CZ161699A3 - Polynukleotid kódující rezistenci nebo toleranci k herbicidům, rostlina obsahující tento polynukleotid a způsob selektivního hubení plevelů - Google Patents

Polynukleotid kódující rezistenci nebo toleranci k herbicidům, rostlina obsahující tento polynukleotid a způsob selektivního hubení plevelů Download PDF

Info

Publication number
CZ161699A3
CZ161699A3 CZ991616A CZ161699A CZ161699A3 CZ 161699 A3 CZ161699 A3 CZ 161699A3 CZ 991616 A CZ991616 A CZ 991616A CZ 161699 A CZ161699 A CZ 161699A CZ 161699 A3 CZ161699 A3 CZ 161699A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
polynucleotide
herbicide
crop
plants
encoding
Prior art date
Application number
CZ991616A
Other languages
English (en)
Inventor
Paul Anthony Thompson
Mary Elizabeth Knight
Ian Jepson
Paul Graham Thomas
Timothy Robert Hawkes
Original Assignee
Zeneca Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9623248.3A external-priority patent/GB9623248D0/en
Priority claimed from GBGB9625957.7A external-priority patent/GB9625957D0/en
Priority claimed from GBGB9703855.8A external-priority patent/GB9703855D0/en
Application filed by Zeneca Limited filed Critical Zeneca Limited
Publication of CZ161699A3 publication Critical patent/CZ161699A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8277—Phosphinotricin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká technologie rekombinantní DNA, a konkrétně přípravy transgenních rostlin, které vykazují podstatnou rezistenci nebo podstatnou toleranci k herbicidům ve srovnání s obdobnými netransgenními rostlinami.
Dosavadní stav techniky
Taková křivka že je vynesena
Rostliny, které jsou podstatně tolerantní k herbicidu, když mu jsou vystaveny, mají křivku závislosti odpovědi na dávce posunutou doprava ve srovnání s netolerantními rostlinami vystavenými stejným podmínkám závislosti odpovědi na dávce vypadá tak, dávka na ose x a na ose y je vyneseno procento uhynutí nebo herbicidní účinek. Tolerantní rostliny vyžadují více herbicidu než obdobné netolerantní rostliny k dosažení stejného herbicidního účinku. Rostliny, které jsou podstatně rezistentní k herbicidu vykazují pouze malé, pokud vůbec, nekrotické, lytické nebo chlorotické léze, když jsou vystaveny herbicidu v takové koncentraci a míře, která je dle. typických agrochemických opatření využívána k hubení plevelů na poli. Rostliny, které jsou rezistentní k herbicidu, jsou k němu také tolerantní. V rámci předkládané přihlášky je třeba chápat termíny rezistentní a tolerantní jako tolerantní a/nebo rezistentní.
·» ···· ·· ···· ·· ·· ··· ··· ···· • · ··· · · ··· · · · · * ············ ······ · · ·· ··· ·· ··· ·· ··
Předkládaný vynález poskytuje : polynukieotid, který
obsahuje alespoň první úsek kódující první protein schopný udělit rostlině- nebo pletivu, které ho obsahují, rezistenci nebo toleranci k prvnímu herbicidu, a druhý úsek kódující druhý protein obdobně schopný udělit rostlině rezistenci
k druhému herbicidu, a to za podmíní ek, že (i) polynukieotid
nokóduje řúzní protein obsahující pouze 5-enolpyruvyl-3-
fosfošikimátsvntetázu (EPSPS) a glutathicn-S-trans ferázu
(GSTi, kii) polynukieotid neobsahuj ie couze úsekv kódu i i o i
superoxidismutázu (SOD) a glutatň -. i o n -o -1 r a n s t e r a z u (G o Τ i
a (iii) polynukieotid neobsahuje pc juze úseky kódující GST
fosfinocricinacetylcransferázu (PAT).
Ve výhodném provedení předkládai liGMC VVnaicZU ]θ ΘΧΌΓΘ36
každého z úseků obsažených v polynukc -60tÍd.U Γ1Ξ6Π5. p ΓΟΓΓ/Ο tO Γ ΘΓΠ.
a terminátorem aktivním v rostlir lách. Takové promotory
a terminátory jsou odborníkovi známy, a ten je může vybrat
podle konkrétní potřeby. Tak např. k vhodným promotorům patří
promotory 35 S CAMV nebo- FMV, a tak é ubichitinové promotory
z Arabiacpsis nebo- kukuřice. Výhodně se použijí konscicuzivní
promotorv. To eliminuje potřebu exter mí indukce a znamená to,
že rostlina je pak trvale toierant mí nebo rezistentní ke
každému z odpovídajících herbicidů.
DNA kódující geny rezistence k herbicidu může být
vložena do rostlinného transformační ho vektoru, kde je její
exprese řízena indukovatelným promotorem, čímž se do transgenní - rostliny vnese indukovatelná rezistence
k herbicidu. K takovým promotorům patří např. chemicky
indukovatelný promotor známý jako promotor G-27, pomocí
kterého lze zapnout rezistenci aci ikací vhodného induktoru
(jako je např. chemická zabezpečovací látka, safener). Za »· ···· ·· ···· ·· · · · · · * ···· · ···· · · ·.
»· ··· ·· ··· ·· ·« múze ovt vvnoana scnccno;
excrirv
1Δ1 L první hodiny.
popřípadě zvýšit rezistenci potřeba. Např. oři střídání plodin moh plodiny růst v následujícím roce, kdy je poh druhou plodinu. Herbicid je pa!neindukovaných a tedy citlivých
Indukce exprese genů rezistence k herbicidu pouze tehdy, když je rezistence k herbicidu potřeba (tj. právě před použitím herbicidu) může být za určitých okolností také metabolicky mnohem účinnější, neboť rostliny tak produkují polypeptidy rezistence pouze když je to potřeba. K vhodný™! redukovatelným promozorúm dále patří promotor indukovazelný tetracykiinem, bakteriální represorový/operátcrový systém genu iac, glukokortikoidový receptor společně s dexamethasonem, promotory indukovatelné mědí nebo kyselinou salicylovou, promotory založené na ekdysonovém receptorů, které byly popsány/ v mezinárodní patentové přihlášce PCT/G39o/0ii95, a také tzv. promotor genu Ale, který/ byl popsán v mezinárodní patentové publikaci WO93/21334.
Ve zvláště výhodném provedení předkládaného' vynálezu alespoň jeden z úseků obsahuje
'./τ', ot r
Odborníkovi κ pre-emergenznimu heroicicu a alespoň ysoen iuje rezistenci k post-emergenznímu herbicidu.
a postjsou definice terminu pre-emergentni a jasné, ale pro přesnost uvádíme, že prezde znamená aplikaci v období před tím, než se výhonky/ klíčících semen objeví nad povrchem půdy, tyj. před tím, než je jakákoliv část rostliny viditelná na povrchu. Post-emergentní znamená aplikaci v-období, kdy jsou semenáčky již viditelné nad povrchem půdy.
Pre-emergentní herbicidy/ je možné vybrat ze skupiny/ obsahující dinitroanilinové herbicidy, bromacil, flupoxam, » · · · · · · · · • · · · · · ···· · · · · • ·· ·· · ··· • · · · » ··· ·· ·· ene yiClUi 2/, i- -L
N-karbamcyltetraz norflurazon, PP201772, atrazin a jiné triaziny, iminothiadozol, diflufenioon, sulfonylmočovinu, imidazolinon, thiokarbamát, traizin, uráčil, močovinu, triketon, isoxazol, actánilid, oxadiazol, fosfosulfonátové herbicidy popsané v EP A 511 826, triazinon, sulfonanilid, amid, oxyacetamidy jako jsou herbicidy typu fluthiamidu, anilidu a trazolinonu. Jako přiklad triketonových herbicidů je možno uvést:
2-(2-nitro-4-trifluorcmetyibenzoyl)-cyklchexan-1, 3-dion,
2-(2-ohlor-4-metansulfcnyibenzoyl)-cykiohexan-1, 3-dion,
2-(2-2nicro-4-metansuifonylbenzoyi)-cykiohexan-1, 3-dion, 5-cykiopropyl-4-(2-metyisulfonyl-4-trifluorometylbenzoyl)isoxazol apod. Aby nebyly žádné pochybnosti, termín triketonové herbicidy označuje jakoukoliv sloučeninu schopnou inhibovat 4-hydroxyfenylpvruvátdioxygenázu (HPPD). V textu předkládaného vynálezu jsou termíny 4-hydroxyfenylqyruvát-dioxygenáza nebo dioxygenáza kyseliny 4-hydroxyfenyl-pyrohroznové (4—HPPD) a o-hvdroxvfenvlqyruvátdioxvgenáza nebo dioxyoenáza kyseliny p-hydroxyfenylhroznové (p-OHPP) užívány jako svnonvma.
pupaGných v EP A 612 735, sulcatrion obsahující c asulam, ben cyklohexandi quižalotop fluormetron, chlorimuron, sulfometron, metosulam, nicosulfuroň karfentrazon ergentní herbicidy mohou být vybrány ze skupiny glyphosat a jeho soli, glufosinát, difenyiéter, tazon, bialafos, bromacil, setoxydim a další ony, dikamba, fosamin, flupoxam, fenoxyprionát, a další aryloxyfenoxypropanoáty, picloram, atrazin a další triaziny, metribuzin, chlorsulfuron, flumetsulam, halosulfuroň, imazaquin, imazetapyr, isoxaben, imazamox, pyrithrobac, rimsulfuron, bensulfuron, , fomesafen, fluroglykofen, KIH9201, ET751,
ZA1296
ICIA0051
RP201772 fluorchloridon • ·
.at, bromoxynil a fencxaprop. nohto herbicidů, k nimž uděluje vvriá 1 θ z υ. rezistenci (nebo ke edkiádaného vynálezu rezistentní glyphosat a difenylězer nebo (ii) glyphosat a/nebo a/nebo triazolinonového aívpnosat a/nebo glufosinát, (iv’ erbicidy / neoc iv±asce vynoone Kcmsinsc poiynukieooid. předkládán kterým jscu rostliny podl nebo tolerantní) jscu:
herbicidy acetani1idového typu, glufosinát a herbicid anilidového rýpu, (iii) triketony glyphosat a/nebo glufosinát a a anilidového typu, (v) glypnosa inhibitor PDS (jako jsou např. sloučeniny podle v
II t i í l V vn rán'
Ό V 0 v y C Z (GOX), fos fionotri dioxygenázu kódované uvedenými úseky polynuklectidu mohou ze skucinv obsahující glvphosatoxidoreduktázu
5-enoipyruvyl-3-fosfosikimátsyntetátu (EPSPS;, lacetyltransferázu (PAT), hydroxyfenylpyruváoIPPD), glutathion-S-transferázu (GST), cvtcchrom
P450, acetylkoenzym-A-karboxylázu (ACC) , acetolaktátsynzázu panu;, protoporryrinogenoxidazu (prctox), syntázu, transportní proceiny polyaminů, (SOD), bromcxynilnitrilázu (BXX), fyrc orodukt cenu črdA získateiného dihydropreroát superoxiddismutázu desaturázu (PDS;, mutované moti z iκov a n e variano proteinů. Produkt genu tfcA je dioxygenáza, kte “ v — -J :
uvedených je schopna z — i oxidovat odpovídající fenol. Enzym II. třídy, jak je popsán v Evropském patentu č. 545 OSO. Alternativně a/nebo dodatečně může být mutován tak, aby obsahoval substituce aminokyselin v určitých pozicích, o kterých se ví, že vedou ke zvýšené rezistenci ke glvphosatu (a jeho agrochemicky přijatelným solím). Tak např. EPSPS může •/šermy, jako je napr. 2,4-D, na EPS PS může být tzv. EPS PS mít alespoň aminokyselinoví v i κ v
To, Gly a • · · « • · » · · 4 η ,·’ ·ρ (-Ρ τ 7 η ie sekvencí id.
3, 1/3 a 2 / /měněny ná/ • · · · » · · · » · · · • · · · · · • · • · · ·
í 1 i Thr174 - Ile
(11) Prol73 - Ser
(111 ) Glyi73 - Ala
( 1 v) Ala264 - Thr
přič emž (i) Thr 174 leží
Me t, (i i) Pro 1 73 1 e ž í v
i n r, (iii) Gly 173 leží
.Ala a (iv) Ala 2 64 Ί „ as X iSZi
Giv. Navíc kon c o v v zbyt/
C-lu- Aru-Pro-AAl- -ΆΑ2- -Leu-Vl·
v souvislé sekvenci Pro-Leu-Ala-LeuGly, ležící v sekvenčním motivu -AA3-AA4-Le-AA5-AA6-AA7-G1y v úseku enzymu EPSPS odpovídajícím pozicím 192 až 232 podle sekvence id. č. 9, může být nahrazen buďto· A-sp nebo· Asn.
V jednom provedení předkládaného vynálezu úsek polynukleotidu kódující enzym HPPD má sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. 1 nebo 3, případně je komplemetární k jedné nich, pokud st inuuouz e .oce mezi ou v solném roztoku síly 0,3 pufrovaném citrátem obsahujícím 0,1% SDS a ρο opláchnutí v solném roztoku sliv 0,3 oufrovaném um u jo ve s rej no ;ě stál seivenci uvedenou zae oakc vvence nebo 3.
Pokud testovací sekvence a sekvence podle předkládaného vynálezu jsou dvouřetězcové, má testovací sekvence hodnotu TM (teplotu tání) v rozmezí 15 °C od TM sekvence id. č. 1. V případě, že testovací sekvence a sekvence id. č. 1 (nebo testovací sekvence a sekvence id. č. 3) jsou smíchány dohromady a denaturovány současně, hodnoty jejich TM leží v rozmezí 5 °C. Výhodněji je hybridizace provedena za relativně stringentních (přísných) podmínek, které jsou ι· ··*· ·· ···· ·· ·« • · · · · ··· • Λ·· · · · · · · · ·
2 s io o ď o o testovací senvence nebo se kvence po
vynálezu se první váže na nosič a hybridi z
ή o C r O V á d r 3 po urči tou dobu v teplotě mezi 6 0 a 6 5
, Ί our rc ' rr;
ím ím oc
U,íí tht a nosíc je pak opláchnut v somem roztoku síly 0,1 pilířovaném citrátem při stejné teplotě. Pokud se hybridizace účastní fragment sekvence podle předkládaného vynálezu, pak mohou být podmínky hybridizace méně stringentní, jak je odborníkovi zřejmé.
Pnknd poiynukleotid obsahuje gen HPPD udělující herbicidům, rostlinný materiál se vystaví působení tri ketonového selektován na základě barevných r; n f- y o vym transformovaný tímto genem herbicidu a pak je vizuálně rozdílů mezi transformovaným a netransrormovanym matei který byl vystaven stejnému herbicidu. Netransformovaný materiál vybledne (zbělá) ' a zůstane bílý, je-li podroben selekčnímu procesu, zatímco transformovaný materiál vybledne, a±e pozceji zase zezeiena, Poiynukleotid podle vynálezu obsahuje další ú szistenci nebo· nocovaní něco zůstane rovno dalšího u;
: -i. t V A π η η í
rovedení předkl ádaného
protein schopný udělit
hmyzu, usychání a/nebo
známy a p; :h uringi ensi s rrotemy ří k nim arovými useny jsou occornikov např. ebdotoxm delta z Bacillus obalové proteiny virů.
Poiynukleotid předkládaného vynálezu může obsahovat 5'-koncové sekvence sousedící s uvedenými úseky, kteréžto sekvence kódují (i) peptid schopný směrovat translační produkty úseků do plastidú jako např. chloroplastů, mitochodrií, jiných organel nebo buněčné stěny a/nebo (ii) netranslatované sekvence zesilující translaci. Vhodné uzzove tranziíni pepzzay, .cí rezistenci k herbicidu (oo sítem trans kricce; je crsss o ro ti β i nu kódovaného letící Dezcrostrecine cicwns enzym ΞΡ5Ρ5 nebo GOX. sekvencí oosaženou v známé netransiatovane sekvence zesilující trans 5-konec uvedeného úseku kódujícího protein. Takové zesilující sekvence jsou odborníkovi známy, patří sem např. sekvence odvozené z TMV známé jako omega, omega prime, a také sekvence, které lze odvodit z 5'-koncových úseků sekvencí kódujících virové tabáku a dalších nukleotidové sekvence m planta muže ovt vnoane nořte n sekvence kódující známé proteiny schocné udělovat . ci i I2:
ρχ xziynuxzeo tiau muže oyo zvýšena v.
- ,- π 1 . , C ' í
proteiny např. viru s kvr
.ledem na požadavek exp
ianta může být vhodné ITlC d ί
sou coivnuxiuvedené výše, které jsou modifikovány tak, že jsou odstraněny motivy nestability mRNA a/nebo náhodná sestřihová místa nebe jsou užity kodony přednostně užívané rostlinami, takže exprese takto modifikovaných polynukleotidů v rostlinách vede k produkci podstatně podobných proteinů s podstatně podobnou aktivitou/funkcí těm proteinům, které jsou získány expresí nemodifikovaných polynukleotidů v organismu, ve kterém jsou úseky nemodifikovaného polynukleotidu kódující protein endogenními, za předpokladu, že jestliže takto modifikovaný po ± ynu a e o t i o. oosanuje koceny precnostně užívané rost_mami, stupen identity mezi úseky kódujícími protein v modifikovaném polynukleotidu a obdobnými úseky kódujícími protein endogenně obsaženými v dané rostlině a kódujícími v podstatě identický protein je menší než asi 70%.
Předmětem vynálezu je dále vektor obsahující uvedený polynukleotid.
···· ·· ··« • · · · • · · · • · · · • · « · · · · • · • · • · • · · · • · ··· · · ·♦
LÍT
--A který byl transíormová
p.a herbicidům, a které byly regenerovány z mazeriálu, pc-lynukleotidem nebo vektorem podle předkládaného vynálezu.
Způsoby transformace jsou odborníkovi známy a patří k nim transformace zorostředkcvaná mikročásticemi, teríum, transformace insLormace zoros' zo ros tředkovana protoplastú (případně v přítomnosti polyetylénglykolu), ;onikace rostlinného pletiva, buněk nebo protoplastú médiu rm poiynutie využívajícím techniky mtkrovláker iransformace elktrcporací a pod. jedle předkládaného vynálezu p technické olodinv produkujíc vlákno, jolynukleotidu d řipadně zdusí ' ; károtou ls formo váné Li o viny, zeleninu, rostli
Ί intážové plodiny a stromy. Zvláště výhodné rostliny )ja, bavlník, tabák, rutrovr ;pa, řepka olejka
Ί .<-> >—> c ! τ ,·—· ,-', -~· —n V·', v- v· —> -i τ τ z-> —' -ί— 2 ,-· 1<- (—· —> i A -f~
-i- _ _ i CUUJjLi / J_ CL J U ~ / V u J utoA-C./ O dXG u kukuřice, pšenice, čirok, žito, banánovník, ječmen, oves, lvv, picni trávy, cukrová třtina, hrách, fazol, topol, jabloň, grapefruit, citrusovník rostlin.
Předkládaný vynález déle poskytuje rostlinný materiál, který obsahuje sekvence nukleové kyseliny obsahující úseky kódující alespoň dva proteiny schopné udělit danému materiálu rezistenci k alespoň dvěma herbicidům , a to za podmínek, že (i) materiál neobsahuje polynukleotid kódující fúzní protein obsahující pouze 5-enolpyruvyl-3-fosfošikimátsyntetázu (EPSPS) a giutathion-S-transferázu (GST), (ii) materiál neobsahuje polynukleotid obsahující pouze úseky kódující • · ···· · · • · · · · • · · · · · · • · · · ♦ · • · • « • « • · · <
/ d.
regenerovat do celých norfologicky normálních řertrinícn rostlin. V materiálu podle výhodného provedení předkládaného vynáiezu alespoň jeden z úseků kóduje protein udělující rezistenci k pre-emergencnímu herbicidu a alespoň jeden z úseku kóduze protein udělující rezistenci k postbv~ očíscsinv v rostlinách (nsbo šeších částech) v ctú: křížení první rostliny, která obsahuje polynukleotid první protein schopný udělit rezistenci k orvními herbicidu,, s druhou rostlinou, která obsahuje poiynukleotid kódující druhv protein udělující rezistenci k druhému herbicidu také přec r n - l ct t- .ο» Τ' p v této přihlášce;. Výhodné kombinace genů sbicidúm jsou (i) gen HPPD a gen EPSPS nebo a PAT, (iii) gen GST a gen EPSPS/GCX, (Vili d calúc a/nebe 5 OS hnebo GOX, íviiii gen zrdA EPSPS a/nebo GOX v každé z těchto genů rezistence zpnus a ger
Kromě toho kombinací muže být jeden nebo více k herbicidu nahrazen genem pro SOD, protox a/nebo ALS. Takové rostliny jsou v této přihlášce uváděny jako rostliny podle vynálezu.
;im pre
V p n 1 ' use-' zoauj-Cl· první pletivu, které ho· k prvními herbicidu, b selektivního hubení na a plevel, přičemž požynuxieoz 10 oosahující alespoň první protein schopny/ udělit rostlině nebo obsahují, rezistenci nebo toleranci a druhy/ úsek kódující druhý protein vynalezu je zpi terém roste plc scnopny ucelit odeone obsahují, rezistenci nebo istlině nebo pletivu, které no úeranci k druhému herbicidu, a to za podmínek, obsahuj ící (i) polynukíeotid nekóduje fúzní protein pouze ϊηοlovruvv1-3-fo s fo š i kimáts vnt e t á zu !P3?S) a glutathion-S-transferázu (( /obsahuje pouze úseky kódující •sanuje pouze úseky kódující G3T
ÚST) , (ii) polynukíeotid superoxidismutázu (SOD) polynukíeotid linou cukrová geny udělující rezistenci nebo toleranci k herbicidu,
Kter obsahuje, nejsou pouze EPSrS
DZVT řepa, geny, nebí ín! polynukíeotid obsahující alespoň první úsek kódující první protein schopný udělit rostlině nebo pletivu, které ho obsahují, rezistenci nebo toleranci k prvními herbicidu, a polynukíeotid kódující druhý protein schopný udělit obdobně ros oline toleranci é ho i du, o pletivu, k t k druhému herb (i) polynukíeotid nekóduje fúz> j — e n o i o y r u v y/1 — 3 -1 o s z o s i k i m a i s y/n z razsDDm íppt obsahují, rezistenci nebo a to za podmínek, že protein obsahující pouze zu (EPSPS) a glutathion-Szu (GST), (ii! polynukíeotid neobsahuje pouze úseky superoxidismutázu (SODi a gluzathion-S-transferázu (GST), (iii! poly/nukleotid neobsahuje pouze úseky kódující GST a fosfinotricinacetyltransferázu (PAT) a (iv) že pokud je plodinou cukrová řepa, geny udělující rezistenci nebo toleranci k herbicidu, které obsahuje, nejsou pouze EPSPS a PAT, přičemž způsob zahrnuje aplikaci alespoň jednoho ·· ···· ·· ···· • · · · · · · z uvedených herbicidů na pole v množství c plevelů bez podstatného účinku na plodinu.
