CZ29198A3 - Genová expresní kazeta poskytující indukovatelnou rezistenci k herbicidu - Google Patents

Genová expresní kazeta poskytující indukovatelnou rezistenci k herbicidu Download PDF

Info

Publication number
CZ29198A3
CZ29198A3 CZ98291A CZ29198A CZ29198A3 CZ 29198 A3 CZ29198 A3 CZ 29198A3 CZ 98291 A CZ98291 A CZ 98291A CZ 29198 A CZ29198 A CZ 29198A CZ 29198 A3 CZ29198 A3 CZ 29198A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
gene
promoter
inducible
plant
alcr
Prior art date
Application number
CZ98291A
Other languages
English (en)
Inventor
Ian Jepson
Original Assignee
Zeneca Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zeneca Limited filed Critical Zeneca Limited
Publication of CZ29198A3 publication Critical patent/CZ29198A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)

Description

175 645/JT
Genová expresní kazeta poskytující indukovatelnou rezistenci k herbicidu
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká konstruktů DNA a rostlin, které tyto konstrukty DNA obsahují. Zvláště se vynález týká promotorových sekvenci pro expresi genů, které uděluji rostlinám rezistenci k herbicidům.
Dosavadní stav techniky
Současné pokroky v rostlinné biotechnologii vedly ke vzniku transgennícn rostlin rezistentních k herbicidům.
Tolerance k herbicidům bylo dosaženo užitím celé řady transgennich strategií. Jedním dobře dokumentovaným příkladem je využití bakteriálního xenobiotického detoxikačního genu fosfinotricinacetyltransferázy (PAT) ze Streptomyces hydroscopicus. Mutovaný gen rostlinného původu, např. změněný cílový gen kódující acetolaktátsyntázu (ALS) z Arabidopsis, byl také úspěšně využit k vytvoření transgenní rostliny rezistentní k aplikaci herbicidu. Exprese genů PAT a ALS byla řízena silným konstitutivním promotorem.
Několik genových regulačních systémů (genových spínačů) je známo a dají se využít pro vnesení indukovatelné rezistence k herbicidům do rostlin. Mnoho takových genových spínačů je popsáno v přehledu Gatze (Current Opinion in Biotechnology, 1996, 7, 168-172) a zahrnují systémy jako např. tetracyklinový represorový genový spínač, Lac represorový systém, systémy indukovatelné mědi jako např. systém založený na ACE 1, promotory indukovatelné salicylovou kyselinou včetně systému PR-la a systémy ·· ···· • · • · • · · • · • · • · založené na steroidnich hormonech, jako např.
glukokortikoidový, progesteronový nebo estrogenový receptorový systém.
Modifikace glukokortikoidového receptorového systému, které zahrnují vazebnou doménu GAL 4 z kvasinky a aktivátor
VP16, popsali Aoyama et al. (The
Plant Cell,
1995, 7,
1773-1785)a lze předpokládat, že být založen např. na steroidnich podobný systém by mohl hormonech hmyzu spíše než savců. Skutečně byl nedávno popsán sytém založený na ekdysonovém receptoru Heliothis virescens. Také benzensulfonamidový genový spínač je znám (Hershey et al., Plant Mol. Biol. 17, 679-690, 1991) stejně jako systémy založené na proteinu alcR z Aspergillus nidulans a promotory glutathion-S-tranferázového genu.
Také několik genů, které udělují rezistenci k herbicidům, je známo. Jeden z herbicidů, který je široce užíván a u něhož je popsán příslušný gen rezistence, je Nfosfonometylglycin (glyfosat) a jeho zemědělsky přijatelné soli, jako je sůl sodná, draselná, amonná, isopropylaminová a trimetylsulfonová.
Genový aktivační systém alcA/alcR z houby Aspergillus nidulans je dobře charakterizovaný. Metabolická dráha přeměny etanolu v A. nidulans je zodpovědná za rozklad alkoholů a aldehydů. Ukázalo se, že v této metabolické dráze působí 3 geny. Geny alcA a alcR leží vzájemně si nablízku, v VII. vazebné skupině a aldA spadá do VIII. vazebné skupiny (Pateman J.H. et al., 1984, Proč. Soc. Lond. B217: 243-264,
Sealy-Lewis H.M. a Lockington R.A., 1984, Curr. Genet. 8: 253-259) . Gen alcA kóduje ADHI v A. nidulans a aldA kóduje AldDH, druhý enzym zodpovědný za metabolickou utilizaci alkoholu. Exprese jak alcA tak i aldA je indukována etanolem a řadou dalších indukujících látek (Creaser E.H. et al., 1984, Biochem. J. 255: 449-454) prostřednictvím . * Λ · Λ ·
• · transkripčního aktivátoru alcR. Gen alcR a koinduktor jsou zodpovědné za expresi alek a aldk, neboť řada mutaci a delecí v genu alcR vede k pleiotropnimu sníženi aktivity ADHI a AldDH (Feienbok B. et al., 1988, Gene, 73: 385-396, Pateman et al., 1984, Sealy-Lewis H.M. a Lockington R.A., 1984). Protein alcR aktivuje expresi z alek tím, že se váže na 3 specifická místa promotoru alek (Kulmberg P. et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 21146-21153).
Gen alcR byl klonován (Lockington R.A. et al., 1985, Gene, 33: 137-149) a sekvenován (Feienbok B. et al., 1988).
Exprese genu alcR je indukovatelná, autoregulovaná a podléhá glukózové represi zprostředkované represorem CREA (Bailey C.
a Arst H.N., 1975,
Eur. J. Biochem. 51: 573-577, Lockington
R.A. et al., 1987, Mol. Microbiol., 1: 275-281, Dowzer
C.E.A. a Kelly J.M., 1989, Curr. Genet. 15: 457-459, Dowzer
C.E.A. a Kelly J.M. , 1991, Mol. Cell Biol. 11: 5701-5709).
Regulační protein obsahuje 6 molekul cysteinu blízko svého
N-konce uspořádaných do dvoujaderného shluku obsahujícího zinek (Kulmberg P et al., 1991,
Tento shluk je podobný vysoce doménám DNA pro transkripční
FEBS Letts. 280:11-16) .
konzervativním vazebným faktory u Ascomycetes (vřeckovýtrusných hub). Transkripční faktory GAL4 a LAC9 obsahují také dvoujaderné komplexy se strukturou „jetelového listu obsahující 2 atomy Zn(II) (Pan T. a Coleman J.E., 1990, Biochemistry, 29:3023-3029, Halvorsen Y.D.C. et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:13283-13289). Struktura ALCR je podobná tomuto typu až na to, že obsahuje asymetrickou smyčku tvořenou 16 aminokyselinovými rezidui mezi molekulami Cys-3 a Cys-4. ALCR sám pozitivně aktivuje vlastní expresi vazbou na dvě specifická místa své promotorové oblasti (Kulmberg P. et al., 1992, Mol. Cell Biol. 12:1932-1939).
Regulace všech tři genů alcR, alcA a aldA, tvořících metabolickou dráhu utilizace etanolu, probíhá na úrovni transkripce (Lockington et al., 1987, Gwyne D. et al., 1987, Gene, 51:205-216, Pickett et al., 1987, Gene, 51:217-226).
V A. nidulans se vyskytuji dvě další alkoholdehydrogenázy. ADHII se vyskytuje v mycéliu, když je houba pěstována na neindukujícím médiu a podléhá represi etanolem. ADHII je kódována genem alcB a je také řízena alcR (Sealy-Lewis a Lockington, 1984). Třetí alkoholdehydrogenáza byla také klonována komplementací s kmenem S. cerevisiae adh-. Gen alcC spadá do vazebné skupiny VII, ale není ve vazbě ani s alcA. ani s alcR. Gen alcC kóduje ADHIII a zpracovává alkohol velmi slabě (McKnight, G.L. et al., 1985, EMBO J., 4: 2094-2099). ADHIII je potřebná pro přežití A. nidulans v období anaerobního stresu. Exprese alcC není reprimována přítomností glukózy, a tedy nemusí být řízena alcR (Roland L.J. a Stromer, J.N., 1986, Mol. Cell Biol., 6: 3368-3372).
Lze shrnout, že A. nidulans exprimuje enzym alkoholdehydrogenázu I (ADHI) kódovanou genem alcA pouze roste-li za přítomnosti různých alkoholů a ketonů. Indukce je přenášena prostřednictvím regulačního proteinu (regulátoru) kódovaného genem alcR a konstitutivně exprimovaného. Je-li přítomen induktor (t.j. alkohol nebo keton), regulační protein aktivuje expresi genu alcA. V přítomnosti induktoru regulační protein také stimuluje svou vlastní expresi. To znamená, že v indukujících podmínkách (t.j. je-li přítomen alkohol nebo keton) vzniká velké množství enzymu ADHI. A naopak, gen alcA a tedy jeho produkt ADHI nejsou exprimovány v nepřítomnosti induktoru. Exprese alcA a tvorba enzymu podléhá represi v přítomnosti glukózy.
Tudíž promotor genu alcA je indukovatelný promotor, aktivovaný regulačním proteinem alcR v přítomnosti induktoru (t.j. kombinací protein/alkohol nebo protein/keton). Geny alcR a alcA (včetně příslušných promotorů) byly již klonovány a sekvenovány (Lockington R.A. a kol, 1985, Gene, 33:137-149, Felenbok B. et al·., 1988, Gene, 73:385-396, Gwyne et al., 1987, Gene, 51:205-216).
Geny pro alkoholdehydrogenázu (adh) byly zkoumány u určitých rostlinných druhů. U kukuřice a jiných obilovin je jejich exprese spouštěna anaerobními podmínkami. Promotorové oblast genu adh z kukuřice obsahuje regulační element o velikosti 300 bp, který je nezbytný pro expresi v anaerobních podmínkách. Avšak v žádné rostlině nebyl nalezen ekvivalent regulačního proteinu alcR. Tedy genový regulační systém typu alcR/alcA není znám v rostlinách. Konstitutivní exprese genu alcR v rostlinných buňkách nevede k aktivaci endogenní adh.
Podstata vynálezu
Ve vynálezu se navrhuje systém, kde geny udělující toleranci k herbicidu jsou exprimovány indukovatelným způsobem v závislosti na aplikaci specifické aktivující látky. Tento přístup má řadu výhod pro zemědělce včetně následuj icích:
1. Indukovatelné řízení tolerance k herbicidům zmenšuje riziko snížení výnosů spojené s vysokou konstitutivní expresí genů rezistence k herbicidům. To může být problémem zejména v ranných fázích růstu, kdy vysoká hladina produktu transgenu může narušovat normální vývoj. Vysoká exprese genu
• · rezistence k herbicidu může také odčerpávat metabolity nezbytné pro metabolismus rostliny.
2. Exprese genu rezistence k herbicidu indukovatelným způsobem dovoluje, aby se dotčený herbicid použil ke kontrole divokých rostlin, pokud se aktivující látka vynechá při ošetření.
3. Užití indukovatelného promotoru k řízení rezistence k herbicidu sníží riziko, že by se hlavním problémem. Pokud na nějaký druh plevelu genu rezistentní druhy plevelů staly rezistence přenesl plodiny, stále ještě bez přítomnosti indukující látky, takového genu tolerance, který herbicidu, genu tolerance, úplnému vegetativnímu indukující látky) před sklizni plodiny. Např. k herbicidu se z obilovin, by se gen z příbuzné lze získat kontrolu použitím herbicidu zejména týkalo rezistenci k se užil (bez představit, že rezistence pšenice, může nakřížit do rezistence k herbicidu z
To by se poskytuje který by vysetím plodiny a případně ještě po je možné si např.
plevelného ovsa hluchého, nebo se řepky olejky nebo kanoly může přenést do divokých příbuzných rostlin rodu Brassica, které už tak jsou Dalším příkladem je to, že indukovatelná k herbicidu u řepy cukrovky sníží riziko obtížným plevelem, exprese rezistence problémů s divokou řepou.
Předkládaný vynález poskytuje chemicky indukovatelnou rostlinnou genovou expresní kazetu, obsahující indukovatelný promotor operativně spojený s cílovým genem, který uděluje rostlině rezistenci k herbicidu.
Kterýkoliv gen rezistence k herbicidu se může použít, ale zejména výhodné jsou geny rezistence k N-fosfonometylglycinu, nebo jeho solím či derivátům.
Λ· ····
Několik indukovatelných promotorů lze užit k vneseni indukovatelné rezistence včetně kteréhokoliv z již dříve uvedených.
Zejména užitečný genový spínač využitelný v této oblasti je založen na regulačním proteinu alcR z Apergillus nidulans, který aktivuje genovou expresi z promotoru alcA za přítomnosti určitých alkoholů a ketonů. Tento sytém je popsán v naší mezinárodni patentové přihlášce WO93/21334, na kterou se zde odkazuje.
Vynález dále poskytuje chemicky indukovatelnou rostlinnou genovou expresní kazetu, která obsahuje první promotor operativně spojený s regulační sekvencí alcR, která kóduje regulační protein alcR, a indukovatelný promotor operativně spojený s cílovým genem, který uděluje rezistenci k herbicidu, přičemž indukovatelný promotor je aktivován regulačním proteinem v přítomnosti účinného exogenniho induktoru, a tudíž aplikace induktoru způsobí expresi cílového genu.
Indukovatelný promotor je výhodně odvozen z promotoru alcA genu, ale případně také z alcR, aldA nebo i dalších genů indukovaných alcR.
V naší práci se zjistilo, že genový spínač alcR/alcA je zvláště vhodný pro expresi genů, které kódují 5endotoxiny z B. thuringiensis, a to přinejmenším z následujících důvodů.
1. Systém genového spínače alcR/alcA byl vyvinut k tomu, aby zajišťoval vysokou úroveň genové exprese. Navíc exprese regulačního proteinu alcR je přednostně zahajována ze silného konstitutivního promotoru jako je např. polyubiquitin. Lze tak dosáhnout vysoké úrovně exprese transgenu srovnatelnou s expresí ze silného konstitutivního promotoru jako např. promotoru 35 CaMV.
• · ··· ·
2. Pokud má být genový spínač použit v případě, kdy je aktivující chemická látka aplikována současně s herbicidem, je žádoucí rychlé zvýšení úrovně genu rezistence k herbicidu. Obr. 1 ukazuje časový průběh exprese markerového genu (CAT) po aplikaci indukující chemické látky - induktoru. Tato studie ukazuje náhlý vzestup exprese (2 hodiny) CAT po aplikaci induktoru na list. Počáteční časná kinetika indukce je způsobena konstitutivní expresi regulačního proteinu, proto není patrno žádné zpoždění (lag fáze) zatímco probíhá syntéza transkripčních faktorů. Navíc byl vybrán jednoduchý dvousložkový systém, který je nezávislý na celém složitém systému signální transdukce.
3. Specifita systému aicR/aicA se testovala s celou škálou rozpouštědel běžných v agronomické praxi. Test na mladých rostlinách v hydroponické kultuře prokázal, že etanol, butan-2-ol a cyklohexanon způsobily vysokou hladinu indukované exprese reportérového genu (obr. 2). Naproti tomu, když se aplikovaly postřikem na list různé alkoholy a ketony, běžné v agronomické praxi (jejichž seznam je uveden v tab. 1), pouze etanol vedl k vysoké úrovni indukované genové aktivity reportérového genu (obr. 3). To je významné, neboť tak nemůže dojít k nelegitimní indukci transgenu při náhodném setkání s rozpouštědly v různých agrochemických prostředcích. Etanol není běžnou součástí agrochemických prostředků a tak vhodně organizovaný postřik etanolem lze považovat za specifický induktor genového spínače alcR/alcA v polních podmínkách.
♦ ··
TABULKA 1
1. Isobutylmetylketon 13. acetonylaceton
2. Fenchon 14 . JF5969(cyklohexanon)
3. 2-heptanon 15. N-metylpyrrolidon
4 . Di-isobutylketon 16. polyetylenglykol
5. 5-metylhexanon 17 . propylenglykol
6. 5-metylpentan-2,4-diol 18 . acetofenon
7 . etylmetyl-keton 19. JF4400(metylcyklohexanon:
8. 2-pentanon 20. propan-2-ol
9. glycerol 21. butan-2-ol
10 . γ-butyrolakton 22 . aceton
11 . diacetonalkohol 23. etanol
12 . Tetrahydrofurfurylalkohol 24 . destilovaná H;O
4. Žádný z celé řady biotických a abiotických stresů, jako např. infekce patogenem, teplo, chlad, sucho, poraněni a zaplavení, neindukuje funkci genového spínače alcR/alcA. Navíc ani řada dalších chemických látek, které nejsou rozpouštědly, jako např. kyselina salicylová, etylen, kyselina abscisová, auxin, kyselina giberelová, a ani různé další agrochemikálie neindukovaly alcR/alcA systém.
První promotor je buď konstitutivní nebo tkáňově specifický, nebo může být vývojově programován anebo dokonce indukovatelný. Regulační sekvence, tedy gen alcR, se získá z Aspergillus nidulans, a kóduje regulační protein alcR.
Indukovatelný promotor je výhodně promotor genu alcA, který se získá z Aspergillus nidulans, nebo je to „chimérický” promotor odvozený z regulačních sekvencí promotoru alcA a ústřední promotorové oblasti genového • ·
promotoru, který je aktivní v jakéhokoliv promotoru rostlinného odvozený „chimérický” promotor proteinem alcR po aplikaci alkoholového nebo rostlinné buňce (včetně genu). Promotor alcA nebo regulačním je aktivován ketonového induktoru.
Indukovatelný promotor se také dá odvodit z promotoru genu aldA, Aspergillus nidulans.
alcB nebo alcC, které se získají z
Induktorem je alkohol nebo keton).
jakákoliv účinná
Vhodné chemické genovou expresní chemická látka (např. látky pro použití s kazetou odvozenou ze systému alcR/alek jsou Creaser a kol (1984, Biochem. J., 225:449ty, které uvádí 454) jako např. aceton, butan-2-ol, 3-oxobutyrová butan-2-on (etylmetylketon) kyselina, cyklohexanon, propan-2-ol a etanol.
Genová expresní kazeta exogenního chemického induktoru reaguje a tím umožňuje na aplikaci vnější aktivaci exprese cílového genu řízeného kazetou. Expresní kazeta je tak silně regulována a je vhodná pro všeobecné použití v rostlinách.
Dvě části expresní kazety jsou buď součástí jedné a téže rekombinantní molekuly DNA (DNA konstruktu) nebo tvoří dva samostatné konstrukty. První část obsahuje cDNA regulačního genu nebo genovou sekvenci subklonovanou do expresního vektoru, ve kterém je její exprese řízena operativním rostlinným promotorem. Druhá část obsahuje alespoň část indukovatelného promotoru, který řídí expresi cílového genu ležícího po směru transkripce od promotoru.
Regulační protein, který je produktem regulačního genu v první části kazety, aktivuje v přítomnosti vhodného induktoru expresi cílového genu tím, že stimuluje indukovatelný promotor ve druhé části genové kazety.
vynálezu, a je řízena chemicky je tedy aktivována na rostlinu.
Pro ·· ···· ··· · • ·· ·· ··
DNA, ··· · nebo podle vynálezu, cílového genu v promotorem podle spouštěným aplikací chemického induktoru užít jakéhokoliv způsobu nebo rostlinnou buňku, včetně vhodného pro zvolenou rostlinu infekce pomocí Agrobacterium tumefaciens, který rekombinantní Ti plazmidy, elektroporace, mikroinjekce nebo protoplastů, transformace pylové se regenerují celé vložen nový jaderný jednoděložné tak i dvouděložné rostliny
Příklady rostlin, které mohou transformace mikroprojektily transformovaných láčky. Z úspěšně které rostliny, materiál.
nese buněk anebo buněk mají v genomu trvale lze transformovat jak být takto geneticky modifikovány, jsou polní jako např. kanola, sója, kukuřice, mangovník, broskvoň, zelenina bavlnik, rajčata, banánovník, plodiny, slunečnice, obiloviny, ovoce a tabák, cukrová řepa, pšenice, ječmen, rýže, čirok, jabloň, hrušeň, jahodník, meloun, brambor, mrkev, hlávkový salát, cibule.
dále poskytuje rostlinnou buňku obsahující genovou expresní kazetu podle vynálezu. Tato genová expresní kazeta je vnesena transformací a trvale vložena v rostlinném poskytuje rostlinné pletivo nebo celou takové transformované
Vynález genomu. Vynález také rostlinu obsahující rostliny nebo semena buňky, a také z nich pocházející, poskytuje způsob pro exprese v rostlině zahrnující transformování konstruktem DNA
Vynález dále řízení genové rostlinné buňky chemicky indukovatelnou genovou expresní kazetou, obsahující první promotor operativně spojený s ··♦· sekvencí odvozenou z genu alcR, protein alcA, cílovým, genem a indukovatelný promotor udělujícím rezistenci k kóduje herbicidu, promotor cílového je aktivován regulačním induktoru, jehož exprese regulační regulační spojený s přičemž indukovatelný proteinem v přítomnosti aplikace způsobí expresi
Strategie indukovatelné herbicidům se dosáhne postřikem aktivátoru, vlastní aplikaci herbicidu (před postřikem), pomalu působících herbicidů, jako je např.
rezistence k který předchází anebo v případě
N-fosfonomethyl„glyphosate, glyfosat) tím, že se do nádrže a vytvoří směs společně s glycin (známý jako chemický induktor přidá herbicidem.
Tato strategie udělující rezistenci spínač alcA/alcR se může se uplatní pro jakýkoliv gen
Např. genový následuj ícími a příslušný herbicid, použít společně s geny:
1.
kukuřice
Glutathion-S-transferázový gen (viz. naše mezinárodní patentová
90/08826), herbicidům
2.
publikace WO který uděluje rezistenci k chloroacetanilidovým jako je acetochlor, metolachlor a alachlor.
Fosfinotricin-acetyltransferáza (PAT), která uděluje rezistenci k herbicidu všeobecně známému pod jménem glufosinát
3.
(„glufosinate) .
Mutované geny pro acetolaktátsyntázu z kukuřice mezinárodní patentová publikace WO 90/14000) a ostatní geny, které udělují rezistenci k sulfonylmočovině a imadazlononům.
4. Geny udělující rezistenci ke glyfosatu. Tyto geny zahrnují gen glyfosatoxidoreduktázy (GOX, viz. mezinárodní patentová publikace WO 90/14000 jménem Monsanto Company), geny kódující syntézu 5-enolpyruvyl-3-fosfošikimové kyseliny ·« e··· (EPSPS), včetně EPSPS I. a II. třídy, geny kódující mutantní formy EPSPS a geny kódující fúzní peptidy EPSPS, složené z chloroplastového tranzitního peptidu a EPSPS (viz např. EP 218 571, EP 293 358, WO 91/04323, WO 92/04449 a WO 92/06201 jménem Monsanto Company), a geny účastnící se exprese CPLyázy.
Další výhodné vlastnosti a provedení vynálezu jsou popsány v příkladech, které nemají omezující charakter, a s odkazem na obrázky, jejichž popis následuje.
Popis obrázků ukazuje časový průběh exprese markerového (značkovacího) genu CAT po aplikaci indukuj ící chemické látky.
Obr.
ukazuj e úroveň indukované exprese reportérového genu při máčení kořenů rozpouštědlech.
Obr.
ukazuje úroveň indukované exprese reportérového genu při postřiku chemickými látkami, uvedenými v tab. 1, na list.
Obr. 4 ukazuje vznik konstruktu s 35S regulátorem tím, že se alcR cDNA liguje do pJR1.
Obr. 5 ukazuje vytvoření reportérového konstruktu.
Obr. 6 je schéma kazety a specifických konstruktů pro transformaci rostlin.
Obr. 7 ukazuje chloroplastovou tranzitní sekvenci 1 z RUBISCO z Arabidopsis (CPT1).
Obr. 8 ukazuje sekvenci plazmidu pMJBl.
Obr. 9 je mapa plazmidu pJRIi
Obr. 10 ukazuje chloroplastovou tranzitní sekvenci 2 z genu EPSPS I. třídy z Petunia hybrida.
Obr. 11 je mapa plazmidu pUB-1.
Obr. 12 je mapa plazmidu pMF6.
Obr. 13 je mapa plazmidu pIE109, kde čísla označují
počet párů baží (nejsou znázorněny v měřítku) a použité zkratky znamenají:
ADHi alkoholdehydrogenáza z kukuřice
PAT fosfinotricinacetyltransferáza (gen rezistence
proti Basta)
AMP gen rezistence k ampicilinu
CaMV 35S promotor 35S viru mozaiky květáku nos Póly A úsek „póly A z genu nopalinsyntázy
ori replikační počátek ColEl z pUC
Obr. 14 je mapa plazmidu pMVl, kde čísla označují
počet párů bázi (nejsou znázorněny v měřítku) a použité
zkratky jsou shodné s obr. 13 a další zkratky znamenají:
UBQp promotor ubiquitinu z kukuřice
UBQi intron z ubiquitinu z kukuřice
nos terminátor z 3' konce nopalinsyntázy
CZP1 GOX sekvence chloroplastového tranzitního
peptidu s glyfosatoxidázou
CZP2 GPSPS sekvence chloroplastového tranzit-
ního peptidu sEPSP syntetázou.
Obr. 15 znázorňuje přípravu plazmidu pUC4 ligací
pAr3 a pBSSK.
Obr. 16 je mapa plazmidu pMV2, kde čísla označují
počet párů baží (nejsou znázorněny v měřítku) a použité
zkratky jsou shodné s obr. 14 a další zkratky znamenají:
AlcA alcA promotor z Aspergillus nidulans
AlcR alcR promotor z Aspergillus nidulans
Obr. 17 je mapa plazmidu pDVl-pUC.
Obr. 18 je mapa plazmidu pDV2-pUC.
Obr. 19 je mapa plazmidu pDV3-Bin.
• · · · · · · · · ·· ·· ···· ·· · ···· ··· ·· · ···· • ··· · · · · · ··· · · • · ···· · · · ····· · · · · ·· · ·
Obr. 20 je mapa plazmidu pDV4-Bin.
Obr. 21 je westernový přenos ukazující expresi EPSPS a GOX v transformovaných rostlinách.
Příklady provedeni vynálezu
Pro ukázku provedení vynálezu byl vybrán genový spínač alek/alcR s geny udělujícími rezistenci ke glyfosatu. Genový spínač je užit k řízení indukovatelné exprese glyfosatoxidázy (GOX) v rostlinách. Zapínatelný GOX byl exprimován samotný nebo ve spojení s konstitutivní expresí
5-enolpyruvyl-3-fosfošikimové kyseliny (EPSPS) CP4. Konstrukty byly optimalizovány pro expresi jak v jednoděložných tak i dvouděložných plodinách.
Příklad 1
Sestrojení konstruktu s regulátorem alcR
Sekvence genomové DNA alcR byla publikována, což umožňuje izolaci vzorku cDNA genu alcR.
cDNA alcR byla klonována do expresního vektoru pJRl(pUC). puRl obsahuje promotor 35S viru mozaiky květáku (CaMV). Tento promotor je konstitutivní rostlinný promotor a nepřetržitě exprimuje regulační protein. V expresním vektoru je použit polyadenylačni signál nos.
Obr. 4 ukazuje sestrojení konstruktu s regulátorem 35S vložením cDNA alcR do pJR1. Po částečném štěpení klonu cDNA alcR enzymem BamHI následovala elektroforéza v agarózovém gelu a vyříznutí a purifikace fragmentu o velikosti 2,6 kb. Fragment byl poté vložen do vektoru pJRl, který byl naštěpen BamHI a ošetřen fosfatázou, aby se zabránilo recirkularizaci. Gen alcR byl poté v konstruktu „35S-alcR umístěn tak, že je řízen promotorem 35S CaMV a polyadenylačním signálem nos 3'.
Příklad 2
Sestrojení reportérového konstruktu alcA-CAT obsahujícího chimérický promotor.
Plazmid pCaMVCN obsahuje reportérovy gen bakteriální chloramfenikoltransferázy (CAT) mezi promotorem 35S a terminátorem transkripce (DNA konstrukt „35S-CAT).
Promotor alcA byl subklonován do vektoru pCaMVCN a tak vznikl konstrukt „alcA-CAT. Fúzí části promotoru aicA a části promotoru 35S vznikl chimérický promotor, který umožňuje řídit a kontrolovat expresi genů.
Obr. 5 ukazuje sestrojení reportérového konstruktu. Promotor alcA a promotor 35S mají totožné sekvence TATA (tzv. TATA boxy)), které byly použity ke spojení těchto dvou promotorů dohromady za použití metody rekombinantní polymerázové řetězové reakce (PCR): oblast 246 bp z promotoru alcA a 5' konec genu CAT z pCaMVCN (obsahující část -70 ústřední oblasti promotoru 35S) byly odděleně amplifikovány, a poté spojeny k sobě za použití PCR. Rekombinantní fragment byl poté štěpen BamHI a HindlII. Vektor pCaMVCN byl částečně štěpen BamHI a HindlII, a poté podroben elektroforéze, takže mohl být izolován správný fragment a ligován s rekombinantním fragmentem.
Ligační směsi byly transformovány do E. coli, které pak byly vysety na bohaté agarové živné půdy. Plazmidová DNA byla izolována minipreparací z výsledných kolonií a rekombinantní klony byly znovu zachyceny podle velikosti při elektroforéze a restrikčním mapováním. Úseky obsahující
místo ligace byly sekvenovány pro kontrolu, zda byly zachyceny správné rekombinantní molekuly.
Přiklad 3
Konstrukt kódující rezistenci ke glyfosatu
Schéma genové kazety a specifických konstruktů pro transformaci rostlin je ukázáno na obr. 6.
Vektor č. 1 pro dvouděložné rostliny
Vektor č. 1 je konstitutivní řídicí plazmid obsahující gen glyfosatoxidázy (GOX) fúzovaný s chloroplastovou tranzitní sekvencí 1 z RUBISCO (CTP1) z Arabidopsis (obr. 7), řízený zesíleným promotorem 35S CaMV (ES) a omega sekvencí zesilovače translace z TMV (TMV). Vektor č. 1 užívá terminátor z genu nopalinsyntázy (nos). Syntetický gen GOX s připojeným CTP1 byl připraven na základě informací z patentové publikace WO 92/00377 a byl doplněn o Ncol místo v počátku translace ATG a o KpnI místo na 5' konci. Vnitřní místa Sphl a Ncol byla odstraněna během syntézy, aniž by došlo ke změně v kódované sekvenci aminokyselin. Syntetizovaná sekvence CTP1-GOX byla izolována jako NcoI-KpnI fragment a standardními molekulárními klonovacimi technikami ligována (vložena) do plazmidu pMJBl naštěpeného Ncol a KpnI. Základem plazmidu pMJBl je plazmid pIBT211 (obr. 8), obsahující promotor CaMV 35 s dvojitým zesilovačem, připojený k sekvenci zesilovače translace z viru mozaiky tabáku a nahrazující tak netranslatovanou zaváděcí sekvenci viru skvrnitosti tabáku, a ukončený signální sekvencí poly(A) z nopalinsyntázy (nos).
Genová kazeta obsahující zesílenou sekvenci 35 cAMV
TMV, CTP1-GOX a terminátor nos (vektor pro dvouděložné
rostliny IpUC, obr. 17) byla izolována jako fragment HindlII-EcoRI a ligována do HindlII/EcoRI naštěpeného pJRli, což je vektor pro transformaci rostlin (transformační vektor) založený na vektoru Binl9 (obr. 9).
Vektor č. 2 pro dvouděložné rostliny
Syntetický gen EPSPS CP4, fúzovaný s chloroplastovou tranzitní sekvenci CTP2 (obr. 10) z genu EPSPS I. třídy z Petunia hybrida, byl syntetizován na základě údajů v patentové přihlášce WO 92/04449 a s místem Ncol v místě iniciace translace ATG. Vnitřní místo Sphl v genu EPSPS CP4 bylo umlčeno aniž by došlo ke změně kódováni aminokyselin.
Fragment obsahující syntetický gen CTP2-EPSPS CP4 byl izolován jako fragment NcoI-SacI a ligován do pMJBI. Fragment obsahující promotor CaMV35 s dvojitým zesilovačem, sekvencí TMV omega, transitním peptidem CTP2, EPSPS a terminátorem nos, byl izolován jako EcoRI-HindlII fragment (viz obr. 18 - vektor č. 2 pro dvouděložné rostliny pUC) a klonován do pJRLIi, a tak vznikl vektor č. 2 pUC pro dvouděložné rostliny pUC (obr. 18).
Po sekvenování spojovacích míst ve vektoru č. 2 pUC byla nalezena další sekvence vložená mezi místo Sací a počátek terminátoru nos. Tato sekvence je následující:
5'AGG CTG CTT GAT GAG CTC GGT ACC CGG GGA TCC ATG GAG CCG AAT 3'.
Vektor č. 3 pro dvouděložné rostliny
Kontrolní vektor jak s genem EPSPS tak s genem GOX byl vytvořen naštěpením vektoru č. 2 enzymem EcoRI a vložením spojky (linkeru) AEcoRI-SphI-ÁEcoRI. Sekvence linkeru je následující:
5'AAT TAG GGG CAT GCC CCT 3'.
Výsledný vektor byl štěpen Sphl, aby se uvolnila kazeta B, která byla pak klonována do Sphl místa vektoru č. 1 ve směru 5' od promotoru 35 CaMV. Kazety 1) a 2) pak byly vystřiženy jako HindlI-EcoRI fragment z vektoru č. 3 pUC (obr. 19) a klonovány do pJRIi.
Vektor č. 4 pro dvouděložné rostliny
Indukovatelný vektor s genem GOX byl sestrojen vystřižením genu CAT z „palcCAT v podobě Pstl fragmentu. Pás s vektorem, obsahujícím promotor alcA a terminátor nos, byl přečištěn z gelu a použit pro ligaci s linkerem PstlXhol-Kpnl-Pstl, který má následující sekvenci:
5'GCC ACT CGA GCT AGG TAC CCT GCA 3'
Orientace byla potvrzena sekvenační analýzou. Sekvence TMV omega a CTP1-GOX byly izolovány z vektoru č. 1 jako Xhol-KpnI fragment a klonovány do vektoru s alcA a nos, obsahujícího linker Xhol-KpnI-Pstl. Kazeta alcA-TMV-CTPlGOX-nos byla vystřižena jako HindlII fragment a klonována do transformujícího vektoru „p35S-alcR, obsahujícího cDNA alcR a terminátor nos, řízené promotorem 35 CaMV z vektoru č. 4 (obr. 20) .
Vektor č. 5 pro dvouděložné rostliny
Vektor č. 5 (obr. 22) pro dvouděložné rostliny, obsahující indukovatelný gen GOX a konstitutivní gen EPSPS, byl připraven následující klonovací strategií. Vektor č. 2 (pDV2-pUC) pro dvouděložné rostliny byl upraven vložením linkeru AEcoRI-HindlII-ÁEcoRI do EcoRI místa, a to umožnilo vystřižení kazety CaMV-en-CTP2-EPSPS-nos v podobě HindlII fragmentu. Tento fragment byl pak vložen do pDV4-Bin naštěpeného HindlII. Rekombinantní molekuly, obsahující všechny tři kazety, t.j. 35S-alcR, CaMV-en-CTP2-EPSPS-nos a
alcA-CTPl-GOX-nos byly selektovány radioaktivně značenými oligonukleotidy.
hybridizací s
Orientace byla potvrzena sekvenovánim všech hraničních úseků
Vektory pro jednoděložné rostliny
Vektor č. 1: Kazeta D
Spojka EcoRI-NotI-EcoRI (sekvence: 5'AATTCAATTTG
CGGCCGCAAATG 3') byla vložena do vektoru pro dvouděložné rostliny č.l pDVl. Plazmid byl pak štěpen Ncol a přesahující konec byl doplněn Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I. Linearizovaný vektor byl štěpen Notl a výsledný fragment s jedním tupým koncem a Notl koncem, obsahující CTP1-GOX a nos terminátor byl vložen do vektoru pPUBl naštěpeného Smal/Notl (obr. 12) a obsahujícího vložený polyubiquitinový promotor, polyubiquitinový intron se spojkou KpnI-Notl-KpnI (5'CATTTGCGGCCGCAAATGGTAC3'). Do výsledného konstruktu byla vložena ještě spojka HindlII-Notl-HindlII (5'AGCTTGCAGCGGCCG CTGCA3').
Vektor 1: Kazeta E
Spojka EcoRi-Notl-EcoRI (5'AATTCAATTTGCGGCCCAAATG3') byla vložena do vektoru pDV2. Plazmid byl pak štěpen Ncol a přesahující konec byl doplněn Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I. Linearizovaný vektor byl štěpen Notl a výsledný fragment s jedním tupým koncem a Notl koncem, obsahující CTP2-EPSPS a nos terminátor byl vložen vektoru pPUBl naštěpeného Smal/Notl a obsahujícího vložený polyubiquitinový promotor, polyubiquitinový intron se spojkou KpnI-NotI-KpnI (5'CATTTGCGGCCGCAAATGGTAC3'), aby tak vznikl plazmid 1. Kazeta se selekční značkou (markérem) PAT (promotor 35S CaMV, intron adhl, gen fosfinotricinacetyltransferázy - PAT, terminátor nos) byla vystřižena z pIE108 (obr. 14) a klonována do místa HindlII v plazmidu 1, čímž vznikla kazeta E. Diagnostické restrikční štěpení bylo využito k potvrzení toho, že kazeta se selektovatelnou značkou byla do vektoru vložena ve stejné orientaci jako kazeta CTP2-EPSPS.
Fragment, obsahující polyubiquitinový promotor, polyubiquitinový intron, CTP1-GOX a nos terminátor, byl vystřižen z kazety D pomocí Notl a vložen do kazety E, čímž vznikl vektor č. 1 pro jednoděložné rostliny (obr. 14). Restrikční štěpení bylo použito k ověření toho, že obě kazety byly vloženy ve stejné orientaci.
Kazeta E pro jednoděložné rostliny vznikla tak, že kazeta se selektovatelnou značkou (promotor 35 CaMV, intron adhl, gen pro f osf inotricinacetyltransferázu - PAT, nos) byla vystřižena z pIE108 a klonována do HindlII místa ve vektoru č. 5.
Vektor č. 1 pro jednoděložné rostliny
Fragment, obsahující polyubiquitinový promotor, polyubiquitinový intron, GOX a nos, byl vystřižen pomocí Notl z kazety D a klonován do kazety E naštěpené Notl, čímž vznikl vektor pro jednoděložné rostliny č. 1.
Vektor č. 2: Kazeta F
Kohezivní konce EcoRI fragmentu z pUC4 (obr. 15), obsahujícího sekvence alcR a terminátoru nos, byly zaplněny (zatupeny) Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I, fragment byl pak vložen do pUBl se spojkou KpnI-Notl-KpnI a orientace byla ověřena restrikční analýzou. Kazeta se selektovatelnou značkou PAT byla vložena do HindlII místa po vystřižení z pIE108 a orientována restrikční analýzou. Takto vznikl vektor č. 1. Vektor 2 byl vytvořen z plazmidu č. 1, popsaného výše a obsahujícího polyubiquitinový promotor, polyubiquitinový intron, CTP2-EPSPS a terminátor nos, štěpením HindlII a vložením spojky ÁHindlII-Notl-ÁHindlII (orientace ověřena sekvenováním):
5'AGCTCGCAGCGGCCGCTGCA3'
5'GCGTCGCCGGCGACGTTCGA3'
Vektor č. 3 vznikl tak, že spojka Clal-Ncol-Clal (5'CGATGCAGCCATGGCTGCAT3') byla vložena do pMF6 (obr. 13). Fragment NcoI/KpnI obsahující CTP1-GOX byl vystřižen z pDVl a vložen do vektoru č. 3 štěpeného NcoI/KpnI, a tak vznikl vektor č. 4. Vektor č. 5 byl vytvořen tak, že Sáli fragment, obsahující kukuřičný intron Adhl a CTP1-GOX byl vystřižen a vložen do pUC2 naštěpeného Sáli a obsahujícího promotor alcA a nos terminátor, a orientace byla ověřena sekvenováním. Fragment HindlII z vektoru 5, obsahující promotor alcA, kukuřičný intron Adhl, CTP1-GOX a terminátor nos, byl vložen do vektoru č. 2a orientován restrikčnim štěpením. Vektor č. 2 pro jednoděložné rostliny byl sestrojen tak, že Notl fragment z předchozího konstruktu, obsahující polyubiquitinový promotor, polyubiquitinový intron, CTP2-EPSPS, terminátor nos, promotor alcA, kukuřičný intron Adhl, CTP1-GOX a terminátor nos, byl vložen do vektoru č. 1 štěpeného Notl a orientován restrikční analýzou (obr. 16).
Příklad 4
Transformování rostlin
Plazmidy pro transformování dvouděložných rostlin byly vneseny do buněk Agrobacterium tumefaciens LBA4404 metodou mražení a tání, popsanou Holstersem et al. (1978).
Transformované rostliny (transformanty) tabáku byly vytvořeny metodou listových disků popsanou Bevanem (1984). Výhonky prýtu byly regenerovány na médiu obsahujícím 100 mg/1 kanamycinu. Po zakořenění byly rostlinky přeneseny do skleníku a dále pěstovány v podmínkách světelného režimu: 16 hodin světlo/8 hodin tma.
Transformace řepky {Brassíca napus cv. Westar) byla provedena metodou transformování nypokotylu podle Moloneye et al. (1989). Transformovaný materiál byl selektován na 15 mg/1 kanamycinu. Zakořeněné výhonky byly přemístěny do půdního kompostu a pěstovány až do zralosti v řízených skleníkových podmínkách (16 hodin den, teplota 20°C den/15°C noc a 60% relativní vzdušná vlhkost).
Transformace kukuřice byla provedena technikou bombardování mikročásticemi podle Kleina et al. (1988). Selekce probíhala na 1 mg/1 biolofosu.
Transformace cukrové řepy byla provedeny metodou užívající protoplasty svěracích buněk průduchů podle naší patentové publikace WO 95/10178.
Podrobnosti o získaných transgenních rostlinách jsou uvedeny v následujících tabulkách 2 a 3.
Tab. 2. Transformace tabáku - podrobné informace.
Vektor Druh Počet výhonků Zakořenilo
pDVl tabák 150 57
pDV2 tabák 150 60
pDV3 tabák 270 77
pDV4 tabák 350 135
pDV5 tabák 150 75
Tab. 3. Transformace řepky - podrobné informace.
Vektor Druh Počet kalusů s výhonky prýtu Zakořenilo
pDVl řepka 14 14
pDV2 řepka 13 13
pDV3 řepka 18 18
pDV4 řepka 20 20
pDV5 řepka 19 18
Přiklad 5
Analýza transgenních rostlin
Polymerázová řetězová reakce (PCR)
Genomová DNA pro PCR analýzu transgenních rostlin byla připravena metodou podle Edwardse et al. (1992). PCR byla provedena tak, jak je popsána Jepsonem et al. (Plant Molecular Biology Reportér 9(2):131-138, 1991). Sada oligonukleotidových PCR primerů byla navržena pro každou vloženou kazetu.
Rostliny byly analyzovány pomocí následujících kombinací oligonukleotidů:
pDVl: TMV1 + G0X1, G0X3 + nosí pDV2: TMV1 + EPSPS1, EPSPS3 + nosí pDV3: EPSPS3 + G0X1 pDV4: 35S + AlcRl, AlcA2 + GOX2 pdv5: 35S + AlcRl, AlcA2 + G0X1, TMV1 + EPSPS1
Sekvence oligonukleotidů jsou:
TMV1: 5 ' CTCGAGTATTTTTACAACAATTACCAAC
G0X1: 5'AATCAAGGTAACCTTGAATCCA
G0X3: 5'ACCACCAACGGTGTTCTTGCTGTTGA
NOS1: 5'GCATTACATGTTAATTATTACATGCTT • · ·
EPSPS1: 5'GTGATACGAGTTTCACCGCTAGCGAGAC
EPSPS3: 5'TACCTTGCGTGGACCAAAGACTCC
35S: 5'GTCAACATGGTGGAGCACG
AlcRl: 5'GTGAGAGTTTATGACTGGAGGCGCATC
A1CA2: 5'GTCCGCACGGAGAGCCACAAACGA
Selekce na glyfosatu
Křivky přežívání na glyfosatu pro tabák (cv. Samsun) a řepku (cv. Westar)
Rostliny obou druhů byly testovány v glyfosatu různých koncentrací tak že se ponořil, v případě tabáku úsek stonku dlouhý 5 až 6 mm s listovou uzlinou, nebo u řepky vzrostný vrchol se dvěma listy, do MS média s glyfosatem (isopropylaminglyfosat) v koncentracích 0 - 0,0055 - 0,011 0,0275 - 0,055 -0,01 mM. Po dvou týdnech růstu byly výsledky vyhodnoceny a jsou uvedeny v tab. 4.
Tab. 4.
Koncentrace Řepka cv. Westar Tabák
0 dobrý růst stonku, 4 až 5 nových stejně jako
listů, kořeny až 5 cm u řepky
0,005 stonek nerostl, 1 nový list, kořeny žádný orgán
do 1 cm nerostl
0,011 stonek nerostl, žádné nové listy, žádný orgán
kořeny do 0,5 cm nerostl
0,0275 stonek nerostl, žádné nové listy, žádný orgán
kořeny do 0,2 cm nerostl
0, 055 žádné orgány nerostly, konec stonku žádný orgán
černal nerostl
0,01 žádné orgány nerostly, konec stonku žádný orgán
černal nerostl
Selekce transformant rezistentních ke glyfosatu se prováděla na koncentraci glyfosatu 0,01 a 0,05 mM.
Konstitutivně tolerantní rostliny
Na základě údajů získaných na rostlinách divokého typu byly primární transformanty pDVl, 2 a 3, které byly pozitivní v PCR, dále testovány na MS médiu s glyfosatem v koncentraci popsané výše. Tabák byl testován tak, že 3 až 4 segmenty ze stonku každé transformanty byly vnořeny do média a netransformované rostliny Samsun sloužily jako kontrola. Vyhodnocování bylo založeno na chování většiny. Rostliny vykazující toleranci k nejvyšší koncentraci herbicidu byly pěstovány do zralosti ve skleníku, aby se sklidila semena.
Test segregace
Semena byla sterilizována 10% bělicím činidlem po dobu 10 minut. Po několikerém opláchnutí sterilní vodou bylo 200 semen vyseto na 1/2 MS médium (2,3 g/1 MS solí, 1,5% sacharóza, 0,8% Bactoagar, pH 5,9) se 100 mg/1 kanamycinu. Semena byla pěstována při 26°C v režimu světlo/tma 16 hodin/8 hodin.
Analýza westernovým přenosem
Proteiny GOX a EPSPS nadměrně exprimovány v E. coli. EPSPS elektroeluovány z buněk byly pomocí pET systému Po indukci IPTG byly GOX a rostoucích v kultivačních lahvích a použity k imunizaci králíků (dvě zvířata na každý klon).
Příprava extraktů z pletiva pro imunopřenos
120 mg listového pletiva se 60 mg PVP a 500 μΐ extrakčního pufru (50 mM Tris-HCL pH 8, 1 mM EDTA, 0,3 mM
DTT) bylo rozetřeno několik minut v mixéru. Po homogenizaci byl extrakt odstředěn 15 minut při 15000 rpm. Supernatant byl uložen při -80°C až do okamžiku použití. Koncentrace proteinů v extraktu byla měřena podle Bradforda.
Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s SDS (SDS-PAGE) a imunopřenos μα proteinu bylo rozděleno pomoci SDS-PAGE. Elektroforetický pufr obsahoval 14,4 % (hmotnost/objem) glycinu, 1 % (hmotnost/objem) SDS a 3 % (hmotnost/objem) Tris Base. Vzorky byly naneseny podle Laemmliho.
Po ukončení SDS-PAGE byly proteiny přeneseny elektropřenosem („elektroblotovaci přístroj Biorad) při 40 mA přes noc na nitrocelulózovou membránu (Hybond C, Amersham). Membrána byla obarvena v 0,05% CPTS ve 12 mM HC1. Pak byla membrána opláchnuta 12 mM HC1, odbarvena 5 až 10 minut v 0,5 M NaHCO3 a několikrát intenzívně opláchnuta vodou. Potom byla membrána blokována, imunodetekována a opláchnuta podle návodu soupravy ECL, Amersham. Nepřímá imunodetekce byla provedena králičí polyklonální protilátkou anti-GOX nebo anti-EPSPS ředěnou 1:10000 jako první protilátkou a druhou proti-králičí protilátkou, ředěnou 1:1000, konjugovanou s křenovou peroxidázou. Další odmývání bylo provedeno přes noc, aby se odstranilo pozadí. Detekce byla provedena pomocí soupravy ECL od Amersham a výsledky jsou ukázány na obr. 22, kde dráha (1) je kontrola a ostatní jsou transformanty. analýza westernovým přenosem prokázala, že některé transformanty jsou schopny exprimovat GOX a EPSPS.
Konstitutivně tolerantní rostliny
Buněčné extrakty byly připraveny z každé rostliny tolerantní ke glyfosatu a množství exprimovaného proteinu bylo stanoveno westernovou analýzou užitím příslušných protilátek. Rostliny exprimující vysoké kladiny GOX a EPSPS byly testovány na vysokých hladinách glyfosatu, aby se stanovil vztah exprese k toleranci k herbicidu.
Rostliny s indukovatelnou tolerancí
Primární transformanty, pozitivní v PCR testu z transformací s pDV4 a pDV5, byly přeneseny přímo do skleníku, aby se projevila indukovatelná tolerance ke glyfosatu. Po dvoutýdenním pěstování byly rostliny indukovány máčením kořenů v etanolu (5% roztok) po 24 hodin a pak byla provedena analýza westernovým přenosem, která hodnotila indukovanou hladinu exprese GOX. Po uplynutí doby potřebné k návratu do neindukovaného stavu se opakovala analýza westernovým přenosem, aby se vybraly rostliny s indukovatelnou tolerancí. Rostliny s nej vyšší expresí GOX po ošetření etanolem byly vybrány pro analýzu časového průběhu. Hladina GOX pak byla hodnocena westernovou analýzou po 6, 12, 18, 24, 36 a 48 hodinách od ošetření etanolem.
Rostliny transformované pDV4 a pDV5 s vysokou úrovní exprese GOX byly použity ve skleníkových pokusech k demonstraci indukovatelné tolerance ke glyfosatu. Rostliny byly indukovány různými koncentracemi etanolu (1 až 15 %) v zálivce ke kořenům rostlin v kultivačních nádobách. Po indukci GOX byly rostliny postříkány glyfosatem. Rostliny divokého typu a neindukované rostliny byly také ošetřeny herbicidem.
• φ • · · · • · · φ φφ · φφφφ φφφ ··· φφφφ • φφφφφ · φ » φφφφ · φ φ φφφφ φφφ φφφφφ ·· φφ φφ φφ
Analýza northernovým přenosem
Primární transformanty, obsahující vektor pro dvouděložné rostliny č. 2, 3 a 5, se analyzovaly northernovým přenosem, kde byl NcoI-SacI fragment CTP2-EPSPS užit jako sonda. Primární transformanty, obsahující vektor pro dvouděložné rostliny č. 1 a 3 se analyzovaly northernovým přenosem, kde byl NcoI-KpnI fragment CTP1-GOX užit jako sonda. Podobně byly analyzovány linie transgenní kukuřice obsahující vektor pro jednoděložné rostliny č. 1 a 2 pomocí CTP2-EPSPS sondy.
Transformanty obsahující vektor pro dvouděložné rostliny č. 5 nebo vektor pro jednoděložné rostliny č. 2 byly ošetřeny aplikací 5% etanolu na list, aby se indukoval GOX. 24 hodin po ošetření byla izolována RNA a analyzována northernovým přenosem se sondou CTP1-GOX.
Primární transformanty, pozitivní v PCR pro příslušnou kazetu a vykazující vhodné úrovně transkriptů GOX nebo EPSPS, byly dále analyzovány.
Test aktivity glyfosatoxidoreduktázy
Test aktivity glyfosatoxidoreduktázy byl proveden tak, jak jej popsali Kishore a Barry (WO 92/00377). Test spočíval v tom, že se kyslíkovou elektrodou měřil příjem kyslíku závislý na glyfosatu, detekovala se tvorba glyoxylatu reakcí s 2,4-dinitrofenylhydrazinem a stanovením hydrozonu pomocí HPLC, nebo výhodně užitím (3-14C)-glyfosatu jako substrátu a detekcí radioaktivní aminometylfosfonové kyseliny pomocí HPLC s anexovou kolonou.
Test aktivity EPSPS
Test aktivity syntázy 5-enol-pyruvyl-3-fosfošikimové kyseliny (EPSP) v rostlinných extraktech byl proveden tak,
že se 1) sledovalo ubýváni fosfoenolpyruvátu jako substrátu (Rubin, J.L., Gaines, C.G. a Jensen, R.A., Plant Physiol. 75: 839-845, 1984), nebo 2)provedením pokusu v opačném směru a spojením pyruvátkinázové a laktátdehydrogenázové aktivity (Mousdale, D.M., Coggins, J.R., Planta 160: 78-83, 1984), anebo 3) použitím 14-C značeného fosfoenolpyruvátu jako substrátu a detekováním radioaktivního EPSP pomocí HPLC s anexovou kolonou a průtokovým detektorem radioaktivity (Della-Ciopa et al., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 83: 68736877, 1986) . Poslední test byl také využit k potvrzení očekávání, že aktivita EPSP syntézy je relativně rezistentní k inhibici glyfosatem.
Průmyslová využitelnost
Vynález poskytuje udělující toleranci indukovatelným způsobem látky. Tento výrobu:
Indukovatelné způsob kontroly herbicidu, závislosti na plevelů, kde geny, jsou exprimovány specifické aplikaci aktivuj ící zemědělskou
1.
přístup má řadu výhod pro řízení tolerance k herbicidům riziko snížení výnosů spojené odstraňuje konstitutivní expresí genů rezistence k herbicidům.
Užití indukovatelného promotoru k řízení k herbicidu sníží riziko, že by se s vysokou
2.
rezistence genu rozšířily rezistentní druhy plevelů.
Rostliny, které mohou být takto modifikovány, jsou polní plodiny, obiloviny, geneticky ovoce a zelenina.
• · ♦ ·

Claims (19)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Chemicky indukovatelná genová expresní kazeta, obsahující indukovatelný promotor operativně spojený s cílovým genem, udělujícím rezistenci k herbicidu, kde cílový gen uděluje rezistenci k herbicidu N-fosfonometylglycinu, jeho solím nebo jeho derivátům.
  2. 2. Chemicky indukovatelná genová expresní kazeta podle nároku 1, kde herbicid je N-fosfonometylglycin, nebo jeho sůl nebo jeho derivát.
  3. 3. Chemicky indukovatelná genová expresní kazeta podle nároku 1 nebo 2, kde indukovatelný promotor je genový spínač tetracyklinového represoru, Lac represorový systém, mědí indukovatelný systém jako např. ACE 1, promotory indukovatelné kyselinou salicylovou jako např. systém PR-la, systém založený na steroidních hormonech jako např. glukokortikoidový, progesteronový nebo estroge.nový receptorový systém nebo modifikace některého z těchto systémů jako je např. glukokortikoidový receptorový systém včetně domény vázající GAL 4 z kvasinek a aktivátoru VP 16, systém hmyzích steroidních hormonů jako např. systém založený na receptoru ekdysonu z Heliothis virescens, benzensulfonamidový spínací genový systém, založený na proteinu alcR z Aspergillus genový spínač nidulans nebo promotor glutathion-S-transferázy.
  4. 4. Chemicky indukovatelná genová expresní kazeta, která obsahuje první promotor operativně spojený s regulační sekvencí alcR, která kóduje regulační protein alcR, a indukovatelný promotor operativně spojený s cílovým genem, který uděluje rezistenci k herbicidu, a kde indukovatelný promotor je aktivován regulačním proteinem v přítomnosti účinného vnějšího induktoru, jehož aplikace způsobí expresi cílového genu.
  5. 5. Genová expresní kazeta podle nároku 4, kde indukovatelný promotor je odvozený z alcA, alcR, aldA nebo jiného promotoru genu indukovaného alcR.
  6. 6. Genová expresní kazeta podle kteréhokoliv z nároků 4 a 5, kde indukovatelný promotor je chimérický promotor.
  7. 7. Rostlinná buňka obsahující genovou expresní kazetu podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 6.
  8. 8. Rostlinná buňka podle nároku 7, kde genová expresní kazeta je trvale vložena do genomu rostliny.
  9. 9. Rostlinné pletivo obsahující rostlinnou buňku podle kteréhokoliv z nároků 7 a 8.
  10. 10. Rostlina obsahující rostlinnou buňku podle kteréhokoliv z nároků 7 a 8.
  11. 11. Rostlina pocházející z rostliny podle nároku 10.
  12. 12. Semeno pocházející z rostliny podle kteréhokoliv z nároků 10 a 11.
  13. 13. Způsob řízení rezistence k herbicidu, vyznačující se tím, že obsahuje ·· ··«· transformováni rostlinné buňky rostlinnou genovou expresní kazetou podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.
  14. 14. Způsob selektivní kontroly plevele v poli s rostlinami podle kteréhokoliv z nároků 10 a 11 nebo se semeny podle nároku 12, vyznačující se tím, že se na pole aplikuje účinné množství herbicidu a exogenního induktoru.
  15. 15. Genová expresní kazeta, která obsahuje první promotor, operativně spojený s prvním cílovým genem kódujícím produkt udělující rezistenci k N-fosfonometylglycinu, a druhý promotor operativně spojený s druhým cílovým genem kódujícím produkt metabolizující druhý promotor je indukovatelný
    N-fosfonometylglycin, kde vněj ší aplikací účinného induktoru, exogenního
    N-fosfonometylglycinu a/nebo druhého cílového rostlině genu.
    kde uděluj e rezistenci exprese prvního
  16. 16. Genová expresní indukovatelný promotor kazeta podle je odvozený z alek, alcR, nároku
    15, kde aldk nebo jiného promotoru genu indukovaného alcR.
  17. 17. Genová expresní kazeta podle nároku 15 nebo 16, kde první promotor je konstitutivní promotor.
  18. 18. Genová expresní kazeta,
    5-enol-pyruvylšikimo-3-fosfát kde první cílový gen kóduje (EPSPS) CP4.
  19. 19. Genová expresní kazeta, kde druhý cílový gen kóduje glyfosatoxidázu.
    1/30
CZ98291A 1995-08-03 1996-08-02 Genová expresní kazeta poskytující indukovatelnou rezistenci k herbicidu CZ29198A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9515941.4A GB9515941D0 (en) 1995-08-03 1995-08-03 DNA constructs

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ29198A3 true CZ29198A3 (cs) 1998-06-17

Family

ID=10778720

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ98291A CZ29198A3 (cs) 1995-08-03 1996-08-02 Genová expresní kazeta poskytující indukovatelnou rezistenci k herbicidu

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6380463B1 (cs)
EP (1) EP0843730A1 (cs)
JP (1) JPH11510695A (cs)
CN (1) CN1197483A (cs)
AU (1) AU711653B2 (cs)
BG (1) BG102272A (cs)
BR (1) BR9609886A (cs)
CA (1) CA2224732A1 (cs)
CZ (1) CZ29198A3 (cs)
GB (1) GB9515941D0 (cs)
HU (1) HUP9802867A3 (cs)
MX (1) MX9800861A (cs)
NO (1) NO980450L (cs)
NZ (1) NZ313750A (cs)
PL (1) PL324821A1 (cs)
RU (1) RU2181380C2 (cs)
TR (1) TR199800131T1 (cs)
WO (1) WO1997006269A1 (cs)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5614395A (en) * 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
TW305860B (cs) * 1994-03-15 1997-05-21 Toray Industries
GB9606062D0 (en) 1996-03-22 1996-05-22 Zeneca Ltd Promoters
FR2751347B1 (fr) * 1996-07-16 2001-12-07 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides
PL333131A1 (en) * 1996-11-07 1999-11-22 Zeneca Ltd Plants immune to herbicides
EP1012257A4 (en) 1997-04-04 2004-08-18 Donald P Weeks METHODS AND MATERIALS FOR PRODUCING AND USING TRANSGENIC ORGANISMS DEGRADING DICAMBA
EP1017830A1 (en) * 1997-07-30 2000-07-12 Zeneca Limited Genetic method for controlling sprouting
US6632980B1 (en) 1997-10-24 2003-10-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
GB9902236D0 (en) * 1999-02-01 1999-03-24 Zeneca Ltd Formulation
EP1925672A1 (en) 2001-06-22 2008-05-28 Syngeta Participations AG Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides
CN1681923B (zh) 2002-07-18 2010-06-02 孟山都技术有限公司 利用人工的多核苷酸及其组合物来减少转基因沉默的方法
ATE465265T1 (de) * 2003-09-02 2010-05-15 Martin Fussenegger Regulierbare genexpression in säugerzellen und säugern
EP3339441A1 (en) 2005-10-13 2018-06-27 Monsanto Technology LLC Methods for producing hybrid seed
WO2007082206A2 (en) * 2006-01-10 2007-07-19 Yu Ruey J N-(phosphonoalkyl)-amino acids, derivatives thereof and compositions and methods of use
US20080313769A9 (en) 2006-01-12 2008-12-18 Athenix Corporation EPSP synthase domains conferring glyphosate resistance
BRPI0708480A2 (pt) 2006-03-02 2011-05-31 Athenix Corp processos e composições para aperfeiçoada atividade de enzima em plantas transgênicas
US8816106B2 (en) 2006-08-29 2014-08-26 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of fatty acids
ITUD20060280A1 (it) 2006-12-29 2008-06-30 Univ Degli Studi Udine Sequenza artificiale di dna evente funzione di leader in 5' (5'-utr) ottimizzata per la sovraespressione di proteine eterologhe in pianta
MX2010005693A (es) 2007-12-03 2010-06-01 Syngenta Participations Ag Proteinas suceptibles diseñadas enzimaticamente.
WO2009111587A2 (en) 2008-03-04 2009-09-11 Washington State University Compositions and methods for differential regulation of fatty acid unsaturation in membrane lipids and seed oil
CN102317459A (zh) 2008-11-18 2012-01-11 联邦科学技术研究组织 产生ω-3脂肪酸的酶和方法
CN101768213B (zh) 2008-12-30 2012-05-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用
CN101817879A (zh) 2009-02-26 2010-09-01 中国科学院遗传与发育生物学研究所 金属硫蛋白及其编码基因与应用
US20130055471A1 (en) 2009-12-15 2013-02-28 Edwin Henricus Antonius HOLMAN Transgenic Ozone-Resistant Plants
AU2011243085A1 (en) * 2010-04-23 2012-10-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Gene switch compositions and methods of use
CA2804025C (en) 2010-06-28 2023-02-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods of producing lipids
AR083029A1 (es) 2010-12-09 2013-01-23 Syngenta Participations Ag Metodos y composiciones que utilizan arn interferente pequeño (arnip) para el control de nematodos en plantas
KR102003178B1 (ko) 2011-03-25 2019-07-24 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 식물 조절 요소 및 그의 용도
US9139838B2 (en) 2011-07-01 2015-09-22 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for selective regulation of protein expression
EP2768950B1 (en) 2011-10-20 2018-03-07 University of Iowa Research Foundation N-demethyase genes and uses thereof
CN104271743B (zh) 2011-12-27 2019-11-05 联邦科学技术研究组织 产生脂质的方法
EP2798063B1 (en) 2011-12-27 2022-03-30 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Production of dihydrosterculic acid and derivatives thereof
AU2012324003B2 (en) 2011-12-27 2016-05-26 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Simultaneous gene silencing and supressing gene silencing in the same cell
EP3235373B1 (en) * 2012-02-01 2020-05-13 Dow AgroSciences LLC Synthetic chloroplast transit peptides
AU2013219927B2 (en) 2012-02-16 2018-11-08 Syngenta Participations Ag Engineered pesticidal proteins
SG11201408362SA (en) 2012-06-15 2015-01-29 Commw Scient Ind Res Org Production of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells
WO2013187957A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 University Of Iowa Research Foundation Caffeine responsive promoters and regulatory genes
CN105143453B (zh) 2012-06-22 2019-04-09 先正达参股股份有限公司 鞘翅目有害生物的生物控制
US9816102B2 (en) 2012-09-13 2017-11-14 Indiana University Research And Technology Corporation Compositions and systems for conferring disease resistance in plants and methods of use thereof
US10793872B2 (en) 2012-09-14 2020-10-06 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC HPPD variants and methods of use
SG11201604871VA (en) 2013-12-18 2016-07-28 Commw Scient Ind Res Org Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
WO2015196250A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising docosapentaenoic acid
CA2942171C (en) 2014-03-11 2023-05-09 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
JP2017511148A (ja) 2014-04-17 2017-04-20 ベーリンガー インゲルハイム エルツェーファウ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト ヘルパータンパク質を過剰発現するように改変された組換え宿主細胞
EP3132039B1 (en) 2014-04-17 2019-07-24 Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG Recombinant host cell for expressing proteins of interest
EP2952584A1 (en) 2014-06-04 2015-12-09 Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG Improved protein production
AR100874A1 (es) 2014-06-16 2016-11-09 Consejo Nac De Investig Científicas Y Técnicas (Conicet) Genes quiméricos y proteínas de resistencia oxidativa, y plantas transgénicas que incluyen los mismos
BR122020005879B1 (pt) 2014-07-07 2022-09-27 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processo para produzir um produto industrial, processo para a produção de lipídeos extraídos, processo para a obtenção de uma célula eucariótica recombinante, método de produção de uma planta, processo para produzir semente, lipídeos recuperados ou extraídos, produto industrial, processo para produzir combustível, processo para produzir combustível diesel sintético, processo para produção de um biocombustível, processo para produzir um ingrediente alimentar, alimentos e processo para a alimentação de um animal
US20170327834A1 (en) 2014-12-15 2017-11-16 Syngenta Participations Ag Pesticidal microrna carriers and use thereof
CN107109414A (zh) 2014-12-23 2017-08-29 先正达参股股份有限公司 鞘翅目有害生物的生物控制
CN107529787A (zh) 2015-04-10 2018-01-02 先正达参股股份有限公司 动物饲料组合物及使用方法
US11624076B2 (en) 2016-04-21 2023-04-11 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC TAL-effector mediated herbicide tolerance
WO2018076335A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Compositions and methods for enhancing abiotic stress tolerance
EP3544991A1 (en) 2016-11-23 2019-10-02 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Axmi669 and axmi991 toxin genes and methods for their use
BR112019012897A2 (pt) 2016-12-22 2020-01-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Métodos de controle de população de pragas, de proteção de plantas contra pragas e de aumento da produção em plantas
AR110757A1 (es) 2017-01-18 2019-05-02 Bayer Cropscience Lp Gen de toxina bp005 y procedimientos para su uso
BR112019014720A2 (pt) 2017-01-18 2020-04-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC métodos para conferir resistência a doença em uma planta e para aumentar o rendimento em uma planta
US11180770B2 (en) 2017-03-07 2021-11-23 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC HPPD variants and methods of use
WO2018165091A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
KR20190140939A (ko) 2017-03-29 2019-12-20 베링거 인겔하임 에르체파우 게엠베하 운트 코 카게 변경된 막 지질 조성물을 갖는 재조합 숙주세포
EP3625340A4 (en) 2017-05-18 2021-02-24 Cargill, Incorporated GENOME EDITING SYSTEM
BR112020008092A2 (pt) 2017-10-24 2020-09-15 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica
US20210032651A1 (en) 2017-10-24 2021-02-04 Basf Se Improvement of herbicide tolerance to hppd inhibitors by down-regulation of putative 4-hydroxyphenylpyruvate reductases in soybean
CN110951692B (zh) * 2019-12-03 2020-12-18 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞测定法
WO2022171827A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg Signal peptides for increased protein secretion

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198345A (en) 1985-04-15 1993-03-30 Gist-Brocades N.V. Vectors in use in filamentous fungi
WO1986006097A1 (en) 1985-04-15 1986-10-23 Allelix, Inc. Promoters of filamentous fungi and use thereof
FI891054A (fi) * 1988-03-08 1989-09-09 Ciba Geigy Ag Kemiskt reglerbara dna-sekvenser och gener samt olika anvaendningar daerav.
EP0388186A1 (en) 1989-03-17 1990-09-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company External regulation of gene expression
WO1990013658A1 (en) 1989-04-28 1990-11-15 The University Of Alberta Plant hormone regulated expression of genetically engineered gene products in plant cells
WO1992000377A1 (en) 1990-06-25 1992-01-09 Monsanto Company Glyphosate tolerant plants
CA2088661C (en) 1990-08-31 2001-12-18 Gerard F. Barry Glyphosate tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
GB9114259D0 (en) 1991-07-02 1991-08-21 Ici Plc Plant derived enzyme and dna sequences
GB9118759D0 (en) * 1991-09-02 1991-10-16 Univ Leicester Recombinant dna
ATE207962T1 (de) * 1992-04-13 2001-11-15 Syngenta Ltd Dna-konstruktionen und diese enthaltende pflanzen
US5717129A (en) 1995-02-16 1998-02-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for maintaining sterility in plants

Also Published As

Publication number Publication date
PL324821A1 (en) 1998-06-22
NO980450L (no) 1998-04-01
AU711653B2 (en) 1999-10-21
JPH11510695A (ja) 1999-09-21
RU2181380C2 (ru) 2002-04-20
TR199800131T1 (xx) 1998-05-21
MX9800861A (es) 1998-04-30
BG102272A (bg) 1998-09-30
EP0843730A1 (en) 1998-05-27
BR9609886A (pt) 1999-05-25
NO980450D0 (no) 1998-02-02
AU6627896A (en) 1997-03-05
WO1997006269A1 (en) 1997-02-20
US6380463B1 (en) 2002-04-30
GB9515941D0 (en) 1995-10-04
CN1197483A (zh) 1998-10-28
HUP9802867A3 (en) 2001-01-29
CA2224732A1 (en) 1997-02-20
NZ313750A (en) 1999-04-29
HUP9802867A2 (hu) 1999-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU711653B2 (en) Inducible herbicide resistance
AP863A (en) Dna constructs.
MXPA98000861A (en) Resistance inducible to herbic
US20090229006A1 (en) Herbicide resistant plants
EP1728868A2 (en) Herbicide resistant plants
MXPA98001008A (en) Constructs of
JP2004528808A (ja) 除草剤抵抗性植物
HRP960245A2 (en) Dna sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides
WO2021051265A1 (zh) 突变的羟基苯丙酮酸双加氧酶多肽、其编码基因及用途
CN114854702B (zh) 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途
CN110628733B (zh) 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途
AU2020101667A4 (en) Application of NAC091D transcription factor protein and its coding gene in inhibiting seed germination
CN111334484B (zh) 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途
CN110628732B (zh) 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途
CN110656094B (zh) 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途
CN115340987B (zh) 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途
CN115336534A (zh) 原卟啉原氧化酶的用途
AU771886B2 (en) Method for selective and optionally reversible degeneration of somatic plant tissue
AU2004203646A1 (en) Herbicide resistant plants

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic