达载体为实施例2构建的CUB-GmEPSPS-2-Bar，其他具体操作方法和步骤同实施例4步骤一中1。

2、农杆菌转化玉米

采用农杆菌介导玉米茎尖转化方法（参考李蓓，FLP_frt位点特异性重组系统在玉米中的应用及转TsVP抗旱玉米的获得，博士论文，2008）转化受体玉米自交系郑58《玉米抗灰斑病基因的分子标记》的幼苗茎尖分生组织，共培养3d后移栽到花盆中。经0.3%除草剂草丁膦喷施筛选后获得抗草丁膦转基因植株。

3、转基因烟草植株的分子鉴定

对步骤2获得的T₀代转入CUB-GmEPSPS-2-Bar重组表达载体的转基因玉米进行PCR检测，以7-8叶期的转基因玉米的基因组DNA为模板，PCR检测用的引物为5’-CCCGTCCTCTACTGCTTTCCC-3’（序列2的第1434-1454位）和5’-TCTCACCTTCATCGCAATCAACA-3’（序列2的第1809-1831位的反向互补序列）。同时以未转基因的玉米自交系郑58作为阴性对照，以步骤2获得的T₀代转入CUB空载体的玉米作为另一对照。

PCR检测结果如图5所示，转入CUB-GmEPSPS-2-Bar重组表达载体的转基因玉米的不同株系均扩增得到了长度约为398bp的目的片段；而转入CUB空载体的转基因玉米与作为阴性对照的未转基因玉米相同，均未扩增出目的片段。

二、转基因玉米的功能验证

用0.15%（0.15g/100ml）的草甘膦水溶液避开主脉涂抹步骤一得到的T₀代转GmEPSPS-2基因玉米阳性植株的叶片，2周后观察植株生长状态及叶片形态。同时设置转入CUB空载体的转基因烟草玉米，以及非转基因玉米作为对照。每种玉米植株各选取10株进行实验。实验重复三次。

结果显示，转GmEPSPS-2基因玉米均能正常生长，而转入CUB空载体的转基因玉米植株和非转基因玉米的生长明显受抑制，叶片发黄、枯萎。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。