CN1236394A - 除草剂抗性植物 - Google Patents

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Abstract

本发明特别提供了至少包括编码能够赋予植物或形成该植物的组织对第一种除草剂抗性和耐性第一种蛋白的第一个区域和编码同样能够赋予对第二种除草剂性第二种蛋白的第二个区域的多核苷酸,其具有以下附加条件(i)该多核苷酸不编码包括仅仅5－烯醇－丙酮酰－3－磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白;(ii)该多核苷酸不包括仅仅编码超氧物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的区域;和(iii)该多核苷酸不包括仅仅编码GST和膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的区域。

Description

除草剂抗性植物
本发明涉及重组DNA技术，且特别是当与非转基因样植物比较时对除草剂显示实质(Substantial)抗性或实质耐性的转基因植物的制备。
对除草剂具有实质“耐性”的植物当受试于除草剂时，与同样受试于除草剂的非耐性样植物相比提供了右移的剂量/反应曲线。该剂量/反应曲线具有绘于x-轴上的“剂量”和绘于y-轴上的“杀死百分比”、“除草效应”等。为了产生拟定的除草效应，耐性植物较非耐性样植物将需要更多的除草剂。对除草剂具有实质“抗性”的植物当以农业化肥团体一般用于杀死田间杂草的浓度和速率受试于除草剂时，如果有的话，也显示出极少的坏死、裂解、萎黄病或其它损伤。对除草剂具有抗性的植物也对该除草剂具有耐性。在本申请的上下文里将术语“抗性”和“耐性”解释为“耐性和/或抗性”。
根据本发明提供了这样的多核苷酸，其至少包括编码能够赋予植物或形成该植物的组织对第一种除草剂抗性或耐性的第一种蛋白的第一个区域，和编码同样能够赋予对第二种除草剂抗性的第二种蛋白的第二个区域，并具有以下的附加条件(ⅰ)该多核苷酸不编码包括仅仅5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白；(ⅱ)该多核苷酸不包括仅仅编码超氧物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的区域；和(ⅲ)该多核苷酸不包括仅仅编码GST和膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)的区域。
在本发明优选的实施方案中，由该多核苷酸所包括的区域每个均在植物可操作启动子和终止子的表达控制之下。这样的启动子和终止子对技术人员是众所周知的，他们可根据其特定的需要挑选启动子及终止子。例如，适宜的启动子包括35S CaMV或FMV启动子以及拟南芥菜和玉米泛素的启动子。优选地，这些启动子为组成性的。这避免了外部诱导并且意味着该植物对每种相应的除草剂永久具有耐性或抗性。编码除草剂抗性基因的DNA也可在可诱导启动子的控制下包括进植物转化载体中以在该转基因植物中得到可诱导的除草剂抗性。这样的启动子包括可化学诱导的已知的GST-27启动子，借此通过施加适宜的诱导物(如化学安全剂)可开启抗性。在有些情况中，该仅在需要时表达或增加对除草剂抗性的能力可能是优越的，例如，在作物轮作期间，第一种作物的一些个体可能在下一年在待种植第二种作物的田间生长。除草剂可用于毁坏这些未被诱导并且仍为易感的“自生自长”植物。仅仅需要除草剂抗性时(即，就在应用除草剂之前)除草剂抗性基因表达的诱导也可能在有些情况中在代谢上更为有效，因为那时植物仅在需要时产生抗性多肽。适宜的可诱导启动子进一步包括可诱导的四环素启动子、细菌lac阻遏物/操纵子系统、与地塞米松一起的糖皮质激素受体、可诱导的铜和水杨酸启动子、国际专利申请No.PCT/GB96/01195中所述的依据蜕皮激素受体的启动子和国际专利申请No.WO93/2 334中所述的所谓Alc启动子。
在本发明特别优选的实施方案中，至少由该肽所包括的区域中至少其中一个提供对出苗前除草剂的抗性并且至少这些区域中另一个提供对出苗后除草剂的抗性。同时技术人员无需对出苗前和出苗后的定义，“出苗前”意为在萌发的种子出现于土表以上之前施用，即在土地之上可见到任何植物材料之前施用。出苗后意为在土表之上可见到幼苗之后施用。
出苗前的除草剂可选自二硝基苯胺除草剂、除草定、flupoxam、毒莠定、氟咯草酮、四唑啉酮包括N-氨甲酰四唑啉酮、如在EP-A-612,735中所述的那些物质、sulcatrione、达草伏、RP201772、阿特拉津或别的三嗪、亚氨基噻重氮(iminothiadozole)、diflufenicon、磺酰脲、咪唑啉酮、硫代氨基甲酸酯、三嗪、尿嘧啶、尿素、三酮、异噁唑、乙酰替苯胺、噁二唑、EP-A-511,826中所述的二氧磷基磺酸酯类除草剂、三嗪酮、磺酰苯胺(sulfonanilide)、酰胺、羟乙酰胺(oxyacetamides)如fluthiamide、N-酰苯胺(anilide)和三唑啉酮    型除草剂。三酮类除草剂的实例包括2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-环己烷-1,3-二酮。
2-(2-氯-4-甲烷磺酰苯甲酰基)-环己烷-1,3-二酮，
2-(2-2-硝基-4-甲烷磺酰苯甲酰基)-环己烷-1,3-二酮，
〔5-环丙基4-(2-甲磺酰基-4-三氟甲基苯甲酰基)异噁唑，等。为了避免疑惑，“三酮类除草剂”意为能够抑制4-羟苯基丙酮酸盐(或丙酮酸)双加氧酶(HPPD)的任何化合物。在本发明上下文里，术语4-羟苯基丙酮酸盐(或丙酮酸)双加氧酶(4-HPPD)和p-羟苯基丙酮酸盐(或丙酮酸)双加氧酶(p-OHPP)为同义的。
出苗后除草剂可选自镇草宁及其盐、glufosinate、二苯醚、磺草灵、灭草松、bialaphos、除草定、稀禾定或别的环己烷二酮、麦草畏、fosamine、flupoxam、苯氧丙酸、喹禾灵或别的芳氧基-苯氧丙酸酯、毒莠定、伏草隆、阿特拉津或别的三嗪、metribuzin、氯嘧黄隆、绿黄隆、flumetsulam、halosulfuron、嘧黄隆、灭草喹、咪草烟、isoxaben、imazamox、metosulam、pyrithrobac、rimsulfuron、苄嘧黄隆、烟嘧黄隆、氟黄胺草醚、fluroglycofen、KIH9201、ET751、carfentrazone、carfentrazone、ZA1296、ICIA0051、RP201772、flurochloridone、达草灭(norflurazon)、百草枯、敌草快、溴苯腈和恶唑禾草灵。本发明多核苷酸能够赋予对其抗性(或本发明植物对其具有抗性或耐性的)这些除草剂的特别优选的组合为：(ⅰ)镇草宁和二苯醚或乙酰N-酰苯胺型除草剂；(ⅱ)镇草宁和/或glufosinate和N-酰苯胺和/或三唑啉酮型除草剂；(ⅲ)三酮和镇草宁和/或glufosinate；(ⅳ)镇草宁和/或glufosinate和三酮及N-酰苯胺型除草剂；(ⅴ)镇草宁和/或glufosinate和PDS抑制剂(如下述化学式Ⅰ-Ⅲ的化合物)。
由该多核苷酸所述区域所编码的蛋白可选自镇草宁氧化-还原酶、5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)、膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)、羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、细胞色素P450、乙酰-COA羧化酶(ACC)、乙酰乳酸合酶(ALS)、原卟啉原(protoporphyrinogen)氧化酶(protox)、dihydropteroate合酶、多胺转运蛋白、超氧物歧化酶(SOD)、溴苯腈水解酶(bromoxynil nitrilase)(BNX)、八氢番茄红素脱氢酶(PDS)、可从真氧产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)获得的tfdA基因的产物以及所述蛋白已知的诱变或其它修饰变异体。所述的tfdA基因的产物为能够氧化苯氧羧酸，如2,4-D成为相应的酚。EPSPS可从为欧洲专利No.546,090中所述的所谓Ⅱ类EPSPS。作为选择、和/或此外，可对其进行突变从而在特定位置包括已知导致对镇草宁(和其农业上可接受的盐)增强抗性的氨基酸替代。例如，相对于在SEQ ID NO:9中所述的EPSPS，该EPSPS可至少在相应于174、178、173和264位置处具有残基Thr、Pro、Gly和Ala，变化如下：
(ⅰ)Thr174-Ile
(ⅱ)Pro178-Ser
(ⅲ)Gly173-Ala
(ⅳ)Ala264-Thr
其中(ⅰ)Thr174在邻接包括Ala-Gly-Thr-Ala-Met的序列内发生；(ⅱ)Pro178在邻接包括Met-Arg-Pro-Leu-Thr的序列内发生；(ⅲ)Gly173在邻接包括Asn-Ala-Gly-Thr-Ala的序列内发生；并且(ⅳ)Ala264在邻接包括Pro-Leu-Ala-Leu-Gly的序列内发生。此外，在相应于跨越SEQ ID NO:9中位置192到232的EPSPS酶区域中的基序Glu-Arg-Pro-AA1-AA2-Leu-Val-AA3-AA4-Leu-AA5-AA6-AA7-Gly中的末端Gly残基可用Asp或Asn残基替代。
在该多核苷酸的一个实施方案中，编码HPPD的区域具有描述于SEQ ID NOs:1或3中的序列，或者作为选择与这样的序列互补，即该序列当于60和65℃之间的温度在含有0.1％SDS的0.3强度的柠檬酸缓冲盐中孵育后以相同的温度用含0.1％SDS的0.3强度的柠檬酸缓冲盐冲洗后仍然分别与SEQ ID NO:1或3中所描述的序列杂交。
当测试和发明序列为双链时，构成测试序列的核酸TM优选与所述的SEQ ID NO:1序列TM相差在15℃以内。当测试和SEQ IDNO:1序列(或测试和SEQ ID NO:3序列)混合到一起并同时变性时，这些序列相互间TM值差异优选在5℃以内。更为优选地，杂交在相对严格的条件下进行，优选支持测试或发明序列。这样，将或者是变性的测试序列或者是变性的发明序列优选首先结合到支持物上并且在60和65℃之间的温度在含有0.1％SDS的0.3强度的柠檬酸缓冲盐中进行一特定长时间的杂交然后以相同的温度但用0.1强度的柠檬酸缓冲盐冲洗支持物。杂交包括本发明序列的地方，杂交条件也可以较少严格，这些对于技术人员都是显而易见的。
当该多核苷酸包括能够赋予对三酮类除草剂抗性的HPPD基因时，以该多核苷酸转化的植物材料可受试于三酮类除草剂并且当受试于所述的除草剂时根据转化和未转化材料之间的颜色差异用视觉加以筛选。因此，当受试于此筛选方法时未转化的材料可变成和维持白色，而当受试于所述的筛选方法时，转化的材料可能变白但后来变成绿色，或可能维持绿色样的颜色。
本发明多核苷酸的进一步实施方案包括编码能够提供给植物对昆虫、脱水和/或真菌、细菌或病毒感染抗性或耐性的蛋白的进一步区域。由该区域所编码的蛋白对技术人员是已知的并且包括，例如，来自苏云金杆菌的Δ内毒素和来自病毒的包被蛋白。
该多核苷酸可以包括所述区域的5′及与其邻接的序列，这些序列编码(ⅰ)能够靶向该区域的翻译产物至质体如叶绿体、线粒体，其它细胞器或植物细胞壁的肽；和/或(ⅱ)非翻译的翻译增强序列。适宜的靶向序列编码叶绿体转运肽，特别是在紧临其下游的赋予对除草剂抗性的区域为EPSPS或GOX酶时更是如此。编码该多核苷酸中含有序列的蛋白的翻译表达可通过包括此所述蛋白编码区5′已知的非翻译的翻译增强序列而得到相对增强。技术人员对这种增强序列非常熟悉，包括称为Ω的来源于TMV的序列和Ω引物(prime)以及特别是可从其它病毒包被蛋白编码序列，如烟草蚀刻病毒5′区域得到的其它序列。至于核苷酸序列在植物体内(in planta)的表达，修饰编码能够赋予对除草剂抗性已知蛋白的序列也许是合意的。因此，本发明也包括如上所述但mRNA不稳定性基序和/或偶然发生的剪切区域，或者使用植物优选的密码子因而被修饰的被除去多核苷酸从而这样修饰的多核苷酸在植物中的表达产生与通过该未修饰多核苷酸在有机体中表达而获得的蛋白具有基本上(substantially)类似活性/功能的基本上类似的蛋白，其中该未修饰多核苷酸的蛋白编码区对该有机体是内源性的，该多核苷酸具有以下的附加条件，即如果这样修饰的多核苷酸包括植物优选的密码子，那么在该修饰多核苷酸内的蛋白编码区与所述植物内源性含有的并编码基本上相同蛋白的同样的蛋白编码区之间的相同程度小于约70％。
本发明进一步包括含有所述多核苷酸的载体。
本发明更进一步提供包括至少2种编码能够赋予对至少2种除草剂抗性蛋白的核苷酸序列并且从以本发明多核苷酸或载体转化的材料中再生出的植物。转化技术是众所周知的并且包括粒子介导的biolistic转化、农杆菌-介导的转化、(任选在聚乙二醇存在下的)原生质体转化；在包括该多核苷酸培养基中的植物组织细胞或原生质体的超声破碎；(任选利用已知的碳化硅“whiskers”技术的)显微插入该多核苷酸到全能植物材料中，电穿孔等。转化的发明植物包括小型谷物(smallgrain cereals)、油料种子植物、纤维植物、果树、蔬菜、种植作物及树木。特别优选的这样的植物包括大豆、棉花、烟草、甜菜、油菜、canola、亚麻、向日葵、土豆、番茄、苜蓿、莴苣、玉米、小麦、高粱、黑麦、香蕉、大麦、燕麦、草皮草、料草、甘蔗、豌豆、蚕豆、水稻、松树、杨木、苹果树、葡萄、柑桔或栗树以及这些植物的后代、种子及一部分。
本发明进一步提供包括含有编码至少2种能够赋予该材料对至少2种除草剂抗性蛋白区域的核酸的植物材料，其具有以下的附加条件，即该材料不包含编码包括仅仅5-烯酮-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白的多核苷酸；(ⅱ)该材料不包含包括仅仅编码超氧物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S转移酶(GST)区域的多核苷酸；(ⅲ)该材料不包含包括仅仅编码GST和膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)区域的多核苷酸；和(ⅳ)当该材料的来源植物为甜菜时，其包括的赋予对除草剂抗性或耐性的基因不仅仅是EPSPS和PAT。
通过对于技术人员已知的方法，该材料可再生成形态上正常且可育的完整植物。在该材料的优选实施方案中，至少其中的一个区域编码能够赋予对出苗前型除草剂抗性的蛋白，并且至少其中的另一个区域编码能够提供对出苗后型除草剂抗性的蛋白。这样的蛋白编码区域及除草剂已在上面讨论过。技术人员将认识到，由于包括编码能够赋予对第一种除草剂抗性的第一种蛋白多核苷酸的第一种植物与包括编码能够赋予对第二种除草剂抗性的第二种蛋白多核苷酸的第二种植物杂交，赋予对多种除草剂抗性的区域可存在于植物(或其一部分)中(参见本申请的实验部分)。赋予对除草剂抗性基因的优选组合为(ⅰ)HPPD基因和EPSPS或GOX基因；(ⅱ)HPPD基因和PAT基因；(ⅲ)GST基因和EPSPS/GOX基因；(ⅳ)EPSPS/GOX基因和PAT基因；(ⅳ)HPPD基因、GOX和/或EPSPS基因，和PAT基因；(ⅴ)ACC′ase基因和PAT和/或EPSPS基因；(ⅵ)PDS基因和PAT和/或EPSPS和/或GOX基因；(ⅶ)可从真氧产碱杆菌获得的tfda基因与EPSPS和/或GOX和/或PAT和/或PDS基因。此外，这些组合中的每一种可具有一个或更多个由SOD、protox和/或ALS基因所替代的除草剂基因这样的植物在本申请中称为本发明的植物。
本发明也包括选择性控制包括杂草和作物植物的大田间杂草方法，其中的作物植物包括(ⅰ)这样的多核苷酸，其至少包括编码能够赋予植物或形成该植物的组织对第一种除草剂抗性或耐性的第一种蛋白的第一个区域和编码同样能够赋予对第二种除草剂抗性的第二种蛋白的第二个区域，其具有以下附加条件(ⅰ)该多核苷酸不编码包括仅仅5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白；(ⅱ)该多核苷酸不包括仅仅是编码超氧物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的区域；(ⅲ)该多核苷酸不包括仅仅是编码GST和膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的区域；和(ⅳ)当该作物为甜菜时，其包括的赋予对除草剂抗性或耐性的基因不仅仅是EPSPS和PAT。或者是这样的多核苷酸，其至少包括编码能够赋予植物或形成该植物的组织对第一种除草剂抗性或耐性的第一种蛋白的第一个区域，及下面的多核苷酸，其包括编码同样能够赋予对第二种除草剂抗性的第二种蛋白的第二个区域，具有下面的附加条件(ⅰ)该多核苷酸不编码包括仅仅5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白；(ⅱ)该多核苷酸不包括仅仅编码超氧物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的区域；(ⅲ)该多核苷酸不包括仅仅编码GST和膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的区域；和(ⅳ)当该作物植物为甜菜时，其包括的赋予对除草剂抗性或耐性的基因不仅仅是EPSPS和PAT，该方法包括以足以控制杂草而基本上不影响作物植物的量施用至少一种所述的除草剂到田间。赋予对除草剂抗性的基因可存在于植物中分离的多核苷酸上。在优选的方法中该植物含有编码EPSPS和/或GOX酶和HPPD酶的基因，此方法包括以足以控制杂草而基本上不影响作物植物的量施用镇草宁和三酮类除草剂到田间。在该方法进一步的实施方案中，该植物含有编码EPSPS和/或GOX酶及膦丝菌素乙酰转移酶的基因，此方法包括施用镇草宁和glufosinate到田间。在此方法进一步的实施方案中，该植物含有编码EPSPS和/或GOX酶及膦丝菌素乙酰转移酶和HPPD酶的基因，该方法包括施用镇草宁和glufosinate及三酮类除草剂到田间。在此方法进一步的实施方案中，该植物含有编码EPSPS和/或GOX酶和/或膦丝菌素乙酰转移酶和谷胱甘肽S转移酶的基因，此方法包括施用镇草宁和/或glufosinate和酰基苯胺类除草剂，如acetochlor到田间。在该方法进一步的实施方案中，该植物含有编码ACC′ase和PAT和/或EPSPS酶的基因，此方法包括施用fluazifop型除草剂和glufosinate和/或镇草宁到田间。在此方法更进一步的实施方案中，该植物含有编码可获自真氧产碱杆菌(任选优化密码子的)tfdA基因产物和EPSPS和/或GOX和/或PAT和/或PDS酶的基因，此方法包括施用2,4D和镇草宁和/或glufosinate和/或除草剂型八氢番茄红素脱氢酶抑制剂到田间。此外，这些组合中的每一个可能具有一个或更多个由SOD、protox和/或ALS基因所替代的除草剂基因。
在该发明方法特别优选的实施方案中，在施用一种或更多种除草剂到田间后施用杀虫有效量的一种或更多种杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂和抗-病毒剂到田间。
本发明进一步提供了制备对二种或更多种除草剂实质上具有耐性或实质上具有抗性的植物的方法，包括以下步骤：
(ⅰ)以本发明多核苷酸或载体转化植物材料；
(ⅱ)筛选这样转化的材料；和
(ⅲ)将这样筛选出的材料再生成形态上正常且可育的完整植物。