Geny udělující rezistenci k herbicíc na samostatných polynukleotidech v r.
ecnem rostimv výhodném způsobu rostl enzymy EFSPS a/nebo GOX aplikaci glyphosatových v množství dostatečném k podstatnému účinku na podle vynálezu plodiny a/nebo GOX a fosfinotr:
ina/plodina obsahuje geny kódující a enzym HPPO, přičemž způsob obsahuje a trikeconovýcn herbicidů na pole k hubení plevelů aniž by došlo plodiny. V dalším provedení způsobu obsahují geny kódující enzymy EPSPS .cinacetyltransferázu, přičemž způsob obsahuje aplikaci glyphosatu a glufosinatu na pole. V dalším provedení způsobu podle vynálezu plodiny obsahují geny kódující enzymy EPSPS a/nebo GCX a fosfrnotricinacecvl•J U _l z. C til z Z 'j. z C U υ Ό b 3.U z. Ί 3 a tri betonových herbicidů n, podle vynálezu plodin'.
glyphosacu a glufosinatu a V dalším provedení způsobu t z u a glui_athion-o-i
OGo 5. ftu. j 1 geny kódující enzymy EPSPS a/nebo GOX a/nebc· fosfinotricinierázu, přičemž způsob obsahuje aplikaci glyphosatu a/nebo glufosinatu a anilidových herbicidů, jako je např. acetochlor, na pole.
V dalším provedení způsobu podle vynálezu plodiny obsahují geny kódující enzymy ACC a PG.T a/nebo EPSPS, přičemž
ΖΌ US OC OOSUUUjs 3. pil· KU Cl PcrDicidU zypU tlUlZitOpU a glyphosacu a/nebo glufosinatu na pole.
V dalším provedení způsobu podle vynálezu plodiny obsahují geny kódující produkt genu cbcZO. (případně s optimalizovanými kodony) získatelný z Alcaligenes eutrophus a enzymy EPSPS a/nebo GOX a/nebo PG.T a/nebp PDS, přičemž způsob obsahuje aplikaci 2,4D a glyphosatu a/nebo glufosinatu a/nebo herbicidního inhibitoru fytoendesaturázy na pole. Kromě toho v každé z těchto kombinací může být jeden ·· ····
0000 • · 00
00 nebo několik genů rezistence k herbicidu nahrazen genem pro SOD, protox a/nebo ALS .
Ve zvláště výhodném provedení způsobu podle vynálezu pesticidně účinné množství jednoho nebo několika insekticidu, fungicidu, baktericidú, nematicidú nebo antivirových látek je aplikováno na pole buďto před nebo po aplikaci jednoho nebo několika herbicidů.
Před k1á danv oa 1 e jsou podstatně rezistentní vůči dvěma nebo více herbicidům, kterýžto způsob spočívá v tom, že obsahuje kroky, kdy:
(i) rostlinný materiál se transformuje polynukleotidem nebo vektorem podle vynálezu, (ii) takto transformovaný materiál se selektuje a (iii) takto selektovaný materiál se regeneruje do morfologicky normálních fertilních rostlin.
Rostliny podle vynálezu se mohou případně získat způsobem, který zahrnuté transformaci prvního ro:
rostlin, které poskytuje způsob přípravy tolerantní nebo podstatně
Γίισ.ϋ.θΐ’ΐα.ΐ'ίΐ S S Κ V 6 Π CI 11G. 6 j. U j i C i druhý rostlinný materiál s v
rezistenci k transformovaného mater a vzázemné cpvlení tec izistenci k prvnímu herbicidu ransřormuze sekvencí udělužící druhému
1 11 Jn
1C 5 5.ΠΌ. j 1 C ί ΓΠυ. 003. 0760336 Cfcliv’ herbicidu, regeneraci takto celých fertilních rostlin rostlin, které vede k potomstvu prvním unemu herbicidu. Případně první a/nebo druhý rostlinný materiál může být předem transformován polynukleotidem obsahujIcím úseky kódující jeden nebo několik proteinů udělujících rezistenci k herbicidu, insekticidních proteinů, proteinů s protihoubovým nebo protivirovým účinkem a/nebo proteinů schopných udělit rostlině lepší odolnost proti usychání.
Předkládaný vynález dále poskytuje použití polynukleotidu nebo vektoru podle vynálezu pro přípravu ····
9 9 » 9 · ·· ·· ···· ·· pletiva a/nebo celých morfologicky normálních fertilních rostlin, které jsou podstatně tolerantní nebo oodstatně rezistentní jsdncns nebo několika herbicidům. Předkládaní vvnález dále poskytuje použití polynukleotídu nebe vekzoru podle vynálezu pro přípravu herbicidního cíle pro velkokapacitní in vitro sereening potenciálních herbicidu. Úseky polynukletidu kódující protein mohou bít heterclogně exprimovaný v E. Celí nebo kvasinkách.
Předmětem předkládané vynálezu 'je dále rostlinné pletivo transformované poiynukleotidem obsahujícím sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 a kódující dioxygenázu. To může být jediný gen rezistence k herbicidu v materiálu. Materiál pak může být odborníkovi známými způsoby regenerován na morfologicky normální ferzilní rostlinu. Ve zvláště výhodném provedeni transformovaného pletivo podle vynálezu, polynukleotid kódující protein s podstatně podobnou aktivitou proteinu kódovaného sekvencí id. č. i je komplementární se sekvencí, která když je inkubována při teplotě 60 až 65 °C 0,3násobné síly při stejné teplotě 0,3násobné síly
v cit r á Γ ottj puf rováném solném roztoku
ob sah uj ícím 0, 1 % SDS a poté opláchnuta
v cit rá t em puf rovaném solném roztoku
ob sah uj ícím a i ± t enc ó O stále ještě hybri
id . č ρ
jesi
Předkládaný' vynález budí pomocí následujícího popisu dc sekvencí.
pcirconeii vvsv;
Ky a seznamem
Sekvence id. č. 1 ukazuje sekvenci DNA, která byla izolována ze Synechocystis sp. a která kóduje enzym (uvedený
99
9 <
• · • ··· ·· «··· • · · • · ··· • · · · • · · ·· ··· • · · • · · · · • · · · ·· • · ·
994
999 ·· ·· jako sekvence id. č. 2), který má aktivitu dioxygenázv kyseliny p-hydroxyfenylpyrohroznové.
izolována z Pseudozior.as ssp. 37/79, ve které nukleotidy 1217 až 2290 kódují enzym (uvedený jako sekvence id. č. 4), který má aktivitu dioxygenázv c-hvdroxvfenvloyruvátu.
Sekvenc ednu termu svnteticxvc n ri moro o ó k 3 z v n 3 Η Ρ Ρ P - P 4
OR s minimální redundancí (vi a HPPD-REV1 dále), které byly použity pro izolac id. č. 3 z bakteriálního genomu.
Sekvence id. č. 7 a 8 jsou také syntetické PCR primery, které byly použity pro modifikaci sekvence id. č. -3 tak, aby mohla být vložena do vektoru pro- transformaci rostlin.
Sekvence id. č. 9 ukazuje aminokyselinovou sekvenci enzymu EPSPS (včetně chloroclastovéhc sicnálního oeotidu;
Z DS ZUiíl 3
Sekvence id. č polylinkery, které j; vytvářet konstrukty, k herbicidům.
<7 ai n jsou primery tta něco iou vloženy do plazmidů, aby bylo možné které obsahují více genů rezistence
Poois obrázků
Obr. 1 je je schematický diagram klonu obsahujícího sekvenci id. č. 3, kde byly identifikovány tři otevřené čtecí rámce: první začíná nukleotidem 15 a končí nukleotidem. 963, druhý začíná nukleotidem 215 a končí nukleotidem 1066 a třetí začíná nukleotidem 1217 a končí nukleotidem 2290 dle sekvence id. č. 3. Obrázek také ukazuje restrikční místa obsažená v sekvenci, která jsou manipulována pomocí primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 7 a 8.
schematicky znázorňuje přípravu expresní kazety obsahující 4-HPPD, kde fragmern
DNA z obr. 1 j· upraven oan i ίσοvan oc pomocí PCR a naštěpen Ncol a Kpnl ípMJBl; caké naštěpeného Ncol a Kpnl.
Obr. 3 je schéma úprav provedených na binárním rostlinném transformačním vektoru pBin!9, aby obsahoval
4-HPPD le oor . z .
sxorssm kazet
Obr. 4 je schematický diagram klonu obsahujícího sekvenci id. č. 1.
Obr. 5 znázorňuje obsahující 4-HPPD, kde přípravu rostlinné expresní kazety pomocí PCR upravený fragment DNA uvedený na obr. 4 je naštěpen enzymy Ncol a Kpní, pak linován do vektoru (pMJBl) také naštěpeného Ncol a Kpnl.
je schematicky konstrukci plazmidovéhc ého pro transformaci Acrcbacterium tmtisfscisn: mapv plazmidú pJRlRi a pGSAT-27Bin.
Ob r. 6 vektoru, pou: a také ukazuj
Obr. 7 ukazuje akzivizu GST ve transformovaném tabáku po aplikaci 4 herbicidů.
Obr. 8 je graf srovnání poškození rostlin divokého typu a rostlin linie GST-27 po ošetření metolachlorem v dávce 1400 g/ha po 3 týdnech.
Obr. 9 je mapa plazmidu pDV3-puc.
Obr . 10 je mapa plazmidu pDV6-Bin.
Obr . 11 j θ mapa plazmidu pU3-l, který obsahuje fragme at
i f j n q -y q b. Q promotoru získaného pomocí PCR z kukuřic ~ /
1 Γ U CL gmen velikosti 2 kb byl klonován do plazmidu piJC 19
Síc 3 PO j ú byla sekvencována pro ov ěření přítomnos ti
-toru
Obr. 12 je mapa plazmidu pIE98.
Obr . 13 je mapa plazmidu pIGPAT.
Obr. 14 je mapa plazmidu pCATlO.
Obr. 15 je mapa plazmidu pCATll.
Cc^ je mapa plazmidu pťGe .
zcbrazuie část olazmidu pl
ČVl
Příklady • · · · · • · · · • · · · • · ··· · » · • · · ·· ·· ···· ·♦ ··· • « · · · ···« · · ··· • · · · · • · · · » · ··· · o ···
Klonování genu 4-HPPD z Pseudomonas spp., transformace genu do rostlinného materiálu a příprava rostlin rezistentních k triketonovým herbicidům
Amine kyše1inová z Pseudcrcnas fluorescens PJ-8' sekvence 4-KPPD purifikovaného pěstovaného na tyrosinu jaro vycucnem
J- B i. echem. 1:
P yiy navrze n y těchto uhlíku, je zn c o ; . Na Za.ciadě teto servence minimálně redundantní primery pro PCR, a po:
nekomolentní, primerů byl ampnrikovan velký, ale fragment genu 4-HPPD z genomové DNA různých bakteriálních kmenů :Pseudcmonas fluorescens PJ-874) . Odborníkovi je znám význam cermínu minimálně redundantní primery, v dále uvedené sekvenci ie redundance naznačena hranatými závorkami.
Jaro čden p ř í k 1 ad ka ždéhc z příslušných primerů 5'-konci a 3'-konci cenu okali zaci na 4-HPPD)jsou zde uvedeny sekvence id. č. 3 a 4.
(sekvence id. č. 5), což je 17-mer, je yselin 4 až 9 publikované primer č. 2 (sekvence id. č. 6), coz je také 1/—mer, je zarozen na znalosti aminokyselinových zbytků 334 až 339. Primer č. 1 (HPPD-P4) má sekvenci:
(odpovídán reich cl mei c . i založen na znalosti sekvence proteinové sekvence (viz výše)
5'TANT/C] GA[G/A]AA[T/C] CC [T/C/G/A]ATGGG • · · · · · » · · » · · · · • · · > · · · · 1 « » · · · I <
•9 ·*· ·· ··· a primer 2 (HPPD-REV1) má sekvenci:
5'GC[T/C]TT[G/A] .AA[G/A]TT[T/C/G/A]CC[T/C1TC.
100 ng genomové DNA. z Pseadcmonas flucrsscsns PJ-3' připraveno podle standardního protokolu a smích 100 pmol každého primerů. Směs pak s ia<
polymerázou byla amplifi kována v PCr l dalšími standardními reagencierai v podmínkách syntézy a disociace DNA.: 94 °C po
5 C po 2 minuty :
Amplifi kovaný fragment obsahoval úsek obsahující 3 kodony z 5'-konce a asi 30 kodonů z 3'-konce kódujícího úseku genu 4-HPPD. Produkt PCR s tupými konci byl standardním způsobem ligován do (housekeeping) vektoru pGEM3Z-f(+).
Částečné sekvencování potvrdilo,
1,5 minuty, o po minouv.
fragmnet PCR j specifický pro 4-HPPD. DTrčené
G G S 3. G. G V 3 někol i k
Z Fs 3 G d G G O G 3 3 G _L U C2ΖΘ G C Θ G S P J ” 8 4-HPPD dává negativní signál p s rostlinou genomovou hvbridizace a orcmývár aminokyselinové sekvence vnalostí proui sekvenci enzymu Tento částečný fragmnec Souuhernově hybridizaci
NA za málo přísných podmínek Fraument EccRI/EcoRI velikcsui
900 bp byl vystřižen ze středu předtím klonovaného částečného genu a tento fragment byl použit, jako sonda. Byla provedena Soutnernova hybridizace genomové DÍLA našcěpené různými enzymy s tímto radioaktivně značeným fragmentem.
DNA naštěpená Bell poskytla jediný pozitivní pás velikosti přibližně 2,5 kb, který je dostatečně velký na to, aby obsahoval celý gen i se sousedními netranslauovanými úseky. Genomové DNA. byla naštěpena Bcil a rozdělena elektroforézou na preparativním ágarózovém gelu. Oblast obsahující fragmenty velikosti 2 až 3 kb naštěpené DNA. byla vyříznuta a DNA z ní byla extrahována elektroelucí. takto získaná DNA byla klonována do místa BamHI (které je kompatibilní s Bell) v plazmidu pbTC18. Otisky kolonií pak • · I • · · · · byly testovány se sondou, kterou byl uvedený fragment velikosti 900 bp, a 12 pozitivních kolonií bylo izolováno. Minipreparací izolovaná DNA z těchto· kolonií .byla naštěpena EcoRI s cílem najít diagnostický pás velikosti 900 bp. Ze 12 testovaných kolonií 7 vytvářelo hnědý pigment když . byly pěstovány přes noc na médiu LB pro minipreparací, 5 z nich bylo· pozitivních na fragment 900 bp, ostatních 5 bylo negativních a nevytvářelo hnědý pigment. Vytváření hnědého pigmentu je spojeno s heteroiogní expresí genu 4-HPPD.
Restrikční analýza uKázala, že klonovaný inzert dlouhý 2,5 kb s úsekem asi 1,2 kb upstream od genu 4-HPPD a asi 400 bp úsekem downstream. Konce genu byly šekvencovány pomocí vhodných primerů a také primerů pro pUClS. Toto sekvencování prokázalo, že gen byl intaktní a exisfovar v obou orienzacicn vznlem v pUClS.
SDS-PAGE elektorcréza lyzátu bakzeri přítomnost nového proteinu velikosti asi 40 kDa, což správně _m mis cum oopovíct z buněk, v tomto případě byl řeco1 pro 4-HPPD. Tento pás byl přítomen v ext které měly gen vložený v první orientaci, protein exprimován z promoto: vektoru. Žádný pás nebyl viditelný u lyzátů z buněk, kde gen byl v opačné orientaci, ačkoliv oba klony produkovaly hnědý pigment, což by napovídalo existenci aktivního proteinu v obou typech buněk. Rekombinantní protein velikosti 40 kDa převládá v rozpustné spíše než nerozpustné proteinové frakci. Klony, ve kterých je gen ve druhé orientaci, byly šekvencovány pomocí automatického sekvenátoru DNA a byla tak identifikována sekvence id. č. 3. Sekvence pak byla upravena tak, že do ní bylo vloženo několik restrikčních míst, aby se umožnilo její vložení do vektoru vhodného pro transformaci • ·· · rostlin. Oligonukleotidy použité pro tyto úpravy, uvedené zde jako sekvence id. č. 7 a 9, jsou primer č. 3 (HPPDSYN1):
Exprese genu 4-HPPD z Pseudomonas v transgenním tabáku
DNA fragment upravený pomocí PCR byl naštěpen enzymy Ncol a KpnI, pak byl ligován do vektoru (pMJBl) také naštěpeného Ncol a KpnI. Vektor pMJBl je plazmid odvozený z plazmidů pUC19 obsahující dvojitý promotor CaMV 35S, zesilovač (enhancer) TMV omega a transkripční terminátor NOS. Schéma výsledného plazmidů je uvedeno na obr. 2. Všechny manipulace s DNA byly provedeny standardním, odborníkovi v oboru molekulární biologie známým, způsobem.
Byla izolována celková DNA a expresní kazera 4-HPPD (tj. v rozsahu od 2x35S až. po nos 3'-terminátor) byla vystřižena částečným štěpením EcoRI a pak úplným štěpením HindlII. Tento postup byl zvolen proto, aby se zabránilo1 rozštěpení EcoRI místa uvnitř genu 4-HPPD. Po preparativní elektroforéze na agarózovém gelu byl požadovaný fragment izolován elektroelucí.
Expresní kazeta 4-HPPD pak byla ligována do vektoru p3in!9 naštěpeného HindlII a EcoRI. Výsledný plazmid je schematicky znázorněn na obr. 3.
DNA byla izolována a použita pro transformaci Agrobacterium tumefaciens LBA4404 na rezistenci ke kanamycinu opět standardními metodami v oboru. Prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens pak byly standardním postupem transformovány listové terčiky/proužky Nicotiana plumbaginifolia cv. Samsun. Transformované výhonky byly regenerovány z kalusů rezistentních ke kanamycinu. Výhonky · 9 9· · · ·»· • «99
9 9 9 » 9 9 « » 9 9 «
9 9 9 9 4 «
«4 9 9 ikořeněny v agarovém médiu MS s kanamycinem. Přeživší :akořeněné rostlinky byly přesazeny a znovu zakořeněny, což i
na.kcnea ocsxvtío as
SO trans formovaných rostlinek tabáku sice s již existujícími primery EDIT;.
V PCR bylo pozitivních 60 rostlin.
Explantáty (tj. list se segmentem stonku obsahujícím axilární pučen) byly umístěny na MS agar (+3% sacharóza) obsahující různé koncentrace ZA1206 (triketonový herbicid) od 0,02 do 2 ppm. Netransformované rostliny tabáku úplně zbělely na koncentraci 0,02 ppm.. Přitom při prodloužené expozici herbicidu se nikdy nezotavily. V tomto konkrétním pokusu zbělely pouze výhonky, které se vyvinuly list explantátů zůstal zelený.
0 tl Γ5.Π.5 ”C nT.C V2.P vch <3.
rostlin tolerovalo koncentraci ŽA1 než koncentrace způsobující p up e nu, p uvc bni
0, 1 ppm (asi svmptomv u x vyssi divokých, tu .
netrans rormovanycn
Zakořenily normál im oez jaxycnxoliv známek zoelen fenotvcově usou k nerozeznání netransformovaných rostlin. Skupina transformovaných rostlin byla tolerantní ke koncentraci 0,2 ppm a několik trans formo váných rostlin tolerovalo· dokonce koncentraci 0,5 až i ppm. Tyto rostliny opět vypadaly normálně a dobře zabořenou v přítomnosti herbicidu. Některé transformované rostliny na počátku zbělely po vystavení herbicidu při výše zmíněných vysokých koncentrácích, ale po prodloužené expozici herbicidu progresivně zelenaly a výrazně se zotavovaly.
Skupina zmíněných k herbicidu rezistentních rostlin byla ošetřena známými herbicidem Isoxaflutolem (tj. 5-cyklopropy-4(2-metylsulfo.nyl-4-trif iuormetylbenzoyl)isoxazol neboli RPA 210772) . Tyto rostliny jsou dokonce více rezistentní k tomuto herbicidu než k původnímu ZA1296, což jasně ukazuje, • e « · · · • · ·
4 4 4 4
4 * · · Λ « 4 4 « · · · ·
4 4
4 « • « · 4 Λ
4 ·4
O?
že rostliny jsou křížově rezis’ inhibitorů 4-HPPD.
k několika třídám
Přiklad
Klonovaní genu 4-HPPD ze oynecnacystis sp. ao materiálu a regenerace materiálu na rostliny k triktonovému herbicidu
G e n o m Svrischccyscis sp P C C ό tí 0 z b v l s e x v e n c o v a n . Ad y o y i o možné vnést do něho vhodná restrikční místa pro usnadnění vložení do vektoru pro rostlinnou transformaci, bylo ze Synechocystis sp připraveno 100 ng genomové DNxA standardním postupem a bylo smícháno se 100 pmol dvou primerů vhodných pro PCR amplifikaci (v 35 cyklech) sekvence, uvedené zde jako rostlinného rezistentní ssKvem výhodně id. č. 1, s ooravncu soužitím termostabiln ' oroof )NA o c 1 vme ráz v reaaino activ dalších standardních reaaencií v oodmínkách vhodných oro
disociaci 3. S y Π Lc ZU DNA, přičemž typické byly následuj ící
podmínky: 94 °C po 1, 5 mir zuty, 5 5 °C po 2 minuty a 74 °C po
3 minuty. Amplifikoval zý fr agment obsahuje kódujíc í úsek genu
4-HPPD. Produkt PCR y ± klonován (s tupými konci) do
standardu ího vektoru j a ke je např. pGEM3Z-f(e) . Arytváření
hnědého -pigmentu je spojeno s heteroiogní expresí genu 4-HPPD (Denoya et al. 1994, J. Bacteriol. 176: 5312-5319).
SDS-PAGE eiektroforéza lyzátů bakteriálních buněk ukázala, že buňky obsahovaly nový protein s očekávanou molekulovou hmotností genového -produktu 4-HPPD. Ve výhodném provedení vynálezu je rekombinantní protein buďto přítomen spíše v rozpustné než nerozpustné proteinové frakci nebo je upraven tak, aby v ní byl přítomen. Klon se podrobil automatickému sekvencování DNA, aby se potvrdilo, že nejsou přítomny žádné artefakty vnesené PCR.
