KR20190140939A - 변경된 막 지질 조성물을 갖는 재조합 숙주세포 - Google Patents

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베링거 인겔하임 에르체파우 게엠베하 운트 코 카게
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발리도겐 게엠베하
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Abstract

본 발명은 재조합 생명공학 분야, 특히 단백질 발현 분야의 기술이다. 본 발명은 개략적으로 숙주세포로부터 목적 단백질(protein of interest, POI)를 발현시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 목적 단백질을 발현 및/또는 분비할 수 있는 숙주세포의 능력을 개선시키는 것 및 단백질 발현을 위한 숙주세포의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 세포 배양 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 의학적 목적 또는 식품을 위해 원하는 분자를 생산하기 위한 세포를 배양하는 것에 관한 것이다.

Description

변경된 막 지질 조성물을 갖는 재조합 숙주세포
본 발명은 재조합 생명공학 분야, 특히 단백질 발현 분야의 기술이다. 본 발명은 개략적으로 지질 대사에 관여하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현 또는 저발현(underexpression)시킴으로써 숙주세포로부터 목적 단백질(protein of interest, POI)을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 목적 단백질을 발현 및/또는 분비할 수 있는 숙주세포의 능력을 개선시키는 것 및 단백질 발현을 위한 숙주세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포 배양 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 의학적 목적 또는 식품 또는 사료 제품을 위해 원하는 분자를 생산하기 위한 세포를 배양시키는 것에 관한 것이다.
목적 단백질(POI)의 성공적인 생산은 원핵세포 및 진핵세포 숙주 모두로부터 이루어져 왔다. 가장 널리 알려진 숙주의 예로는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 세균, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)와 같은 효모, 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 또는 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei)와 같은 사상균(filamentous fungi), 또는 CHO 세포와 같은 포유류 세포가 있다. 몇몇 단백질의 수율은 쉽게 높은 수준에 도달할 수 있었던 반면, 그 밖의 많은 단백질은 상대적으로 낮은 수준으로만 생산되었다.
일반적으로 이종 단백질 합성은 다른 수준으로 제한될 수 있다. 잠재적인 제한은 전사 및 번역, 단백질 접힘 및, 해당되는 경우, 분비, 이황화 결합 형성 및 당화뿐만 아니라, 표적 단백질의 응집 및 분해이다. 전사는 강력한 프로모터를 이용하거나 이종 유전자의 복제물 수를 증가시킴으로써 향상시킬 수 있다. 그러나, 이러한 방법들은 분명히 정체기에 도달하여, 전사 제한 발현 다운스트림의 다른 병목 현상을 나타낸다.
숙주세포에서 높은 수준의 단백질 수율은 접힘, 이황화 결합의 형성, 당화, 세포 내 수송, 또는 세포로부터의 방출과 같은 하나 또는 그 이상 각각의 단계에서 제한될 수 있다. 숙주 유기체의 전체 유전체 DNA 서열을 이용할 수 있을지라도, 이와 관련된 수많은 기작들은 여전히 완벽하게 이해되지 못하고 있고, 현재 최신의 기술 지식에 기초하여서도 예측될 수 없다. 게다가, 높은 수율로 재조합 단백질을 생산하는 세포의 표현형은 성장률의 감소, 바이오매스 형성의 감소 및 세포 적합성이 전체적으로 감소될 수 있다.
당업계에서, 예를 들어 단백질 접힘을 용이하게 하는 샤페론의 과발현, 아미노산의 외부 공급 등과 같이 목적 단백질의 생산을 증가시키기 위한 다양한 시도가 있었다.
그러나, 목적 단백질을 생산 및/또는 분비할 수 있는 숙주세포의 능력을 개선시키는 방법이 여전히 필요하다. 본 발명의 근본적인 기술적 문제는 이러한 요구를 충족시키는 것이다.
기술적 문제의 해결책은 조작된 세포, 방법 및 용도와 같은 수단을 제공하는 것이고, 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 상기 숙주세포에서 과발현 또는 저발현함으로써 진핵생물 숙주세포에서 비-막 목적 단백질의 수율을 증가시키기 위한 상기 수단을 적용하는 것이다. 이러한 수단, 방법 및 용도는 본 명세서, 청구항에 기재되어 있고, 실시예에 예시되며 도면에서 도시화된다.
따라서, 본 발명은 숙주세포에서 재조합 단백질의 수율을 증가시키기 위한 단순하고 효율적이며 산업적 방법에서 사용하기에 적합한 새로운 방법과 용도를 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 이러한 목적을 달성하기 위한 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 명세서에서 사용된 단수 형태 “한(a)”, “한(an)” 및 “그(the)”는 문맥상 명백히 다르게 명시하지 않는 한 복수 형태를 포함함을 주지해야 한다. 따라서, 예를 들어, “숙주세포(a host cell)” 또는 “방법(a method)”은 하나 또는 그 이상의 숙주세포 또는 방법을 각각 포함하고, “그 방법(the method)”은 여기에서 기술된 그 방법으로부터 변형 또는 치환될 수 있는 것으로 당업계에서 통상의 기술자에게 알려진 동등한 단계 및 방법을 포함한다. 이와 유사하게, “방법들(methods)” 또는 “숙주세포들(host cells)”은 “숙주세포(a host cell)” 또는 “방법(a method)”을 각각 포함한다.
달리 명시하지 않으면, 일련의 요소들의 앞에 오는 용어 “적어도”는 일련의 매 요소를 지칭하는 것으로 이해된다. 당업자는 더 이상의 통상적 실험을 하지 않고도 여기에서 기술된 본 발명의 구현예에 대한 많은 균등물들을 인지하거나 알아낼 수 있을 것이다. 이와 같은 균등물들은 본 발명에 포함되는 것으로 본다.
용어 “및/또는”은 어디에서 사용되는지에 관계없이 “및”, “또는” 및 “상기 용어에 연결되는 모든 요소 또는 요소들의 다른 어떤 조합”의 의미를 포함한다. 예를 들어, A, B 및/또는 C는 A, B, C, A+B, A+C, B+C 및 A+B+C를 의미한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 더욱 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 그 지정된 숫자도 포함한다. 예를 들어, 약 20은 20을 포함한다.
용어 “이하(less than)”, “이상(more than)” 또는 “보다 큰(larger than)”은 지정된 숫자를 포함한다. 예를 들어, 20 이하는 20보다 적거나 같음을 의미하고, 20 이상은 20보다 많거나 같음을 의미한다.
이하 본 발명의 명세서와 청구범위와 항목(items)에 달리 명시가 없다면, 용어 “포함하다(comprise)” 및 “포함하다(comprises)” 및 “포함하는(comprising)”과 같은 변형은 정해진 정수(integers) (또는 단계) 또는 정수(또는 단계)의 그룹을 포함함을 내재하고 있는 것으로 이해되어야 할 것이다. 이는 임의의 정수(또는 단계) 또는 정수(또는 단계)의 그룹을 배제하지 않는다. 본 발명에서 사용된 용어 “포함하는(comprising)”은 “함유하는(containing)”, “구성되는(composed of)”, “포함하는(including)”, “가진(having)” 또는 “가진(carrying)”으로 치환되어 사용될 수 있고 반대도 또한 같으며, 예로서 용어 “가진(having)”은 용어 "포함하는(comprising)”으로 대체되어 사용될 수 있다. 본 발명에서 “구성되는(consisting of)”이 사용되는 경우, 청구범위/항목에 명시되지 않은 임의의 정수 또는 단계를 배제한다. 본 발명에서 “본질적으로 구성되는(consisting essentially of)”이 사용되는 경우, 실질적으로 청구범위/항목의 기본적이고 신규한 특성에 영향을 주지 않는 정수 또는 단계를 배제하지 않는다. 본 발명에서 각각의 경우에, 용어 “포함하는(comprising)”, “본질적으로 구성되는(consisting essentially of)” 및 “구성되는(consisting of)” 중 어느 하나는 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다.
또한, 본 발명의 대표적인 구현예를 기술함에 있어서, 본 명세서는 본 발명의 방법 및/또는 과정을 특정 단계의 배열로 나타낼 수 있다. 그러나, 상기 방법 또는 과정의 범위가 하기 기술된 특정 순서의 단계에 의존하지 않는 한, 상기 방법 또는 과정은 특정 단계의 배열에 한정되지 않아야 한다. 당업자라면 이해되는 바와 같이, 단계의 다른 배열도 가능할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 특정 순서의 단계는 청구범위의 제한으로서 구축된 것이 아니다. 추가로, 본 발명의 방법 및/또는 과정에 관한 청구범위에 기재된 순서는 이들 단계의 수행을 제한하는 것은 아니며, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 여전히 유지하면서, 쉽게 이들의 배열을 변형시킬 수 있도록 이해될 수 있다.
본 발명은 특히 본 발명에 기술된 방법론, 프로토콜, 재료, 시약 및 물질 등에 제한되지 않는 것으로 이해될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 청구범위/항목에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서의 전반에 걸쳐 인용된 모든 출판물 및 특허문헌(모든 특허 문헌, 특허 출원, 과학 출판물, 제조업체의 사양, 설명서 등)은 본 명세서에, 그에 관계 없이, 그 전체가 참조로 포함된다. 본 명세서의 어떠한 기재도 선행 발명에 의해 본 발명이 그러한 공개보다 선행할 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석될 수 없다. 참조로 인용된 자료가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 한도 내에서, 본 명세서가 이러한 자료를 대체할 것이다.
본 발명은 지질 대사에 관여하는 단백질(본 발명의 “보조 단백질(helper protein)”)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열(“본 발명의 폴리뉴클레오타이드”)의 놀라운 발견에 기초하며, 이 단백질의 발현, 바람직하게는 과발현은 목적 단백질(POI)의 수율을 증가시킨다. 본 발명은 지질 대사에 관여하는 적어도 하나, 예를 들어 하나 또는 그 이상의 단백질을 과발현할 수 있도록 숙주세포를 조작함으로써 POI의 수율을 개선시키는데 유용한 방법 및 물질을 제공한다. 바람직한 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 15 중 어느 하나, 예를 들어 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15와 같이 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 보조 단백질(지질 대사에 관여)을 코딩하고, 여기서 기능적 상동체는 각각 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이다.
본 발명은 또한 지질 대사에 관여하는 단백질(“본 발명의 보조 단백질”)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열(“본 발명의 폴리뉴클레오타이드”)의 놀라운 발견에 기초하며, 이 단백질의 저발현은 목적 단백질(POI)의 수율을 증가시킨다. 이러한 보조 단백질은 또한 본 명세서에서 때때로 “KO 단백질” 또는 “KO 보조 단백질”을 의미한다. 따라서, 본 출원의 문맥에서 오직 “보조 단백질” 또는 “보조 유전자” 또는 “보조 인자” 등으로 사용되었을지라도, 이것이 기술적으로 의미가 있는 경우(즉, 저발현이 POI의 수율 증가를 야기하는 경우), 용어 “보조 단백질” 또는 “보조 유전자” 또는 “보조 인자” 등은 또한 “KO 보조 단백질" 또는 “KO 보조 유전자” 또는 “KO 보조 인자”를 포함한다. 본 발명은 또한 지질 대사에 관여하는 적어도 하나, 예를 들어 하나 또는 그 이상의 단백질을 저발현할 수 있도록 숙주세포를 조작함으로써 POI의 수율을 개선시키는데 유용한 방법 및 물질을 제공한다. 바람직한 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17로 표시되는 아미노산 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 KO 단백질(지질 대사에 관여)을 코딩하고, 여기서 기능적 상동체는 각각 SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17 중 어느 하나에 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이다.
본 발명자들의 발견은 본 발명에 이르기까지 지질 대사가 진핵생물 숙주세포, 특히 진균 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 것과 연관지어지지 않았기 때문에 다소 놀랍다. 이론에 얽매이지 않고, 지질 대사의 변형은 진핵생물 숙주세포, 특히 진균 숙주세포에서 생물막 지질 조성을 변형시켜서, 재조합 단백질 생산에 긍정적인 영향을 미친다.
지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질의 과발현은, 바람직하게는 본 명세서에 기술된 보조 단백질의 적어도 하나의 과발현은 목적 단백질의 수율을 증가시키는 본 명세서에 기술된 숙주세포의 막, 특히 세포막 또는 소포체 막의 지질 조성을 변화시킨다고 가정된다.
구체적으로, 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질의 과발현, 바람직하게는 본 명세서에서 기술된 스핑고지질의 분자 종 패턴(molecular species pattern)을 변경시키는 적어도 하나의 보조 단백질의 과발현은, 바람직하게는 세라마이드의 C26 지방 아실 모이어티 및/또는 이노시톨-함유 포스포릴세라마이드 (이노시톨포스포릴세라마이드(IPC), 만노실-이노시톨포스포릴세라마이드(MIPC), 만노실-디이노시톨-포시포릴세라마이드(M(IP)2C)와 같은)의 함량을 증가시키고/거나 세라마이드의 C24 지방 아실 모이어티 및/또는 이노시톨-함유 포스포릴세라마이드(이노시톨포스포릴세라마이드(IPC), 만노실-이노시톨포스포릴세라마이드(MIPC), 만노실-디이노시톨-포스포릴세라마이드(M(IP)2C)와 같은)의 함량을 감소시킴으로써 목적 단백질의 수율을 증가시킨다고 여겨진다.
바람직하게는, 세라마이드, 예를 들어, IPC, MIPC 및 M(IP)2C 에 혼합된 26 탄소(C26) 사슬 길이의 지방 아실의 상대적 함량은 적어도 100% 증가된 반면, 24 탄소(C24) 사슬 길이의 지방 아실의 상대적 함량은 적어도 70% 감소된다.
바람직하게는, 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질, 바람직하게는 본 명세서에서 기술된 적어도 하나의 보조 단백질의 과발현이 대부분의 스핑고지질의 분자 종 패턴의 변경을 초래하고, 즉, 세라마이드 및 IPC-클래스 이노시톨-함유 포스포리세라마이드(IPC, MIPC, M(IP)2C)의 지방 아실 모이어티가 우선적으로 C24 대신 C26을 함유한다. C26의 함량은 빈 벡터에 비해 적어도 100% 향상되는 스핑고지질(세라마이드, IPC, MIPC 및 M(IP)2C)의 종류에 의존한다.
또한 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질, 바람직하게는 본 명세서에 기술된 보조 단백질의 적어도 하나의 과발현은 IPC 및 MIPC의 함량을 감소시키고(대략 230%로) 및/또는 이노시톨-함유 포스포릴세라마이드의 성숙한 형태인 M(IP)2C의 형성을 적어도 6배(600%) 증가시키는 것으로 가정되며, 이는 목적 단백질의 수율 증가를 초래한다.
추가로, 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질의 저발현, 바람직하게는 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 보조 단백질 - 여기서 KO 보조 단백질 -의 저발현은 목적 단백질의 수율 증가를 초래하는 비-극성 저장 지질 트리글리세라이드(TG)를 고갈시키는 것으로 여겨진다.
용어 “수율(yield)”은 본 발명에서 기술된 POI 또는 모델 단백질(들)의 양을 나타내며, 특히 SDZ-Fab(SEQ ID NO: 37의 중쇄(heavy chain) 및 SEQ ID NO: 38의 경쇄(light chain)) 및 HyHEL-Fab(SEQ ID NO: 39의 중쇄 및 SEQ ID NO: 40의 중쇄), 각각, 이들은, 예를 들어, 조작된 숙주세포로부터 수득되고, 증가된 수율은 상기 숙주세포의 증가된 POI의 생산 또는 분비의 양에 기인할 수 있다. 수율은 mg POI/g 숙주세포의 바이오매스(세포 건조 중량 또는 세포 습윤 중량으로 측정)로 나타낼 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 “농도(titer)”는 생산된 POI 또는 모델 단백질의 양과 유사한 의미를 나타내며, mg POI/L 배양물의 상청액으로 나타낼 수 있다. 수율의 증가는 조작되기 전의 숙주세포, 예를 들어, 비-조작된 숙주세포로부터 얻은 수율과 조작된 숙주세포로부터 얻은 수율을 비교하여 확인될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에서 기술된 모델 단백질에 대한 문단에서 사용된 “수율”은 실시예 4c에 기술된 바와 같이 확인된다. 따라서, 본 발명에서 기술된 모델 단백질에 대한 문단에서 사용된 “수율”은 또한 “Fab 수율” 또는 “Fab 농도”를 나타낸다. Fab 농도는 mg/L로, Fab 수율은 mg/g 바이오매스(세포 건조 중량 또는 세포 함수 중량으로 측정)로 주어진다. SDZ-Fab 및 HyHEL-Fab는, 각각, SEQ ID NO: 41과 SEQ ID NO: 42, 및 SEQ ID NO: 43과 SEQ ID NO: 44로 표시되는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.
간략하게, 모델 단백질 HyHEL-Fab 및 SDZ-Fab을 발현하는 P. pastoris 균주 CBS7435mutS pPM2d_pAOX HyHEL 및/또는 CBS7435mutS pPM2d_pAOX SDZ(이들의 생산에 대한 실시예 1 참조)은 각각 본 명세서에서 기술된 바와 같이 보조 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 함께 조작된다. 동시-과발현을 위해, 보조 단백질을 코딩하는 상기 유전자는 P. pastoris GAP 프로모터의 조절 하에서 복제되었고, 실시예 3b 및 실시예 4에서 기술된 Fab 생산 균주로 형질전환되었다. 유전자는 또한 P. pastoris AOX 프로모터의 조절 하에서 복제될 수 있다. 저발현을 위해, KO 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 유전자는 Fab 생산 균주의 유전체에서 넉아웃된다(실시예 5 참조). 조작된 세포는 10 g/L 글리세롤 및 50 mg/mL Zeocin을 함유하는 YP-배지에서 25℃로 밤새도록 성장된다. 이러한 배양물의 부분 표본(2.0의 최종 OD600에 상응)은 20 g/L 포도당 및 포도당 정제를 함유하는 합성 배지 M2로 옮겨지고(실시예 4a에서 기술됨), 25℃에서 25시간동안 배양된다. 배양물은 세척되고 합성 배지 M2에서 재현탁되며 부분 표본(4.0의 최종 OD600에 상응)은 5 g/L 메탄올이 첨가된 합성 배지 M2로 옮겨졌다. 메탄올(5 g/L)은 12시간마다 첨가되었다. 48시간 후, 원심분리에 의해 세포를 수득하였다. 바이오매스는 1 mL 세포 현탁액으로부터 유래한 세포 펠릿의 중량을 측정함으로써 확인되었다. 상청액은 각각 ELISA를 통해 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab를 정량화하는데 사용되었다(실시예 4c에서 기술됨). 특히, 항-인간 IgG 항체(예를 들어. ab7497, Abcam)는 코팅 항체로서 사용되었고, 예를 들어, 염소 항-인간 항-인간 IgG(Fab 특이적) 항체(예를 들어, Sigma A8542, 알칼라인 포스파타제가 결합된)는 검출 항체로서 사용되었다. 상용화된 인간 Fab/카파, IgG 단편은 시험 표준으로서, 100 ng/mL의 시작 농도로 이용되었고, 결과적으로, 상청액 샘플은 희석되었다. 수율의 증가는 세포가 폴리펩타이드를 과발현하도록 조작되기 전 및 후의 POI 수율의 비교에 기초하여 결정될 수 있다. 실시예에 표시된 모델 단백질 SDZ-Fab 및/또는 HyHEL-Fab을 포함하는 표준 실험은 수율 차이를 확인하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 지질 대사에 관여하는 새롭게 발견된 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드(본 명세서에서 “보조 단백질”이라고도 나타냄) 및 POI 수율을 증가시키기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은, 이에 제한되는 것은 아니나, SEQ ID NO: 1 내지 17 중 어느 하나로 표시되는 보조 단백질 또는 이들의 기능적 상동체에 기초된다. 기능적 상동체의 의미는 본 발명의 후반부에 정의되어 있다. 본 발명의 보조 단백질의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 19 내지 35에 각각 나열되어 있다. 본 명세서에 사용된 것과 같이, 이러한 단백질은 본 발명에서 복수 또는 단수 형태로 상호 교환적으로 나타내지만, 달리 명시적으로 언급되지 않는한 단수 형태로 이해되어야 한다. SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 지질 대사에 관여하는 보조 단백질은 바람직하게 진핵생물 숙주세포에서 과발현되는 반면, SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 지질 대사에 관여하는 보조 단백질은 바람직하게 진핵생물 숙주세포에서 저발현된다.
본 발명은 추가로 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(이하 “본 발명의 폴리뉴클레오타이드(들)” 또는 “본 발명의 뉴클레오타이드”를 의미한다) 및, POI 수율을 증가시키기 위한 이들의 개별적 또는 조합된 용도에 관한 것이다. 상기 폴리뉴클레오타이드(들)는 숙주세포 내로 도입되거나, 이미 세포 내 존재하는 경우, 과발현되는 방식으로 조작될 수 있다. 보조 단백질을 과발현하기 위해 사용된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 15, 예를 들어 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중 어느 하나 또는 이들의 기능적 상동체를 암호화한다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 예로는 SEQ ID NO: 19 내지 SEQ ID NO: 33, 예를 들어, SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33에 기재된 것들이 있다. SEQ ID NO: 19 내지 33 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 지질 대사에 관여하는 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게 진핵생물 숙주세포에서 과발현되는 반면, SEQ ID NO: 34 또는 35로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 지질 대사에 관여하는 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게 진핵생물 숙주세포에서 저발현된다.
따라서, 본 발명은 진핵생물 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 숙주세포에서 지질 대사에 관여하는 보조 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 과발현시켜, 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현하지 않는 숙주세포에 비해 상기 목적 단백질의 수율을 증가시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 지질 대사에 관여하는 상기 보조 단백질은 전사 인자가 아니다. 바람직하게, 지질 대사에 관여하는 상기 보조 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 15, 예를 들어 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는다.
바람직하게, 보조 단백질의 과발현의 관점에서, 지질 대사는 스핑고지질 생합성, 인지질 생합성, 지질 수송, 또는 에르고스테롤 생합성이다. 본 발명의 보조 단백질의 과발현에 의한 지질 대사의 변형은 진핵생물 숙주세포, 특히 진균 숙주세포에서 생물막 지질 조성을 변경시켜서 재조합 단백질 생산에 긍정적으로 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 과발현의 내용에서 용어 “지질 대사”가 사용될 때, “지질 대사”는 용어 “생물막 지질 조성의 변형”, 바람직하게 진핵생물 숙주세포, 특히 진균 숙주세포에서의 생물막 지질 조성의 변형으로 치환될 수 있다. 생물막 지질 조성의 변형은 스핑고지질 생합성, 인지질 생합성, 지질 수송 또는 에르고스테롤 생합성에 의해 영향받을 수 있다.
나아가 본 발명은 진핵생물 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은
- 지질 대사에 관여하고, SEQ ID NO: 1 내지 15, 예를 들어 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열, 바람직하게 SEQ ID NO: 1 내지 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현하도록 숙주세포를 조작하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이며;
- 상기 목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 상기 숙주세포를 조작하고;
- 상기 목적 단백질을 발현하기에 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하고; 선택적으로
세포 배양물로부터 상기 목적 단백질을 분리하는 것을 포함한다.
또한 본 발명은 진핵생물 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은
- 지질 대사에 관여하고, SEQ ID NO: 1 내지 15, 예를 들어 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열, 바람직하게 SEQ ID NO: 1 내지 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 12 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현하도록 조작된 숙주세포를 제공하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이며, 여기서 상기 숙주세포는 상기 목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것이고;
- 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 과발현하고 상기 목적 단백질을 발현하기에 적합한 조건 하에서 숙주세포를 배양하고, 선택적으로
세포 배양물로부터 상기 목적 단백질을 분리하는 것을 포함한다.
단백질의 수율을 증가시키는 방법과 관련하여, “보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현/저발현하도록 조작하는 단계” 및 “목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 조작하는 단계”의 순서는 “목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 조작하는 단계”가 “보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현/저발현하도록 조작하는 단계”에 앞서도록 대안적으로 서로 바꿀 수 있다. 특히, 본 명세서에 기술된 것과 같이, 목적 단백질의 수율은 보조 단백질이 과발현되고/거나 KO 단백질이 저발현될 때 증가된다.
본 발명은 또한 목적 단백질을 생산하기 위한 재조합 진핵생물 숙주세포를 제공하며, 여기서 숙주세포는 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현하도록 조작된다.
바람직하게, 본 발명은 목적 단백질을 생산하기 위한 재조합 숙주세포를 제공하며, 여기서 숙주세포는 SEQ ID NO: 1 내지 15, 예를 들어, SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중 어느 하나, 바람직하게 SEQ ID NO: 1 내지 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 12 내지 15 중 어느 하나, 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현하도록 조작되고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이다.
바람직한 구현예에서, 보조 단백질은, 바람직하게는 과발현될 때, 숙주세포에서 모델 단백질 SDZ-Fab (SEQ ID NO: 37의 중쇄 및 SEQ ID NO: 38의 경쇄; 도 2) 또는 HyHEL-Fab (SEQ ID NO: 39의 중쇄 및 SEQ ID NO: 40의 경쇄; 도 2)의 수율을, 상기 보조 단백질이 과발현되도록 조작되기 전의 숙주세포에 비해, 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 적어도 200%, 및 바람직하게 적어도 10% 증가시킬 수 있다. 조작하기 전의 숙주세포는 본 발명의 보조 단백질을 과발현하지 않으며, 조작된 후에는 적합한 배양 조건 하에서 보조 단백질을 과발현할 수 있다. 놀랍게도, 실시예에서 기술된 예시의 재조합 세포는 모델 단백질 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab의 수율을 적어도 20%(1.2배 변화) 증가시킬 수 있음이 밝혀졌다.
본 발명은 또한 진핵생물 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 지질 대사에 관여하는 보조 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 상기 숙주세포에서 저발현시켜, 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 저발현하지 않는 상기 숙주세포에 비해 상기 목적 단백질의 수율을 증가시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 상기 지질 대사에 관여하는 보조 단백질은 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이다.
따라서, 본 발명은 진핵생물 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은
- 지질 대사에 관여하고 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 저발현하도록 숙주세포를 조작하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이며,
- 상기 목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 상기 숙주세포를 조작하고,
- 상기 목적 단백질을 발현하기에 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하고, 선택적으로
세포 배양물로부터 상기 목적 단백질을 분리하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 진핵생물 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은
- 지질 대사에 관여하고 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 저발현하도록 조작된 숙주세포를 제공하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이며, 여기서 상기 숙주세포는 상기 목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것이고;
- 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 저발현하고 상기 목적 단백질을 발현하기에 적합한 조건 하에서 숙주세포를 배양하고, 선택적으로
세포 배양물로부터 상기 목적 단백질을 분리하는 것을 포함한다.
단백질의 수율을 증가시키는 방법과 관련하여, “보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현/저발현하도록 조작하는 단계” 및 “목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 조작하는 단계”의 순서는 “목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 조작하는 단계”가 “보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현/저발현하도록 조작하는 단계”에 앞서도록 대안적으로 서로 바꿀 수 있다. 특히, 본 명세서에 기술된 것과 같이, 목적 단백질의 수율은 보조 단백질이 과발현되고/거나 KO 단백질이 저발현될 때 증가된다.
또한 본 명세서는 목적 단백질을 생산하기 위한 재조합 진핵생물 숙주세포를 제공하며, 여기서 숙주세포는 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 저발현하도록 조작된다. 바람직하게는, 상기 지질 대사에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이다.
바람직하게, 보조 단백질의 저발현과 관련하여, 보조 단백질이 관여하는 지질 대사는 지질 저장이다. 바람직하게, 보조 단백질의 저발현과 관련하여, 보조 단백질은 전사 인자가 아니다. 본 발명의 보조 단백질의 저발현에 의한 지질 대사의 변형은 진핵생물 숙주세포, 특히 진균 숙주세포에서 생물막 지질 조성을 변경시켜서 재조합 단백질의 생산에 긍정적으로 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 저발현과 관련하여 용어 “지질 대사”가 사용될 때, “지질 대사”는 용어 “생물막 지질 조성의 변형”, 바람직하게는 진핵생물 숙주세포, 특히 진균 숙주세포에서 생물막 지질 조성의 변형으로 치환될 수 있다. 생물막 지질 조성의 변형은 비-극성 저장 지질 생합성 또는 인지질 대사에 의해 영향받을 수 있다.
바람직한 구현예에서, 보조 단백질은, 바람직하게 저발현될 때, 숙주세포에서 모델 단백질 SDZ-Fab (SEQ ID NO: 37의 중쇄 및 SEQ ID NO: 38의 경쇄) 또는 HyHEL-Fab (SEQ ID NO: 39의 중쇄 및 SEQ ID NO: 40의 경쇄)의 수율을, 상기 보조 단백질이 저발현되도록 조작되기 전의 숙주세포에 비해, 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 적어도 200%, 및 바람직하게 적어도 10% 증가시킬 수 있다. 조작되기 전의 숙주세포는 본 발명의 보조 단백질을 저발현하지 않고, 조작된 후에는 적합한 배양 조건 하에서 보조 단백질을 저발현할 수 있다. 놀랍게도, 실시예에서 기술된 예시의 재조합 세포는 모델 단백질 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab의 수율을 적어도 20%(1.2배 변화) 증가시킬 수 있음이 밝혀졌다. 일부 예시에서, 수율은 실시예 6b에 나타난 것과 같이, 80% 증가하였다.
본 발명은 또한 목적 단백질(POI)를 생산하기 위한, 본 명세서에 기술된 것과 같은 숙주세포의 용도를 제공한다. 숙주세포는 하나 또는 그 이상의 POI(들)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위해 유리하게 사용될 수 있고, 그 후에 POI를 발현시키기에 적합한 조건 하에서 배양될 수 있으며, 이에 의해 본 발명의 보조 단백질은 과발현되거나 저발현된다.
지질 대사에 관여하고, SEQ ID NO: 1 내지 17, 예를 들어 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 보조 단백질을 코딩하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 17 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는, 분리된 폴리뉴클레오타이드는 또한 본 발명에서 의해 제공된다. 바람직하게, 지질 대사에 관여하고, SEQ ID NO: 1 내지 15, 예를 들어 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 보조 단백질을 코딩하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는, 분리된 폴리뉴클레오타이드는 또한 본 발명에 의해 제공된다.
마찬가지로, 보조 단백질을 코딩하고 SEQ ID NO: 19 내지 SEQ ID NO: 36 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드는 또한 본 발명에 의해 제공된다. 숙주세포에서 융합되거나 목적 단백질을 생산하는데 사용되는 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게 SEQ ID NO: 19 내지 SEQ ID NO: 33 또는 SEQ ID NO: 36 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 유사하게, 본 명세서에서 기술된 분리된 보조 단백질은 목적 단백질을 생산하는데 사용된다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 보조 단백질을 코딩한다.
본 발명은 또한 본 발명의 적어도 0.25%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 또는 10%의 목적 단백질 및 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 이종의 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있다.
[본 발명의 항목]
1. 진핵생물 숙주세포에서 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 과발현시킴으로써, 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현시키지 않은 숙주세포에 비해 목적 단백질의 수율을 증가시키는 단계를 포함하는
진핵생물 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법.
2. 1 항목의 방법으로서,
상기 지질 대사에 관여하는 단백질은 스핑고지질 생합성, 인지질 생합성, 지질 수송, 지질 저장, 에르고스테롤 생합성, 지방산 생합성, 포스파티드산 생합성 및/또는 인지질 대사 과정에 관여하는 방법.
3. 1 또는 2 항목의 방법으로서,
상기 지질 대사에 관여하는 단백질은 전사 인자가 아닌 방법.
4. 1 내지 3 항목 중 어느 하나의 방법으로서,
상기 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 방법.
5. 1 내지 4 항목 중 어느 하나의 방법으로서,
상기 스핑고지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 방법.
6. 1 내지 4 항목 중 어느 하나의 방법으로서,
상기 인지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 방법.
7. 1 내지 4 항목 중 어느 하나의 방법으로서,
상기 지질 수송에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 방법.
8. 1 내지 4 항목 중 어느 하나의 방법으로서,
상기 에르고스테롤 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 SEQ ID NO: 12 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 12 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 방법.
9. 1 내지 4 항목 중 어느 하나의 방법으로서,
상기 지질 저장에 관여하는 단백질은 PP7435_Chr4-0493 및 PP7435_Chr4-0494 (ARV1) 사이에 명시된 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr4-0493 및 PP7435_Chr4-0494 사이에 명시된 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 방법.
10. 1 내지 9 항목 중 어느 하나의 방법으로서:
- 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현하도록 숙주세포를 조작하고, 이 숙주세포는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 바람직하게 SEQ ID NO: 1 내지 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO:l 12 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이고;
- 상기 숙주세포가 목적 단백질을 코딩하는 이종 기원의 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 조작하며,
- 상기 숙주세포를 상기 목적 단백질을 발현하기 위해 적합한 조건 하에서 배양하고, 선택적으로
- 세포 배양액으로부터 상기 목적 단백질을 분리하는 것을 포함하는 방법.
11. 1 내지 9 항목 중 어느 하나에 따른 목적 단백질을 생산하는 방법:
- 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 과발현하도록 조작된 숙주세포를 제공하고, 이 숙주세포는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 바람직하게 SEQ ID NO: 1 내지 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이고, 여기서 상기 숙주세포는 목적 단백질을 코딩하는 이종 기원의 폴리뉴클레오타이드를 포함하며;
- 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체가 과발현되고 상기 목적 단백질이 발현되기에 적합한 조건 하에서 숙주세포를 배양하며, 선택적으로
- 세포 배양액으로부터 상기 목적 단백질을 분리하는 것을 포함하는 방법.
12. 1 내지 11 항목 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 과발현은 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드의 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 복제물을 가짐으로써 상기 숙주세포에서 달성되는 방법.
13. 1 내지 12 항목 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 숙주세포의 적어도 하나의 염색체 안에 삽입되는 방법.
14. 13 항목의 방법으로서, 여기서 삽입은 이소성으로(ectopically) 및/또는 자연적 유전자 자리(natural locus)에 있는 방법.
15. 14 항목의 방법으로서, 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 게놈의 AOX1, GAP, ENO1, TEF, HIS4, TYR1, HIS3, LEU2, URA3, LYS2, ADE2, TRP1, GAL1, 또는 ADH1 위치에 삽입되는 방법.
16. 1 내지 12 항목 중 어느 하나의 방법으로서, 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 벡터 또는 플라스미드에 포함되는 방법.
17. 15 항목의 방법으로서, 벡터는 Yip 유형의 벡터, YEp 유형의 벡터, YRp 유형의 벡터, YCp 유형의 벡터, pGPD-2, pAO815, pGAPZ, pGAPZpHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K, pPICZ, pPICZ pPIC3K, pHWO10, pPUZZLE, 또는 2 μm 플라스미드인 방법.
18. 1 내지 17 항목 중 어느 하나의 방법으로서, 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 과발현은 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 작동시키는 재조합 프로모터를 사용함으로써 달성되는 방법.
19. 1 내지 17 항목 중 어느 하나의 방법으로서, 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 과발현은 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 내재된 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 변형시킴으로써 달성되는 방법.
20. 18 항목의 방법으로서, 여기서 프로모터는 PAOX1, PTPI, PPGK, PGAPDH, PLAC, PGAL, PPGI, PGAP, PTEF, PENO1, PTPI, PRPS2, PRPS7, PRPS31, PRPL1, PFLD, PICL, PTHI, PSSA1, PHSP90, PKAR2, PGND1, PGPM1, PTKL1, PPIS1, PFET3, PFTR1, PPHO8, PNMT1, PMCM1, PUBI4, PRAD2, PPET9, PFMD, PGAL1, PADH1, PADH2/GAP, PCUP1, 또는 PMAL인 방법.
21. 1 내지 17 항목 중 어느 하나의 방법으로서, 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 과발현은 프로모터의 활성을 향상시키기 위한 인핸서를 사용함으로써 달성되는 방법.
22. 21 항목의 방법으로서, 인핸서는 효모 상위 활성 서열 UAS/GAL인 방법.
23. 1 내지 22 항목 중 어느 하나의 방법으로서, 진핵생물 숙주세포는 비-포유류 진핵생물 숙주세포인 방법.
24. 23 항목의 방법으로서, 비-포유류 진핵생물 숙주세포는 진균 숙주세포인 방법.
25. 24 항목의 방법으로서, 상기 진균 숙주세포는 피키아 파스토리스, 한세눌라 폴리모르파, 트리코더마 레세이, 사카로마이세스 세레비지에, 클루베로마이세스 락티스, 야로위아 리포리티카, 피키아 메타놀리카, 캔디다 보이디니이, 코마가타엘라 속, 아스퍼질러스 속, 또는 스키조사카로마이세스 폼베인 방법.
26. 1 내지 25 항목 중 어느 하나의 방법으로서, SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 15, PP7435_Chr3-0788 (SUR2), PP7435_Chr3-1005 (AUR1), PP7435_Chr4-0626 (IFA38), PP7435_Chr3-0669 (SCS7), PP7435_Chr3-0636 (CRD1), PP7435_Chr3-0950 (SLC4), PP7435_Chr2-0585 (PIS1), PP7435_chr1-0934 (PRY2), PP7435_Chr4-0963 (FAD12) 및 PP7435_Chr1-0794 (PSD1) 중 어느 하나로부터 선택된 상기 지질 대사에 관여하는 단백질 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상이 과발현되는 방법.
27. 26 항목의 방법으로서, 스핑고지질 생합성에 관여하는 다음의 적어도 하나의 단백질은 과발현되는 방법:
(a) SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(b) SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(c) SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(d) SEQ ID NO: 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(e) SEQ ID NO: 1 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(f) SEQ ID NO: 1, 3 또는 4로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1, 3 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(g) SEQ ID NO: 1, 3, 4 또는 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1, 3, 4 또는 8로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(h) SEQ ID NO: 5 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 5 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(i) SEQ ID NO: 1 또는 7로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 또는 7로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(j) SEQ ID NO: 5, 6 또는 9로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 5, 6 또는 9로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(k) SEQ ID NO: 1, 5, 6 또는 9로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1, 5, 6 또는 9로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(l) SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(m) SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(n) SEQ ID NO: 6으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(o) SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(p) SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(q) SEQ ID NO: 9로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 9로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(r) PP7435_Chr3-0788 (SUR2) 로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr3-0788 로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(s) PP7435_Chr3-1005 (PHS1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr3-1005로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(t) PP7435_Chr2-0350 (AUR1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr2-0350로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(u) PP7435_Chr4-0626 (IFA38)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr4-0626 로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(v) PP7435_Chr3-0669 (SCS7)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr3-0669로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(w) SEQ ID NO: 3 또는 4로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 3 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(x) SEQ ID NO: 3, 4 또는 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 3, 4 또는 8로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(y) SEQ ID NO: 1 또는 5로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 또는 5로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(z) SEQ ID NO: 1, 5 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1, 5 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(aa) SEQ ID NO: 1 및 PP7435_Chr3-0788 (SUR1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 및 PP7435_Chr3-0788로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(bb) SEQ ID NO: 1 및 PP7435_Chr3-1005 (PHS1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 및 PP7435_Chr3-1005로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(cc) SEQ ID NO: 1 또는 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 또는 8로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(dd) SEQ ID NO: 1 및 PP7435_Chr2-0350 (AUR1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 및 PP7435_Chr2-0350로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(ee) SEQ ID NO: 1 및 PP7435_Chr4-0626 (IFA38)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 및 PP7435_Chr4-0626로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질; 또는
(ff) SEQ ID NO: 1 및 PP7435_Chr3-0669 (SCS7)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 및 PP7435_Chr3-0669로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질.
28. 26 항목의 방법으로서, 인지질 생합성에 관여하는 다음의 단백질은 과발현되는 방법:
(a) SEQ ID NO: 10으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(b) PP7435_Chr3-0636 (CRD1)으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr3-0636으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(c) PP7435_Chr3-0950 (SLC4)으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr3-0950으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(d) PP7435_Chr2-0585 (PIS1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr2-0585 로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질.
29. 26 항목의 방법으로서, 지질 수송에 관여하는 다음의 단백질은 과발현되는 방법:
(a) SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(b) PP7435_Chr1-0934 (PRY1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr1-0934로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(c) SEQ ID NO: 11 및 PP7435_Chr1-0934 (PRY1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 11 및 PP7435_Chr1-0934로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질.
30. 26 항목의 방법으로서, 지방산 생합성에 관여하는 다음의 단백질은 과발현되는 방법:
(a) PP7435_Chr4-0963 (FAD12)으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr4-0963으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질.
31. 26 항목의 방법으로서, 스핑고지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질 및 지질 수송에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 과발현되는 방법.
32. 31 항목의 방법으로서, 스핑고지질 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 지질 수송에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 및 11로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 방법.
33. 26 항목의 방법으로서, 인지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질 및 지질 수송에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 과발현되는 방법.
34. 33 항목의 방법으로서, 인지질 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 10 또는 PP7435_Chr1-0794 (PSD1)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 지질 수송에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
35. 34 항목의 방법으로서, 인지질 생합성 또는 지질 수송에 관여하는 다음의 단백질은 과발현되는 방법:
a) SEQ ID NO: 10 및 11로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 10 및 11로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
b) PP7435_Chr1-0794 (PSD1) 및 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr1-0794및 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질.
36. 26 항목의 방법으로서, 스핑고지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질 및 인지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 과발현되는 방법.
37. 36 항목의 방법으로서, 스핑고지질 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 인지질 생합성에 관여하는 단백질은 PP7435_Chr2-0585 (PIS1), PP7435_Chr3-0636 (CRD1) 또는 SEQ ID NO: 10로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
38. 37 항목의 방법으로서, 스핑고지질 생합성 또는 인지질 생합성에 관여하는 다음의 단백질은 과발현되는 방법:
a) SEQ ID NO: 1 및 PP7435_Chr2-0585 (PIS1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 및 PP7435_Chr2-0585로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
b) SEQ ID NO: 1 및 10으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 및 10으로 표시되는 아미노산 서열에 각각 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
c) SEQ ID NO: 1 및 PP7435_Chr3-0636 (CRD1)으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 및 PP7435_Chr3-0636으로 표시되는 아미노산 서열에 각각 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질.
39. 26 항목의 방법으로서, 스핑고지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질 및 인지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 과발현되는 방법.
40. 26 항목의 방법으로서, 스핑고지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질 및 에르고스테롤 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 과발현되는 방법.
41. 40 항목의 방법으로서, 스핑고지질 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 에르고스테롤 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
42. 26 항목의 방법으로서, 에르고스테롤 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질 및 지질 수송에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 과발현되는 방법.
43. 42 항목의 방법으로서, 에르고스테롤 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 12 또는 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 지질 수송에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
44. 37 항목의 방법으로서, 에르고스테롤 생합성 또는 지질 수송에 관여하는 다음의 단백질은 과발현되는 방법:
a) SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열에 각각 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
b) SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열에 각각 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질.
45. 26 항목의 방법으로서, 스핑고지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질 및 지질 저장에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 과발현되는 방법.
46. 45 항목의 방법으로서, 스핑고지질 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 지질 저장에 관여하는 단백질은 ARV1이며, ARV1은 PP7435_Chr4-0493 및 PP7435_Chr4-0493 사이에 위치하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
47. 1 내지 46 항목 중 어느 하나의 방법으로서, 샤페론을 과발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
48. 47 항목의 방법으로서, 샤페론은 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 방법.
49. 47 또는 48 항목의 방법으로서, 스핑고지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질 및 적어도 하나의 샤페론은 과발현되는 방법.
50. 49 항목의 방법으로서, 스핑고지질 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 샤페론은 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 및 18로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 방법.
51. 47 또는 48 항목의 방법으로서, 에르고스테롤 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질 및 적어도 하나의 샤페론은 과발현되는 방법.
52. 51 항목의 방법으로서, 에르고스테롤 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 13, 14 또는 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 샤페론은 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 13 및 18로 표시되는 아미노산 서열에 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 방법.
53. 1 내지 52 항목 중 어느 하나의 방법으로서, 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드의 과발현은 숙주세포의 막의 지질 조성을 변화시키고, 여기서 숙주세포의 막은 바람직하게 세포막 또는 소포체막인 방법.
54. 1 내지 53 항목 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 목적 단백질은 비-막 목적 단백질인 방법.
55. 54 항목의 방법으로서, 상기 비-막 목적 단백질은 효소, 치료 단백질, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제인 방법.
56. 55 항목의 방법으로서, 치료 단백질은 여전히 그것의 항원에 결합하는 능력을 갖는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 방법.
57. 1 내지 56 항목 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이의 기능적 상동체는 조작되기 전 숙주세포에 비해 모델 단백질 HyHEL (SEQ ID NO: 39의 중쇄 및 SEQ ID NO: 40의 경쇄)의 수율을 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30% 증가시키는 방법.
58. 목적 단백질을 생산하기 위한 재조합 진핵생물 숙주세포로서, 여기서 숙주세포는 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 과발현하도록 조작된 재조합 진핵생물 숙주세포.
59. 58 항목의 숙주세포로서, 상기 지질 대사에 관여하는 단백질은 스핑고지질 생합성, 인지질 생합성, 지질 수송, 에르고스테롤 생합성, 지방산 생합성, 포스파티딘산 생합성 및/또는 인지질 대사 과정에 관여하는 숙주세포.
60. 58 또는 59 항목의 숙주세포로서, 상기 지질 대사에 관여하는 단백질은 전사 인자가 아닌 숙주세포.
61. 58 및 59 항목 중 어느 하나의 숙주세포로서, 상기 지질 대사에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 내지 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 숙주세포.
62. 58 내지 61 항목 중 어느 하나의 숙주세포로서, 상기 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 상기 이들의 기능적 상동체는 조작하기 전 숙주세포에 비해 모델 단백질 HyHEL(SEQ ID NO: 39의 중쇄 및 SEQ ID NO: 40의 경쇄)의 수율을 적어도 10% 증가시키는 숙주세포.
63. 58 내지 62 항목 중 어느 하나의 숙주세포로서, 과발현은 상기 숙주세포에서 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드의 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 복제물에 의해 달성되는 숙주세포.
64. 58 내지 63 항목 중 어느 하나의 숙주세포로서, 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 숙주세포의 게놈으로 삽입되는 숙주세포.
65. 64 항목의 숙주세포로서, 삽입은 이소성으로 및/또는 자연적 유전자 자리에서인 숙주세포.
66. 65 항목의 숙주세포로서, 여기서 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 게놈의 AOX1, GAP, ENO1, TEF, HIS4, TYR1, HIS3, LEU2, URA3, LYS2, ADE2, TRP1, GAL1, 또는 ADH1 위치로 삽입되는 숙주세포.
67. 58 내지 66 항목 중 어느 하나의 숙주세포로서, 여기서 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 벡터 또는 플라스미드 내에 포함되어 있는 숙주세포.
68. 67 항목의 숙주세포로서, 여기서 벡터는 YIp 유형의 벡터, YEp 유형의 벡터, YRp 유형의 벡터, YCp 유형의 벡터, pGPD-2, pAO815, pGAPZ, pGAPZpHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K, pPICZ, pPICZ pPIC3K, pHWO10, pPUZZLE, 또는 2 μm 플라스미드인 숙주세포.
69. 58 내지 68 항목 중 어느 하나의 숙주세포로서, 여기서 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 과발현은 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 작동시키는 재조합 프로모터를 사용함으로써 달성되는 숙주세포.
70. 69 항목의 숙주세포로서, 여기서 프로모터는 PAOX1, PTPI, PPGK, PGAPDH, PLAC, PGAL, PPGI, PGAP, PTEF, PENO1, PTPI, PRPS2, PRPS7, PRPS31, PRPL1, PFLD, PICL, PTHI, PSSA1, PHSP90, PKAR2, PGND1, PGPM1, PTKL1, PPIS1, PFET3, PFTR1, PPHO8, PNMT1, PMCM1, PUBI4, PRAD2, PPET9, PFMD, PGAL1, PADH1, PADH2/GAP, PCUP1, 또는 PMAL인 숙주세포.
71. 69 항목의 숙주세포로서, 여기서 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 과발현은 프로모터와 활성을 향상시키기 위한 인핸서를 사용함으로써 달성되는 숙주세포.
72. 71 항목의 숙주세포로서, 여기서 인핸서는 효모 상위 활성 서열 UAS/GAL인 숙주세포.
73. 58 내지 72 항목 중 어느 하나의 숙주세포로서, 여기서 진핵생물 숙주세포는 비-포유류 진핵생물 숙주세포인 숙주세포.
74. 73 항목의 숙주세포로서, 여기서 비-포유류 진핵생물 숙주세포는 진균 숙주세포인 숙주세포.
75. 74 항목의 숙주세포로서, 여기서 숙주세포는 피키아 파스토리스, 한세눌라 폴리모르파, 트리코더마 레세이, 사카로마이세스 세레비지에, 클루이베로마이세스 락티스, 야로위아 리포리티카, 피키아 메타놀리카, 캔디다 보이디니이, 코마가타엘라 속, 아스퍼질러스 속 및 스키조사카로마이세스 폼베인 숙주세포.
76. 58 내지 75 항목 중 어느 하나의 숙주세포로서, 여기서 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 15, PP7435_Chr3-0788 (SUR2), PP7435_Chr3-1005 (AUR1), PP7435_Chr4-0626 (IFA38), PP7435_Chr3-0669 (SCS7), PP7435_Chr3-0636 (CRD1), PP7435_Chr3-0950 (SLC4), PP7435_Chr2-0585 (PIS1), PP7435_chr1-0934 (PRY2), PP7435_Chr4-0963 (FAD12) 및 PP7435_Chr1-0794 (PSD1) 또는 이들의 기능적 상동체 중 어느 하나로부터 선택된 지질 대사에 관여하는 단백질 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상이 과발현되는 숙주세포.
77. 76 항목의 숙주세포로서, 여기서 항목 27 내지 46에서 정의된 단백질은 과발현되는 숙주세포.
78. 58 내지 77 항목 중 어느 하나의 숙주세포로서, 샤페론을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현하도록 추가로 조작되는 숙주세포.
79. 78 항목의 숙주세포로서, 여기서 샤페론은 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 숙주세포.
80. 78 또는 79 항목의 숙주세포로서, 여기서 항목 48 내지 52에서 정의된 단백질은 과발현되는 숙주세포.
81. 58 내지 80 항목 중 어느 하나의 숙주세포로서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주세포.
82. 81 항목의 숙주세포로서, 여기서 상기 목적 단백질은 비-막 목적 단백질인 숙주세포.
83. 82 항목의 숙주세포로서, 여기서 상기 비-막 목적 단백질은 효소, 치료 단백질, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제인 숙주세포.
84. 83 항목의 숙주세포로서, 여기서 치료 단백질은 여전히 그것의 항원에 결합하는 능력을 갖는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 숙주세포.
85. 58 내지 84 항목 중 어느 하나의 숙주세포로서, 여기서 과발현은 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 내재된 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 변형시킴으로써 달성되는 숙주세포.
86. 58 내지 85 항목 중 어느 하나의 숙주세포로서, 여기서 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드의 과발현은 숙주세포의 생물막의 지질 조성을 변화시키는 숙주세포.
87. 목적 단백질을 생산하기 위한 58 내지 86 항목 중 어느 하나의 숙주세포의 용도.
88. 87 항목에 따른 숙주세포의 용도로서, 여기서 목적 단백질은 비-막 목적 단백질인 용도.
89. 지질 대사에 관여하고, SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드, 또는 샤페론을 코딩하고 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 및 18 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 분리된 폴리뉴클레오타이드.
90. 분리된 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 19 내지 33 및 SEQ ID NO: 36 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
91. 숙주세포에 삽입하기 위한 항목 89 또는 90에 따른 분리된 폴리뉴클레오타이드의 용도.
92. 목적 단백질, 바람직하게는 비-막 목적 단백질을 생산하기 위한 항목 89 또는 90에 따른 폴리뉴클레오타이드의 용도.
93. 숙주세포를 생산하기 위한 항목 89 또는 90에 따른 폴리뉴클레오타이드의 용도.
94. SEQ ID NO: 1 내지 15 및 SEQ ID NO: 18 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
95. 목적 단백질, 바람직하게는 비-막 목적 단백질을 생산하기 위한 항목 94에 따른 분리된 폴리펩타이드의 용도.
96. 적어도 0.25%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 또는 10%의 목적 단백질 및 항목 86 또는 87에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물로서, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 이종의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것이고, 목적 단백질은 바람직하게 비-막 목적 단백질인 조성물.
97. 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 진핵생물 숙주세포에서 저발현시켜서 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 저발현하지 않는 상기 숙주세포에 비해 목적 단백질의 수율을 증가시키는 단계를 포함하는
진핵생물 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법.
98. 97 항목의 방법으로서, 여기서 상기 지질 대사에 관여하는 단백질은 지질 저장에 관여하는 것인 방법.
99. 97 또는 98 항목의 방법으로서, 여기서 상기 지질 대사에 관여하는 단백질은 전사 인자가 아닌 방법.
100. 98 또는 99 항목의 방법으로서, 여기서 상기 지질 저장에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 16 또는 17 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 방법.
101. 100 항목의 방법으로서, 여기서 지질 저장에 관여하는 다음의 단백질은 저발현되는 방법:
a) SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
b) SEQ ID NO: 16으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
c) SEQ ID NO: 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질.
102. 97 내지 101 항목 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 목적 단백질은 비-막 목적 단백질인 방법.
103. 97 내지 102 항목 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 진핵생물 숙주세포는 비-포유류 진핵생물 숙주세포인 방법.
104. 103 항목의 방법으로서, 여기서 비-포유류 진핵생물 숙주세포는 진균 숙주세포이고, 여기서 진균 숙주세포는 바람직하게 피키아 파스토리스, 한세눌라 폴리모르파, 트리코더마 레세이, 사카로마이세스 세레비지에, 클루이베로마이세스 락티스, 야로위아 리포리티카, 피키아 메타놀리카, 캔디다 보이디니이, 코마가타엘라 속, 아스퍼질러스 속 및 스키조사카로마이세스 폼베이며, 여기서 진균 숙주세포는 보다 바람직하게 피키아 파스토리스인 방법.
105. 97 내지 104 항목 중 어느 하나의 방법으로서,
- 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 저발현하도록 숙주세포를 조작하는 단계로서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이며,
- 상기 숙주세포가 상기 목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 조작하는 단계,
- 상기 목적 단백질을 발현하기에 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로
- 세포 배양물로부터 상기 목적 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 방법.
106. 97 내지 104 항목 중 어느 하나에 따른 목적 단백질을 생산하는 방법으로서,
- 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 저발현하도록 조작된 숙주세포를 제공하고, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이고, 여기서 상기 숙주세포는 상기 목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하며;
- 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 저발현하고 상기 목적 단백질을 발현하기에 적합한 조건 하에서 숙주세포를 배양하고, 선택적으로
- 세포 배양물로부터 상기 목적 단백질을 분리하는 것을 포함하는 방법.
107. 97 내지 106 항목 중 어느 하나의 방법으로서, 지질 대사에 관여하는 다음의 단백질은 저발현되는 방법:
a) SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질.
108. 97 내지 106 항목 중 어느 하나의 방법으로서, 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 상기 숙주세포에서 과발현하는 단계를 포함하는 방법.
109. 108 항목의 방법으로서, 여기서 과발현되고 지질 대사에 관여하는 상기 단백질은 지질 저장, 스핑고지질 생합성, 인지질 생합성, 인지질 대사 과정, 또는 포스파티딘산 생합성에 관여하는 방법.
110. 109 항목의 방법으로서, 여기서 스핑고지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 과발현되고 지질 저장에 관여하는 적어도 두 개의 단백질은 저발현되는 방법.
111. 110 항목의 방법으로서, 여기서 스핑고지질에 관여하는 다음의 단백질은 과발현되고, 지질 저장에 관여하는 다음의 단백질은 저발현되는 방법:
a) SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질은 과발현되고, SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질은 저발현되며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질.
112. 109 항목의 방법으로서, 여기서 인지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 과발현되고, 지질 저장에 관여하는 적어도 두 개의 단백질은 저발현되는 방법.
113. 112 항목의 방법으로서, 여기서 인지질 생합성에 관여하는 단백질은 PP7435_Chr3-0950 (SLC4), PP7435_Chr1-0160 (SLC1), PP7435_CHR1-0078 (GPT2) 또는SEQ ID NO: 10로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 지질 저장에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
114. 113 항목의 방법으로서, 여기서 인지질 생합성에 관여하는 다음의 단백질은 과발현되고, 지질 저장에 관여하는 다음의 단백질은 저발현되는 방법:
a) PP7435_Chr3-0950 (SLC4)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질은 과발현되고, SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질은 저발현되며, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr3-0950, SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
b) PP7435_Chr1-0160 (SLC1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질은 과발현되고, SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질은 저발현되며, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr1-0160, SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
c) PP7435_CHR1-0078 (GPT2)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질은 과발현되고, SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질은 저발현되며, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_CHR1-0078, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
d) SEQ ID NO: 10으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질은 과발현되고, SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질은 저발현되며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 단백질.
115. 109 항목의 방법으로서, 여기서 인지질 대사 과정에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 과발현되고, 지질 저장에 관여하는 적어도 두 개의 단백질은 저발현되는 방법.
116. 115 항목의 방법으로서, 여기서 인지질 대사 과정에 관여하는 단백질은 과발현되고 PP7435_Chr2-0045 (CDS1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 지질 저장에 관여하는 단백질은 저발현되고 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr2-0045, SEQ ID NO: 16 및 SEQ ID NO: 17로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 방법.
117. 116 항목의 방법으로서, 여기서 포스파티딘 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 과발현되고, 지질 저장에 관여하는 적어도 두 개의 단백질은 저발현되는 방법.
118. 117 항목의 방법으로서, 여기서 포스파티딘 생합성에 관여하는 단백질은 과발현되고 PP7435_Chr3-1169 (DGK1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 지질 저장에 관여하는 단백질은 저발현되고 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr3-1169, SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 방법.
119. 109 항목의 방법으로서, 지질 저장에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 과발현되고, 지질 저장에 관여하는 적어도 두 개의 단백질은 저발현되는 방법.
120. 119 항목의 방법으로서, 과발현되고 지질 저장에 관여하는 단백질은 PP7435_Chr3-0741 (ARE2)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 저발현되고 지질 저장에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr3-0741, SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 방법.
121. 목적 단백질을 생산하기 위한 재조합 진핵생물 숙주세포로서, 여기서 숙주세포는 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 저발현하도록 조작되고, 여기서 목적 단백질은 바람직하게 비-막 단백질인 재조합 진핵생물 숙주세포.
122. 121 항목의 숙주세포로서, 여기서 상기 지질 대사에 관여하는 단백질은 지질 저장에 관여하고, SEQ ID NO: 16 또는 17 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 또는 17 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 숙주세포.
123. 121 또는 122 항목의 숙주세포로서, 여기서 지질 대사에 관여하는 다음의 단백질은 저발현되는 숙주세포:
a) SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
b) SEQ ID NO: 16으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
c) SEQ ID NO: 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질.
124. 121 내지 123 항목 중 어느 하나의 숙주세포로서, 여기서 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 항목 109 내지 120 에서 정의된 것과 같이 과발현되는 숙주세포.
125. 121 내지 124 항목 중 어느 하나의 숙주세포로서, 여기서 상기 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 상기 이들의 기능적 상동체는 조작되기 전 숙주세포에 비해 모델 단백질 HyHEL (SEQ ID NO: 39의 중쇄 및 SEQ ID NO: 40의 경쇄)의 수율을 적어도 10% 증가시키는 숙주세포.
126. 숙주세포의 막의 지질 조성을 변화시킴으로써 진핵생물 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법으로서, 여기서 숙주세포의 막은 바람직하게는 세포막 또는 소포체 막인 방법.
127. 126 항목의 방법으로서, 여기서 상기 숙주세포의 막의 지질 조성은 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질, 바람직하게는 본 명세서에서 기술된 보조 단백질 중 하나의 과발현에 의해 변화되는 방법.
128. 스핑고지질의 분자 종 패턴을 변화시킴으로써, 바람직하게는 세라마이드 및/또는 이노시톨-함유 포스포리세라마이드(이노시톨포스포리세라마이드, 만노실-이노시톨포스포리세라마이드, 만노실-디이노시톨-포스포리세라마이드)의 C26 지방 아실 모이어티의 함량을 증가, 및/또는 세라마이드 및/또는 이노시톨-함유 포스포리세라마이드(이노시톨포스포리세라마이드, 만노실-이노시톨포스포리세라마이드, 만노실-디이소시톨-포스포리세라마이드)의 C24 지방 아실 모이어티의 함량을 감소시킴으로써 진핵생물 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법.
129. 128 항목의 방법으로서, 스핑고지질의 분자 종 패턴은 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질, 바람직하게는 본 명세서에서 기술된 보조 단백질의 과발현에 의해 변경되는 방법.
130. 세라마이드, IPC, MIPC 및 M(IP)2C에 포함된 26 탄소(C26)의 사슬 길이의 지방 아실의 상대적 함량은 적어도 100% 증가되고, 반면에 24 탄소(C24)의 사슬 길이의 지방 아실의 상대적 함량은 적어도 70% 감소되는 방법.
131. IPC 및 MIPC의 함량을 감소시킴으로써(대략 30%로) 및/또는 이노시톨-함유 포스포리세라마이드의 성숙한 형태, M(IP)2C의 형성을 적어도 6배(600%) 증가시킴으로써 진핵생물 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법.
132. 131 항목의 방법으로서, 여기서 상기 감소 및/또는 증가는 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질, 바람직하게는 본 명세서에서 기술된 보조 단백질 중 하나의 과발현에 의해 달성되는 방법.
133. 131 또는 132 항목의 방법으로서, 여기서 스핑고지질의 상대적 분포는 다음과 같이 영향받는 방법: M(IP)2C에서 6배(600%) 증가 및 IPC 및 MIPC의 상대적 분포에서 대략 30% 감소하는 방법.
134. 비-극성 저장 지질 트리아실글리세롤(TG)의 세포를 고갈시킴으로써 진핵생물 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법.
135. 134 항목에 있어서, 여기서 상기 고갈은 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질, 바람직하게는 본 명세서에서 기술된 보조 단백질 중 하나의 저발현에 의해 달성되는 방법.
도 1은 본 발명의 보조 단백질의 아미노산 및 폴리뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
도 2는 모델 단백질 SDZ-Fab 및 HyHEL-Fab 각각의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열과 폴리뉴클레오타이드 서열과 S. cerevisiae 알파 결합 인자 신호 선도 서열을 보여준다. 밑줄친 서열 부분은 모델 단백질 서열에 융합되는 SEQ ID NO: 45 또는 46의 선도 서열을 나타낸다.
본 발명은 본 명세서에서 기술된 것과 같이 지질 대사에 관여하는 보조 단백질의 발현의 놀라운 발견에 특히 기초하고, 이 발견은, 과발현되거나(SEQ ID NO: 1 내지 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 보조 단백질) 또는 저발현되는(SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 KO 보조 단백질) 경우, 목적 단백질의 수율을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 각각의 보조 단백질의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드와 본 명세서에서 때때로 사용된 이의 상응하는 유전자 식별자(identifier)은, 특히 실시예들에서, 이하 “과발현된 보조 단백질)”및 “저발현된 보조 단백질)”로서 지정된 표 1에서 나열된다. 과발현 및 저발현된 보조 단백질의 조합은 본 명세서 및 실시예 6에서 상세하게 기술된다.
표 1
피키아 파스토리스 서열의 유전자 식별자는 Sturmberger et al. [J. Biotechnol. (2016). 235(4):121-131)]에서 검색하였고, 사카로마이세스 세레비지에 서열의 유전자 식별자는 Cherry J.M. et al. [Nucleic Acids Res. (2012) 40 (Database issue D700-5)]에서 검색하였다. 유전자 온톨로지 용어는 다음과 같이 정의된다: “스핑고지질”은 지방산 연장(elongation)을 포함하는 스핑고지질 생합성을 의미하고; “수송”은 지질 수송을 의미하며; “인지질”은 인지질 생합성을 의미하고; “스테롤”은 에르고스테롤 생합성을 의미하며; 그리고 “저장”은 지질 저장을 의미한다. 유전자 등록 번호(gene accession number)는 ENA(European Nucleotide Archive)에서 검색했고, 단백질 등록 번호(protein accession number)는 UniProtKB에서 검색했다. *KAR2 서열(뉴클레오타이드뿐만 아니라 아미노산)은 CBS7435와 거의 동일한 피키아 파스토리스 균주 GS115에 대해서만 주석을 달았다. 따라서, KAR2에 대한 유전자/단백질 등록 번호는 피키아 파스토리스 균주 GS115의 배경에서 주석이 달린 서열에 대해 나열되어 있다. 특히, 의심의 여지를 피하기 위해, SEQ ID NO로 나타낸 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열은 이러한 서열의 임의의 다른 공급원을 대체한다.
Figure pct00001
§상기 표에서 HMG1의 DNA-서열은 두 개의 절단된 변이체(t1, t2)로서 사용된 전장 서열 옆에 두었고, 두 개의 절단된 변이체는 이들의 막 고정 도메인이 고갈된 것, 즉, 변이체 t1HMG1의 5'-말단에서 1449 뉴클레오타이드 또는 t2HMG1의 경우에서 1543 뉴클레오타이드가 고갈된 것이다(이들의 개시 ATG-코돈은 제외).
본 발명에서 사용된 “보조 단백질” 또는 “본 발명의 보조 단백질”은 지질 대사에 관여하고, 본 명세서에서 기술된 모델 단백질 또는 목적 단백질(POI)의 수율을 증가시키는 단백질을 의미하며, 바람직하게는 목적 단백질을 발현하는 숙주세포에서, SEQ ID NO: 1 내지 15, 예를 들어 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15로 표시되는 보조 단백질의 경우 과발현되거나, SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 보조 단백질의 경우 저발현되는 단백질을 의미한다. 지질 대사에 관여하고, 과발현될 때 모델 단백질의 수율을 향상시키는 본 발명의 추가의 보조 단백질은 PP7435_Chr3-0788 (SUR2), PP7435_Chr3-1005 (PHS1), PP7435_Chr2-0350 (AUR1), PP7435_Chr4-0626 (IFA38), PP7435_Chr3-0669 (SCS7), PP7435_Chr3-0636 (CRD1), PP7435_Chr3-0950 (SLC4), PP7435_Chr2-0585 (PIS1), PP7435_chr1-0934 (PRY2), ARV1 (ORF not annotated; located between PP7435_Chr4-0493/0494), PP7435_Chr3-0741 (ARE2), PP7435_Chr4-0963 (FAD12), PP7435_Chr1-0794 (PSD1), PP7435_Chr1-0160 (SLC1), PP7435_CHR1-0078 (GPT2) PP7435_Chr3-1169 (DGK1) 및 PP7435_Chr2-0045 (CDS1) 또는 이들의 기능적 상동체로 표시되어 있다. 이 용어는 예를 들어, 샤페론 또는 샤페론 유사 단백질과 같이 광범위하게 이해되어야 하며, 이에 제한되지 않아야 한다. 본 발명에서 명백하게 나타났듯이, 본 발명의 보조 단백질은 이들의 기능이 다양하지만, 모두 특정 부류의 지질 대사에 관여된다. 본 발명의 바람직한 보조 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 17 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함한다. 본 발명의 바람직한 보조 단백질은 SEQ ID NO: 19 내지 36 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오타이드 또는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15, 각각의 기능적 상동체를 코딩하는 이들의 변이체에 의해 암호화될 수 있다. 본 발명의 목적상, 용어 "보조 단백질"은 또한 각각 SEQ ID NO: 1 내지 17 중 어느 하나로 표시되는 보조 단백질의 기능적 상동체를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 보조 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이다. 본 발명은 PP7435_Chr3-0788 (SUR2), PP7435_Chr3-1005 (PHS1), PP7435_Chr2-0350 (AUR1), PP7435_Chr4-0626 (IFA38), PP7435_Chr3-0669 (SCS7), PP7435_Chr3-0636 (CRD1), PP7435_Chr3-0950 (SLC4), PP7435_Chr2-0585 (PIS1), PP7435_chr1-0934 (PRY2), ARV1 (ORF not annotated; located between PP7435_Chr4-0493/0494), PP7435_Chr3-0741 (ARE2), PP7435_Chr4-0963 (FAD12), PP7435_Chr1-0794 (PSD1), PP7435_Chr1-0160 (SLC1), PP7435_CHR1-0078 (GPT2) PP7435_Chr3-1169 (DGK1) 및 PP7435_Chr2-0045 (CDS1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 보조 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하고, 여기서 기능적 상동체는 PP7435_Chr3-0788 (SUR2), PP7435_Chr3-1005 (PHS1), PP7435_Chr2-0350 (AUR1), PP7435_Chr4-0626 (IFA38), PP7435_Chr3-0669 (SCS7), PP7435_Chr3-0636 (CRD1), PP7435_Chr3-0950 (SLC4), PP7435_Chr2-0585 (PIS1), PP7435_chr1-0934 (PRY2), ARV1 (ORF not annotated; located between PP7435_Chr4-0493/0494), PP7435_Chr3-0741 (ARE2), PP7435_Chr4-0963 (FAD12), PP7435_Chr1-0794 (PSD1), PP7435_Chr1-0160 (SLC1), PP7435_CHR1-0078 (GPT2) PP7435_Chr3-1169 (DGK1) 및 PP7435_Chr2-0045 (CDS1)로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이다.
용어 “지질 대사에 관여하는”은 보조 단백질이 진핵세포의 지질 대사에서 기능/활성을 갖는 것을 의미한다. 지질 대사는, 그 중에서도, 지질 합성, 지질 분해, 지질 수송(단백질, 베지클, 또는 이들의 합성 부위에서 목적지 부위로, 예를 들어 생물막 내의 도입으로 지질을 운반하는 목적의 직접적인 막의 접촉을 통해 매개되는; 또는 과잉 또는 오작동하는 지질의 세포 밖으로의 수송), 지질 저장(과량의 자유 스테롤 또는 지방산에 의해 유발되는 지질 독성을 피하기 위해 스테릴 에스테르 또는 트리아실글리세롤과 같은 생물학적 불활성 형태로 지질 저장; 지질 액적(lipid droplet)이라 불리는 특수 소기관에서 발생하는 지질 저장), 지질 변형, 지질 안정성, 지질-지질 상호작용, 지방산 생합성 및 변형, 스핑고지질 생합성, 인지질 생합성, 에르고스테롤 생합성, 매우 풍부한 스핑고지질의 분자 종 패턴을 변화시키는 것과 같은 기능을 포함하고, 즉, 세라마이드(세라마이드 및 헥소실-세라마이드) 및 이노시톨-함유 포스포릴세라마이드(IPC..이노시톨포스포릴세라마이드, MIPC..만노실-이노시톨포스포릴세라마이드, M(IP)2C..만노실-디이노시톨-포스포릴세라마이드)의 지방 아실 모이어티는 우선적으로 C24(지방 아실 사슬에서 24 탄소) 대신 C26(지방 아실 사슬에서 26 탄소)를 함유하며; 스핑고지질 분포 패턴을 변경시켜 IPC를 소비하게 하는 더 많은 M(IP)2C인 복잡한 스핑고지질의 성숙한 형태를 더 자주 발생하게 하고; P. pastoris의 주요 저장 지질인 트리아실글리세롤의 세포를 고갈시키는 것을 포함한다. 바람직하게, 지질 대사에 관여하는 상기 보조 단백질은 전사 인자가 아니다. 따라서, 본 명세서에서 기술된 것과 같이 과- 또는 저발현되는 경우, 지질 대사에 관여하는 보조 단백질은 진핵생물 숙주세포, 특이 진균 숙주세포에서 생물막 지질 조성을 변형시킬 수 있고, 이로써 재조합 단백질 생산에 긍정적으로 영향을 미칠 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 “생물막”은, 이에 제한되는 것은 아니나, 세포막 및 소포체 막, 베지클 막, 골지 막 등을 포함한다. 따라서, 보조 단백질의 과- 및 저발현과 관련하여, 본 명세서에서 용어 “지질 대사”가 사용되는 경우, 각각 용어 “생물막 지질 조성의 변형”, 바람직하게는 진핵생물 숙주세포, 특히 진균 숙주세포에서 생물막 지질 조성의 변형에 의해 대체될 수 있다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, 보조 단백질의 과발현과 관련하여, 이러한 보조 단백질은 스핑고지질 생합성(SEQ ID NO: 1 내지 9를 포함하는 보조 단백질), 인지질 생합성(SEQ ID NO: 10을 포함하는 보조 단백질), 지질 수송(SEQ ID NO: 11을 포함하는 보조 단백질), 에르고스테롤 생합성(SEQ ID NO: 12 내지 15를 포함하는 보조 단백질), 지방산 생합성, 포스파티딘산 생합성 및/또는 인지질 대사 과정에 관여된다. 본 명세서에서 사용된 용어 “스핑고지질 생합성”은 지방산 연장을 포함한다. 결과적으로, 스핑고지질 생합성에 관여하는 보조 단백질은 스핑고지질 생합성 및/또는 지방산 연장에 관여될 수 있다. 복잡한 스핑고지질, 예를 들어 IPC, MIPC 또는 M(IP)2C의 생합성은 지방산의 연장에 분리되지 않게 연결된다. 장쇄 지방산은 매우 긴 사슬 지방산(예를 들어 C24 또는 C26)의 형성하는 지방산 연장의 과정에서 연속적인 4 단계 사이클을 거치게 된다. 지방산의 연장에 의해 생산되는 매우 긴 사슬의 지방산은 이후 복잡한 스핑고지질(IPC, MIPC, M(IP)2C)을 생성하는 스핑고지질 생합성의 과정에서 기질로 직접 쉽게 통합된다. 스핑고지질의 생합성의 초기 단계는 소포체에서 발생하지만, 복잡한 이노시톨-함유 포스포릴세라마이드를 생성하기 위해 세라마이드에 대한 추가의 변형 및 성숙 과정이 골지에서 일어난다. 따라서, 상당한 양의 세라마이드 및 헥소실-세라마이드는 소포체의 생물막에서 발견될 수 있지만 분비 경로(베지클 및 골지) 및 세포성 플라스마 막의 추가의 소기관에서 더 낮은 양으로 발견될 수도 있다. 복잡한 스핑고지질(IPC, MIPC, M(IP)2C)는 소위 지질 뗏목에서 스테롤과 함께 국소화되는 세포성 플라스마 막에서 가장 풍부하지만, 소포체 및 분비 경로(베지클, 골지)를 따라 다른 소기관의 생물막에서 낮은 양으로 발견될 수 있다. 본 명세서에도 언급된 바와 같이, 보조 단백질의 저발현과 관련하여, 이러한 보조 단백질은 예를 들어 지질 저장에 관여된다(예를 들어, SEQ ID NO: 16 또는 17을 포함하는 KO 보조 단백질). 따라서, 생물막 지질 조성의 변형은 본 명세서에 기술된 보조 단백질이 과발현되는 경우 바람직하게는 스핑고지질 생합성, 인지질 생합성, 지질 수송, 또는 에르고스테롤 생합성에 의해 영향을 받을 수 있거나, 본 명세서에 기술된 보조 단백질이 저발현되는 경우 바람직하게 지질 저장에 의해 영향을 받을 수 있다. 지질 대사에 관여하는 본 발명의 보조 단백질은 바람직하게 전사 인자가 아니다. 본 명세서에 기술된 상이한 군의 보조 단백질(즉, 스핑고지질 생합성, 인지질 생합성, 지질 수송, 에르고스테롤 생합성 및 지질 저장에 관여하는)은 피키아 파스토리스 유전자에 기초된다.
본 명세서에서 사용된 용어 “목적 단백질”은 일반적으로 임의의 단백질에 관한 것이나 바람직하게는 “이종의 단백질” 또는 “재조합 단백질”이고, 보다 바람직하게는 “비-막 목적 단백질”에 관한 것이다. “비-막 목적 단백질”은 목적 단백질이 바람직하게 일체형 막 단백질이 아님을 의미하며, 일체형 막 단백질은 그것의 자연 환경에서(즉, in situ) 영구적인 부분이거나 진균 세포와 같은 진핵세포의 생물학적 막에 부착되는 것이다. 이러한 단백질은 생물학적 막을 적어도 한번은 가로질러 걸쳐 있는 것으로 분류된다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 비-막 목적 단백질은 바람직하게 막관통 단백질(transmembrane) 도메인을 가지고 있지 않는다. 그러나, 본 명세서에서 사용된 “비-막 단백질”은 GPI-고정 단백질을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 보조 단백질의 “상동체” 또는 “기능적 상동체”는 이들의 일차, 이차 또는 삼차 구조에서 상응하는 위치에 동일하거나 보존되는 잔기를 갖는 단백질을 의미하는 것일 수 있다. 상기 용어는 또한 상동성 폴리펩타이드를 코딩하는 둘 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 서열로 확장된다. 특히 본 발명의 보조 단백질과 상동의 폴리펩타이드는 본 명세서에 기술된 서열(SEQ ID NO: 1 내지 18)과 관련하여 적어도 약 30% 아미노산 서열 상동성을 갖는다. 바람직하게, 상동성 폴리펩타이드는 본연의 서열 또는 전장 화합물의 구체적으로 한정된 임의의 단편과 적어도 약 35% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 40% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 45% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 50% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 55% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 60% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 65% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 70% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 75% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 80% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 85% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 90% 아미노산 서열 상동성, 예를 들어 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 95% 아미노산 서열 상동성을 가질 수 있다. 보조 단백질로서의 기능이 이러한 상동체로 증명된 경우, 상동체는 “기능적 상동체”로 명명된다. 기능적 상동체는 그것이 유래된 보조 단백질과 동일하거나 실질적으로 동일한 기능을 수행한다. 즉, 기능적 상동체는 동일한 효소 활성 또는 세포의 지질 대사에서 동일한 지질 대사 반응의 촉매 작용을 갖는다. 뉴클레오타이드 서열의 경우, “기능적 상동체”는 본래의 뉴클레오타이드 서열과 상이한 서열을 가지지만, 퇴화된(degenerated) 유전적 코드의 사용으로 인해, 여전히 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 기능적 상동체는 또한 보조 단백질의 생물학적 활성 단편일 수 있다. 일반적으로, 보조 단백질의 생물학적 활성 단편은 전장 보조 단백질과 유사하거나 유사한 생물학적 효과를 발휘하는 상기 보조 단백질의 단편을 의미하며, 이는 상기 생물학적 활성 단편이 상응하는 전장 보조 단백질(SEQ ID NO: 1 내지 18)로 관찰된 POI 수율을 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%로 증가시키는 것을 초래하는 것을 의미한다. 이러한 활성 단편은, 예를 들어 아미노- 및/또는 카르복시- 말단 결실 및/또는 상기 전장 보조 단백질의 아미노산 서열의 아미노- 및/또는 카르복시- 말단 아미노산이 아닌 적어도 하나의 아미노산의 결실에 의해 수득될 수 있다.
일반적으로, 상동체는 당업계에 알려진 임의의 돌연변이 생성 과정, 예를 들어 부위-특이적 돌연변이 생성, 합성 유전자 구축, 반-합성 유전자 구축, 우발적 돌연변이 생성, 셔플링 등을 사용하여 제조될 수 있다. 부위-특이적 돌연변이 생성은 하나 또는 그 이상(예를 들어, 몇몇) 돌연변이가 모체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에서 하나 또는 그 이상의 정의된 부위에 도입되는 기술이다. 부위-특이적 돌연변이 생성은 목적하는 돌여변이를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 사용하는 PCR에 의해 in vitro 상에서 이루어질 수 있다. 부위-특이적 돌연변이 생성은 또한 모체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 내 부위에서 제한 효소를 통해 절단되고, 뒤이어 폴리뉴클레오타이드 내 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 접합하는 것을 포함하는 카세트 돌연변이 생성에 의해 in vitro 상에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드를 자르는 제한 효소와 올리고뉴클레오타이드는 동일한 것이며, 이는 플라스미드의 점착성 말단 및 서로간 연결에 의한 삽입을 가능하게 한다. 예를 들어, Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; 및 Barton et ai, 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966를 참조한다. 부위-특이적 돌연변이 생성은 또한 당업계에 알려진 방법에 의해 생체 내에서 달성될 수 있다. 예를 들어, U.S. Patent Application Publication No. 2004/0171 154; Storici et ai, 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et ai, 1998, Nat. Med. 4: 285-290; 및 Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16를 참조한다. 합성 유전자 구축은 목적 폴리펩타이드를 코딩하기 위하여 설계된 폴리뉴클레오타이드 분자의 in vitro 상 합성을 수반한다. 유전자 합성은 Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054)에 기술된 멀티플렉스 마이크로칩-기반 기술 및 이와 유사한 기술과 같이 수많은 기술을 이용하여 수행될 수 있고, 여기서 올리고뉴클레오타이드는 빛에 의해 작동되는 미세유체 칩에 의해 합성되고 조립된다. 단일 또는 복수의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입이 이루어질 수 있고, 돌연변이 생성, 재조합, 및/또는 셔플링의 알려진 방법을 이용하여 테스트될 수 있으며, Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241:53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; 또는 WO 95/22625에 개시된 관련 스크리닝 과정이 뒤이어 진행될 수 있다. 이용될 수 있는 다른 방법으로는 오류-유발 PCR, 파지 디스플레이(예를 들어, Lowman et al, 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; U.S. Patent No. 5,223,409; WO 92/06204) 및 지역-특이적 돌연변이 생성(Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7:127)을 포함한다. 돌연변이 생성/셔플링 방법은 대용량 처리 기술, 숙주세포에 의해 발현되는 복제되고 돌연변이된 폴리펩타이드의 활성을 검출하기 위한 자동화된 스크리닝 방법(Ness et a., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896)과 결합될 수 있다. 활성화 폴리펩타이드를 코딩하는 돌연변이된 DNA 분자는 숙주세포로부터 정상으로 회복될 수 있고, 당업계의 표준화 방법을 이용하여 빠르게 시퀀싱할 수 있다. 이러한 방법은 폴리펩타이드 각각의 아미노산 잔기에 대한 중요성을 빠르게 확인 가능하게 한다. 반-합성 유전자 구축은 합성 유전자 구축, 및/또는 부위-특이적 돌연변이 생성, 및/또는 우발적 돌연변이 생성, 및/또는 셔플링의 조합에 의해 이루어진다. 반합성 구축은 PCR 기술과 조합하여, 합성되는 폴리뉴클레오타이드 단편을 활용하는 과정이 특징적이다. 따라서 유전자의 정해진 지역은 새롭게 합성되는 반면, 이외 다른 지역은 부위-특이적 돌연변이 생성 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있고, 이외 다른 지역은 오류 유발 PCR 또는 비-오류 유발 PCR 증폭이 실시될 수 있다. 뒤이어 폴리뉴클레오타이드는 셔플링될 수 있다. 대안적으로, 상동체는 미생물과 가깝게 또는 멀리 관련된 cDNA 라이브러리 스크리닝에 의해 천연 공급원으로부터 얻어질 수 있다.
SEQ ID NO: 1 내지 17 중 어느 하나의 상동체 또는 본 명세서에 기술된(단락 [0046]) 추가의 보조 단백질의 기능은 상동체 서열이 삽입된 발현 카세트를 제공하고, 실시예 섹션에서 사용된 모델 단백질 중 하나 또는 또 다른 POI와 같은 실험 단백질을 코딩하는 서열을 가진 숙주세포를 형질전환하며, 동일한 조건 하에서 모델 단백질 또는 POI의 수율 차이를 결정함으로써 테스트될 수 있다.
본 발명은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17, 또는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17의 기능적 상동체를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 19 내지 35중 어느 하나를 포함할 수 있다. 바람직하게, 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 30 내지 58 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 본 발명은 또한 PP7435_Chr3-0788 (SUR2), PP7435_Chr3-1005 (PHS1), PP7435_Chr2-0350 (AUR1), PP7435_Chr4-0626 (IFA38), PP7435_Chr3-0669 (SCS7), PP7435_Chr3-0636 (CRD1), PP7435_Chr3-0950 (SLC4), PP7435_Chr2-0585 (PIS1), PP7435_chr1-0934 (PRY2), ARV1 (ORF not annotated; located between), PP7435_Chr3-0741 (ARE2), PP7435_Chr4-0963 (FAD12), PP7435_Chr1-0794 (PSD1), PP7435_Chr1-0160 (SLC1), PP7435_CHR1-0078 (GPT2) PP7435_Chr3-1169 (DGK1) 및 PP7435_Chr2-0045 (CDS1) 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
나아가, 본 발명은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 적어도 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 제공한다. 나아가, 본 발명은 PP7435_Chr3-0788 (SUR2), PP7435_Chr3-1005 (PHS1), PP7435_Chr2-0350 (AUR1), PP7435_Chr4-0626 (IFA38), PP7435_Chr3-0669 (SCS7), PP7435_Chr3-0636 (CRD1), PP7435_Chr3-0950 (SLC4), PP7435_Chr2-0585 (PIS1), PP7435_chr1-0934 (PRY2), ARV1 (ORF not annotated; located between PP7435_Chr4-0493/0494), PP7435_Chr3-0741 (ARE2), PP7435_Chr4-0963 (FAD12), PP7435_Chr1-0794 (PSD1), PP7435_Chr1-0160 (SLC1), PP7435_CHR1-0078 (GPT2) PP7435_Chr3-1169 (DGK1) 및 PP7435_Chr2-0045 (CDS1)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 적어도 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 제공한다.
용어 “분리된”은 자연적으로 발생하지 않는 형태 또는 환경의 물질을 의미한다. 분리된 물질의 비-제한적인 예로는 (1) 임의의 비-자연적으로 발생하는 물질, (2) 이에 제한되는 것은 아니나, 임의의 효소, 변이체, 핵산, 단백질, 펩타이드 또는 공동인자를 포함하는 임의의 물질, 즉 자연과 관련된 하나 또는 그 이상 또는 모든 자연적으로 발생하는 성분으로부터 적어도 부분적으로 제거된 물질; (3) 자연에서 발견된 물질, 예를 들어 mRNA로부터 형성된 cDNA와 관련하여 사람의 손에 의해 변형된 임의의 물질; 또는 (4) 자연적으로 관련된 다른 성분과 관련하여 물질의 함량을 증가시킴으로써 변형된 임의의 물질(예를 들어, 숙주세포에서의 재조합 생산; 상기 물질을 코딩하는 유전자의 복수의 복제물; 및 상기 물질을 코딩하는 단백질과 관련된 자연적인 프로모터보다 강한 프로모터의 사용)을 포함한다.
본 발명은 숙주세포에 삽입되기 위한 앞서 언급한 분리된 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나의 용도를 제공한다. 대한적으로, 숙주세포에 폴리뉴클레오타이드(들)가 이미 존재하는 경우, 숙주세포는, 후술하는 바와 같이, 이들의 과발현되는 방식으로 조작될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주세포로부터 POI 수율을 증가시키기 위한 상기 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이며, 여기서 POI를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 폴리뉴클레오타이드와 공동-발현된다.
"서열 상동성" 또는 "%상동성"은 표준화된 알고리즘을 사용하여 정렬된 적어도 두 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 사이에 일치하는 잔기의 퍼센트를 나타낸다. 이러한 알고리즘은 두 서열 간 정렬을 최적화하기 위해 표준화, 및 재현할 수 있는 방식으로 비교되는 서열간 차이를 삽입할 수 있고, 따라서 보다 의미있는 상기 두 서열의 비교를 이룰 수 있게 한다. 본 발명의 목적상, 두 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열의 서열 상동성은 NCBI BLAST program version 2.2.29 (Jan-06-2014) (Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402)를 사용하여 결정된다. 두 아미노산 서열의 서열 상동성은 다음의 파라미터의 blastp 세트에 의해 확인된다: Matrix: BLOSUM62, Word Size: 3; Expect value: 10; Gap cost: Existence = 11, Extension = 1; Filter = low complexity activated; Filter String: L; Compositional adjustments: 조건적인 구적 스코어 매트릭스 조정. 본 발명의 목적상 두 뉴클레오타이드 서열간 서열 상동성은 다음의 예시적인 파라미터에서 blastn 세트의 NCBI BLAST program version 2.2.29 (Jan-06-2014)를 사용하여 결정된다: Word Size: 11; Expect value: 10; Gap costs: Existence = 5 , Extension = 2; Filter = low complexity activated; Match/Mismatch Scores: 2,-3; Filter String: L; m.
또한, 본 발명은 본 발명의 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현하도록 조작된 숙주세포를 제공한다. SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나 또는 이들의 기능적 상동체를 각각 포함한다. 보조 단백질은 또한 PP7435_Chr3-0788 (SUR2), PP7435_Chr3-1005 (PHS1), PP7435_Chr2-0350 (AUR1), PP7435_Chr4-0626 (IFA38), PP7435_Chr3-0669 (SCS7), PP7435_Chr3-0636 (CRD1), PP7435_Chr3-0950 (SLC4), PP7435_Chr2-0585 (PIS1), PP7435_chr1-0934 (PRY2), ARV1 (ORF not annotated; located between PP7435_Chr4-0493/0494), PP7435_Chr3-0741 (ARE2), PP7435_Chr4-0963 (FAD12), PP7435_Chr1-0794 (PSD1), PP7435_Chr1-0160 (SLC1), PP7435_CHR1-0078 (GPT2) PP7435_Chr3-1169 (DGK1) 및 PP7435_Chr2-0045 (CDS1) 또는 이들의 기능적 상동체를 포함한다. 유사하게, 본 발명은 본 발명의 보조 단백질(KO 보조 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 저발현하도록 조작된 숙주세포를 제공한다. KO 보조 단백질은 SEQ ID NO: 16 또는 17 중 어느 하나 또는 이들의 기능적 상동체를 각각 포함한다. KO 보조 단백질 또는 본 발명의 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 저발현되도록 조작된 숙주세포는 본 명세서에 기술된 항목에 기재된 하나 또는 그 이상의 보조 단백질을 추가로 과발현할 수 있다.
바람직하게, 본 발명은 목적 단백질을 생산하기 위한 재조합 숙주세포를 제공하며, 여기서 숙주세포는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현하도록 조작된다.
바람직하게, 본 발명은 목적 단백질을 생산하기 위한 재조합 숙주세포를 제공하며, 여기서 상기 숙주세포는 SEQ ID NO: 16 또는 17 중 어느 하나로 표시되는 아미노산과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 KO 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 저발현하도록 조작된다.
용어 “폴리펩타이드를 발현하는”은 폴리펩타이드가 mRNA로 전사되고 mRNA가 폴리펩타이드로 번역되는 경우를 의미한다. 용어 “과발현하는”은 일반적으로 참고 표준에서 관찰되는 발현 수준보다 그 발현 양이 높거나 동등한 경우를 의미한다. 본 발명에서 용어 “과발현하다”, “과발현하는”, “과발현된” 및 “과발현”은 숙주세포의 유전적 변형 전의 숙주세포 또는 정의된 조건에서 유전적으로 변형되지 않은 비교 가능한 숙주세포의 동일한 유전자 산물 또는 폴리펩타이드의 발현보다 더 높은 수준을 갖는 경우를 의미한다. 본 발명에서, SEQ ID NO: 1 내지 15중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 보조 단백질은 과발현된다. 숙주세포가 임의의 유전자 산물을 포함하지 않는 경우, 유전자 산물은 발현을 위해 숙주세포로 삽입될 수 있고; 이 경우, 임의의 검출가능한 발현은 용어 “과발현”에 포함된다.
용어 “저발현하다”는 일반적으로 본 명세서에 기술된 KO 보조 단백질을 저발현하도록 조작하기 전의 숙주세포인, 참고 표준에서 관찰되는 발현 수준에 비해 그 발현 양이 감소한 경우를 의미한다. 본 발명에서 용어 “저발현하다”, “저발현하는”, “저발현된” 및 “저발현”은 숙주세포의 유전적 변형 전의 숙주세포 또는 정의된 조건에서 유전적으로 변형되지 않은 비교 가능한 숙주세포의 동일한 유전자 산물 또는 폴리펩타이드의 발현보다 더 낮은 수준을 갖는 경우를 의미한다. 예를 들어, KO 단백질은 참고 표준과 비교하여 적어도 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90%, 95%, 99 %로 저발현되거나 전혀 발현되지 않을 수 있다(100% 감소). 유전자 산물 또는 폴리펩타이드의 발현은, 예를 들어 KO 보조 유전자의 결실/넉-아웃에 의해 얻어진 유전자 산물 또는 펩타이드의 발현은 또한 용어 "저발현"에 포함되지 않는다.
본 발명에서 사용된, "조작된(engineered)" 숙주세포는 유전자 조작, 예를 들어 인간의 개입을 이용하여 조작된 숙주세포이다. 숙주세포가 임의의 단백질을 "저발현하도록 조작된" 경우, 숙주세포는 숙주세포가 발현하는 능력, 바람직하게는 보조 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 과발현할 수 있도록 조작되며, 이로써 임의의 단백질, 예를 들어 POI 또는 모델 단백질의 발현이 동일한 조건 하에서 조작되기 전의 숙주세포와 비교하여 증가된다.
숙주세포가 “저발현”되거나 임의의 단백질을 “저발현하도록 조작된” 경우, 숙주세포는 숙주세포가 KO 보조 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 저발현할 수 있도록 조작되며, 이로써 임의의 단백질, 예를 들어 POI 또는 모델 단백질의 발현이 동일한 조건 하에서 조작되기 전의 숙주세포와 비교하여 증가된다. 저발현은 SEQ ID NO: 16 또는 17 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 KO 보조 단백질의 기능적 발현을 방지하는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 이 결과 기능을 발휘할 수 없게 된다. 저발현의 수단은 유전자 침묵(예를 들어, RNAi 유전자 안티센스), 넉-아웃, 발현 수준 변경, 발현 패턴 변경, 유전자 서열 돌연변이, 서열 파괴, 삽입, 추가, 돌연변이, 발현 조절 서열의 변형, 등을 포함할 수 있다. 저발현의 바람직한 수단은 KO 보조 단백질의 기능적 발현을 넉-아웃하는 것이고, 예를 들어, KO 보조 단백질 또는 이들의 단편을 코딩하는 서열을 결실하거나 KO 보조 단백질의 발현을 위해 요구되는 조절 서열(예를 들어, 프로모터)를 결실하는 수단이다.
본 발명의 숙주세포와 관련하여, "조작되기 전"은 이러한 숙주세포가 보조 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 조작되지 않은 것을 의미한다. 따라서 상기 용어는 또한 숙주세포가 보조 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과- 또는 저-발현하지 않고, 보조 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현 또는 저발현하지 않도록 조작되지 않은 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “상기 목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 상기 숙주세포를 조작하는”은 본 발명의 숙주세포가 목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 구비하고, 즉, 본 발명의 숙주세포가 목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 조작된 것을 의미한다. 이는 형질전환 또는 형질감염, 또는 숙주세포에 폴리뉴클레오타이드를 삽입하기 위한 당업계에 알려진 적합한 임의의 기술에 의해 달성될 수 있다.
과발현
과발현은 당업계에서 당업자에게 알려진 임의의 방법뿐만 아니라 상세하게 후술된 방법에 의해 달성될 수 있다. 일반적으로, 유전자의 전사/번역을 증가시킴으로써, 예를 들어 유전자의 복제물 수를 증가시키거나 유전자, 예를 들어 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 내인성의 폴리뉴클레오타이드의 발현과 관련된 조절 서열 또는 부위를 번형시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 과발현은 조절 서열(예를 들어, 프로모터)와 작동 가능하게 연결된, 보조 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 하나 또는 그 이상의 복제물을 삽입시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 유전자는 높은 발현 수준에 도달하기 위해, 강력한 항시적 프로모터 및/또는 유비쿼터스 프로모터와 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이러한 프로모터는 내인성 프로모터 또는 재조합 프로모터일 수 있다. 대안적으로, 상기 프로모터는 발현이 항시적으로 이루어지고자 조절 서열이 제거될 수 있다. 어느 프로모터의 경우, 임의의 유전자 본연의 프로모터가 유전자의 발현 증가 및 유전자의 항시적 발현을 이끄는 이종의 프로모터로 치환될 수 있다. 예를 들어, 보조 단백질은 동일한 조건에서 배양된 조작되기 전의 숙주세포에 비해, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 이상 또는 300% 이상 과발현될 수 있다. 추가적으로 유도성 프로모터의 사용은 숙주세포 배양 과정에서 발현 증가를 가능하게 한다. 또한 과발현은 예를 들어, 특정 유전자의 염색체 위치 변형, 특정 유전자, 예를 들어 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결 부위 부근의 핵산 서열 변경, 유전자의 전사에 관여하는 단백질(예를 들어, 조절 단백질, 억제자, 인핸서, 전사인자 활성자 등)의 변형, 또는 당업계에서 기술적으로 특정 유전자 발현을 저해하는 전통적인 다른 수단, 예를 들어 안티세스 핵산 분자의 사용, 예를 들어 과발현되는 목적 유전자의 발현을 저해하는 전사 인자에 대한 유전자를 결실 또는 변이시키거나, 억제 단백질의 발현 차단에 의해 달성될 수 있다. mRNA의 수명을 연장시키는 것 또한 발현 수준을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 특정 종결 지역은 mRNA의 반감기를 연장하는데 이용될 수 있다(Yamanishi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2011) 75:2234 and US 2013/0244243). 만일 유전자의 복수의 복제물이 포함되는 경우, 상기 유전자는 다양한 복제 수의 플라스미드에 위치할 수 있거나, 염색체에 도입되고 증폭될 수 있다. 만일 숙주세포가 보조 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하지 않는 경우, 발현을 위해 숙주세포 내로 유전자가 삽입될 수 있다. 이 경우, "과발현"은 당업계에서 당업자에게 알려진 임의의 방법을 사용하여 유전자 산물을 발현하는 것을 의미한다.
이러한 당업자는 Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), EP 0 472 869, US 4,601,893, Schwarzer and Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001- 1007 (1993)), WO 96/15246, Malumbres et al. (Gene 134, 15- 24 (1993)), JP-A-10-229891, Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) 및 Makrides (Microbiological Reviews 60, 512-538 (1996)), 이 중에서도 유전자 및 분자 생물학에서 널리 알려져 있는 서적으로부터 관렴 지침을 찾을 수 있다.
보조 단백질
본 발명의 보조 단백질은 원래 피키아 파스토리스 CBS7435 균주 또는 사카로마이세스 세레비지에로부터 SEQ ID NO: 8 및 9로 분리되었다. 메탄올자화 효모 피키아 파스토리스(코마가타엘라 파피) CBS7435는 일반적으로 사용되는 P. pastoris 재조합 단백질 생산 숙주의 모균주이다. 상기 숙주세포의 전체 유전자 서열은 Sturmberger et al. [J. Biotechnol. (2016). 235(4):121-131)]에 기술되어 있다. 본 명세서에서 동정한 보조 단백질을 코딩하는 유전자는 단백질 수율에 미치는 이로운 효과와는 연관이 없는 것으로 알려져 왔다. 매우 가깝게 관련된 피키아 파스토리스 균주, GS115의 전체 유전자 서열은 CBS7435의 우전자 서열과 거의 동일하고, CBS7435의 서열에 상응하는 GS115의 서열은 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.
상기 보조 단백질은 광범위한 숙주세포에 걸쳐 과발현될 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 종 또는 속 고유의 서열을 사용하는 대신, 보조 단백질 서열은 또한 다른 원핵생물 또는 진핵생물 유기체들로부터 유래될 수 있다. 보조 단백질을 코딩하는 외부 DNA 서열은 다양한 공급원, 예를 들어 식물, 곤충, 곰팡이, 또는 포유류 종, 바람직하게 사카로마이케스 목, 바람직하게 사카로마이케스 과, 바람직하게 사카로마이케스 종으로부터 수득될 수 있고, 바람직하게 코마가타엘라 속으로부터 얻을 수 있다.
특히, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체 단독 또는 이들의 조합을 포함하는 보조 단백질을 과발현할 수 있는, 유전적으로 변형된 숙주세포에 관한 것이다. 보조 단백질의 조합을 반영하도록 조작되는 숙주세포는 바람직한 구현예에서 예상된다. 이러한 숙주세포는 바람직하게 본 명세서에 기술된 방법 및 용도에 적용된다. 2개 또는 그 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상의 보조 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 조합은 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로부터 선택된다.
마찬가지로, 조합은 과발현되는 SEQ ID NO: 1 내지 15 및 PP7435_Chr3-0788 (SUR2), PP7435_Chr3-1005 (PHS1), PP7435_Chr2-0350 (AUR1), PP7435_Chr4-0626 (IFA38), PP7435_Chr3-0669 (SCS7), PP7435_Chr3-0636 (CRD1), PP7435_Chr3-0950 (SLC4), PP7435_Chr2-0585 (PIS1), PP7435_chr1-0934 (PRY2), ARV1 (ORF not annotated; located between PP7435_Chr4-0493/0494), PP7435_Chr3-0741 (ARE2), PP7435_Chr4-0963 (FAD12), PP7435_Chr1-0794 (PSD1), PP7435_Chr1-0160 (SLC1), PP7435_CHR1-0078 (GPT2) PP7435_Chr3-1169 (DGK1) 및 PP7435_Chr2-0045 (CDS1) 중 어느 하나 또는 이들의 기능적 상동체로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 보조 단백질(들)의 조합을 포함하며, 저발현되는 SEQ ID NO: 16 또는 17 중 어느 하나 또는 이들의 기능적 상동체로부터 선택된 보조 단백질을 포함한다. 이러한 조합을 반영하도록 조작되는 숙주세포는 바람직한 구현예에서 예상된다. 이러한 숙주세포는 본 명세서에 기술된 방법 및 용도에 적용될 수 있다.
다음의 보조 단백질 및 스핑고지질 생합성에 관여하는 본 발명의 보조 단백질의 조합은 바람직하게 본 명세서에 기술된 숙주세포, 방법 및 용도에 적용된다:
(a) SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(b) SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(c) SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(d) SEQ ID NO: 1 및 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 및 2로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(e) SEQ ID NO: 1 및 3으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 및 3으로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(f) SEQ ID NO: 1, 3 및 4로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1, 3 및 4로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(g) SEQ ID NO: 1, 3, 4 및 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1, 3, 4 및 8로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(h) SEQ ID NO: 5 및 6으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 5 및 6으로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(i) SEQ ID NO: 1 및 7로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 및 7로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(j) SEQ ID NO: 5, 6 및 9로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 5, 6 및 9로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질;
(k) SEQ ID NO: 1, 5, 6 및 9로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 단백질로서, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1, 5, 6 및 9로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 단백질.
본 발명의 보조 단백질의 조합은 스핑고지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질과 지질 수송에 관여하는 적어도 하나의 단백질을 과발현하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기술된 숙주세포, 방법 및 용도에 적용되는 바람직한 조합에서, 스핑고지질 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 지질 수송에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 및 11로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이다.
본 발명의 보조 단백질의 조합은 인지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질과 지질 수송에 관여하는 적어도 하나의 단백질을 과발현하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기술된 숙주세포, 방법 및 용도에 적용되는 바람직한 조합에서, 인지질 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 지질 수송에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 10 및 11로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 보조 단백질 이외에 샤페론을 과발현시키는 것에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "샤페론"은 접힘, 풀림, 다른 폴리펩타이드와의 조립 또는 분해를 돕는 폴리펩타이드에 관한 것이며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이다.
따라서, 본 발명의 보조 단백질의 조합은 스핑고지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질과 적어도 하나의 샤페론을 과발현하는 것을 포함한다. 바람직하게, 스핑고지질 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 샤페론은 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 및 18로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이다.
본 발명의 보조 단백질의 추가의 조합은 에르고스테롤 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질과 적어도 하나의 샤페론을 과발현하는 것을 포함한다. 바람직하게, 에르고스테롤 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 샤페론은 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 13 및 18로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이다.
목적 단백질
본 명세서에서 사용된 용어 “목적 단백질(protein of interest, POI)”은 숙주세포에서 재조합 기술 수단에 의해 생산된 단백질을 의미한다. 보다 구체적으로, 상기 단백질은 숙주세포에서 자연적으로 발생되지 않은 폴리펩타이드, 예를 들어, 이종의 단백질일 수 있거나, 숙주세포 본연의 폴리펩타이드, 예를 들어 숙주세포에 대한 상동성 단백질일 수도 있으나, 예를 들어, 상기 숙주세포는 POI를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 자가-복제 벡터로 형질전환되거나, 숙주세포의 게놈으로 POI를 코딩하는 핵산 서열의 하나 또는 그 이상의 복제물로 재조합시키는 기술에 의해 삽입되거나, POI를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 조절 서열, 예를 들어 프로모터 서열의 재조합 변형에 의해 생산될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에서 나타내는 목적 단백질은 당업자에게 널리 알려진 재조합 발현의 방법에 의해 생산될 수 있다. 목적 단백질은 바람직하게 막 단백질이 아니며, 예를 들어, 바람직하게 POI는 비-막 목적 단백질이다.
숙주세포
본 명세서에서 사용된 “숙주세포”는 단백질의 발현 및 선택적으로 단백질을 분비할 수 있는 세포를 의미한다. 이러한 숙주세포는 본 발명의 방법에 적용된다. 이러한 목적을 위해, 즉 숙주세포가 지질 대사에 관여하는 폴리펩타이드를 과- 또는 저발현하기 위해 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 세포에 존재하거나 도입된다. 본 발명에서 제공된 숙주세포는 진핵생물 숙주세포일 수 있다. 보다 구체적으로는 비-포유류 진핵생물 숙주세포이다. 보다 더 구체적으로는 진균 숙주세포이다. 당업계에서 평가되고 있는 바와 같이, 원핵세포는 핵 부근의 막(핵막)이 부족한 반면, 원핵세포는 핵막을 가지고 있다. 진핵세포의 예로는, 이에 제한되는 것인 아니나, 척추동물 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 동물 세포, 무척추동물 세포, 식물 세포, 선충류 세포, 곤충 세포, 줄기 세포, 곰팡이 세포 또는 효모 세포를 포함한다.
효모 세포의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 사카로마이세스 속(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지에, 사카로마이세스 클루이베리, 사카로마이세스 우바륨), 코마가타엘라 속(코마가타엘라 파스토리스, 코마가타엘라 슈도파스토리스, 또는 코마가타엘라 파피), 클루이베로마이에스 속(예를 들어, 클루이베로마이에스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스), 캔디다 속(예를 들어, 캔디다 유틸리스, 캔디다 카카오이), 지오트리쿰 속(예를 들어, 지오트리쿰 퍼멘탄스) 뿐만 아니라 한세눌라 폴리모르파 및 야로위아 리포리티카를 포함한다.
피키아 종은 특히 흥미롭다. 피키아는 피키아 파스토리스, 피키아 메타놀리카, 피키아 클루이베리, 및 피키아 안구스타를 포함하는 수많은 종을 포함한다. 가장 바람직하게는 피키아 파스토리스 종이다.
전술한 피키아 파스토리스 종은 다시 나뉘어지며, 코마가타엘라 파스토리스 및 코마가타엘라 파피로 다시 명명된다. 따라서 피키아 파스토리스는 코마가타엘라 파스토리스 및 코마가타엘라 파피 모두와 동일한 것을 의미한다.
본 발명에서 유용한 피키아 파스토리스 균주의 예로는 X33 및 이의 아형들 GS115, KM71, KM71H; CBS7435 (mut+) 및 이의 아형들 CBS7435 muts, CBS7435 mutsΔArg, CBS7435 mutsΔHis, CBS7435 mutsΔArg, ΔHis, CBS7435 muts PDI+, CBS 704 (=NRRL Y-1603 = DSMZ 70382), CBS 2612 (=NRRL Y-7556), CBS 9173-9189 및 DSMZ 70877뿐만 아니라 이들의 변이체들이 있다. 이러한 효모 균주는 세포 저장기관, 예를 들어 American Tissue Culture Collection (ATCC), 독일, 브라운슈바이크의 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" (DSMZ) 또는 네덜란드, 위트레흐트의 "Centraalbureau voor Schimmelcultures" (CBS) 로부터 구할 수 있다.
추가적인 바람직한 구현예에 따르면, 숙주세포는 피키아 파스토리스, 한세눌라 폴리모르파, 트리코더마 레세이, 사카로마이세스 세레비지에, 클루이베로마이에스 락티스, 야로위아 리포리티카, 피키아 메타놀리카, 캔디다 보이디니이 및 코마가타엘라, 및 스키조사카로마이에스 폼베이다. 상기 숙주세포는 또한 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis) 유래일 수 있다. 이러한 효모 균주는 세포 저장기관, 예를 들어 American Tissue Culture Collection (ATCC), 독일, 브라운슈바이크의 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" (DSMZ) 또는 네덜란드, 위트레흐트의 "Centraalbureau voor Schimmelcultures" (CBS) 로부터 구할 수 있다.
에스케리키아 콜라이의 예로는 에스케리키아 콜라이 K12 균주로부터 유래된 것을 포함하며, 구체적으로 HMS 174, HMS174 (DE3), NM533, XL1-Blue, C600, DH1, HB101, JM109, 뿐만 아니라 B-균주로부터 유래한 것, 구체적으로 BL-21, BL21 (DE3) 등을 포함한다. 예를 들어, E. coli는 복제 목적을 위해 사용될 수 있지만, 본 발명의 숙주세포로서 사용될 수도 있다. 이러한 세균성 균주는 세포 저장 기관, 예를 들어 American Tissue Culture Collection (ATCC), 독일, 브라운슈바이크의 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" (DSMZ) 또는 네덜란드, 위트레흐트의 "Centraalbureau voor Schimmelcultures" (CBS) 로부터 구할 수 있다.
바람직하게, 숙주세포에 의해 발현되는 보조 단백질은 동일한 세ㅗ로부터 유래하거나, 또는 동일한 종, 속 또는 과의 세포로부터 재조합된다. 본 발명에서 사용된 “재조합”은 인간 개입에 의한 유전적 물질의 변경을 의미한다. 전형적으로, 재조합은 복제 및 재조합을 포함하는 분자 생물학적(재조합 DNA 기술) 방법에 의해 바이러스, 세포, 플라스미드 또는 벡터 내 DNA 또는 RNA가 조작되는 것을 의미한다. 재조합 세포, 폴리펩타이드 또는 핵산은 자연적으로 발생한 대응물(“야생형”)과 어떻게 상이한지 전형적으로 기술될 수 있다. “재조합 세포” 또는 “재조합 숙주세포”는 상기 세포의 본연의 것이 아닌 핵산 서열을 포함하도록 유전적으로 변경된 세포 또는 숙주세포를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “생산하다” 또는 “생산하는”은 목적 단백질이 과발현되도록 하는 과정을 의미한다. “목적 단백질을 생사하기 위한 숙주세포”는 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 도입될 수 있는 숙주세포를 의미한다. 본 발명에서 재조합 숙주세포는 목적 단백질을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 것을 필요로 하지 않는다. 목적하는 뉴클레오타이드 서열을 삽입하기 위한 숙주세포가 제공될 수 있는지는 예를 들어, 키트를 사용하여 당업자에게 평가되었다. “생산하는” 또는 “생산하다”는 또한 본 발명의 숙주세포를 사용하여 POI를 생산하고, 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 과발현하기에 적합한 조건 하에서 본 발명의 숙주세포를 배양하며, 그리고 선택적으로 세포 배양물로부터 상기 목적 단백질을 분리하는 단계를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "뉴클레오타이드 서열" 또는 "핵산 서열"은 DNA 또는 RNA를 나타낸다. "핵산 서열" 또는 "폴리뉴클레오타이드 서열" 또는 단순하게 "폴리뉴클레오타이드"는 5'에서 3' 말단으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드의 단일 또는 이중가닥 중합체를 나타낸다. 이는 자가-복제 플라스미드, DNA 또는 RNA의 감염성 중합체, 및 비-기능적 DNA 또는 RNA를 모두 포함한다.
용어 “아미노산”은 자연 발생 및 합성 아미노산 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 기능을 갖는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 의미한다. 자연 발생 아미노산은 유전적 암호에 의해 암호화된 것으로서, 상기 아미노산은 이후에 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린으로 변형될 수 있다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과동일한 기초적 화학구조, 예를 들어, 수소, 카르복시기, 아미노기, 및 호모세린, 노어루신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포니움과 같은 R 기와 결합된 탄소를 갖는 화합물을 의미한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노어루신) 또는 변형된 펩타이드 골격을 가지나, 자연 발생 아미노산과 같이 동일한 기초적 화학 구조를 지니고 있다. 아미노산 모사체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 차이가 있는 구조를 갖는 화학적 화합물이나, 자연 발생 아미노산과 유사한 기능을 지니고 있는 것을 의미한다.
용어 “폴리펩타이드” 및 “단백질”은 상호 교환적으로 사용된다. 용어 “폴리펩타이드”는 둘 또는 그 이상의 아미노산, 전형적으로 적어도 3개, 바람직하게 적어도 20개, 보다 바람직하게 적어도 30개, 적어도 50개와 같이 아미노산을 포함하는 단백질 또는 펩타이드를 의미한다. 따라서, 폴리펩타이드는 아미노산 서열을 포함하고, 따라서, 때때로 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 “폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드”로 나타낸다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “폴리펩타이드 서열”은 용어 “아미노산 서열”과 상호 교환적으로 사용된다. 앞서 언급했듯이, 과발현은 선택되는 보조 단백질의 하나의 여분의 복제물의 하나 또는 그 이상을 삽입함으로써 달성된다. 바람직한 구현예에 따르면, 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 단일 복제물 또는 세포당 다수의 복제물로 존재할 수 있다. 상기 복제물은 각각으로부터 인접하거나 멀리 있을 수 있다. 본 발명에 따른 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 숙주세포의 유전체 내로, 단일 복제물 또는 세포당 다수의 복제물로 삽입하기에 적합한 하나 또는 그 이상의 플라스미드 상에 제공된 보조 단백질을 코딩하는 재조합 뉴클레오타이드 서열을 사용한다. 상기 복제물은 각각으로부터 인접하거나 멀리 있을 수 있다. 하나의 구체예에서, 과발현은 숙주세포당 폴리뉴클레오타이드의 하나 또는 다수의 복제물, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현함으로써 달성된다. 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게 숙주세포에서 폴리펩타이드의 발현을 제공하는 전사적 및 번역적 조절 서열과 작동 가능하게 연결된다. 본 명세서에서 사용된 용어 “전사적 조절 서열”은 유전자 핵산 서열과 관련이 있으며, 유전자 전사를 조절하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 “전사적 조절 서열”은 유전자 핵산 서열과 관련이 있으며, 유전자의 번역을 조절하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 전사적 및/또는 번역적 조절 서열은 플라스미드 또는 벡터에 위치하거나 숙주세포의 염색체로 삽입될 수 있다. 전사적 또는 번역적 조절 서열은 그것을 조절하는 유전자의 동일한 핵산 분자에 위치된다. 바람직하게, 과발현은 숙주세포당 SEQ ID NO: 1내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 1, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 복제물을 가짐으로써, 또는 숙주세포당 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 복제물을 가짐으로써 달성될 수 있다.
보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 POI를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게 숙주세포의 유전체로 삽입된다. 용어 “유전체”는 일반적으로 DNA(또는 특정 바이러스 종에서 RNA)에서 코딩된 유기체의 모든 유전적 정보를 나타낸다. 이는 염색체, 플라스미드 또는 벡터, 이들 둘 모두 내 존재할 수 있다. 바람직하게, 보조 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포의 염색체 내 삽입될 수 있다.
보조 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 이의 자연적인 유전자자리 내 위치할 수 있다. “자연적인 유전자 자리(natural locus)”는 특정 염색체 상 자리로서, 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 위치하고, 예를 들어 본 발명의 보조 단백질을 코딩하는 유전자의 자연적인 유전자 자리이다. 임의의 이러한 유전자는 상기 표 1에 표시된 유전자 유사체에 따라 동정된다. 그러나, 또 다른 구현예에서, 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포의 유전체 내 자연적 유전자 자리가 아닌 이소성으로 삽입된다. 용어 “이소성 삽입”은 일반적인 염색체 유전자 자리가 아닌 다른 부위에서 미생물의 유전체로 핵산이 삽입되는 것, 예를 들어 미리 결정되거나 우발적 삽입을 나타낸다. 선택적으로, 보조 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 자연적 유전자 자리 및 이소성으로 삽입될 수 있다.
효모 세포에 대해, 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 POI를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 목적하는 위치, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니나, AOX1, GAP, ENO1, TEF, HIS4 (Zamir et al., Proc. NatL Acad. Sci. USA (1981) 78(6):3496-3500), HO (Voth et al. Nucleic Acids Res. 2001 June 15; 29(12): e59), TYR1 (Mirisola et al., Yeast 2007; 24: 761-766), His3, Leu2, Ura3 (Taxis et al., BioTechniques (2006) 40:73-78), Lys2, ADE2, TRP1, GAL1, ADH1 또는 5S 리보솜 RNA 유전자의 삽입에 대한 위치로 삽입될 수 있다.
다른 구현예에서, 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 POI를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드 또는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 “플라스미드” 또는 “벡터”는 자체적으로 복제하는 폴리뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 게놈 통합 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 당업자는 숙주세포에 따라 적합한 플라스미드 또는 벡터를 사용할 수 있다.
바람직하게, 플라스미드는 진핵생물의 발현 벡터이며, 바람직하게 효모 발현 벡터이다.
플라스미드는 재조합 유전자 및 적합한 숙주 유기체 내 이들의 mRNA의 번역과 같이 복제된 재조합 뉴클레오타이드 서열의 전사를 위해 사용될 수 있다. 플라스미드는 또한 당업계에 알려진 방법, 예를 들어 J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)에 개시된 방법에 의해 숙주세포 유전체 내로 타겟 폴리뉴클레오타이드를 삽입하는데 사용할 수 있다. "플라스미드"는 일반적으로 숙주세포 내 독자적인 복제를 위한 개시점, 선택적 마커, 수 많은 제한 효소 절개 부위, 적합한 프로모터 서열, 및 전사 종결 인자를 포함하고, 상기 구성들은 함께 작동 가능하도록 연결되어 있다. 목적 서열을 코딩하는 폴리펩타이드는 숙주세포 내 폴리펩타이드의 발현을 위한 전사 및 번역 조절 서열이 작동 가능하게 연결되어 있다.
동일한 핵산 분자가 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여 있을 때, 상기 핵산은 “작동 가능하게 연결”되어 있다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 발현에 영향을 주는 경우, 프로모터는 재조합 유전자의 코딩 서열과 작동 가능하게 연결되어 있다.
대부분의 플라스미드는 세균 세포마다 오직 하나의 복제물이 존재한다. 그러나, 몇몇 플라스미드에서는 많은 복제수가 존재한다. 예를 들어, 플라스미드 ColE1은 전형적으로 에스케리키아 콜리 내 염색체마다 10 내지 20개, 의 플라스미드 복제물이 존재한다. 만일 본 발명의 뉴클레오타이드 서열이 플라스미드 내 포함되어 있다면, 플라스미드는 숙주세포마다 1 내지 10개, 10 내지 20개, 20 내지 30개, 30 내지 100개 또는 그 이상의 복제 수를 갖는다. 플라스미드의 많은 복제수에 따라 세포에 의한 보조 단백질의 과발현이 가능하게 된다.
수많은 적합한 플라스미드 또는 벡터는 당업계에 알려져 있고, 다수는 상업적으로 이용 가능하다. 적합한 벡터의 예는 Sambrook et al, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), 및 Ausubel et al, eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1997)를 포함한다.
본 발명의 벡터 또는 플라스미드는 효모 인공 염색체를 포함하고, 이는 이종의 DNA 서열(예를 들어, 3000 kb 크기의 DNA 서열)을 포함하도록 유전적으로 변형될 수 있는 DNA 컨스트럭트를 의미하며, 짧은 사슬 중합체, 중심립, 및 복제의 개시점(복제 개시점) 서열을 포함한다.
본 발명의 벡터 또는 플라스미드는 또한 박테리아 인공 염색체(BAC)를 포함하고, 이는 이종의 DNA 서열(예를 들어, 300 kb 크기의 DNA 서열)을 포함하도록 유전적으로 변형될 수 있는 DNA 컨스트럭트를 의미하며, 복제 개시점 서열(Ori)를 포함하고, 하나 또는 그 이상의 헬리카제(예를 들어, parA, parB, 및 parC)를 포함할 수 있다.
숙주로서의 효모를 사용하는 플라스미드의 예로는, YIp 타입 벡터, YEp 타입 벡터, YRp 타입 벡터, YCp 타입 벡터 (Yxp 벡터는, 예를 들어 Romanos et al. 1992, Yeast. 8(6):423-488에 개시된 것임), pGPD-2 (Bitter et al., 1984, Gene, 32:263-274에 개시됨), pYES, pAO815, pGAPZ, pGAPZα, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K, pPICZ, pPICZα, pPIC3K, pPINK-HC, pPINK-LC (all available from Thermo Fisher Scientific/Invitrogen), pHWO10 (Waterham et al., 1997, Gene, 186:37-44에 개시됨), pPZeoR, pPKanR, pPUZZLE 및 pPUZZLE-유도체 (Stadlmayr et al., 2010, J Biotechnol. 150(4):519-29.; Marx et al. 2009, FEMS Yeast Res. 9(8):1260-70.에 개시됨); pJ-vectors (예를 들어, pJAN, pJAG, pJAZ 및 이들의 유도체; all available from BioGrammatics, Inc), pJexpress-vectors, pD902, pD905, pD915, pD912 및 이들의 유도체, pD12xx, pJ12xx (all available from ATUM/DNA2.0), pRG plasmids (Gnugge et al., 2016, Yeast 33:83-98에 개시됨), 2 μm 플라스미드 (예를 들어, Ludwig et al., 1993, Gene 132(1):33-40에 개시됨)를 포함한다. 이러한 벡터는 알려져 있고, 예를 들어 Cregg et al., 2000, Mol Biotechnol. 16(1):23-52 or Ahmad et al. 2014., Appl Microbiol Biotechnol. 98(12):5301-17에 개시되어 있다. 추가적으로 적합한 벡터는 예를 들어 Lee et al. 2015, ACS Synth Biol. 4(9):975-986; Agmon et al. 2015, ACS Synth. Biol., 4(7):853-859; or Wagner and Alper, 2016, Fungal Genet Biol. 89:126-136에 개시된 것과 같은 고급 모듈 복제 기술에 의해 이미 생산된 것일 수 있다. 추가적으로, 이들 및 다른 적합한 벡터는 또한 www.addgene.org에서 구할 수 있다.
이들의 숙주로서 에스케리키아 콜라이를 사용하는 플라스미드의 예로는, pBR322 (available e.g. from New England Biolabs and ThermoFisher Scientific), pBAD-vectors, pET-vector series (both available from e.g. ThermoFisher Scientific, pET vectors also from Novagen),, pUC18, pUC19, pUC118/119 (all available from e.g Takara), pVC119 (described in Del Sol et al., 2006, J Bacteriol. 188(4):1540-1550), pSP64, pSP65 (both from Promega), pTZ-18R/-18U (from Amersham), pTZ-19R/-19U (available from Sigma-Aldrich), pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf(-) (pGEM vectors are available from Promega), 및 pBluescript KS (available from Agilent)를 포함한다. 에스케리키아 콜라이에서 발현을 위해 적합한 플라스미드의 예는, pKK223 (Brosius and Holy, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81:6929-6933에 개시됨), pMC1403, pMC931 (Casadaban et al. 1980, J Bacteriol. 143(2):971-980에 개시됨), 및 pKC30 (Rao, 1984, Gene 31(1-3):247-250에 개시됨)를 포함한다. 추가적으로, 이들 및 다른 적합한 벡터는 www.addgene.org에서 구할 수 있다.
프로모터
재조합 세포에서 내인성 폴리펩타이드의 과발현은 전사적 또는 번역적 조절 인자, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐레이션 신호인자, 전사 종결 인자, 내부 리보솜 유입점(IRES) 등의 변형에 의해 달성될 수 있고, 이는 숙주세포에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 한다. 이러한 서열은 전사에 관여하는 세포성 단백질과 특히 상호작용한다(Maniatis et al., Science, 236: 1237-1245 (1987)). 예시적인 서열은 예를 들어, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 개시되어 있다.
예를 들어, 재조합 세포에서 내인성 보조 단백질의 과발현은 프로모터의 변형, 예를 들어 높은 발현 수준에 도달하기 위해 또 다른 강력한 프로모터와 보조 단백질이 작동 가능하게 연결되어 있는 내인성 프로모터를 대체함으로써 달성될 수 있다. 이러한 프로모터는 유도성이거나 항시적일 수 있다. 내인성 프로모터의 변형은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 돌연변이 또는 상동체 재조합에 의해 수행될 수 있다.
보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 과발현은 당업계에 알려진 다른 방법, 예를 들어 Marx et al., 2008 (Marx, H., Mattanovich, D. and Sauer, M. Microb Cell Fact 7 (2008): 23), 및 Pan et al., 2011 (Pan et al., FEMS Yeast Res. (2011) May; (3):292-8.)에 개시된 이들의 내인성 조절 지역을 유전적으로 변형시킴으로써 달성될 수 있고, 이러한 방법은, 예를 들어 보조 단백질의 발현을 증가시키는 재조합 프로모터의 삽입을 포함한다. 형질전환은 Cregg et al. (1985) Mol.　Cell. Biol. 5:3376-3385에 개시되어 있다. "재조합" 프로모터는 서열의 발현을 유도하는 것으로 나타낸다. 본 명세서에 사용된 재조합 프로모터는 임의의 서열에 대한 본연의 프로모터가 아니며, 예를 들어 상기 프로모터는 자연 발생 프로모터("본연의 프로모터")와 다르다. 이러한 프로모터는 때때로 이종의 프로모터로서 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 용어 “프로모터”는 특정 유전자의 전사를 돕는 지역을 의미한다. 프로모터는 전형적으로 프로모터가 존재하지 않은 경우의 발현된 재조합 산물의 양에 비해 뉴클레오타이드 서열로부터 발현된 재조합 산물의 양을 증가시킨다. 하나의 유기체로부터 프로모터는 다른 유기체 기원의 서열로부터 재조합 산물 발현을 향상시키도록 이용될 수 있다. 프로모터는 당업계의 방법(예를 들어, Datsenko et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97(12): 6640-6645 (2000))를 사용하여 상동성 재조합에 의해 숙주세포 염색체로 삽입될 수 있다. 추가로, 하나의 프로모터 엘리먼트는 동시에 결합된 다수의 서열에 대한 발현 산물의 양을 증가시킬 수 있다. 따라서, 하나의 프로모터 엘리먼트는 하나 또는 그 이상의 재조합 산물의 발현을 향상시킬 수 있다.
프로모터 활성은 그것의 전사적 효율에 의해 평가될 수 있다. 이는 프로모터 유래 mRNA 전사체의 양의 측정, 예를 들어, 노던 블롯팅, 정량적 PCR에 의해 직접적으로 확인할 수 있고, 프로모터로부터 발현된 유전자 산물의 양을 측정하여 간접적으로 확인될 수 있다.
프로모터는 “유도성 프로모터” 또는 “항시적 프로모터”일 수 있다. “유도성 프로모터”는 특정 인자의 존재 또는 부존재에 의해 유도될 수 있는 프로모터를 의미하며, “항시적 프로모터”는 이와 관련된 유전자 또는 유전자들의 계속적인 전사를 가능하게 하는 비조절된 프로모터를 의미한다.
바람직한 구현예에서, 보조 단백질과 POI 모두를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 전사는 각각 유도성 프로모터에 의해 작동된다. 또 다른 구현예에서, 보조 단백질과 POI를 모두 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 전사는 항시적 프로모터에 의해 작동된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 보조 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 전사는 항시적 프로모터에 의해 작동되고, POI를 코딩하는 뉴클레오타이드의 전사는 유도성 프로모터에 의해 작동된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 보조 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 전사는 유도성 프로모터에 의해 작동되고, POI를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 전사는 항시적 프로모터에 의해 작동된다. 실시예에서와 같이, 보조 단백질 유전자의 전사는 항시적 GAP 프로모터에 의해 작동될 수 있고, POI를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 전사는 유도성 AOX1 프로모터에 의해 작동될 수 있다. 하나의 구현예에서, 보조 단백질과 POI를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 전사는 동일한 프로모터 또는 프로모터 활성 및/또는 발현 양상의 관점에서 유사한 프로모터에 의해 작동된다.
수많은 유도성 프로모터가 당업계에 알려져 있다. 대부분 Gatz, Curr. Op. Biotech., 7: 168 (1996) (see also Gatz, Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89 (1997))에 기술되어 있다. 예로는 테트라사이클린 리프레서 시스템, Lac 리프레서 시스템, 구리-유도성 시스템, 살리실레이트-유도성 시스템(PR1 a 시스템과 같은), 글루코코르티코이드-유도성(Aoyama et al., 1997), 알코올-유도성 시스템, 예를 들어 AOX 프로모터, 및 ecdysome-유도성 시스템을 포함한다. 또한 포함되는 프로모터로 벤젠 설폰아마이드-유도성(U.S. Patent No. 5,364,780) 및 알코올-유도성(WO 97/06269 and WO 97/06268) 시스템 및 글루타티온 S-트랜스퍼라제 프로모터가 있다.
효모 숙주세포에 사용하기에 적합한 프로모터 서열은 Mattanovich et al., Methods Mol. Biol. (2012) 824:329-58에 기술되어 있고, 삼탄당인산 이성질체화 효소(TPI), 포스포글리세르산 인산화 효소(PGK), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소화 효소(GAPDH 또는 GAP) 및 이들의 변형체, 락타아제(LAC) 및 갈락토시다제(GAL), 피키아 파스토리스 글루코스-6-포스페이트 이성질체화 프로모터(PPGI), 3-포스포글리세르산 인산화효소 프로모터(PPGK), 글리세롤 알데하이드 포스페이트 탈수소화효소 프로모터(PGAP), 번역 신장 인자 프로모터(PTEF), 및 피키아 파스토리스 에놀라아제 I의 프로모터(PENO1), 삼탄당인산 이성질체화 효소(PTPI), 리보솜 소단위 단백질들(PRPS2, PRPS7, PRPS31, PRPL1), 알코올 산화효소 프로모터(PAOX) 또는 변형된 특성을 갖는 이들의 변이체, 포름알데하이드 탈수소화 효소 프로모터(PFLD), 이소구연산염 분해 효소 프로모터(PICL), 알파-케토이소카프로에이트 탈탄산 효소 프로모터(PTHI), 열충격 단백질 패밀리 구성들의 프로모터(PSSA1, PHSP90, PKAR2), 6-포스포글루콘산 탈수소화 효소(PGND1), 포스포글리세르산 뮤타아제(PGPM1), 케톨전달효소(PTKL1), 포스파티딜이노시톨 합성효소(PPIS1), 페로-O2-산화 환원 효소(PFET3), 고-친화적 철 투과 효소(PFTR1), 억제 가능한 알칼라인 인산 가수분해 효소(PPHO8), N-미리스토일 트랜스퍼라제(PNMT1), 페로몬 반응 전사 인자(PMCM1), 유비퀴틴(PUBI4), 단일-가닥의 DNA 핵산내부 가수분해 효소(PRAD2), 미토콘드리아성 내막의 주요 ADP/ATP 교환 수송체 프로모터(PPET9) (WO2008/128701) 및 포름산 탈수소 효소(FMD) 프로모터와 같은 해당 효소를 포함한다. GAP 프로모터, AOX 프로모터 또는 GAP 또는 AOX 프로모터로부터 유래된 프로모터는 특히 바람직하다. AOX 프로모터는 메탄올에 의해 유도될 수 있고 예를 들어 포도당에 의해 억제될 수 있다.
적합한 프로모터의 추가적인 예로는 사카로마이세스 세레비지에 에놀라아제 (ENO-1), 사카로마이세스 세레비지에 갈락토스인산화효소(GAL1), 사카로마이세스 세레비지에 알코올 탈수소화 효소/글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소화 효소(ADH1, ADH2/GAP), 사카로마이세스 세레비지에 삼탄당인산 이성질체화 효소(TPI), 사카로마이세스 세레비지에 메탈로티오네인(CUP1), 및 사카로마이세스 세레비지에 3-포스포글리세르산 인산화 효소(PGK) 및 말타아제 유전자 프로모터(MAL)를 포함한다.
효모 숙주세포의 다른 유용한 프로모터는 Romanos et al, 1992, Yeast 8:423-488에 기술되어 있다.
E. coli를 사용하기에 적합한 프로모터 서열은 T7 프로모터, T5 프로모터, 트립토판(trp) 프로모터, 락토오스(lac) 프로모터, 트립토판/락토오스(tac) 프로모터, 지질단백질(lpp) 프로모터, 및 플라스미드 내 λ 파지 PL 프로모터를 포함한다.
보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 작동하는 프로모터는 바람직하게 보조 단백질의 프로모터에 내재된 것이 아니다. 바람직하게, 재조합 프로모터는 보조 단백질 유전자의 내인성 프로모터 대신 사용된다.
인핸서
바람직한 구현예에서, 과발현은 보조 단백질의 발현을 작동시키는 프로모터의 활성을 향상시키는 인핸서를 사용함으로써 달성된다. 전사적 인핸서는 상대적으로 방향 및 위치 독립적이며, 상기 인핸서는 5' 및 3' 방향 전사 단위를 갖고, 인트론 내부 뿐만 아니라 그것의 코딩 서열 자체 내부에서 발견된다. 상기 인핸서는 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 발현 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 위치에 위치할 수 있다. 대부분 효모 유전자는 하나의 USA만을 포함하고, 이는 일반적으로 캡(Cap) 위치에 몇 백개의 염기쌍 내부에 존재하므로, 대부분의 효모 인핸서(UAS)가 프로모터의 3'에 위치하는 경우 제대로 기능을 발휘할 수 없을 수 있으나, 고등의 진핵세포의 인핸서는 프로모터의 5' 및 3'에서도 기능을 발휘할 수 있다.
현재 많은 인핸서 서열은 포유류 유전자(globin, RSV, SV40, EMC, elastase, albumin, a-fetoprotein 및 insulin) 유래로 알려져 있다. 또한 진핵세포 바이러스 유래의 인핸서, 예를 들어, SV40 후기 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 개시점의 후면에 존재하는 플라오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 사용할 수도 있다. 사카로마이세스 세레비지에 유래 UAS/Gal 시스템과 같은 효모 인핸서는 상위 활성 서열(UAS)로 명명되기도 하며, 이는 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용될 수 있다(European Patent No. 0317254 및 Rudoni et al., The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, (2000), 32(2):215-224에 개시됨).
바람직한 구현예에서, 본 발명에 기술된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 타입의 보조 단백질은 과발현된다. 예를 들어, 숙주세포는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나, 또는 이들의 기능적 상동체로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 보조 단백질이 과발현되도록 조작될 수 있으며, 여기서 이들의 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나와 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 아미노산을 포함한다. 추가의 구현예에서, 숙주세포는 SEQ ID NO: 1 내지 15, PP7435_Chr3-0788 (SUR2), PP7435_Chr3-1005 (PHS1), PP7435_Chr2-0350 (AUR1), PP7435_Chr4-0626 (IFA38), PP7435_Chr3-0669 (SCS7), PP7435_Chr3-0636 (CRD1), PP7435_Chr3-0950 (SLC4), PP7435_Chr2-0585 (PIS1), PP7435_chr1-0934 (PRY2), ARV1 (ORF not annotated; located between PP7435_Chr4-0493/0494), PP7435_Chr3-0741 (ARE2), PP7435_Chr4-0963 (FAD12), PP7435_Chr1-0794 (PSD1), PP7435_Chr1-0160 (SLC1), PP7435_CHR1-0078 (GPT2) PP7435_Chr3-1169 (DGK1) 및 PP7435_Chr2-0045 (CDS1) 중 어느 하나 또는 이들의 기능적 상동체로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 보조 단백질을 과발현하도록 조작된 것일 수 있으며, 여기서 이들의 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15, PP7435_Chr3-0788 (SUR2), PP7435_Chr3-1005 (PHS1), PP7435_Chr2-0350 (AUR1), PP7435_Chr4-0626 (IFA38), PP7435_Chr3-0669 (SCS7), PP7435_Chr3-0636 (CRD1), PP7435_Chr3-0950 (SLC4), PP7435_Chr2-0585 (PIS1), PP7435_chr1-0934 (PRY2), ARV1 (ORF not annotated; located between PP7435_Chr4-0493/0494), PP7435_Chr3-0741 (ARE2), PP7435_Chr4-0963 (FAD12), PP7435_Chr1-0794 (PSD1), PP7435_Chr1-0160 (SLC1), PP7435_CHR1-0078 (GPT2) PP7435_Chr3-1169 (DGK1) and PP7435_Chr2-0045 (CDS1) 중 어느 하나와 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 아미노산을 포함한다.
목적 단백질
숙주세포가 적합한 조건 하에서 보조 단백질 및 목적 단백질의 과발현을 위해 배양될 수 있는 경우, 숙주세포는 목적 단백질을 발현하고, SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나 또는 이들의 기능적 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현할 수 있는 것으로 가정하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는다. 숙주세포가 적합한 조건 하에서 보조 단백질과 목적 단백질의 공동발현을 위해 배양될 수 있는 경우, 숙주세포는 목적 단백질을 발현하고 SEQ ID NO: 1 내지 15, PP7435_Chr3-0788 (SUR2), PP7435_Chr3-1005 (PHS1), PP7435_Chr2-0350 (AUR1), PP7435_Chr4-0626 (IFA38), PP7435_Chr3-0669 (SCS7), PP7435_Chr3-0636 (CRD1), PP7435_Chr3-0950 (SLC4), PP7435_Chr2-0585 (PIS1), PP7435_chr1-0934 (PRY2), ARV1 (ORF not annotated; located between PP7435_Chr4-0493/0494), PP7435_Chr3-0741 (ARE2), PP7435_Chr4-0963 (FAD12), PP7435_Chr1-0794 (PSD1), PP7435_Chr1-0160 (SLC1), PP7435_CHR1-0078 (GPT2) PP7435_Chr3-1169 (DGK1) 및 PP7435_Chr2-0045 (CDS1) 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현할 수 있는 것으로 추가로 가정하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15, PP7435_Chr3-0788 (SUR2), PP7435_Chr3-1005 (PHS1), PP7435_Chr2-0350 (AUR1), PP7435_Chr4-0626 (IFA38), PP7435_Chr3-0669 (SCS7), PP7435_Chr3-0636 (CRD1), PP7435_Chr3-0950 (SLC4), PP7435_Chr2-0585 (PIS1), PP7435_chr1-0934 (PRY2), ARV1 (ORF not annotated; located between PP7435_Chr4-0493/0494), PP7435_Chr3-0741 (ARE2), PP7435_Chr4-0963 (FAD12), PP7435_Chr1-0794 (PSD1), PP7435_Chr1-0160 (SLC1), PP7435_CHR1-0078 (GPT2) PP7435_Chr3-1169 (DGK1) 및 PP7435_Chr2-0045 (CDS1) 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “목적 단백질(POI)”는 숙주세포에서 재조합 기술의 수단에 의해 생산되는 단백질을 의미한다. 보다 구체적으로, 단백질은 숙주세포에서 자연적으로 발생하지 않는 폴리펩타이드, 즉 이종의 단백질일 수 있거나, 숙주세포에서 자연적으로 발생하는 단백질, 즉 숙주세포에 대한 상동성 단백질일 수도 있으나, 상기 숙주세포는 예를 들어 POI를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 자가-복제 벡터로 형질전환되거나, 숙주세포의 유전체로 POI를 코딩하는 핵산 서열의 하나 또는 그 이상의 복제물로 재조합시키는 기술에 의해 삽입되거나, POI를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 조절 서열, 예를 들어 프로모터 서열의 재조합 변형에 의해 생산될 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에서 나타나는 목적 단백질은 당업자에게 널리 알려진 재조합 발현의 방법에 의해 생산될 수 있다.
목적 단백질(POI)에 대한 제한은 없다. 상기 POI는 일반적으로 진핵세포성 또는 원핵세포성 폴리펩타이드, 이들의 변이체 또는 유도체이다. 상기 POI는 임의의 진행세포성 또는 원핵세포성 단백질일 수 있다. POI의 예는 Schmidt, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2004), 65: 363-372 or in Kirk et al., Curr. Opin. Biotechnol. (2002), 13: 345-351에 기술되었다. Schmidt 의 표 1 및 2 및 Kirk et al.의 표 1에서 언급된 임의의 단백질은 본 발명에서 사용된 것과 같은 용어 “POI”에 포함된다. 상기 단백질은 자연적으로 분비되는 단백질 또는 세포 내 단백질, 예를 들어 자연적으로 분비되지 않는 단백질일 수 있다. 본 발명은 또한 단백질의 생물학적 활성 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, POI는 아미노산 사슬 또는 복합체, 예를 들어 이량체, 삼량체, 헤테로-이량체, 다합체 또는 저중합체 상태로 존재할 수 있다.
목적 단백질은 영양제, 음식물, 소화제, 보충물로서 사용되는 단백질, 예를 들어, 식품, 사료, 또는 화장품일 수 있다. 상기 식품은 예를 들어, 부용, 디저트, 시리얼 바, 과자, 스포츠 음료, 식품, 또는 다른 영양 제품일 수 있다. 바람직하게, 상기 목적 단백질은 식품 첨가제이다.
다른 구현예에서, 목적 단백질은 동물 사료로 사용될 수 있다. 상기 POI는 진균독소 분해 효소와 같이 해독 효소일 수 있다. 진균독소는 아플라톡신 데톡시자임(aflatoxin detoxizyme), 제아랄레논 에스터라아제(zearalenone esterases), 제아랄레논 락토나아제(zearalenone lactonases), 제아랄레논 하이드로라아제(zearalenone hydrolase), 퓨모니신 카르복실에스터라아제(fumonisin carboxylesterases), 퓨모니신 아미노트렌스퍼라아제(fumonisin aminotransferases), 아미노폴리올 아민 옥시다아제(aminopolyol amine oxidases), 데옥시니바레톨 에폭사이드 하이드로라아제(deoxynivalenol expoxide hydrolases)를 포함한다. 상기 POI는 또한 오크라톡신 유도체(ochratoxin derivatives) 또는 에르고트 알카로이드(ergot alkaloid)를 분해하는 효소일 수 있다. 이러한 화합물들은 인간 및 가축을 포함하는 살아있는 유기체에 유해하다. 이러한 효소의 예로는 오크라톡신 아미다아제, 에르고타민 하이드로라아제, 에르고타민 아밀라아제를 포함한다. 진균독소 분해 효소는 사료의 진균독소 오염을 조절할 수 있어 동물 사료에 유용하다.
POI의 추가적 예로는, 항균성 단백질, 예를 들어, 락토페린, 라이소자임, 락토페리신, 락토히드린, 카파-카제인, 헵토코린, 락토페록시다아제, 우유 단백질, 급성기 단백질, 예를 들어 감염 반응에 의해 가축으로부터 정상적으로 생산되는 단백질을 포함한다.
식품 첨가제로서 사용될 수 있는 효소의 예로는 피타아제, 사일라네이즈 및 베타-글루카나아제를 포함한다. “식품”은 인간에 의해 섭취, 흡수, 소화되기 적합한 어느 하나의 자연적 또는 인위적 음식, 식품, 또는 이와 유사한 물질 또는 식품의 성분을 의미한다.
식품 첨가제로서 사용될 수 있는 효소의 예로는 프로테아제, 리파아제, 락타아제, 펙틴 메틸 에스터라제, 펙티나아제, 트랜스굴라타미나제, 아밀라제, 베타-글루카나제, 아세토락테이트 데카르복실라제 및 락카제를 포함한다.
효소
POI는 효소일 수 있다. 바람직한 효소는 세제, 전분, 연료, 직물, 수지 및 종이, 퍼스널 케어 제품, 또는 제빵, 유기 합성 등 산업상 응용을 위해사용될 수 있다(Kirk et al., Current Opinion in Biotechnology (2002) 13:345-351 참조).
치료 단백질
POI는 치료 단백질일 수 있다. POI는 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 하기 구체적으로 기술한 바와 같이, 항체 또는 항체 단편, 또는 항체 유래 스캐폴드, 단일 도메인 항체 및 이들의 유도체가 아닌 다른 항체 유래 친화성 스캐폴드, 성장인자, 호르몬, 효소, 백신 등 생물 약제학상의 물질로서 적합한 단백질일 수 있다.
바람직하게, 목적 단백질은 포유류 폴리펩타이드 또는 보다 바람직하게 인간 폴리펩타이드이다. 임의의 폴리펩타이드, 단백질, 단백질 변이체, 융합 단백질 및/또는 이들의 단편을 나타내는 특히 바람직한 치료 단백질은 포유류에 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 치료 단백질은 세포에 대하여 이종인 것을 필요로 하지 않음이 예상될 수 있다. 본 발명의 세포에 의해 생산될 수 있는 단백질의 예로는 이에 제한되는 것은 아니나, 효소, 조절 단백질, 수용체, 펩타이드 호르몬, 성장인자, 사이토카인, 스캐폴드 결합 단백질(예를 들어, 안티칼린스), 구조 단백질, 림포카인, 부착 분자, 수용체, 및 아고니스트 또는 안타고니스트 역할을 할 수 있는 임의의 다른 폴리펩타이드이고, 및/또는 치료 또는 진단 용도를 갖는 단백질이다. 또한, 목적 단백질은 백신화, 백신, 항원-결합 단백질, 면역 자극 단백질로 사용하기 위한 항원일 수 있다.
이러한 치료 단백질은, 이에 제한되는 것은 아니나, 인슐린, 인슐린-유사 성장인자, hGH, tPA, 사이토카인, 예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18와 같은 인터류킨, 인터페론(IFN) 알파, IFN 베타, IFN 감마, IFN 오메가 또는 IFN 타우, 종양 괴사인자(TNF), TNF 알파 및 TNF 베타, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 단백질은 항체이다. 용어 "항체(antibody)"는 에피토프와 결합하고, 인식하는 특정 형태의 분자구조를 포함하는 어느 하나의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 것으로 의도되며, 하나 또는 그 이상의 비-공유 결합 상호작용은 상기 분자구조와 에피토프간 복합체를 안정화시킨다. 전형적인 항체 분자는 면역글로불린이고, 모든 유래, 예를 들어 인간, 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개, 다른 포유류들, 닭, 다른 조류 등 유래의 모든 형태의 면역 글로불린, 예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, IgY 등이 항체로 여겨질 수있다. 예를 들어, 항체 단편은 이에 제한되는 것은 아니나, Fv(VL 및 VH를 포함하는 분자), 단일-사슬 FV(sc FV)(펩타이드 링커로 연결된 VL 및 VH를 포함하는 분자), Fab, Fab', F(ab')2, 단일 도메인 항체(sdAb)(단일 가변 도메인 및 3 CDR을 포함하는 분자) 및 이들의 다가 항체일 수 있다. 상기 항체 또는 이들의 단편은 쥐의, 인간의, 인간화된 것이거나 키메릭 항체 또는 이들의 단편일 수 있다. 치료 단백질의 예는 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 항체 단편, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, di-scFvs, bi-scFvs, tandem scFvs, bispecific tandem scFvs, sdAb, nanobodies, VH, 및 VL, 또는 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, IgA 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgG 항체, IgM 항체, intrabody, diabody, tetrabody, minibody 또는 monobody를 포함한다.
치료 단백질의 추가적인 예로는 혈액 응고 인자(VII, VIII, IX), 푸사리움 유래 알칼라인 프로테아제, 칼시토닌, CD4 수용체 다베포이에틴, DNase(낭포성 섬유증), 에리트로포이에틴, 유트로핀(인간 성장 호르몬 유사체), 여포 자극 호르몬(폴리트로핀), 젤라틴, 글루카곤, 글루코세레브로시다제(고셔병), A. niger 유래 글루코스아밀라제, A. niger 유래 글루코스 옥시다제, 성선 자극 호르몬, 성장 인자(GCSF, GMCSF), 성장 호르몬(소마토트로핀), 간염 B 백신, 히루딘, 인간 항체 단편, 인간 아포지질단백질 AI, 인간 칼시토닌 전구체, 인간 콜라게나제 IV, 인간 표피 성장 인자, 인간 인슐린-유사 성장 인자, 인간 인터류킨 6, 인간 라미닌, 인간 프로-아포지질단백질 AI, 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린 및 뮤테인, 인슐린, 인터페론 알파 및 뮤테인, 인터페론 베타, 인터페론 감마(뮤테인), 인터류킨 2, 황체 호르몬, 모노클로날 항제 5T4, 마우스 콜라겐, OP-1(골신생, 신경보호 인자), 오프렐베킨(인터류킨 11-아고니스트), 재조합 플라스미노겐-활성자 G, 스테필로키나아제, 줄기세포 인자, 티타누스 독소 단편, 조직 플라스미노겐-활성자, 및 종양 괴사 인자(Schmidt, Appl Microbiol Biotechnol (2004) 65:363-372 참조)를 포함한다.
선도 서열
목적 단백질은 숙주세포로부터 상기 POI의 분비를 야기하는 선도 서열과 결합될 수 있다. 발현 벡터 내 이러한 분비 선도 서열의 존재는 재조합 발현 및 분비를 위한 목적 단백질이 자연적으로 분비되지 않고, 자연적 분비 선도 서열이 부족하거나, 자연적 분비 선도 서열이 없는 뉴클레오타이드 서열만 복제된 경우 필요로 한다. 일반적으로, 숙주세포로부터 상기 POI의 분비를 효과적으로 야기하는 임의의 분비 선도 서열이 본 발명에서 사용될 수 있다. 상기 분비 선도 서열은 효모 기원일 수 있으며, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지에의 MFa와 같은 알파-인자 또는 효모 포스파타아제일 수 있고, 포유류 또는 식물 또는 그 밖의 생물 유래일 수 있다. 적합한 분비 선도 서열의 선택은 당업자에게 명확하다. 선택적으로, 발현 벡터 내 뉴클레오타이드 서열 또는 발현 벡터 내 복제된 자연적 선도 서열을 포함하는 POI를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 복제되기 전, 상기 분비 선도 서열은 당업자에게 알려져 있는 전통적인 복제 기술에 의해, 재조합 발현을 위한 POI를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 내 융합되어 있을 수 있다. 이러한 경우, 발현 벡터 내 분비 선도 서열은 필요로 하지 않는다.
POI(들)를 코딩하는 재조합 뉴클레오타이드 서열(들)뿐만 아니라 보조 단백질을 코딩하는 단백질은 또한 세포당 단일 복제물 또는 복수의 복제물에서 자동적으로 복제하는 하나 또는 그 이상의 플라스미드에 제공될 수 있다.
선택적으로, POI를 코딩하는 재조합 뉴클레오타이드 서열 및 보조 단백질을 코딩하는 재조합 뉴클레오타이드 서열은 세포당 단일 복제물 또는 복수의 복제물에서 동일한 플라스미드로 존재한다.
보조 단백질의 저발현
본 발명자들은 또한 숙주세포로부터 POI 수율에 대해 부정적인 영향을 미치는 것으로 관찰된, 지질 저장에 관여하는 동정된 몇몇 보조 단백질(KO 보조 단백질)을 확인하였다. 숙주세포로부터 POI 수율에 대해 부정적인 영향을 미치는 이러한 보조 단백질은 바람직하게는 전사 인자가 아니다. 바람직한 것은 SEQ ID NO: 16 또는 17중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 보조 단백질이고, 보조 단백질의 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 또는 17 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 적어도 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 상동성을 갖는 SEQ ID NO: 16 또는 17 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 16 또는 17의 KO 보조 단백질을 코딩하는 유전자의 변형, 예를 들어 돌연변이 또는 결실은 POI의 수율을 증가시킬 수 있음을 밝혀냈다. 본 발명은 본 발명자에 의해 동정된 KO 보조 단백질을 저발현하도록 숙주세포를 조작함으로써 POI의 수율을 향상시키는데 유용한 방법 및 물질을 제공한다. 만일 이러한 보조 단백질이 숙주세포 내 존재하는 경우, 예를 들어 POI의 수율을 향상시키기 위해 예를 들어, 돌연변이화 또는 넉-아웃과 같이 변형될 수 있다. 이러한 KO 보조 단백질의 존재는 본 명세서에서 제공된 유전자 식별자 또는 뉴클레오타이드 서열의 관점에서 당업계에 알려진 임의의 방법으로 동정할 수 있다. 비-막 목적 단백질의 수율을 향상시키기 위해 숙주세포로부터 유리하게 부재하는 KO 보조 단백질은 상기 표 1에 나열되어 있다.
바람직하게, 숙주세포는 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 KO 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 저발현하도록 조작될 수 있고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이다. 예를 들어, 숙주세포는 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 저발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 숙주세포는 SEQ ID NO: 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 저발현하도록 조작될 수 있다.
바람직하게 KO1(SEQ ID NO: 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 보조 단백질) 및/또는 KO2(SEQ ID NO: 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 보조 단백질)이 저발현되는 경우, 모델 단백질 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab의 수율은, KO 단백질을 저발현하도록 조작하기 전의 숙주세포에 비해, 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 적어도 300%, 바람직하게는 적어도 10% 증가될 수 있다.
용어 “저발현하다”은 일반적으로 참고 표준에 나타난 발현 수준보다 그 발현 양이 적은 경우를 의미하며, 여기서 참고 표준은 KO 단백질을 저발현하도록 조작되기 전의 숙주세포이다. 본 발명에서 용어 “저발현하다”, “저발현하는”, “저발현된” 및 “저발현”은 숙주세포의 유전적 변형 전의 숙주세포 또는 정의된 조건에서 유전적으로 변형되지 않은 비교 가능한 숙주세포의 동일한 유전자 산물 또는 폴리펩타이드의 발현보다 낮은 수준을 갖는 경우를 의미한다. 예를 들어, KO 단백질은 참고 표준과 비교하여 적어도 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90%, 95%, 99 % 로 저발현되거나 전혀 발현되지 않을 수도 있다(100% 감소). 유전자 산물 또는 폴리펩타이드의 발현은 용어 "저발현"에 포함되지 않는다.
저발현은 하나 또는 그 이상의 KO1 및 KO2 또는 이들의 기능적 상동체의 기능적 발현을 방지하는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 이 결과 기능 또는 전체 기능을 발휘할 수 없게 된다. 저발현의 수단은 유전자 침묵(예를 들어, RNAi 유전자 안티센스),넉-아웃, 발현 수준 변경, 발현 패턴 변경, 유전자 서열 돌연변이, 서열 파괴, 삽입, 추가, 돌연변이, 발현 조절 서열의 변형 등을 포함할 수 있다.
바람직하게 저발현은 숙주세포 내 KO 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 넉-아웃함으로써 달성될 수 있다. 유전자는 전체 또는 일부 코딩 서열을 삭제함으로써 넉아웃시킬 수 있다. 유전자 넉아웃을 하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 Kuhn and Wurst (Eds.) Gene Knockout Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press (March 27, 2009)를 참조한다. 유전자는 또한 유전자 서열의 일부 또는 모두를 제거함으로써 넉아웃시킬 수 있다. 선택적으로, 유전자는 뉴클레오타이드 서열의 삽입, 예를 들어 저항 유전자의 삽입에 의해 넉-아웃시키거나 불활성화될 수 있다. 선택적으로, 유전자는 그것의 프로모터를 불활성화시킴으로써 넉-아웃시키거나 불활성화될 수 있다. 따라서, KO1 및 KO2의 저발현과 관련하여, 바람직한 숙주세포는 SEQ ID NO: 16 또는 17 또는 이들의 기능적 상동체를 발현하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것이며, 진균 숙주세포, 예를 들어 피키아 파스토리스, 한세눌라 폴리모르파, 트리코더마 레세이, 사카로마이세스 세레비지에, 클루이베로마이세스 락티스, 야로위아 리포리티카, 피키아 메타놀리카, 캔디다 보이디니이 및 코마가타엘라 및 스키조사카로마이세스 폼베와 같은 진균 숙주세포가 바람직하다. 보다 바람직한 것은 SEQ ID NO: 16 또는 17을 발현하는, 피키아 파스토리스 속 유래의 진균 숙주세포이다.
한 구체예에서, 저발현은 숙주세포에서 상기 KO 단백질을 코딩하는 유전자를 나타내는 폴리뉴클레오타이드를 파괴함으로써 달성된다.
"파괴(disruption)"는 파괴되기 전의 본래 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 추가, 결실, 치환되는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 변화이다.
"삽입(insertion)" 또는 "추가(addition)"는 파괴되기 전의 본래 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 추가되는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 변화이다.
"결실(deletion)"은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 각각 제거되는(예를 들어, 부재되는) 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 변화로 정의된다. 결실은 전체 서열의 결실, 일부 코딩 서열의 결실, 단일 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 결실을 포함한다.
"치환(substitution)"은 일반적으로 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기로의 대체를 나타낸다. "치환"은 예를 들어, 부위-특이적 돌연변이, 우발적 돌연변이의 생성, 겝프트 듀플렉스(gapped duplex) 접근법에 의해 수행될 수 있다(미국특허 번호 4,760,025; Moring et al., Biotech. (1984) 2:646 ; 및 Kramer et al., Nucleic Acids Res., (1984) 12:9441 참조).
바람직하게, 파괴는 틀 이동 돌연변이, 조기 종결 코돈, 임계 잔기의 점 돌연변이, 넌센스 또는 이 밖의 비-기능성 단백질 산물로의 번역을 초래한다.
다른 구현예에서, 저발현은 넉아웃되도록 상기 폴리펩타이드와 작동 가능하게 연결된 포로모터를 파괴함으로써 달성된다. 프로모터는 하위 유전자의 전사를 직접적으로 관여한다. 상기 프로모터는 필요적으로, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 시작 및 종결 서열, 번역 시작 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성자 서열과 같은 다른 발현 조절 서열과 함께 있을 수 있다. 따라서, 상기 발현 조절 서열 중 어느 하나를 파괴하는 것 또한 상기 폴리펩타이드의 발현 저해를 가능하게 한다.
다른 구현예에서, 저발현은 전사 후 유전자 억제(post-transcriptional gene silencing, PTGS)에 의해 달성된다. 상기 기술은 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 것이며, PTGS는 이종 RNA 서열, 빈번하게 유전자 파괴에 필요한 안티센스의 발현을 통해 유전자의 발현 수준을 저해시킨다(Lechtreck et al., J. Cell Sci (2002). 115:1511-1522; Smith et al., Nature (2000). 407:319-320; Furhmann et al., J. Cell Sci (2001). 114:3857-3863; Rohr et al., Plant J (2004). 40(4):611-21).
"저발현"은 유전자 발현을 낮추는 당업계에 알려진 임의의 기술로 달성될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드와 작동 가능하게 연결된 프로모터는 낮은 프로모터 활성을 갖는 또 다른 프로모터로 대체될 수 있다. 프로모터 활성은 그것의 전사 효율에 의해 평가될 수 있다. 상기 활성은 예를 들어, 노던 블롯팅, 정량적 PCR에 의해 프로모터로부터 mRNA 전사체의 양의 측정을 통해 직접적으로 확인할 수 있고, 또는 프로모터로부터 발현되는 유전자 산물의 양의 측정을 통해 간접적으로 확인할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 저발현은 KO 단백질이 기능성을 지닐 수 있는 적합한 접힘이 이루어지지 않도록, 발현되는 KO 단백질의 접힘을 방해함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 KO 단백질의 이황화 결합 형성을 제거하거나, 알파 나선 및 베타 병풍 구조의 형성을 파괴하도록 도입될 수 있다.
추가의 구현예에서, 보조 단백질 KO1 및/또는 KO2가 저발현된 숙주세포는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 보조 단백질을 과발현시킬 수 있다. 저발현 및 과발현된 보조 단백질의 구체적인 조합은 본 발명의 항목에 기술되어 있다.
용도
또한 본 발명은 목적 단백질을 생산하기 위한 조작된 숙주세포의 용도를 제공한다. 숙주세포는 하나 또는 그 이상의 POI(들)를 코딩하는 폴리펩타이드를 삽입하기 위해 유래하게 사용될 수 있고, POI를 발현하기에 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 이러한 용도의 상세한 내용은 본 발명의 방법과 관련된 부분에 기술되어 있다.
보조 단백질 및 POI를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 관련 유전자를 각각 하나의 벡터로 접함함으로써 숙주세포로 재조합될 수 있다. 유전자를 운반하는 단일 벡터, 또는 보조 단백질 유전자 및 또 다른 POI 유전자를 운반하는 두 개의 개별 벡터를 구축하는 것이 가능하다. 이러한 유전자이러한 벡터 또는 벡터들을 이용하여 숙주세포로 형질전환함으로써 숙주세포 유전체로 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, POI를 코딩하는 유전자는 유전체로 삽입되고, 보조 단백질을 코딩하는 유전자는 플라스미드 또는 벡터로 삽입된다. 일부 구현예에서, 보조 단백질을 코딩하는 유전자는 유전체로 삽입되고, POI를 코딩하는 유전자는 플라스미드 또는 벡터로 삽입된다. 일부 구현예에서, POI 및 보조 단백질을 코딩하는 유전자는 유전체로 삽입된다. 일부 구현예에서, POI 및 보조 단백질을 코딩하는 유전자는 플라스미드 또는 벡터로 삽입된다. 만일 POI를 코딩하는 다수의 유전자가 사용되는 경우, POI를 코딩하는 일부 유전자는 유전체로 삽입되는 반면, 다른 유전자는 동일하거나 상이한 플라스미드 또는 벡터로 삽입된다. 만일 보조 단백질을 코딩하는 다수의 유전자가 사용되는 경우, 보조 단백질을 코딩하는 일부 유전자는 유전체로 삽입되는 반면, 다른 유전자는 동일하거나 상이한 플라스미드 또는 벡터로 삽입된다. 더 많은 교시는 본 발명의 후술 부분에서 찾을 수 있다.
일반적으로 목적 단백질은 적합한 배지에서 숙주세포를 배양하고, 배양물로부터 발현된 POI를 분리하고, 발현된 산물에 대해 적합한 방법으로 정제 특히 세포로부터 POI를 분리함으로써 재조합 숙주세포를 사용하여 생산될 수 있다.
추가로 본 발명은 목적 단백질을 생산하기 위한 SEQ ID NO: 1 내지 15 및 18 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드의 용도를 제공한다.
방법
본 발명은 또한 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 과발현하는 단계를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는SEQ ID NO: 1 내지 15중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 보조 단백질을 코딩한다.
본 발명은 또한 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 SEQ ID NO: 16 및/또는 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 보조 단백질을 저발현하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는”은 과발현된 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제외하고는, 동일한 배양 조건 하에서 동일한 POI를 발현하는 동일한 세포에 비해, 목적 단백질의 수율이 증가되는 것을 의미한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 보조 단백질의 과발현은 POI의 생산 수율을 증가시키는 것으로 나타났다. 따라서, 증가되어야 하는 수준으로 POI를 발현하는 임의의 숙주세포에 대해, 보조 단백질이 숙주세포에 존재하지 않는 경우, 본 발명은 숙주세포 내 하나 또는 몇몇의 보조 단백질을 발현하거나, 보조 단백질을 코딩하는 유전자가 숙주세포에 이미 존재하는 경우, 세포 내 보조 단백질의 발현 수준을 추가로 증가시킴으로써 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 보조 단백질을 발현 또는 과발현하도록 숙주세포를 조작하고, (ii) 상기 목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 상기 숙주세포를 조작하며, (iii) 보조 단백질을 과발현하고 목적 단백질을 발현하기에 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하고, 선택적으로 (iv) 세포 배양물로부터 목적 단백질을 분리하는 것을 포함한다. (i) 및 (ii)에 인용된 단계는 인용된 순서로 수행될 필요는 없다는 것을 유의해야 한다. 먼저 (ii)에서 인용된 단계를 수행한 다음 (i) 를 수행할 수 있다. 단계 (i)에서, 숙주세포는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현하도록 조작될 수 있다.
본 발명은 또한 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 보조 단백질을 발현 또는 저발현하도록 숙주세포를 조작하고, (ii) 상기 목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 상기 숙주세포를 조작하며, (iii) 보조 단백질을 과발현하고 목적 단백질을 발현하기에 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하고, 선택적으로 (iv) 세포 배양물로부터 목적 단백질을 분리하는 것을 포함한다. (i) 및 (ii)에 인용된 단계는 인용된 순서로 수행될 필요는 없다는 것을 유의해야 한다. 먼저 (ii)에서 인용된 단계를 수행한 다음 (i) 를 수행할 수 있다. 단계 (i)에서, 숙주세포는 SEQ ID NO: 16 또는 17 로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 저발현하도록 조작될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 보조 단백질 및/또는 POI, 프로모터, 인핸서, 선도 서열 등을 조작하기 위해 사용되는 과정은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 예를 들어 J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)에 개시되어 있다.
과발현된 보조 단백질 또는 POI를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 같은 외부 또는 타겟 폴리뉴클레오타이드는 다양한 수단, 예를 들어 상동체 재조합 또는 삽입 부위에서 타겟 서열 특이적인 혼성 재조합 효소를 사용하여 염색체 내 삽입될 수 있다. 상기 기술된 외부 또는 타겟 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 벡터 내(“삽입 벡터”) 존재한다. 이러한 벡터들은 상동성 재조합에 이용되기 전에 전형적으로 원형 및 선형화되어 있다. 선택적으로, 외부 또는 타겟 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포로 재조합되는 fusion PCR에 의해 결합된 단편 또는 합성적으로 구축된 DNA 단편일 수 있다. 상동 재조합 부위(homology arms)에 더하여, 벡터는 또한 선별 또는 스크리닝을 위한 마커, 복제 개시점, 및 다른 엘리먼트들을 포함할 수 있다. 또한 우발적 또는 비-표적화된 삽입을 초래하는 이종 재조합을 이용하는 것도 가능하다. 이종 재조합은 현저하게 다른 서열을 지닌 DNA 분자간 재조합을 나타낸다. 재조합 방법은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 Boer et al., Appl Microbiol Biotechnol (2007) 77:513-523에 개시되어 있다. 또한, Principles of Gene Manipulation and Genomics by Primrose and Twyman (7th edition, Blackwell Publishing 2006)은 효모 세포의 유전자 조작에 대해 나타내고 있다.
과발현된 보조 단백질 및/또는 POI를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 발현 벡터 상에 존재할 수 있다. 이러한 벡터는 당업계에 알려져 있고, 이미 상술되어 있다. 발현 벡터에서, 프로모터는 이종의 단백질을 코딩하는 유전자의 상위에 위치하고, 유전자의 발현을 조절한다. 다중-복제 벡터는 특히 이의 다중 복제 부위로 인해 유용하다. 발현을 위하여, 프로모터는 일반적으로 다중 복제 부위의 상위에 위치한다. POI를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 삽입을 위한 벡터는 우선, 전체 POI를 코딩하는 전체 DNA 서열을 포함하는 DNA 컨스트럭트를 제조하고, 이후 상기 컨스트럭트를 적절한 발현 벡터에 삽입하거나, 개별 엘리먼트, 예를 들어 선도 서열, 표적 DNA 서열에 대한 유전 정보를 포함하는 DNA 단편을 삽입하고, 뒤이어 접합하여 구축될 수 있다. 선택적인 단편의 제한 또는 접합으로서, 부착 부위(att) 또는 효소에 기초한 재조합 기술이 벡터로 DNA 서열을 삽입하는데 이용될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 Landy (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913-949에 기술되어 있고; 당업자에게 알려져 있다.
본 발명에 따른 숙주세포는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터 또는 플라스미드를 세포 내 도입하여 수득될 수 있다. 진핵세포를 형질감염 또는 형질전환하거나, 원핵 세포를 형질전환하기 위한 기술은 당업계에 알려져 있다. 이러한 기술로는 지질 소포 매개 흡수, 열 충격 매개 흡수, 칼슘 포스페이트 매개 형질감염 (칼슘포스페이트/DNA 동시 발현), 변형된 바이러스, 예를 들어 변형된 아데노바이러스를 이용한 바이러스성 감염, 미세주사 및 전기 천공을 포함할 수 있다. 원핵세포의 형질전환을 위한 기술로는 열 충격 매개 흡수, 세균성 원생동물과 정상세포간 융합, 미세주사 및 전기 천공을 포함할 수 있다. 식물 형질전환을 위한 기술로는 아그로박테리움, 예를 들어 A. tumefaciens에 의한 매개 전환, 급속 추진형 텅스텐 또는 금 미세투사물, 및 전기 천공, 미세주사 및 폴리에틸렌 글리콜 매개 흡수를 포함한다. 상기 DNA는 단일 또는 이중 가닥일 수 있고, 선행 또는 원형, 느슨하거나 초나선형 DNA일 수 있다. 포유류 형질전환을 위한 다양한 기술로서, 예를 들어, Keown et al.(1990) Processes in Enzymology 185:527-537에 개시되어 있다.
본 발명은 또한 숙주세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 (i) SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현하도록 조작된 숙주세포를 제공하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 가지며, 여기서 상기 숙주세포는 목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 및 (ii) 보조 단백질 또는 이들의 기능적 상동체를 과발현하고 목적 단백질을 발현하기에 적합한 조건 하에서 숙주세포를 배양하고, 선택적으로 세포 배양물로부터 목적 단백질을 분리하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 숙주세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 (i) SEQ ID NO: 16 또는 17 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 보조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 저발현하도록 조작된 숙주세포를 제공하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 가지며, 여기서 상기 숙주세포는 목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 및 (ii) 목적 단백질을 발현하기에 적합한 조건 하에서 숙주세포를 배양하고, 선택적으로 목적 단백질을 분리하는 것을 포함한다. 바람직하게, 숙주세포는 SEQ ID NO: 16 또는 17 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하는 보조 단백질을 코딩하는 두 폴리뉴클레오타이드를 저발현하도록 조작된다.
본 발명에서 개시된 방법은 POI 및 보조 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 상기 재조합 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는 것으로 이해된다. 재조합되어 생산된 POI는 상기 세포 또는 세포 배지로부터 발현 시스템 및 발현 단백질의 특성, 예를 들어 신호 펩타이드에 융합되는 단백질인지의 여부, 및 수용성 또는 막 결합 단백질인지 여부에 따라 분리될 수 있다. 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 배양 조건은 숙주세포의 형태, 특히 적용되는 발현 벡터를 포함하는 요소에 따라 다양할 수 있다. 신호 펩타이드는 일반적으로 양 전하를 띄는 N-말단, 뒤이어 소수성 코어, 뒤이어 신호 펩티다아제로 알려져 있는 효소의 인식 부위를 포함한다. 상기 효소는 전좌 과정 동안 단백질로부터 신호 펩타이드를 절단한다. 상기 단백질은 소포체에서 골지체로 전달되고, 이후 단백질의 특성에 따라 수많은 분비 기작의 경로 중 하나에 따르게 된다. 예를 들어, 상기 단백질은 배양 배지에 분비될 수 있고, 상기 세포의 표면에 부착되어 있을 수 있다. 세포의 도메인, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인을 포함하는 수용체들은 세포막에 부착될 수 있는 단백질의 예시들이며, 세포 외 도메인만이 세포의 바깥 쪽에 위치한다. 어떤 분비 단백질의 선도 서열은 신호 단백질의 C-말단에 위치하고, 신호 단백질의 절개 이후, 성숙한 목적 단백질로부터 처리(가공)되는 펩타이드를 포함한다. 이러한 선도 서열은 종종 프리프로(prepro) 펩타이드로 나타내며, 프리 지역은 신호 서열이고, 프로 지역은 선도 서열의 남은 부위를 나타낸다.
하나의 예시로서, 효모 α-인자 선도 서열로서, 신호 펩티드 (C- 말단 신호 펩티다아제 인식 부위 AlaLeuAla를 포함), 뒤이어 KEX2 프로테아제 처리 부위를 구성하는 염기성 아미노산 쌍 LysArg를 포함하는 프로 지역, 뒤이어 프로 지역의 C 말단에 펩티드 GluAlaGluAla를 포함한다. 선도 서열의 처리는 KEX2 프로테아제의 Lys와 Arg 잔기 사이의 절단에 의한, 신호 펩티다아제의 신호 펩티드 제거를 포함한다. 상기 GluAlaGluAla 잔기는 뒤이어 STE13 유전자의 산물인 펩티다아제에 의해 제거된다 (Julius et al., Cell (1983) 32:839). 상기 효모 α-인자 선도 서열은 미국 특허 4,546,082에 기술되어 있다. 효모 세포에 의해 자연적으로 분비되는 단백질로부터 유래한 신호 펩티드는 효모에서 이종 단백질 생산을 위한 재조합 발현 시스템으로 이용되어 왔다. 효모 발현 시스템에서 포유류 신호 펩티드의 사용도 보고된 바 있으나, 어떤 포유류 신호 펩티드는 효모에서 이종 단백질의 분비를 촉진하는데 효과적이지 않다.
상기 표현 “목적하는 폴리펩타이드가 발현되기에 적합한 조건 하에서 배양하는 것”은 목적하는 화합물의 산물을 얻거나 목적하는 폴리펩타이드를 얻기에 적합하거나 충분한 조건(예를 들어, 온도, 압력, Ph, 유도, 성장률, 배지, 기간 등) 하에서 미생물을 유지 및/또는 성장하는 것을 의미한다.
보조 단백질 유전자(들), 및/또는 POI 유전자로 형질전환 또는 보조 단백질 유전자(들)의 저발현 및/또는 POI 유전자로 형질전환에 의해 얻을 수 있는 본 발명에 따른 숙주세포는 바람직하게 이종의 단백질을 발현하는 부담없이 대량의 세포 수로 효율적인 성장 조건 하에서 먼저 배양될 수 있다. 세포가 POI 발현을 위해 제조될 때, 적합한 배양 조건은 POI를 생산하기 위해 선택되고 최적화된다.
예로서, 보조 유전자(들) 및 POI(들)을 위해 상이한 프로모터 및/또는 복제물 및/또는 삽입 부위를 이용하여, 보조 유전자의 발현은 POI(들)의 발현과 관계된 시점 및 유도 수준의 관점에서 조절될 수 있다. 예를 들어, POI 발현의 유도 전에, 보조 단백질(들)은 먼저 발현될 수 있다. 보조 단백질은 POI 번역의 초기에, 존재하는 이점을 갖는다. 선택적으로 보조 단백질(들) 및 POI(들)은 동시에 삽입될 수 있다. 또 다른 실시예에서, POI 발현의 유도 전에, 보조 단백질(들)은 먼저 저발현될 수 있다. 보조 단백질은 POI 번역의 초기에 이미 부재하는 이점을 갖는다.
유도성 프로모터는 유도 자극이 가해지는 순간, 활성화되도록 사용될 수 있고, 상기 프로모터의 조절 하에서 유전자의 전사를 직접 관여할 수 있다. 유도 자극이 있는 성장 조건에서, 일반적으로, 상기 세포는 정상 조건에 비해, 보다 느리게 성장되고, 상기 배양물은 종전 단계에서 많은 수의 세포로 이미 성장되어 있으므로, 전체로서 배양 시스템은 많은 양의 이종 단백질을 생산한다. 유도 자극은 바람직하게 적적한 시료 (예를 들어, AOX-프로모터를 위한 메탄올)의 첨가 또는 적절한 영양성분(예를 들어, MET3-프로모터를 위한 메티오닌)의 제거이다. 또한, 열 또는 삼투압 증진용 시약뿐만 아니라 에탄올, 메틸아민, 카드뮴 또는 구리의 추가도 보조 유전자(들) 및 POI(들)에 작동 가능하게 연결된 프로모터에 의존하여 발현을 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 숙주세포는 바람직하게, 적어도 1g/L의 세포밀도, 바람직하게 적어도 10 g/L 세포 건조 중량, 보다 바람직하게 적어도 50 g/L 세포 건조 중량을 얻을 수 있는 최적화된 성장 조건 하의 바이오리액터에서 배양된다. 이는 생체 분자의 실험실 규모뿐만 아니라 파일럿 또는 산업 규모의 수율을 달성하는데 이점이 있다.
본 발명에 따르면, 보조 단백질의 과발현 및/또는 KO 단백질의 저발현에 기인하여, 바이오매스를 낮게 유지하더라도 높은 수율로 POI를 수득할 수 있다. 따라서, mg POI/g 건조 중량으로 측정된 높은 특정 수율은 실험실 규모에서 1 내지 200, 예를 들어 50 내지 200, 예를 들어 100 내지 200의 범위일 수 있고, 파일럿 및 산업 규모는 실현 가능하다. 본 발명에 따른 생산 균주의 특정 수율은 바람직하게, 보조 단백질의 과발현 및/또는 KO 단백질의 저발현이 없는 산물의 발현과 비교할 때, 적어도 1.1배, 보다 바람직하게 적어도 1.2배, 적어도 1.3배 또는 적어도 1.4배 증가를 제공하며, 일부 경우 2배 이상 증가할 수 있다.
본 발명에 따른 숙주세포는 표준화 시험, 예를 들어 ELISA, 활성 분석, HPLC, 표면 플라즈마 공명(Biacore), 웨스턴 블롯, 모세관 전기영동(Caliper) 또는 SDS-Page에 의해 숙주세포의 발현/분비 능력 또는 수율이 테스트될 수 있다.
바람직하게, 상기 세포는 적합한 탄소원을 포함하는 최소 배지에서 배양될 수 있고, 이에 따라 분리 과정이 현격하게 간소화된다. 예를 들어, 최소화 배지는 활용 가능한 탄소원(예를 들어, 포도당, 글리세롤, 에탄올 또는 메탄올), 대량 원소(칼륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 클로라이드, 설페이트, 포스페이트) 및 미량 원소(구리, 요오드, 망간, 몰디브덴산염, 콸트, 및 철염, 및 보론산)를 포함하는 염을 포함한다.
효모 세포의 경우, 세포는 하나 또는 그 이상의 상기 기술한 발현 벡터(들)로 형질전환될 수 있고, 이는 이배체 균주를 형성하며, 및 유도성 프로모터에 적합하게 변형된 전통적인 영양 배지에서 배양되고, 형질전환체를 선별하거나 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시킨다. 효모의 성장에 적합한 수많은 최소 배지는 당업계에 알려져 있다. 이러한 배지들 중 어느 하나는 염(예를 들어, 소듐 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 버퍼(예를 들어, HEPES, 시트릭산 및 포스페이트 버퍼), 뉴클레오사이드(예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항체, 미량 원소, 비타민, 및 포도당 또는 등가의 에너지원이 필수적으로 첨가될 수 있다. 이 밖의 필수적 첨가제는 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등 조건은 발현을 위해 선별된 숙주세포에서 종래 이용된 조건일 수 있고, 이는 당업자에게 알려져 있다. 다른 형태의 숙주세포에 대한 세포 배양 조건도 알려져 있고, 당업자에 의해 손쉽게 결정될 수 있다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지의 설명은, 예를 들어, American Society for Bacteriology (Washington D.C, USA, 1981)의 핸드북 "Manual of Methods for General Bacteriology"에 포함되어 있다.
세포는 액체 배지에서 배양(예를 들어, 유지 및/또는 성장)될 수 있고, 바람직하게 연속적 또는 간헐적으로, 전통적인 배양 방법, 예를 들어 정치 배양, 시험관 배양, 진탕 배양(예를 들어, 회전식 진탕 배양, 진탕 플라스크 배양 등), 환기 교반 배양, 발효일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 진탕 플라스크 또는 딥 웰 플레이트에서 배양될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포는 바이오리액터(예를 들어, 바이오리액터 배양 과정)에서 배양될 수 있다. 배양 과정은, 이에 제한되는 것은 아니나, 회분식 배양, 유가 배양, 및 연속적인 배양의 방법을 포함한다. 용어 “회분법” 및 “회분식 배양”은 배지, 영양, 보충 첨가제 등의 조성물이 배양 초기에 설정되어 있고, 배양 기간 동안 변경하지 않는 폐쇄적 시스템을 나타낸다; 그러나 이러한 배양은 배지의 과도한 산성화 및/또는 세포사멸을 막기 위해 Ph 및 산소와 같은 인자의 조절이 가능할 수도 있다. 용어 “유가법” 및 “유가 배양”은 배양 과정에서 첨가(예를 들어, 정기적 또는 연속적인 첨가)되는 하나 또는 그 이상의 기질 또는 보충제가 제외된 회분식 배양을 나타낸다. 용어 “연속법” 및 “연속적인 배양”은 바이오리액터에 정해진 배양 배지가 연속적으로 첨가되고, 목적하는 산물을 회수하기 위해, 사용된 동일한 양 또는 “조건화된” 배지가 즉시 제거되는 시스템을 나타낸다. 이러한 수많은 배양 기술들은 발전해오고 있으며, 당업계에 널리 알려져 있다.
일부 구현예에서, 세포는 약 12 내지 24시간 동안 배양되고, 다른 구현예에서, 세포는 약 24 내지 36시간, 약 36 내지 48시간, 약 48 내지 72시간, 약 72 내지 96시간, 약 96 시간 내지 120시간, 약 120 내지 144 시간, 또는 144시간 이상의 기간 동안 배양된다. 다른 구현예에서, 배양은 목적하는 POI의 생산 수율에 이를 때까지 충분한 기간동안 이어진다.
상기 언급한 방법은 추가로 발현된 POI를 분리하는 단계를 포함한다. 만일, POI가 세포로부터 분비되면, 최신의 기술을 이용하여 배양 배지로부터 분리되고 정제될 수 있다. 세포로부터 POI의 분비는 일반적으로, 세포가 파괴되고 세포내 단백질이 분비되어 생성된 결과물인, 단백질의 복합체 혼합물보다는, 배양물의 상청액으로부터 이들의 산물을 회수하는 것이 보다 바람직하다. 프로테아제 억제제, 예를 들어 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF)는 정제 과정에서 단백질 분해성 퇴화를 억제하고, 항생제는 우발적인 오염물의 성장을 막기 위하여 포함될 수 있다. 상기 조성물은 당업계의 방법에 의해 농축, 여과, 투석될 수 있다. 선택적으로, 배양된 숙주세포는 세포 추출물에 포함된 목적 단백질을 수득하기 위하여, 초음파적으로, 기계적으로, 효소적으로, 또는 화학적으로 파쇄될 수 있고, 상기 목적 단백질은 분리 및 정제될 수 있다.
POI를 얻기 위한 분리 및 정제 방법은 염석 및 용매 침전과 같은 용해도 차이를 이용하는 방법, 한외 여과기 및 겔 전기영동과 같은 분자량 차이를 이용하는 방법, 이온-교환 크로마토그래피와 같은 전하 차이를 이용하는 방법, 친화도 크로마토그래피와 같은 특정 친화도를 이용하는 방법, 가역상 고성능 액상 크로마토그래피와 같이 소수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 전기영동과 같이 등전점의 차이를 이용한 방법에 기초할 수 있다. 특정 정제 단계는 바람직하게, 함께 발현되어 POI 제조물을 오염시킬 수 있는 보조 단백질을 제거하기 위해 실시된다.
분리되고 정제된 POI는 웨스턴 블롯팅 또는 POI 활성을 위한 특정 분석과 같은 전통적인 방법에 의해 동정될 수 있다. 정제된 POI의 구조는 아미노산 분석, 아미노-종결 펩타이드 시퀀싱, 일차 구조 분석, 예를 들어 질량 분석 등에 의해 확인할 수 있다. POI는 약학 조성물 또는 사료 또는 식품 첨가제에서 활성 성분으로서 사용하는데 필요한 요건을 충족시킬 수 있도록 대량 및 높은 정제율로 수득되는 것이 바람직하다.
실시예
다음의 실시예는 당업계의 일반적인 기술자에게 본 발명의 제조와 사용하는 방법을 완전히 개시 및 기술하고자 제공하는 것으로서, 이로써 본 발명 및 청구항 기재의 범위를 한정하기 위한 의도는 아니다. 상용되는 수치(예를 들어, 함량, 온도, 농도 등)에 대한 정확성을 확보하고자 노력하였으나, 몇몇 실험적 오차 및 변수는 허용되어야 한다. 달리 명시하지 않으면, 부분은 중량에 대한 부분, 분자량은 평균 분자량, 온도는 섭씨 온도; 및 압력은 대기 또는 대기 부근의 압력이다.
이하 실시예는 지질 생합성에 관여하는 새로이 동정된 단백질 각각이 이들의 과- 각각 저발현에 따라 POI의 농도(mg/L 부피 당 산물) 및 수율(mg/g 바이오매스 당 산물, 바이오매스는 세포 건조 중량 또는 세포 습윤 중량)이 증가됨을 입증하고자 하였다. 실시예와 같이, 피키아 파스토리스 효모에서 재조합 항체 Fab 단편과 재조합 효소의 수율은 증가된다. 진탕 배양(진탕 플라스크 또는 딥 웰 플레이트에서 수행됨) 및 실험 규모가 유가 배양에서 긍정적인 효과를 보여주었다.
실시예 1: P. pastoris 균주의 발생
a) 항체 Fab 단편 HyHEL을 분비하는 P. pastoris 의 구축
P. pastoris CBS7435 (유전체는 CBS Kuberl et al. 2011에 의해 시퀀싱됨) mutS (CBS-KNAW Fungal Biodiversity Center, Uetrecht, The Netherlands로부터 얻음) 변이체가 숙주 균주로 사용되었다. pPM2d_pGAP 및 pPM2d_ pAOX 발현 벡터는 WO2008/128701A2에 개시된 pPuzzle_ZeoR 벡터 백본의 파생물로서, pUC19 세균성 복제 개시점 및 Zeocin 항생제 저항성 카세트로 이루어진다. 이종의 유전자의 발현은 P. pastoris 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소화 효소(GAP) 프로모터 또는 알코올 산화효소(AOX) 프로모터, 각각, 및 S. cerevisiae CYC1 전사 종결 인자에 의해 매개된다. 항체 Fab 단편 HyHEL의 경쇄(LC)(SEQ ID NO: 44) 및 중쇄(HC)(SEQ ID NO: 43)는(도 2) 벡터 DNA 주형(N-말단 S. cerevisiae 알파 결합 인자 신호 선도 서열과 목적 유전자를 전달)으로부터 표 3의 HyHEL-HC 및 HyHEL-LC에 대한 프라이머를 이용하여 증폭되었고, 이들 각각은 SbfI 및 SfiI으로 절단된 벡터 pPM2d_pGAP 및 pPM2d_Paox 모두에 연결되었다. 상기 LC 단편은 pPM2d_pGAP 및 pPM2d_pAOX의 변이체에 연결되었고, 여기에서 이후 선형화를 가능하게 하기 위해, 상기 프로모터 부위 내 하나의 제한효소 부위가 교체되었으며(pPM2d_pGAP에서 AvrII 대신 NdeI, pPM2d_pAOX에서 Bpu1102I 대신 Bsu36I), 상기 HC 단편은 벡터의 변형되지 않은 형태에 연결되었다. 경쇄 및 중쇄의 서열을 검증한 후, 두 사슬의 발현 카세트는 양립할 수 있는 제한 효소 MreI 및 AgeI를 사용함으로써 하나의 벡터 상에서 조합되었다.
전기천공법으로 P. pastoris에 삽입하기 전(Gasser et al. 2013. Future Microbiol. 8(2):191-208에 기재된 표준 형질전환 프로토콜을 사용하여), 플라스미드는 제한 효소(pPM2d_pGAP에 대한) 또는 Bsu36I 제한 효소(pPM2d_pAOX에 대한)를 사용하여 각각 선형화되었다. 양성 형질전환체의 선별은 50 μg/mL의 Zeocin를 함유하는 YPD 플레이트(리터당: 10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 포도당, 20 g agar-agar)에서 수행되었다. 콜로니 PCR은 변형된 플라스미드의 존재를 확인하기 위해 사용되었다. 따라서, 각각 5분간 P. pastoris 콜로니를 가열 및 동결하고, 적절한 프라이머로 PCR을 실시하여 유전자 DNA를 수득하였다. 상기 결과로 초래된 균주는 각각 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab 또는 CBS7435 mutS pGAP HyHEL-Fab로 명명되었다.
b) 항체 Fab 단편 SDZ를 분비하는 P. pastoris의 구축
항체 Fab 단편 SDZ의 경쇄(LC) 및 중쇄(HC)는(도 2)는 벡터 DNA 주형 (N-말단 알파 결합 인자 신호 선도 서열과 목적 유전자를 전달)으로부터 표 3의 SDZ-HC 및 SDZ-LC에 대한 프라이머를 이용하여 증폭되었고, 이들 각각은 SbfI 및 SfiI으로 절단되고 Bsu36I 제한 효소 부위를 갖는 벡터 pPM2d_pAOX 또는 pPM2d_pAOX의 변이체에 각각 연결되었다. 경쇄 및 중쇄의 서열을 검증한 후, 두 사슬의 발현 카세트는 양립할 수 있는 제한 효소 MreI 및 AgeI을 사용함으로써 하나 벡터 상에서 조합되었다.
전기천공법으로 P. pastoris에 삽입하기 전(Gasser et al. 2013. Future Microbiol. 8(2):191-208)에 기재된 표준 형질전환 프로토콜을 사용하여, 플라스미드는 Bsu36I 제한 효소를 사용하여 선형화되었다. 양성 형질전환체의 선별은 50 μg/mL의 Zeocin를 함유하는 YPD 플레이트(리터당: 10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 포도당, 20 g agar-agar)에서 수행되었다. 콜로니 PCR은 변형된 플라스미드의 존재를 확인하기 위해 사용되었다. 따라서, 각각 5분간 P. pastoris 콜로니를 가열 및 동결하고, 적절한 프라이머로 PCR을 실시하여 유전자 DNA를 수득하였다. 상기 결과로 초래된 균주는 각각 CBS7435 mutS pAOX SDZ-Fab 또는 CBS7435 mutS pGAP SDZ-Fab 로 명명되었다.
표 2는 HyHEL LC 및 HC 뿐만 아니라 SDZ LC 및 HC의 PCR 증폭을 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 나타낸다(알파-결합 인자_정방향(Alpha-mating factor_ forward)은 Fab 사슬 전체의 증폭을 위한 정방향 프라이머이다).
[표 2]
Figure pct00002
실시예 2: 조작된 P. pastoris 균주의 평가
메탄올자화 효소 P. pastoris는 생산/분비 능력에서 과잉을 제공하는 매니폴드(manifold)를 이미 적용하고 있는 목적 단백질(POI)을 포함하는 이종 또는 재조합 단백질의 과발현 및 생산을 위해 널리 인정된 균주이다. 이러한 숙주 균주 조작 전략은 예를 들어 샤페론 또는 단백질 접힘 기작의 다른 성분과 같은 도움 단백질의 과발현을 포함한다(Zhang et al., Biotechnol Prog. (2006). 22(4):1090-1095). 재조합 단백질 생산/분비를 관리하는 P. pastoris의 개선을 위한 목적의 대부분의 적용은 더 넓은 맥락에서 P. pastoris의 세포 생물학을 고려하지 않았다.
생명공학 관련 적용 분야에서의 빈번한 활용에도 불구하고, 예를 들어 P. pastoris 에 대한 막 특성 및 특징과 같은 세포의 생물학적 정보의 양은 적다. 따라서, 본 발명에서 정의된 지질 대사에 관여하는 단백질, 예를 들어 지방산 연장을 포함하는 스핑고지질 생합성, 인지질 생합성, 지질 수송, 에르고스테롤 생합성, 또는 지질 저장에 관여하는 단백질의 단독 또는 재조합 또는 이종의 단백질 생산/분비에 대한 조합의 과- 또는 저발현의 효과가 조사되었다. 이러한 목적 단백질에 대한 모델 단백질로서, 2 종의 상이한 Fab 단백질이 사용되었다. 추가로, 지질 대사에 관여하는 단백질과 조합된 샤페론의 과발현이 조사되었다.
실시예 3: 타겟 유전자를 과발현하는 균주의 제조
Fab 분비에 대한 긍정적인 효과를 조사하기 위해, 지질 대사에 관여하는 다양한 단백질(본 발명의 표 1 참조)은 다른 두 Fab 생산 균주: CBS7435 pPM2d_pAOX HyHEL 및 CBS7435 pPM2d_pAOX SDZ(제조는 실시예 1 참조)에서 단독 또는 조합, 또는 샤페론과 조합되어 과발현된다.
a) pPM2aK21 발현 벡터로의 지질 대사 또는 샤페론 유전자의 증폭 및 복제
단독(표 3; 실시예 4a 내지 4c의 결과 참조) 및 조합(실시예 6a의 표 3 결과)되어 과발현된 유전자는 개시 코돈(모사(authentic) Kozak 서열의 초기 3 또는 4개 뉴클레오타이드 포함)에서 종결 코돈 방향으로 표 3 및 5로 표시된 프라이머를 사용하여 PCR(Phusion Polymerase, ThermoFisher Scientific)에 의해 증폭되었다. 서열 검색에서 원하는 유전자를 검색할 수 없는 코딩 서열에 상응하는 것을 제외하고, P. pastoris 균주 CBS7435 mutS의 DNA 유전체를 주형으로 하였다. 이 경우, LIP1 또는 TSC3에 대해 보다 정확하게, S. cerevisiae 암호화된 서열은 표 3에 표시된 프라이머를 사용하여 S. cerevisiae BY4741의 유전체 DNA로부터 증폭되었다. 서열은 두 가지 제한 효소 SbfI 및 SfiI를 갖는 pPM2aK21 발현 벡터의 MCS로 클로닝되었다. pPM2aK21는 pPM2d의 파생물이며, AOX 종결 서열(실시예 1a에 기술됨), E. coli (pUC19)의 복제 개시점, E. coli 및 효모 선별용 항생제 내성 카세트(카나마이신 및 G418에 내성을 부여하는), GAP 프로모터를 포함하고 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 샤페론을 단백질을 코딩하는 목적 유전자(GOI)를 위한 발현 카세트, 다중 클로닝 부위(MCS) 및 S. cerevisiae CYC1 전사 종결 인자로 이루어진다. 유전자 서열은 Sanger 시퀀싱에 의해 검증되었다.
표 3. Pichia pastoris 서열의 유전자 식별자를 Sturmberger et al. [J. Biotechnol. (2016). 235(4):121-131)]에서 검색하였고, Saccharomyces cerevisiae 서열의 유전자 식별자를 Cherry J.M. et al. [Nucleic Acids Res. (2012) 40 (Database issue)]에서 검색하였다.
[표 3]
Figure pct00003
§ MHG1의 DNA-서열은 두 개의 절단된 변이체(t1, t2)로서 사용된 전장 서열 옆에 두었고, 상기 변이체는 막 고정 도메인이 고갈된 것, 즉 변이체 t1HMG1 의 초기 1449 뉴클레오타이드 또는 t2HMG1의 경우 1543 뉴클레오타이드가 고갈된 것이다(이들의 개시 ATG-코돈 제외).
b) Fab 생산 균주에서 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 샤페론을 코딩하는 적어도 2 종의 유전자의 과발현
P. pastoris Fab 과생산 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab 및 CBS7435 mutS pAOX SDZ-Fab는 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 샤페론을 코딩하는 2, 3, 또는 4개의 유전자의 과발현을 위한 숙주 균주로서 사용되었다(실시예 3a 참조). Fab 생산 균주로의 형질전환 전(Gasser et al. 2013. Future Microbiol. 8(2):191-208에 개시된 표준 형질전환 프로토콜을 사용하여), 표 3으로부터 선택된 유전자를 포함하는 pPM2aK21 벡터는 제한 효소 AscI를 갖는 AOX 종결 서열에서 선형화되었다. 양성 형질전환체는 G418 및 Zeocin를 함유하는 YPD 아가 플레이트에서 선별되었다.
실시예 4: Fab 발현에 대한 스크리닝
소 규모 스크리닝에 있어서, 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 하나의 유전자(표 1 및 3 참조)를 과발현하는 각각의 8 내지 12개의 형질전환체를 P. pastoris Fab 생산 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab에서 실험하였다. 형질전환체는 선형화된 빈 벡터(pPM2aK21)와 함께 형질전환된 모 숙주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab와 비교하여 평가되었고, 세포 성장, Fab 농도 및 Fab 수율의 효과에 기초하여 이들의 순위를 매겼다.
지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자의 선별은 추가의 숙주 균주, CBS7435 mutS pAOX SDZ-Fab의 배경에서 재-평가되었다. 다시 말하면, 8 내지 12개의 형질전환체를 선형화된 빈 벡터(pPM2aK21)와 형질전환된 모 숙주 CBS7435 mutS pAOX SDZ-Fab와 비교하여 실험하였다.
a) 피키아 파스토리스 Fab 생산 균주의 소 규모 배양
10 g/L 글리세롤 및 50 μg/mL Zeocin을 포함하는 2mL YP-배지 (10g/L 효모 추출물, 20g/L 펩톤)에 P. pastoris 균주의 단일 콜로니를 접종하였고, 25℃에서 밤새도록 성장시켰다. 이러한 배양물의 부분 표본 (2.0의 최종 OD600에 상응)을 20 g/L 포도당 및 포도당 정제 (Kuhner, Switzerland; CAT# SMFB63319)를 포함하는 2mL의 합성 스크리닝 배지 M2 (배지 조성물은 하기에 기재)로 옮기고, 24 딥웰 플레이트 내 280 rpm, 25℃에서, 25 시간 동안 배양하였다. 상기 배양물은 원심분리로 한번 세척하였고, 이후 펠릿은 합성 스크리닝 배지 M2에서 재현탁되었으며, 부분 표본 (4.0의 최종 OD600에 상응)은 새로운 24 딥웰 플레이트 내 2mL의 합성 스크리닝 배지 M2로 옮겨졌다. 실온, 2500xg에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수득하고 분석을 실시하기 전, 메탄올 (5g/L)을 48시간 동안 12시간 마다 반복적으로 첨가하였다. 바이오매스는 1mL 세포 부유액 당 세포 중량을 측정하여 확인되었고, 상청액 내 재조합 분비 단백질의 확인은 하기 실시예 4b-4c에 기술하였다.
리터당 다음을 함유하는 합성 스크리닝 배지 M2: 22.0 g Citric acid monohydrate 3.15 g (NH4)2PO4, 0.49 g MgSO4*7H2O, 0.80 g KCl, 0.0268 g CaCl2*2H2O, 1.47 mL PTM1 미량 금속, 4 mg Biotin; pH는KOH(고체)를 사용하여 5로 조정하였다.
b) SDS-PAGE & 웨스턴 블롯 분석
단백질 젤 분석을 위해, 12.5% 분리 젤(Tris-based discontinuous buffer system) 및 Tris-Glycin 러닝 버퍼를 사용한 Bio-Rad Mini-Protean Tetra Cell system이 사용되었다. 전기영동 후, 상기 단백질은 콜로이드성 쿠마시 염색에 의해 시각화되거나 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로스 막으로 옮겨졌다. 따라서, 상기 단백질은 제조사의 지침에 따라 Mini Trans-Blot® Cell for wet (tank) transfer (Bio-Rad)을 사용하여 니트로셀룰로스 막에 일렉트로블롯팅시켰다. 차단시킨 후, 웨스턴 블롯은 다음의 항체에 의해 검출되었다: Fab 경쇄: 항-인간 카파 경쇄(결합 또는 비결합) - 과산화효소(HRP) 결합된 항체, Sigma A7164 (1:5,000); Fab 중쇄: 1:1,000으로 희석된 마우스 항-인간 IgG 항체 (Ab7497, Abcam) 및 항-마우스 IgG(전체 분자)-1:5,000으로 희석된 과산화효소 결합된 이차 항체로서, 염소로부터 생산된 항체(A4416, Sigma).
HRP-결합체는 chemoluminescent Super Signal West Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific)에 의해 검출되었다.
c) ELISA에 의한 Fab의 정량화
ELISA에 의한 순수 Fab의 정량화는, 코팅 항체로서 항-인간 IgG 항체(ab7497, Abcam)와 검출 항체로서 염소 항-인간 IgG(Fab 특이적) - 과산화효소 결합된 항체(Sigma A0293)를 사용하여 실시하였다. 인간 Fab/카파, IgG 단편(Bethyl P80-115)은 최초 농도 100 ng/mL를 표준으로 사용되었고, 상청액 샘플은 이에 따라 희석되었다. TMB (biomol E102)는 검출을 위한 기질로서 사용되었다. 코팅-, 희석- 및 세척 버퍼는 PBS (2 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4.2 H2O, 2.7 mM g KCl, 8 mM NaCl, pH 7.4)에 기초하였고, 이에 따라 BSA(1% (w/v)) 및/또는 Tween20 (0.1% (v/v))가 추가되었다.
표 4는 표 5에 나타낸 바와 같이 유전자를 과발현하는 조작된 균주의 ELISA에 의해 측정된 모델 POI HyHEL-Fab에 대한 농도 및 수율의 배수 변화(FC) 수준을 나타낸다. 상기 값은 빈 삽입 벡터를 과발현하는 모균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab와 비교하여 상대적인 수로 나타내었다. 조사된 클론의 수는 괄호로 나타내었다(n, 테스트된 클론의 수). Pichia pastoris 서열의 유전자 식별자는 Sturmberger et al. [J. Biotechnol. (2016). 235(4):121-131)]로부터 찾을 수 있고, Saccharomyces cerevisiae 서열의 유전자 식별자는 Cherry J.M. et al. [Nucleic Acids Res. (2012) 40(Database issue D700-D705)]에서 찾을 수 있다.
[001] 표 4
Figure pct00004
§ MHG1의 DNA-서열은 두 개의 절단된 변이체(t1, t2)로서 사용된 전장 서열 옆에 두었고, 상기 변이체는 막 고정 도메인이 고갈된 것, 즉 변이체 t1HMG1 의 초기 1449 뉴클레오타이드 또는 t2HMG1의 경우 1543 뉴클레오타이드가 고갈된 것이다(이들의 개시 ATG-코돈 제외).
상기 표 4에 따른 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현하는 조작된 균주에 의해 생산/분비된 HyHEL-Fab 의 수율은 표 4에 표시된 바와 같이 적어도 20% 증가되었다. ELO3 (PP7435_chr3-0987)는 또한 1.3의 농도 FC 및 1.4의 수율 FC를 갖는 CBS7435 mutS pAOX SDZ-Fab에서 과발현된다.
실시예 5: 선택된 유전자를 저발현하는 균주의 제조
P. pastoris POI 생산 균주는 지질 저장에 관여하는 유전자와 같은 지질 생합성 경로 유전자를 포함하는 유전자의 넉-아웃을 포함하도록 조작되었다. 선택된 것은 트리아실글리세롤 합성 효소를 코딩하는 2개의 유전자였다: dga1 (PP7435_Chr3-1009 (Table 1) 및 lro1 (PP7435_Chr2-0587 표 1)).
P. pastoris Fab를 과생산하는 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab는 숙주 균주로서 사용되었다. 스플릿 마커 카세트는 Heiss et al. (2013) [Appl Microbiol Biotechnol. 97(3):1241-9.]에 개시된 것과 같이 파괴된 유전자 자리로 형질전환체를 생성하기 위해 사용되었다. 양성 넉-아웃 균주의 검증은 G418에서 성장할 수 있는 형질전환체의 유전체 DNA와 파괴 카세트의 외부 프라이머를 사용하여 PCR로 확인하였다.
표 5는 넉-아웃 카세트의 구축을 위해 사용된 모든 프라이머를 목록화하였다(넉-아웃 타겟마다 2 중복 스플릿 마커 카세트): 프라이머 쌍 A_forward/A_backward, B_forward/B_backward, C_forward/C_backward, D_forward/ D_backward는 PCR(Phusion Polymerase, Thermo Scientific)로 단편 A, B, C 및 D를 증폭하기 위해 사용되었다. 단편 A는 유전체 P. pastoris DNA로부터 증폭된 것으로서, 각 ATG (타겟 유전자의)의 5' 방향으로 1000 bp에서 시작하여, ATG의 5' 방향으로 대략 200 bp까지이다. 단편 D는 유전체 P. pastoris DNA로부터 증폭된 것으로서, 각 ATG(타겟 유전자의)의 3' 방향으로 200 bp에서 시작하여, ATG의 3' 방향으로 1000 bp까지이다. 단편 B는 KanMX 선별 마커 카세트의 앞 2/3로 이루어지고, pPM2aK21 벡터 DNA 주형으로부터 증폭된다. 단편 B는 KanMX 선별 마커 카세트의 뒤 2/3으로 이루어지고, pPM2aK21 벡터 DNA 주형으로부터 증폭된다. 단편 A 및 B는 프라이머 A_forward 및 B_backward를 사용하여 오버랩 PCR에 의해 함께 어닐링된다(AB). 단편 C 및 D는 프라이머 C_forward 및 D_backward를 사용하여 오버랩 PCR에 의해 함께 어닐링된다(CD). 넉-아웃 균주를 제조하기 위해, Fab 생산 숙주균주는 단편 AB 및 CD의 전체 1 μg DNA로 형질전환되었고, 또한 모두 중첩되었다. 500 μg/mL G418를 함유하는 YPD 아가 플레이트에서 세포를 선별하였다. 양성 넉-아웃 복제물은 프라이머 쌍 check_forward(선별 마커 카세트에 결합) 및 check_backward(프라이머 서열 D_backward은 3' 부위 부근에 결합)를 사용하여 PCR에 의해 검증되었다. 400 bp(ATG 부근)이 KanMX 카세트로 교체됨에 따라, 적절한 크기의 PCR 산물 밴드는 예상되는 위치에서 선별 마커 카세트의 삽입으로 확인하였다.
표 5
Figure pct00005
실시예 6: 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자의 조합(과- 및 저발현)
지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현의 조합을 위해, ELO3 (PP7435_Chr3-0987)를 과발현하는 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab 균주 또는 PRY1 (PP7435_Chr3-1160)를 과발현하는 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab균주 또는 HMG1 (PP7435_Chr2-0242)를 과발현하는 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab균주, 이들 모두를 항시적 pGAP 프로모터의 조절 하에서(실시예 3a 및 b에 기술된 것과 같이 생성된) 기원 균주로서 사용하였다. 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자의 저발현의 조합을 위해, 유전자 자리 DGA1 (Δdga1, PP7435_Chr3-1009; 실시예 5에 기술됨)에서 파괴를 갖는 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab 균주를 기원 균주로 사용하였다. 이러한 모든 균주에서, 모델 단백질 (POI) HyHEL-Fab를 코딩하는 플라스미드는 선택 마커로 Zeocin에 기초하지만, 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 유전자 자리의 파괴를 위해 사용된 카세트를 코딩하는 임의의 추가 유전자의 과발현을 위한 플라스미드는 동방향(co-directional) loxP 인식 부위의 측면에 있는 KanMX 저항 카세트를 운반하였다.
지질 대사에 관여하는 단백질 또는 샤페론 또는 지질 생합성에 관여하는 추가의 단백질을 코딩하는 유전자 위치의 파괴를 위해 사용되는 카세트를 코딩하는 적어도 하나의 추가 유전자로 형질전환하기 전에, 마커 유전자 발현 카세트(KanMX - flanked by loxP sites)는 Cre 재조합효소에 의해 재순환되었다. 따라서, 마커 레스큐(rescue)를 위해 선택된 균주를 에피좀 pTAC_Cre_HphMX4 플라스미드로 형질전환하였고, 이는 S. cerevisiae TPI 프로모터의 조절 하에서 Cre 재조합 효소를 발현하며, 배양 배지에서 하이그로마이신(Hyg)에 의한 선택 압력이 존재하는 한 P. pastoris에서 일시적으로 유지된다. 형질전환체는 YPD/Zeo/Hyg 아가 플레이트 상에서 28℃, 2일 동안 성장되었고, 선택적 아가 플레이트에서 성장을 위해 28℃, 추가 2일동안 반복 평판 배양(replica-plated)되었다. 24개의 딥 웰 플레이트(DWP) 스크리닝을 위해 2-3 플레이팅 라운드 후 G418 및 Hyg에서 성장할 수 없는 클론만이 선택되었다(실시예 4a에 기술됨). Fab 농도 및 수율은 실시예 4c에 기술된 바와 같이 측정되었다. 이후, Fab 수율 및/또는 농도 측면에서 최고의 균주는 지질 생합성에 관여하는 단백질을 코딩하는 추가의 유전자를 과발현하는 또 다른 플라스미드로 형질전환되거나(실시예 3a 및 b에 기술됨), 중첩하는 스플릿 마커 넉-아웃 카세트의 새로운 세트로 형질전환되었다(실시예 5에 기술됨). 8 내지 16 형질전환체(지질 생합성에 관여하는 2 가지의 조합된 단백질을 갖거나, 지질 생합성에 관여하는 단백질이 넉-아웃된)는 선택적인 아가 플레이트(Zeo 및 G418을 포함)에서 선택되고, 실시예 4에서 기술한 바와 같이 Fab 분비에 대해 스크리닝하였다. 추가의 조합 단계를 위해, 앞서 기술한 단계를 반복하고, 따라서 세 가지 조합 등을 갖는 균주를 수득하였다. 모든 스크리닝 실험에서, 모 균주(빈 벡터를 갖거나 갖지 않는 과생산하는 숙주세포)가 기준으로서 사용되었다.
a) 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 조합의 과발현에 대한 결과
과생산하는 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab의 배경에서, 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 적어도 두 가지 유전자의 과발현의 조합은 지방산 연장 경로를 포함하는 스핑고지질 생합성의 효소 성분이 조합으로 과발현될 때, 지방산 연장 경로를 포함하는 스핑고지질 생합성의 효소 성분이 지질 수송 경로의 성분과 조합되거나 샤페론과 조합되어 과발현될 때, 지질 수송 경로의 효소 성분이 인지질 생합성 경로의 성분과 조합되어 과발현될 때, 또는 에르고스테롤 생합성 경로의 효소 성분이 샤페론과 조합되어 과발현될 때 Fab 수율 및/또는 농도의 측면에서 뚜렷한 개선을 나타냈다.
그 결과를 표 6에 표시하였다.
표 6은 P. pastoris에서 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현되는 조합(+)의 결과를 보여준다. ELISA에 의해 측정된 HyHEL-Fab 농도/수율에 대한 배수 변화(FC) 수준은 빈 삽입 벡터를 과발현하는 모 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab와 비교하여 상대적 수로 나타내었다. CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab ELO3는 추가의 조합에 대해 기원하는 균주이고, 따라서 임의의 수율의 FC 값 및/또는 수율의 FC 값은 명시적 복제물을 의미한다(n=1).
[001] 표 6
Figure pct00006
* sc: 사카로마이세스 세레비지에
ELO2 (PP7435_Chr3-0603)와 조합된 ELO3 (PP7435_chr3-0987) 및 PRY1 (PP7435_chr3-1160)과 조합된 ELO3 (PP7435_chr3-0987)은 또한 CBS7435 mutS pAOX SDZ-Fab에서 과발현되어, 각각, 농도의 FC가 1.2(n=12)로, 수율의 FC가 1.4(n=12)로 증가하고, 농도의 FC가 1.3(n=10)으로, 수율의 FC가 1.3(n=10)으로 증가하였다.
나열된 각각의 조합은 빈 벡터 대조군으로 형질전환된 모 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab에 비해 모델 단백질 HyHEL-Fab (POI)의 Fab 농도 및/또는 Fab 수율의 증가를 초래함을 알 수 있다(표 7의 결과 참조). 기원 균주와 비교하여 Fab 농도 및/또는 수율의 증가는 지방산 연장 경로를 포함하는 스핑고지질 생합성, 인지질 생합성 경로, 에르고스테롤 생합성 경로, 또는 지질 수송 경로에 관여하는 유전자의 조합, 및 선택적으로 샤페론과의 조합이 모델 단백질 HyHEL-Fab 에 의해 증폭된 POI의 농도 및/또는 수율을 더욱 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
b) 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자의 조합의 저발현에 대한 결과
지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자의 두 가지 넉-아웃의 조합을 위해, 유전자 자리 DGA1(PP7435_Chr3-1009) 및 LRO1 (PP7435_Chr2-0587)에서 파괴하는 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab 균주를 사용하였다. 유전자 자리 DGA1 및 LRO1를 갖는 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab는 성공적으로 파괴되고, 표 7에 표시된 것과 같은 Fab 수율 및 농도의 결과를 나타내었다:
표 7은 지질 생합성(지질 저장 경로)에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자의 두 가지 넉-아웃의 결과를 나타낸다. ELISA에 의해 측정된 HyHEL-Fab 농도 및 수율에 대한 배수 변화(FC) 수준을 모 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL와 비교하여 상대적은 수로 나타냈다.
표 7
Figure pct00007
실시예 7: 유가 배양
지질 대사, 예를 들어 지방산 연장을 포함하는 스핑고지질 생합성 또는 지질 수송과 같은 지질 대사에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미치는 실시예 3 및 6에서의 조작된 균주는 유가 바이오리액터 배양에서 분석하여, 생산균주의 개량을 검증하였다. 예를 들어 지방산 연장을 포함하는 스핑고지질 생합성 및 스핑고지질과 같은 지질 대사에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미치는 실시예 3 및 6에서의 조작된 균주는 생산 숙주 균주 개선의 검증을 위해 유가 바이오리액터 배양에서 분석되었다.
a) 유가 배양 프로토콜
각각의 균주는 50 mL 의 YPhyG로 채워져 있는, 넓은-목, 칸막이를 지니며, 덮혀 있는 300 mL 진탕 플라스크에 접종되었고, 28℃, 110 rpm에서 밤새 교반되었다(전-배양물 1). 전-배양물 2(넓은-목, 칸막이를 지니며, 덮혀 있는 1000 mL 진탕 플라스크 내 100 mL YPhyG)는 전-배양물 1로부터 OD600(600nm에서 측정된 광학 밀도)이 늦은 오후(배가 시간: 약 2 시간)에 약 20(YPhyG 배지에 대해 측정된)에 도달하도록 접종되었다. 전-배양물 2의 인큐베이션 역시 , 28℃, 110 rpm에서 수행되었다.
유가 배양은 1.0 L의 작업 부피를 갖는 바이오리액터(Minifors, Infors, Switzerland)에서 수행되었다. 모든 바이오리액터(약 5.5의 pH를 갖는 400 mL BSM-배지로 채워진)는 OD600이 2.0일 때 전-배양물 2로부터 각각 접종되었다. 일반적으로, 바이오매스를 생산하기 위해 P. pastoris는 글리세롤 상에서 성장되고, 배양물은 글리세롤이 공급된 후 뒤이어 메탄올이 공급되었다.
최초의 회분(batch) 단계에서, 온도는 28℃로 설정되었다. 생산 단계의 시작 전, 남은 기간에 걸쳐 온도는 25℃로 감소되었고, 이 수준은 남은 과정동안 유지되었으며, 이러한 과정 동안 pH는 5.0으로 떨어졌고, 이 수준은 유지되었다. 산소 포화도는 전체 과정동안 30%로 설정되었다(연속적인 조절: 교반, 흐름, 산소 공급). 교반은 700 내지 1200rpm 으로 적용되었고, 공기 흐름(flow)은 1.0-2.0 L/min의 범위로 선택되었다. 25% 암모늄을 사용하여 pH는 5.0으로 조절되었다. 생성되는 거품은 필요한 경우 거품 방지제 Glanapon 2000의 첨가에 의해 조절되었다.
회분 단계 동안, 바이오매스는 약 110-120 g/L의 습윤 세포 중량(WCW)에 이를 때까지 생성된다(μ ~ 0.30/h). 보편적인 회분 단계(바이오매스 생성)은 약 14시간동안 지속된다. 글리세롤은 식 2.6+0.3*t (g/h)으로 정의된 속도로 공급되며, 총 30g의 글리세롤(60%)가 8시간 내 보충되었다. 처음 샘플링 시점은 20시간으로 선택되었다.
다음 18시간동안(공정 시간 20 내지 38시간), 혼합된 글리세롤/메탄올 공급물이 적용되었다: 글리세롤 공급 속도는 다음 식으로 정의된다: 2.5+0.13*t (g/h), 66 g의 글리세롤(60%)을 공급함, 메탄올 공급 속도는 다음 식으로 정의된다: 0.72+0.05*t (g/h), 21g의 메탄올을 첨가함.
다음 72시간 동안(공정 시간 38 내지 110시간까지), 총 215-216 g의 메탄올을 공급하였다(공급 속도는 다음 식으로 정의된다: 2.2 + 0.016 * t (g/L)).
다음의 절차를 이용하여 다양한 시점에서 샘플을 채취하였다: 처음 3 mL의 샘플링된 배양 브로스(실린지 사용)를 버렸다. 1 mL의 새로 채취한 샘플(3-5 mL)을 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮기고, 5분동안 13,200 rpm(16,100 g)으로 회전시켰다. 상청액은 별도의 바이알로 공들여 옮겼다.
1 mL의 배양 브로스를 13,200 rpm(16,100 g)에서 5분동안 트레이드(tared) 에펜도르프 바이알에서 원심분리하였고, 생성된 상청액을 정밀하게 제거하였다. 바이알은 무게를 재고(정확도 0.1 mg), 빈 바이알의 용기를 빼서 습윤 세포 중량을 얻었다.
배지는 다음과 같다:
다음을 함유하는 YPhyG 전배양 배지 (리터당): 20 g Phytone-Peptone, 10 g Bacto-Yeast Extract, 20 g glycerol
회분 배지: 다음을 함유하는 변형된 염기성 염 배지 (BSM) (리터당): 13.5 mL H3PO4 (85%), 0.5 g CaCl·2H2O, 7.5 g MgSO4·7H2O, 9 g K2SO4, 2 g KOH, 40 g glycerol, 0.25 g NaCl, 4.35 mL PTM1, 0.1 mL Glanapon 2000 (antifoam)
다음을 함유하는 PTM1 미량 원소(리터당): 0.2 g Biotin, 6.0 g CuSO4．5H2O, 0.09 g KI, 3.00 g MnSO4．H2O, 0.2 g Na2MoO4．2H2O, 0.02 g H3BO3, 0.5 g CoCl2, 42.2 g ZnSO4．7H2O, 65.0 g FeSO4．7H2O, 및 5.0 mL H2SO4 (95 %-98 %).
다음을 함유하는 글리세롤 공급 용액 (kg 당): 600 g glycerol, 12 mL PTM1
다음을 함유하는 메탄올 공급 용액: 순수 메탄올.
b) 결과
표 8은 빈 벡터를 포함하는 조작되지 않은 Fab 생산 균주(대조군 균주)와 비교하여 유가 배양 생산 과정에서 P. pastoris 에서 증가된 Fab 분비/생산을 나타내는 유전자 또는 유전자 조합을 나열하였다. Fab 생산 농도는 ELISA에 의해 정량화되었다(실시예 4c). 바이오매스는 습윤 세포 중량으로 측정되었다. 생산 농도 및 수율의 변화는 각각의 대조군 균주에 상대적인 배수 변화값으로 나타내었다. 배수 변화 값은 유가 생산 과정에서 AOX HyHEL 모 숙주(빈 벡터 대조군)에 상대적인 농도 및 생산 수율에서의 개선을 보였으며, 모 숙주는 직접적인 비교를 위해 성장되고 병렬적으로 샘플링되었다.
표 8은 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자 단독 또는 유가 배양에서 P. pastoris와의 조합의 과발현의 결과를 보여준다. ELISA에 의해 측정된 HyHEL-Fab 농도/수율에 대한 배수 변화(FC) 수준을 빈 삽입 벡터를 과발현하는 모균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab와 비교하여 상대적인 수로 나타냈다.
표 8
Figure pct00008
* sc: 사카로마이세스 세레비지에
표 8에 나타난 바와 같이, 목록화된 모든 유전자 또는 유전자 조합은 이들의 과발현에 의해 모델 단백질 HyHEL-Fab의 수율(mg/바이오매스)이 적어도 20%(배수 값>1.2) 증가되었다. 지방산 연장 또는 대사를 포함하는 스핑고지질 생합성에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미치는 조합된 과발현, 또는 지질 수송 또는 샤페론에 관여하는 유전자와의 조합은 바이오리액터에서 ELO3을 단독으로 과발현(PP7435_chr3-0987)하는 기원 균주를 능가했다.
실시예 8: 소 규모 배양의 지질 분석
소 규모 배양에서 생산된 선택된 유전자(표 3에 나열됨)를 과발현하는 P. pastoris 생산 균주의 바이오매스(실시예 4a의 설명에 따름)를 지질 분석을 수행하는데 사용하였다. 10 mM Tris/HCl [pH7.5]에 재현탁한 후, 세포를 10분동안 유리 비드로 4℃, Genie Disruptor (Scientific Industries)에서 붕해시켰다. 생성된 균질물뿐만 아니라 세포 잔해물 및 유리 비드를 10 ml 유리 Pyrex 튜브에 옮기고, Folch et al. [Folch J. et al., A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, J. Biol. Chem. 226 (1957) 497-509.]에 개시된 방법으로 지질을 추출하였다. 요약하면, 지질을 실온에서 1시간동안 격렬하게 진탕하여 3 ml의 CHCl3:MeOH (2:1; v/v)으로 추출하였다. 0.2 부피의 0.034% MgCl2, 1 ml의 2 N KCl/MeOH (4:1; v/v), 및 1 ml의 인공 상부상(upper phase) (CHCl3:MeOH:H2O; 3: 48:47; 부피당)으로 연속 세척 단계를 수행하여 단백질 및 비-극성 물질을 제거하였다. 탁상용 원심분리기에서 3분동안 2,000g으로 원심분리한 후, 수성상을 흡인법으로 제거하였다. 마지막으로 지질을 질소 기류하에서 건조시키고, -20℃에서 저장하였다.
인지질 분석을 위해, 지질 추출물을 실리카겔 60 플레이트(Merck, Darmstadt, Germany)에 수동으로 로딩하였다. 개별의 인지질을 (CHCl3/MeOH/25% NH3; 부피당)를 일차 용매 시스템으로 사용하고, (CHCl3/C3H6O/MeOH/CH3COOH/H2O; 부피당)를 이차 용매 시스템으로 사용하여 2차원 얇은 층 크로마토그래피로 분리하였다. 요오드 증기로 염색하여 인지질을 검출하였다. 염색된 반점을 긁어내고, 인지질을 Broekhuyse [Broekhuyse R. M., Phospholipids in tissues of the eye I isolation, characterization and quantitative analysis by two-dimensional thin-layer chromatography of diacyl and vinyl-ether phospholipids, Biochim. Biophys. Acta 152 (1968) 307-315]의 절차로 정량화하였다. 총 인지질 분석을 위해, 건조된 지질 추출물의 부분 표본을 포스페이트를 기준으로 사용하여 포스페이트 결정에 직접 적용하였다.
비-극성 지질(스테릴에스테르(SE) 및 트리아실글리세롤(TG))의 분석을 위해, 지질 추출물을 실리카겔 60 플레이트(Merck, Darmstadt, Germany)에 로딩하였고, 얇은 층 크로마토그래피으로 분래하였다. 크로마토그램은 2-단계 발달 시스템에 의해 오름차순으로 개발되었다. 먼저, 경질 석유(light petroleum)/디에틸 에테르/아세트산(부피 당 35/15/1)을 이동상으로 사용하였고, 크로마토그램을 플레이트의 반-거리(half-distance)로 개발하였다. 그런 다음, 플레이트를 건조시키고, 경질 석유(light petroleum)/디에틸 에테르(부피당 49/1)를 이차 이동상으로 사용하여 플레이트의 상단까지 크로마토그래피를 추가로 개발하였다. 플레이를 15초동안 0.63 MnCl2.4H2O, 60 ml H2O, 60 ml 메탄올, 및 4 ml 농축된 황산을 포함하는 용액에 담지하여 밴드를 시각화하였고, 가열 챔버에서 105℃, 30분동안 배양하였다. SE 및 TG 밴드를 적절한 기준(콜레스테릴 올레이트 및 트리올레인)과 비교하고 400 nm에서 스캐너(CAMAG TLC Scanner 3)를 이용하여 밀도 측정 스캐닝하여 동정하고 정량화하였다.
스테롤 분석은 Quail and Kelly [Quail M. A., Kelly Sl L., The extraction and analysis of sterols from yeast, Methods Mol. Biol. 53 (1996) 123-31]에 개시된 것으로 수행되었다. 내부 기준으로 콜레스테롤을 사용하여 지질 추출물의 알칼라인 가수분해한 후, 질량 선별 검출기(HP 5972)가 장착된 Hewlett-Packard 5890 Gas-Chromatograph로 HP 5-MS capillary column (20 m x 0.25 mm i.d. x 0.25 μm film thickness)을 사용하여 GLC/MS(gas liquid chromatography/mass spectrometry)를 수행하였다. 1 μl의 샘플 부분 표분을 270℃의 주입 온도에서 운반 가스로서 헬륨을 이용하여 비분할(splitless) 모드에서 주입하고, 0.9 ml/min으로 설정된 유량을 이용하여 일정한(constant) 유량 모드에서 주입하였다. 온도 프로그램은 1분동안 100℃, 10℃/min으로 250℃까지, 그리고 3℃/min으로 310℃까지였다. 스테롤은 이들의 질량 단편화 패턴에 의해 동정되었다.
표 9. 각각의 모(parent) 배경에서, 모 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab 및 이중 결실 돌연변이 Δdga1Δlro1의 지질 특성. 지질은 g 세포 습윤 중량(CWW) 당 mg 지질(인지질, 에르고스테롤, 트리아실글리세롤, 스테릴 에스테르)로 나열되었다. 가능한 경우, 포준 편차는 주어졌다. N.d.(검출되지 않음).
표 9
Figure pct00009
표 10. 각각의 모(parent) 배경에서, 모 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab 및 이중 결실 돌연변이 Δdga1Δlro1의 총 세포 추출물의 인지질 패턴. PI, 포스파티딜이노시톨; PS, 포스파티딜세린; PC, 포스파티딜콜린; PE, 포스파티딜에탄올아민; CL, 카르디올리핀; PA, 포스파티딘산.
표 10
Figure pct00010
DGA1 및 LRO1의 결실은 트리아실글리세롤의 생합성에 요구되는 아실트랜스퍼라제를 코딩하는 이중 결실 돌연변이 Δdga1Δlro1. DGA1 및 LRO1를 초래한다. 두 효소는 디아실글리세롤을 아실레이트할 수 있다. DGA1은 아실-CoA 의존적 방법으로 디아실글리세롤을 에스테르화하는 반면, LRO1은 아실-공여체로서 아실-CoA에 독립적이다. 두 트리아실글리세롤-아실트랜스퍼라제의 결실은 표 9에서 볼 수 있는 것처럼 트리아실글리세롤의 총 손실을 초래한다. 트리아실글리세롤 및 스테릴에스테르는 모두 비-극성 지질이며, 과도한 스테롤 및/또는 지방산의 저장에 관여한다. 그러나, 이들의 존재는 세포의 생존에 필수적인 것이 아니다. 트리아실글리세롤 결실의 강력한 효과와 함께, 이중 결실 돌연변이 Δdga1Δlro1는 저장 지질의 2차 종류인, 스테릴 에스테르에서 강한 감소를 보여준다(표 9). 스테릴 에스테르는 모 생산 균에 비해 10배 감소된다. 트리아실글리세롤의 결실 및 스테릴 에스테르의 강한 감소는 인지질 및 스테롤의 전반적인 감소를 동반한다(표 9). 그러나, 이중 결실 돌연변이 Δdga1Δlro1의 개별의 인지질은 크게 영향받지 않는다(표 10). 포스파티딜세린 및 프소파티딜이노시톨에서는 약간의 변화가 관찰되었으며, 이는 포스파티딘 산을 소비하면서 모 생산 균주에 비해 둘 다 증가되었다.
표 11. 빈 삽입 벡터(빈 벡터)를 과발현하거나 P. pastoris의 에르고스테롤 생합성에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현하는 모균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab의 총 세포 추출물의 스테롤 조성. HMG1은 이것의 본연의 전장뿐만 아니라, 이들의 N-말단 막 횡단 도메인이 모두 결여된 두 개의 절단된 형태(t1HMG1 및 t2HMG1)로서 과발현된다(표 1의 각주 참조).
표 11
Figure pct00011
에르고스테롤 생합성 경로는 매우 복잡하고, 고도로 조절되며, 최대 25개의 효소를 포함한다. 주요 역할 또는 속도-제한 단계에 위치하는 일부 효소는 과발현을 위해 선택되었다. 스테롤 조성 및 총 스테롤 함량에 대한 효과는 표 11에 나타내었다. 이의 전장 변이체로서 HMG1의 과발현은 빈 삽입 벡터를 과발현하는 모 생산 균주와 비교하여 스테롤 패턴 및 양과 관련하여 어떤 변화도 나타나지 않았다. 그러나, 이들의 N-말단 막 횡단 도메인에 대해 고갈된 절단된 형태로서 HMG1의 과발현은 에르고스테롤의 생산에서 증가를 초래한다. 총 스테롤 함량에서 가장 큰 변화는 에르고스테롤 생합성 경로에서 추가로 하위에 관여하는 ERG11이 과발현될 때 달성되었다.
-) 이중 결실 돌연변이 Δdga1Δlro1는 저장 지질 트리아실글리세롤이 완전히 고갈된다.
-) 이중 결실 변이체 Δdga1Δlro1는 모 생산 균주에 비해 스테릴 에스테르의 강한 감소를 보여준다. Δdga1Δlro1의 결실시, 모 생산 균주와 비교하여 오직 10%의 스테릴 에스테르만이 남게 된다.
-) 인지질의 총 함량은 모 생산 균주에 비해 이중 결실 변이체 Δdga1Δlro1에서 65%로 감소된다.
-) 유사하게, Δdga1Δlro1의 결실은 스테롤의 총 함량을 대략 68%로 감소시킨다.
-) ERG11의 과발현은 에르고스테롤 및 스테롤 전구체에서 가장 높은 증가를 초래한다. 에르고스테롤의 함량은 70% 증가된 빈 삽입 벡터를 과발현하는 모 생산 균주와 비교된다.
실시예 9: 유가 배양의 지질 분석
바이오리액터 배양의 최종 샘플링 시점에서 얻은 세포 펠릿(상기 결과)은 스핑고지질을 분석하기 위해 사용되었다. 스핑고지질 종류 및 각각의 종류의 분자적 종과 관련된 스핑고지질 분포 패턴의 특성은 보조 단백질 ELO3이 과발현될 때 뚜렷한 변화를 나타냈다.보조 단백질 ELO3 과발현에 의한 효과는 또한 스핑고지질 생합성 과정 또는 지질 수송의 추가 성분들이 과발현될 때 향상되거나 변경될 수 있다.
유가 배양으로부터 얻은 세포 펠릿은 TE-버퍼(10mM Tris; 1 mM EDTA; pH 7.4)에서 용해되고, 총 세포 추출물은 유리 비드로 4℃, 15분 동안 격력하게 진탕시켜 제조하였다. 총 세포 추출물로부터 얻은 동일한 양((300 μg 단백질)을 30 μl의 내부 표준 혼합물(0.15　nmol N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine, 0.15　nmol N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-enine, 4.5　nmol C17 sphinganine, Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL, USA)과 섞고, 6　ml 프로판-2-올/헥산/물(부피당 60:26:14)로 현탁하였으며, J.E. Markham et al. [J. Biol.Chem. (2006). 281:22684-22694.]에 의해 종래에 개시된 약간 변형된 프로토콜로 60℃에서 30분 동안 배양하였다. 베앵하는 동안, 샘플은 짧게 볼텍싱되고, 0, 10, 20 및 30분 후에 초음파 처리되었다. 그런 다음, 추출물을 원심분리에 의해 세포 잔해물로부터 제거하였고, 질소 하에서 건조시켰으며, 800　μl 테트라하이드로퓨란/메탄올/물(부피 당 4:4:1)에서 다시 용해시켰고[C. Bure et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. (2011). 25:3131-3145.], -20℃, 아르곤 하에서 저장하였다. 분석을 위해, 샘플을 약하게 가열하고 초음파처리하여 재용해시켰다.
UPLC-nanoESI-MS/MS는 ACQUITY UPLC® HSS T3 Column (100　mm Х 1　mm, 1　μm; Waters Corp., Milford, MA, USA)이 장착된 ACQUITY UPLC® system (Waters Corp., Milford, MA, USA) 상에서 수행된 Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)에 의해 시작되었다. 2　μl의 부분 표본을 바늘 오버필 모드(needle overfill mode)를 갖는 부분 루프에 주입하였다. 유량은 0.12 ml/min이었고, 분리 온도는 35℃였다. 이니스톨 함유 스핑고지질을 다음과 같이 선형적 농도 구배법(linear gradient elution)으로 분리하였다: 65% 용매 B를 2분동안 유지시키고, 8분동안 100% 용매 B로 선형적 증가시키며, 100% 용매 B를 2분동안 유지시키고 2분 내에 65% 용매 B로 평형시켰다. 세라마이드(Cer) 및 헥소실세라마이드(HexCer)를 다음과 같이 분리하였다: 80% 용매 B를 2분동안 유지시키고, 8분동안 100% 용매 B로 선형적 증가시키며, 100% 용매 B를 2분동안 유지시키고, 2분 내에 80% 용매 B로 평형시켰다. 용매 B는 0.1% (v/v) 아세트산을 함유한 테트라하이드로퓨란/메탄올/20 mM 암모늄 아세테이트였고, 용매 A는 0.1% (v/v) 아세트산을 함유한 메탄올/20 mM 암모늄 아세테이트였다. 칩-기반 나노전자분무 이온화 기법은 5　μm의 내부 직경 노즐, 209 nl/min의 유량 및 1.5 kV의 전압을 갖는 양이온 모드에서 TriVersa Nanomate® (Advion, Ithaca, NY, USA)를 이용하여 달성되었다. 스핑고지질 분자 종의 검출은 4000 QTRAP® tandem mass spectrometer (AB Sciex, Framingham, MA, USA)를 이용하여, (i) Cer, Hex 및 LCB의 [M+H]+ 분자 이온에서 탈수된 장쇄 염기(LCB) 단편으로의 전이; 및 (ii) 이니스톨 함유 스핑고지질에 대한 머리 부분(head group)을 포함하는 포스포이노시톨의 손실을 모니터링함으로써 수행되었다[C.S. Ejsing et al., J. Mass Spectrom (2006). 41:372-389. J.E. Markham et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. (2007). 21:1304-1314]. 체류 시간은 30 ms였으며, 검출기 반응을 최대화하도록 MS 파라미터를 최적화하였다.
보조 단백질 ELO3의 과발현은 총 함량, 조성 및 스핑고지질의 분자적 종 분포에서 몇 가지 중요한 변화를 초래한다. 상세하게, 세라마이드의 분자적 종 분포 및 스핑고지질의 IPC-종류(IPC, MIPC, M(IP)2C)에서의 뚜렷한 이동은 보조 단백질 ELO3이 과발현될 때 관찰되었다(표 12 내지 16 참조). 헥소실-세라마이드의 종 조성은 보조 단백질 ELO3의 과발현에 의해 영향받지 않았다. 모 숙주 균주의 스핑고지질(빈 벡터 대조군)은 대부분 그들의 지방산 모이어티에서 매우 긴 지방산(VLCFA) C24:0을 갖는 분자적 종 변이체를 포함한 반면, 보조 단백질 ELO3을 발현하는 조작된 균주는 VLCFA C26:0으로의 뚜렷한 이동을 보였다.
스핑고지질 생합성 과정 또는 지질 수송의 추가 성분의 과발현은 보조 단백질 ELO3를 과발현하는 본연의 균주에 비해 분자적 종 분포에 크게 영향을 미치지 않았지만(데이터는 나타내지 않음), 특정 스핑고지질 종류의 상대적 및 총 풍부도와 관련하여 명확한 변화가 관찰되었다. 표 17 및 18은 모든 스핑고지질의 상대적 분포를 나타낸다. 보조 단백질 ELO3의 과발현은 성숙한 이노시톨-함유 포스포릴세라마이드 M(IP)2C가 IPC를 소비하면서 향상되는 분포 패턴 변화를 변화시킨다. ELO3의 모든 조합은 IPC에서 현저히 감소했음을 보여주며, 상기 IPC는 조합 ELO3+LAG1, ELO3+KAR2, 및 ELO3+LCB1+LCB2+TSC3의 경우에서와 같이 M(IP)2C에서 강력한 증가를 동반하거나 조합 ELO3+PRY1의 경우에서와 같이 헥소실-세라마이드에서 높은 증가를 동반한다.
절대값 측면에서, 보조 단백질 ELO3 과발현의 평가는 뚜렷한 변화를 보여준다(표 18 참조). 즉, ELO3 단독의 과발현, 또는 스핑고지질 생합성, 지질 수송 또는 샤페론에 관여하는 추가 인자와의 조합에서, IPC의 뚜렷한 감소를 초래한다. 동시에, M(IP)2C의 절대 수준은 ELO3이 과발현될 때 현저하게 상승한다. M(IP)2C의 축적은 ELO3에 따라 추가 성분이 공동-발현될 때 보다 효율적으로 향상된다. ELO3 과발현이 KAR2 과발현과 조합될 때 M(IP)2C의 높은 축적이 달성된다. PRY1과 ELO3의 조합은 복잡한 이노시톨 함유 포스포릴세라마이드의 발생을 전반적인 감소시킨다.
ELO3의 과발현은 대부분 스핑고지질의 변경된 분자적 종 패턴, 즉 세라마이드 및 이노시톨-함유 포스포릴세라마이드의 지방 아실 모이어티(IPC, MIPC, M(IP)2C)가 우선적으로 C24 대신에 C26을 포함하는 변경된 분자적 종 패턴을 초래한다. C26의 함량은 빈 벡터에 비해 적어도 100% 향상된 스핑고지질의 종류(세라마이드, IPC, MIPC 및 M(IP)2C)에 의존한다(표 12-16).
Figure pct00012
표 12. 빈 삽입 벡터(빈 벡터) 또는 ELO3을 과발현하는 생산 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab의 유가 샘플에서의 세라마이드의 분자적 종의 조성. 결과는 각각의 균주 내 모든 세라마이드 종의 상대적인 함량을 표시하였다. 분자적 종은 시험된 두 균주에서 상대적 양이 0.3% 미만일 때 표에서 제외시켰다. 스핑고지질은 장쇄-염기로 이루어지며, 이는 지방산에 아마이드 결합으로 연결되어 있다. 따라서, 분자적 종은 “(장쇄-염기/지방-아실)”로 표현된다. 장쇄-염기 및 지방 아실은 추가로 XX:YY:Z(XX: 아실-사슬에서 탄소의 수; YY: 포화/불포화의 정도가 기술된 아실-사슬에서 C-C 이중 결합의 수; Z: 아실-사슬에서 하이드록실기의 수)에서 상세하게 표현된다.
Figure pct00013
표 13. 빈 삽입 벡터(빈 벡터) 또는 ELO3을 과발현하는 생산 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab의 유가 샘플에서의 헥소실-세라마이드의 분자적 종의 조성. 결과는 각각의 균주 내 모든 헥소실-세라마이드 종의 상대적인 함량을 표시하였다. 분자적 종은 시험된 두 균주에서 상대적 양이 0.3% 미만일 때 표에서 제외시켰다. 스핑고지질은 장쇄-염기로 이루어지며, 이는 지방산에 아마이드 결합으로 연결되어 있다. 따라서, 분자적 종은 “(장쇄-염기/지방-아실)”로 표현된다. 장쇄-염기 및 지방 아실은 추가로 XX:YY:Z(XX: 아실-사슬에서 탄소의 수; YY: 포화/불포화의 정도가 기술된 아실-사슬에서 C-C 이중 결합의 수; Z: 아실-사슬에서 하이드록실기의 수)에서 상세하게 표현된다.
ELO3의 과발현은 헥소실-세라마이드 종의 분포에 영향을 미치지 않는다(표 13).
Figure pct00014
표 14. 빈 삽입 벡터(빈 벡터) 또는 ELO3을 과발현하는 생산 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab의 유가 샘플에서의 이노시톨포스포릴세라마이드(IPC)의 분자적 종의 조성. 결과는 각각의 균주 내 모든 IPC 종의 상대적인 함량을 표시하였다. 분자적 종은 시험된 두 균주에서 상대적 양이 0.3% 미만일 때 표에서 제외시켰다. 스핑고지질은 장쇄-염기로 이루어지며, 이는 지방산에 아마이드 결합으로 연결되어 있다. 따라서, 분자적 종은 “(장쇄-염기/지방-아실)”로 표현된다. 장쇄-염기 및 지방 아실은 추가로 XX:YY:Z(XX: 아실-사슬에서 탄소의 수; YY: 포화/불포화의 정도가 기술된 아실-사슬에서 C-C 이중 결합의 수; Z: 아실-사슬에서 하이드록실기의 수)에서 상세하게 표현된다.
Figure pct00015
표 15. 빈 삽입 벡터(빈 벡터) 또는 ELO3을 과발현하는 생산 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab의 유가 샘플에서의 만노실-이노시톨포스포릴세라마이드(MIPC)의 분자적 종의 조성. 결과는 각각의 균주 내 모든 MIPC 종의 상대적인 함량을 표시하였다. 분자적 종은 시험된 두 균주에서 상대적 양이 0.3% 미만일 때 표에서 제외시켰다. 스핑고지질은 장쇄-염기로 이루어지며, 이는 지방산에 아마이드 결합으로 연결되어 있다. 따라서, 분자적 종은 “(장쇄-염기/지방-아실)”로 표현된다. 장쇄-염기 및 지방 아실은 추가로 XX:YY:Z(XX: 아실-사슬에서 탄소의 수; YY: 포화/불포화의 정도가 기술된 아실-사슬에서 C-C 이중 결합의 수; Z: 아실-사슬에서 하이드록실기의 수)에서 상세하게 표현된다.
Figure pct00016
표 16. 빈 삽입 벡터(빈 벡터) 또는 ELO3을 과발현하는 생산 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab의 유가 샘플에서의 만노실-디이노시톨-포스포릴세라마이드세라마이드(M(IP)2C)의 분자적 종의 조성. 결과는 각각의 균주 내 모든 M(IP)2C 종의 상대적인 함량을 표시하였다. 분자적 종은 시험된 두 균주에서 상대적 양이 0.3% 미만일 때 표에서 제외시켰다. 스핑고지질은 장쇄-염기로 이루어지며, 이는 지방산에 아마이드 결합으로 연결되어 있다. 따라서, 분자적 종은 “(장쇄-염기/지방-아실)”로 표현된다. 장쇄-염기 및 지방 아실은 추가로 XX:YY:Z(XX: 아실-사슬에서 탄소의 수; YY: 포화/불포화의 정도가 기술된 아실-사슬에서 C-C 이중 결합의 수; Z: 아실-사슬에서 하이드록실기의 수)에서 상세하게 표현된다.
LAG1, LCB1+LCB2+TSC3Sc, KAR2 또는 PRY1과 같은 추가의 보조 단백질과 보조 단백질 ELO3의 과발현을 조합하는 것은, ELO3의 단독 과발현과 같이(종을 함유하는 C24 미만, 종을 함유하는 C26 이상), 세라마이드 및 이노시톨-함유 포스포릴세라마이드(IPC, MIPC, M(IP)2C)의 분자적 종 패턴에서 동일한 경향을 나타낸다. C26의 함량은 빈 벡터에 비해 적어도 100% 향상된 스핑고지질의 종류(세라마이드, IPC, MIPC 및 M(IP)2C)에 의존한다(데이터는 나타내지 않음).
KAR2와 같은 추가의 보조 단백질과 ELO3의 과발현을 조합하는 것은, 종을 함유하는 C24에서 세라마이드 및 이노시톨-함유 포스포릴세라마이드(IPC, MIPC, M(IP)2C)의 종을 함유하는 C26으로의 이동을 향상시킨다. C26의 함량은 빈 벡터에 비해 적어도 200% 향상된 스핑고지질의 종류(세라마이드, IPC, MIPC 및 M(IP)2C)에 의존한다(데이터는 나타내지 않음).
ELO3의 과발현은 스핑고지질의 상대적 분포에서 뚜렷한 변화를 초래한다. (표 17).
ELO3의 과발현은 IPC 및 MIPC의 대략 30%의 감소를 초래하고, 균주를 과발현하는 빈 벡터에 비해 6배 상승되는 이노시톨-함유 포스포릴세라마이드, M(IP)2C의 성숙한 형태의 형성을 강하게 증가시킨다. (표 17).
축적하는 M(IP)2C에 대한 ELO3-과발현의 효과는 LAG1 또는 KAR2와의 공동-과발현에 의해 상승적으로 향상된다. M(IP)2C는 균주를 과발현하는 빈 벡터에 비해 적어도 10 배 상승된다. (표 17).
ELO3의 과발현은 스핑고지질의 전반적인 형성을 증가시키지 않는다. (표 18).
LAG1의 과발현은 ELO3의 과발현이 빈 벡터 대조군과 같이 행동하기 때문에 스핑고지질의 지방 아실 모이어티를 변경시키지 않는다. C24에서 C26으로의 이동은 관찰되지 않았다. (데이터는 나타내지 않음).
그러나, LAG1 과발현은 스핑고지질의 상대적 분포 패턴, 즉 IPC를 소비하면서 M(IP)2C가 증가하는 상대적 분포 패턴에서 유사한 변화를 초래한다. (표 17).
LAG1의 과발현은 균주를 과발현하는 빈 벡터에 비해 M(IP)2C의 형성을 적어도 10배 증가시킨다. (표 18).
PRY1의 과발현은 종 분포 및 스핑고지질 분포에서의 변화를 나타내지 않는다. (표 17).
PRY1의 과발현은 일반적으로 감소된 수준의 이노시톨-함유 포스포리세라마이드(IPC, MIPC 및 M(IP)2C 미만)를 보여준다. (표 18).
Figure pct00017
[001] 표 17. 빈 삽입 벡터(빈 벡터)를 과발현하거나 ELO3, ELO3 LAG1, LAG1, ELO3 LCB1 LCB2 TSC3Sc, PRY1, ELO3 PRY1 또는 ELO3 KAR2를 과발현하는 생산 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab의 유가 샘플에서의 스핑고지질 분석. 결과는 각각의 균주 내 모든 스핑고지질의 종류(Cer, 세라마이드; HexCer, 헥소실-세라마이드; IPC, 이노시톨포스포릴세라마이드; MIPC, 만노실-이노시톨포스포릴세라마이드; M(IP)2C, 만노실-디이노시톨-포스포릴세라마이드)의 상대적 분포를 보여준다.
Figure pct00018
표 18. 빈 삽입 벡터(빈 벡터)를 과발현하거나 ELO3, ELO3 LAG1, LAG1, ELO3 LCB1 LCB2 TSC3Sc, PRY1, ELO3 PRY1 또는 ELO3 KAR2를 과발현하는 생산 균주 CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab의 유가 샘플에서의 분석된 스핑고지질의 절대값의 비교. 피크 강도의 제시는 분석된 균주 사이의 모든 모든 스핑고지질의 종류(Cer, 세라마이드; HexCer, 헥소실-세라마이드; IPC, 이노시톨포스포릴세라마이드; MIPC, 만노실-이노시톨포스포릴세라마이드; M(IP)2C, 만노실-디이노시톨-포스포릴세라마이드)의 상대적 풍부도를 직접 비교할 수 있게 한다.
<110> Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG VTU Technology GmbH Lonza Ltd. <120> RECOMBINANT HOST CELL WITH ALTERED MEMBRANE LIPID COMPOSITION <130> I19O10C0110P <150> EP 17163588 <151> 2017-03-29 <160> 103 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Pichia pastoris <400> 1 Met Ser Asp Ile Asn Thr Leu Ser Gln Lys Ile Pro Ser Tyr Val Gln 1 5 10 15 Tyr Gly Ile Pro Ser Ile Asp His Pro Phe Gly Ile Arg Leu Trp Pro 20 25 30 Ile Phe Ser His Phe Phe Glu Ala Val Val Gly Tyr Pro Ala Glu Asp 35 40 45 Phe Arg Phe Ile Gln Gly Leu Thr Thr Met Ala Asn Leu Lys Asp Ala 50 55 60 Leu Gly Val Ile Ala Val Tyr Tyr Phe Val Ile Phe Gly Gly Gln Trp 65 70 75 80 Leu Met Arg Thr Leu Asn Ala Arg Pro Phe Lys Leu Asn Phe Leu Phe 85 90 95 Gln Leu His Asn Leu Val Leu Thr Gly Ala Ser Phe Thr Leu Leu Ile 100 105 110 Leu Ile Val Glu Gln Leu Ile Pro Gly Ile Tyr Arg His Gly Ile Phe 115 120 125 Trp Ala Ile Cys His Lys Asp Ser Phe Thr Asn Glu Leu Val Thr Leu 130 135 140 Tyr Tyr Leu Asn Tyr Leu Ile Lys Tyr Val Glu Leu Ile Asp Thr Val 145 150 155 160 Phe Leu Val Leu Lys Arg Lys Lys Leu Leu Phe Leu His Thr Tyr His 165 170 175 His Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Thr Gln Leu Leu Gly His Thr 180 185 190 Ala Val Glu Trp Val Pro Ile Ala Leu Asn Leu Ala Val His Val Val 195 200 205 Leu Tyr Trp Tyr Tyr Phe Leu Ser Ala Arg Gly Ile Arg Val Trp Trp 210 215 220 Lys Gln Trp Val Thr Arg Phe Gln Ile Ile Gln Phe Leu Ile Asp Leu 225 230 235 240 Gly Phe Val Tyr Phe Ala Thr Tyr Thr Phe Tyr Ala Asp Lys Tyr Phe 245 250 255 Pro Glu Leu Pro Asn Met Gly Thr Cys Tyr Gly Thr Glu Glu Ala Ala 260 265 270 Ala Phe Gly Tyr Leu Ile Leu Thr Ser Tyr Leu Val Leu Phe Ile Leu 275 280 285 Phe Tyr Ile Arg Val Tyr Lys Ser Gly Pro Thr Thr Ser Lys Gly Lys 290 295 300 Ser Lys Ala Ala Ala Thr Thr Gly Gln Lys Thr Glu Thr Ala Ser Pro 305 310 315 320 Ser Gly Lys Ser Thr Ser Val Arg Arg Ala 325 330 <210> 2 <211> 334 <212> PRT <213> Pichia pastoris <400> 2 Met Ser Ile Leu Ser Phe Asp Lys Pro Phe Gly Ile Glu Leu Trp Pro 1 5 10 15 Ile Phe Asp Thr Phe Ala Ser Lys Ala Thr His Gly Ala Phe Val Pro 20 25 30 Ser Glu Phe Glu Phe Val Ala Gly Lys Leu Pro Leu Ser Thr Leu Glu 35 40 45 Pro Val Leu Tyr Ser Ile Ala Ala Tyr Tyr Phe Ile Val Phe Gly Gly 50 55 60 Tyr Tyr Phe Ile Lys Lys Leu Glu Leu Lys Pro Leu Val Leu Asn Ala 65 70 75 80 Leu Phe Ser Ala His Asn Leu Phe Leu Thr Thr Ala Ser Leu Val Leu 85 90 95 Leu Thr Leu Met Val Glu Gln Leu Val Pro Ile Ile Tyr His His Gly 100 105 110 Leu Phe Tyr Ala Ile Cys Asn Thr Arg Ala Trp Thr Gln Glu Leu Val 115 120 125 Thr Leu Tyr Tyr Leu Asn Tyr Leu Ile Lys Phe Val Glu Phe Ile Asp 130 135 140 Thr Phe Phe Leu Val Val Lys Gln Lys Lys Leu Thr Phe Leu His Thr 145 150 155 160 Tyr His His Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Thr Gln Leu Val Gly 165 170 175 Val Thr Ser Ile Ser Trp Val Pro Ile Ser Leu Asn Leu Gly Val His 180 185 190 Val Val Met Tyr Trp Tyr Tyr Phe Leu Ala Ser Arg Gly Ile Arg Val 195 200 205 Trp Trp Lys Glu Trp Val Thr Arg Phe Gln Ile Met Gln Phe Ile Leu 210 215 220 Asp Leu Gly Phe Val Tyr Phe Ala Ser 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Phe Tyr Leu Arg His Trp Leu Asn Val Lys Ile Leu Trp 305 310 315 320 Ser Val Leu Thr Glu Phe Arg Thr Val Gly Pro Phe Glu Leu Asn Trp 325 330 335 Ile Thr Gln Gln Tyr Lys Cys Trp Ile Ser Gln Pro Ile Val Phe Ser 340 345 350 Leu Ile Phe Ala Leu Gln Leu Val Asn Leu Tyr Trp Phe Val Leu Ile 355 360 365 Leu Arg Ile Leu Tyr Arg His Ile Phe Leu Asp Val Thr Lys Asp Glu 370 375 380 Arg Ser Asp Asp Glu Ser Glu Glu Glu Ala Gln Val Glu Pro Ser Lys 385 390 395 400 Lys Glu Glu <210> 4 <211> 378 <212> PRT <213> Pichia pastoris <400> 4 Met Gly Val Glu Thr Ser Ser Ser Gly Thr Gln His Phe Ser Asp Asp 1 5 10 15 Gly Cys Val Ser Ser Arg Lys Pro Asn Ala Thr Val Ser Phe Glu Lys 20 25 30 Pro Glu Arg Ala Asn Glu Leu Lys Asn His Lys Ile Tyr Lys Lys Ser 35 40 45 Lys Ala Ser Trp Leu Gln Arg Asn Gln Ile Leu Leu Ala Ser Ser Leu 50 55 60 Leu Asn Ala Leu Phe Ile Leu Lys Gln Ile Pro Ser Phe Gln Ser Leu 65 70 75 80 Val Asn Lys Phe Phe His Leu Gln Tyr Lys Asn Leu Asp Gly Thr Tyr 85 90 95 Asp Ile Gly Lys Asp Asp Tyr Phe Phe Val Ile Tyr Trp Ile Ile Asn 100 105 110 Leu Thr Ile Ile Arg Ser Val Leu Met Asp Trp Val Leu Glu Pro Leu 115 120 125 Ala Ile Lys Ile Val Gly Ile Asn Asn Arg Lys Ala Leu Thr Arg Phe 130 135 140 Lys Glu Gln Gly Trp Ser Leu Phe Tyr Tyr Thr Thr Ser Trp Thr Val 145 150 155 160 Gly Phe Tyr Leu Tyr Tyr Lys Ser Asp Tyr Phe Phe Asn Cys Asp His 165 170 175 Ile Phe Ile Gly Trp Pro Asn Asn Lys Leu Asp Phe Tyr Phe Lys Ser 180 185 190 Tyr Tyr Leu Ile Gln Met Ser Cys Trp Leu Gln Gln Ile Val Val Leu 195 200 205 Asn Ile Glu Glu Arg Arg Lys Asp Tyr Val Gln Met Phe Ser His His 210 215 220 Ile Ile Thr Cys Leu Leu Ile Ile Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Leu 225 230 235 240 Gln Ile Gly His Val Ile Leu Val Met Met Asp Ile Val Asp Val Phe 245 250 255 Leu Ser Leu Ala Lys Met Leu Lys Tyr Cys Gly Tyr Ser Thr Leu Cys 260 265 270 Asp Val Met Phe Phe Ile Phe Leu Val Ser Trp Ile Ala Ile Arg His 275 280 285 Val Cys Tyr Asn Tyr Val Phe Trp His Thr Cys Thr Lys Ser Arg Asp 290 295 300 Leu Met Asn Ala Asp Cys Ser Arg Tyr Ala 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240 caccctgaac tattcagaga tgtgatggtg aaagatggta ttgctccatg gtatgccaat 300 tttgaaagtt tctacacgcg tcgtttgaaa acaagattag atgactgttt tgcaaggccc 360 atatgtggag ttcccggtag gtacatcaaa tgttacgaca gaaccagtga cgattacaac 420 aatacctata attattccgg caccgtcaca gagcgcttga atttgagttc atacaactat 480 ttagggttcg cacaatcctc tggtctgtgc acctcagaaa gtatcaagac ggtggagaag 540 tatggtacca acagtgctgg tcctcgagtt agtgtgggaa ctactgatct ccatcttgaa 600 tgtgaggacg tcgttgccaa atttactggc aaggacaatg ctttggtatt ttccatgggt 660 tatgggacca atgcaaatct cttcacctct ttggtggact ctaagtgttg tgttatctca 720 gattctttaa accacggatc tatcaggaca ggtgttcgtt tgtctggcgc ctcagtcaaa 780 acttttgctc acaacgacat ggcagcgctg gaaagaactt tgagaagtgt catttcccaa 840 ggtcagccaa agactcatag accctggaag aagatttttg ttgctgtaga gggactttat 900 tccatggaag gaaccctttg taatttgcca aaactggtag aattgcgtaa gcgttacaag 960 ttttatttat ttgttgacga ggcacattct attggtgcta tgggacccaa tggtaagggt 1020 gtttgtgact attttggcat ttcttcttcc aatattgata ttatgatggg tacttttacc 1080 aaatcatttg gagccacagg cggttacatc gctgccgaca aagccatcat agacagattg 1140 aagttagatc tcacaacaaa tacttatgga gaatcaatgt cacctgctgt gctcacacaa 1200 atcattactt ctttgaaaat tatagatgga caactcaatg gtaatgaagg taaagagagg 1260 ctacaaagga ttgccttcaa ttctaggtat ctgcgattag gactaaagcg attaggattt 1320 attgtttatg gtgctgatga ttctcctgtt atcccccttt tactgtatct tccccccaag 1380 atgcctgcat ttagccgaat gatgtacgat agaaaggttg ctgtcgttgt tgtgggatat 1440 cctgcaacgg atataacgtc ttctcgtatt cgattctgcg tttcctcttc tttgaagaag 1500 gaggatatag attatttgct caaatgttgt gatgagatag gagatacttt gtttttgaag 1560 ttcagcacag ggattgctgg tggtgagaag cacccgggag actataagaa gggcattgct 1620 cctaggtgga cattggagga ggttctggag aagacaccgg aggattgcaa gaaagccatg 1680 tactaa 1686 <210> 25 <211> 962 <212> DNA <213> Pichia pastoris <400> 25 atggttaaac tcattgttaa tccaaggtct gagaccctga gacaaatcaa cgtagacact 60 acccccaata caagagtcag agacattgtg gtagcttacg gaaaggcaaa taacagttta 120 tccagctcca gaatcagatt cactaaactg gaagaagacg cagtttccaa gaaaccaaag 180 catgtcactc 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ttgacatcag caacaatgat aaggctttag gtaagctgaa gagagaggtc 900 gaaaaggcca agcgtacttt gtcttcccag atgactacca gaattgagat tgactctttc 960 gtcgacggta tcgacttctc tgagcaactg tctagagcta agtttgagga gatcaacatt 1020 gaattattca agaagacact gaaaccagtt gaacaagtcc tcaaagacgc tggtgtcaag 1080 aaatctgaaa ttgatgacat tgtcttggtt ggtggttcta ccagaattcc aaaggttcaa 1140 caattattgg aggattactt tgacggaaag aaggcttcta agggaattaa cccagatgaa 1200 gctgtcgcat acggtgctgc tgttcaggct ggtgttttgt ctggtgagga aggtgtcgat 1260 gacatcgtct tgcttgatgt gaacccccta actctgggta tcgagactac tggtggcgtt 1320 atgactacct taatcaacag aaacactgct atcccaacta agaaatctca aattttctcc 1380 actgctgctg acaaccagcc aactgtgttg attcaagttt atgagggtga gagagccttg 1440 gctaaggaca acaacttgct tggtaaattc gagctgactg gtattccacc agctccaaga 1500 ggtactcctc aagttgaggt tacttttgtt ttagacgcta acggaatttt gaaggtctct 1560 gccaccgata agggaactgg aaaatccgag tccatcacca tcaacaatga tcgtggtaga 1620 ttgtccaagg aggaggttga ccgtatggtt gaagaggccg agaagtacgc cgctgaggat 1680 gctgcactaa 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nucleic acid amplification <400> 60 ataggccgag gcggccctac aaaaggaatg g 31 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 61 ttccctgcag gaccatgtct caacccactc 30 <210> 62 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 62 acggccgagg cggcctcaca tgtgataaat tgtg 34 <210> 63 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 63 ttccctgcag ggaaatgaca caacataaaa gctcgatgg 39 <210> 64 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 64 acggccgagg cggcctcaaa ggaagcaata ctttag 36 <210> 65 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 65 ttccctgcag gaccatgcag tacgtaggta g 31 <210> 66 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 66 tatggccgag gcggcctcag ctgtcatcga ttc 33 <210> 67 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 67 gaagctctcc accaatttg 19 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 68 cgtcaaacag gaggcaggac 20 <210> 69 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 69 tctcctgcag gcaaacatga gtctggtcca g 31 <210> 70 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 70 tatggccgag gcggccaact aattatcgcg tctttc 36 <210> 71 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 71 ttccctgcag gacgatgctt actgggttgt c 31 <210> 72 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 72 aggccgaggc ggcctcaaga tttaatgcaa atcttag 37 <210> 73 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 73 taccctgcag gacgatggga ataagtgcca caatc 35 <210> 74 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 74 aggccgaggc ggcctcaaga tttaatgcaa atcttag 37 <210> 75 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 75 ttccctgcag gacgatgacg ccagacgttg ttcc 34 <210> 76 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 76 aggccgaggc ggcctcaaga tttaatgcaa atcttag 37 <210> 77 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 77 atacctgcag gacaatgctg tcgttaaaac catc 34 <210> 78 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 78 ataggccgag gcggccctac aactcatcat gatcatagtc 40 <210> 79 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 79 agatatagtt ctgttttatt ccattagagg aggatccg 38 <210> 80 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 80 gttgtcgacc tgcagcgtac tagatactgg cacataacac 40 <210> 81 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 81 gtgttatgtg ccagtatcta gtacgctgca ggtcgacaac 40 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 82 cggtgagaat ggcaaaagct tatg 24 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 83 aagcccgatg cgccagagtt g 21 <210> 84 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 84 acctcctttg cttctctatc agtggatctg atatcaccta 40 <210> 85 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 85 taggtgatat cagatccact gatagagaag caaaggaggt 40 <210> 86 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 86 actaactcag tgtcacccag ctc 23 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 87 tcttgccatc ctatggaact g 21 <210> 88 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 88 acagagcaag acttgccag 19 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 89 actctagctg ttgtccgcca gttc 24 <210> 90 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 90 gttgtcgacc tgcagcgtac tatcaattgt gaacataatg 40 <210> 91 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 91 cattatgttc acaattgata gtacgctgca ggtcgacaac 40 <210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 92 cggtgagaat ggcaaaagct tatg 24 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 93 aagcccgatg cgccagagtt g 21 <210> 94 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 94 gactcataga aacgacggaa gtggatctga tatcaccta 39 <210> 95 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 95 taggtgatat cagatccact tccgtcgttt ctatgagtc 39 <210> 96 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 96 attcacccag ttagggcctc cg 22 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 97 tcttgccatc ctatggaact g 21 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 98 taggagtacc cagcatacag 20 <210> 99 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 99 actacctgca ggcgaaacga tgagattccc atc 33 <210> 100 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 100 tcatggccga ggcggcccta ttacttgtca caggactttg gctc 44 <210> 101 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 101 ctatggccga ggcggcccta ttaacactca cctctgttg 39 <210> 102 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 102 tatcggccga ggcggcccta ttacttacct ggggacaag 39 <210> 103 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for nucleic acid amplification <400> 103 ctatggccga ggcggcccta ttaacactca cctctgttg 39

Claims (15)

  1. 진핵생물 숙주세포에서 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 과발현시킴으로써, 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과발현시키지 않은 숙주세포에 비해 목적 단백질의 수율을 증가시키는 단계를 포함하고,
    상기 지질 대사에 관여하는 단백질은 바람직하게 스핑고지질 생합성, 인지질 생합성, 지질 수송, 및/또는 에르고스테롤 생합성에 관여하며,
    상기 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 상기 적어도 하나의 단백질의 기능적 상동체(functional homologue)를 포함하고, 상기 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 진핵생물 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 스핑고지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 상동체를 포함하고, 상기 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 가지며,
    상기 인지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 상동체를 포함하고, 상기 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 가지며,
    상기 지질 수송에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 상동체를 포함하고, 상기 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 가지며,
    상기 에르고스테롤 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질은 SEQ ID NO: 12 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 상동체를 포함하고, 상기 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 12 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 목적 단백질을 생산하는 방법:
    - 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 과발현되도록 조작된 숙주세포를 제공하고, 이 숙주세포는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 바람직하게 SEQ ID NO: 1 내지 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖고, 여기서 상기 숙주세포는 목적 단백질을 코딩하는 이종의(heterologous) 폴리뉴클레오타이드를 포함하며;
    - 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체가 과발현되고, 상기 목적 단백질이 발현되기에 적합한 조건 하에서 숙주세포를 배양하고, 선택적으로
    세포 배양액으로부터 상기 목적 단백질을 분리하는 것을 포함하는 목적 단백질을 생산하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나 또는 이들의 기능적 상동체로부터 선택된 지질 대사에 관여하는 단백질 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상이 과발현되고, 여기서 선택적으로 샤페론을 코딩하는 추가의 폴리뉴클레오타이드가 과발현되는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    스핑고지질 생합성에 관여하는 다음의 적어도 하나의 단백질이 과발현되는 방법:
    (a) SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 단백질; 또는
    (b) SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 단백질; 또는
    (c) SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 단백질; 또는
    (d) SEQ ID NO: 1 및 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는, 각각, SEQ ID NO: 1 및 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 단백질; 또는
    (e) SEQ ID NO: 1 및 3으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는, 각각, SEQ ID NO: 1 및 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 단백질; 또는
    (f) SEQ ID NO: 1, 3 및 4로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는, 각각, SEQ ID NO: 1, 3 및 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 단백질; 또는
    (g) SEQ ID NO: 1, 3, 4 및 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는, 각각, SEQ ID NO: 1, 3, 4 및 8로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 단백질; 또는
    (h) SEQ ID NO: 5 및 6으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는, 각각, SEQ ID NO: 5 및 6으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 단백질; 또는
    (i) SEQ ID NO: 1 및 7로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는, 각각, SEQ ID NO: 1 및 7로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 단백질; 또는
    (j) SEQ ID NO: 5, 6 및 9로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는, 각각, SEQ ID NO: 5, 6 및 9로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 단백질; 또는
    (k) SEQ ID NO: 1, 5, 6 및 9로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는, 각각, SEQ ID NO: 1, 5, 6 및 9로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 단백질.
  6. 제4항에 있어서,
    스핑고지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질 및 지질 수송에 관여하는 적어도 하나의 단백질이 과발현되고,
    인지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질 및 지질 수송에 관여하는 적어도 하나의 단백질이 과발현되거나,
    스핑고지질 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질 및 적어도 하나의 샤페론이 과발현되거나,
    에르고스테롤 생합성에 관여하는 적어도 하나의 단백질 및 적어도 하나의 샤페론이 과발현되는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    스핑고지질 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 지질 수송에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는, 각각, SEQ ID NO: 1 및 11로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖거나,
    인지질 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 지질 수송에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는, 각각, SEQ ID NO: 10 및 11로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖거나,
    스핑고지질 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 샤페론은 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는, 각각, SEQ ID NO: 1 및 18로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 포함하거나,
    에르고스테롤 생합성에 관여하는 단백질은 SEQ ID NO: 13, 14 또는 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 샤페론은 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는, 각각, SEQ ID NO: 13 및 18로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 방법.
  8. 목적 단백질의 생산을 위한 재조합 진핵생물 숙주세포로서,
    숙주세포는 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 과발현시키도록 조작되고,
    상기 지질 대사에 관여하는 단백질은 바람직하게 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는, 바람직하게 SEQ ID NO: 1 내지 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12 내지 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인
    목적 단백질의 생산을 위한 재조합 진핵생물 숙주세포.
  9. 진핵생물 숙주세포에서 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 저발현시킴으로써, 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 저발현시키지 않은 숙주세포에 비해 목적 단백질의 수율을 증가시키는 것을 포함하고,
    여기서 상기 지질 대사에 관여하는 단백질은 바람직하게 지질 저장에 관여하는 것인
    진핵생물 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    단백질은 SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는 저발현되는 SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 따른 목적 단백질을 생산하는 방법:
    - 지질 대사에 관여하는 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 저발현되도록 조작된 숙주세포를 제공하고, 이 숙주세포는 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 또는 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖고, 여기서 상기 숙주세포는 목적 단백질을 코딩하는 이종의 폴리뉴클레오타이드를 포함하며;
    - 지질 대사에 관여하는 단백질 또는 이들의 기능적 상동체가 저발현되고, 상기 목적 단백질이 발현되기에 적합한 조건 하에서 숙주세포를 배양하고, 선택적으로
    세포 배양액으로부터 상기 목적 단백질을 분리하는 것을 포함하는 목적 단백질을 생산하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    여기서 단백질은 SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는, 각각, SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인 방법.
  13. 목적 단백질의 생산을 위한 재조합 진핵생물 숙주세포로서,
    숙주세포는 지질 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 저발현(underexpress)하도록 조작되고, 여기서 목적 단백질은 바람직하게 비-막 단백질이며,
    여기서 상기 지질 대사에 관여하는 상기 단백질은 바람직하게 지질 저장에 관여하고, SEQ ID NO: 16 또는 17 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하며, 여기서 기능적 상동체는 SEQ ID NO: 16 및 17 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 것인
    목적 단백질의 생산을 위한 재조합 진핵생물 숙주세포.
  14. 제13항에 있어서,
    지질 대사에 관여하는 다음의 단백질이 저발현되는 숙주세포:
    (a) SEQ ID NO: 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이들의 기능적 상동체를 포함하고, 여기서 기능적 상동체는, 각각, SEQ ID NO: 16 및 17에 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 단백질.
  15. 제1항 내지 제7항 및 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항 또는 제8항, 제13항 또는 제14항에 있어서,
    숙주세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 칸디다 보이디니(Candida boidinii), 코마가텔라 속(Komagataella sp.), 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 및 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)인 방법 또는 숙주세포.
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