本发明植物可任选通过下面的方法获得，包括以赋予对第一种除草剂抗性的序列转化第一种植物，并且以赋予对第二种除草剂抗性的序列转化第二种植物，将这样转化的材料再生成可育完整的植物并对这些植物异花传粉以得到包括既对所述第一种除草剂具有抗性的基因又对第二种除草剂具有抗性的基因的后代。任选地，该第一种和/或第二种材料可事先以包括以下区域的多核苷酸加以转化，这些区域编码一种或更多种赋予对除草剂抗性的蛋白、杀虫剂蛋白、抗真菌剂蛋白、抗病毒剂蛋白和/或能够赋予植物对干旱改进耐性的蛋白。
本发明更进一步提供了本发明多核苷酸或载体在制备对二种或更多种除草剂实质上具有耐性或抗性的植物组织和/或形态上正常且可育完整植物(Ⅰ)中的应用。
本发明更进一步提供了本发明多核苷酸或载体在体外就高流通量筛选潜在除草剂而制备除草剂目标中的使用。该多核苷酸的蛋白编码区可在大肠杆菌或酵母中异源表达。
本发明更进一步包括以包括SEQ ID NO:1中描述序列并且编码双加氧酶的多核苷酸转化的植物组织。这可能是该材料中唯一赋予对除草剂抗性的基因。可用已知的方法将该材料再生成形态上正常且可育的植物。在该转化组织特别优选的实施方案中，编码与SEQ ID NO:1所编码蛋白基本上具有类似活性蛋白的多核苷酸与这样的的序列互补：即该序列当于60到65℃间温度在含有0.1％SDS的0.3强度的柠檬酸缓冲盐中孵育后于相同的温度用含0.1％SDS的0.3强度的柠檬酸缓冲盐冲洗后仍与SEQ ID NO:1中描述的序列杂交。
通过下面的描述及相关的附图和序列描述，本发明将进一步显而易见。
SEQ ID NO:1显示了从集胞蓝细菌分离的DNA序列，其编码具有p-羟苯基丙酮酸双加氧酶活性的酶(如SEQ ID NO:2所述)。
SEQ ID NO:3显示了从假单胞菌87/79中分离的DNA序列，其中第1217到2290的核苷酸编码具有p-羟苯基丙酮酸双加氧酶活性的酶(如SEQ ID NO:4中所述)。
SEQ ID NO:5和6描述一种用于从细菌基因组中分离SEQ IDNO:3的具有最低丰余的合成PCR引物(参见下面的HPPD-P4和HPPD-REV1)。
SEQ ID NOs:7和8也是用于修饰SEQ ID NO:3序列从而其可掺入到所需植物转化载体中的合成PCR引物。
SEQ ID NO:9显示矮牵牛EPSPS酶(包括叶绿体信号肽)的氨基酸序列。
SEQ ID NOs:10-32为插入到限制性消化过的质粒中从而能够制备包括能赋予对除草剂抗性多种基因的构建体的PCR引物或多-接头。
图1显示包括在SEQ ID NO:3中描述序列的克隆的图解，SEQID NO:3中鉴定出三个开放阅读框：第一个起于核苷酸15且止于核苷酸968；第二个起于核苷酸215且止于核苷酸1066且第三个起于核苷酸1217且止于核苷酸2290。该图也显示通过用引物SEQ ID NOs:7和8进行遗传工程操作过的序列内含有的限制性位点，图2图解描述了含有植物表达弹夹(expression cassette)的4-HPPD的制备，该弹夹中PCR编辑的图1的DNA片以酶Nco1和Kpn1限制性酶切，然后连接到也以Nco1和Kpn1限制性酶切的载体(pMJB1)中。图3图解显示如何对植物转化双重载体pBin19进行遗传工程操作以含有图2的4-HPPD表达弹夹。
图4图解显示包括SEQ ID NO:1中描述序列的克隆。图5图解描述含有植物表达弹夹的4-HPPD的制备，该弹夹中PCR编辑的图4的DNA片段以酶Nco1和Kpn1限制性酶切，然后连接到也以Nco1和Kpn1限制性酶切的载体(pMJB1)中。
图6图解显示用于农杆菌转化的质粒载体的构建并且也包括质粒pJRlRi和pGST-273in的图谱；
图7显示在受试于四种除草剂的转化烟草中GST的活性；
图8为比较在以1400g/ha metolachlor处理3周后野生型植物和GST-2系的损伤的图；
图9为质粒pDV3-puc的图谱；
图10为质粒pDV6-Bin的图谱；
图11为含有来自玉米泛素启动子片段PCRed的质粒pUB-1的图谱，将2kb的片段克隆αpUC19中并对接点(junction)进行测序以确证该泛素启动子的存在；
图12为质粒pIE98的图谱；
图13为质粒pIGPAT的图谱；
图14为质粒pCAT10的图谱；
图15为质粒pCAT11的图谱；
图16为质粒pPG6的图谱；
图17为质粒pMV1质粒的一部分。实施例1克隆假单胞菌的4-HPPD基因、转化该基因到植物材料中并且制备对三酮类除草剂具有抗性的植物
以酪氨酸作为唯一碳源而培养的荧光假单胞菌PJ-874中纯化的4-HPPD的氨基酸序列是已知的。(Ruetschi等，欧洲生物化学杂志1992,202(2):459-466)，用该序列设计具有最少丰余的PCR引物以用于从不同的菌株(荧光假单胞菌菌株87-79)基因组DNA中扩增大段但不完整的4-HPPD基因片段。技术人员会认识到什么是术语“具有最少丰余引物”的意义所在，在下述的序列中此丰余用方括号表示。各个引物中每个引物的一个实例(相应于HPPD基因中5′和3′位置)分别示于SEQ ID NOs:3和4中。
17聚体的引物1(SEQ ID NO:5)根据发表蛋白序列(见上面)的4-9氨基酸的序列知识而设计并且同样为17聚体的引物2根据334到339残基的知识而设计。
引物1(HPPD-P4)具有序列5′TA〔T/C〕GA〔G/A〕AA〔T/C〕CC〔T/C/G/A〕ATGGG且引物2(HPPD-REV1)具有序列 5′GC〔T/C〕TT〔G/A〕AA〔G/A〕TT〔T/C/G/A〕CC〔T/C〕TC。用标准的方法制备100ng假单胞菌87-79的基因组DNA并且与100pmol的每种引物相混合。用Taq聚合酶和其它标准的试剂在下面的DNA合成和解离条件下对该混合物进行PCR扩增(35轮循环)：
94℃×1.5分钟
55℃×2分钟
74℃×3分钟
扩增出的序列包括含有4HPPD基因编码区5′端3个密码子和3′端约30个密码子的区域。用标准的方法将此PCR产物平端克隆入持家载体pGEM3Z-f(+)中。
部分测序证实此克隆的PCR片段为4-HPPD特异性的。得到的此氨基酸序列与发表的有关荧光假单胞菌PJ-874酶的序列相比含有数处不同。4-HPPD基因的此部分片段在低严格杂交/洗条件下与植物DNA的基因组Southern印迹中得到阴性杂交信号。从预先克隆的部分基因的中部切下900bp的EcoR1/EcoR1片段以用作探针。用多种酶对该基因组DNA限制消化后的Southern印迹与该放射性标记的片段杂交。
Bcl1限制性消化的DNA得到单一的约2.5kb的阳性带，该带足以含有整个基因加上非翻译DNA的侧翼区。将基因组DNA以Bcl1限制性消化并于制备性琼脂糖凝胶上电泳。切出含有2-3kb大小片段的消化过DNA的区域并且进行DNA电洗脱。将回收的DNA克隆入pUC18的BamH1(与Bcl1兼容)位点中。以该900bp的片段检测菌落印迹并分离出12个阳性菌落。从这些菌落中小量制备(DNA)，并以EcoR1切割以寻找鉴别性的900bp的带。在这12个菌落中，当过夜培养于LB中的7个形成棕色色素以制备小量(DNA)，这其中的5个为该900bp阳性带，其它5个小量制备物为阴性并且不产生棕色的色素。“棕色色素”的形成与4-HPPD基因的异源表达有关。
限制性分析显示该克隆的插入子为2.5kb的长度，具有4-HPPD基因上游约1.2kb的DNA和400bp的下游。用适当的引物和来自pUC18的引物对该基因末端进行测序。此测序证明该基因为完整的并且相对于pUC18的多接头位点以2个方向存在。
对细菌细胞裂解液的SDS-PAGE显示存在一40kDa大小的新的蛋白，其对于4-HPPD是正确的(大小)。细胞提取物中存在一较大的条带，其中具有以第一个方向插入基因从而使该基因从载体中的lac启动子开始表达。当裂解液从其中的基因为相反方向的细胞中获得时没能见到明显的40kD的条带，虽然二种克隆产生棕色色素表明在这二种细胞类型中均有活性蛋白的存在。此40kDa的重组蛋白以可溶性而不是不溶性蛋白成分而存在。将其中的基因为第二种方向的克隆进行自动DNA序列分析以显示出SEQ ID NO:3中描述的序列。编辑此序列以导入数个单一的限制位点从而有利于其装配进适于植物转化工作的载体中。SEQ ID NOs:7和8中描述的编辑寡核苷酸的引物3(HPPD SYN1)5′-GTTAGGTACCAGTCTAGACTGACCATGGCCGACCAATACGAAAACC-3′和引物4(HPPD SYN2)5′-TAGCGGTACCTGATCACCGGGTTATTAGTCGGTGGTCAGTAC-3′。假单胞菌4-HPPD基因在转基因烟草中的表达
将PCR编辑的DNA片段从酶Nco1和Kpn1限制性消化，然后连接到也以Nco1和Kpn1限制性消化的载体(pMJB1)中。pMJB1为来源于pUC19的质粒，其含有2个CaMV35S启动子；TMVΩ增强子和NOS转录终止子。得到的质粒图示于图2中。所有的DNA操作使用对植物分子生物学技术人员已知的标准方法。
分离大批DNA并通过EcoR1部分消化而切下4-HPPD表达弹夹(即，从2×35S到nos 3′终止子)且然后以Hind 3完全消化。这是为了避免在4-HPPD基因内部的EcoR1位点切割。制备性琼脂糖凝胶电泳后，通过电洗脱回收需要的DNA片段。
然后将4-HPPD表达弹夹连接到以Hind 3和EcoR1限制性消化过的双重载体pBin19中。得到质粒的结构图示于图3中。
再次用标准技术分离DNA并用于转化卡那霉素抗性的根癌农杆菌LBA4404中。用标准的技术对烟草(Nicotiana plumbaginifolia varSamsun)叶子背面(discs)/叶片(slices)进行农杆菌介导的转化。从卡那霉素抗性的愈伤组织中再生转化的幼枝。将幼枝于含有卡那霉素的MS琼脂上生根。将存活的生根外植体再次生根以提供约80株卡那霉素抗性的转化烟草植物。通过PCR证实4-HPPD基因的存在(用预先-存在的EDIT引物)约60株植物为PCR阳性。
将外植体(即叶子加上含有附属芽的短的茎段)置于含有0.02到2ppm各种浓度ZA1206(三酮类除草剂)的MS琼脂(+3％蔗糖)上。未转化的烟草外植体在0.02ppm时被完全漂白。以后继续暴露于除草剂中它们没有恢复。在这些特定的实验中，仅仅是从芽中长出的幼枝受到漂白。而外植体组织上的叶子保持绿色。
大约30株PCR阳性(PCR+ve)的转化植物耐受0.1ppm的ZA1296(大约是导致野生型烟草症状时的水平的5倍)而无漂白迹象。它们生根正常并且在表型上与未转化植物难以分辨，这些转化子中有一部分耐受0.2ppm且少数转化子耐受达0.5-1ppm的浓度。在除草剂存在下这些植物仍然表型正常且生根良好。有些转化的植物当受试于所述较高浓度除草剂时开始时被漂白，但继续暴露它们逐渐“绿起来”并且“恢复”。
用已知的除草剂Isoxaflutole〔5-环丙基-4-(2-甲基磺酰-4-三氟甲基苯甲酰基)异噁唑或RPA210772〕处理此对所述除草剂具有抗性的转基因植物中的一部分植物。这些植物对该除草剂较对命名为ZA1296的除草剂甚至具有更多的抗性因而清楚地表明这些植物对各种4-HPPD抑制剂具有交叉抗性。实施例2将集胞蓝细菌的4-HPPD基因克隆入植物材料并且再生此材料以产生对三酮类除草剂具有抗性的植物
集胞蓝细胞PCC6803的基因组已被测序。为了导入独特物限制位点以利于其装配入适于植物转化工作的载体中，用标准的方法制备集胞蓝细菌的DNA，并且与100pmol的二种适于PCR扩增(35个循环)SEQ ID NO:1中指定序列的引物混合，使用优选具有纠错阅读活性的DNA热稳定DNA聚合酶和其它标准的试剂在适当的DNA合成和解离条件下，下面为典型的条件：
94℃×1.5分钟
55℃×2分钟
74℃×3分钟
扩增出的片段包括含有4-HPPD基因编码区的区域。用标准的技术将此PCR产物平端克隆入标准的持象载体中，例如pGEM3Z-f(+)中。
自动DNA序列分析证实此克隆的PCR产物为4-HPPD特异性的。有些带有克隆的4-HPPD基因的转化菌落当过夜培养于LB中时形成棕色色素。“棕色色素”的形成与4-HPPD基因的异源表达有关(Denoya等1994细菌学杂志176:5312-5319)。
结细菌细胞裂解液的SDS-PAGE显示它们含有一种新的蛋白，其具有4-HPPD基因产物的预期分子量。在优选的实施方案中该重组蛋白或者以可溶性成分存在而不以不溶性成分存在，或者将其加工成这样的成分存在。此克隆优选进行自动DNA序列分析以证实PCR产生的人工产物的缺如。集胞蓝细胞pcc6803 4-HPPD基因在大肠杆菌中的异源表达
将此PCR编辑的DNA片段以适宜的酶如Nco1和Kpn1限制性消化，然后连接到例如适当限制性消化过的大肠杆菌表达载体(如已知的pET系列)中。所有的DNA操作使用对分子生物学领域中的技术人员为已知的标准方法。
适宜的宿主菌如带有所述载体的BL21(DE3)或其它DE3溶原菌表达大量的HPPD酶从而足以提供其用于大量的筛选过程中从而鉴定出候选4-HPPD抑制子。从所述转化宿主菌株中纯化的HPPD可用于提供抗血清从而用于分析以编码4-HPPD的多核苷酸转化的植物。集胞蓝细胞pcc6803 4-HPPD基因在转基因组植物中的异源表达
将PCR编辑的DNA片段以适宜的酶如Nco1和Kpn1限制性消化，然后连接到例如适宜的持家载体，如pMJB1中以产生含有适当植物可操作启动子和终止子的表达弹夹。pMJB1为pUC19衍生的质粒，其含有2个CaMV 35S启动子；TMVΩ增强子和nos转录终止子。得到的质粒图解显示于图4中。
然后将4-HPPD表达弹夹连接到以Hind3和EcoR1限制性消化过的双重载体pBin19中。得到质粒的结构图解显示于图5中。
再次用标准的方法分离DNA并用于转化对卡那霉素具有抗性的根癌农杆菌LBA4404。用标准的方法对土豆和番茄进行农杆菌介导的转化。从对卡那霉素具有抗性愈伤组织中再生转化的幼枝。将幼枝于含有卡那霉素的MS琼脂上生根。将存活生根的外植体再次生根以提供大约80株对卡那霉素具有抗性的转化的烟草植物。通过PCR证实4-HPPD基因的存在(用预先存在的EDIT引物)。筛选大量的PCR阳性植物以用于进一步分析。
将外植体(即，叶子加上含有附属芽的短的茎段)置于含有0.02到2ppm各种浓度ZA1206(三酮类除草剂)的MS琼脂(+3％蔗糖)中。未转化的植物在0.02ppm时被完全漂白。继续暴露于该除草剂它们没有恢复。在这些特定的实验中，仅仅是从芽生长出的幼枝受到漂白，外植体组织上的叶子保持绿色。
大约30株PCR阳性的转化植物耐受0.1ppm的ZA1296(大约是导致野生型烟草症状的水平的5倍)而没有漂白迹象。它们生根正常并且与未转化植物在表型上难以区分。这些转化子中的一部分耐受0.2ppm并且少数转化子耐受达0.5-1ppm的浓度。在除草剂存在下这些植物仍然表型正常且生根良好。当受试于所述较高浓度的除草剂时有些转化的植物起始被漂白，但继续暴露(于除草剂)时它们逐渐“绿起来”并且“恢复”。
用已知的除草剂Isoxaflutole〔5-环丙基-4-(2-甲基磺酰-4-三氟甲基苯甲酰基)异噁唑或RPA210772〕处理对所述除草剂具有抗生的转基因植物的一部分。这些植物对该除草剂具有抗性并且对部分为ZA1296的除草剂具有抗性因而清楚地表明该植物对多种4-HPPD抑制剂具有交叉抗性。
实施例3将GST基因克隆入植物材料中并且产生对N-酰苯胺和二苯醚类除草剂具有抗性的植物植物    将烟草(Nicotiana tabacum cv Samsum)的茎干(Stocks)保存于Musharige和Skoog培养基(MS培养基：补充以3％蔗糖和0.8％细菌培养用琼脂的MS盐(4.6g/l),pH5.9)中。将这些植物，用于生根分析的外植体和用于萌发测试的种子于25℃室温光照培养16小时。当培养于温室中时，将这些植物转移到堆肥(JohnInnes堆肥3号，Minster Brand产品)中。细菌菌株    大肠杆菌菌株DH5(GIBCO BRL)为：F-,80dlac ZM15,(lacZYAargF)U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17(rK -,mK +),supE44,-thi-gyrA96relA1。根癌农杆菌菌株LBA4404用于转化烟草叶片。质粒    将GST-27DNA插入到命名为pIJ21-3A的2.961kb的pBluescript_ⅡSK(+/-)噬菌粒(Jepson等1994)中。pJR1Ri为12.6kb的质粒。该pJR1Ri质粒含有细菌卡那霉素抗性标记(KAN)。其具有2个25bp的重复序列：右边界(RB)和左边界(LB)。T-DNA含有由NOS启动子驱动的卡那霉素抗性标记基因。GST-27蛋白编码序列在CaMV35S启动子的控制下表达。大小标记    当在琼脂糖凝胶上检查消化和PCR(聚合酶链式反应)产物时将1kb DNA梯子用作DNA大小标记(Bethesda ResearchLaboratories Life Technologies，有限公司)。正如技术人员所知道的将虹色蛋白分子量标记(Amersham)加样于聚丙烯酰胺凝胶中用于Western分析。化学试剂    活性成分acetochlor、alachlor和metolachlor生产于ZENECA    Agrochemicals(UK),    Jealott’s   Hill    ResearchStation。在乙醇中制备技术成分(fechnical ingredients)且用于HPLC分析、生根分析和萌发测试(参见下面)。质粒构建
在1×Tris乙酸盐(TA)缓冲液中用限制酶EcoRⅠ(发玛西亚)消化含有GST-27DNA基因的质粒pIJ21-3A。于0.8％琼脂糖凝胶上检查消化(结果)。用Klenow DNA聚合酶(发玛西亚)添平突出端后将EcoRⅠ消化的片段连接到pJR1Ri的Smal(发玛西亚)位点中(图6)。连接GST基因之前用中碱性磷酸酶(C.A.P)防止pJR1Ri的自连。通过热休克方法用该质粒转化感受态大肠杆菌细胞(DH5)。将其培养于L-琼脂及卡那霉素平板上。通过PCR或以标记探针(α-32P dNTP)于42℃杂交过夜检查阳性菌落。通过每个A或T增加2℃并且每个G或C增加4℃来确定探针的解链温度(TM)。反应根据制造商方法用Taq聚合酶(Ampli-Taq DNA聚合酶，PerkinElmer Cetus)在最低的Tm-5C进行，按如下设立36个环循环的PCR条件：94℃DNA变性48秒，在最低的Tm时退火1分钟且于72℃延伸2.5分钟。第一轮循环之前，以85℃开始反应。
挑选8个阳性菌落并于37℃振荡培养于LB培养基和卡那霉素培养中过夜。提取这些细胞培养物的DNA且然后通过以50,000rpm在CsCl梯度中超速离心而纯化。
通过用Sequenese_(2.0版，美国生化公司)根据制造商步骤；按照Sanger方法对35S启动子和GST基因之间的区域进行测序而检查插入到pJR1Ri中的方向。用Hostler等1987所述的冻融方法将得到的质粒(pGST-27Bin)(图6)导入根癌农杆菌菌株LBA4404中。通过农杆菌的叶片转化
根据Bevan1984所述方法将pGST-27Bin转化入烟草中。培养于MS上3周龄的无菌烟草(Nicotiana tabacum cv Samsum)培养物用于转化。于NBM培养基(补充以1mg/l6-苯甲氨基嘌呤(6-BAP)、0.1mg/l萘乙酸(NAA)的MS培养基)和卡那霉素中将这些叶片孵育1天。此培养基能使从叶片中长出幼枝(Shoot)。一天后，切掉叶片边缘并将叶片切成碎片。然后将其与含有具有插入子的pJR1RⅠ质粒(pGST-27Bin)的转化农杆菌细胞悬液(菌株LBA4404)一起孵育20分钟。然后将碎片返回到含有NBM培养基的平板中。2天后，将外植体转移到含有补充以羧苄青霉素(500mg/l)和卡那霉素(100mg/l)的NBM培养基的培养盘中。5周后，将每个叶片背面的1根幼枝转移到补充以羧苄青霉素(200mg/l)和卡那霉素(100mg/l)的NMB培养基中。2-3周后，将其有根的幼枝转移到新鲜培养基中。将每个幼枝的2根插条转移到各自的培养盘中。一个保存为组织培养原种(Stock)，另一个在生根后转移到温室中生长。将带有GST-27构建体的42个独立的转化子转移到温室中。用于PCR反应的叶片DNA提取通过PCR证实推断性转化子中转基因的存在。从培养于无菌条件中3-4周龄的植物中采集叶片样品。将大约5mm直径的叶片于200μl提到缓冲液(0.5％十二烷基磺酸钠(SDS)、250mM NaCl、100mM Tris HCl(pH8)中研磨30秒。将样品以13,000rpm离心5分钟且然后向上层液中加入等体积150μl的异丙醇。将样品置于冰上10分钟，以13,000rpm离心10分钟并放置至干燥。然后将其重悬于100μl去离子水中，其中的15μl用于PCR反应。PCR用Jepson(1991)所述的条件进行。用对GST-27 3′区域特异性的引物GSTⅡ/7(AACAAGGTGGCGCAGTT)(SEQ IDNO:10)和对NOS终止子特异性的NOS3(CATCGCAAGACCGGCAACAG)(SEQ ID NO:11)分析以GST-27DNA转化的植物。通过PCR,42个初始转化子中的39个得到了310bp的片段。Western印迹分析    为了证实GST-27在烟草中的异源表达，进行Western印迹分析。于4℃在聚乙烯poly-pyrolidone(PVPP)(为了吸附苯类化合物)和0.5ml提取缓冲液(1M Tris HCl,0.5MEDTA(乙二胺-四乙酸)、5mM DTT(二硫苏糖醇)、pH7.8)中研磨120mg来自于无菌条件下培养3-4周植物的叶片。然后再加入200μl提取缓冲液。混合该样品且然后于4℃离心15分钟。去除上清液，用BSA作为标准通过Bradford分析估计蛋白的浓度。将样品保存于-70℃直至需用。
煮沸2分钟后，将5μg具有33％(v/v)Laemmli染料(97.5％Laemmli缓冲液(62.5mM Tris HCl,10％w/v蔗糖、2％w/vSDS,pH6.8),1.5％焦宁y和1％-巯基乙醇)的蛋白样品上样于SDS-聚丙烯酰胺凝胶(17.7％30:0.174丙烯酰胺：双丙烯酰胺)中。在下面的缓冲液(14.4％w/v甘油，1％w/v SDS,3％w/v Tris碱)中电泳分离蛋白提取物。然在下面的印迹缓冲液(14.4％w/v甘油，3％w/v Tris碱，0.2％w/v SDS,20％v/v甲醇)中用电印迹方仪(Biorad unit)于40mV过夜将其转移至硝酸纤维素(Hybond-CAmersham)上。
通过在0.05％CPTS(酞菁铜四磺酸四钠盐(Copperphtalocyanine tetrasulfonic acid tetrasodium salt))及12mM HCl中染色新印迹的硝酸纤维素而检查上样等量的蛋白。然后通过在12mMHCl溶液中2-3次冲洗而对印迹进行脱色并且过量的染料通过在0.5MNaHCO3溶液中5-10分钟并且以去离子水冲洗而去除。滤膜用含有5％w/v BSA的TBS-Tween(2.42％的w/v Tris HCl,0.8％w/vNaCl,5％Tween20(聚环氧乙烷山梨糖醇单月桂酸酯)，pH7.6)封闭1小时。然后将其在补充以2％w/v BSA的TBS-Tween中洗20分钟。用1∶2000稀释的绵羊GST-27抗血清作为一级抗体并且用1∶1000稀释的兔抗绵羊抗血清作为与辣根过氧化物酶(HRP)的二级抗体进行间接免疫测定。用补充以2％w/v BSA和TBS-Tween洗去任何多余的抗血清。和Amersham描述的方法进行ECL(增强化学发光)检测。通过在上述溶液中再次洗膜而去掉任何背景。
在LKB 2222-020Ultroscan XL激光光密度计(发玛西亚)上对GST基因的表达水平进行估计。Western分析表明PCR阳性的初级转化子中有8个没有显示出可检测到的GST-27的表达。剩下的31个显示出不同的表达水平，其变化从几乎检测不到的水平到如同在纯玉米GSTⅡ样品中检测到的相当于1％总可溶性蛋白的高水平。Southern印迹分析    通过Southern印迹分析确定转基因的整合模式。自培养于温室中植物采集的置于含有0.75ml提取缓冲液(0.35M山梨糖醇，0.1M Tris HCl,0.005M EDTA,0.02M偏亚硫酸氢钠，pH7.5)的塑料袋中的2.5g新鲜烟草叶片通过穿过“Pasta机器”的滚动器(roller)而压碎。然后在6000rpm于室温中离心压碎的提取物5分钟。弃上清液后，将沉淀物重悬于300μl提取缓冲液和300μl核团(nuclei)裂解缓冲液(2％w/v CTAB),0.2M Tris HCl,0.05MEDTA,2M NaCl,pH7.5)中。加入120μl5％的Sarkosyl并且将该样品置于65℃水浴中15分钟。加入600μl24∶1的氯仿∶异戊醇后以6000rpm离心提取物5分钟。将700μl异丙醇加入到相同体积的上清液中并以13,000rpm离心10分钟。然后以70％乙醇洗沉淀物并放置气干。将沉淀物于4℃置于30μl TE(10mM Tris HCl,1mMEDTA)中过夜以将其重悬。将样品保存于20℃直至需用。
对于含有GST-27基因的植物的提取物，将叶片总RNA于37℃在1×Phor-one-all缓冲液(20mM Tris乙酸盐，20mM乙酸镁，100mM乙酸钾，发玛西亚)中用下面的限制酶SacⅠ和XbaⅠ消化6小时。DNA于0.8％琼脂糖凝胶中进行分离，通过在0.5M NaOH、1.5MNaCl中轻轻摇动30分钟而变性并且通过在0.5M Tris HCl,1.5MNaCl中摇动75分钟而中和该凝胶。然后通过于20×SSC(3MNaCl,0.3M Na3citrate)中毛细印迹将此DNA转移至Hybond-N(Amersham)尼龙膜上。联合使用UV层聚(Strata)交联(Stratagene)并且于80℃烘烤20分钟而将DNA固定于膜上。通过用EcoRⅠ消化从含有GST-27基因的质粒(用于农杆菌转化)中切下探针。用Prime-a-Gene试剂盒(Promega)，根据Feinberg和Vogelstein所述随机引物方法用α-32P dNTP(3,000 Ci/mM)标记该探针。通过以SacⅠ和EcoRⅠ消化pIJ21-3A而制备阳性对照。
在5×SSPE(0.9M NaCl,0.05M磷酸钠，0.005M EDTA,pH 7.7),0.5％SDS,1％w/v Marvel(干奶粉)，200μg/ml变性鲑精DNA中于65℃3-4小时进行预杂交。在相同的缓冲液(但没有最后一种成分)中进行杂交。于-70℃放射自显影之间，于65℃在3×SSC,0.5％SDS中洗30分钟并且于1×SSC,0.1％SDS中洗2次而进行洗膜。HPLC分析为了证实表达GST-27的植物显示抗除草剂底物的GST活性，用HPLC进行体外除草剂分析。从培养于温室中3-4月龄的开花烟草植物中采集1g叶片组织，并于液氮和7ml提取缓冲液(5mM甘氨酰甘氨酸、0.5mM EDTA、1mM DTT,pH 7.5)中研磨。将提取物转移至含有0.1g PVPP的离心管中并以16,500rpm于4℃离心30分钟。将2.5ml上清液上样于Sephadex G-25(PD 10)柱(发玛西亚)中并且以3.5ml含有1mM EDTA和1mM DTT的磷酸钠缓冲液(50mM,pH 7.0)洗脱。用BSA作为标准通过Bradford方法对蛋白进行估计。将提取物分成数多份并于-70℃保存备用。用65:35乙腈：1％水溶性磷酸流动相以1.5ml/分钟的速率在Spherisorb5μ ODS2柱(25cm*4.6mm i.d.，制造商：Hichrom)上进行HPLC分析。在UVLC-6A Schimadzu检测器上(波长200nm)上检测该化合物。
反应在室温(20-25℃)于0.8ml HPLC小瓶中进行。将15-94％体积的植物外植体加入到磷酸钠缓冲液(pH7),5mM谷胱甘肽成同型谷胱甘肽及2或20ppm化合物(2ppm消草醚，20ppmacetochlor,alachlor及metolachlor)中。同样用相同的比例但以磷酸钠缓冲液代替提取物而设立对照。通过加入用作底物的除草剂而起始反应。监测化合物反应性最长达9-19小时。通过JCL6000色谱数据系统包(Jones色谱)计算特异性滞留时间点的HPLC峰值面积对时间图。根据校正峰值面积对时间数据的指数适合度(fits)获得半寿期及假一级速率常数(psendo first-order rate constant data)。用2.0版的FIT软件包对这些数据进行控制(master)。
用上述方法学，分析转化植物抗不同除草剂底物GST活性。这些除草剂由3种二氯乙酰硝基苯胺(acetochlor alachlor metolachlor)和二苯醚(消草醚)所组成。已知这些化学药品，特别是二氯乙酰硝基苯胺被结合到谷胱甘肽上。提取在PVPP及低温时进行以限制蛋白的变性。对GST稳定性研究显示当贮存于-20℃时玉米粗提物中GST活性下降73％。因此，决定将提取物分成多等份。将其保存于-70℃备用。对每个样品于冰上过夜解冻仅一次。提取后2周内进行分析。
根据其溶解性限度设定除草剂在HPLC小瓶中的浓度。在20ppm分析acetochlor,alachlor及metolachlor并且于2ppm分析消草醚。根据除草剂的反应性将此分析进行9-19小时。对metolachlor分析更长的时间，因为其半寿期在这些条件下较长。于200nm处在UV检测器上对这些化合物进行测定。监测除草剂的特异性滞留时间及峰值面积。根据7-11个时间点计算GST活性。指数下降曲线后进行酶交联，被分析除草剂峰值面积的下降用于计算GST活性。同时计算半寿期及第一级速率常数。
分析包括野生型(阴性对照)、4GST-275、6、12和17品系的5个烟草品系。挑选它们是因为通过Western分析测定其高表达。为了限制监测前的任何迅速交联，最后加入除草剂。同时分析GST-2717品系将acetochlor交联到同型半胱氨酸上。结果报告于图7中并且显示表达GST-27的植物在体外表现出抗氯乙酰硝基苯胺除草剂的活性。
总之，转基因烟草植物表达GST-27蛋白并且可通过其在体外抗除草剂底物的相对活性而别它们。体内分析-生根分析GST-27品系在体个具有显著的抗至少3种氯乙酰N-酰苯胺的活性。此外，已知大多数这类除草剂抑制根部延长。因此，决定设立对acetochlor,alachlor和metolachlor的生根测试。
建立导向(pilot)实验以找出最为有效的浓度。挑选7种浓度范围：0,1,5,10,20,40和100ppm。用alachlor测试二种转化的品系(GST-276和17品系)和野生型烟草。挑选6和17品系因为根据Western印迹分析它们代表最低和最高表达的植物。将由附着到一条动枝上的叶片所组成的三个外植体转移到补充以除草剂的MS培养基中。2周后观察到根部的生长(图8)。对于该植物的普通(general)方面，可观察到1ppm浓度的除草剂对野生型的影响，叶片更带有黄色且更小。随着浓度的增加，这些影响更大并且新叶片的数目下降。从10ppm开始，该植物不产生新的叶片。相反，对于转化的品系，从20ppm浓度可观察到除草剂对品系2的影响且从40ppm可观察到除草剂对品系6的影响。在这些浓度之间，虽然叶片似乎更小且其数目略有下降，但它们仍为绿色的。其次，野生型在达5ppm时仍产生一些根，但其长度在0到5ppm之间的浓度内剧烈下降。至于2和6品系，分别在10ppm和20ppm时仍产生根，较低浓度其长度下降。在这些条件下且2周后，可观察到对于该实验的此时期而测试的“最佳”品系来说，限制生根的浓度在20到40ppm之间。
建立随后的实验用野生型(对照)、4个GST-27(5,6,12和17品系)。用acetochlor、alachlor和metolachlor分析这些植物，对于提及的20ppm acetochlor和metolachlor除草剂用下面的范围：0,10,20,40ppm，并且对于alachlor用0,20,40,100ppm。挑选这些浓度是因为在HPLC中这些植物显示出抗acetochlor和metolachlor的最终活性。使用相同的条件：每个浓度每个品系的3个外植体转移到补充以除草剂的MS培养基中。开始分析后观察根部生长3周时间。
至于导向实验，每盘中外植体的反应通常一致。对于alachlor，在除草剂存在时野生型外植体没有显示任何生根或任何新的叶片的产生。但是GST-27 6品系和17品系在10和20ppm时几乎没有生根及小叶片。品系5和12与这2个品系抗性不同。对于alachlor，在该测试范围时野生型不产生任何根，但在20ppm时产生一些叶片。品系6和17在达40ppm的浓度时仍生根，其生根似乎不受该除草剂的影响。随着除草剂浓度的增加根的数目似乎越少。对于这些品系，在这些条件下且3周后生根浓度的限度在40到60ppm之间。在20和40ppm该除草剂时9和16品系不产生任何根但产生很小的叶片。对于metolachlor，在10和20ppm时，野生型烟草产生很少的小根。6和17品系产生短根，但不如对于alachlor所产生的根多。对于该除草剂，对6品系的生根浓度限制在20到40ppm之间且对17品系则大于40ppm。以除草剂处理植物    为了证实表达GST-27的转基因植物赋予对除草剂处理的抗性，在温室中进行出苗前及出苗后除草剂试验。
通过对于每种范围的除草剂播种每个品系大约50粒种子于沙(25％筛过的泥沙，75％grift，缓释肥料)中进行出苗前测试。每个化学范围处理4份。用牵引式喷雾器(tracksprayer)施用在5％JF5969(905.6g/l环己酮，33.33g/lsynperonic NPE1800和16.7g/lTween85)中制备的除草剂(0,300和350g/ha)至种子栽培入箱(fray)中。使种子在温室中萌发并于3周后对萌发计分。对于alachlor的结果显示该转基因植物对除草剂的出苗前施用具有抗性。对于ocetochlor、metolachlor和EPTC(12000g/ha)获得了类似的结果。
通过在堆肥中每种除草剂范围种植每个品系的28粒种子进行出苗后测试。16天后用牵引式喷雾器以5％JF5969制剂中的alachlor喷洒烟草植物(1cm高)。喷洒处理后3周用相对于未喷洒对照的植株大小、坏死、叶尖状态、叶片形态来对损伤计分。100％损伤的得分意为该植物被除草剂杀死且0％的得分意为该植物与未处理对照类似。对于alachlor的出苗后结果表明该转基因植物对此除草剂具有抗性。图9中图解描述了以1400g/ha metolachlor处理后对野生型植物和各个(segregating)GST-27品系的损伤。从2000g/ha acetochlor进行类似研究得到类似结果。
                 实施例4将镇草宁抗性基因克隆到植物材料中并产生对镇草宁抗性的植物
用于该实施例中所有弹夹和特异性植物转化构建体示于欧洲专利申请No.EP A1536330的图中。双子叶(Dicot)植物载体1    载体1为组成性对照质粒，其含有融合到来自由增强的35S CaMV启动所驱动的拟南芥菜Rubisco基因叶绿体转运(CTP)序列1上的镇草宁氧化酶基因(GOX)。该构建体在CTP编码序列的5′端含有Ω翻译增强子。载体1利用NOS终止子。CTP-GOX构建体根据WO92-00377中公开的序列合成，在翻译起始ATG处添加NcoⅠ位点并且在3′末端添加KpnⅠ位点。在合成过程中删除内部的SphⅠ位点和NcoⅠ位点而不改变蛋白序列。将CTP-GOX序列分离为NcoⅠKphⅠ片段并用标准的分子克隆技术将其连接到NcoⅠKphⅠ切割过的pMJB1中，该pMJB1为基于pIBT211的质粒，含有CaMV启动子，其2个增强子连接到代替烟草蚀刻病毒5′非-翻译前导序列的烟草马赛克病毒翻译增强子序列上，并终止于NOS终止子。
将含有增强的CaMV35S启动子Ω增强子-CTP-GOX-Nos序列的弹夹分离为HindⅢEcoRⅠ片段并连接到HindⅢEcoRⅠ切割的pJRIi(一种基于pBin19的植物转化载体)中。双子叶植物载体2    根据WO92-0449中描述的序列合成融合到矮牵牛叶绿体转运肽上的CP4-EPSPS(其为Ⅱ类EPSPS)，其在翻译起始ATG处具有NcoⅠ位点。沉寂EPSPS中的内部SphⅠ位点而不改变蛋白序列。分离含有合成CTP-EPSPS序列的片段作为NcoⅠSacⅠ片段并连接入pMJBⅠ中。将该序列置于增强的35S启动子和NOS终止子的表达控制之下，其中Ω序列位于该蛋白编码区的5′端，并且将该序列分离为EcoRⅠHindⅢ片段，将其克隆入pJRIi以得到双子叶植物载体2。双子叶植物载体3    通过用EcoRⅠ切割双子叶植物载体2并插入EcoRⅠ-SphⅠ-EcoRⅠ接头而构建既具有EPSPS又具有GOX基因的对照载体。以SphⅠ切割得到的载体以释放弹夹(“B”)，将其克隆入双子叶植物载体1启动子5′端的SphⅠ位点中以形成pDV3puc(图9)。然后从pDV3puc中切下包括来自载体(1)和(2)启动子和终止子的编码区作为HindⅢ和EcoRⅠ片段并克隆入pJRIi中。用已知的技术通过农杆菌介导的转化将双重载体pJRIi质粒pDV3导入到烟草中。从获自这样转化材料的愈伤组织中取出270根幼枝，其中的77根生根。为了证实EPSPS和GOX基因在这样生根的幼枝中的存在，从pDV3植物中制备DNA提取物并且用下面的引物通过PCR加以分析：
3′末端EPSPS基因
GATCGCTACTAGCTTCCCA(SEQ ID NO:12)EPSPS2
5′末端GOX基因
AATCAAGGTAACCTTGAATCCA(SEQ ID NO:13)GOX1
如果两个基因均存在，PCR反应提供1.1kb的条带。为了证实镇草宁耐性基因的功能，将pDV3组织培养外植体转移到含有0.01mM和0.05mM镇草宁的MS培养基中。转移到含有镇草宁的培养基中2周后对植物进行计分。用在兔子中产生的抗纯化GOX和EPSPS的抗血清通过Western分析在含有除草剂培养基中成功生长的抗性品系。
从每个初级转化子中制备叶片DNA提取物并用于PCR反应以证实载体的存在。用前述的方法对每个PCR阳性的pDV3植物进行Western印迹分析以证实GOX和EPSPS的异源表达。对高水平表达植株进行自我传粉并且在卡那霉素平板上进行种子筛选(seed screen)。保存单座位植物用于纯合子制备。证明以pDV3构建体转化的植物对镇草宁具有抗性的数据可见于实施例8中。
               实施例5对N-酰苯胺型除草剂和镇草宁具有抗性植物的制备
将表达GOX和EPSPS的杂合和纯合烟草品系异花传粉到表达GST-27的纯合烟草品系。用前述的方法，种植在该异花传粉中产生的种子并采集叶片材料用于Western分析。然后用GOX/EPSPS抗体筛选来自GST-27Western阳性植物的蛋白提取物以筛选出同时表达GST-27、GOX和EPSPS的品系。然后将这些品系用于以acetochlor、alachlor和metoloachlor和EPTC的出苗前除草剂喷洒中。随后，可用配制的镇草宁以出苗后的方式喷洒这些植物。
                  实施例6通过不包括异花传粉的方法制备同时对N-酰苯胺和镇草宁型除草剂具有抗性的植物
用EcoRⅠ切割载体pDV3puc，酚氧化提取并沉淀。将ΔEcoRⅠ-HindⅢ-EcoRⅠ接头NKOL3 5′AATTACGGAAGCTTCCGT 3′(SEQID NO:14)加热到70℃并冷却至室温以使其自我退火。然后将退火的接头连接到EcoRⅠ切割的pDV3puc中。以末端标记的寡核苷酸MKOL3筛选推断的组合。从阳性杂交菌落中分离质粒DNA。以HindⅢ限制性消化释放出5.4kb的片段，其含有驱动Ω-CTP2-EPSPS-NOS表达的35S CaMV启动子和驱动Ω-CTP1-GOX-NOS表达的35S CaMV启动子。将此片段克隆入以HindⅢ切割并以CIP脱磷酸的pGST-27Bin中。用插入探针筛选重组子。用适当的序列分析确定此得到的载体pDV6-Bin(图10)。用已知的技术经过农杆菌将此得到的质粒转化入烟草中。转化后回收270根幼枝，其中的80根生根。从每个级转化子中制备叶片DNA提取物并用于PCR反应中以证实编码该载体区域的蛋白在叶片中的存在。这些引物如上所示(SEQ IDNOs:12和13)。为了证实该转基因的功能，在组织培养基中用0,0.01mM和0.05mM镇草宁和10ppm和40ppm alachlor分析来自pDV6-Bin的初级转化子。许多转基因(植物)成功生长于野生型对照不能生长条件下的2种培养基中。用前述方法对每个PCR阳性植物进行western印迹分析以证实GOX和EPSPS及GST-27的异源表达。然后用acetochlor alachlor metoloachlor和EPTC将这些品系用于出苗前除草剂喷洒中。随后，可以配制的镇草宁用出苗后的方式喷洒这些植物。下表1给出了除草剂处理DV6植物(即同时表达镇草宁抗性基因和GST的植物)前后的数据。顶部上半个表显示出苗前除草剂施用的幅度及其在没有出苗后除草剂施用时的连续状态。顶部表的下半部给出了800g/ha镇草宁处理后发生的损伤。底部表显示由于出苗后镇草宁处理对未经出苗前处理前植物造成损伤的复制子得分(replicatescores)。野生型植物的所有复制子得分类似而转基因得分反映出这为一个单独的种群的事实，即不表达转基因的不成对的(azygous)植物能够活过出苗后喷洒测试。表1    出苗后除草剂处理的平均值21DAT
后处理 前处理 ％毒害植物
化学药品 幅度 化学药品 幅度 pDV6#2 pDV6#71 野生型
无 无 0 0 0
Acetochlor 50 0 0 -
Metolachlor 300 0 0 -
Alachlor 400 0 0 -
Dimethenamid 50 0 0 -
Cycloat 5000 0 0 -
EPTC 5000 0 0 -
Bayer FOE5043 50 0 0 -
四唑啉酮 200 - 0 -
镇草宁 800 无 - 18.75 48.75 86.25
360g/l Acetochlor 50 0 0 -
Metolachlor 300 0 0 -
Alachlor 400 0 0 -
Dimethenamid 50 0 0 -
Cycloat 5000 0 0 -
EPTC 5000 0 0 -
Bayer FOE5043 50 0 0 -
四唑啉酮 200 - 0 -
后处理 前处理
化学药品 幅度 化学药品 a b c d
镇草宁 800 无 75 0 0 0
100 0 0 95
90 90 90 75
FOE5043是已知作为fluthiamide的氧代乙酰胺。
              实施例7对glufosinate和N-酰苯胺型除草剂具有抗性玉米的制备
按如下制备含有赋予对出苗前除草剂抗性GST-27和赋予对出苗后除草剂glufosinate抗性膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的单子叶(玉米、小麦)转化载体：步骤1：以HindⅢ消化pUB1(基于pUC的含有玉米泛素启动子的内含子的载体)(图1 1)。向由该消化产生的缺口中插入HindⅢ-AgeⅠ-HindⅢ接头(5′AGCTTGTACACCGGTGTACA3′(SEQ IDNO:15))。将得到的重组载体命名为pUB2。步骤2：用KpnⅠ和BamHⅠ从pIJ21-3A中切下GST-27cDNA并且克隆入BamHⅠ和KpnⅠ切割的pUB2中以形成pUB3。步骤3：将KpnⅠ-PacⅠ-KpnⅠ接头(5′CGGACAATTAATTGTCCGGTAC3′(SEQ ID NO:16))自我退火并克隆入KpnⅠ切割的pUB3中以形成pUB4。步骤4：从pIE98中将NOS终止子分离为SmaⅠ片段(图12)，并且平端克隆入EcoRⅤ切割的pUB4中以形成pUB5。通过以EcoRⅠ和BamHⅠ限制性消化确定NOS终止子在pUB5中的方向。测序所有的接头以确定各种构建体成分正确的插入。步骤5：通过用AgeⅠ和PacⅠ消化将存在于pUB5中的泛素GST-27 NOS弹夹从其中切出并且克隆于含有在35S-CaMV启动子控制下PAT基因的氨苄基青霉素负性载体pIGPAT中(图13)。通过以来自pIJ21-3A的EcoRⅠcDNA插入子的菌落杂交检测重组子。通过以来自pIJ21-3A的EcoRⅠcDNA插入子的菌落杂交检测重组子。以NcoⅠ限制性消化获取重组子以形成pCAT10(图14)。步骤6：通过以AscⅠ消化切下35S-PAT-NOS弹夹并插入pPUN14的AscⅠ泛素-PAT-NOS弹夹以形成pCAT11(图15)。用已知的须状体(whiskers)和粒子轰击技术将pCAT11转化入小麦和玉米中。然后将细胞转移到含有bialophos的培养基中以筛选出表达PAT基因的愈伤组织材料。然后用下面的引物(分别为SEQ ID NOs:33和34)对培养于含有此除草剂培养基中的愈伤组织进行PCR以证实GST-27基因在该愈伤组织中的存在。
5′CCAACAAGGTGGCGCAGTTCA 3′(SEQ ID NO:33)
5′CATCGCAAGACCGGCAACAG 3′(SEQ ID NO:34)。将含有GST-27表达弹夹的愈伤组织转移到植物再生培养基中并回收玉米植物。通过对叶片总蛋白提取物的Western印迹证实此转化的玉米植物以高水平组成性表达GST基因。将此植物与优良的玉米近交品系间异花传粉并回收种子。为了证实该植物对除草剂acetochlor的增强的耐性。将所述的种子种植于每公顷施用2,000到8,000克除草剂的土壤中。让这些种子萌发并培养7天后分析得到的幼苗样品由化学药品所致的损伤并与在相同条件下种植的非转基因种子得到的幼苗(如果有的话)进行比较。培养于以除草剂和相应的安全剂处理土壤中的“转基因”幼苗和非转基因对照幼苗几乎没有表现出损伤(如果有的话)，而培养于含有除草剂而无完全剂的土壤中的非转基因幼苗显示出非常大的损伤。使存活过第一种除草剂处理后的幼苗进一步培养20天左右，然有用的约0.1到1％活性成分的各种浓度商业glufosinate混合物喷洒。当与不含PAT基因的幼苗比较时，依据施用的浓度，含有PAT基因(其表达通过De Block M等(EMBO杂志6(9):2513-2518(1981)所述方法加以测定)的幼苗或者是对glufosinate具有完全抗性，或者对该除草剂具有相对耐性。
                   实施例8同时对镇草宁和glufosinate具有抗性植物(单子叶及双子叶)的制备
该实施例显示同时对glufosinate和镇草宁具有抗性植物的制备。该多除草剂抗性源自被遗传工程操作为对glufosinate具有抗性的第一种植物与被操作为对镇草宁具有抗性的第二种植物之间的杂交。Glufosinate抗性构建体pPG6的制备
pPG6为源自pBin19RiPAT的基于Bin19的载体并且含有具有驱动GUS基因35S CaMV启动子的弹夹。在启动子与GUS之间插入ST-LS1基因的第二个内含子。该序列为189bp，具有80％的A/T含量，在所有三个阅读框中为典型的剪切点和终止密码子。内含子的存在阻止了GUS在农杆菌中的表达因为在原核细胞中不发生剪切。其也含有带有驱动PAT基因表达35S CaMV启动子的弹夹。图16显示pPG6的图谱。镇草宁抗性构建体
按上面实施例4中所述制备双子叶植物载体1-3。单子叶植物载体1    单子叶植物载体1为同时含有CTP1 GOX和CTP2 EPSPS的质粒，在来源于pUC的质粒中二者均由玉米多泛素启动子所驱动并由玉米多泛素内含子1所增强。其也含有赋予对膦丝菌素耐性的弹夹。
质粒1：将载体pUB1以KpnⅠ消化并插入KpnⅠ-Not1-Kpn1接头(序列5′CAT TTG CGG CCG CAA ATG GTA C3-SEQ IDNO:17)。将EcoRⅠ-Not1-EcoR1接头(5′AAT TCA TTT GCG GCCGCA AAT G3′(SEQ ID NO:18))插入到DV1-pUC的EcoR1位点中。以Nco1切割得到的质粒并用DNA聚合酶1Klenow片段补平5′突出端。然后和Not1消化线性载体并分离Not1-平端片段。将含有CTP1-GOX和NOS序列的该片段连接到Sma1-Not1消化修饰的pUB1中。将Hind111-Not1｀-Hind111接头(序列5′AGC TTG CAGCGG CCG CTG CA3′(SEQ ID NO:19))插入到该质粒中以得到质粒1。
质粒2：将EcoRⅠ-Not1-EcoR1接头(5′AAT TCA TTT GCGGCC GCA AAT G3′(SEQ ID NO:20))插入DV2-pUC的EcoR1位点(分离不含有上述接头的另一个克隆，因而允许此克隆策略)。将得到的质粒以Nco1消化并且用DNA聚合酶1 Klenow片段将5′突出端补平。然后用Not1切割线性载体并将得到的片段克隆入刚才所述的相同载体(修饰的pUB1)中以产生质粒2。从pIE108中切下包括35SCaMV启动子、Adh1内含子、膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)和nos终止子的PAT可筛选标记弹夹并且克隆入质粒2的Hind111位点以得到弹夹2。用鉴别性限制性分析确定该PAT弹夹与CTP2 EPSPS弹夹是相同的方向。
从质粒1上的Not1片段切下带有多泛素启动子和内含子、CTP1GOX及nos终止子的弹夹并连接到Not1切割的弹夹2中以得到单子叶植物载体1,pMV1(图17)。烟草的转化    用Holsters等的冻融方法(1978)将用于双子叶植物转化的质粒转移到根癌杆菌LBA4404中。通过Bevan等所述的叶片方法(leaf disc method)(1984)转化烟草(Nicotiane tabaccumvar Samsun)。在含有100g/l卡那霉素的培养基中再生出幼枝。生根和筛选后将植物转移到温室中并且于16小时光照8小时黑暗的条件下培养。玉米转化    用Klein等所述的粒子轰击方法(1988)对玉米进行转化。转化材料的筛选于1mg/l bialophos上进行。植物分析PCR    对所有在组织培养中生根的烟草品系和玉米愈伤组织进行此分析。通过对技术人员已知的方法提取DNA。用下面的寡核苷酸分析初级转化子：pDV1     TMV1+GOX1,            GOX3+nos1pDV2     TMV1+EPSPS,           EPSPS1+nos1pDV3     EPSPS3+GOX3,pPG6     35S+BARJAP2RpMV1     GOX4+GOX5             EPSPS4+EPSPS535S+BARJAP2R这些寡核苷酸序列为：TMV1        5’CTCGAGTATTTTTACAACAATTACCAAC(SEQ ID No.21)GOX1        5’AATCAAGGTAACCTTGAATCCA(SEQ ID No.22)GOX3        5’ACCACCAACGGTGTTCTTGCTGTTGA(SEQ ID No.23)nos1        5’GCATTACATGTTAATTATTACATGCTT(SEQ ID No.24)EPSPS1      5’GTGATACGAGTTTCACCGCTAGCGAGAC(SEQ ID No.25)EPSPS3      5’TACCTTGCGTGGACCAAAGACTCC(SEQ ID No.26)EPSPS4      5’ATGGCTTCCGCTCAAGTGAAGTCC(SEQ ID No.27)EPSPS5      5’CGAGACCCATAACGAGGAAGCTCA(SEQ ID No.28)GOX4        5’ATTGCGTGATTTCGATCCTAACTT(SEQ ID No.29)GOX5        5’GAGAGATGTCGATAGAGGTCTTCT(SEQ ID No.30)35S         5’GGTGGAGCACGACACACTTGTCTA(SEQ ID No.31)BARJAP2R    5’GTCTCAATGTAATGGTTA(SEQ ID No.32)筛选出PCR阳性植物用于进一步分析。用镇草宁的筛选    构建烟草在含有镇草宁在含有镇草宁培养基中进行组织培养的杀死曲线。这通过将～6mm长并带有叶结(leaf node)的茎段插入含有一定浓度范围镇草宁异丙胺的MS培养基中而完成。每个浓度使用4/5个茎段。2周后对该结果计分并示于表2中。
表2：镇草宁对野生型烟草的杀死曲线
镇草宁异丙胺浓度(mM) 外植体的生长
0 茎生长良好，4-5只新叶片根～5cm
0.005 任何器官中均无生长
0.011 任何器官中均无生长
0.0275 任何器官中均无生长
0.055 任何器官中均无生长
0.1 任何器官中均无生长
通过培养于含有0.01和0.05mM镇草宁异丙胺盐的上述培养基中筛选pDV1、2和3的初级转化子。结果示于表3中。
表3：在组织培养中对镇草宁耐性品系的筛选
pDV1 pDV2 pDV3
对草类的测试 50 25 50
耐性品系 25 18 20
对PAT的筛选    在1mg/l bialophos上测试再生的愈伤组织。Western分析    通过技术人员已知的方法进行GOX和EPSPS蛋白的过度表达及抗体的产生。按如下分析烟草的初级转化子。将～100mgPVPP加入到Eppendorf管底部。收获叶片材料(通过用管盖作为切割器而获得的4只叶圆片)于冰上。加入0.5ml提取缓冲液(50mM TrisHCl pH7.8,1mM EDTA钠盐，3mM DTT)和2μl100mMPMSF。用电动研磨器在冷室中研磨这些样品。研磨持续10秒，将未磨碎的材料推回管中并继续研磨10-15秒直到样品均一。在冷室中将这些管离心15分钟，将上清液转移到新管中并于-70℃冷冻备用。用已知的Bradford方法测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE分离25μg蛋白并以40mA过夜印迹至Hybond-N膜上。以印迹仪上取下该滤膜并置于100ml 1×Tris-Saline5％Marvel中且于室温振摇45分钟。通过在室温于1×Tris-Saline0.1％Tween20中振摇，第一次洗5分钟，第二次洗20分钟而洗该滤膜。一级抗体以1×Tris-Saline0.02％Tween20中1∶10000的稀释液使用。将该膜与一级抗体在室温孵育2小时或4℃孵育过夜。用在1×T-S0.1％Tween在室温中10分钟然后1小时洗膜。以1∶10000的稀释液用二级抗体(抗兔IgG过氧化物酶交联物)，于室温与该膜孵育1小时。按上述洗膜。用AmershamECL检测试剂盒进行检测。根据Western结果观察pDV1和2品系中蛋白表达水平的幅度。GOX和EPSPS在pDV3中的表达水平在表达的GOX量上几乎未表现出变化但EPSPS的量变化增加。筛选出同时表达二种基因的品系用于进一步分析。
用同样的方法分析玉米愈伤组织，将表达GOX和EPSPS的愈伤组织再生成完整植株并再次分析叶片材料中二种基因的表达。膦丝菌素乙酰转移酶活性分析用14C标记的乙酰CoA测定PAT活性。通过叶片提取物中存在的PAT将标记的乙酰基转移到膦丝菌素(PPT)底物中。乙酰化的PPT和14C在TLC平板上以不同的速率迁移，并可通过放射自显影加以观察。用10×T50E2缓冲液(TE)-50ml1MTris-HCl pH7.5,4ml0.5M EDTA和46ml双蒸水制备叶片提取缓冲液，将亮抑蛋白酶肽调至1×TE中15mg/ml的水平。将贮备PMSF在甲醇中制成30mg/ml。BSA贮备液中在TE中制成30mg/ml并将DTT制成1M。PPT在TE中作为1mM溶液使用。14C乙酰CoA为58.1mCi/mmol(Amersham)。通过混合4315μl双蒸水、500μl10×TE、50μl亮抑蛋白酶肽、25μl PMSF贮备液、100μl BSA贮备液及10μlDTT贮备液制备提取缓冲液(终体积5000μl)。用管盖作为切割器在冰上收获叶片样品到Eppendorf管中。用电动研磨器在冷室中在100μl提取缓冲液中研磨此样品(三片)。将此样品离心10分钟并取出50μl到冰上的新管中。将样品于-70℃贮存备用。用Bradford分析定量存在于提取物中的蛋白。通过混合5体积标记的乙酰CoA与3体积1mMPPT溶液而制备底物溶液。向～25μl叶片总蛋白样品(～2μg/ml)中加入2μl底物溶液，于37℃将此混合物孵育30秒，然后移至冰上以终止反应。将6μl样品点样于硅胶TLC平板(Sigma T-6770)上。在异丙醇和25％铵溶液的3∶2混合物中进行上行层析3小时。将平板包于塑料薄膜中并对Kodak XAR-5胶片进行曝光。用该分析方法分析所有26个初级转化子的PAT活性。表4给出了此分析结果的细节。
表4：PAT活性数据
PAT活性 pPG6品系
高 1,9,11,12,14,21,22,24,25,27,28,30,32
中 5,7,10,15,19,20
低 6,2,8
叶片涂抹除草剂    通过涂抹接种物(Challenge)至单独的叶片而测试表现出一定范围PAT活性的35S-PAT初级转化子和对照植物。以1％和0.2％该贮备液(150g/l)的水溶液涂抹标记叶片的上下二个表面。48小时和一周后进行计分并采集叶片样品用于PAT分析。表5显示叶片涂抹的结果。
表5：叶片涂抹分析
表达 植物品系 0.2％ 0.2％ 1％ 1％
48小时 1周 48小时 1周
高 24,1,14 未损伤 未损伤 未损伤 未损伤
低 6,10 未损伤 死亡 死亡 死亡
野生型 死亡 死亡 死亡 死亡
除草剂喷洒试验
Glufosimate(接种物Challenge或Basta)，建立接种物对野生型烟草影响的剂量反应曲线。将5株植物用每种处理中，14天后进行计分。构建杀死曲线后，用接种物以相同的施用水平喷洒筛选出的35SPAT品系。表6显示对于#12和27两个品系的数据。在这些水平转基因植物设有显示出损伤。
表6：对35S初级转化子喷洒试验的结果
 Basta    野生型 35S PAT#12  35S PAT#27
200g/ha400g/ha600g/a900g/a    ％损伤                           ％损伤                      ％损伤30                                 0                            040                                 0                            040                                 0                            080                                 0                            0
建立镇草宁对野生型烟草影响的杀死曲线。通过取茎段并培养于新鲜培养基中以产生20株新的植物而传代培养生长于组织培养中的野生型烟草。在转移到3英寸培养盘中的John Innes No3堆肥中之前将这些植物在组织培养中培养一个月。起初将其用羊毛覆盖以保护它们。揭开(覆盖物)后让其适应4小时后喷洒。喷洒后将水只浇至盘中，即不让水触及叶片，进行5天。处理后8天和28天进行计分。表7显示以一定施用浓度范围时平均百分损害(每种处理重复(reps)三次)。
表7：以所示水平的镇草宁处理野生型烟草的剂量反应曲线
处理 化合物 水平g/ha  佐剂 烟草野生型
号
1 Roundup Ultra(美国) 100 ‘Frigate’ 73
2 480g/l镇草宁 200 (K30512) 90
3 异丙胺 400 99
4 (a.e.360g/l) 800 100
5 LDJW010017 1200 100
6 1600 100
构建镇草宁杀死曲线后，用适当水平的镇草宁对多个pDV1,2和3品系进行喷洒试验。表8显示了pDV3的结果，pDV1和pDV2品系的结果类似于pDV3。
表8：用镇草宁处理的pDV3初级转化子的剂量/反应
1 2 3 4 5 6 7
水平g/ha 12.33 37 100 300 1000 3000 9000
野生型 2 3 20 80 93 - -
pDV3#11 - - 0 0 25 70 80
#14 - - 7 22 13 33 76
#19 - - 0 0 0 35 80
#21 - - 0 5 0 24 78
#31 - - 12 0 4 26 78
#34 - - 0 0 6 30 63
#36 - - 0 0 0 0 0
#37 - - 0 0 9 24 72
#43 - - 0 0 0 6 73
#44 - - 0 40 45 78 85
#45 - - 0 0 3 9 70
#47 - - 5 0 0 11 72
#60 - - 0 0 0 19 63
#64 - - 0 5 0 12 63
分离分析    将每个初级转化子(pPG6、pDV1、pDV2和pDV3)的种子于10％Domestos中消毒20分钟。在无菌水中洗数次后，将每种近交初级转化子的100粒种子种植于含有100mg/l卡那霉素的0.5XMS(2.3g/lMS盐，1.5％蔗糖，0.8％细菌培养用琼脂，pH5.9)培养基中。在26℃于16小时光照/8小时黑暗的条件下生长3周后对幼苗进行计分。以3∶1的比例分离的品系被认为是具有单个转基因插入。在pPG6品系中，#12、20、27以所需的比例分离。对于pDV3品系，#14、19、21、31、34、43和45以所需的比例分离。纯合品系的产生    将分离实验中10株未漂白的幼苗(杂合或纯合)转移到盘中的新鲜培养基中并培养2-3周。然后将其转移到31只盘中的JI No3堆肥中直到开花。用含有Km的0.5XMS再次测试种子以鉴定出纯合品系。烟草品系的杂交    将含有pDV1、pDV2和pDV3的纯合品系，即分别表达GOX、EPSPS和GOX/EPSPS基因的植物对表达PAT基因的纯合pPG6品系，#27品系进行异花传粉。同时用pPG6品系作为雄性品系进行传粉。转基因谷物(corn)品系的分析    用上述的寡聚体即35S-AlcR、AlcA-GOX1和对于GOX和EPSPS的内部寡聚体通过PCR测试再生的愈伤组织。同时对此PCR阳性愈伤组织进行Western分析以筛选表达GOX和EPSPS的愈伤组织。再生这些愈伤组织并通过PCR再次分析此得到的植物。然后对这些植物进行回交和近亲杂交。烟草子代的分析
GOX、EPSPS及PAT的表达，所有子代为二种基因纯合体。播种来自每种杂交的种子和来自纯合体母本的种子并从大量植物中收获叶片材料。通过Western印迹且然后通过前述的PAT活性测定方法分析蛋白提取物。发现GOX和EPSPS及PAT活性表达的水平在特定的杂交内彼此类似并且类似于纯合体母体的表达水平。对植物的外观、重量、生长活力等进行计分。除草剂处理    设计三个广义(broad)的实验：
1．35S-PAT cf pDV1 cf pDV1-PAT
2．35S-PAT cf pDV2 cf pDV2-PAT
3．35S-PAT cf pDV3 cf pDV3-PAT用一定浓度范围的glufosinate在不同的时间点处理35S-PAT品系并鉴定出现特定程度损伤的水平。用镇草宁以一定浓度范围处理DV品系并且鉴定损伤水平。然后用不同比例的二种除草剂混合物处理DV-PAT品系并且分析损伤的水平。在5-6个叶片期处理每个种群(每个处理重复5次)。对病原体攻击的抗性    将表达高水平每种蛋白并显示出对除草剂具有良好耐性的35S-PAT、DV1、2和3及DV-PAT品系暴露于多种真菌病原体并对感染的水平进行计分和比较。玉米子代的分析    将从初级转化子杂交而得到的种子用于产生植物进而从其中筛选出最高表达的品系。这通过对GOX、EPSPS表达水平的western分析并且通过上述的PAT活性实验来完成。进行类似的实验以鉴定对单独施用或以各种组合施用的镇草宁和glufosinate的耐性。
                    实施例9对出苗前漂白除草剂如fluorochloridone、达草灭、fluridone、flurtamone及diflufencican和对镇草宁具有耐性植物的制备
八氢番茄红素脱氢酶(PDS)抑制剂如flurochloridone及达草灭为一类阻止类胡萝卜素生物合成并且导致漂白症状的除草剂。PDS基因(crtl)克隆自噬夏孢欧文氏菌，一种非绿色的植物病原菌腐败菌(bacterial rot)，并且用含有CaMV35S启动子的质粒和叶绿体转运肽(pYPIET4)(Misawa等，1993)在转基因烟草(及番茄)中过渡表达。与获取含有相同构建体的番茄植物一样获取过渡表达crtl基因的ET4-208品系烟草植物的纯合种子。除草剂耐性试验    试验化学式(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)的化合物(见下面)。将转基因和野生型番茄种子(cv Ailsa Craig)种植于JIP3的3″盘中，每盘三粒种子。于4％JF5969中配制每种化合物(除了商业制剂化合物Ⅰ以外)并且用牵引式喷雾器以200l/ha喷洒于每只盘中。在13、20和27DAT(处理后天数)分析该测试。对野生型番茄的所有处理中均有明显的剂量反应，其中在所有情况中的最高水平得到87-100％的植物毒性。转基因番茄对测试的所有PDS抑制剂具有高度耐性，即对至少达1kg/ha化合物Ⅱ和Ⅲ及达9kg/ha化合物Ⅰ具有耐性(见表9)。对于转基因烟草获得了类似的结果。
表9:27PAT的植物毒性
    番茄
化学药品 水平(g/ha) 野生型 转基因
化合物Ⅱ 37 3.3
111 13.3 3.3
333 20 0
1000 100 3.3
3000 0
化合物Ⅲ 37 0
111 8.3 0
333 56.7 0
1000 100 10
3000 3.3
化合物Ⅰ 333 0 0
1000 23.3 0
3000 100 0
9000 100 0
用常见的方式将DV3#43B(包括EPSPS和GOX基因的镇草宁抗性品系-见实施例4)异花传粉到纯合的ET4-208中并反过来也是这样。收集种子并用于类似于上述的除草剂试验中。在处理的前一天将番茄种子以多排播种于小容器中。于4％JF5969中配制每种化合物(除了商业制剂Racer之外)并且用牵引式喷雾器以200l/ha喷洒于容器中。于13、20和27DAT分析该测试，在最后一次分析后将对漂白除草剂具有耐性的幼苗转移到3″盘中的新鲜John Innes111堆肥中。2周后以500和800g/ha对其施用镇草宁除草剂。14和28DAT时进行计分。得到的植物对二种除草剂均具有抗性，并且此抗性以孟德尔方式遗传。化学式Ⅰ的化合物：
Figure A9719954100461
化学式Ⅱ的化合物：
Figure A9719954100462
化学式Ⅲ的化合物：
Figure A9719954100463
               实施例10对三酮、乙酰N-酰苯胺和镇草宁具有耐性植物的制备
按前述将pDV6#71GpDV3#19J异花传粉到纯合三酮耐性的品系中并且反过来也一样。按下述收集种子并用于除草剂试验中。在处理的前一天将从DV6/HPPD杂交而获得的烟草种子以多排播种于小容器中。一些容器以acefochlor处理(75g/ha)，一些以alachlor处理(300g/ha)且其它以ZA1296处理(100和300g/ha)。于21DAT时进行分析。对于21DAT分析的得分列于下面并且代表植物毒性。
野生型 野生型 DV6/HPPD DV6/HPPD
化学药品 水平(g/ha) Repa Repb Repa Repb
Acetochlor 75 40 100 0 0
Alcchlor 300 80 90 0 0
ZA1296 100 90 95 10 0
300 100 100 0 0
以800g/ha的镇草宁喷洒存活过300g/ha ZA1296处理的幼苗并且证实对此具有耐性。
                  序列表(1)一般信息：
(ⅰ)申请人：
   (A)姓名：Zeneca Ltd
   (B)街道：15 Stanhope Gate
   (C)城市：伦敦
   (E)国家：英国
   (F)邮编：W1Y 6LN
   (G)电话：0171-304 5000
(ⅱ)发明题目：核苷酸抗性植物
(ⅲ)序列号：32
(ⅳ)计算机可读形式：
   (A)介质类型：软盘
   (B)计算机：IBM PC兼容机
   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：专利公开#1.0,#1.30版(EPO)(2)SEQ ID NO:1信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：1020个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：未知
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)生物：集胞蓝细菌PCC 6803
(ⅸ)特征：
   (A)名字/关键：CDS
   (B)位置：1..1020
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:ATG GAA TTC GAC TAT CTT CAT TTA TAC GTT GAC GAT TAT CAG TCA GCT           48Met Glu Phe Asp Tyr Leu His Leu Tyr Val Asp Asp Tyr Gln Ser Ala1               5                  10                  15CAT CGT TGT TAT CAA CGT CAA TGG GGT TTC ACT TGC GTA AAT AAA ATT           96His Arg Cys Tyr Gln Arg Gln Trp Gly Phe Thr Cys Val Asn Lys Ile
         20                  25                  30ATT ACT GAC CAA GGA ATT ACT GGC ATC TAC CAA CAG GGG CAA ATA CTT          144Ile Thr Asp Gln Gly Ile Thr Gly Ile Tyr Gln Gln Gly Gln Ile Leu
     35                  40                  45CTG CTA ATT TCG GCA TCG GAA TCT AGT TTG AGT AGA TAT GCC GAC TAT          192Leu Leu Ile Ser Ala Ser Glu Ser Ser Leu Ser Arg Tyr Ala Asp Tyr
 50                  55                  60CTC CAG AAA CAT CCC CCC GGC GTA GGT GAA GTC GCT TGG CAG GTG GCC          240Leu Gln Lys His Pro Pro Gly Val Gly Glu Val Ala Trp Gln Val Ala65                  70                  75                  80AAT TGG CAA AAA ATT CAG CAT CAA TTA TCA GAA TTA CAG ATA GAA ACC          288Asn Trp Gln Lys Ile Gln His Gln Leu Ser Glu Leu Gln Ile Glu Thr
             85                  90                  95ACA CCA GTT ATT CAT CCT CTG ACT AAA GCA GAA GGA TTA ACT TTT TTG          336Thr Pro Val Ile His Pro Leu Thr Lys Ala Glu Gly Leu Thr Phe Leu
        100                 105                 110CTC TGG GGA GAT GTG CAC CAT AGC ATT TAT CCT GTT CGT TCT GAG CTA          384Leu Trp Gly Asp Val His His Ser Ile Tyr Pro Val Arg Ser Glu Leu
    115                 120                 125AAT CAG AAT AAA ACA TTG CAT GGT GTT GGT TTA ACG ACC ATC GAC CAT          432Asn Gln Asn Lys Thr Leu His Gly Val Gly Leu Thr Thr Ile Asp His
130                 135                 140GTG GTG CTA AAC ATT GCC GCC GAT CAA TTT ACC CAG GCT TCC CAA TGG          480Val Val Leu Asn Ile Ala Ala Asp Gln Phe Thr Gln Ala Ser Gln Trp145                 150                 155                 160TAT CAA CAG GTG TTT GGC TGG TCG GTG CAG CAG AGT TTT ACT GTC AAT          528Tyr Gln Gln Val Phe Gly Trp Ser Val Gln Gln Ser Phe Thr Val Asn
            165                 170                 175ACG CCC CAT TCT GGT CTG TAT AGC GAA GCC CTG GCC AGT GCC AAT GGG          576Thr Pro His Ser Gly Leu Tyr Ser Glu Ala Leu Ala Ser Ala Asn Gly
        180                 185                 190AAA GTC CAA TTT AAC CTC AAT TGT CCC ACC AAT AAC AGT TCC CAA ATT          624Lys Val Gln Phe Asn Leu Asn Cys Pro Thr Asn Asn Ser Ser Gln Ile
    195                 200                 205CAA ACT TTT TTA GCC AAT AAC CAT GGG GCT GGT ATT CAA CAT GTC GCT          672Gln Thr Phe Leu Ala Asn Asn His Gly Ala Gly Ile Gln His Val Ala
210                 215                 220TTT TCC ACT ACG AGT ATT ACG CGA ACT GTG GCT CAT CTG CGG GAA AGG          720Phe Ser Thr Thr Ser Ile Thr Arg Thr Val Ala His Leu Arg Glu Arg225                 230                 235                 240GGC GTA AAT TTT TTA AAA ATC CCC ACT GGC TAT TAT CAA CAG CAA AGA          768Gly Val Asn Phe Leu Lys Ile Pro Thr Gly Tyr Tyr Gln Gln Gln Arg
            245                 250                 255AAC AGT AGC TAT TTT AAT TAT GCA AGT TTG GAT TGG GAT ACC TTA CAG         816Asn Ser Ser Tyr Phe Asn Tyr Ala Ser Leu Asp Trp Asp Thr Leu Gln
        260                 265                 270TGC CTA GAA ATT TTG CTG GAT GAT CAA GAT AAT ACG GGG GAG CGA TTA         864Cys Leu Glu Ile Leu Leu Asp Asp Gln Asp Asn Thr Gly Glu Arg Leu
    275                 280                 285CTG CTA CAA ATT TTT AGT CAG CCT TGC TAT GGA GTA GGC ACT CTA TTT         912Leu Leu Gln Ile Phe Ser Gln Pro Cys Tyr Gly Val Gly Thr Leu Phe
    290             295                 300TGG GAA ATT-ATT GAA CGC CGC CAC CGG GCA AAA GGA TTT GGT CAA GGA         960Trp Glu Ile Ile Glu Arg Arg His Arg Ala Lys Gly Phe Gly Gln Gly305                 310                 315                             320AAC TTT CAA GCT CTC TAT GAA GCG GTG GAG ACT TTA GAA AAA CAG TTA        1008Asn Phe Gln Ala Leu Tyr Glu Ala Val Glu Thr Leu Glu Lys Gln Leu
            325                 330                 335GAA GTG CCA TAA                                                        1020Glu Val Pro(2)SEQ ID NO:2信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：339个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Met Glu Phe Asp Tyr Leu His Leu Tyr Val Asp Asp Tyr Gln Ser Ala1               5                  10                  15His Arg Cys Tyr Gln Arg Gln Trp Gly Phe Thr Cys Val Asn Lys Ile
         20                  25                  30Ile Thr Asp Gln Gly Ile Thr Gly Ile Tyr Gln Gln Gly Gln Ile Leu
     35                  40                  45Leu Leu Ile Ser Ala Ser Glu Ser Ser Leu Ser Arg Tyr Ala Asp Tyr
 50                  55                  60Leu Gln Lys His Pro Pro Gly Val Gly Glu Val Ala Trp Gln Val Ala65                 70                  75                  80Asn Trp Gln Lys Ile Gln His Gln Leu Ser Glu Leu Gln Ile Glu Thr
             85                  90                  95Thr Pro Val Ile His Pro Leu Thr Lys Ala Glu Gly Leu Thr Phe Leu
        100                 105                 110Leu Trp Gly Asp Val His His Ser Ile Tyr Pro Val Arg Ser Glu Leu
    115                 120                 125Asn Gln Asn Lys Thr Leu His Gly Val Gly Leu Thr Thr Ile Asp His
130                 135                     140Val Val Leu Asn Ile Ala Ala Asp Gln Phe Thr Gln Ala Ser Gln Trp145                 150                 155                 160Tyr Gln Gln Val Phe Gly Trp Ser Val Gln Gln Ser Phe Thr Val Asn
            165                 170                 175Thr Pro His Ser Gly Leu Tyr Ser Glu Ala Leu Ala Ser Ala Asn Gly
        180                 185                 190Lys Val Gln Phe Asn Leu Asn Cys Pro Thr Asn Asn Ser Ser Gln Ile
    195                 200                 205Gln Thr Phe Leu Ala Asn Asn His Gly Ala Gly Ile Gln His Val Ala
210                 215                 220Phe Ser Thr Thr Ser Ile Thr Arg Thr Val Ala His Leu Arg Glu Arg225                 230                 235                 240Gly Val Asn Phe Leu Lys Ile Pro Thr Gly Tyr Tyr Gln Gln Gln Arg
            245                 250                 255Asn Ser Ser Tyr Phe Asn Tyr Ala Ser Leu Asp Trp Asp Thr Leu Gln
        260                 265                 270Cys Leu Glu Ile Leu Leu Asp Asp Gln Asp Asn Thr Gly Glu Arg Leu
    275                 280                 285Leu Leu Gln Ile Phe Ser Gln Pro Cys Tyr Gly Val Gly Thr Leu Phe
290                 295                 300Trp Glu Ile Ile Glu Arg Arg His Arg Ala Lys Gly Phe Gly Gln Gly305                 310                 315                 320Asn Phe Gln Ala Leu Tyr Glu Ala Val Glu Thr Leu Glu Lys Gln Leu
            325                 330                 335Glu Val Pro(2)SEQ ID NO:3信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：2582个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)生物：荧光假单胞菌
(ⅸ)特征：
   (A)名字/关键：CDS
   (B)位置：1217..2290
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:ATTAGTCGAA GAATATGCCC ATCCTGTCGC CTGTCGAGCA ACTGCTAATG CAACCTCCGT        60CTGATCGCCT CACCTACCTG AAGCTGGCCG CTGTGACCAT GATTTGGGGT GGCACTTTTG       120TCGCCGGACG TTACCTGACC AATCAAGTCG ACCCGCTGCT GGCCGCCAGC CTGCGGTTTA       180TCCTGGCCAG CCTGGCGCTG CTGCTGTTTA TGCTGTGTGC ACGCATCCCG CTGGCGCGGC       240CACGTCCCCG GCAACTGCTG CATCTGGCGG TGCTGGGGTT TTTCGGGATC TTTTTCTACA       300ACCTGTGTTT TTTCTACGGC CTGCAGTACA TCAACGCCTC GCGCGCTTCG TTGATCGTGG       360CGTTGAATCC GGCGGTGATC GGCCTGGCTT CCTGGTGGTT GTTCAAAGAG CGCCTCGGCA       420CTGCCAGGGT GCTGGGTATC GCGTTGTGCC TGGCCGGCGC TGCGACGGTG ATCGTCAGTC       480GCAACCCGCA GTTGCTGCAA GGTGCATCGA GTACCTGGCA GGGCGACCTG CTGGTGTTCG       540GCTGTGTGCT GGGGTGGGGG ATTTACTCGT TGTTTTCCCG CGCATTGAAT CAAAGCCTGG       600GGCCGTTGCA AACGGTCACC TGGTCAGTGC TGCTGGGCAC CCTGATGCTG ACGGCTGTCA       660CCGCGCTCGC CGGGCGCTTC ACGCTTGCAG GGCTTGGCAG CCTGCACCTG CCGCAGGTTG       720TGAGCCTGTT GTATTTGGGC GTGCTCGGCT CCGCGCTGGC GTACATCGGC TATTACGATG       780GCATCCGGCG TATCGGCGCG ACCCGCGCAG GCGTGTTTAT CGCGCTGAAC CCGCTGACGG       840CGGTGATCTG CGGCGCGCTG CTGCTTGGCG AACAGCTAAC GTTACCCATG GCGCTCGGCG       900GCGCGGTGAT CCTGTTGGGC ATCTATCTGT GCAACAAACC CCTTGCGCAG CCCAGCGCAA       960TAGGGATTTG ATGAGAGTGC GGACAAATAC TGTTACGCTG TGTAGAATCG ATTTACGCAT      1020ACAAGAATAT GGACTTGCGC TCACGCAAGC CTCGGCCGTC AGAGACTGAT GTAATCATGA      1080AGCTACTCGG CTCCCCCCTG ATCTTTGGTG ACTTCCTCGC GCGCAGCGTG CGGGGTCTCT      1140CGTGCGCGCC ACCCTGCAAC CTCATCCTTG CCTGTAATTG ACTGCTTGCT ACTTACAAGA      1200ATGATGAGGT GCCGAA ATG GCC GAC CAA TAC GAA AAC CCA ATG GGC CTG          1249
              Met Ala Asp Gln Tyr Glu Asn Pro Met Gly Leu
                1               5                  10ATG GGC TTT GAA TTT ATT GAA TTC GCA TCG CCG ACT CCG GGC ACC CTG        1297Met Gly Phe Glu Phe Ile Glu Phe Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Leu
         15                  20                  25GAG CCG ATC TTC GAG ATC ATG GGC TTC ACC AAA GTC GCG ACC CAC CGC        1345Glu Pro Ile Phe Glu Ile Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg
     30                  35                  40TCC AAG AAT GTG CAC CTG TAC CGC CAG GGC GAG ATC AAC CTG ATC CTC        1393Ser Lys Asn Val His Leu Tyr Arg Gln Gly Glu Ile Asn Leu Ile Leu
 45                  50                  55AAC AAC CAG CCC GAC AGC CTG GCC TCG TAC TTC GCC GCC GAA CAC GGC        1441Asn Asn Gln Pro Asp Ser Leu Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly60                  65                  70                  75CCT TCG GTG TGC GGC ATG GCG TTC CGG GTC AAA GAC TCG CAG CAG GCT        1489Pro Ser Val Cys Gly Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gln Gln Ala
             80                  85                  90TAC AAC CGC GCG TTG GAA CTG GGC GCC CAG CCG ATT CAT ATC GAA ACC        1537Tyr Asn Arg Ala Leu Glu Leu Gly Ala Gln Pro Ile His Ile Glu Thr
         95                 100                 105GGC CCG ATG GAA CTC AAC CTG CCG GCC ATC AAG GGC ATC GGC GGT GCG        1585Gly Pro Met Glu Leu Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala
    110                 115                 120CCG CTG TAC CTG ATC GAC CGC TTC GGT GAA GGC AGC TCG ATA TAT GAC        1633Pro Leu Tyr Leu Ile Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Asp
125                 130                 135ATC GAC TTC GTG TAC CTC GAA GGT GTC GAC CGC AAC CCG GTA GGC GCG        1681Ile Asp Phe Val Tyr Leu Glu Gly Val Asp Arg Asn Pro Val Gly Ala140                 145                 150                 155GGC CTC AAG GTC ATC GAC CAC CTG ACC CAC AAC GTG TAT CGC GGC CGC        1729Gly Leu Lys Val Ile Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg
            160                 165                 170ATG GCC TAC TGG GCC AAC TTC TAC GAG AAA CTG TTC AAC TTC CGT GAA        1777Met Ala Tyr Trp Ala Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu
        175                 180                 185GCA CGC TAC TTC GAT ATC AAG GGC GAA TAC ACC GGC CTT ACG TCC AAG        1825Ala Arg Tyr Phe Asp Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys
    190                 195                 200GCC ATG AGT GCC CCG GAC GGC ATG ATC CGC ATC CCG CTG AAC GAG GAA        1873Ala Met Ser Ala Pro Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu
205                 210                 215TCG TCC AAG GGC GCC GGC CAG ATC GAA GAG TTC CTG ATG CAG TTC AAC        1921Ser Ser Lys Gly Ala Gly Gln Ile Glu Glu Phe Leu Met Gln Phe Asn220                 225                 230                 235GGC GAG GGC ATC CAG CAC GTG GCG TTC CTC ACC GAA GAC CTG GTC AAG        1969Gly Glu Gly Ile Gln His Val Ala Phe Leu Thr Glu Asp Leu Val Lys
            240                 245                 250ACC TGG GAT GCG TTG AAG AAG ATC GGC ATG CGC TTC ATG ACC GCG CCG        2017Thr Trp Asp Ala Leu Lys Lys Ile Gly Met Arg Phe Met Thr Ala Pro
        255                 260                 265CCG GAC ACC TAC TAC GAA ATG CTC GAA GGC CGC CTG CCA AAC CAC GGC         2065Pro Asp Thr Tyr Tyr Glu Met Leu Glu Gly Arg Leu Pro Asn His Gly
    270                 275                 280GAG CCG GTG GAC CAA CTG CAG GCG CGC GGT ATT TTG CTG GAC GGC TCC         2113Glu Pro Val Asp Gln Leu Gln Ala Arg Gly Ile Leu Leu Asp Gly Ser
285                 290                     295TCG ATC GAG GGC GAC AAG CGC CTG CTG CTG CAG ATC TTC TCG GAA ACC         2161Ser Ile Glu Gly Asp Lys Arg Leu Leu Leu Gln Ile Phe Ser Glu Thr300                 305                 310                 315CTG ATG GGC CCG GTG TTC TTC GAA TTC ATC CAG CGC AAA GGC GAC GAT        2209Leu Met Gly Pro Val Phe Phe Glu Phe Ile Gln Arg Lys Gly Asp Asp
            320                 325                 330GGG TTT GGC GAG GGC AAC TTC AAG GCG CTG TTC GAG TCG ATC GAG CGC        2257Gly Phe Gly Glu Gly Ash Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ser Ile Glu Arg
        335                 340                 345GAC CAG GTA CGT CGC GGT GTA CTG ACC ACC GAC TAAGCGTCAG CAACAAAAAA      2310Asp Gln Val Arg Arg Gly Val Leu Thr Thr Asp
    350                 355AGCCCGGCGA GAAGGTTTTC AGCCGGGCTT TTTAGTGCCT GCACGTTTTA AGCTTTGCGC      2370TGACGCACCA AATGTTTGAA GCCTTCATAC ACCAGCACCA TCACGGCCAG CCAGATCGGG      2430ATATACGTCA GCCATTGCCC GCCCTTGATG CCTTCGCCCA ACAACAAGGC CACAAAGAGC      2490AGTAATACCG GCTCCACATA GCTGAGCAAC CCGAACAGGC TAAAGGCCAA TAAACGGCTG      2550GCGATGATGT AGCTCACCAG CGCTGAAGCA CT                                    2582(2)SEQ ID NO:4信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：358个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Met Ala Asp Gln Tyr Glu Asn Pro Met Gly Leu Met Gly Phe Glu Phe1               5                  10                  15Ile Glu Phe Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Leu Glu Pro Ile Phe Glu
         20                  25                  30Ile Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg Ser Lys Asn Val His
     35                  40                  45Leu Tyr Arg Gln Gly Glu Ile Asn Leu Ile Leu Asn Asn Gln Pro Asp
 50                  55                  60Ser Leu Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly Pro Ser Val Cys Gly65                  70                  75                  80Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gln Gln Ala Tyr Asn Arg Ala Leu
             85                  90                  95Glu Leu Gly Ala Gln Pro Ile His Ile Glu Thr Gly Pro Met Glu Leu
        100                 105                 110Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu Ile
    115                 120                 125Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Asp Ile Asp Phe Val Tyr130                  135                 140Leu Glu Gly Val Asp Arg Asn Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Val Ile145                 150                 155                 160Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Ala Tyr Trp Ala
            165                 170                 175Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ala Arg Tyr Phe Asp
        180                 185                 190Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Ser Ala Pro
    195                 200                 205Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu Ser Ser Lys Gly Ala
210                 215                 220Gly Gln Ile Glu Glu Phe Leu Met Gln Phe Asn Gly Glu Gly Ile Gln225                 230                 235                 240His Val Ala Phe Leu Thr Glu Asp Leu Val Lys Thr Trp Asp Ala Leu
            245                 250                 255Lys Lys Ile Gly Met Arg Phe Met Thr Ala Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr
        260                 265                 270Glu Met Leu Glu Gly Arg Leu Pro Asn His Gly Glu Pro Val Asp Gln
    275                 280                 285Leu Gln Ala Arg Gly Ile Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ile Glu Gly Asp
290                 295                 300Lys Arg Leu Leu Leu Gln Ile Phe Ser Glu Thr Leu Met Gly Pro Val305                 310                 315                 320Phe Phe Glu Phe Ile Gln Arg Lys Gly Asp Asp Gly Phe Gly Glu Gly
            325                 330                 335Asn Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ser Ile Glu Arg Asp Gln Val Arg Arg
        340                 345                 350Gly Val Leu Thr Thr Asp
    355(2)SEQ ID NO:5信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：17个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:TATGAGAATC CTATGGG            17(2)SEQ ID NO:6信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：17个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:GCTTTGAA GTTTCCCTC    17(2)SEQ ID NO:7信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：46个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:GTTAGGTACCAGTCTAGACTGACCATGGCCGACCAATACGAAAACC   46(2)SEQ ID NO:8信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：43个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:TAGCGGTACC TGATCACCCG GGTTATTAGT CGGTGGTCAG TAC  43(2)SEQ ID NO:9信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：516个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:Met Ala Gln Ile Asn Asn Met Ala Gln Gly Ile Gln Thr Leu Asn Pro1               5                  10                  15Asn Ser Asn Phe His Lys Pro Gln Val Pro Lys Ser Ser Ser Phe Leu
         20                  25                  30Val Phe Gly Ser Lys Lys Leu Lys Asn Ser Ala Asn Ser Met Leu Val
     35                  40                  45Leu Lys Lys Asp Ser Ile Phe Met Gln Lys Phe Cys Ser Phe Arg Ile
 50                  55                  60Ser Ala Sar Val ALa Thr Ala Gln Lys Pro Ser Glu Ile Val Leu Gln65                  70                  75                  80Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser
             85                  90                  95Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr
       100                  105                 110Val Val Asp Asn Leu Leu Ser Ser Asp Asp Ile His Tyr Met Leu Gly
    115                 120                 125Ala Leu Lys Thr Leu Gly Leu His Val Glu Glu Asp Ser Ala Asn Gln
130                 135                 140Arg Ala Val Val Glu Gly Cys Gly Gly Leu Phe Pro Val Gly Lys Glu145                 150                 155                 160Ser Lys Glu Glu Ile Gln Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met
            165                 170                 175Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr Val Ala Gly Gly Asn Ser Arg Tyr
        180                 185                 190Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Ser Asp Leu
    195                 200                 205Val Asp Gly Leu Lys Gln Leu Gly Ala Glu Val Asp Cys Phe Leu Gly
210                 215                 220Thr Lys Cys Pro Pro Val Arg Ile Val Ser Lys Gly Gly Leu Pro Gly225                 230                 235                 240Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Thr Ala
            245                 250                 255Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile
        260                 265                 270Ile Asp Lys Leu Ile Ser Val Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Lys Leu
    275                 280                 285Met Glu Arg Phe Gly Ile Ser Val Glu His Ser Ser Ser Trp Asp Arg
290                 295                 300Phe Phe Val Arg Gly Gly Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Gly Lys Ala Phe305                 310                 315                 320Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala
            325                 330                 335Val Thr Gly Gly Thr Ile Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Asn Ser Leu
        340                 345                 350Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu Val Leu Glu Lys Met Gly Ala Glu
    355                 360                 365Val Thr Trp Thr Glu Asn Ser Val Thr Val Lys Gly Pro Pro Arg Ser
370                 375                 380Ser Ser Gly Arg Lys His Leu Arg Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys385                 390                 395                 400Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Tyr Ala Asp
            405                 410                 415Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr
        420                 425                 430Glu Arg Met Ile Ala Ile Cys Thr Glu Leu Arg Lys Leu Gly Ala Thr
    435                 440                 445Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu
450                 455                 460Asn Val Thr Asp Ile Asp Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala465                 470                 475                 480Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Asp Val Pro Val Thr Ile Asn Asp Pro
            485                 490                 495Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro Asn Tyr Phe Asp Val Leu Gln Gln
        500                 505                 510Tyr Ser Lys His
    515(2)SEQ ID NO:10信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：17个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:AACAAGGTGG CGCAGTT    17(2)SEQ ID NO:11信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：20个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
    (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:CATCGCAAGA CCGGCAACAG    20(2)SEQ ID NO:12信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：19个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:GATCGCTACT AGCTTCCCA    19(2)SEQ ID NO:13信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：22个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13:AATCAAGGTA ACCTTGAATC CA    22(2)SEQ ID NO:14信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：18个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14:AATTACGGAA GCTTCCGT       18(2)SEQ ID NO:15信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：20个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15:AGCTTGTACA CCGGTGTACA        20(2)SEQ ID NO:16信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：22个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16:CGGACAATTA ATTGTCCGGT AC     22(2)SEQ ID NO:17信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：22个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17:CATTTGCGGC CGCAAATGGT AC      22(2)SEQ ID NO:18信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：22个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1 8:AATTCATTTG CGGCCGCAAA TG    222)SEQ ID NO:19信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：20个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19:AGCTTGCAGC GGCCGCTGCA       20(2)SEQ ID NO:20信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：22个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20:AATTCATTTG CGGCCGCAAA TG    22(2)SEQ ID NO:21信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：28个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:21:CTCGAGTATT TTTACAACAA TTACCAAC    28(2)SEQ ID NO:22信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：22个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:22:AATCAAGGTA ACCTTGAATC CA     22(2)SEQ ID NO:23信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：26个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:23:ACCACCAACG GTGTTCTTGC TGTTGA    26(2)SEQ ID NO:24信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：27个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:24:GCATTACATG TTAATTATTA CATGCTT    27(2)SEQ ID NO:25信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：28个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:25:GTGATACGAG TTTCACCGCT AGCGAGAC    28(2)SEQ ID NO:26信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：24个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:26:TACCTTGCGT GGACCAAAGA CTCC    24(2)SEQ ID NO:27信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：24个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:27:ATGGCTTCCG CTCAAGTGAA GTCC    24(2)SEQ ID NO:28信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：24个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:28:CGAGACCCAT AACGAGGAAG CTCA    24(2)SEQ ID NO:29信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：24个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:29:ATTGCGTGAT TTCGATCCTA ACTT    24(2)SEQ ID NO:30信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：24个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:30:GAGAGATGTC GATAGAGGTC TTCT    24(2)SEQ ID NO:31信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：24个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:31:GGTGGAGCAC GACACACTTG TCTA    24(2)SEQ ID NO:32信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：18个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“引物”
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)最初来源：
   (A)有机物：引物
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:32:GTCTCAATGT AATGGTTA          18

Claims (30)

1．至少包括编码能够赋予植物或形成该植物的组织对第一种除草剂抗性或耐性的第一种蛋白的第一个区域和编码同样能够赋予对第二种除草剂抗性的第二种蛋白的第二个区域的多核苷酸，它们具有以下的附加条件(ⅰ)该多核苷酸不编码包括仅仅5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白；(ⅱ)该多核苷酸不包括仅仅编码超氧物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的区域；和(ⅲ)该多核苷酸不包括仅仅是编码GST和膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的区域。
2．根据权利要求1的多核苷酸，其中的每个区域在植物可操作启动子和终止子的表达控制之下。
3．根据前面任一权利要求的多核苷酸，其中的第一种除草剂为出苗后除草剂且第二种除草剂为出苗前除草剂。
4．根据前面任一权利要求的多核苷酸，其中的蛋白选自镇草宁氧化还原酶、5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶、膦丝菌素乙酰转移酶、羟苯基丙酮酸双加氧酶、谷胱甘肽S转移酶、细胞色素P450、乙酰-COA羧化酶、乙酰乳酸合酶、原卟啉原氧化酶、dihydropteroate合酶、多肽转运蛋白、超氧物歧化酶、溴苯腈水解酶、八茎番茄红素脱氢酶、可从真氧产碱杆菌获得的tfdA基因的产物以及所述蛋白已知的诱变或其它修饰变异体。
5．根据权利要求1到4中任一权利要求的多核苷酸，其进一步包括编码能够提供植物对昆虫、干旱和/或真菌、细菌或病毒感染具有抗性蛋白的区域。
6．根据前面任一权利要求的多核苷酸，其包括所述区域5′的序列和与所述区域相邻的序列，这些序列编码(ⅰ)能够靶向该区域的翻译产物到质体如叶绿体、线粒体、其它细胞器或植物细胞壁的肽；和/或(ⅱ)非翻译的翻译增强序列。
7．根据前面任一权利要求的多核苷酸，其受到以下的修饰，即去除mRNA不稳定基序和/或偶然(fortuitous)剪切区，或者使用植物优选的密码子从而这样修饰的多核苷酸在植物中的表达产生与该未修饰多核苷酸蛋白编码区为其内源性的生物中此未修饰多核苷酸的表达而获得的蛋白具有基本上类似活性/功能的基本上类似的蛋白，其具有以下附加条件，即如果这样修饰的多核苷酸包括植物优选的密码子，那么该修饰多核苷酸内的蛋白编码区与所述植物中内源性所含的并且编码基本上相同蛋白的同样蛋白编码区之间的相同程度小于约70％。
8．根据权利要求3到7中任一权利要求的多核苷酸，其中的出苗前除草剂选自二硝基苯胺除草剂、二苯醚、磺酰脲、二氧磷基磺酸酯、羟乙酰胺、四唑啉酮和N-氨甲酰四唑啉酮、、咪唑啉酮、硫代氨基甲酸酯、三嗪、三唑嘧啶、尿嘧啶、苯脲、三酮、异噁唑、乙酰替苯胺、噁二唑、三嗪酮、磺酰苯胺、酰胺、N-酰苯胺、RP201772、氟咯草酮、达草伏和三唑啉酮型除草剂并且出苗后除草剂选自镇草宁及其盐、glufosinate、磺草灵、灭草松、bialaphos、除草定、稀禾定或别的环己烷二酮、麦草畏、fosamine、flupoxam、苯氧丙酸、喹禾灵或别的芳氧基-苯氧丙酸酯、毒莠定、伏草隆、阿特拉津或别的三嗪、metribuzin、氯嘧黄隆、绿黄隆、flumetsulam、halosulfuron、嘧黄隆、灭草喹、咪草烟、isoxaben、imazamox、metosulam、pyrithrobac、rimsulfuron、苄嘧黄隆、烟嘧黄隆、氟黄胺草醚、fluroglycofen、KIH9201、ET751、carfentrazone、ZA1296、sulcotrione、百草枯、敌草快、溴苯腈和噁唑禾草灵。
9．根据前述权利要求之任一的多核苷酸，其中出苗前除草剂选自乙酰替苯胺、三酮、PDS抑制剂、硫代氨基甲酸酯、四唑啉酮并且出苗后除草剂选自镇草宁、glufosinate、百草枯、和bialphos。
10．包括权利要求1到9中任一权利要求的多核苷酸。
11．包括至少含有编码能够赋予植物或形成该植物的组织对第一种除草剂抗性或耐性第一种蛋白的第一个区域多核苷酸和含有编码同样能够赋予对第二种除草剂抗性第二种蛋白的第二个区域多核苷酸的植物，其中的多核苷酸具有以下附加条件(ⅰ)该多核苷酸不编码包括仅仅5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白；(ⅱ)该多核苷酸不包括仅仅编码超氧物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的区域；(ⅲ)该多核苷酸不包括仅仅是编码GST和膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的区域；和(ⅳ)当该植物为甜菜时，其包括的赋予对除草剂抗性或耐性的基因不仅仅是EPSOS和PAT。
12．前述权利要求的植物，其中第一种除草剂是出苗前除草剂，第二种除草剂是一种出苗后除草剂。
13．包括其一部分、种子及子代的、对至少2种除草剂具有抗性的植物，其从以权利要求1到9中任何一个多核苷酸或权利要求10载体转化的材料中获得。
14．根据前述权利要求的植物，选自小型谷物作物、油料种子作物、纤维植物、蔬菜、种植作物及树木。
15．根据权利要求11至14中任何一个的植物，选自大豆、棉花、烟草、甜菜、油菜、canola、亚麻、向日葵、土豆、番茄、苜蓿、莴苣、玉米、小麦、高粱、黑麦、香蕉、大麦、燕麦、草皮草、料草、甘蔗、豌豆、蚕豆、水稻、松树、杨木、苹果树、葡萄、柑桔或栗树及这些植物的子代、种子及一部分。
16．选择性控制包括杂草和作物植物的田间中的杂草方法，其中的作物植物包括(ⅰ)至少包括编码能够赋予植物或形成该植物的组织对第一种除草剂抗性或耐性第一种蛋白的第一个区域和编码同样能够赋予对第二种除草剂抗性第二种蛋白的第二个区域的多核苷酸，其具有以下附加条件(ⅰ)该多核苷酸不编码包括仅仅5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白；(ⅱ)该多核苷酸不包括仅仅编码超氧物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的区域；(ⅲ)该多核苷酸不包括仅仅是编码GST和膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的区域；和(ⅳ)当该植物为甜菜时，其包括的赋予对除草剂抗性或耐性的基因不仅仅是EPSPS和PAT；或(ⅱ)至少包括编码能够赋予植物或形成该植物的组织对第一种除草剂抗性或耐性第一种蛋白的第一个区域多核苷酸和包括编码同样能够赋予对第二种除草剂抗性第二种蛋白的第二个区域多核苷酸，它们具有下面的附加条件(ⅰ)该多核苷酸不编码包括仅仅5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白；(ⅱ)该多核苷酸不包括仅仅编码超氧物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的区域；(ⅲ)该多核苷酸不包括仅仅是编码GST和膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的区域；和(ⅳ)当该植物为甜菜时，其包括的赋予对除草剂抗性或耐性的基因不仅仅是EPSPS和PAT，该方法包括以足以控制杂草而基本上不影响此作物植物的量施用至少一种所述的除草剂到田间。
17．根据前述权利要求的方法，其中的作物植物包括编码EPSPS酶的基因和编码GST酶的基因，该方法包括以足以控制杂草而基本上不影响此作物植物的量施用镇草宁和乙酰替硝基苯胺到田间。
18．根据权利要求16的方法，其中的作物植物包括编码HPPD酶的基因和编码PAT酶的基因，该方法包括以足以控制杂草而基本上不影响此作物植物的量施用三酮和glufosinate到田间。
19．根据权利要求16的方法，其中的作物植物包括编码PAT酶的基因和编码GST酶的基因，该方法包括施用足以有效控制杂草而基本上不影响此作物植物的量的glufosinate和乙酰替硝基苯胺到田间。
20．根据权利要求16的方法，其中的作物植物包括编码EPSPS和/或GOX酶的基因和编码HPPD酶的基因，该方法包括以足以控制杂草而基本上不影响该作物植物的量施用镇草宁和三酮到田间。
21．根据权利要求16的方法，其中的作物植物包括编码PDS酶的基因和编码EPSPS和/或GOX酶的基因，该方法包括以足以控制杂草而基本上不影响此作物植物的量施用PDS抑制剂和镇草宁到田间。
22．根据权利要求16的方法，其中的作物植物包括编码EPSPS和/或GOX酶的基因和编码PAT酶的基因，该方法包括以足以控制杂草而基本上不影响此作物植物的量施用镇草宁和glufosinate到田间，但具有该植物不是甜菜的附加条件。
23．根据权利要求16的方法，其中的作物植物包括编码PDS酶的基因和编码PAT酶的基因，该方法包括以足以控制杂草而基本上不影响此作物植物的量施用PDS抑制剂和glufosinate到田间。
24．根据权利要求16的方法，其中的作物植物包括编码PDS酶的基因和编码GST酶的基因，该方法包括以足以控制杂草而基本上不影响此作物植物的量施用PDS抑制剂和乙酰替硝基苯胺到田间。
25．根据权利要求17到24中任一权利要求的方法，其中的作物植物进一步含有编码ALS、SOD或BNX的基因，该方法包括以足以控制杂草而基本上不影响此作物植物的量施用磺酰脲、paraquat或bromoxynil除草剂到田间。
26．根据权利要求16到25中任一权利要求的方法，进一步包括施用杀虫剂有效量的一种或更多种杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂及抗病毒剂到田间。
27．制备对二种或更多种除草剂具有实质耐性或实质抗性的植物的方法，包括以下步骤：
(ⅰ)以权利要求1至10中任何一权利要求的多核苷酸或权利要求10的载体转化植物材料；
(ⅱ)筛选这样转化的材料；和
(ⅲ)再生这样筛选出的材料成为形态上正常的可育的完整植株。
28．权利要求1到9中任一权利要求的多核苷酸或权利要求10的载体在制备对二种或更多种除草剂具有实质耐性或实质抗性的植物组织和/或形态上正常的可育的完整植株(Ⅰ)中的使用。
29．权利要求1到9中任一权利要求的多核苷酸或权利要求10的载体在制备用于在体外就高流通量筛选潜在除草剂的除草剂靶目标中的应用。
30．根据前面一个权利要求的使用，其中的此多核苷酸的蛋白编码区在大肠杆菌或酵母中异源表达。
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