·· · · · Λ * · · · · ’ • * · · · · * 9 9 9 9 · 9 9 9 9 • · · · · · <
Heterologní exprese genu 4-HPPD Synechocvscis sp. PCC6803 v E. coli
DNA fragment upravený pomocí PCR byl naštěpen vhodnými nzymy Ncol a celu (jako vhodně naštěoeného. Vše enzmymy jako napr. expresního ve ktoru pETi rak oroveden
KpnI, pak byl ligován do jsou např. vektory série onv mamoulace s DNA oviv standardním, odborníkovi v oboru -molekulární biologie znám jmi, způsobem.
Vhodný hostitelský kmen jako např. BL21(DE3) nebo jmý lysogenní kmen typu DE3 nesoucí gen 4-HPPD exprimuje množství HPPD dostatečné k tomu, aby byl vhodný k provádění vysokokapacitníno sereeningu pro identifikaci alternativního inhibitoru
4-HPPD.
HPPD purifikovaný z takového transformovaného hostitelského kmene se může vvužít oro
D O 1VHUK-cOtiaí ra pr kóduj í ί-HPPD .
Heterologní exprese genu 4-HPPD Synechocystis sp. PCC6303 v transgenních rostlinách
DNA. fragment upravený pomocí PCR byl naštěpen např. enzymy jako Ncol a Koni, pak byl ligován do vhodného udržovacího vektoru jako např. pMJBl, pro vytvoření expresní kazety příslušný v rostlině aktivní promotor a terminátor.
Vektor pMJBl je plazmid odvozený z plazmidů pDTC19 obsahující dvojitý promotor CaMV 35S, zesilovač (enhancer) TMV omega a transkripční terminátor NOS. Schéma výsledného plazmidů je uvedeno na obr. 4.
Expresní kazeta 4-HPPD pBinl9 naštěpeného HindlII pak byl ngovana oo vextoru coRI. Výsledný plazmid je schematicky znázorněn na obr. 5.
ňgrobacterium tumafaciens LBA4404 na rezistenci ke kanamycinu
DNA byla izolována a použita pro transformaci
9 9
9
9 9 9 • · · · · 4
S · · » 9 9 99 opět standardními metodami známými v oboru. Prostřednictvím Agrobacteríurn. tumefaciens pak byly standardním postupem transformovány rajče a brambor. Transformované výhonky byly regenerovány z kalusů rezistentních ke kanamycinu. Výhonky byly zakořeněny v agarovém médiu MS s kanamycinem. Přeživší zakořeněné rostlinky byly přesazeny a znovu zakořeněny, což nakonec poskytlo asi 80 transformovaných rostlinek tabáku rezistentních ke kanamycinu. Přítomnost genu 4-HPPD byla ověřena pomocí PCR (a sice s již existujícími primery EDIT). Značný počet PCR pozitivních rostlin byl odebrán pro další anaiyzy.
Explantáty (tj. list se segmentem stonku obsahujícím axilární pupen) byly umístěny na MS agar (+3% sacharóza) obsahující různé koncentrace ZA1206 (triketonový herbicid) od
0,02 do 2 ppm. Netransformované koncentraci 0,02 ppm. Přitom herbicidu se nikdy nezotavily. zbělely pouze výhonky, které se rostliny úplně zbělely na při prodloužené expozici V tomto konkrétním pokusu vyvinuly z pupenu, původní
Přibližně 30 transformovaných a v PCR pozitivních rostlin tolerovalo koncentraci ZA1296 0,1 ppm. (asi 5x vyšší než koncentrace způsobující symptomy u divokých, tj. netransformovaných, rostlin) bez jakýchkoliv známek bělení. Zakořenily normálně a fenotypově jsou k nerozeznání od netransformovaných rostlin. Skupina transformovaných rostlin byla tolerantní ke koncentraci 0,2 ppm a několik transformovaných rostlin tolerovalo dokonce koncentraci 0,5 až 1 ppm. tyto rostliny opět vypadaly normálně a dobře zakořeňovaly v přítomnosti herbicidu. Některé transformované rostliny na počátku zbělely po vystavení herbicidu při výše zmíněných vysokých koncentracích, ale po prodloužené expozici herbicidu progresivně zelenaly a výrazně se zotavovaly.
Skupina zmíněných k herbicidu rezistentních rostlin byla ošetřena známým herbicidem Isoxarlutoiem (tj. 5-cyklopropy-4(2-metylsulfonyl-4-tri ilucrmetylbenzoyl) isoxazol neboli RPA 210772). Tyto rostliny jsou rezistentní k tomuto herbicidu, což jasně ukazuje, že rostliny jsou křížově třídám inhib;
-HPPD.
Přiklad z
Klonování genu GST do rostlinného materiálu a regenerace rostlin rezistentních k herbicidům anilidového a difenyléterového typu byla pěstován pr A Q H u / -7 nos tuny žabáku Nicotiana plumbaginifolia cv. na médiu dle Murashige a Skoog (MS médium: MS soli 4,6 g/1 doplněné 3 % sacharózy a 0,S % bactoagaru, iny, explantáty pro· zakořeňovací pokusy semena byly pěstovány v kultivační místnosti př;
°C se lohodinovou světelnou periodou. Při skleníku byly rostliny přeneseny do kompostu kompost č. 3, Minster Brand Products).
pěstovaní v; (John Inne;
Bakteriální kmeny
E. coli kmen DH5a (GIBCO BRL.) byl: F”, (lacZYAargF)U169, deoR, recAl, endAl, hsdPNl (rK~, mKT), sccEíí, “zhi-cyrbiaQ relAl. Agrobacterium tumefaciens použitý pro transformaci rostlin tabáku byl kmen LBA 4404.
Plazmidy
DNA z GST-27 byla vložena do fagemidu pBluescript® II
SK( + ) velikosti 2,961 kb a označena pIJ21-3A (Jepson et al .
» 0 * · « a
k · * •0 0000 00 0000 • 0 0 · · · « ···· 0 0000 ·· 0 0 0 0 00 0 0 0 0 · · ·· «00 0· ·0·
26
1994) . pJRlRi je plazmid velikosti 12
obsahuje bakte riální gen rezistence ke
dvě repetitivn i sekvence velikosti 25
kb. Plazmid pJRlRi ί ς p :< v e Ϊ-DNA obsahuje markerový gen ý promotorem NOS. Exprese a CaMV 35S oromotorem.
a pravou i Rr sekvence kóc
Kam ri
Stanaaroy (marxery) veuixostu kb žebříček od firmy Bethesda Research Laboratories
Life Technologies, lne. byl použit jako markér velikostí při kontrole štěpení a produktů PCR (polymerázové řetězové reakce) na agarózovém gelu. Pro westernové analýzy byl na polyakrylamidový gel nanesen markér molekulové hmotnosti proteinů Rainbow (Amersham), což vše je odborníkovi známo.
Ostatní chsmikálie
A.k 11 vn i , i jako acetochlor, alachlor a metoíachior byiy produkty firmy ZENECA. A.grochemicals (UK) , Jeallot's Hill Research Station. Technické sloučeniny byly rozpuštěny v etanolu a testovány pomocí HPLC, zakořeňovacích s ioucenunv testu a testu Kurcen:
viz caíe .
Konstrukce plazmidů
Plazmid pIJ21-3A. obsahující DÍLA genu GST-27 byl naštěpen restrikčním enzymeme EcoRI (TA.) pufru. Naštěpení bylo EcoRI fracmenty byly (Pharmacia) v Ix Tris-acetátovém
3.(J3.1?óZOVeiuL CfΘ 1U . (Pharmacia)! místa ověřeno na 0,E povány do Smál plazmidů pJRlRi (obr. 6) po zaplnění přesahujících konců Klenowovcu DNA poiymerázou (Pharamcza) . Ošetření enzymem telecí alklickou fosfatázou (CA.P) zabránilo znovuspojení (selfligaci) pJRlRi před ligováním genu GST. Kompetentní bakterie E. coli (DH5a) byly transformovány plazmidem metodou teplotního šoku a pak byly pěstovány na agarových plotnách s kanamycynem. Pozitivní kolonie byly testovány buďto pomocí PCR nebo hbridizací přes noc ve 42 cC s radioaktivně značenou sondou ( a-~-P dNTP) . Teplota tání (Tm) sondy br nu bázi A nebo - _ . _ Reakce pan probíhala při nejnižší teplo ocívmerázou (Amoli-Taa DNA Polymer součtem 2 °C pro }
Z;
určena oro Kazdou G nebo ím-o o s íaq e, Perkin Elmer Cetus) codie orotokoli vodce.
: dminkv
PCR s 3 5 cykly byl y nastaveny následovně: denaturace DNA při 94 °C 43 sekund, nasednutí primerů oři nejnižší Tm po 1 minutu a prodlužování při 72 °C po 2,5 minuny. Před prvním cyklem byla reakce zahájena při 35 °C.
Bylo vybráno 8 pozitivních kolonií a ty byly pěstovány při 3’ přes noc v třepané kultuře v LB-médiu uícracenzriruu;
iO 009 rpm na cradientu a puriči kován CsCl.
Orientace inzertu v pJRlRi byla ověřena sekvencovánim úseku mezi 35S promotorem a genem GST Sangerovou metodou pomocí Sequenase® (verze 2.0, United Scates Biochemical, Corporation) podle protokolu (pGST-27Bin) (viz obr. 6) byl
Agrobactsrium tumefaciens metodou mrznutí/tání, publikovali Hostlers et al. 1987.
v ý robce. Vý s i e dn ý vnesen do kmenu piazmio
LBA d 4 g4
Transformace listů pomocí Agrobacterium tumefaciens
Transformace pGST-27Bin do tabáku byla provedena postupem, který publikoval Bevan 1984. Pro transformaci byly užity 3 až 4 týdny staré sterilní kultury tabáku (Nicotiana tabaccum cv. Samsun) pěstované na médiu MS. Listy byly po den inkubovány na médiu NBM (tj . médum MS doplněné 1 mg/1 benzylaminopurinem (6-BAP), 0,1 mg/1 naftalenoctovou
0· 0 0«
2S kyselinou (NAA)) s kanamycinem. Toto médium podporuje růst výhonků z listu. Další den byly okraje listu odříznuty a list rozřezán na kousky. Tyto kousky pak byly společně inkubovány se suspenzí buněk Agrobacteriura tumeřaciens (kmen LBA4404) transformovaných plazmidem pJRlRi s inzertem (pGST-273in). Pak byly kousky opět vráceny na médium NBM. Po dvou dnech se explantáty převedly do kultivačních nádob obsahujících NBM médium s karbenicilinem (500 mg/1) a kanamycinem (100 mg/1).
kr ;ku listu přenesen
Po pěti týdnech byl 1 výhonek z každého na NBM médium s karbenicilinem (200 mg/1) a. kanamycinem (100 mg/1) . Po dalších 2 až 3 týdnech byly výhonky s kořeny přeneseny do čerstvého média. Dva kousky z každého výhonku bylo umístěno do samostatných kultivačních nádobek. .Jeden byi udržován jako zásobní tkáňová kultura a druhý byl po zakořenění přesazen do půdy ve skleníku. Do skleníku tak bylo přeneseno- 4 2 nezávisíte
COT-Ot.
Extrakce listové DNA. pro PCR
Přítomnost transgenu v předpokládaných transformovaných rostlinách (trans formantech) se ověřovala pomocí PCR. Ze 3 až 4 týdny starých rostlin pěstovaných ve sterilních podmínkách se odebraly vzorky listů, Listové terčíky o průměru 5 mm byly rozdrceny 30 sekund ve 200 pil extrakčního pufru (0,5% dodecylsulfát sodný(SDS), 250mM NaCl, lOOmMI Tris-HCl, pH 8) . Vzorky byly 5 minut stočeny při 13 000 rpm a pak bylo přidáno i tn ou lu isoorooa anolu ke žernu h ií fáze. Vzc byly ponechány na ledu 10 minut a pak stočeny 10 minut při
000 rpm a ponechány oschnout. Pak byly resuspendovány ve
100 μί deionizované vody a 15 μί vzorku pak bylo užito pro
PCR. PCR byla provedena ve stejných podmínkách jak popsali
Jepson et al. (1991) . Rostliny transformované DNA GST-27 byly • ft · analyzovány pomocí primem GST ii/7 (AAGAAAGGTGGCGCAGTT, sekvence id. č. 10) specifického pro 3'-konec úseku GST-27 a primerů NOS3 (CATCGCAAGACCGGCAACAG, sekvence id. č. 11) soecifického oro NGS terminátor. 39 ze 42 primárních istormant poskytlo v PCR produkt velikosti 310 bp.
Analýza westernovými přenosem
Pro ověření heterolcgní exprese GST-27 v tabáku byla provedena analýza westernovým přenosem. 120 mg listového starých rostlin pěstovaných z 3 až 4 týdny v sterilních podmínkách bylo polyvinyipyrolidonu (PVP), rozdrceno ve 4 C v 0,06 g který absorboval fenolické sloučeniny, a 0,5 ml extrakčního pufru (1M Tris-HCl, 0,5M EDTA. (etylendiamintetraacetát), 5mM DTT (dithiotreitol), pH 7,8) . Pak bylo přidáno dalších 200 μΐ extrakčního pufru. Vzorky byly promíchány a stočeny 15 minut ve 4°C. Supernatant byl odstraněn, koncentrace proteinu byla stanovena Bradfordovým testem pomocí BSA jako standardu. Vzorky byly až do dalšího· upotřebení uloženy v -70 °C.
Vzorky 5 ,u.g proteinu s 33% (objem.) Laemmiiho barvicího roztoku (97,5¾ 10 % (hmo t./ob j em)
1,5 % ovronin a
Tris-HCl,
Laemmiiho pufr (62,6mM sacharózy, 2% (hmot./objem) SDS, pH 1% merkaptoetanol) byly naneseny na SDSpolyakrylamidový gel (17,7%, 30:0,174 akrylamid:bisakrylamid) po 2 minutách vaření. Proteinové extrakty byly separovány elektrcforézou v pufru (14,4% (hmot./objem) glycin,
1% (hmot./objem) SDS, 3% (hmot./objem) TrisBase)
Pak byl' nit roce ruio;
vou memor· (Hybcnd-C, Amersham) pomocí elektroblotovacíno zařízení (Biorad Unit) v pufru (14,4% (hmot./objem) glycin, 3% (hmot./objem) TrisBase,
0,2% (hmot./ob j em) SDS, 20% (objem. ) metanol) při 40 mV přes noc. Zda bylo naneseno stejné množství proteinu ve všech • · ·« vzorcích bylo kontrolováno barvením. čerstvě přenesených vzorků na membráně v roztoku 0,05% CPTS (sodná sůl měďftalckyanincetrasulfonové kyseliny) a 12mM HCl. Membrána pak byla odbarvena oplachováním 2x až 3x ve 12mM HCl a nadbytek barvy bvl odstraněn promvváním v roztoku 0,5'M NaHCO; po 5 až minus a rak b y i v b 1 o k o v á n y Tris-HCl, S nou vodou. Membrány p;
1, soro
BSA.
i TBS-Tween (hmot./objem) NaCl, 5% Tween 20 urát), pH 7,6) obsahujícím 5% hodinu v byly promývány 2 minut (hmot./obj em) póly x yetylen(hmot./obj em) v TBS-Tween s 2% (hmot./objem) BSA. Nepřímá imunodetekce byla provedena s ovčím antisérem GST-27 v ředění 1:2000 jako první protilátkou a králičím anti-ovčím antisérem v ředění 1:1000 jako druhou protilátkou, spojenou s křenovou peroxidázou bytek antiséra byl opláchnut
Detekce
Jakýkoliv nad (hmot./objem) chemiluminiscence) (Amersham).
ΌΓΟΙΐΐνν έΓιΙΓΓι ΙΠβ-!ΐΌ2ΓέΠ*/ V
Stanovení úrovně exprese genu GST bylo provedeno pomocí laserového densitometru LKB (Pharmacia). Westernová analýza (HRP s 2%
BSA.
se provádě mo-i ween pomocí ECL 'enhanced postupem dle výrobce odstraněno dodatečným
2222-020 Ultroscan XL vedla k identifikaci δ pro ce mu,
ich trans formant pozitivních v PCR, které nevykazovaly
expresi GST-27. Zbýváj ících 31 trans formant vykazovalo
exprese, která byla v rožne zí od sotva detekovátelné
velmi vysokou v rozsahu 1 % celkového rozpustného
u, c o z b y 1 o stanoveno s rovnáním se signálem
anvm u vzorku čistého GST li 2 kukuřice.
Analýza Southernovým přenosem
Vzorec integrace transgenu byl ověřován Southernovou analýzou. Z rostlin tabáku pěstovaných ve skleníku bylo ·· · · • · · · · odebráno 2,5 g pletiva z listu, ' které bylo umístěno do plastického sáčku obsahujícího extrakční pufr (0,35M sorbit, O,1M Tris-HCl, 0,005M EDTA, 0,02M disiřičitan sodný, pH 7,5) a vymačkáno protažením strojkem na těstoviny. Takto získané extrakty pak byly stočeny 5 minut při 60 00 rpm při teplotě místnosti. Po slití supernatantu byl
300 μΐ extrakčního pufru a 300 Lil pufru (2-d (hmot./objem) CTAB, 0,2M
2M NaCl, pH 7,5). Pak se přidalo 120 μί 5% sarkosvlu a vzorky byly vloženy na 15 minut do vodní lázně s teplotou 65 °C.
Extrakty pak byly po přidání 600 ml směsi chloroform:isoamylalkohol 24:1 stočeny 5 minut při 6000 rpm. 700 μί isopropanolu pak bylo přidáno ke stejnému objemu iJA jaoerneno fyzovaomo Tris-HCl, 0,05M EDTA,
supernatancu a točeno dalších 1 0 minut při 13 000 rpm. Pelet
byl opláchnut 70% etánolem a usušen na vzduchu. Pak byl
ponechán přes noc rozpouštět ve 4°V ve 3 0 μί TE (iQmM Tris-
HCI, ImM EDTA) a resuspendován. Vzor kyz bylyz až do upotřebení
uchovávány při 20 °C.
Celková liscova DNm z extraucu rostlm obsahujicicn gen GST-27 byla štěpena 6 hodin ve 37 °C restrikčními enzymy Sací a Xbal v pufru lx Phor-one-al1 (20mM Tris-octan, 20 mM octan hořečnatý, lOOmM octan draselný, Pharmacia) . DNA pak byla rozdělena na 0,8% agarózovém gelu, denaturována 30 minut za současného jemného třepání v 0,5M NaOH a 1, 5M NaCl a pak byl gel neutralizován 75 minut třepáním v 0,5M Tris-HCl a 1, 5M NaCl. DNA byla přenesena r.a nylonovou membránu
Hybond-N (Amersham) Domočí kacilárního ořenosu ve 20x :SC (3M NaCl, 0,3M citrát sodný)
DNA cvia rixovana na memoranu jtrtagene) a pečení kombinací UV záření (UV Strataiinker, minut při 80 °C. Sondy byly/ vystřiženy pomocí EcoRI z plazmidu použitého pro transformaci Agrobacierium tumefaciers obsahujícícho gen GST-27. Sonda byla označena • · · · · · • · • · · · • · · ·· · ·· ····
a-'“P dNTP' (3000 Ci/mM) pomocí soupravy Prime-a-Gen ÍP romega)
postupem náhodných primerů podle Feinberga a Vogel sterna.
Pozitivní kontrola byla připravena štěpením plJ21-3A enzymy
Sací a EcoRI.
Prehybridizace probíhala v 5x SSPE (0,9M NaCl, 0, 0 5M
fosofrečnan sodný, 0,005 EDTA, pH 7,7), 0,5* b L·' O f
1* (hmot./objem) Marvel (sušené mléko v prášku), 200 ug/mi DMA lososího spermatu denaturovaná 3 až 4 hodiny v 65 °C. Hybridizace probíhala ve stejném pufru s vynechanou poslední složkou. Membrány pak byly promývány 30 minut v 65 °C ve 3x SSC, 0,5% SDS a dvakrát 20 minut v lx SSC, 0,1% SDS před tím, než byla provedena autoradiografie v -70 °C.
Analýza HPLC
Pro ověření toho, zda transgenní rostliny exprimující GST-27 mají GST aktivitu proti herbicidovým substrátům, byly provedeny testy in vitrc pomocí HPLC. Ze 3 až 4 měsíce starých kvetoucích rostlin tabáku pěstovaných ve skleníku byl odebrán 1 g listového pletiva, rozdrcen v kapalném dusíku a 7 ml extrakčního pufru (50mM glycyiglycin, 0,5mM EDTA, ImM DTT, pK 7,5) . Extrakty byly přeneseny do centr!fugační zkumavky obsahující 0,1 g PVP a pak centr!fugovány 30 minut při 16 500 rpm ve 4°C. 2,5 ml supernatantu bylo naneseno na kolonku (PD10) se Sephadexem G-25 (Pharmacia) a eluováno 3,5 ml pufru s fosforečnanem sodným (50mM, pH 7,0) obsahujícím ImM EDTA a ImM DTT. Stanovení proteinu bylo provedeno Bradfordovou metodou s BSA jako standardem. Extrakty byly rozděleny na alikvotní části a uschovány až do upotřebení při -70 °C.
Analýzy HPLC byly prováděny na kolonách Spherisorb
5μ ODS2 (25 cm x 4,6 mm vnitřní průměr, výrobce Hichrom) směsí acetonitril: 1% vodná kyselina fosforečná 65:35 jako
m.' rvi ·· ···· • · · · • · · ·· · ml/min. Sloučeniny byly detektorem UV detektorem LC-βΑ Schimadzu (vlnová délka 200 nm).
Reakce byly prováděny v 0,8ml HPLC viálkách při teplotě místnosti (20 až 25 °C) . 15 až 94 % (objem.) rostlinného e přidalo k fosfátovému pufru (pH7) s SmM i nebo homogiusat hionem a 2 až 20 ppm příslušné sloučeniny (2 ppm fluordifenu nebo 20 ppm acetochloru, a metolachloru). Kontroly byly připraveny se oměry až na to, že rostlinné extrakty byly stej nymi nahrazeny fosfátovým pufrem.
Reakce byla zahájena přidáním herbicidu použitého jako substrát. Reaktivita sloučeniny byla sledována po dobu 9 až 19 hodin. Specifický retenční čas a plochy vrcholů byly počítány pomocí programu JCL 6000 systém chromatography data chromatomraíickvch da paokage pro zpracování
Jonesova cnromatocrariei .
‘ro Kazaou sloučeninu se měřila plocha vrcholu HPLC vs. časový pi ní ž i:
iových bodů. Poloos rychlostní konstanta získány z exponenciálníh proložení gované plochy vrcholů vs. čas. Tato data byla zpracovávána programovým, balíkem FIT verze 2.01.
Pomocí tohoto postupu popsaného výše byla hodnocena akrivita GST transformovaných rostlin proti různým herbicidům jako substrátu. Testované herbicidy byly 3 dichloracteanilidy pseuao;
bodů kcri rocníor, alachlor metolachlor) di fenyléter fluordifen) . Tyto látky jsou známy tím, že jsou konjugovány s glutatnionem, zvláště prováděly v přícomnosti dichloracetanilidy. Extrakce se PVPP a při nízké teplotě, aby se omezila denaturace proteinů. Studie stability GST ukázala,že aktivita GST kukuřice se snížila o 73 % v hrubém extraktu, když byl uchován při -20 °C. Proto byly extrakty rozděleny do alikvotních částí a až do upotřebení uchovávány při -70 °C.
• ·
každý vzorek byl rozmražen pouze jednou, a to přes noc a na ledu. Všechny testy byly provedeny do 2 týdnu od přípravy extraktů.
Koncentrace herbicidu v HPLC viálkách byla nastavena podle jejich rozpustnosti. Acetochlor, alachlor a metolachlor byly testovány při 2Q ppm a fluordiřen při 2 ppm. Test probíhal 9 až 19 hodin v závislosti na reaktivitě herbicidu. Metolachlor byl testován delší dobu, protože má v cěohto podmínkách vysoký poločas. Detekce sloučenin se prováděla UV detektorem při 200 nm. Specifický retenční čas a plochy vrcholů byly měřeny pro každý herbicid. Aktivita G5T se určovala na základě 7 až 11 časových bodů. Enzymatická konjugace následovala po exponenciálním snížení křivky.
Snížení plochy vrcholu u testovaného herbicidu bylo použito k výpočtu aktivity GST. Byly také vypočítány hodnoty poločasu a rychlostní konstantv prvního řádu.
Bylo testováno pět linií tabáku včetně divokého typu 'npfTďtivní konC roku meidliVlii KUUclOiai , i 17. Tvto linie linie GST-27 označované 5, 6, 12 yly vybrány na základě výsledků westernové analýzy ukazujících na jejich vysokou expresi. Aby se zabránilo rychlé konjugaci ještě před vlastní sledováním, byl herbicid přidán jako poslední. GST-27 linie č.17 byla testována také na konjugaci acetochloru a homoglutathionu. Výsledky jsou uvedeny na obr. 7 a ukazují, že rostliny exprimující GST-27 mají chloracetanilidovým herbicidům in vitro.
Stručně lze shrnout, že transgenní .n GST-27 a ryto rostliny j :lativní aktivity aktivitu proti rostliny tabáku tuC Σ Ω. Θ 00—1313 Π3 in vitro expnmuj i pro základě jejich pro ci herbicidovému substrátu.
000 • ·
Analýzy -in vivo - zakořeňovací testy
U linií GST-27 byla prokázána významná aktivita proti nejméně 3 chloracetani1idúm. .Avšak většina herbicidů této třídy je známa tím, že inhibuje prodlužování kořenů. Bylo proto rozhodnuto provést zakořeňovací testy pro acetochlor, alachlor a metolachlor.
Byla připravena pilotní studie k tomu, aby se zjistily acncen l ivl
5, 10, 20, 40 a 100 ppm. Dvě transformované linie (GST-27 č. 6 a 17)a .tabák divokého typu byly testovány s alachlorem. Linie 6 a 17 byly vybrány proto, že představují rostliny s nejnižší a nejvyšší expresí, jak lze soudit -na základě westernové analýzy. Tři explantáty, setávající z listu a kousku výhonku, byly přeneseny na médium MS doplněné herbicidem. Růst kořenů byl pozorován po 2 týdny (obr. 3) .
typu již od koncentrace 1 ppm, neboť listy jsou menší a žlutější. Se zvyšující se koncentrací je účinek zřetelnější a snižuje se počet nových listů. Od koncentrace 10 ppm nové listy. Naoroti tomu rostliny u transf nevytvai zrnovaných i vuoec . i n i i je ucmex neroiciou pozcz teprve od koncentrace 20 ppm oro linii 2 od ppm pro linii 6. V rozmezí těchto koncentrací jsou listy menší a jejich počet je snížen, ale jsou stále zelené. Za druhé, rostliny divokého typu vytvářejí alespoň nějaké kořeny do koncentrace 5 ppm, ale už v rozmezí 0 až 5 ppm se dramaticky snižuje jejich délka. Pokud jde o linie 2 a 6, ty vytvářejí kořeny až do koncentrace 10 ppm (linie 2) a 20 ppm (5) , přičemž se snižuje jejich délka. Za těchto podmínek po 2 týdnech sledování lze pozorovat, že koncentrace omezující zakořeňování leží mezi 20 a 40 ppm pro nejlepší linii testovanou v tomto stadiu pokusu.
• fc fcfcfcfc • · · • · · · · • · · • · · • β fcfcfc ·· fcfcfc · ·· ·· • fcfc · · · · • · · · * · fcfc · • · · · ······ • · · . · ·
9· fcfcfc ··
Následující pokus byl připraven pro rostliny divokého uypu (kontrola), 4 linie GST-27 (linie č. 5, 6, 12 a 17; .
Tyto rostliny byly testovány na acetochloru, alachloru a metolachloru v koncentracích 0, 10, 20 a 40 ppm pro acetochlor a metolachlor, a 0, 10, 40 a 100 ppm pro alachlor.
Tyto koncentrace byly vybrány proto, že při analýze HPLC rostliny vykazovaly nejnižší aktivitu proti acetochloru a me tolaehloru. Jinak pokus probíhal ve stejných podmínkách; 3 explantáty pro každou linii a pro každou koncentraci byly přeneseny na médium MS s herbicidem. Pozorování kořenů probíhalo po 3 týdny od zahájení pokusu.
Co se týče pilotní studie, odpověď explantátú v každé nádobě byla obecně uniformní. Na acetochloru explantáty divokého typu nejevily žádné zakořeňování ani nevytvářely nové listy v přítomnosti herbicidu. Ale linie 6 a 17 vytvořily několik kořenů a také malé listy při koncentracícn 10 a 20 ppm. Linie 5 a 12 nebyly tak rezistentní jako předchozí dvě linie. Na alachloru explantáty divokého typu nevytvářely při testovaných koncentracích žádné kořeny, ale při koncentraci 20 ppm vytvořily několik listů. Linie 6 a 17 vytvářely kořeny až do koncentrace 40 ppm, přičemž kořeny byly zcela neovlivněny herbicidem. Počet kořenů se zdál nižší s rostoucí koncentrací herbicidu. Pro tyto linie byla za daných podmínek koncentrace omezující zakořeňování mezi 40 a 100 ppm po 3 týdnech. Linie 9 a 16 nevytvářely žádné kořeny a jen velmi malé lístky na 20 a 40 ppm herbicidu. Na metolachloru rostliny tabáku divokého typu vytvářely pouze několik malých kořínků v koncentraci 10 a 20 ppm. Linie 6 a 17 vytvářely krátké kořeny, ale ne tolik kolik vytvářely na alachloru. Pro tento herbicid byla koncentrace omezující zakořeňování mezi 20 a 40 ppm pro linii 6 a více než 40 ppm pro Imi 17.
·· ··«» ·♦ ···· • · • ··· • · · • · · ·· ···
Ošetření rostlin herbicidem
Pro demonstraci toho, že transgenní rostliny exprimující GST-27 nesou rezistenci k působeni herbicidu, byly ve skleníku provedeny pokusy s pre-emergentmím a postemergentním ošetřením herbicidem.
Pre-emergentní testy byly zahájeny vysetím asi 50 semen od každé linie pro každou tescovanou koncentraci herbicidu do písku (25 % prosáté hlíny, 75 % hrubého písku, pomalu se
Koncentr via pr:
1 V tť ku. tr í i d
i. Herbicid
0,3 00 a 3 50 g/ha) formulovaný
5%
JF5969 (905, 6 g/Icyklohexanon, 33,33 g/1 synperonic NPE 1300 a 16,7 g/1 Tween 85) byl aplikován pomocí rozprašovače na plata s osivem. Osivo bylo ponecháno ve skleníku a klíčení bylo hodnoceno po 3 týdnech. Výsledky pro alachlor ukázaly, že transgenní rostliny jsou rezistentní k pre-emergentní aplikaci herbicidu. Podobné výsledky byly získány pro acetochlor, metoiachlor a EPTC (12 000 g /ha).
Post-emergentní testy byly provedeny vysetím 28 semen Dro . každou, linii a cro každý herbicid do kompostové oudy. Po 16 dnech byly tabákové rostlinky (asi 1 cm vysoké) postříkány alachlorem formulovaným, v 5i JF5969 pomocí postřikovače.
Poškození rostlin bylo hodnocen·:
ován v
PO xaci a sice byla hodnocena velikost rostliny, výskyt nekróz, stav vzrostného vrcholu a morfologie listů ve srovnání s neošetřenou kontrolou. Ve výsledném hodnocení skóre 100 % znamená, že rostlina je herbicidem zcela zahubena, a skóre 0 % znamená, že rostlina je podobná neošetřené kontrole. Post-emergentní výsledky pro alachlor ukázaly, že- transgenní rostliny jsou rezistentní k tomuto herbicidu. Míra poškození rostlin divokého typu a segregující linie GST-27 po aplikaci metolachloru v dávce 1400 g/ha je graficky znázorněna na obr. 9. Obdobné studie byly provedeny neroi du postřikem, ·· a··· ·· ···· > . a a a aaa a a aaaa » a a aa ··· a a a aaa aa aa i a < a > a a a a a aaa aaa a a aa a* také s žcscocíiiorea v aavc výsledkům.
2000 cj / a vealy k
Příklad
Klonování genu rezistence ke glyphosatu do materiálu a příprava r·; Přehled kazet a s' jstlin rezistentních ke glyphosatu /ecifických konstruktů pro transřormac costiin je uv ;p Al 536330.
in na oorazci
Evropské patentové přihlášce obsahuj ící kontrolní plazmid (GOX) fúzovaný vektor č. 1 pro dvouděložné rostliny
č. 1 je konstitutivní gen glyphosatoxidázy s chloroplastovou (CTP) transitní sekvencí 1 genu pro Rubisco z Arabidopsis tkaliana řízený zesíleným promotorem CaMV 353. Konstrukt obsahuje translační kóduzící sekvence
zesilovač (enhancer) Omega
CTP. Ve ktor č. 1 u z i v a
•GCX je synteti zovár i o o d 1 e
álezu WO 92/00377 s tím, že
1 místa pro Ncol v místě
xonce terminátor NOS. Konstruk sekvence popsané v přihlá jsou doplněna další re: translačního počátku ATG a místo KpnI na 3'-konci. Vniuřní místa Sphl a Ncol byla během syntézy odstraněna, aniž by došlo ke změně izolována jako sekvence proteinu. Sekvence CTP-GOX byla Ncol-Kpnl fragment a ligována užitím standardních, v oboru známých, technik do plazmidů pMJBl naštěpeného Ncol a KpnI, což je plazmid založený na plazmidů pIBT211 obsahující CaMV 353 promotor se zdvojeným enhancerem napojený na zesilovací translační sekvenci z viru mozaiky tabáku, kzerá nahrazuje netranslatovanou 5'-koncovou vedoucí sekvenci viru skvrnitosti tabáku, a je ukončený terminátorem
NOS .
« · · · · · • · · · • · • ·
Kazeta obsahující konstrukt zesílený promotor CaMV 35S
Omecra - CTP-GOX - Nos byla izolován;
ar;
fragment' HindiII-EcoRI a ligována transformačního vektoru odvozeného HindlII a EcoRI.
do plazmidu pjRlRi, z pBini 9, naštěpeného
Vektor č. 2 pro dvouděložné rostlin
Gen
UP ť )PSPS nv s chloroplastovým transitním peptidem z petúnie byl připraven podle sekvence popsané v přihlášce vynálezu WO92,/04449 s místem Ncol v počátku translace ATG. Vniřní místo Sphl je umlčeno, aniž by došlo ke změně sekvence proteinu. Fragment obsahující syntetickou sekvenci CTP-EPSP5 byl izolován jako NcoI-SacI fragment a byl ligován do pMJBl. Sekvence byla
Véna do plazmidu tak.
ii exprese ie řízena zesnenvm.
promotorem CaMV 35S a terminátorem NOS s Omega fragmentem umístěnými na 5'-konci protein kódujícího úseku, a byla izolována jako EcoRI-HindlI fragment, který pak byl klonován do pJRlRi, čímž vznikl vektor č. 2.
Vektor č. 3 pro dvouděložná rostliny
Kontrolní vektor s geny EPSPS a GOX byl konstruován tak, že se vektor č. 2 pro dvouděložné rostliny naštěpil EcoRI a vložil se do něho linker (spojovací člen) EcoRI-Sphl-EcoRI. tento vektor se pak štěpil Sphl, aby se uvolnila kazeta (3), která byla klována do místa Sphl vektoru č. 1 směrem k 5'-konci od promotoru, čímž vznikl vektor pDV3puc (obr. 9). Kódující úseky, včetně promotorů a terminátorů odvozených z vektorů č. 1 a 2 pak byly vystřiženy z pDV3puc jako HindiII-EcoRI fragment a klonovány do oJRlRi.
Plazmid pDV3 v binárním vektoru pjRlRi byl vnesen do zprostředkované tabáku prostřednictvím transformace
Agrobactaríum tumafacíers v oboru známým způsobem. Z kalusu z takto transformovaného materiálu bylo získáno 270 výhonku a z nich 77 zakořenilo. Pro potvrzení přítomnosti genů EPSPS a GOX v zakořeněných výhoncích byly extrakty DNA z rostlin transformovaných pDV3 analyzovány pomocí PCR s následujícími primery:
3'-konec genu EPSPS:
'TCO CA.
5'-konec aenu GOX:
;ps:
12,
AAT C AAG G T AA.C CTT G AA.T:
sekvence id. č. 13, GOX1)
Reakce PCR poskytla pás velikosti 1,1 kb, pokud byly oba geny přítomny. Pro potvrzení funkčnosti genu tolerance ke glyphosatu v pDV3 byly explantáty přeneseny na MS médium obsahující 0,01mM a 0,05mM glyphosat. Rostliny byly hodnoceny
ΌΟ dvou rvanecn ;a oreneseni meaium a -a.
Rezistentní linie, které úspěšně rostly na médiu obsahujícím herbicid, byly analyzovány pomocí westernového přenosu užitím králičího antiséra proti purifikovaným GOX a EPSPS.
Z kaž dé primární trar isformanry byla θ X ~ r* y b o V 3 Π 3 11 S r 0 V 3
DNA. a po už i y a v PCR reakci pro potvrzení přítomnosti vektoru.
Westernov A Π anaiyza o v1a provedena na každé pDV3 rostlině
pozitivní V PCR, aby se potvrdila hete rolcgní exprese GOX
a EPSPS, 3 sice metodou popsanou již v předchozím textu.
Rostliny S vysokou hladinou exprese byly samosprášeny
a semena pak byla podrobena screeningu na kanamycinových plotnách. Rostliny s jediným. lokusem byly uchovány pro přípravu homozygotů. Údaje potvrzující, ze rostlinv transformované konstruktem pDV3 jsou rezistentní ke glyphosatu, jsou uvedeny v příkladu 8.
• · ·
9 9···
4 4 · · · • · · · » · 4 44 4
4 4 4 4 4 ·
4 4 4 4 ·
4 44 4 * * ···
Příklad 5
Příprava rostlin rezistentních k herbicidům anilidového a glypnosatu
Pyl heterozygotnícn a homozygotních linií tabáku exprimujicich GOX a EPSPS byl přenesen na homozygotní linií žabáku exprimující GST-27. Semena vzniklá z tohoto křížení byla vyseta a listový materiál byl pak použit na weszernovou analýzu, jak bylo již dříve popsáno. Proteinové extrakty z rostlin pozitivních ve westernové analýze pak byly testovány protilátkami GOX/EPSPS, aby se selektovala linie exprimující jak GS'T-27, GOX tak i EPSPS. Tyto linie pak byly užity pro pre-emergentní postřiky acetochlorem, alachlorem a metolachlorem a EPTC. Následně byly rostliny stříkány post-emergentně formulovaným?, g]yphosatem.
typu
Příklad 6
Příprava rostlin, anilidového zak i ocvlením kzeré jsou glyphcsaZov;
rezistentní k herbicidům o typu, způsobem bez kř(
Vekzor pDV3puc byl štěpen EcoRI, extrahován chloroformem a precipitován. Linker delta EcoRI-HindiII-EcoRI MK0L3 (5 dáATTACGGAAGCTTCCGT 3' , sekvence id. č. 14) byl· zahřát na 73 °C a ponechán chladnout na teplotu místnosti, aby došlo k samospojení. Spojený (tj. dvouřetězcový) linker byl ligován do pDV3puc naštěpeného EcoRI. Domnělé rekombinanty byly testovány s koncově značeným oligonukleotidem MK0L3. Plazmidová DNA byla izolována z pozitivně hybridi zujících kolonií. Restrikční štěpení HindlII vedlo k uvolnění fragmentu velikosti 5,4 kb obsahujícího konstrukt 0mega-CTP2EPSPS-NOS, jehož exprese je řízena CaMV 35S promotorem, fc · • fcfcfc ehož expre;
byl klonován do plazmidů a defosforylovaného CÍP.
pomocí sondy z inzertu.
10) byl ověřen vhodným • · fcfcfc • r ··· · ·« • ♦ « • fc fc* a konstrukt Omega-CTPl-GOX-NOS,
35S promotorem. Tento fragment pGST-27Bin naštěpeného HindlII Rekombinanty byly selektovány
Výsledný vektor pDV6-Bin (obr. sekvencováním. Výsledný plazmid byl transformován do tabáku prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens známým způsobem. Po transformaci bylo získáno 270 výhonků, z nichž 80 zakořenilo.
Z každé primární trans formanty byla extrahována listová DNA a použita v PCR reakci pro potvrzení přítomnosti protein kódujícího úseku vektoru. Pro PCR byly užity primery uvedené výše (sekvence id. č. 12 a 13) . P;
potvrzení funkčno st i transgenu byly primární trans formanty pDV6 hodnoceny na médiu obsahujícím 0, 0, OlmNI a 0,05mM glypnosat a 10 ppm a 40 ppm alachloru. Značný počet transgenních rostlin úspěšně rostl na obou médiích v podmínkách, kdy kontrola divokého typu nerostla. Westernová” analýza byla provedena na každé pDV3 rostlině pozitivní v PCR, aby se potvrdila heterologní exprese GOX, EPSPS a GST-27, extu. Tyto líni;
S mg tou popsanou p a k b y1y užity pro p r e YLL — im emergentní postřiky acetcchiorem, alachlorem a metolachlorem a EPTC. Následně byly rostliny stříkány post-emergentně formulovaný glvphosatem.
Tabulka i uvedená dále ukazuje údaje o pre- a postherbicidním ošetření rostlin pDV6, tj.rostlin exprimujících jak gen rezistence ke glyphosatu tak i GST. Horní část tabulky ukazuje dávky, ve kterých byl herbicid aplikován preemergentně a následný pokračující stav bez post-emergentní aplikace herbicidu. Dolní polovina tabulky ukazuje poškození způsobené po aplikaci glyphosatu v dávce 800 g/ha. Spodní tabulka ukazuje opakovaná skóre poškození vlivem postemergentní aplikace glyphosatu na rostlinách, které nebyly
4?
vystaveny pre-emergentnímu ošetřeni. Vsecnna opanovaní na rostlinách divokého typu dávala shodné výsledky, zatímco výsledky opakování s transgenními rostlinami odrážely skutečnost, že šlo o segregující populaci, tj. azygctní rostliny, které neexprimcvaly transgen, byly schopny projít testem post-emergentního postřiku.
Průměrné hodnoty pro post-emergentní aplikaci herbicidu
emergenoní Pre-emergentní aplikace % fytotoxicity
uátka DgV“ ka Látka Dávka pDV6 X o pDV6 č . 7 1 Divo ký syp
Žádná Žádná - 0 j n v
-Acetochlor 50 0 0 -
Metolachlor 300 0 0 -
Alachlor 4 00 0 0 -
Diae t en am a ó 5 0 0 0 -
C' / k l· G á t 5 0 0 0 0 0 -
EDTC 50 0 0 0 0 -
Bayer FOE 5043 5 0 0 0 -
T e t r a z o 1 i no n 200 - 0
glyphošat 8 0 0 Žádná - 13,75 4 3,75 36, 25
360 g/i -Acetochlor 50 0 0 -
Metolachlor 300 0 0 -
Alachlor 400 0 0 -
Dimetenamid 50 0 0 -
Cykloát 5000 0 0 -
EPTC 5000 0 0 -
Bayer EOE 5043 50 0 p
Tetrazolinon 2 00 - 0 -
• · 9 · φ · · 999 99« • ··· · · *
9·Φ ·· ··· ·· ··
pQS t — 6ΓΠ.ΘΓCí6ΓΪtni aplikace Pre-emergentní aplikace
Látka Dávka Látka 3. b c d
glyphosat 800 Žádná 75 0 0 0
100 0 0 95
90 90 90 75
FOE5043 ie oxyacetamid známý iako' fluthiamid.
Příklad 7
Příprava kukuřice rezistentní i glyphošatového typu
Vektor pro transformaci k herbicidům anilidového jednoděložných rostlin (kukuřice, pšenice), který obsahuje gen GST-27 udělující rezistenci k pre-emergentním herbicidům, a fosfinotricinacetyltransferázu (PAT) emergentnímu herbicidu udělující rezistenci k pos· giurosmatu, bvl przoraven následujícím způsobem: 1. krok: pilBl
-a 2 ivextor odvozeny ubichitznovy promotor a intron z kukuřice) byl naštěpen (viz obr. 11) HindlII. Do takto vzniklé mezery byl vložen linker (5 'AGCTTGTACA.CCGGTGTACA3 ' , sekvence id.č. 15) . Výsledkem byl rekombinantní vektor označený pTJB2 .
2. krok: cDNA pro GST-27 byla vystřižena z pIJ21-3A pomocí KpnI a BamHI a klonována do pUB2 naštěpeného KpnI
Hindi11-AgeI-HindiI:
z pUC obsahující amHI, čímž vznikl pUB3.
3. krok: Linker Kpnl-Pacl-Kpnl (5CGGACAATTAATTGTCCGGTAC3', dvouřetězcovou DNA) a pak klonován do pUB3 naštěpeného KpnI, čímž se vytvořil pUB4.
sekvence id. č.
16' byl sám spojen (tj . vytvořil • · • · · · • · · · ·· · · · ·· ·· • · · • · · • · · · · · » · «· ··
4. krok: Terminátor NOS byly izolován jako Smál fragment z pIE937 (obr. 12) a s tupými konci klonován bo pUB4 naštěpeného EcoRV, čímž vznikl pUB5. Orientace terminátoru NOS v pUB5 byla potvrzena štěpením pomocí EoRI a BamHI. Všechna místa spojů byla sekvencována pro potvrzení správného vložení jednotlivých složek konstruktu.
5. krok: Kazeta ubichitin-GST-27-NGS přítomná v pUB5 byla vyjmuta štěpením Agel a PacI a klonována do ampicilin minus vektoru pIGPAT (obr. 13), který obsahuje gen PAT řízený promotorem 35S CaMV. Rekombinanty se detekovaly hybridizací kolonií s EcoRI cDNA. inzertem z pIJ21-3A. Rekombinanty byly orientovány pomocí štěpení Ncol a byl tak vytvořen vektor pCATlO (obr. 14).
6. krok: Kazeta 35S-PA.T-NOS byla odstraněna štěpením A.scI a kazeta AscI ubichitin-P.AT-NOS z pPUN14 byla vložena, čímž vznikl pC.ATll (obr. 15) . pCATll byl transformován do pšenice a kukuřice odborníkovi známými metodami pomocí mikrovláken a ostřelování mikročásticemi. Buňky pak byly přeneseny do média obsahujícího bialofos pro selekci kalusů, které exprimují gen PAT. Kalusy rostoucí ne médiu obsahujícím tento herbicid pak byly testovány pomocí PCR ušitím následujících primerů (sekvence id. č. 33 a 34) pro potvrzení přítomnosti genu GST-27 v kalusu:
5'CCAACAAGGTGGCGCAGTTCA 3'(sekvence id.č. 33) 'CATCGCAAG.ACCGGCAA.CAG 3' (sekvence id. č.34).
Kalusy obsahující expresní kazetu GST-27 byly přeneseny na regenerační médium, kde byly získány rostliny kukuřice. Transformované rostliny kukuřice byly ověřeny, a sice westernovou analýzou celkového proteinu, že konstitutivně exprimují vysokou hladinu genu GST. Pyl těchto rostlin byl přenesen na elitní inbrední linii kukuřice a z tohoto křížení byla získána semena. Pro potvrzení zvýšené tolerance rostlin • · ·· · · > · ·
I · · · · k herbicidu acetochloru byla uvedená semena vyseta do půdy, do které bylo aplikováno mezi 2000 a 8000 g/ha herbicidu. Po vyklíčení a po 7 dnech růstu jsou vzorky semenáčků hodnoceny, jaká mají (pokud vůbec) poškození v důsledku herbicidu ve srovnání se semenáčky z vyrostlých z netransgenního osiva za stejných podmínek. Transgenní semenáčky a netransgenní kontrolní semenáčky pěstované v půdě ošetřené herbicidem a příslušnou zabezpečovací látkou vykazují velmi malé poškození, pokud vůbec, zatímco netransgenní semenáčky pěstované v půdě obsahující herbicid bez zabezpečovací látky vykazují velmi podstatné poškození. Semenáčky, které přežily první aplikaci herbicidu, byly ponechány růst dalších 20 dnů a pak na ně byla postřikem aplikována komerční směs glufosinátu v různých koncentracích obsahujících od 0,1 do 1 % aktivní látky. ' Semenáčky obsahující gen PAT (jehož exprese byla určena metodou, kterou publikovali DeSiock, M. et al., EMBO J.6(9) 2513-2513, 1987) byly buďto zcela rezistentní ke glufosinátu nebo byly relativně tolerantní k herbicidu, což záviselo na aplikované koncentraci, ve srovnání se semenáčky,· které neobsahovaly uvedený gen.
Příklad 8
Příprava rostlin (jednoděložných i dvouděložných) rezistentních ke glvphosatu i ke glufosinauu
Tento příklad ukazuje přípravu rostlin, které jsou rezistentní jak ke glyphosatu tak i ke glufosinátu. Tato vícečetná rezistence k herbicidům je výsledkem křížení první rostliny, která byla geneticky upravena tak, že je rezistentní ke glufosinátu, s druhou rostlinou, která byla geneticky upravena tak, že je rezistentní ke glyphosatu.
• · · 0
0 0 0 I 0 0 * » 0 0 «
000 00« «
00
Příorava konstruktu dPGo nesoucího rezistenci ke alufcs inatu
Vekzor pPG6, založený na vektoru Binl9 odvozený z vektoru pBml9RiPAT, obsahuje kazetu obsahující promotor CaMV 35S řídící gen GUS . mezi promotor a gen GUS je vložen druhý intron genu ST-LS1. Tato sekvence je dlouhá 189 bp, má obsah A/T 80 % a obsahuje typická setřihová místa a stop-kodony ve všech třech čtecích rámcích. Přítomnost intronu zabraňuje expresi GUS v Agrcbacterium tumefaciens, neboť u eukaryot nedochází k sestřihu. Obsahuje také kazezu nesoucí promotor CaMV 355 řídící expresi PAT genu. Mapa pPG6 je ukázána na obr. 16.
Konstrukty nesoucí rezistenci ke glyphosatu
Vektory vhodné pro dvouděložné rostliny byly již výš:
popsány v příkladu 4.
Vektor č.l pro jednoděložné rostliny
Vektor č.l vhodný pro jednoděložné rostliny je plazmid odvozený z plazmidů pUC, který obsahuje jak CTP1 GCX tak i CTP2 EPSPS, v obou případech řízené polyubichitinovým promotorem z kukuřice zesíleným polyubichitinovým intronem 1 z kukuřice. Obsahuje také kazetu nesoucí rezistenci k fos f motricinu.
Plazmid č. 1: Vektor pUBl byl naštěpen Koni a byl do něho vložen linker KpnI-Notl-KpnI (5'catttgcggccgcaaatggta 3', sekvence id. č. 17). Linker EcoRI-Notl-EcoRI (5'AATTCATTTGCGGCCGCAAATG 3', sekvence id. č. 18) byl vložen do EcoRI místa plazmidů DVl-pUC. Výsledný plazmid byl naštěpen Ncol a 5'-přesahující konec byl zaplněn pomocí Klenowova fragmentu DNA. polymerázy I. Lineární vektor byl pak štěpen Notl a fragment Notl s tupými konci byl izolován, tento fragment obsahující sekvence CTP1-GOX a NOS byl ligován • · · · · · • · ···· • · • · · · · a • ···· · ·· · • · · · · · · · · ··« do modifikovaného pUBl naštěpeného Smál a Notl. Linker HindiII-Notl-HindlII (5'AGCTTGCAGCGGCCGCTGCA 3', sekvence id. č. 19) byl vložen do plazmidu a vznikl tak plazmid č. 1.
Plazmid č. 2: Do EcoRI místa plazmidu DV2-pUC (byl izolován i druhý klon neobsahující výše uvedený linker, umožňující tuto klonovací strategii) byl vložen linker EcoRINotl-EcoRI (5'AATTCATTTGCGGCCGCAAATG 3', sekvence id. č. 20). Výsledný plazmid bylnaštěpen Ncola a 5'-přesahující konec byl zaplněn pomocí Klenowova fragmentu DNA polymerázy I. Lineární vektor byl pak štěpen Notl a výsledný fragmenc byl klonován do stejného vektoru (modifikovaný pUBl), který již byl popsán výše, čímž vznikl plazmid č. 2. Kazeta se selektovatelným markérem PAT obsahující promotor CaMV 35S, intron Adhl, gen fosfinotricinacetyltransferázy (PAT) a terminátor nos byla vystřižena z pIE108 a klonována do místa HindlII plazmidu č. 2, čímž vznikla kazeta č. 2. Diagnostická restrikční analýza byla použita k ověření toho, že kazeta PAT je ve stejné orientaci jako kazeta CTP2 EPSPS.
Kazeta nesoucí polyubichitinový promotor a intron, CTP1 GOX a terminátor nos byla vystřižena z plazmidu č. 1 jako fragmenc Notl a ligová do kazety č. 2 naštěpené Notl, čímž vznikl vektor č. 1, nazvaný pMVl (obr. 17), vhodný pro jednoděložr.é rostliny.
Transformace tabáku
Plazmidy pro transformaci dvouděložných rostlin byly vneseny do kmenu LBA4404 Agrobactsrium tumefaciens metodou mrznutí/tání, kterou publikovali Holsters et al.(1978). Rostliny tabáku Nicotiana tabaccum cv. Samsun byly transformovány metodou listových terčíků, kterou popsali Bevan et al. (1984) . Výhonky byly regenerovány na médiu obsahujícím 100 mg/1 kanamycinu. Po zakořenění a selekci byly
• · ·· · · ·· ·· • · · · · · · • ···· · · · · • · · · · ······ • · · · · ·· · · · · · · · rostliny přeneseny do skleníku a dále pěstovány ve světelném režimu 16 hodin světlo/8 hodin tma. Trans formanty pPG6 byly označeny jako linie 35S-PAT.
Transformace kukuřice
Transformace kukuřice byla provedena metodou ostřelování mikročásticemi, kterou popsali Klein et al.(1988). Selekce transformovaného materiálu probíhala na 1 mg/1 bialofosu.
Analýzy rostlin
Polymerázová řetězová reakce (PCR)
Tato analýza byla provedena na všech liniích tabáku,které zakořeňovaly ve tkáňové kultuře a také na všech kalusech kukuřice. DNA. pro tento účel byla extrahována způsobem odborníkovi známým. Primární trans formanty byly analyzovány pomocí následujících oligonuklěotidů:
pDVi TMVI + G0X1 GOX3 + nosí
pDV2 TMVi + EPSPS i EPSPS1 + nos i
pDV3 EPSPS3 + G0X3
P PG 6 35S BARJAP2R
pMVl G0X4 + GGX5 EPSPS4 + EPSPS5 35S + BARJAP2R
Sekvence těchco oligonuklěotidů jsou následující:
TMVI 5 -CTCGAXTATTTTTACAACAATTACCAAC (sekvence id. č. 21)
C-OXi 5 -AATCAAGGTAACCTTGAATCCA (sekvence id. č . 22 )
GOX3 5 -ACCACCAACGGTGTTCTTGCTGTTGA (sekvence id. č . 23)
no s i 5 -GCATTACATGTTAATTATTACATGCTT (sekvence id. č. 24)
EPSPSi 5 -GTGATACGAGTTTCACCGCTAGCGAGAC (sekvence id. č. 25)
EPSPS3 5 -TACCTTGCGTGGACCAAAGACTCC (sekvence id. č. 26)
EPSPS4 5 -ATGGCTTCCGCTCAAGTGAAGTCC (sekvence id. č. 27)
EPSPS5 5 -CGAGACCCATAACGAGGAAGCTCA (sekvence id. č. 28)
GOX4 5 -ATTGCGTGATTTCGATCCTAACTT (sekvence id. č. 29)
• · · · · · · • · · ♦ · · • · · · · ·· ··· ♦· • · ··
GOX5 5 gporos vovogsvrgrogToypQT paVwcp ce id. Č . 3 0 )
35S u -GGTGGAGCACGACACACTTGTCTA (sekven c s id. č 31 )
BARJAP2R 5 -GTCTCAATGTAATGGTTA (sekvence id. č 32
Rostliny pozitivní v PCR byly vybrány pro další analýzy.
Selekce na giyphosatu
Pro tabák ve tkáňové kultuře na médiu obsahujícím glyphosat byla zkonstruována křivka úhynu. To bylo provedeno tak, že stonkový segment dlouhý asi 6 mm nesoucí jednu listovou uzlinu byl vložen do média MS obsahujícího různé koncentrace glyphosatisopropylaminu. Pro každou koncentraci bylo užito 4 až 5 segmentů. Po dvou týdnech byly vyhodnoceny výsledky, které jsou uvedeny v tabulce 2.
Tabulka 2
Křivka úhynu tabáku divokého typu na giyphosatu
Koncentrace isopropylaminglyphosatu (mM) Růst explantátů
0 Dobrý růst stonku, 4-5 nových listů, kořeny - 5 cm
0, 0 0 5 Žádný orgán nerostl
0,011 zz
0,0275 zz
0, 055 //
0, 1 tr
Primární trans formanty pDVl, 2 a 3 byly selektovány růstem na médiu obsahujícím 0,01 a 0,05mM glyphosatisopropyiaminové soli. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 3.
flfl ···· • · · • · · · · • · · · • fl · • fl ··· • fl ··· • · · • · flflfl • · • · flfl · · · • fl ·· • · · • · · • flfl · · · • · ·· flfl
Tabulka 3
Selekce linií tolerantních ke glyphosatu ve tkáňové kultuře
pDVl pDV2 pDV3
Testovány s herbicidem 50 25 50
Tolerantní linie 25 18 20
Selekce na PAT
Regenerované kalusy byly testovány tak, pěstovánv na 1 mct/1 bialořosu.
Westernová analýza
Nadměrná exprese proteinů GOX a EPSPS a příprava protilátek byly provedeny metodami odborníkovi známými. Primární transformanty tabáku byly testovány následujícím způsobem: přibližně 100 mg PVPP se dalo na dno mikrozkumavky Eppendorf. Listové pletivo (4 listové terčíky vyříznuté víčkem zkumavky) bylo vloženo do 0,5 ml extrakčního pufru (50mM Tris-HCl, pH7,8, ImM sodná sůl EDTA, 3mM DTT) se 2 μΐ lOOmM PMSF. Vzorky místnosti pomocí elektrického sekund, pak byl nerozdrcený materiál stlačen zpět do zkumavky a drcení mohlo pokračovat dalších 10 až 15 seh.und, přidaly zyfy rozdrceny v chladové drtiče. Drcení probíhalo dokud materiál nebyl zcela homogenní. Zkumavky pak byly stočeny 15 minut v chladové místnosti, supernatanty přeneseny do čistých zkumavek a až do upotřebení uschovány zamražené při -70 °C. Koncentrace proteinů byla stanovena Bradfordovou metodou. 25 μg proteinu bylo rozděleno na SDS-PAGE elektroforéze a přeneseno blokovací technikou přes noc při 40 mA na membránu Hybond-N. Flitr byl vyjmut z blokovacího zařízení a vložen do 100 ml roztoku lx Tris-sůl, 51 Marvel (sušené mléko) a inkuboval se za současného třepání při • · ·4 4 4 • 4 4 4 4 4 • · 4 4 4 • ··· · ···· • 4 4 4 4 <
44 » 4 4 4 » 4 4 4
444 444
4 • · 44 ·· 444 teplotě místnosti po 45 minut. Pak byl filtr opláchnut třepáním při teplotě místnosti v lx Tris-sůl, 0,1* Tween 20, první promytí 5 minut a druhé promytí 20 minut. Membrána se pak ínkubovaía 2 hodiny při teplotě místnosti nebo přes noc při teplotě 4°C s primární protilátkou. Pak byla membrána promývána při teplotě místnosti v lx T-S, 1% Tween 10 minut až i hodinu. Druhá protilátka (konjugát anti-králičího IgG a peroxidázy) byla použita v ředění 1:10000 a byla inkubována s membránou 1 hodinu při teplotě místnosti. Promývání bylo stejné jako předchozí. Detekce byla provedena pomocí detekční soupravy ECL Amersham. Výsledky westernové analýzy ukázaly celé rozmezí úrovně exprese u linií pDVl a pDV2. Úroveň exprese GOX a EPSPS u linie pDV3 jevila jen malou variabilitu v případě exprese GOX, ale zvýšenou variabilitu v množství EPSPS . Pro další analýzy byly vybrány linie exprimující oba geny.
Kalusy kukuřice byly analyzována stejným. způsobem, kalusy exprimující GOX a EPSPS byly regenerovány na celé rostliny a listové pletivo pak bylo testováno na expresi obou genů.
Test aktivity fosfinotricinacetyltransferázy
Aktivi
PAT bvla měřena Domoci radioaktivně o, macenezo acetvíkoenzymu A (AcetvlCoA).
V listovýc:
extrakt;
při této metodě díky aktivitě PAT značená icetylová skupina přenesena na substrát fosfinotricin (PPT) .
Acetylovaný PPT a i4C migrují odlišně na destičce TLC a lze je připraven listový lOx T50E10 pufr (TE), vizualizovat autoradiograficky. Byl extrakční pufr následujícího složení:
tj. 50 ml 1M Tris-HCl, pH 7,5, 4 ml 0,5M EDTA a 46 ml vody.
Leupeptin byl rozpuštěn v lx TE v koncentraci 15 mg/ml.
Zásobní roztok PMSF o koncentraci 30 mg/ml byl připraven v metanolu. Zásobní' roztok BSA byl 30 mg/ml v TE a použitý ·· ···· ·· ·· • · · · · · • ··· · · · · • · · ··· ··· • · · · • · ··· ·· ·· ·· ···· • · · • · · · «
DTT byl 1M. PPT byl užit jako lmM roztok v TE. Aktivita značeného AcetylCoA byla 58,1 Ci/mmol (Am.ersham) . Extrakční pufr byl připraven smícháním 4315 μΐ dvojitě destilované vody, 500 μΐ ΙΟχ TE, 50 μΐ zásobního roztoku leupeptinu, 25 μΐ zásobního roztoku PMSF, 100 μΐ zásobního roztoku ESA a 10 μι zásobního roztoku DTT (celkový objem 5000 pil) . Listové vzorky odebrané pomocí víčka zkumavky jakožto řezadia byly přeneseny do mikrozkumavky Eppendorf. Vzorky (3 listové terčíky) byly rozdrceny ve 100 μΐ extrakčního pufru pomocí elektrického drtiče v chladové místnosti. Vzorky pak byly 10 minut točeny a 50 μΐ bylo odebráno do čisté zkumavky na ledu. Až do použití byly vzorky skladovány při -70 °C. Pro kvantifikaci proteinů ve vzorcích byla užita Bradfordova metoda. Substrátový roztok byl připraven smícháním 5 objemů značeného AcetylCoA se 3 objemy lmM roztoku PPT. Ke vzorku obsahujícímu přibližně 25 μρ celkového listového proteinu (přibližně 2 μρ/μΐ) se přidaly 2 μΐ substrátového roztoku a směs se inkubovala 30 minut při 37 °C, pak se přemístila na led a tím se zastavila reakce. Vzorky velikosti 6 μΐ se pak nanesly na silikagelovou destičku pro TLC (Sigma T-6770). Vertikální chromatografie byla provedena ve směsi 3:2 isopropanolu a 25% amoniaku po 3 hodiny. Destičky pak byly zabaleny do plastové fólie a exponovány přes noc na film Kodak XAR-5. U všech 26 primárních transformant byla hodnocena aktivita PAT touto analytickou metodou. Následující tabulka 4 uvádí podrobně výsledky této analýzy.
Tabulka 4
Přehledné údaje o aktivitě PAT
A.ktivita PAT Linie pPG6
Vysoká 1,9,11,12,14,21,22,24,25,27,28,30,32
Střední 5,7,10,15,19,20
Nízká 6,2,8
·· ··«·
0· 0000 » 0 0 » *000
0 0 0 · 0 0 0 ··
Test potíráním listu herbicidem
Primární trans formanty 35S-PAT s celým rozsahem aktivity
PAT společně s kontrolními rostlinami byly testovány tak, že jednotlivé listy byly potřeny látkou Challenge. Obě strany označených listů byly potřeny 1% nebo 0,2% roztokem zásobního roztoku (150 g/1) . Po 48 hodinách a po 1 týdnu byly listy hodnoceny a byly odebrány vzorky pro testování aktivity PAT. Výsledky potírání listů herbicidem ukazuje tabulka 5.
Tabulka 5
Výsledky potírání listů herbicidem
Exprese Rostlinná linie 0,2% 0,2% i 1 1%
4 8 h 1 týden 48 h 1 týden
Vysoká 2 4,1,14 bez poškození bez poškození bez poškození bez poškození
Nízká 6, 10 bez poškození odumřelý odumřelý odumřelý
Divoký tvp odumřelý odumřelý o dumř e1ý odumřelý
Test postřikem herbicidu
Glufosinát (Challenge nebo Basta)
Pro rostliny tabáku divokého typu byla připravena křivka závislosti odpovědi na dávce Challenge. Pro každou aplikaci bylo užito 5 rostlin a hodnocení bylo provedeno po 14 dnech. Po té, co byla k dispozici tato křivka, byl proveden test postřikem- Chellenge s vybranými liniemi 35SPAT při použití stejných dávek. Tabulka 6 ukazuje tyto údaje pro dvě linie č.12 a 27. Transgenní rostliny nejevily při těchto dávkách žádné poškození.
4444
4··· • · · • 4 4 4 4 • · • ·
444
44 • · · · · · · • · 4·· · · · · · 4 4 44444· · 4 · · ··· ·· ··
Τ 3 Ό '3 3 Κ 3. Ό
Výsledky testu postřikem na primární trans formanty 35S
dávka Basta divoký typ 35SPATČ.12 35SPATČ.27
% poškození % poškození % poškození
200 g/ha 30 0 0
400 g/ha 40 0 0
600 g/ha 40 0 0
900 g/ha 80 0 0
Křivka úhynu byla připravena pro účinek glyphosatu na tabák divokého typu. Rostliny tabáku divokého typu pěstované ve tkáňové kultuře byly subkultivovány odebráním segmentů stonku a přenesením do čerstvého média, čímž bylo získáno 20 nových rostlin. Ty byly pěstovány jeden měsíc ve tkáňové kultuře a pak byly přeneseny do květináčů (7,6 cm) s kompostem John Innes č. 3. Zpočátku byly pro ochranu přikryty vinou. Po odkrytí byly ponechány aklimatizovat 4 dny před tím, než byl aplikován postřik. Po postřiku bylo veškeré zalévání prováděno jen do podložních misek, tj. žádná voda se nedotkla listů po 5 dnů. Hodnocení proběhlo 8 dnů a 28 dnů po aplikaci. Tabulka 7 ukazuje průměrné procento poškození (každé ošetření bylo ve třech opakováních) v celém rozsahu použitých koncentrací.
Po té, co byla zkonstruována křivka úhynu pro glyphosat, byla řada linií pDVl, 2 a 3 podrobena také postřikovému testu s příslušnými dávkami glyphosatu. Tabulka 3 ukazuje výsledky pro pDV3, přičemž výsledky pro pPVl a pDV2 byly velmi podobné těmto uvedeným pro pDV3.
·· ···· • ft *·· · • · · • · ftftft • · · · • · · ·· ♦ ·* • · · • · · · · • * · · • · · • ft ftftft • ft ·· « · · · • · · · *>·· ··· • · • ft ftft
Tabulka Ί
Závislost odpovědi na dávce pro glyphosat aplikovaný na tabák divokého typu
Ap 1 i ka -ce č. Sloučenina Dávka g/ha Adj uvans Tabák divokého typu
1 Roundup Ultra (USA) 100 „Frigate 73
2 480 g/1 isopropylamin- 200 (K30512) 90
3 glvphosatu 4 00 99
4 (a.e. 36 0- g/1) 800 100
5 LDJW010017 12 0 0 100
6 1600 100
Tabulka 8
Odpověď na dávku u primárních transformant pDV3 ošetřených glyphošatem
1 2 3 . 4 5 6 7
Dávka g/ha 12,33 37 100 300 1000 3000 9000
Divoký typ 2 3 20 80 93
pDV3 č.11 - - 0 0 25 70 80
č . 14 - - 7 22 13 33 76
č.19 - - 0 Q 0 35 8 0
č.21 - - 0 5 0 24 78
Č.31 - - 12 0 4 26 78
č. 34 - - 0 0 6 30 63
č. 36 - - 0 0 0 0 0
č . 37 - - 0 0 9 24 72
č .43 - - 0 0 0 6 73
Č. 44 - - 0 40 45 78 85
č. 4 5 - - 0 0 3 9 70
č. 47 - - 5 0 0 11 72
Č. 60 - - 0 0 0 19 63
č. 64 - - 0 5 0 12 63
• •«to • to ·· ···· • to • · · · · · • · ··· · · ··· • · · · · · · • · ·· · · ·· ··· ·· ··· ·· • ·· · • ·· · to·· ··· • · ·· ··
Segregační analýza
Semena z každé z primárních transformant (pPGo, pDVl, pDV2 a pDV3) byla sterilizována v 10% Domestosu po 10 minut. Po několikerém opláchnutí destilovanou vodou bylo 100 semen pro každou samosprášenou trans formantu vyseto na médium 0,5x MS (2,3 g/1 MS soli, 1,5% sacharóza, 0,8% baktoagar, pH 5,9) obsahující 100 mg/1 kanamycinu. Semenáčky byly hodnoceny po třech týdnech růstu ve 26 °C a světelném režimu 16 hodin světlo/8 hodin tma. Linie segregující v poměru 3:1 nesly pravděpodobně vložený jeden transgen. V případě linií pPG6 linie č. 12, 20 a 27 segregovaly v požadovaném poměru. Linie pDV3 č. 14, 19, 21, 31, 34, 43 a 45 segregovaly v požadovaném poměru.
Příprava homozygotních linií
Ze segregačních testů bylo 10 semenáčků, které nevybledly (heterozygotních nebo homozygotních) přeneseno na čerstvé médium v nádobkách a pěstováno další dva až tři týdny. Po této době byly přeneseny do kompostu JI č.3 ve 31 nádobách a pěstovány až do vykvetení. Semena pak byla znovu testována na médiu 0,5x MS obsahujícím kanamycin pro identifikaci homozygotních linií.
Křížení linií tabáku
Homozygotní linie obsahující pDVl, pDV2 a pDV3, tj . explantáty exprimující geny GOX, EPSPS a GOX/EP3PS byly použity k opylení homozygotní linie pPG6 č.27 exprimující gen PAT. Linie pPG6 byla užita také jako samčí linie.
Analýza transgenních linií kukuřice
Regenerované kalusy byly testovány pomocí PCR s oligonukleotidy popsanými výše, tj. 35S-AlcR, AicA-GOXl
a vnitřními oligonukleotidy pro GOX a EPSPS. Na kalusech pozitivních v PCR byla provedena také westernová analýza, aby bylo možné selektovat kalusy exprimující GOX a EPSPS. Tyto kalusy pak byly regenerovány a výsledné rostliny byly znovu testovány v PCR. Rostliny pak byly zpětně kříženy a také samosprášeny.
Analýza potomstva u tabáku
Exprese GOX, EPSPS a PAT
Všechno potomstvo bylo homozygotní pro oba geny. Semena z každého křížení a od každého rodičovského homozygota byla vyseta a listové pletivo pak bylo odebráno a podrobeno řadě analýz. Proteinové extrakty byly analyzovány westernovým. přenosem a aktivita PAT byla měřena jak již bylo popsáno dříve. Bylo zjištěno, že hladiny exprese GOX a EPSPS a aktivita PAT si byly navzájem velmi podobné v rámci konkrétního křížení a také se podobaly hodnotám homozygotního rodiče. Rostliny pak byly hodnoceny z hlediska vzhledu, výšky, životaschopnosti, růstu atd.
.Aplikace herbicidů
Byly připra’ vény tři rozsáhlé experimenty:
1 . 35S-PAT, pDVl , pDVl-PAT
2 . 35S-PAT, pDV2 , pDV2-PAT
3 . 35S-PAT, pDV3 , pDV3-PAT
Na. linie 35S-P.AT byl aplikován rozsah koncentrací
ufosinatu konkrétní DV byly a byla ošetřeny dávka, kdy byl identifikován v různých okamžicích. Linie tem v rozsahu koncentrací poškození. Linie DV-PAT pak byly a byla stanovena stupeň poškození, ošetřeny glyphosa identifikována míra směsí obou herbicidů s různým poměrem a byla vyhodnocena míra
99 • 9
9 9 9 ·
9 99 9 9 9 9 9
9 9 9 9
9 9 9
9 9 99 9 9 999 poškození. Každá z populací byla ošetřena ve stadiu 5 až 6 listu (5 opakování pro každé ošetření).
Rezistence k napadení patogenem
Linie 35S-PAT, DVÍ, 2 a 3 a DV-PAT exprimující vysoké hladiny každého proteinu a projevující dobrou toleranci k herbicidu byly vystaveny řadě houbových patogenů a pak byla vyhodnocena a porovnána míra infekce.
Analýza potomstva u kukuřice
Semena z křížení primárních transformant byla užita k získání rostlin, ze kterých byly vybrány linie s nejlepší expresí. To bylo provedeno pomocí westernové analýzy hladin exprese GOX a EPSPS a měřením aktivity PA.T, jak bylo již dříve popsáno. Byly také provedeny obdobné pokusy pro stanoveni tolerance k herbicidům glyphosatu a glufosinátu, ať už aplikovanými jednotlivě nebo v různých směsích.
Příklad 9
Příprava rostlin tolerantních k pre-emergentním herbicidům způsobujícím blednutí, tj . fluorochloridonu, norfluorazonu, fluridor.u, flurtamonu a diflufenicanu a ke glyphosatu
Inhibitory desaturázy fytoenu (PDS), tj. fluorochloridon a norfluorazon, představují skupinu herbicidů, které blokují syntézu karotenoidů a vytvářejí proto symptomy blednutí. Gen PDFS (crtl) byl klonován z Erwinia uredovora, nezelené patogenní bakterie způsobující nekrózy, a exprimován v transgenním tabáku (a rajčeti) pomocí plazmidů obsahujícího promotor CaMV 35S a chloroplastový trazitní peptid (pYPIET4)(Misawwa et al., 1993). Homozygotní semena z linie tabáku ET4-208, která nadměrně exprimuje gen crtl byla • · • · · · • · · · » · · · · » · · · · · · · 1 »····* * ’ • fl ··· ·· *·· ·· ·· získána stejně jako rostliny rajčete obsahující konstrukt.
Testy rezistence k herbicidu
Byly testovány sloučeniny podle vzorců I, II a III (uvedené dále). Semena transgenních a kontrolních rajčat (cv. Ailsa Craig) byla vyseta do nádob (7,6 cm) s JIP3, vždy tři semena v nádobě. Každá sloučenina byla formulována ve 4% JF5969 (kromě sloučeniny I, což je komerční prostředek) a postřik v dávce 200 1/ha byl aplikován postřikovačem. Test byl vyhodnocován 13., 20. a 27. den po ošetření (DAT). Existuje zde jasná závislost na dávce u všech ošetření na rajčeti divokého typu, kdy nejvyšší dávky jevily 87 až 100 % fytotoxicitu. Transgenní rajčata jsou vysoce tolerantní ke všem testovaným inhibitorům PDS, přinejmenším až do 1 kg/ha u sloučenin II a III a až do 9 kg/ha u sloučeniny I (víz tab. 9). Obdobné výsledky byly získány pro transgenní tabák.
Pyl z linie DV3 č. 433 (linie rezistentní ke glyphosatu obsahující geny EPSPS a GOX, viz příklad 4) byl obvyklými způsobem přenesen na homozygotní linii ET4-208 a naopak. Semena byla sklizena a použita v testech s herbicidy podobně jak bylo popsáno výše. Semena tabáku byla vyseta do řádek v malých jednotkách den před ošetřením. Každá sloučenina byla formulována ve 4% JF5969 (kromě prostředku Racer, který je komerčně dostupný) a postřik v dávce 200 1/ha byl na jednotky aplikován řádkovým postřikovačem. Test byl vyhodnocován 13., které byly b yiy ρο (7,6 cm) aplikován Hodnocení
20. a 27. den po ošetření (DAT). Semenáčky, tolerantní k herbicidům způsobujícím blednutí, posledním hodnocení přeneseny do nových nádob s kompostem John Innes 111. Po dvou týdnech byl glyphosatový herbicid v dávkách 500 a 800 g/ha. účinku proběhlo 14 a 28 dní po aplikaci (DAT)
Výsledné • · · 0 * · • 0 00 • · « · « • · · · · · · I rostliny byly rezistentní k oběma třídám, a rezistence se dědila Mendelovským způsobem.
herbicidů
T 3. L· u l· k 3. 9
Rytotoxicita 27. den po ošetření (27 DAT)
Ra j če
Látka Dávka (g/ha) Divoký typ Transgenní
Sloučenina II 37 3,3 gg|jÍilB|g
111 13, 3 3, 3
333 20 0
1000 100 3, 3
3000 0
Sloučenina III 37 0
111 8, 3 0
333 56, 7 0
1000 100 10
3000 3,3
Sloučenina I 333 0 0
1000 23, 3 0
3000 100 0
9000 100 0
Sloučenina podle vzorce I:
o
Cl (I) ♦ · * · « ·
♦ · ··♦· I · · » · · · « ·· · · » « · ’ « · · » · ·····< • · » · < 4 9 4 94 94 «· (III)
Příklad 10
Příprava rosclin tolerantních k triketonúm, acetanilidúm a glvphosatu
Pyl z pDV6 Č.71G a pDV3č.l9J byl přenesen na homozygotní linii tolerantní k triketonúm a naopak. Semena z těchto křížení byla sklizena a použita v pokusech s herbicidy. Semena tabáku získaná z křížení DV6/HPPD byla vyseta do řádků v malých jednotkách den před ošetřením. Některé jednotky pak byly ostřeny acetochlorem (75 g/ha), jiné alachlorem (300 g/ha) a další ZA1296 (100 a 300 g/ha) . Hodnocení účinku probíhalo 21. den po aplikaci herbicidu (21 DAT). Výsledky ···· > · · · · » · · » · « ·· «·· ·· ·· » · · « F · · « • · · · · « hodnocení jsou uvedeny v následující tabulce, kde je uvedena fytotoxický účinek 21. den.
Divoký typ Divoký typ DV6/HPPD DV6/KPPD
Látka Dávka (g/ha) opakování 3 opakování b opakování a opakování b
Acetochlor 75 40 100 0 0
A.lachlor 300 80 90 0 0
ZA1296 100 90 95 10 0
300 100 100 0 0
Semenáčky, které přežily ošetření ZA129S v dávce 300 g/ha byly ošetřeny postřikem glyphosatu v dávce 800 g/ha a projevily toleranci i k této aplikaci.
• fe ·· » · · <
» · · ’ • « · · · ·
• < fe · ·
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) (B) (C) (D) DÉLKA: 1020 párů baží TYP: nukleová kyselina TYP VLÁKNA: dvojité
TOPOLOGIE: lineární
ii) TYP MOLEKULY: DNA
iii) HYPOTETICKÁ: ne
(iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Synechocystis sp. PCC6803 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..1020 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
ATG Met τ. GAA Glu TTC Phe GAC Asp TAT Tyr 5 CTT Leu CAT His TTA Leu TAC Tyr GTT Val 10 GAC Asp GAT Asp TAT Tyr CAG Gin TCA Ser 15 GCT Ala 48
CAT CGT TGT TAT CAA CGT TGG GGT TTC ACT TGC GTA AAT AAA ATT 96
His Arg Cys Tyr Gin Arg Gin Trp Gly Phe Thr Cys Val Asn Lys Ile
20 25 30
ATT ACT GAC CGA GGA ATT ACT GGC ATC TAC CAA CAG GGG CAA ATA CTT 144
Ile Thr Aso Gin Gly Ile Thr Gly Ile Tyr Gin Gin Gly Gin Ile Leu
35 40 45
CTG CTA ATT TGG GCA TCG GAA TCT AGT TTG AGT AGA TAT GCC GAC TAT 192
Leu Leu Ile Ser Ala Ser Glu Ser Ser Leu Ser Arg Tyr Ala Asp Tyr
50 55 60
CTC CAG AAA CAT CCC CCC GGC GTA GGT GAA GTG GCT TGG CAG GTG GCC 240
Leu Gin Lys His Pro Pro Gly Val Gly Glu Val Ala Trp Gin Val Ala
65 70 75 80
AAT TGG CAA AAA ATT CAG CAT CAA TTA TCA GAA TTA CAG ATA GAA ACC 238
Asn Trp Gin Lys Ile Gin His Gin Leu Ser Glu Leu Gin Ile Glu Thr
85 90 95
ACA CCA GTT ATT CAT CCT CTG ACT AAA
Thr Pro Val Ile His Pro Leu Thr Lys
100 105
CTC i Gaj GGA GA. í GTG CAC CAT AGC ATT
Leu Trp Glv Asp Val His His Ser Ile
115 120
AAT CAG AA7 AAA ACA TTG CAT GGT GTT
Asn Gin Asn Lys Thr Leu His Gly Val
130 135
GTG G i G CTA AAC ATT GCC G'_C GAT CAA
Val Val Leu Asn τ 2. s Ala Ala Asp Gin
145 150
TAT CAA CAG GTG TTT GGG TGG TGG GTG
Tyr Gin Gin Val Phe Gly Trp Ser Val
165
ACG CCC CAT TCT GCT CTG TAT AGC GAA
Thr Pro His Ser Gly Leu Tyr Ser Glu
ISO 185
AAA GTC CAA TTT AAC CTC AAT TGT CCC
Lys Val Gin Phe Asn Leu Asn cys Pro
195 200
CAA ACT TTT TA GCC AAT AAC CAT GGG
Gin Thr Phe Leu Ala A.sn Asn His Gly
210 215
TCC ACT ACG AGT ATT ACG CGA ACT
Phe Ser Thr Thr Ser Ile Thr Arg Thr
225 230
GGC GTA AAT TTT TTA AAA ATC CCC ACT
Gly Val Asn Phe Leu Lys Ile Pro Thr
245
AAC AGT AGC TAT TTT AAT TAT GCA AG
Asn Ser Ser Tyr Phe Asn Tyr Ala Ser
260 265
TGC CTA GAA ATT TTG CTG GAT GAT CAA
Cys Leu Glu Ile Leu Leu Asp Asp Gin
275 280
CTG CTA CAA ATT TTT AGT CAG CCT TGC
Leu Leu Gin Ile Phe Ser Gin Pro Cys
290 295
TGG GAA ATT ATT GAA CGC CGC CAC CGG
Trp Glu Ile Ile Glu Arg Arg His Arg
305 310
AAC TTT CAA GCT CTC TAT GAA GCG GTG
Asn Phe Gin Ala Leu Tyr Glu- Ala Val
325
GAA GTG CCA TAA
Glu Val Pro
65 • · • · • · • · • fc • fc • fcfc · • • fcfc • • • · · • « • · • · fcfc · • · • · • fcfc · · · • · • fcfc · • · fcfc fc fcfcfc ··
GCA GAA GGA TTA ACT TTT TTG 336
Ala Glu Gly Leu Thr 110 Phe Leu
TAT CCT .GTT CGT TCT GAG CTA 384
Tyr Pro Val Arg Ser 125 Glu Leu
GGT TTA ACG ACC ATC GAC CAT 432
Gly Leu Thr Thr Ile 140 Asp His
TTT ACC CAG GCT TCC CAA TGG 480
Phe Thr 155 Gin Ala Ser Gin Trp 160
CAG CAG AGT TTT ACT GTC AAT 528
Gin Gin 170 Ser Phe Thr Val 175 Asn
GCC CTG GCC AGT. GCC AAT GGG 576
Ala Leu Ala Ser Ala 190 Asn Gly
ACC AAT AAC AGT TCC CAA ATT 624
Thr Asn Asn Ser Ser 205 Gin Ile
G<. i GGT ATT CAA CA GTC GGT 672
Ala Gly Ile Gin His 220 Val Ala
GTG GCT CAT CTG CGG GAA AGG 720
Val Ala 235 His Leu Arg Glu Arg 240
GGC TAT TAT CAA CAG CAA AGA 768
Gly Tyr 250 Tyr Gin Gin Gin 255 Arg
TTG GAT TGG GAT ACC TTA CAG 816
Leu Asp Trp Asp Thr 270 Leu Gin
GAT AAT ACG GGG GAG CGA TTA 864
Asp Asn Thr Gly Glu 285 Arg Leu
TAT GGA GTA GGC ACT CTA TTT 912
Tyr Gly Val Gly Thr 300 Leu Phe
GCA AAA GGA TT GGT CAA GGA 960
Ala Lys 315 Gly Phe Gly Gin Gly 320
GAG ACT TTA GAA AAA CAG TTA 1008
Glu Thr 330 Leu Glu Lys Gin 335 Leu 1020
• · · · • · · · · · • · · « ······ • · · · · β« · · · ·.· ··
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 339 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
Met 1 Glu Phe Asp Tyr 5 Leu His Leu Tyr Val 10 Asp Asp Tyr Gin Ser 15 Ala
His Arg Cys Tyr Gin Arg Gin Trp Gly Phe Thr Cys Val Asn Lys Ile
20 25 30
Ile Thr A.s o Gin Gly Ile Thr Gly Ile Tyr Gin Gin Gly Gin Ile Leu
35 4 0 45
Leu Leu Ile Ser Ala Ser Glu Ser Ser Leu Ser Arg Tyr Ala Asp Tyr
50 55 60
Leu Gl.n Lys His Pro Pro Gly Val Gly Glu Val Ala Trp Gin Val Ala
65 70 75 80
Asn Trp Gin Lys Ile Gin His Gin Leu Ser Glu Leu Gin Ile Glu Thr
85 90 95
Thr Pro Val Ile His Pro Leu Thr Lys Ala Glu Gly Leu Thr Phe Leu
100 105 110
Leu Trp Gly Asp Val His His Ser Ile Tyr Pro Val Arg Ser Glu Leu
115 120 125
Asn Gl.n Asn Lys Thr Leu His Gly Val Gly Leu Thr Thr Ile Asp His
130 135 140
Val Val Leu Asn Ile Ala Ala Asp Gin Phe Thr Gin Ala Ser Gin Trp
145 150 155 160
Tyr Gin Gin Val Phe Gly Trp Ser Val Gin Gin Ser Phe Thr Val Asn
165 170 175
Thr Pro His Ser Gly Leu Tyr Ser Glu Ala Leu Ala Ser Ala Asn Giv
180 185 190
Lys Val Gin Phe Asn Leu Asn Cys Pro Thr Asn Asn Ser Ser Gin Ile
195 200 205
Gin Thr Phe Leu Ala Asn Asn His Gly Ala Gly Ile Gin His Val Ala
210 215 220
Phe Ser Thr Thr Ser Ile Thr Arg Thr Val Ala His Leu Arg Glu Arg
225 230 235 240
Gly Val Asn Phe Leu Lys Ile Pro Thr Gly Tyr Tyr ' Gin Gin Gin Ar-
245 250 255 ttt ttt
Asn Ser Ser Tyr Phe Asn Tyr Ala Ser Leu Asp Trp Asp Thr Leu Gin
260 265 270
Cys Leu Glu 275 Ile Leu Leu Asp Asd 280 Gin Asp Asn Thr Gly 285 Glu Arg Leu
Leu Leu Gin Ile Phe Ser Gin Pro Cys Tyr Gly Val Gly Thr Leu Phe
290 295 300
Trp Glu Ile Ile Glu Arg Arg His Arg Ala Lys Gly Phe Gly Gin Gly
305 310 315 320
Asn PSe Gin Ala Leu Tyr Glu Ala Val Glu Thr Leu Glu Lys Gin Leu
325 330 335
Glu Val Pro (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A.) DÉLKA: 2582 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Pseudomonas fluorescens (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1217..2290 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
ATTAGTCGAA GAATATGCCC ATCCTGTCGC CTGTCGAGCA ACTGCTAATG CAACCTCCGT 60
CTGATCGCCT CACCTACCTG AAGCTGGCCG CTGTGACCAT GATTTGGGGT GGCACTTTTG 120
TCGCCGGACG TTACCTGACC AATCAAGTCG ACCCGCTGCT GGCCGCCAGC CTGCGGTTTA 180
TCCTGGCCAG CCTGGCGCTG CTGCTGTTTA TGCTGTGTGC ACGCATCCCG CTGGCGCGGC 240
CACGTCCCCG GCAACTGCTG CATCTGGCGG TGCTGGGGTT TTTCGGGATC TTTTTCTACA 300
A.CCTGTGTTT TTTCTACGGC CTGCAGTACA TCAACGCCTC GCGCGCTTCG TTGATCGTGG 360
CGTTGAATCC GGCGGTGATC GGCCTGGCTT CCTGGTGGTT GTTCAAAGAG CGCCTCGGCA 420
CTGCCAGGGT GCTGGGTATC GCGTTGTGCC TGGCCGGCGC TGCGACGGTG ATCGTCAGTC 480
GCAACCCGCA GTTGCTGCAA GGTGCATCGA GTACCTGGCA GGGCGACCTG CTGGTGTTCG 540
GCTGTGTGCT GGGGTGGGGG ATTTACTCGT TGTTTTCCCG CGCATTGAAT CAAAGCCTGG 600
GGCCGTTGCA AACGGTCACC TGGTCAGTGC TGCTGGGCAC CCTGATGCTG ACGGCTGTCA 660
CCGCGCTCGC CGGGCGCTTC ACGCTTGCAG GGCTTGGCAG CCTGCACCTG CCGCAGGTTG 720
TGAGCCTGTT GTATTTGGGC GTGCTCGGCT CCGCGCTGGC GTACATCGGC TATTACGATG 780
GCATCCGGCG TATCGGCGCG ACCCGCGCAG GCGTGTTTAT CGCGCTGAAC CCGCTGACGG 840
CGGTGATCTG CGGCGCGCTG CTGCTTGGCG AACAGCTAAC GTTACCCATG GCGCTCGGCG 900
GCGCGGTGAT CCTGTTGGGC ATCTATCTGT GCAACAAACC CCTTGCGCAG CCCAGCGCAA 960
TAGGGATTTG ATGAGAGTGC GGACAAATAC TGTTACGCTG TGTAGAATCG ATTTACGCAT 1020
ACAAGAATAT GGACTTGCGC TCACGCAAGC CTCGGCCGTC AGAGACTGAT GTAATCATGA 1080
AGCTACTCGG CTCCCCCCTG ATCTTTGGTG ACTTCCTCGC GCGCAGCGTG CGGGGTCTCT 1140
CGTGCGCGCC ACCCTGCAAC CTCATCCTTG CCTGTAATTG ACTGCTTGCT ACTTACAAGA 1200
ATGATGAGGT GCCGAA ATG Met 1 GCC GAC CAA Ala Asp Gin . TAC GAA AAC CCA ATG GGC CTG , Tyr Glu Asn Pro Met Gly Leu 5 10 1249
ATG Met GGC Gl y TTT GAA TTT Phe ATT Ile GAA Glu TTC Phe GCA Ala 20 TCG Ser CCG Pro ACT Thr CCG Pro GGC Gly 25 ACC Thr CTG Leu 1297
Phe Glu 15
GAG CCG ATC TTC GAG ATC ATG GGC TTC ACC AAA GTC GCG ACC CAC CGC 1345
Glu Pro Ile Phe Glu Ile Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg
30 35 40
TCC AAG AAT GTG CAC CTG TAC CGC CAG GGC GAG ATC AAC CTG ATC CTC 1393
Ser Lvs Asn Val His Leu Tyr Arg Gin Gly Glu Ile Asn Leu Ile Leu
4 5 50 55
AAC AAC CAG CCC GAC AGC CTG GCC TCG TAC TTC GCC GCC GAA CAC GGC 1441
Asn Asn Gin Pro Asp Ser Leu Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly
60 65 70 75
CCT TCG GTG TGC GGC ATG GCG TTC CGG GTC AAA GAC TCG CAG CAG GCT 1489
Pro Ser Val Cys Gly Met Al a Phe Arg Val Lys Asp Ser Gin Gin Ala
* 80 85 90
TAC AAC CGC GCG TTG GAA CTG GGC GCC CAG CCG ATT CAT ATC GAA ACC 1537
Tyr Asn Arg Ala Leu Glu Leu Gly Ala Gin Pro Ile His Ile Glu Thr
95 100 105
GGC CCG ATG GAA CTC AAC CTG CCG GCC ATC AAG GGC ATC GGC GGT GCG 1585
Gly Pro Met Glu Leu Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala
110 115 120
CCG CTG TAC CTG ATC GAC CGC TTC GGT GAA GGC AGC TCG ATA TAT GAC 1633
Pro Leu Tyr Leu Ile Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Asp
125 130 135
ATC GAC TTC GTG TAC CTC GAA GGT GTC GAC CGC AAC CCG GTA GGC GCG 1681
Ile Asp Phe Val Tyr Leu Glu Gly Val Asp Arg Asn Pro Val Gly Ala
140 145 150 155
• · « • · « • · · · · ι k · ··· » · « » · · • · · · ·
GGC Gly CTC Leu AAG Lys GTC Val ATC Ile 160 GAC Asp CAC His CTG Leu ACC Thr CAC His 165 AAC Asn GTG Val TAT Tyr CGC Arg GGC Gly 170 CGC Arg 1729
ATG GCC TAC TGG GCC AAC TTC TAC GAG AAA CTG TTC AAC TTC CGT GAA 1777
Met Ala Tyr TrD 17 5 Ala Asn Phe Tyr Glu 180 Lys Leu Phe Asn Phe 185 Arg Giu
GCA CGC TAC TTC GAT ATC AAG GGC GAA TAC ACC GGC CTT AGG TCC AAG 1825
Ala Arg Tyr Phe Asp Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys
190 195 200
GCC ATG AGT GCC CCG GAC GGC ATG ATC CGC ATC CCG CTG AAC GAG GAA 1873
Ala Met Ser Ala Pro Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu
205 210 215
TCG TCC AAG GGC GCC GGC CAG ATC GAA GAG TTC CTG ATG CAG TTC AAC 1921
Ser Ser Lys Gly Ala Gly Gin Ile Glu Glu Phe Leu Met Gin Phe Asn
220 225 230 235
GAG GGC ATC CAG CAC GTG GCG TTC CTC ACC GAA GAC CTG GTC AAG 1969
Gly Glu Gly Ile Gin His Val Ala Phe Leu Thr Glu Asp Leu Val Lys
240 245 250
ACC TGG GAT GCG TTG AAG AAG ATC GGC ATG CGC TTC ATG ACC GCG CCG 2017
Thr Trp Asp Ala Leu Lys Lys Ile Gly Met Arg Phe Met Thr Ala Pro
255 260 265
CCG GAC ACC TAC TAC GAA ATG CTC GA.A GGC CGC CTG CCA AAC CAC GGC 20 65
Pro Asp Thr Tyr Tyr Glu Met Leu Glu Gly Arg Leu Pro Asn His Gly
270 275 280
GAG CCG GTG GAC CAA CTG CAG GCG CGC GGT ATT TTG CTG GAC GGC TCC 2113
Glu Pro Val Asp Gin Leu Gin Ala Arg Gly Ile Leu Leu Asp Gly Ser
285 290 295
TCG ATC GAG GGC GAC AAG CGC CTG CTG CTG CAG ATC TTC TCG GAA ACC 2161
Ser Ile Glu Gly Asp Lys Arg Leu Leu Leu Gin Ile Phe Ser Glu Thr
300 305 310 315
CTG ATG GGC CCG GTG TTC TTC GAA TTC ATC CAG CGC AAA GGC GAC GAT 2209
Leu Met Gly Pro Val Phe Pne Glu Phe Ile Gin Arg Lys Gly Asp Asp
320 325 330
GGG TTT GGC GAG GGC AAC TTC AAG GCG CTG TTC GAG TCG ATC GAG CGC 2257
Gly Phe Gly Glu Gly Asn Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ser Ile Glu Arg
335 340 345
GAC CAG GTA CGT CGC GGT GTA CTG ACC ACC GAC TAAGCGTCAG CAACAAAAAA 2310
Asp Gin Val Arg Arg Gly Val Leu Thr Thr Asp
350 355
AGCCCGGCGA GAAGGTTTTC AGCCGGGCTT TTTAGTGCCT GCACGTTTTA AGCTTTGCGC 2370
TGACGCACCA AATGTTTGAA GCCTTCATAC ACCAGCACCA TCACGGCCAG CCAGATCGGG 2430
ATATACGTCA GCCATTGCCC GCCCTTGATG CCTTCGCCCA ACAACAAGGC CACAAAGAGC 2490
AGTAATACCG GCTCCACATA GCTGAGCAAC CCGAACAGGC TAAAGGCCAA TAAACGGCTG 2550
GCGATGATGT AGCTCACCAG CGCTGAAGCA CT 2582 • ·· ·· • · · • · · « • · ··· · · ’ • · · » · · ·· • · · · • · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 358 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
Met Ala Asp Gin Tyr Glu Asn Pro Met Gly Leu Met Gly Phe Glu Phe
1 5 10 . 15
Ile Glu Phe Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Leu Glu Pro Ile Phe Glu
20 25 30
Ile Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg Ser Lys Asn Val His
35 40 45
Leu Tyr Arg Gin Gly Glu Ile Asn Leu· Ile Leu Asn Asn Gin Pro Asp
50 55 60
Ser Leu Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly Pro Ser Val Cvs Gly
65 70 — 75 80
Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gin Gin Ala Tyr Asn Arg Ala Leu
85 90 95
Glu Leu Gly Ala Gin Pro Ile His Ile Glu Thr Gly Pro Met Glu Leu
100 105 110
Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu Ile
115 120 125
Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Asp Ile Asp Phe Val Tyr
130 135 140
Leu Glu Gly Val Asp Arg Asn Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Val Ile
145 150 155 160
Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Ala Tyr Trp Ala
165 170 175
Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ala Arg Tyr Phe Asp
180 185 190
Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Ser Al a Pro
195 200 205
Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu Ser Ser Lys Gly Ala
210 215 220
Gly Gin Ile Glu Glu Phe Leu Met Gin Phe Asn Gly Glu Gly Ile Gin
225 230' 235 240
His Val Ala Phe Leu Thr Glu Asp Leu Val Lys Thr Trp Asp Ala Leu
245 250 255
Lys Lys Ile Gly Met Arg Phe Met Thr Ala Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr
260 265 270
Glu Met Leu Glu Gly Arg Leu Pro Asn His Gly Glu Pro Val Asp Gin
275 280 285
Leu Gin Ala Arg Gly Ile Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ile Glu Gly Asp
290 295 300
Lys Arg Leu Leu Leu Gin Ile Phe Ser Glu Thr Leu Met Gly Pro Val
305 310 315 320
Phe Phe Glu Phe Ile Gin Arg Lys Gly Asp Asp Gly Phe Gly Glu Gly
325 330 335
Asn Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ser Ile Glu Arg Asp Gin Val Arg Arg
340 345 350
Gly Val Leu Thr Thr Asp
355 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
TATGAGAATC CTATGGG ····
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARA.KTERI ŠTIKA. SEKVENCE:
(A) DÉLKA.: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTA.CE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
GCTTTGAAGT TTCCCTC (2) INFOBMLACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA.: 4 6 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
GTTAGGTACC AGTCTAGACT GACCATGGCC GACCAATACG AAAACC ···· ft · · • ft ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 43 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis. = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
TAGCGGTACC TGATCACCCG GGTTATTAGT CGGTGGTCAG TAC 43 (2) INFOPMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 516 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xí) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
Met 1 Ala Gin Ile A.sn 5 A.sn Met Ala Gin Gly 10 Ile Gin Thr Leu Asn 15 Pro
Asn Ser Asn Phe 20 His Lys Pro Gin Val 25 Pro Lys Ser Ser Ser 30 Phe Leu
Val Phe Gly 35 Ser Lys Lys Len Lys 40 Asn Ser Ala Asn Ser 45 Met Leu Val
····
Leu Lys 50 Lys Asp.Ser Ile Phe 55 Met Gin.Lys Phe Cys 60 Ser Phe Arg Ile
Ser Ala Ser Val Ala Thr Ala Gin Lys Pro Ser Glu Ile Val Leu Gin
65 70 75 80
Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly Thr Val Lvs Leu Pro Gly Ser Lys Ser
85 90 95
Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr
100 105 110
Val Val As o Asn Leu Leu Ser Ser Asp Asp Ile His Tyr Met Leu Gly
115 120 125
Ala Leu Lys Thr Leu Gly Leu His Val Glu Glu Asp Ser Ala Asn Gin
130 135 140
Arg Ala Val Val Glu Gly Cys Gly Gly Leu Phe Pro Val Gly Lys Glu
145 150 155 160
Ser Lys Glu Glu Ile Gin Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met
165 170 175
Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr Val Ala Gly Gly Asn Ser Arg Tyr
180 185 190
Val Leu Aso Gly Val Pro Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Ser Asp Leu
195 200 205
Val Asp Gly Leu Lys Gin Leu Gly Ala Glu Val Asp Cys Phe Leu Gly
210 215 220
Thr Lys Cys Pro Pro Val Arg Ile Val Ser Lys Gly Gly Leu Pro Gly
225 230 235 240
Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser Ile Ser Ser Gin Tyr Leu Thr Ala
245 250 255
Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile
260 265 270
Ile Asp Lys Leu Ile Ser Val Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Lys ( Leu
275 280 285
Met Glu Arg Phe Gly Ile Ser Val Glu His Ser Ser Ser Trp Asp Arg
290 295 300
Phe Phe Val Arg Gly Gly Gin Lys Tyr Lys Ser Pro Gly Lys Ala Phe
305 310 315 320
Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala
325 330. 335
Val Thr Gly Gly Thr Ile Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Asn Ser Leu
340 345 350
Gin Gly Asd Val Lys Phe Ala Glu Val Leu Glu Lys Met Gly Ala Glu
355 360 365
Val Thr Trp Thr Glu Asn Ser Val Thr Val Lys Gly Pro Pro Arg Ser
375 380 • 9
9999 •9 9·9« » · 9 » 9 9 9 9
999
9 99 9
Ser 385 Ser Gly Arg Lys His 390 Leu Arg Ala Ile Asp 395 Val Asn Met Asn Lys 400
Met Pro Asp Val Ala 405 Met Thr Leu Ala Val 410 Val Ala Leu Tyr Ala 415 Asp
Gly Pro Thr Ala 420 Ile Arg Asp Val Ala 425 Ser Trp Arg Val Lys 430 Glu Thr
Glu Arg Met Ile Ala Ile Cys Thr Glu Leu Arg Lys Leu Gly Ala Thr
435 440 445
Val Glu 450 Glu Gly Pro Asp Tyr 4 55 Cys Ile Ile Thr Pro 460 Pro Glu Lys Leu
Asn 465 Val Thr Asp Ile Aso 4 70 Thr Tyr Asp Asp His 475 Arg Met Ala Met Ala 430
Phe Ser Len Ala Ala 485 Cys Ala Asp Val Pro 490 Val Thr Ile Asn Asp 495 Pro
Gly Cys Thr Arg 500 Lys Thr Phe Pro Asn 505 Tyr Phe Asp Val Leu 510 Gin Gin
Tyr Ser Lys His 515 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 10:
AACAAGGTGG CGCAGTT ···· • · ♦
0 ··<
0 ·
0 00 ·»»
00 0 0 0 0
0 0 ·
000 000 0 0
0« 0« (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 11:
CATCGCAAGA CCGGCAACAG 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (n) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 12:
GATCGCTACT AGCTTCCCA ···· • · · • · ··· • « · · · • · · ·· ··· • « · • · ··· *» · » • · · ·· ··· ···* ·· ·· • · · 4 • · · 4 «·· ··· • · ·· ·»
2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTAjCE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 13:
AATCAAGGTA ACCTTGAATC CA 2 2 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 14:
AATTACGGAA GCTTCCGT ·· ···« ·· ··*· ·· · · ··· · · · ···· • · ··· · · ··· · · · · • C 9 9 9 9 99 999999
9 9 9 9 9 9 9
999 99 999 99 99 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA.: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 15:
AGCTTGTACA CCGGTGTACA 2 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 16:
CGGACAATTA ATTGTCCGGT AC • · · · · · • · • ···· · ···· · ·· * φ · ··· · · · ······ • · e · · · · · • · ·· · ·· ··· ·· ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYF: nukleová kyselina (C) TYP VLÁUCNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(Á) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 17;
CATTTGCGGC CGCAAATGGT AC 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. 0. 18:
AATTCATTTG CGGCCGCAAA TG
80 flfl · · · · fl · · • · · · * • · fl · • · · • » · · • · flflfl· flfl · · • · · ♦ · fl · • ···· · flfl · • < ·· ··· ··· • · fl flfl ·· flflfl flfl ··
INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19 :
(i) CHARAKTERISΤIPDA SEKVENCE : (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární
(11) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer
(iii ) HYPOTETICKÁ: ne
(iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne
(vi) PŮVODNÍ ZDROJ: (A) ORGANISMUS: primer
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 19 :
AGCTTGCAGC GGCCGCTGCA 20
INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20 :
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer
(111 ) HYPOTETICKÁ: ne
(iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne
(Vi) PŮVODNÍ ZDROJ: (A) ORGANISMUS: primer
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 20:
AATTCATTTG CGGCCGCAAA TG • 9 9 9 9 9
• · · 9 · 9 • · · • · 9 · · • · 4 • 4 · • « · · · • · « 4 » · · 4 » · · 4
9 4 99<
(2) INFOFRLACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA,: 28 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi)·POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 21:
CTCGAGTATT TTTACAACAA TTACCAAC 2 8 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁ2KNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (n) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /'popis = „primer (m) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 22:
AATCAAGGTA ACCTTGAATC CA • ·
ΒΒΒΒ t« · · • Β • Β
Β Β BBB · · ··· · · · · ·· · Β · B BB BBB BBB
BB ΒΒΒ Β Β B
BB BBB BB BBB BB BB (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 23:
ACCACCAACG GTGTTCTTGC TGTTGA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (ni) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 24:
GCATTACATG TTAATTATTA CATGCTT • β · · • · • · ··· · · ··· · · « · . · a < · · ·· ······ ······ · · • · · · a ·· ··· «· · a (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 28 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNO.: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 25:
GTGATACGAG TTTCACCGCT AGCGAGAC 28 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A.) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 26:
TACCTTGCGT GGACCAAAGA CTCC
4 • · • · · · · « • · · ··· · · · 0 • ···· · · ··· · · · 0
0··· · · ··· *00 ······ · · • * · · 0 «0 · <· * · · · 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 27:
ATGGCTTCCG CTCAAGTGAA GTCC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:
(i) CHARAKTERISTIKA. SEKVENCE:
(A) DÉLKA.: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne ívi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 28:
CGAGACCCAT AACGAGGAAG CTCA
4 • · • · · · • · • · · «·· · · · · • « · ·· · ···· · · · · • · ··· · · * ······ ····«· · · • · ··· · · · ·· · · · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA.: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA.: j e dno du c h é (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A.) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ.: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 29:
ATTGCGTGAT TTCGATCCTA ACTT 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKA.ČNÍM ČÍSLEM 30:
(i) CPLARAKTERIŠTIKA. SEKVENCE :
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A.) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A.) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 30:
GAGAGATGTC GATAGAGGTC TTCT
4 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ. ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 31:
GGTGGAGCAC GACACACTTG TCTA 2 4 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „primer
Iii) 1 HYPOTETICKÁ.: ne
iv) OPAČNÁ ORIENTACE : ne
vi ) ' PŮVODNÍ ZDROJ: (A) ORGANISMUS: primer
xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID
GTCTCAATGT AATGGTTA

Claims (26)

  1. l·. Polynukleotid, který obsahuje alespoň první úsek kódující první protein schopný udělit rostlině nebo pletivu, které ho obsahují, rezistenci nebo toleranci k prvnímu herbicidu, a druhý úsek kódující druhý protein obdobně schopný udělit rostlině rezistenci k druhému herbicidu, a to za podmínek, že (I) polynukleotid nekóduje fůzní protein obsahující pouze 5-enolpyruvyl-3-fosfošikimátsyntetázu (EPSPS) a glutathion-S-transferázu (GST), (II) polynukleotid neobsahuje pouze úseky kódující a glutathion-S-transferázu (GST) neobsahuje pouze úseky kódující acetyltransferázu (PAT).
    superoxiddismutázu (SOD) a (III) polynukleotid GST a fosfinotricin^oiynukieotid podJ naroxu kde ;re:
    A. CL A < A tt i i V z ussku ]e řízena promotorem aktivní v rostlině.
    terminátorem, které jsou
  2. 3. Polynukleotid podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde první herbicid je post-emergentní herbicid a druhý herbicid je pre-emergentní herbicid.
  3. 4. Polynukleotid podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde proteiny jsou vybrány ze skupiny obsahující glyphosatoxidoreduktázu, 5-enolpyruvyl-3-fosfošikímá-syntetázu, fosfionotricinacetyltransferázu, hydroxyfenylpyruvatdroxygenazu, glutathion-S-transferázu, cytochrom P450, acetylkoenzym-A-karboxylázu, acetolaktátsyntázu, protoporfyrinogenoxidázu, dihydropteroátsyntázu, polyaminové transportní proteiny, superoxiddismutázu, bromoxynilnitrilázu, fytoendesaturázu, produkt genu tfdA získatelného • · • · · ··· z Alcaligenes eutrophus, a známé mutované nebo jinak modifikované varianty uvedených proteinů.
    Lokoliv z nároků 1 až 4, protein schopný poskytnout k hmyzu, vysýchání a/nebo infekcím.
  4. 5. Polynukleotid podle kteréh který dále obsahuje úsek kódující rostlině rezistenci nebo toleranci houbovým, bakteriálním nebo virovým
  5. 6. Polynukleotid podle kteréhokoliv z předchozích nároků, který obsahuje 5'-koncové sekvence souvisle sousedící s uvedenými úseky, kteréžto sekvence kódují (I) peptid schopný směrovat translační produkty úseků do plastidů jako např. chloroplastů, mitocnondrií, jiných organel nebe buněčné stěny a/nebo (II) netranslatované sekvence zesilující translaci .
  6. 7. Polynukleotid podle kteréhokoliv z předchozích nároků, který je modifikován tak, že jsou odstraněny motivy nestability mRNA a/nebo náhodná sestřihová místa, nebo jsou užity kodony přednostně užívané rostlinami, takže exprese takto modifikovaných polynukleotidů v rostlinách vede k produkci podstatně podobných proteinů s podstatně podobnou aktivitou/funkcí těm proteinům, které jsou získány expresí nemodifikovaných polynukleotidů v organismu, ve kterém jsou úseky nemodifikovaného polynukleotidů kóduj.ící protein endogenními, a to za předpokladu, jestliže takto modifikovaný polynukleotid obsahuje kodony přednostně užívané rostlinami, stupeň identity mezi úseky kódujícími protein v modifikovaném polynukleotidů a obdobnými úseky kódujícími protein endogenně obsaženými v dané rostlině a kódujícími v podstatě identický protein je menší než asi 70%.
    • · · · · · • · • · · · • · • · > · « « · · <
    » · · <
    ·* ·♦· ·· • · · · • « • fl » ···
  7. 8. Polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 3 až 7, kde pre-emergentní herbicidy je možné vybrat obsahující dinitroanilinové herbicidy, ze skupiny difenyléter, sulfonylmočovinu, fosfosulfonáty, oxyacetamidy, tetrazclinony a N-karbamoyltetrazolinony, imidazolinony, thiokarbamát, triazin, triazolopyrrmidiny, uráčil, fenylmočovinu, triketon, isoxazoi,acetanilid, oxadiazol, triazicnon, sulfonanilid, amid, anilid, RP201772, flurocnloridon, norflurazon a herbicidy tatrazolinonovéno typu, a post-emergentní herbicidy jsou vybrány ze skupiny obsahující glyphosat a jeho soli, glufosinát, asulam, bentazon, bialafos, bromacil, sethoxydim a další cyklohexandiony, dicamba, fosamin, flupoxam, fenoxyprionát, quizalofop a další aryloxvfenoxypropanoáty, picloram, fluormetron, atrazin a další triaziny, metribuzin, chlorimuron, chlorsulfuron, flumetsuiam, halosulfuron, sulfometron, imazaquin, isoxaben, imazamox, metosulam, pyrithrobac, bensuifuron, nicosulfuroň, imazethapyr, rímsulfuron, fluroglycofen, KIH92Q1, ET751, carfentrazon, ZA1296, sulcotrion, paraquat, diquat, bromoxynil a fenoxaprop.
    fomesafen,
  8. 9. Polynukleotid podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde pre-emergentní herbicid je vybrán ze skupiny obsahující acetanilidy, triketony, inhibitory PDS, thiokarbamáty, tetrazolinony, a post-emergentní herbicid je vybrán ze skupiny obsahující glyphosat, glufosinát, paraquat a bialaphos.
  9. 10. Vektor, který obsahuje polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 1 až.9.
    • · · · · · • 4
    4 4 4 444 4 4 • 4 ···
    4· ··
  10. 11. Rostlina, která obsahuje polynukleotid obsahující alespoň první úsek kódující první protein schopný udělit rostlině nebo pletivu, které ho obsahují, rezistenci nebo toleranci k prvními herbicidu, a polynukleotid obsahující druhý úsek kódující druhý protein schopný udělit obdobně rezistenci nebo toleranci k druhému herbicidu, a to za podmínek, ;anunící že (I) poiynukleorid nekóduje fúzní protein pouze 5-enolpyruvyl-3-fos foš ikimátsyntetázu (EPSPS) a glutathion-S-transferázu (GST), (II) polynukleotid neobsahuje pouze úseky kódující superoxidismutázu (SOD) a glutathion-S-transferázu (GST), (III) polynukleotid neobsahuje pouze úseky kódující GST a fosfinotricinacetyltransferázu (PAT), a (IV) že pokud je plodinou cukrová řepa, geny udělující rezistenci nebo toleranci k herbicidu, které obsahuje, nejsou pouze geny EPSPS a PAT.
  11. 12. Rostlina podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde první herbicid je pre-emrgentní herbicid a druhý herbicid je post-emergentní herbicid.
  12. 13. Rostliny včetně jejich částí, semen a jejich potomstva, které jsou rezistentní k alespoň dvěma herbicidům, a které byly získány z materiálu, který byl transformován polynukleotidem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 nebo vektorem podle nároku 10.
    Rostliny podle kteréhokoliv z předchozích nároků vybrané ze skupiny obsahující obiloviny, plodiny pěstované pro vlákno, ovocné plantážové plodiny a stromy.
    olej niny, plodiny, technické zeleniny, • · • * ··· · ·· ·· • a · ··
  13. 15. Rostliny podle kteréhokoliv z nároků 11 až 14, které jsou vybrány ze skupiny, do které patří sója, bavlník, tabák, cukrová řepa, řepka olejka, kanola, len, slunečnice, brambor, rajče, vojtěška, salát hlávkový, kukuřice, pšenice, čirok, žito, banánovník, ječmen, oves, trávníkové trávy, picni trávy, cukrová třtina, hrách, polní fazol, rýže, borovice, topol, jabloň, grapefruit, citrusovník a ořech, a také potomstvo, semena nebo části takových rostlin.
  14. 16. Způsob selektivního hubení plevelů na poli s plevelem a plodinou vyznačující se tím, že plodina obsahuje polynukleotid obsahující alespoň první úsek kódující první protein schopný udělit rostlině nebo pletivu, které ho obsahují, rezistenci nebo toleranci k prvními herbicidu, a druhý úsek kódující druhý protein schopný uděliz obdobně rezistenci nebo toleranci k druhému herbicidu, a to za podmínek, že (I) polynukleotid nekóduje fúzní protein obsahující pouze 5-enolpyruvyl-3fosfošikimátsyntetázu (EPSPS) a glutathion-S-transferázu (GST), (II) polynukleotid neobsahuje pouze úseky kódující superoxidismutázu (SOD) a glutathion-S-transferázu (GST), (III) polynukleotid neobsahuje pouze úseky kódující GST a fosfinotricinacetyl-transferázu (PAT), a (IV) že pokud je plodinou cukrová řepa, geny udělující rezistenci nebo toleranci k herbicidu, které obsahuje, nejsou pouze geny EPSPS a PAT, nebo (II) polynukleotid obsahující alespoň první úsek kódující první protein schopný udělit rostlině nebo pletivu, které ho obsahují, rezistenci nebo toleranci k prvními herbicidu, a polynukleotid kódující druhý protein schopný udělit obdobně rezistenci nebo toleranci k druhému herbicidu, a to za podmínek, že (I) polynukleotid nekóduje fúzní protein obsahující pouze 5-enolpyruvyl-392 fosfošikimátsyntetázu (EPSPS) a glutathion-S-transferázu (GST), (II) polynukleotid neobsahuje pouze úseky kódující superoxidismutázu (SOD) a glutathion-S-transferázu (GST), (III) polynukleotid neobsahuje pouze úseky kódující GST a fosfinotricinacetyltransferázu (PAT) a (IV) že pokud je plodinou cukrová řepa, geny udělující rezistenci nebo toleranci k herbicidu, které obsahuje, nejsou pouze EPSPS a PAT, přičemž se na pole aplikuje alespoň jeden z'uvedených herbicidů v množství dostatečném k vyhubení plevelů bez podstatného ovlivnění plodiny.
  15. 17. Způsob podle předchozího nároku 16 vyznačující se tím, že plodina obsahuje gen kódující enzym EPSPS a gen kódující enzym GST, přičemž se na pole aplikuje glyphosat a acetanilid v množství dostatečném k vyhubení plevelů bez podstatného ovlivnění plodiny.
    18. Způsob podle nároku 16 vyzná č u j í c í s e tím, že plodina obsahuje gen kóduj ící enzym HPPD a gen kódující enzym PAT, přičemž se na pole aplikuje t .riketon a glufosinát v bez podstatného množství dostat ovlivnění plodiny. ečném k vyhubení ple velu 19. Způsob podle nároku 16 vvzna č u j í c í s e t í m, že plodina obsahuje gen kóduj ící enzym PAT a gen
    kódující enzym GST, přičemž se na pole aplikuje glufosinát a acetanilid, thiokarbamát a/nebo tetrazolinon v množství dostatečném k vyhubení plevelů bez podstatného ovlivnění plodiny.
  16. 20. Způsob podle nároku 16 vyznačující se t í m, že plodina obsahuje gen kódující enzym EPSPS a/nebo
    4 44 4
    44 4 4 • 44 4 · 4 4 4 4 · • 4 ··· · 4 444 4 4 4 4
    44 4444 44 444 444
    44444· 44
    44 444 *4 444 44 44 enzym GOX a gen kódující enzym HPPD, přičemž se na pole aplikuje glyphosat a triketon v množství dostatečném k vyhubení plevelů bez podstatného ovlivnění plodiny.
  17. 21. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že plodina obsahuje gen kódující enzym PDS a gen kódující enzym EPSPS a/nebo enzym GOX, přičemž se na pole aplikuje inhibitor PDS a glyphosat v množství dostatečném k vyhubení plevelů bez podstatného ovlivnění plodiny.
  18. 22. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že plodina obsahuje gen kódující enzym EPSPS a/nebo enzym GOX a gen kódující enzym PAT, přičemž se na pole aplikuje glyphosat a glufosinat v množství dostatečném k vyhubení plevelů bez podstatného ovlivnění plodiny, a to za podmínky, že plodina není cukrová řepa.
  19. 23. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že plodina obsahuje gen kódující enzym PDS a gen kódující enzym PA3T, přičemž se na pole aplikuje inhibitor PDS a glufosinat v množství dostatečném k vyhubení plevelů bez podstatného ovlivnění plodiny.
  20. 24. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že plodina obsahuje gen kódující enzym PDS a gen kódující enzym GST, přičemž se na pole aplikuje inhibitor PDS a acetani1idový herbicid v množství dostatečném k vyhubení plevelů bez podstatného ovlivnění plodiny.
  21. 25. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 17 až 24 vyznačující se tím, že plodina dále obsahuje gen kódující ALS, SOD nebo BNX, přičemž se na pole aplikuje ·· ···· • 9 ··· · • fcfc · · · • · • fc ·· sulfonylmočovina, paraquat nebo bromoxynilový herbicid v množství dostatečném k vyhubení plevelů bez podstatného ovlivnění plodiny.
  22. 26. Způsob podle vyznačuj ící kteréhokoliv se tím, z nároků 16 az že se dále na pole aplikuje pesticidně účinné množství jednoho nebo několika insekticidů, fungicidů, antivirových prostředků.
    baktericidů, nematicidů nebo jsou poastatne
  23. 27. Způsob přípravy rostlin, které tolerantní nebo podstatně rezistentní vůči dvěma nebo více herbicidům, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:
    (I) rostlinný materiál pod’ nároku 10, (II) takto transformovaný materiál se selektuje a (III) takto selektovaný materiál se regeneruje do celých morfologicky normálních fertilních rostlin.
    se transformuje polynukieotidem ί až 9 nebo vektorem podle
  24. 28. Použití polynukleotidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 nebo vektoru podle nároku 10 pro přípravu rostlinného pletiva a/nebo celých morfologicky normálních fertilních rostlin (I),které jsou podstatně tolerantní nebo podstatně rezistentní ke dvěma nebo více herbicidům.
  25. 29. Použití polynukleotidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 nebo vektoru podle nároku 10 pro přípravu herbicidového cíle pro vysokokapacitní in vitro screening potenciálních herbicidů.
    • · ·· ····
    I · ··· » · 4 » · 4 ·· ··· • · • ··· ·· fc··· ·· > · · * » · · · • « · · · · « · ·· ··
  26. 30. Použití podle předchozího nároku, kde úseky polynukleotidu kódující proteiny jsou heterologně exprimovány v E. coli nebo kvasinkách.
CZ991616A 1996-11-07 1997-10-31 Polynukleotid kódující rezistenci nebo toleranci k herbicidům, rostlina obsahující tento polynukleotid a způsob selektivního hubení plevelů CZ161699A3 (cs)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9623248.3A GB9623248D0 (en) 1996-11-07 1996-11-07 Herbicide resistant plants
GBGB9625957.7A GB9625957D0 (en) 1996-12-13 1996-12-13 Improvements in or relating to organic compounds
GBGB9703855.8A GB9703855D0 (en) 1997-02-25 1997-02-25 Improvements in or relating to organic compounds
PCT/GB1997/002996 WO1998020144A2 (en) 1996-11-07 1997-10-31 Herbicide resistant plants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ161699A3 true CZ161699A3 (cs) 1999-08-11

Family

ID=27268575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ991616A CZ161699A3 (cs) 1996-11-07 1997-10-31 Polynukleotid kódující rezistenci nebo toleranci k herbicidům, rostlina obsahující tento polynukleotid a způsob selektivního hubení plevelů

Country Status (14)

Country Link
EP (2) EP0946737A2 (cs)
JP (1) JP2001503625A (cs)
KR (1) KR20000053140A (cs)
CN (1) CN1236394A (cs)
AU (1) AU4789597A (cs)
BG (1) BG103462A (cs)
BR (1) BR9712695A (cs)
CA (1) CA2269666A1 (cs)
CZ (1) CZ161699A3 (cs)
IL (1) IL129707A0 (cs)
NZ (1) NZ335101A (cs)
PL (1) PL333131A1 (cs)
SK (1) SK60999A3 (cs)
WO (1) WO1998020144A2 (cs)

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6069115A (en) * 1997-11-12 2000-05-30 Rhone-Poulenc Agrochimie Method of controlling weeds in transgenic crops
JP2002520024A (ja) * 1998-07-10 2002-07-09 カルジーン エルエルシー 植物色素体における除草剤耐性遺伝子の発現
US6492578B1 (en) * 1998-07-10 2002-12-10 Calgene Llc Expression of herbicide tolerance genes in plant plastids
PT1104243E (pt) 1998-08-13 2013-05-07 Bayer Cropscience Ag Herbicidas para culturas de milho tolerantes ou resistentes
DE19836700A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Getreidekulturen
DE19836660A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Sojakulturen
DE19836684A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Reiskulturen
DE19836659A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Baumwollkulturen
WO2000012732A2 (en) * 1998-08-28 2000-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Organelle targeting sequences
AU2924800A (en) * 1999-03-03 2000-09-21 Syngenta Limited Use of glutathione-s-transferase to increase stress tolerance in plants
US20020079846A1 (en) * 2000-01-18 2002-06-27 Facchini Peter James Novel glutathione-S-transferase nucleic acids and polypeptides and methods of use thereof
IL153601A0 (en) * 2000-06-27 2003-07-06 Basf Ag Cyanobacterial nucleic acid fragments encoding proteins useful for controlling plant traits via nuclear or plastome transformation
US7083967B1 (en) 2000-06-27 2006-08-01 Basf Corporation Cyanobacterial nucleic acid fragments encoding proteins useful for controlling plant traits via nuclear or plastome transformation
ES2538471T3 (es) 2000-12-07 2015-06-22 Syngenta Limited Hidroxi fenil piruvato dioxigenasas (HPPD) derivadas de plantas y resistentes frente a herbicidas tricetónicos, y plantas transgénicas que contienen estas dioxigenasas
JP4779283B2 (ja) * 2001-10-19 2011-09-28 住友化学株式会社 雑草防除剤代謝蛋白質、その遺伝子およびその利用
ATE536409T1 (de) 2001-10-19 2011-12-15 Sumitomo Chemical Co Unkrautbekämpfungsstoffwechselproteine, gene dafür und ihre verwendung
EP2278017B1 (en) 2002-02-26 2015-03-25 Syngenta Limited A method of selectively producing male or female sterile plants
CN1330762C (zh) * 2002-05-10 2007-08-08 北京大学 新的草甘膦耐受型5－烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合酶及其编码基因
EP2308977B2 (en) 2004-04-30 2017-04-26 Dow AgroSciences LLC Novel herbicide resistance gene
JP4720223B2 (ja) * 2004-05-18 2011-07-13 住友化学株式会社 除草活性化合物耐性植物
CN103361316B (zh) 2005-10-28 2017-05-17 美国陶氏益农公司 新除草剂抗性基因
US20070154963A1 (en) * 2005-12-30 2007-07-05 Danying Cai Method to determine whether a compound is a cellular GSTpi inhibitor
BRPI0712484B1 (pt) 2006-06-06 2017-06-06 Monsanto Technology Llc método para seleção de células transformadas
US7855326B2 (en) 2006-06-06 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Methods for weed control using plants having dicamba-degrading enzymatic activity
US7838729B2 (en) * 2007-02-26 2010-11-23 Monsanto Technology Llc Chloroplast transit peptides for efficient targeting of DMO and uses thereof
EP3290520B1 (en) 2007-03-09 2021-07-14 Monsanto Technology LLC Preparation and use of plant embryo explants for transformation
CN101668419B (zh) * 2007-04-04 2016-03-23 巴斯福植物科学有限公司 Ahas突变体
MX2009012120A (es) * 2007-05-09 2010-02-12 Dow Agrosciences Llc Genes novedosos con resistencia a herbicidas.
WO2008150473A2 (en) * 2007-05-30 2008-12-11 Syngenta Participations Ag Cytochrome p450 genes conferring herbicide resistance
ES2619279T3 (es) 2009-01-22 2017-06-26 Syngenta Participations Ag. Polipéptidos de Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa mutantes y métodos de uso
US9347046B2 (en) 2009-01-22 2016-05-24 Syngenta Participations Ag Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
US9175305B2 (en) 2009-01-22 2015-11-03 Syngenta Participations Ag Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
CN102762725A (zh) * 2009-12-23 2012-10-31 拜尔知识产权有限公司 耐受hppd抑制剂型除草剂的植物
UY33141A (es) * 2009-12-23 2011-07-29 Bayer Cropscience Ag Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd
UY33140A (es) * 2009-12-23 2011-07-29 Bayer Cropscience Ag Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd
EA201290616A1 (ru) * 2010-01-07 2013-02-28 Басф Агро Б.В., Арнхем (Нл), Цвайгнидерлассунг Веденсвиль Устойчивые к гербициду растения
KR20140021581A (ko) 2011-03-07 2014-02-20 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤 논벼 경작에서의 잡초들의 제어 방법
CN102776158B (zh) * 2012-06-14 2013-10-23 重庆市农业科学院 一种抗草甘膦EPSP合成酶GmEPSPS-2及其编码基因与应用
BR112015005674B1 (pt) * 2012-09-14 2022-09-06 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Polipeptídeos recombinantes para conferir tolerância à herbicidas
BR112016020889B1 (pt) 2014-03-11 2022-10-04 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Molécula de ácido nucleico recombinante, célula hospedeira bacteriana, proteína hppd recombinante, uso do ácido nucleico recombinante e produto de base
BR112016028069A2 (pt) * 2014-06-06 2017-10-24 Univ Cornell composições e processos para impedimento de alimentação por psilídeos
AU2015288157A1 (en) * 2014-07-11 2017-01-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
CN104611304B (zh) * 2014-12-22 2017-05-17 北京大北农生物技术有限公司 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途
CN104878094B (zh) * 2015-04-30 2019-01-15 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9888的核酸序列及其检测方法
CN104878096B (zh) * 2015-04-30 2019-01-15 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9868的核酸序列及其检测方法
CN104830845B (zh) * 2015-04-30 2018-10-30 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9878的核酸序列及其检测方法
CN104878095B (zh) * 2015-04-30 2018-10-26 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9858的核酸序列及其检测方法
CN104878090B (zh) * 2015-04-30 2019-01-15 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9877的核酸序列及其检测方法
CN104830846B (zh) * 2015-04-30 2018-10-30 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9898的核酸序列及其检测方法
JP6873979B2 (ja) 2015-09-11 2021-05-19 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト Ｈｐｐｄ変異体および使用方法
CN105603047A (zh) * 2015-12-31 2016-05-25 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法
WO2017184727A1 (en) 2016-04-21 2017-10-26 Bayer Cropscience Lp Tal-effector mediated herbicide tolerance
US11708565B2 (en) 2017-03-07 2023-07-25 BASF Agricultural Solutions Seesi US LLC HPPD variants and methods of use
WO2019083810A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Basf Se IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE FOR 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE DIOXYGENASE (HPPD) INHIBITORS BY NEGATIVE REGULATION OF HPPD EXPRESSION IN SOYBEANS
US20210032651A1 (en) 2017-10-24 2021-02-04 Basf Se Improvement of herbicide tolerance to hppd inhibitors by down-regulation of putative 4-hydroxyphenylpyruvate reductases in soybean
WO2019233349A1 (zh) 2018-06-04 2019-12-12 青岛清原化合物有限公司 突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶、其编码核酸以及应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7705215B1 (en) * 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
DE4003045A1 (de) * 1990-02-02 1991-08-08 Hoechst Ag Virus/herbizidresistenz-gene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DK0536330T3 (da) * 1990-06-25 2002-04-22 Monsanto Technology Llc Glyphosattolerante planter
JP3173785B2 (ja) * 1990-08-31 2001-06-04 モンサント カンパニー グリホセート耐性５―エノールピルビルシキミ酸―３―ホスフェートシンターゼ
US5290926A (en) * 1990-09-14 1994-03-01 Ciba-Geigy Corporation Isolated DNA Encoding plant histidinol dehydrogenase
HU216644B (hu) * 1991-03-12 1999-07-28 Hoechst Ag. Eljárás ariloxi-fenoxi-alkánkarbonsav típusú herbiciddekel szemben rezisztens kukorica előállítására
US5491076A (en) * 1993-11-01 1996-02-13 The Texas A&M University System Expression of foreign genes using a replicating polyprotein producing virus vector
US5767373A (en) * 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
US5631152A (en) * 1994-10-26 1997-05-20 Monsanto Company Rapid and efficient regeneration of transgenic plants
GB9515941D0 (en) * 1995-08-03 1995-10-04 Zeneca Ltd DNA constructs
DE69636637T2 (de) * 1995-04-20 2007-08-23 Basf Ag Auf basis ihrer struktur entworfene herbizid-resistente produkte
FR2751347B1 (fr) * 1996-07-16 2001-12-07 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides

Also Published As

Publication number Publication date
SK60999A3 (en) 1999-10-08
BR9712695A (pt) 1999-10-19
CA2269666A1 (en) 1998-05-14
JP2001503625A (ja) 2001-03-21
EP0946737A2 (en) 1999-10-06
EP1728868A2 (en) 2006-12-06
BG103462A (en) 2000-01-31
NZ335101A (en) 2000-11-24
KR20000053140A (ko) 2000-08-25
CN1236394A (zh) 1999-11-24
IL129707A0 (en) 2000-02-29
WO1998020144A2 (en) 1998-05-14
PL333131A1 (en) 1999-11-22
AU4789597A (en) 1998-05-29
WO1998020144A3 (en) 1998-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ161699A3 (cs) Polynukleotid kódující rezistenci nebo toleranci k herbicidům, rostlina obsahující tento polynukleotid a způsob selektivního hubení plevelů
US20090229006A1 (en) Herbicide resistant plants
JP7118047B2 (ja) 植物における遺伝子発現のための方法及び組成物
EP1173582B1 (en) Herbicide resistant plants
AU2007329208B2 (en) Novel selectable marker genes
PL190393B1 (pl) Konstrukt chimerowy zawierający gen chimerowy elementarny, wektor, komórka roślinna, roślina, sposób nadawania oporności na herbicydy roślinom, sposób uzyskiwania roślin o tolerancji na wiele herbicydów oraz sposób działania herbicydem na rośliny
CZ29198A3 (cs) Genová expresní kazeta poskytující indukovatelnou rezistenci k herbicidu
HRP960245A2 (en) Dna sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides
JP2010526535A (ja) 新規な除草剤抵抗性遺伝子
WO2000066746A1 (en) Herbicide resistant plants
EP1173581A1 (en) Herbicide resistant plants
RU2628504C2 (ru) Способы повышения урожайности резистентных к 2,4-d сельскохозяйственных культур
CA2321965A1 (en) Method of producing plants which are tolerant or resistant to herbicides
AU2004203646A1 (en) Herbicide resistant plants
MXPA99004200A (en) Herbicide resistant plants
US20160295862A1 (en) Methods of improving the yield of 2,4-d resistant crop plants
ZA200108766B (en) Herbicide resistant plants.
ZA200108769B (en) Herbicide resistant plants.

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic