KR102291978B1 - 목적 단백질의 발현을 위한 재조합 숙주세포 - Google Patents

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베링거 인겔하임 에르체파우 게엠베하 운트 코 카게
발리도겐 게엠베하
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Abstract

본 발명은 재조합 생명공학, 특히 단백질 발현 분야의 기술이다. 본 발명은 대략적으로 숙주세포로부터 목적 단백질 (protein of interest(POI))을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 목적 단백질을 발현 및/또는 분비할 수 있는 숙주세포의 능력을 향상시키는 것 및 단백질 발현을 위한 숙주세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포 배양 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 식료품 또는 의약적 목적의 분자를 생산하기 위하여 세포를 배양시키는 것에 관한 것이다.

Description

목적 단백질의 발현을 위한 재조합 숙주세포{RECOMBINANT HOST CELL FOR EXPRESSING PROTEIN OF INTEREST}
본 발명은 재조합 생명공학, 특히 단백질 발현 분야의 기술이다. 본 발명은 대략적으로 숙주세포로부터 목적 단백질 (protein of interest(POI))을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 목적 단백질을 발현 및/또는 분비할 수 있는 숙주세포의 능력을 향상시키는 것 및 단백질 발현을 위한 숙주세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포 배양 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 식료품 또는 의약적 목적의 분자를 생산하기 위하여 세포를 배양시키는 것에 관한 것이다.
목적 단백질(POI)의 성공적인 생산은 원핵세포 및 진핵세포 숙주 모두로부터 이루어져 왔다. 가장 널리 알려진 숙주의 예로는 Escherichia Coli와 같은 세균, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris 또는 Hansensula polymorpha와 같은 효모, Aspergillus awamori 또는 Trichoderma reesei와 같은 곰팡이, 또는 CHO 세포와 같은 포유류 세포가 있다. 몇몇 단백질의 수율은 손쉽게 높은 수준에 도달할 수 있었던 반면, 그 밖의 많은 단백질들은 상대적으로 낮은 수준으로 생산되었다.
재조합 단백질의 분비를 향상시키기 위하여, 하나의 전략은 단백질의 접힘 및 프로세싱에 관련된 숙주의 분비 기전을 표적으로 하는 것이다.
이종 단백질의 수율을 증가시키기 위한 수단으로서, 단백질 이황화물 이성질화효소(PDI)를 암호화하는 cDNA 및 이종 이황화-결합 단백질을 암호화하는 cDNA의 동시 발현이 WO 93/25676에서 최초로 제안되었다. WO 93/25676은 안티스타신(antistasin) 및 진드기 항응고 단백질의 재조합 발현은 PDI와의 동시 발현에 의해 증가될 수 있음을 보고하였다.
WO 94/08012는 예를 들어, KAR2/Bip, 또는 PDI 샤페론 단백질과 같은 Hsp70 샤페론 단백질의 발현을 증가시켜 과발현된 단백질의 분비를 증가시키는 방법을 제공하였다.
WO 05/0617818 및 WO 06/067511은 2μm-Based 발현 플라스미드를 이용하여 효소에서 목적하는 이종 단백질의 생산방법을 제공하였다. 이는 하나 또는 그 이상의 샤페론 단백질(들)과 이종 단백질의 유전자를 동일한 플라스미드 상에 동시 발현시킨 경우, 이종 단백질의 수율이 현저하게 증가됨을 입증하였다.
WO 2008/128701 A2는 BMH1, BFR2, COG6, COY1, CUP5, IMH1, KIN2, SEC31, SSA4 및 SSE1 단백질 중 하나를 이용하여 진핵 세포로부터 POI의 분비를 증가시키는 발현 시스템을 기술하였다.
단백질 생산을 증가시키기 위한 다른 접근법은 비접힘 단백질 반응 (UPR)을 활성화하는 전사인자인 HAC1의 과발현에 기초한다. 전사적 분석은 330개 이상의 유전자들이 HAC1에 의해 조절됨을 밝혀냈고, 이들 대다수는 분비 또는 분비 소기관의 발생과 관련되어 있었다. WO 01/72783은 비접힘 단백질 반응 (UPR)의 유도에 의한 진핵 세포로부터 분비되는 이종 단백질의 양을 증가시키는 방법을 기술하였으며, 상기 UPR은 HAC1, PTC2, 및 IRE1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 동시 발현에 의해 조절된다.
Wentz et al.은 적절한 선택압의 적용에 의해 분비가 증진된 균주를 동정하기 위하여 Saccharomyces cerevisiae 효모의 표면 발현된 유전자 라이브러리를 이용하였다. 효모 cDNA인 CCW12, SED1, CWP2, RPP0는 온도 의존적으로 scTCR의 표면발현을 향상시킴을 확인할 수 있었다. ERO1은 20℃에서 유도시킬 때, 단백질 분비를 향상시켰다(Wentz et al., Appl. Environ. Microbiol. (2007) 73(4):1189-1198).
Liu et al.(Biotechnol . Prog. (2006), 22:1090-1095)은 피키아 파스토리스에서 Kar2의 동시-과발현은 rhG-CSF의 발현을 5.6배 증가시킴을 보여주었다. KAR2와 Sec63, PDI1 및 YDJ1의 조합은 2.8, 6.7 및 5.94 배의 증가를 이끌었다. Blatt et al에 의해 실시된 실험에서, KAR2 (BiP)의 동시-과발현은 피키아 파스토리스에서 A33scFv 발현을 2배 증가시켰다. KAR2와 PDI1의 조합은 긍정적인 KAR2의 효과를 거의 없앴다(Blatt et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007, 74:381-389).
Guerfall et al.은 피키아 파스토리스에서 내인성 HAC1 과발현의 효과를 조사하였다. 또한, HAC1은 항시적 및 유도적으로 과발현되었다. 모든 경우에서, 유도된 UPR의 결과로서 증가된 KAR2 발현이 확인되었다. HAC1의 유도적 방법의 과발현은 4번 중 1번의 단백질 분비 증가와, 4번 중 3번의 단백질 분비 감소를 이끌었던 반면, 전장 HAC1의 항시적 과발현은 미약하거나 효과가 전혀 없었다 (Guerfall et al., Microbial Cell Factories, (2010), 9:49).
Sleep et al.에서 LHS-1의 동시-과발현은 rHA의 농도를 증가시킴을 보여주었다. LH1은 SIL1, JEM1 및 SCJ1과 조합되었으나, 농도는 JEM1만 동시-과발현시킨 경우에 비해 낮았다. 동일한 시점에서 SIL1, LHS1 및 JEM1의 동시-과발현은 배양 배지에 의존하여, GM-CSF 발현은 1.45배 증가시켰고, rHA 발현은 약 1.1 및 2배 증가시켰다(Sleep et al. Applied and Environmental Microbiology, (2008) 74(24):7759-7766).
US 2009221030 A1은 트리코더마 레세이에서, 다양한 보조 단백질, 그 중에서도, BIP1의 과발현, 단독 및 다른 보조 단백질 그 중에서도 LHS1과의 조합을 기술하였다. BIP1 단독은 가장 높은 발현량을 얻었으며, 반면 BIP1과 LHS1의 조합은 8% 더 낮은 분비 단백질의 농도로 이어졌다.
US 8,440,456은 피키아 파스토리스의 유전체 서열을 제공하였으며, 신호 단백질, 샤페론 및 프로모터를 암호화하는 염기서열을 개시하였다. 이는 상기 염기서열과 14개의 샤페론들을 과발현시킬 수 있는 유전적으로 조작된 효모를 포함하는 발현 벡터를 개시하였다. 특히, ROT1, SHR3 및 SIL1은 실험을 위해 선별되었으나, SIL1의 발현은 관찰되지 않았고, ROT 또는 SHR3의 과발현은 이종 단백질의 분비를 현저하게 향상시키는데 실패하였다. 보조 단백질을 암호화하는 유전자의 과발현은 목적 단백질 발현의 향상에 일반적으로 적용되는 반면, 단백질을 암호화하는 유전자의 저발현 또는 넉-아웃은 목적 단백질 발현의 향상에 적용되지 않거나 매우 드물게 적용되어왔다.
숙주세포에서 단백질의 높은 수율은 접힘, 이황화 결합의 형성, 당화, 세포 내 수송, 또는 세포로부터의 유리와 같은 하나 또는 그 이상 각각의 단계에서 제한될 수 있다. 숙주 유기체의 전체 유전체 DNA 서열을 이용할 수 있을지라도, 이와 관련된 수많은 기작들은 여전히 완벽하게 이해되지 못하고 있고, 현재 최신의 기술 지식에 기초하여서도 예측될 수 없다.
숙주세포의 목적 단백질 생산 및/또는 분비할 수 있는 능력을 향상시키는 방법에 대한 지속적인 필요가 있었다. 본 발명에 따른 어느 하나의 목적은 간이하고 효율적이며, 산업상으로 적합하게 이용할 수 있는, 숙주세포에서 재조합 단백질의 수율을 증가시키는 새로운 방법을 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 이러한 목적을 달성할 수 있는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명에서 사용된 단수 형태, "한(a)", "한(an)" 및 "그(the)"는 문맥상 명백히 다르게 명시하지 않는 한 복수 형태를 포함함을 주지해야 한다. 따라서, 예를 들어, "숙주세포 (a host cell)" 또는 "방법 (a method)"는 하나 또는 그 이상의 숙주세포 또는 방법을 각각 포함하고, "그 방법(the method)"은 여기에서 기술된 그 방법으로부터 변형 또는 치환될 수 있는 것으로 업계에서 통상의 기술자에게 알려진 동등한 단계 및 방법을 포함한다. 이와 유사하게, "방법들 (methods)" 또는 숙주세포들 (host cells)"은 "숙주세포 (a host cell)" 또는 방법 (a method)를 각각 포함한다.
달리 명시하지 않으면, 일련의 요소들의 앞에 오는 용어 "적어도"는 일련의 매 요소를 지칭하는 것으로 이해된다. 당업자는 더 이상의 통상적 실험을 하지 않고도 여기에서 기술된 본 발명의 구현예에 대한 많은 균등물들을 인지하거나 알아낼 수 있을 것이다. 이와 같은 균등물들은 본 발명에 포함되는 것으로 본다.
용어 "및/또는"은 어디에서 사용되는지에 관계없이 "및", "또는" 및 "상기 용어에 연결되는 모든 요소 또는 요소들의 다른 어떤 조합"의 의미를 포함한다. 예를 들어, A, B, 및/또는 C는 A, B, C, A+B, A+C, B+C, 및 A+B+C를 의미한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 ±20% 이내, 바람직하게는 ±10% 이내, 더욱 바람직하게는 ±5% 이내를 의미한다. 그 지정된 숫자도 포함한다. 예를 들면 약 20은 20을 포함한다.
용어 "이하" 또는 "이상"은 지정된 숫자를 포함한다. 예를 들어, 20 이하는 20보다 적거나 같음을 의미하고, 20 이상은 20보다 많거나 같음을 의미한다.
이하 본 발명의 명세서와 청구범위에 달리 명시가 없다면, 용어 "포함하다(comprise, comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 다른 용어는 정해진 정수(integers) 또는 단계 또는 정수 그룹 또는 단계들뿐 아니라, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 그룹 또는 단계들도 포함함을 내재하고 있는 것으로 이해되어야 할 것이다. 본 발명에서 사용된 용어 "포함하는(comprising)"은 "함유하는(containing)" 또는 "포함하는(including)"으로 치환되어 사용될 수 있거나 때때로 용어 "가진(having)"으로 사용될 수 있다. 본 발명에서 "로 구성된(consisting of)"이 사용되는 경우, 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 제외한다. 본 발명에서 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"이 사용되는 경우, 실질적으로 청구항의 기본적이고 신규한 특성에 영향을 주지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 본 발명에서 각각의 경우에, 용어 "포함하는(comprising)", "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)" 및 "구성되는(consisting of)" 중 어느 하나는 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다.
또한, 본 발명에서 기술된 대표적인 구현예에서, 본 명세서는 본 발명의 방법 및/또는 과정을 특정 단계의 배열로 나타낼 수 있다. 그러나 상기 방법 또는 과정의 범위는 하기 기술된 특정 단계의 순서에 의존하는 것은 아니고, 상기 방법 또는 순서는 특정 단계의 배열에 한정되는 것은 아니다. 당업계의 일반적인 기술로 평가된 바와 같이, 단계의 다른 배열도 가능할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 특정 단계의 순서는 청구범위의 제한으로서 구축된 것이 아니다. 추가적으로, 본 발명의 방법 및/또는 과정에 관한 청구범위에 기재된 순서는 이들 단계의 수행을 제한하는 것은 아니며, 당업계의 일반적인 기술은 본 발명의 사상 및 범위를 여전히 유지하면서, 손쉽게 이들의 배열을 변형시킬 수 있도록 평가할 수 있다.
또한, 본 발명은 특히 본 발명에 기술된 방법론, 프로토콜, 재료, 시약 및 물질 등에 제한되지 않고 달라질 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위한 것이며, 청구항에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 명세서의 전반에 걸쳐 인용된 모든 출판물 및 특허문헌(모든 특허 문헌, 특허 출원, 과학 출판물, 제조업체의 사양, 설명서 등)은 본 명세서에 그 전체가 참조로 포함된다. 본 명세서의 어떠한 기재도 선행 발명에 의해 본 발명이 그러한 공개보다 선행할 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석될 수 없다. 참조로 인용된 자료가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 한도 내에서, 본 명세서가 이러한 자료를 대체할 것이다.
본 발명은 KO1, KO2, KO3 (또한 각각 KO 단백질 1, KO 단백질 2, KO 단백질 3로 나타냄) 및 이의 기능적 상동체를 포함하는, 다양한 단백질 (넉아웃(KO) 단백질로 나타냄)의 발현은 숙주세포에서 POI의 수율에 부정적 영향을 미친다는 놀라운 발견에 기초하였다. 기능적 상동체의 의미는 본 출원의 후단에 정의되었다. 또한 변이 또는 결실과 같은 유전자의 변형은 POI의 수율을 증가시킴을 발견하였다. 본 발명은 숙주세포를 조작하여 POI의 수율을 향상시킴에 유용한 방법 및 물질을 제공하며, 이들은 새롭게 동정된 유전자를 저발현하도록 세포를 조작한다. 용어 "수율"은 본 발명에서 기술된 POI 또는 모델 단백질(들)의 양을 나타내며, 특히 SDZ-Fab (서열번호 25 및 26) 및 HyHEL-Fab (서열번호 29 및 30) 각각, 이들은, 예를 들어, 조작된 숙주세포로부터 수득되고, 증가된 수율은 상기 숙주세포의 증가된 POI의 생산 또는 분비의 양에 기인할 수 있다. 수율은 mg POI/g 숙주세포의 바이오매스 (세포 건조 중량 또는 세포 습윤 중량으로 측정)로 나타낼 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "농도"는 생산된 POI 또는 모델 단백질의 양과 유사한 의미를 나타내며, mg POI/ L 배양물의 상청액으로 나타낼 수 있다. 수율의 증가는 조작되기 전의 숙주세포, 예를 들어, 비-조작된 숙주세포로부터 얻은 수율과 조작된 숙주세포로부터 얻은 수율을 비교하여 확인될 수 있다.
바람직하게, 본 발명에서 기술된 모델 단백질에 대한 문단에서 사용된 "수율은 실시예 5c에 기술된 바와 같이 확인된다. 따라서, 본 발명에서 기술된 모델 단백질에 대한 문단에서 사용된 "수율"은 또한 "Fab 수율" 또는 "Fab 농도"를 나타낸다. Fab 농도는 mg/L로, Fab 수율은 mg/g 바이오매스(세포 건조 중량 또는 세포 함수 중량으로 측정)로 주어진다.
간략하게, 모델 단백질 HyHEL-Fab 및 SDZ-Fab을 발현하는 피키아 파스토리스 균주 CBS7435mutS pPM2d_pAOX HyHEL 및/또는 CBS7435mutS pPM2d_pAOX SDZ (이들의 제조는 실시예 1 참고) 각각은 본 발명에서 기술된 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 조작되었다. 동시-과발현을 위해, 보조 단백질을 암호화하는 상기 유전자는 피키아 파스토리스 GAP 프로모터의 조절 하에서 복제되었고, 실시예 4에서 기술된 바와 같이 Fab를 생산하는 균주로 형질전환되었다. 저발현을 위해, Fab를 생산하는 균주의 유전체에서 KO 표적을 암호화하는 유전자 또는 이의 기능적 상동체는 넉아웃 (Knocked out)되었다 (실시예 6 참고). 조작된 세포는 10g/L 글리세롤 및 50㎍/ml 지오신(Zeocin)을 함유하는 YP-배지에서 25℃로 밤새도록 배양되었다 (실시예 5a 참고). 이러한 배양물의 부분표본 (2.0의 최종 OD600에 상응)은 20g/L 포도당 및 포도당 정제를 함유하는 합성 M2 배지로 옮겨지고 (실시예 5a에 기술), 25℃에서 25시간 동안 인큐베이션되었다. 배양물은 세척되고 합성 M2 배지에서 재부유되었으며, 이의 부분표본 (4.0의 최종 OD600에 상응)은 5g/L 메탄올이 첨가된 합성 M2 배지로 옮겨졌다. 메탄올(5g/L)은 12시간 마다 3번씩 첨가되었다. 48시간 후, 원심분리에 의해 세포를 수득하였다. 바이오매스는 1mL 세포 현탁액으로부터 유래한 세포 펠릿의 중량을 측정하여 확인되었다. 상청액은 각각 ELISA를 통해 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab를 정량화하는데 이용되었다. 특히, 항-인간 IgG 항체 (예를 들어, ab7497 Abcam)는 코팅 항체로 이용되었고, 예를 들어, 염소 항-인간 항-인간 IgG (Fab 특이적) 항체 (예를 들어, Sigma A8542, 알칼라인 포스파타제가 결합됨)는 검출 항체로 이용되었다. 상용화된 인간 Fab/Kappa, IgG 단편은 시험 표준으로서, 100ng/ml의 시작 농도로 이용되었고, 결과적으로, 상청액 샘플은 희석되었다. 수율의 증가는 KO 단백질을 암호화하는 폴리펩티드를 저발현하도록 세포를 조작하기 전 및 후, 목적 단백질 수율의 비교에 기초하여 확인될 수 있다. 본 실시예에서 보여주고 있는, 모델 단백질 SDZ-Fab 및/또는 HyHEL-Fab 관련 표준 시험은 수율의 차이를 확인하는데 이용될 수 있다.
본 발명은, 이에 제한되는 것은 아니나, 하기 본 발명자들에 의해 발견된 넉아웃 단백질에 기초한다.
[표 1]
Figure 112016112217397-pct00001
본 발명은 하나 또는 그 이상의 저발현된 KO 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는, 조작된 재조합 숙주세포를 제공한다. 본 발명에서 사용되는, "조작된" 숙주세포는 유전자 조작, 예를 들어 인간의 개입을 이용하여 조작된 숙주세포이다. 숙주세포가 주어진 단백질을 "저발현하도록 조작된" 경우, 숙주세포는 저발현이 달성되도록 유전자 조작 전의 동일한 조건 하에서 숙주세포에 비해 기능적 KO 단백질의 발현 수준이 감소되도록 조작된다. 상기 유전적 조작을 실시한 숙주세포는 적어도 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 1개, 예를 들어 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 유전적 조작은 KO 단백질을 암호화하는 유전자의 저발현을 일으킨다. 바람직하게, 이러한 조작은 세포가 검출될 수 없는 수준의 KO 단백질(들)을 갖도록 한다. 저발현은 전술한 조작되기 전의 숙주세포를 나타내는 "상응하는 모 균주"와 조작된 숙주세포간 비교에 의해 관찰될 수 있다. 본 발명에서 사용된 KO 단백질은 복수 또는 단수의 형태로서, 상호 교환적이고, 다른 언급되지 않는 한, 명시적으로 달리 언급하지 않는 한, 단수 형태로 이해되어야 한다.
넉-아웃되는 유전자와 관련하여- 샤페론 (KO2, KO3) 유래 유전자는 과발현이 이로울 것으로 예상되어왔으나, 실제, 긍정적인 효과를 지니는 것은 결실이었다.
KO1은 빵의 효모에서 응집시키는 역할을 하는바, 상기 KO1의 결실이 단백질 분비를 향상시킨다는 점은 예상할 수 없었다. 빵의 효모에서 응집은 영양 생장 단계에서 가역적으로 세포가 응집하는 현상으로서, 접합 (mating)과는 관련이 없다.
첫 번째 양태로서, 본 발명은 목적 단백질을 제조하기 위한 재조합 숙주세포를 제공하며, 상기 숙주세포는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작되어 있고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 적어도 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다.
상기 재조합 숙주세포는 우선 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 제공하며, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 적어도 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖고, 이후, 상기 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 상기 숙주세포를 조작한다.
바람직한 구현예로서, 상기 숙주세포는 효모세포이고, 바람직하게 피키아 종의 숙주세포, 및 보다 바람직하게 본 발명의 KO 단백질을 포함하지 않거나 및/또는 KO 단백질(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않은 피키아 파스토리스이다. 한 구현예로서, 상기 숙주세포는 서열번호 22, 23, 24로 표시되는 폴리뉴클레오티드가 결실되어 수득되거나, 이의 상동체이다.
본 발명에서 사용되는 용어, 폴리펩티드의 "상동체" 또는 "기능적 상동체"는 이들의 일차, 이차, 삼차 구조에서 상응하는 위치에 동일하거나 보존되는 잔기를 갖는 폴리펩티드를 의미하는 것일 수 있다. 상기 용어는 상동체 폴리펩티드를 암호화하는 둘 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 확장될 수도 있다. 특히, 본 발명에서 기술된 KO1, KO2 및 KO3에 대한 폴리펩티드 상동체는 본연의 전장 서열 또는 이들의 어떤 단편에 관하여 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 상동성을 갖는다. 바람직하게, 상동성 폴리펩티드는 본연의 복합체(compound) 또는 전장 복합체의 구체적으로 한정된 어느 하나의 단편과 적어도 35% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 40% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 45% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 50% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 55% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 60% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 65% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 70% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 75% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 80% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 85% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 아미노산 서열 상동성과 같이 적어도 90% 아미노산 서열 상동성, 보다 바람직하게 95% 아미노산 서열 상동성을 갖는다. KO1, KO2, 및 KO3 단백질로서의 기능이 이러한 상동체로 증명된 경우, 상기 상동체는 "기능적 상동체"로 명명된다. 기능적 상동체는 상기 보조 단백질로서 동일하거나 실질적으로 동일한 기능, 예를 들어, 본 발명에서 기술한 바와 같이, 모델 단백질 SDZ-Fab 및/또는 HyHEL-Fab의 수율을 증가시키는 기능을 수행한다. 상기 기능은 당업계에서 알려진 어세이 또는 바람직하게 실시예 7에 기술한 모델 단백질을 이용한 어세이, 또는 실시예 5c, 특히, "Fab 농도" 또는 "Fab 수율"의 문단에서 기술한 방법에 의해 테스트될 수 있다.
잠재적인 기능적 상동체의 기능은 기능적으로 동등한 변이 서열이 삽입된 발현 카세트를 제공하고, 실시예에서 사용되는 모델 단백질 중 하나 또는 구체적인 POI와 같은 테스트 단백질을 암호화하는 서열을 전달하는 숙주세포로 형질전환하며, 동일한 조건에서 모델 단백질 또는 POI 수율의 차이를 확인함으로써 테스트될 수 있다.
한 구현예로서, 상기 숙주세포는 KO 단백질 1을 저발현하도록 조작된다. 상기 숙주세포는 바람직하게 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작되어 있고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다.
또 다른 구현예로서, 상기 숙주세포는 KO2를 저발현하도록 조작된다. 상기 숙주세포는 바람직하게 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작되어 있고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다.
추가적인 구현예로서, 상기 숙주세포는 KO3을 저발현하도록 조작된다. 상기 숙주세포는 바람직하게 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작되어 있고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다.
본 발명은 서열번호 22, 서열번호 23, 또는 서열번호 24를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하며, 또한, 본 발명은 서열번호 10, 11, 12 중 하나를 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 몇몇의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 22, 23, 24로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 보다 바람직하게, 상기 분리된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24와 100% 서열 상동성을 갖는다.
또한, 본 발명은 서열번호 10, 11, 12 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 이의 기능적 상동체를 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 바람직하게, 본 발명은 서열번호 10의 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드 또는 이의 기능적 상동체를 제공한다. 바람직하게, 본 발명은 서열번호 11의 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드 또는 이의 기능적 상동체를 제공한다. 바람직하게, 본 발명은 서열번호 12의 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드 또는 이의 기능적 상동체를 제공한다. 추가적인 양태로서, 본 발명은 서열번호 10, 11, 또는 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 폴리펩티드 서열 상동성을 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 DNA 또는 RNA를 나타낸다. "핵산 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드 서열" 또는 간단히 "폴리뉴클레오티드"는 5'에서 3'으로 리딩되는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 염기의 단일 또는 이중-가닥 폴리머를 나타낸다. 이는 자가-복제 플라스미드, DNA 또는 RNA의 감염성 폴리머, 또는 비-기능적 DNA 또는 RNA를 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오티드 발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되고, 상기 mRNA가 폴리펩티드로 번역되는 경우를 의미한다. 용어 "저발현하다"는 일반적으로 KO 단백질을 저발현하도록 조작하기 전의 숙주세포인, 참고 표준에서 관찰되는 발현 수준에 비해 그 발현 양이 감소한 경우를 나타낸다. 본 발명에서 용어, "저발현하다", "저발현하는", "저발현되는" 및 "저발현"은 유전자 산물 또는 폴리펩티드의 발현이 유전적 변형 전의 숙주세포 또는 유전적으로 변형되지 않은 비교 가능한 숙주세포의 동일한 유전자 산물 또는 폴리펩티드의 발현에 비해 낮은 수준인 경우를 나타낸다. "보다 적은"은 예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80, 90% 또는 그 이상을 포함한다. 유전자 산물 또는 폴리펩티드의 비 발현 또한 용어 "저발현"에 포함된다.
숙주세포는 KO 단백질 1 또는 이의 기능적 상동체를 발현하는 세포를 제공하고, KO 단백질 1을 암호화하는 유전자를 저발현하도록 세포를 조작하여 수득될 수 있다. 상기 숙주세포는 또한 KO 단백질 2 또는 이의 기능적 상동체를 발현하는 세포를 제공하고, KO 단백질 2를 암호화하는 유전자를 저발현하도록 세포를 조작하여 수득될 수 있다. 또한 상기 숙주세포는 또한 KO 단백질 3 또는 이의 기능적 상동체를 발현하는 세포를 제공하고, KO 단백질 3을 암호화하는 유전자를 저발현하도록 세포를 조작하여 수득될 수 있다.
바람직한 구현예로서, 상기 KO 단백질 1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작되기 전의 숙주세포에 비해, 상기 KO 단백질 1이 저발현된 경우, 숙주세포 내 모델 단백질 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab의 생산은 적어도 1%, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 적어도 200% 또는 그 이상 증가할 수 있다. 놀랍게도, 실시예에 기술된 예시적인 재조합 숙주세포는 모델 단백질 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab 모두의 수율을 적어도 20% (1.2 배) 증가시킬 수 있었다.
바람직한 구현예로서, 상기 KO 단백질 2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작되기 전의 숙주세포에 비해, 상기 KO 단백질 2가 저발현된 경우, 숙주세포 내 모델 단백질 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab의 수율은 적어도 1%, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 적어도 200% 또는 그 이상 증가할 수 있다. 놀랍게도, 실시예에 기술된 예시적인 재조합 숙주세포는 모델 단백질 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab 모두의 수율을 적어도 20% (1.2 배) 증가시킬 수 있었다.
바람직한 구현예로서, 상기 KO 단백질 3을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작되기 전의 숙주세포에 비해, 상기 KO 단백질 3이 저발현된 경우, 숙주세포 내 모델 단백질 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab의 수율은 적어도 1%, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 적어도 200% 또는 그 이상 증가할 수 있다. 놀랍게도, 실시예에 기술된 예시적인 재조합 숙주세포는 모델 단백질 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab 모두의 수율을 적어도 20% (1.2 배) 증가시킬 수 있었다.
세 번째 양태로서, 본 발명은 목적 단백질을 제조하기 위한 본 발명에서 기술된 재조합 숙주세포 중 어느 하나의 용도를 제공한다.
네 번째 양태로서, 본 발명은 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현시키는 것을 포함하는, 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증진시키는 방법을 제공하며, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다.
바람직하게, 상기 방법은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현시키는 것을 포함하며, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다.
바람직하게, 상기 방법은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현시키는 것을 포함하며, 상기 기능적 상동체는 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다.
바람직하게, 상기 방법은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현시키는 것을 포함하며, 상기 기능적 상동체는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다.
다섯 번째 양태로서, 본 발명은
- 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나, 예를 들어 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작하고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖으며,
- 상기 숙주세포에서 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 재조합하고, 및
- 목적 단백질을 발현하도록 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는, 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
단백질의 수율을 증진시키는 방법의 문단에서, "조작하는 단계" 및 "재조합하는 단계"의 순서는 "재조합하는 단계"가 "조작하는 단계"보다 앞서듯이 선택적으로 바뀔 수 있다. 특히, 본 발명에서 기술한 바와 같이, 목적 단백질의 수율은 KO 단백질이 저발현되거나 및/또는 보조 단백질이 과발현될 때, 증가된다.
조작하는 단계 및 재조합하는 단계는 반드시 언급된 순서에 의해 수행되어야만 하는 것은 아니다. 다른 순서로 상기 단계를 수행하는 것은 가능하다.
바람직하게, 본 발명은
- 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작하고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖으며,
- 상기 숙주세포에서 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 재조합하고, 및
- 목적 단백질을 발현하도록 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는, 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
바람직하게, 본 발명은
- 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작하고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖으며,
- 상기 숙주세포에서 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 재조합하고, 및
- 목적 단백질을 발현하도록 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는, 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
바람직하게, 본 발명은
- 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작하고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖으며,
- 상기 숙주세포에서 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 재조합하고, 및
- 목적 단백질을 발현하도록 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는, 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
여섯 번째 양태로서, 본 발명은
- 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나, 예를 들어 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작된 숙주세포를 제공하고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖으며, 상기 숙주세포는 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 및
- 목적 단백질을 발현하도록 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는, 숙주세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 본 발명은
- 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작된 숙주세포를 제공하고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖으며, 상기 숙주세포는 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 및
- 목적 단백질을 발현하도록 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는, 숙주세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 본 발명은
- 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작된 숙주세포를 제공하고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖으며, 상기 숙주세포는 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 및
- 목적 단백질을 발현하도록 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는, 숙주세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 본 발명은
- 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작된 숙주세포를 제공하고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖으며, 상기 숙주세포는 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 및
- 목적 단백질을 발현하도록 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는, 숙주세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 KO1, KO2, 및 KO3 유전자 중 2개 또는 전부의 저발현을 포함한다. 본 발명은 또한 목적 단백질을 제조하기 위한 재조합 숙주세포도 포함하며, 상기 숙주세포는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 상동체를 암호화하는 적어도 2개, 3개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작되어 있고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%의 서열 상동성을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 그 이상의 서열번호 10, 11, 또는 12로부터 선택되는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체는 숙주세포에서 저발현된다. 기능적 상동체는 상기 KO 단백질의 생물학적 활성 단편일 수 있다. 일반적으로, 단백질의 생물학적 활성 단편은 전장 단백의 기능적 효과와 유사하거나 비교할 수 있는 효과를 지는 단편을 의미한다. 이러한 단편 또는 변이체는 내부 결실뿐만 아니라 아미노- 및/또는 카르복시 말단 결실에 의해 생산될 수 있다.
1. 목적 단백질을 제조하기 위한 재조합 숙주세포로서, 상기 숙주세포는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작되어 있고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%의 서열 상동성을 갖는 것인, 숙주세포.
2. 상기 1 항목의 숙주세포로서, 여기에서 바람직하게 상기 KO 단백질 또는 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 저발현된 경우, 조작하기 전의 숙주세포에 비해 모델 단백질 SDZ-Fab(서열번호 25 및 26) 및/또는 HyHEL-Fab(서열번호 29 및 30)의 수율을 적어도 20% 증가시키는 것인, 숙주세포.
3. 상기 1 또는 2 항목의 숙주세포로서, 상기 저발현은 상기 숙주세포의 유전체로부터 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 넉아웃시켜 달성되는 것인, 숙주세포.
4. 상기 1 또는 2 항목의 숙주세포로서, 상기 저발현은 상기 숙주세포 내 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 파괴시켜 달성되는 것인, 숙주세포.
5. 상기 1 또는 2 항목의 숙주세포로서, 상기 저발현은 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 프로모터를 파괴시켜 달성되는 것인, 숙주세포.
6. 상기 1 또는 2 항목의 숙주세포로서, 상기 저발현은 전사후 유전자 억제(post-transcriptional gene silencing)에 의해 달성되는 것인, 숙주세포.
7. 앞선 항목들 중 어느 하나의 숙주세포로서, 상기 숙주세포는 피키아 파스토리, 한세눌라 폴리모르파, 트리코더마 레세이, 사카로마이세스 세레비지애, 클루이베로마이세스 락티스, 야로위아 리포리티카, 피키아 메탄올리카, 캔디다 보이디니이, 및 코마가타엘라, 및 스키조사카로마이세스 폼베인, 숙주세포.
8. 앞선 항목들 중 어느 하나의 숙주세포로서, 상기 목적 단백질은 효소, 치료 단백질, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제, 바람직하게, 해독 효소인, 숙주세포.
9. 상기 8 항목의 숙주세포로서, 상기 치료 단백질은 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 숙주세포.
10. 앞선 항목들 중 어느 하나의 숙주세포로서, 여기에서 바람직하게 상기 KO 단백질 또는 기능적 상동체가 저발현된 경우, 조작하기 전의 숙주세포에 비해 모델 단백질 SDZ-Fab(서열번호 25 및 26) 및/또는 HyHEL-Fab(서열번호 29 및 30)의 수율을 적어도 20% 증가시키는 것인, 숙주세포.
11. 앞선 항목들 중 어느 하나의 숙주세포로서, 상기 숙주세포는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현하고, 목적 단백질을 발현하는, 숙주세포.
12. 앞선 항목들 중 어느 하나의 숙주세포로서, 상기 숙주세포는 보조 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 숙주세포.
13. 상기 12 항목의 숙주세포로서, 상기 보조 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 162로 표시되는 아미노산 서열 갖거나 이의 기능적 상동체이고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 162로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는, 숙주세포.
14. 상기 12 또는 13 항목의 숙주세포로서, 상기 숙주세포는 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 발현 또는 과발현하도록 조작되어 있는, 숙주세포.
15. 앞선 청구항들 중 어느 하나의 숙주세포로서, 상기 숙주세포는
(ⅰ) 서열번호 10으로 표시되는 아미노산을 갖는 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하고, 추가적으로 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체, 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 과발현하도록 조작되거나, 또는
(ⅱ) 서열번호 10으로 표시되는 아미노산을 갖는 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하고, 추가적으로 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체, 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 과발현하도록 조작된 것인, 숙주세포.
16. KO 단백질 1 또는 이의 기능적 상동체를 발현하는 세포를 제공하고, 및 KO1을 암호화하는 유전자를 저발현하도록 상기 세포를 조작하여 수득한 숙주세포.
17. KO 단백질 2 또는 이의 기능적 상동체를 발현하는 세포를 제공하고, 및 KO2를 암호화하는 유전자를 저발현하도록 상기 세포를 조작하여 수득한 숙주세포.
18. KO 단백질 3 또는 이의 기능적 상동체를 발현하는 세포를 제공하고, 및 KO3을 암호화하는 유전자를 저발현하도록 상기 세포를 조작하여 수득한 숙주세포.
19. 목적 단백질의 제조를 위한 앞선 항목들 중 어느 하나의 숙주세포의 용도.
20. 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증진시키는 방법으로서, 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현시키는 것을 포함하고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%의 서열 상동성을 갖는 것인, 방법.
21. 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증진시키는 방법으로서,
- 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작하고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%의 서열 상동성을 갖는 것이며,
- 상기 숙주세포에서 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 재조합하고,
- 목적 단백질을 발현하도록 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하고, 선택적으로
- 상기 세포 배양물로부터 목적 단백질을 분리하는 것을 포함하는, 방법.
22. 숙주세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법으로서,
- 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작된 숙주세포를 제공하고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%의 서열 상동성을 갖는 것이며, 여기에서 상기 숙주세포는 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고;
- 목적 단백질을 발현하도록 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하고, 및 선택적으로
- 상기 세포 배양물로부터 목적 단백질을 분리하는 것을 포함하는, 방법.
23. 상기 20-22 항목들 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 저발현은 상기 숙주세포의 유전체로부터 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 넉아웃시켜 달성되는 것인, 방법.
24. 상기 20-22 항목들 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 저발현은 상기 숙주세포 내 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 파괴시켜 달성되는 것인, 방법.
25. 상기 20-23 항목들 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 저발현은 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 프로모터를 파괴시켜 달성되는 것인, 방법.
26. 상기 20-24 항목들 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 저발현은 전사후 유전자 억제, 바람직하게, KO 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 유래 전사체와 결합하는 이종 RNA 서열의 발현에 의해 달성되는 것인, 방법.
27. 상기 20-26 항목들 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 숙주세포는 상기 숙주세포는 피키아 파스토리, 한세눌라 폴리모르파, 트리코더마 레세이, 사카로마이세스 세레비지애, 클루이베로마이세스 락티스, 야로위아 리포리티카, 피키아 메탄올리카, 캔디다 보이디니이, 및 코마가타엘라, 및 스키조사카로마이세스 폼베인, 방법.
28. 상기 20-27 항목들 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 목적 단백질은 효소, 치료 단백질, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제, 바람직하게, 해독 효소인, 방법.
29. 상기 28 항목의 방법으로서, 상기 치료 단백질은 항체 또는 항체 단편인, 방법.
30. 상기 20-29 항목들 중 어느 하나의 방법으로서, 여기에서 바람직하게 상기 KO 단백질 또는 기능적 상동체가 저발현된 경우, 조작하기 전의 숙주세포에 비해 모델 단백질 SDZ-Fab(서열번호 25 및 26) 및/또는 HyHEL-Fab(서열번호 29 및 30)의 수율을 적어도 20% 증가시키는 것인, 방법.
31. 상기 20-30 항목들 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 숙주세포는 적어도 하나의 보조 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
32. 상기 31 항목의 방법으로서, 상기 보조 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 162로 표시되는 아미노산 서열 갖거나 이의 기능적 상동체이고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 162로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는, 방법.
33. 상기 31 또는 32 항목들 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 숙주세포는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 162로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 발현 또는 과발현하도록 조작되고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 162로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는, 방법.
34. 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%의 목적 단백질 및 항목 13에서 정의된 보조 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물로서, 여기에서 상기 폴리뉴클레오티드는 이종 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 것인. 방법.
도 1은 HP1, HP2, HP 3, HP 4, HP5, HP6, HP7, HP8, HP9, HP10, KO1, KO2 및 KO3의 아미노산 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 2는 모델 단백질 SDZ-Fab 및 HyHEL-Fab의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열을 각각 나타낸다.
본 발명은 숙주세포에서의 KO1, KO2 및/또는 KO3의 조작에 관한 것이다. 상기 조작된 숙주세포는 발현된 목적 단백질을 생산할 수 있는 능력이 증가됨을 놀랍게도 발견하였다.
첫 번째 양태로서, 본 발명은 목적 단백질을 제조하기 위한 재조합 숙주세포를 제공하며, 상기 숙주세포는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나, 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작되어 있고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는다.
본 발명의 목적상, 용어 "KO 단백질"은 KO1, KO2, 또는 KO3의 기능적 상동체 역시 포함하는 것으로 의미된다.
KO 단백질 1
빵 효모 내 FLO8의 기능은 이배체의 균사형(filamentously) 성장 및 반수체의 침습적인 성장 및 응집을 위해 필요로 하는 전사적 활성자로 추측된다. 다만, 이러한 단백질이 효모 또는 다른 숙주세포에서 단백질 산물의 증가된 수율로 이어질 수 있다는 점은 전혀 시사하고 있지 않다.
KO 단백질 2
빵 효모 내 KO2는 공-샤페론 HCH1을 암호화한다. 몇몇 효모 내 HCH1은 Hsp90 기능을 조절한다 (Armstrong et al., PLoS One. 2012;7(11):e49322.) 다만, 이러한 단백질의 저발현이 숙주세포에서 POI의 증가된 수율로 이어질 수 있다는 점은 전혀 시사하고 있지 않다.
KO 단백질 3
빵 효모 내 KO 3은 세균성 샤페론 DnaJ의 여러 상동체 중 하나를 암호화한다. 다만, 이러한 단백질의 저발현이 숙주세포에서 POI의 증가된 수율로 이어질 수 있다는 점은 전혀 시사하고 있지 않다.
샤페론 (KO2, KO3) 유래 유전자는 과발현이 이로울 것으로 예상되어왔으나, 실제, 긍정적인 효과를 지니는 것은 결실이었다. KO1은 빵의 효모에서 응집시키는 역할을 하는바, 상기 KO1의 결실이 단백질 분비를 향상시킨다는 점은 예상할 수 없었다. 빵의 효모에서 응집은 이배체인 빵의 효모가 균사형으로(filamentously) 성장하거나, 반수체인 세포가 침습적인 성장하는 현상으로서, 이들 세포가 응집한다. 그러나 숙련된 기술자도 응집 유전자의 넉-아웃이 단백질 분비를 증진시킨다고 추정할 수 없다.
"서열 상동성" 또는 "상동성"은 표준화된 알고리즘을 이용하여 정렬된 적어도 두 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이에 일치하는 잔기의 퍼센트를 나타낸다. 이러한 알고리즘은 두 서열간 정렬을 최적화하기 위하여 표준화, 및 재현할 수 있는 방식으로 비교되는 서열간 차이를 삽입할 수 있고, 따라서 보다 의미있는 상기 두 서열의 비교를 이룰 수 있게 한다. 본 발명의 목적상, 두 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드간 서열 상동성은 NCBI BLAST program version 2.2.29 (Jan-06-2014) (Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402)에 의해 결정된다. 두 아미노산 서열의 서열 상동성은 하기 파라미터의 blastp 세트에 의해 확인된다: Matrix: BLOSUM62, Word Size: 3; Expect value: 10; Gap cost: Existence = 11, Extension = 1; Filter = low complexity activated; Filter String: L; Compositional adjustments: 조건적인 구성적 스코어 메트릭스 조정. 본 발명의 목적상, 두 뉴클레오티드 서열간 서열 상동성은 하기 예시적인 파리미터에서 blastn 세트의 NCBI BLAST program version 2.2.29 (Jan-06-2014)를 이용하여 확인된다: Word Size: 11; Expect value: 10; Gap costs: Existence = 5 , Extension = 2; Filter = low complexity activated; Match/Mismatch Scores: 2,-3; Filter String: L; m.
숙주세포
본 발명에서 사용되는 "숙주세포"는 단백질의 발현 및 선택적으로 단백질의 분비를 할 수 있는 세포를 나타낸다. 이러한 숙주세포는 본 발명의 방법에 적용된다. 이러한 목적, 즉 숙주세포에서 폴리펩티드를 발현하기 위하여, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 세포에 존재하거나 도입된다. 본 발명에 따른 숙주세포는 원핵 또는 진핵세포일 수 있다. 당업계에서 평가되고 있는 바와 같이, 원핵세포는 핵 부근의 막 (핵막)이 부족한 반면, 진핵세포는 핵막을 가지고 있다. 진핵세포의 예시로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 척추동물 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 동물 세포, 비척추동물 세포, 식물 세포, 선충류 세포, 곤충 세포, 줄기 세포, 곰팡이 세포, 효모 세포를 포함한다.
효모 세포의 예로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 사카로미케스 종 (예를 들어, 사카로미케스 세레비지애, 사카로미케스 클루이베리, 사카로미케스 우바륨), 코마가타엘라 종 (코마가타엘라 파스토리스, 코마가타엘라 슈도파스토리스, 또는 코마가타엘라 파피), 클루이베로마이세스 종 (예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스), 캔디다 종 (캔디다 유틸리스, 캔디사 카카오이), 지오트리쿰 종 (예를 들어, 지오트리쿰 퍼멘탄스) 뿐만 아니라 한세눌라 폴리모르파 및 야로위아 리포리티카를 포함한다.
상기 피키아 종은 특히 흥미롭다. 피키아는 피키아 파스토리스, 피키아 메탄올리카, 피키아 클루이베리, 및 피키아 안구스타를 포함하는 수많은 종을 포함한다. 가장 바람직하게는 피키아 파스토리스이다.
전술한 피키아 파스토리스는 다시 나뉘어지며, 코마가타엘라 파스토리스 및 코마가타엘라 파피로 다시 명명된다. 따라서 피키아 파스토리스는 코마가타엘라 파스토리스 및 코마가타엘라 파피 모두와 동일한 것을 의미한다.
본 발명에서 유용한 피키아 파스토리스 균주의 예시로는 X33 및 이의 아형들 GS115, KM71, KM71H; CBS7435 (mut+) 및 이의 아형들 CBS7435 muts, CBS7435 mutsΔArg, CBS7435 mutsΔHis, CBS7435 mutsΔArg, ΔHis, CBS7435 muts PDI+, CBS 704 (=NRRL Y-1603 = DSMZ 70382), CBS 2612 (=NRRL Y-7556), CBS 9173-9189 및 DSMZ 70877 뿐만 아니라 이들의 변이체들이 있다.
에스체리키아 콜리의 예시로는 에스체리키아 콜리 K12 균주로부터 유래하는 것을 포함하며, 구체적으로, HMS 174, HMS174 (DE3), NM533, XL1-Blue, C600, DH1, HB101, JM109 뿐만 아니라, B-균주로부터 유래한 것, 구체적으로 BL-21, BL21 (DE3) 등을 포함한다.
추가적인 바람직한 구현예에 따르면, 상기 숙주세포는 피키아 파스토리스, 한세눌라 폴리모르파, 트리코더마 레세이, 사카로마이세스 세레비지애, 클루이베로마이세스 락티스, 야로위아 리포리티카, 피키아 메탄올리카, 캔디다 보이디니이 및 코마가타엘라, 및 스키조사카로마이세스 폼베이다. 상기 숙주세포는 또한 우스틸라고 마이디스 (Ustilago maydis) 유래일 수 있다.
바람직하게, 상기 숙주세포에 의해 발현되는 보조 단백질은 동일한 세포로부터 유래하거나, 동일한 종, 속, 과의 세포로부터 재조합된다. 본 발명에서 사용되는 "재조합"은 인간 개입에 의한 유전적 물질의 변경을 나타낸다, 전형적으로, 재조합은 복제 및 재조합을 포함하는 분자 생물학적 (재조합 DNA 기술) 방법에 의해 바이러스, 세포, 플라스미드 또는 벡터 내 DNA 또는 RNA가 조작되는 것을 나타낸다. 재조합 세포, 폴리펩티드, 또는 핵산은 자연적으로 발생한 대응물 ("야생형")과 어떻게 상이한지 전형적으로 기술될 수 있다. "재조합 세포" 또는 "재조합 숙주세포"는 상기 세포의 본연의 것이 아닌 핵산 서열을 포함하도록 유전적으로 변경된 세포 또는 숙주세포를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 용어 "제조하다" 또는 "제조하는"은 목적 단백질이 과발현되도록 하는 과정을 나타낸다. "목적 단백질을 제조하기 위한 숙주세포"는 목적 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 도입될 수 있는 숙주세포를 나타낸다. 본 발명에서 재조합 숙주세포는 목적 단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 것을 필요로 하지 않는다. 목적하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하기 위한 숙주세포가 제공될 수 있는지는 예를 들어, 키트를 사용하여 당업자에 의해 평가되었다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호 교환적으로 사용된다. 용어 "폴리펩티드"는 둘 또는 그 이상의 아미노산, 전형적으로 적어도 3개, 바람직하게 적어도 20개, 보다 바람직하게 적어도 30개와 같이, 적어도 50개의 아미노산을 포함하는 단백질 또는 펩티드를 나타낸다. 따라서, 폴리펩티드는 아미노산 서열을 포함하고, 따라서, 때때로 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 "폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드"로 나타낸다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 기능을 갖는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 나타낸다. 자연 발생 아미노산은 유전적 암호에 의해 암호화된 것으로서, 상기 아미노산은 이후에 예를 들어 하이드록시프롤린, Y-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린으로 변형될 수 있다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기초적 화학구조, 예를 들어, 수소, 카르복시기, 아미노기, 및, 호모세린, 노어루신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포니움과 같은 R 기와 결합된 탄소를 갖는 화합물을 나타낸다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노어루신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가지나, 자연 발생 아미노산과 같이 동일한 기초적 화학 구조를 지니고 있다. 아미노산 모사체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 차이가 있는 구조를 갖는 화학적 화합물이나, 자연 발생 아미노산과 유사한 기능을 지니고 있다.
바람직한 구현예로서, 본 발명은 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작된 숙주세포를 제공하며, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖고, 상기 저발현이 발생한 경우, 목적 단백질 SDZ-Fab (서열번호 25의 중쇄 및 서열번호 26의 경쇄; 도 2) 및/또는 HyHEL-Fab(서열번호 29의 중쇄 및 서열번호 30의 경쇄; 도 2)의 수율은 조작하기 전의 숙주세포에 비해 적어도 10% 증가된다.
본 발명에서 사용되는, "조작된" 숙주세포는 유전자 조작, 예를 들어 인간의 개입을 이용하여 조작된 숙주세포이다. 숙주세포가 주어진 단백질을 "저발현하도록 조작된" 경우, 숙주세포는 비-조작된 숙주세포가 지닌 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 발현하는 능력을 더 이상 가지지 못하도록 조작되었으며, 이에 따라, 조작 전의 동일한 조건 하에서 숙주세포에 비해 주어진 단백질, 예를 들어 목적 단백질 또는 모델 단백질의 발현은 증가된다.
본 발명의 숙주세포 문단에서 사용되는 "조작되기 전"은 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 조작되지 않은 숙주세포를 의미한다. 따라서 상기 용어는 또한 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하지 않는 숙주세포 또는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작되지 않은 숙주세포를 의미한다.
용어 "저발현"은 하나 또는 그 이상의 KO1, KO2, KO3 또는 이의 기능적 상동체의 기능적 발현을 막거나 저해하는 어느 하나의 방법을 포함한다. 이러한 방법은 이들의 알려진 기능을 실현할 수 없게 한다. 저발현의 수단은 유전자 서열의 돌연변이 생성, 서열의 파괴, 삽입, 추가, 돌연변이생성, 대조 서열의 발현 변형 등에 의한 유전자 억제 (예를 들어, RNAi 유전자 안티센스), 넉-아웃, 발현 수준의 변화, 발현 패턴의 변화를 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 숙주세포는 바람직하게 하기 본 발명에서 정의된 아미노산을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작될 수 있다. 만일 숙주세포가 하나 이상의 이러한 폴리뉴클레오티드를 갖는다면, 다른 이러한 폴리뉴클레오티드의 복제물 역시 저발현되는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 숙주세포는 반수체일 뿐 아니라. 이배체, 사배체 또는 그 이상의 -배체일 수 있다. 따라서, 바람직한 구현예로서, 이러한 폴리뉴클레오티드의 모든 복제물, 예를 들어 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 또는 그 이상의 복제물이 저발현된다.
저발현의 방법
바람직하게, 저발현은 숙주세포에서 KO 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 넉-아웃시켜 달성될 수 있다. 유전자는 상기 유전자의 전체 또는 일부의 암호화 서열을 결실시켜 넉아웃시킬 수 있다. 넉아웃 유전자를 제조하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어, Kuhn and Wurst (Eds.), 유전자 넉아웃 프로토콜(분자 생물학적 방법), Humana Press (March 27, 2009)을 참조할 수 있다. 유전자는 상기 유전자 서열 전체 또는 일부를 제거하여 넉아웃될 수 있다. 선택적으로, 유전자는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 저항성 유전자를 삽입하여 넉-아웃 또는 불활성화될 수 있다. 선택적으로, 유전자는 상기 유전자의 프로모터를 불활성화하여 넉-아웃 또는 불활성화될 수 있다.
한 구현예로서, 저발현은 숙주세포에서 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 파괴하여 달성될 수 있다.
"파괴"는 파괴되기 전의 본래 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 추가, 결실, 치환되는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 변화이다.
"삽입" 또는 "추가"는 파괴되기 전의 본래 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 추가되는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 변화이다.
"결실"은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 각각 제거되는(예를 들어, 부재되는) 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 변화로 정의된다. 결실은 전체 서열의 결실, 일부 암호화 서열의 결실, 단일 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 결실을 포함한다.
"치환"은 일반적으로 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 다른 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기로의 대체를 나타낸다. "치환"은 부위-특이적 돌연변이, 우발적 돌연변이의 생성, 겝프트 듀플렉스 (gapped duplex) 접근법에 의해 수행될 수 있다 (미국특허 번호 4,760,025; Moring et al., Biotech. (1984) 2:646 ; and Kramer et al., Nucleic Acids Res., (1984) 12:9441 참조). 부위 특이적 돌연변이 생성은 목적하는 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 PCR에 의해 in vitro 상에서 이루어질 수 있다. 부위 특이적 돌연변이 생성은 모체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 내 부위에서 제한효소를 통해 절단하고, 뒤이어 폴리뉴클레오티드 내 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 접합하는 것을 포함하는 카세트 돌연변이 생성에 의해 in vitro 상에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드를 자르는 제한 효소와 상기 올리고뉴클레오티드는 동일한 것이며, 이는 플라스미드의 점착성 말단 및 서로간 연결에 의한 삽입을 가능하게 한다. 예를 들어, Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; and Barton et ai, 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966을 참조하라. 부위 특이적 돌연변이 생성은 기술적으로 알려진 방법, 예를 들어, 미국 특허 공개번호 2004/0171 154; Storici et ai, 2001 , Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et ai, 1998, Nat. Med. 4: 285-290; and Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16에 의해 in vivo 상에서 이루어질 수 있다. 합성 유전자 컨스트럭션은 목적 폴리펩티드를 암호화하기 위하여, 설계된 폴리뉴클레오티드 분자의 in vitro 상 합성을 수반한다. 유전자 합성은 Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054)에 기술된 멀티플렉스 마이크로칩-기반 기술, 및 이와 유사한 기술과 같이 수많은 기술을 이용하여 수행될 수 있고, 상기 올리고뉴클레오티드는 빛에 의해 작동되는 미세유체 칩에 의해 합성되고 조립된다. 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입이 이루어질 수 있고, 돌연변이 생성, 재조합, 및/또는 혼성의 알려진 방법을 이용하여 테스트될 수 있으며, Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241:53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; 또는 WO 95/22625에 개시된 관련 스크리닝 과정이 뒤어어 진행될 수 있다. 이용될 수 있는 다른 방법으로 실수 유발 PCR, 파지 디스플레이 (예를 들어, et al, 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; 미국 특허번호. 5,223,409; WO 92/06204) 지역(region) 특이적 돌연변이 생성 (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7:127)을 포함한다. 돌연변이 생성/혼성 방법은 대용량 처리 기술, 숙주세포에 의해 발현되는 복제되고 돌연변이된 폴리펩티드의 활성을 검출하기 위한 자동화된 스크리닝 방법(Ness et a/., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896)과 결합될 수 있다. 활성화 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이된 DNA 분자는 숙주세포로부터 정상으로 회복될 수 있고, 당업계의 표준화 방법을 이용하여 빠르게 시퀀싱할 수 있다. 이러한 방법은 폴리펩티드 내 개개의 아미노산 잔기에 대한 중요성을 빠르게 확인 가능하게 한다. 반-합성 유전자 컨스트럭션은 합성 유전자 컨스트럭션 및/또는 부위 특이적 돌연변이 생성, 및/또는 임의돌연변이 생성, 및/또는 혼성의 조합에 의해 이루어진다. 반합성 컨스트럭션은 PCR 기술과 조합하여, 합성되는 폴리뉴클레오티드 단편을 활용하는 과정이 특징적이다. 따라서, 유전자의 정해진 지역은 새롭게 합성되는 반면, 이외 다른 지역은 부위-특이적 돌연변이 생성 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있고, 이외 다른 지역은 실수 유발 PCR 또는 비-실수 유발 PCR 증폭이 실시될 수 있다. 뒤이은 폴리뉴클레오티드는 혼성이 실시될 수 있다. 선택적으로, 상동체들은 미생물과 가깝게 또는 멀리 관련된 cDNA 라이브러리 스크리닝에 의해 천연 시료로부터 얻어질 수 있다.
바람직하게, 유전자의 파괴는 틀 이동 돌연변이, 조기 종결 코돈, 임계 잔기의 점 돌연변이, 넌센스 또는 이 밖의 비기능성 단백질 산물로의 번역을 초래한다.
또 다른 구현예에서, 저발현은 상기 KO 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 프로모터를 파괴하여 달성될 수 있다. 프로모터는 하위 유전자의 전사를 직접적으로 관여한다. 주어진 서열의 발현을 위하여, 상기 프로모터는 필요적으로, 인헨서, 리보솜 결합 부위, 전사 시작 또는 종결 서열, 번역 시작 또는 종결 서열, 및 인헨서 또는 활성자 서열과 같은 다른 발현 조절 서열과 함께 있을 수 있다. 따라서, 상기 발현 조절 서열 중 어느 하나를 파괴하는 것 또한 상기 KO 단백질을 암호화하는 폴리펩티드의 발현 저해를 가능하게 한다.
어느 핵산 분자가 또 하나의 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여 있을 때, 상기 핵산은 "작동 가능하게 연결"되어 있는 것이다. 예를 들어, 프로모터가 암호화 서열의 발현에 영향을 주는 경우, 프로모터는 재조합 유전자의 암호화 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것이다.
또 다른 구현예에서, 저발현은 전사후 유전자 억제(PTGS)에 의해 달성될 수 있다. 상기 기술은 당해 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 것이며, PTGS는 이종 RNA 서열, 빈번하게 유전자 파괴에 필요한 안티센스의 발현을 통하여 유전자의 발현 수준을 저해시킨다(Lechtreck et al., J. Cell Sci (2002). 115:1511-1522; Smith et al., Nature (2000). 407:319-320; Furhmann et al., J. Cell Sci (2001). 114:3857-3863; Rohr et al., Plant J (2004). 40(4):611-210). 전사후 유전자 억제는 RNA 분자가 유전자 발현을 억제하는 생물학적 과정으로서, 전형적으로, 짧은 RNA (small RNA)를 포함하는 microRNA(miRNA), 짧은 간섭 RNA (small interfering RNA (siRNA)), 또는 안티센스 RNA를 이용한 특정 mRNA 분자의 파괴에 의해 야기된다. 유전자 억제는 전사의 차단 (유전자-결합), mRNA 전사체의 퇴화 (짧은 간섭 RNA(siRNA) 또는 RNase-H 의존성 안티센스)를 통해 또는 miRNA (예를 들어, 모르피노 올리고스 또는 다른 RNase-H 비의존성 안티센스)를 포함하는 mRNA 번역, pre-mRNA 스플라이싱 부위 또는 다른 기능적 RNAs의 성숙을 위해 이용되는 뉴클레아제 절단 부위의 차단을 통해 발생할 수 있다. 이러한 짧은 RNA는 다른 특정 전령 RNA (mRNA)와 결합할 수 있고 이들의 활성을 감소시킬 수 있으며, 예를 들어, 단백질의 생산에 관여하는 mRNA를 막을 수 있다. 예시적인 siRNA 분자는 약 10-50 또는 그 이상의 뉴클레오티드 유래의 길이를 갖는다. 짧은 RNA 분자는 표적-특이적 RNA 간섭에 관여하는 표적 RNA 서열과 "충분히 상보적인" 서열을 갖는 적어도 하나의 사슬을 포함한다. 작은 간섭 RNA는 세포 내부에서 유래할 수 있거나 상기 세포로 외인성으로 유도될 수 있다. 세포로 유도되면 외인성 siRNA는 RNA-유도형 억제 복합체 (RISC)에 의해 처리된다. 상기 siRNA는 표적 RNA와 상보적이며, 이를 억제시키고, RISC는 표적 RNA에 위치하기 위하여 siRNA를 주형을 사용한다. RISC가 표적 mRNA에 위치하면, 상기 RNA는 리보뉴클레아제에 의해 절단된다. 상기 사슬은 ds-siRNA 분자의 문단에서 안티센스 가닥으로 일반적으로 나타낸 RNAi 메카니즘 또는 처리에 의해 mRNA의 파괴하기에 충분한 또는 적합한 서열을 갖는다. 상기 siRNA 분자는 표적 분자 내 잔기와 상보적인 모든 잔기로 설계될 수 있다. PTGS는 많은 유기체에서 발견되었다. 많은 효모 세포에서, 분열 효모, 스키조사카로마이세스 폼베는, 이질염색질 형성 및 중심립 억제와 관련된 활성 RNAi 기전을 갖는다 (Raponi et al., Nucl. Acids Res. (2003) 31 (15): 4481-4489). 사카로마이세스 세레비지애, 칸디다 알비칸 및 클루이베로마이세스 폴리스포러스를 포함하는 몇몇 출아 효모 또한 RNAi 기전에서 발견된다(Bartel et la., Science Express doi:10.1126/ science.1176945, published online 10 September 2009). "저발현"은 유전자 발현을 낮추는 당업계에 알려져 있는 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, KO 단백질과 작동 가능하게 연결된 프로모터는 낮은 프로모터 활성을 갖는 또 다른 프로모터로 대체될 수 있다. 프로모터 활성은 이의 전사 효율에 의해서 평가될 수 있다. 상기 활성은 예를 들어 노던 블롯팅, 정량적 PCR에 의한 프로모터로부터 mRNA 전사체의 양의 측정을 통해 직접적으로 확인될 수 있고, 또는 프로모터로부터 발현되는 유전자 산물의 양의 측정을 통해 간접적으로 확인될 수 있다.
또 다른 구현예에서 저발현은 KO 단백질이 기능성을 지닐 수 있는 적합한 접힘이 이루어지지 않도록, 발현되는 KO 단백질의 접힘을 방해하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 KO 단백질의 이황화 결합 형성을 제거하거나, 알파 나선 구조 또는 베타 병풍 구조의 형성을 파괴하도록 도입될 수 있다.
목적 단백질
본 발명에서 사용되는 용어 "목적 단백질 (POI)"은 숙주세포에서 재조합 기기술 수단에 의해 생산된 단백질을 나타낸다. 보다 구체적으로, 상기 단백질은 숙주세포에서 자연 발생되지 않은 폴리펩티드, 예를 들어 이종 단백질일 수 있거나, 숙주세포 본연의 폴리펩티드, 예를 들어, 숙주세포에 대한 상동성 단백질일 수도 있으나, 상기 숙주세포는 POI를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 자가-복제 벡터로 형질전환되거나, 숙주세포의 유전체로 POI을 암호화하는 핵산 서열의 하나 또는 그 이상의 복제물로 재조합시키는 기술에 의해 삽입되거나, POI를 암호화하는 유전자의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 조절 서열, 예를 들어 프로모터 서열의 재조합 변형에 의해 생산될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에서 나타내는 목적 단백질은 당업자에게 널리 알려진 재조합 발현의 방법에 의해 생산될 수 있다.
목적 단백질(POI)에 대한 제한은 없다. 상기 POI는 일반적으로 진핵세포성 또는 원핵세포성 폴리펩티드, 이들의 변이체 또는 유도체이다. 상기 POI는 어느 하나의 진핵세포성 또는 원핵세포성 단백질일 수 있다. 상기 단백질은 자연적으로 분비되는 단백질 또는 세포 내 단백질, 예를 들어, 자연적으로 분비되지 않는 단백질일 수 있다. 본 발명은 또한 단백질의 생물학적 활성 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, POI는 아미노산 사술 또는 복합체, 예를 들어 이량체, 삼량체, 헤테로 이량체, 다합체 또는 저중합체 상태로 존재할 수 있다.
목적 단백질은 영양제, 음식물, 소화제, 보충물로서 사용되는 단백질, 예를 들어 식료품, 사료, 또는 화장품일 수 있다. 상기 식료품은 예를 들어, 부용, 디저트, 시리얼 바, 과자, 스포츠 음료, 식품, 또는 다른 영양 제품일 수 있다. 바람직하게, 상기 목적 단백질은 식품 첨가제이다.
또 다른 구현예로서, 목적 단백질은 동물 사료로 사용될 수 있다. POI는 진균독소 분해 효소와 같이 해독 효소일 수 있다. 해독 효소는 독소를 분해하여 이의 독성을 저해하는 효소를 의미한다. 진균독소는 옥수수에 손쉽게 대량 서식하는 곰팡이에 의해 생산되는 독성 2차 산물이며, 옥수수에 유해하고 인간 또는 동물에 건강상 문제를 야기하는 능력으로 특징되어 진다. 진균독소 분해 효소는 아플라톡신, 데톡시자임, 제아랄레논 에스터라제, 제아랄레논 락토나제, 제아랄레논 하이드로라아제, 퓨모니신 카르복실에스터라제, 퓨모니신 아미노트렌스퍼라제, 아미노폴리올 아민 옥시다제, 데옥시니바레놀 에폭사이드 하이드로라아제를 포함한다. POI는 또한 오크라독소 유사체, 또는 맥각 알칼로이드를 분해하는 효소일 수 있다. 오크라독소는 아스퍼질러스 또는 페니실린 과의 여러 곰팡이에서 2차 산물로서 생산되는 진균독소 그룹이고, 이소쿠마린의 유도체로 이루어진 약 유기산이다. 알려져 있는 오크라독소는 세 종류가 있으며, A, B, 및 C로 표기된다. 오크라독소 A는 오크라독소과에서 가장 흔하며, 따라서 가장 일반적으로 검출되고, 또한 독성이 가장 강하다. 오크라독소는 시리얼 및 전분이 풍부한 다른 식품에 존재하는, 신독성, 기형발생, 간독성 및 발암성 진균독소이다. 맥각 알칼로이드는 아마이드 결합을 포함하는 화합이며, 예를 들어, 에르고코르닌, 에르고코르니닌, 에르고크리스틴, 에르고메트린, 에르고신, 에르고타민 및 에르고아미닌을 포함한다. 이러한 화합물은 인간 및 가축을 포함하는 살아있는 유기체에 유해하다. 이러한 효소의 예시로는 오크라톡신 아미다제, 에로고타민 하이드롤라아제, 에르고타민 아밀라제를 포함한다. 진균독소 분해 효소는 사료의 진균독소 오염을 조절할 수 있어 동물 사료에 유용하다.
POI의 추가적 예시로는, 락토페린, 라이소자임, 락토페리신, 락토히드린, 카파-카제인, 헵토코린, 락토페록시다아제, 우유 단백질과 같은 항균 단백질 급성기 단백질, 예를 들어 감염 반응에 의해 가축으로부터 정상적으로 생산되는 단백질, 및 라이소자임 및 락토페린과 같은 작은 항균 단백질을 포함한다. 다른 예시로는 살균 단백질, 항바이러스 단백질, 급성기 단백질 (감염 반응에 의해 가축으로부터 유도), 프로바이오틱 단백질, 세균 발육 억제 단백질 및 양이온성 항균 단백질을 포함한다.
"사료"는 비-인간 동물에 의해 섭취, 흡수, 소화되기 적합한 어느 하나의 자연적 또는 인위적 음식, 식품, 또는 이와 유사한 물질, 또는 식품의 성분을 의미한다. "사료 첨가제"는 일반적으로 사료에 첨가되는 물질을 나타낸다. 이는 전형적으로, 하나 또는 그 이상의 비타민, 미네랄, 효소 및 적절한 담체 및/또는 부형제를 포함한다. 본 발명의 목적상, 식품 첨가제는 효소 또는 그 밖의 단백질일 수 있다. 사료 첨가제로 사용될 수 있는 효소의 예시로는 피타아제, 사일라네이즈 및 베타-글루코나아제를 포함한다. "음식"은 인간에 의해 섭취, 흡수, 소화되기 적합한 어느 하나의 자연적 또는 인위적 음식, 식품, 또는 이와 유사한 물질, 또는 식품의 성분을 의미한다.
"식품 첨가제"는 일반적으로 음식에 첨가되는 물질을 나타낸다. 이는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 비타민, 미네랄, 효소 및 적절한 담체 및/또는 부형제를 포함한다. 본 발명의 목적상, 식품 첨가제는 는 효소 또는 그 밖의 단백질일 수 있다. 식품 첨가제로 사용될 수 있는 효소의 예시로는 프로테아제, 리파아제, 락타아제, 펙틴 메틸 에스터라제, 펙틴나아제, 트렌스글루타민나아제, 아밀라제, 베타-글루쿠로나제, 아세토락테이트 데카르복시라제 및 라카제를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 식품 첨가제는 항균 단백질, 예를 들어 (ⅰ) 항균 우유 단백질 (인간 또는 비-인간), 락토페린, 라이소자임, 락토페리신, 락토히드린, 카파-카제인, 헵토코린, 락토페록시다아제, 알파- 1-안티트립신, 및 IgA와 같은 면역 글로불린, (ⅱ) 급성기 단백질, 예를 들어 C-반응성 단백질 (CRP); 락토페린; 라이소자임; 혈청 아밀로이드 A(SAA); 페리틴; 헵토클로빈 (Hp); 보체 2-9, 특히 보체-3; 세로무코이드; 셀룰로플라즈민 (Cp); 15-케토-13,14-다이하이드로-프로글렌딘 F2 알파 (PGFM); 피브리노겐 (Fb); 알파(1)-산 글라이코단백질(AGP); 알파(1)-안티트립신; 만노오스 결합 단백질; 리포사카라이드 결합 단백질; 알파-2 마크로글로불린 및 다양한 디펜신, (ⅲ)항균 펩티드, 예를 들어 세크로핀, 마구진, 디펜신, 타치플레신, 파라신 l. 부포린 I, PMAP-23, 모로네시딘, 아노플린, 감비신, 및 SAMP-29, 및 (ⅳ) 다른 항균 단백질(들), CAP37, 그레눌리신, 분비성 백혈구 프로테아제 억제자, CAP18, 유비퀴시딘, 소의 항균 단백질-1, Ace-AMP1, 타치플레신, 큰 디펜신, Ac-AMP2, Ah-AMP1, 및 CAP18을 포함한다.
POI는 효소일 수 있다. 바람직한 효소는 세제, 전분, 연료, 직물, 수지 및 종이, 오일, 퍼스널 케어 제품의 제조, 또는 제빵, 유기 합성 등 산업상 응용을 위해 사용될 수 있다. 이러한 효소의 예시로는, 얼룩 제거 및 세탁을 위한 프로테아제, 리파아제, 만난나제 및 셀룰로오즈; 전분의 액화 및 당화를 위한 풀루라네이스 아밀라아제, 아미노글루코시다제; 글루코스에서 프룩토스로 전환을 위한 글루코스 이성질화 효소; 사이클로덱스트린 생산을 위한 사이클로덱스트린-글라이코실트랜스퍼라제; 연료 및 전분에서 점성의 감소를 위한 사일라네이스; 제빵에서 반죽 안정성 및 조절을 위한 아밀라아제, 사일라네이스, 리파아제, 포스포리파아제, 글루코스 옥시다아제, 리폭시게나아제, 트랜스글루타민나아제; 데님 마감 및 목화 연화를 위한 셀룰라아제; 직물의 축소를 위한 아밀라아제; 정련을 위한 펙트산 분해효소; 표백 종결을 위한 카탈라제; 표백을 위한 라카제; 과도한 염색을 제거하기 위한 페옥시다아제; 수지 및 종이 생산에서 리파아제, 프로테아제, 아밀라아제, 시알라네이스, 셀룰로스; 에스터교환을 위한 리파아제 및 지방과 오일의 처리 과정에서 고무성분 제거를 위한 포스포리파아제 및 포스포리파아제; 유기 합성에서 카이럴성 알콜 및 아마이드의 분해를 위한 리파아제; 반합성 페니실린 합성을 위한 아실라제, 광학이성질성 카르복시산 합성을 위한 니트릴라아제; 가죽 생성을 위한 프로테아제 및 리파아제; 퍼스널 케어 제품 제조를 위한 아미노글루코시다제, 글루코스 옥시다아제, 및 페록시다아제를 포함한다 (Kirk et al., Current Opinion in Biotechnology (2002) 13:345-351 참조)
치료 단백질
POI는 치료 단백질일 수 있다. POI는 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 하기 구체적으로 기술한 바와 같이, 항체 또는 항체 단편, 성장 인자, 호르몬, 효소, 백신 등 생물 약제학상의 물질로서 적합한 단백질일 수 있다.
상기 POI는 자연적으로 분비되는 단백질 또는 세포 내 단백질, 예를 들어 자연적으로 분비되지 않는 단백질일 수 있다. 또한 본 발명은 기능적 상동체의 재조합 산물, 기능적 동등체 변이, 유도체 및 자연적으로 분비 또는 자연적으로 분비되지 않은 단백질의 생물학적 활성 단편을 제공한다. 기능적 상동체는 바람직하게 동일하거나 이에 상응하는 서열의 기능적 특징을 갖는다.
POI는 구조적으로 본연의 단백질과 구조적으로 유사하고, 본연 단백질의 C- 및 N- 말단 또는 측쇄 모두 또는 각각에 하나 또는 그 이상의 아미노산의 삽입, 본연의 아미노산 서열 내 하나 또는 수많은 위치에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환, 또는 본연의 단백질 말단 도는 아미노산 서열 내 다양한 위치 모두 또는 각각에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 결실, 또는 본연의 아미노산 서열 내에서 하나 또는 그 이상의 위치에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 삽입에 의해 본연의 단백질로부터 유래될 수 있다. 전술한 다양한 단백질에 대한 이러한 변형은 당업계에 널리 알려져 있다.
바람직하게, 목적 단백질은 포유류 폴리펩티드 또는 보다 바람직하게 인간 폴리펩티드이다. 특히 어느 폴리펩티드, 단백질, 단백질 변이체, 융합 단백질 및/또는 이의 단편을 나타내는 바람직한 치료 단백질은 포유류에 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 치료 단백질은 세포에 대하여 이종인 것을 필요로 하지 않음이 예상될 수 있다. 본 발명의 세포에 의해 생산될 수 있는 단백질의 예시로는 이에 제한되는 것은 아니나, 효소, 조절 단백질, 수용체, 펩티드 호르몬, 성장인자, 사이토카인, 스케폴드 결합 단백질 (예를 들어, 안티칼린스), 구조 단백질, 림포카인, 부착 분자, 수용체, 막 또는 단백질 수송체 및 아고니스트 또는 안타고니스트 역할을 하며, 및/또는 치료 또는 진단 용도를 갖는 단백질이다. 또한 목적 단백질은 백신화, 백신, 항원-결합 단백질, 면역 자극 단백질로 사용하기 위한 항원일 수 있다. 이는 또한 항체의 항원-결합 단편일 수 있고, 상기 단편은 기술적으로 알려진 적합한 항원-결합 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 이에 제한되는 것은 아니나, Fv(VL 및 VH를 포함하는 분자), 단일-사슬 Fv (scFV)(펩티드 링커로 연결된 VL 및 VH를 포함하는 분자), Fab, Fab', F(ab')2, 단일 도메인 항체(sdAb)(단일 가변 도메인 및 3 CDR을 포함하는 분자) 및 이들의 다가 항체일 수 있다. 상기 항체 또는 이의 단편은 쥐의, 인간의, 인간화된 것이거나 키메릭 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 치료 단백질의 예시는 항체, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 재조합 항체, 항체 단편, 예를 들어, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, di-scFvs, bi-scFvs, tandem scFvs, bispecific tandem scFvs, sdAb, nanobodies, VH, 및 VL, 또는 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, IgA 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgG 항체, IgM 항체, intrabody, minibody 또는 monobody를 포함한다.
이러한 치료 단백질은 이에 제한되는 것은 아니나, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, hGH, tPA, 사이토카인, 예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18와 같은 인터류킨, 인터페론 (IFN) 알파, IFN 베타, IFN 감마, IFN 오메가 또는 IFN 타우, 종양 괴사인자 (TNF) TNF 알파 및 TNF 베타, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 단백질은 항체이다. 용어 "항체"는 에피토프와 결합하고, 인식하는 특정 형태의 분자구조를 포함하는 어느 하나의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것으로 의도되며, 하나 또는 그 이상의 비공유 결합 상호작용은 상기 분자구조와 에피토프간 복합체를 안정화한다. 전형적인 항체 분자는 면역글로불린이고, 모든 유래, 예를 들어 인간, 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개, 다른 포유류들, 닭, 다른 조류 등 유래의 모든 형태의 면역글로불린, 예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 등이 항체로 여겨질 수 있다. 기술된 서열을 암호화하는 수많은 항체; 및 그 밖의 항체들은 당업계에 널리 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다.
예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 기술적으로 알려진 방법에 의해 생산될 수 있다. 일반적으로, 항체-생산 세포는 목적 항원 및 면역원에 민감하다. 항체 생산 세포로부터 동정된 전령 RNA는 PCR 증폭을 이용하여 cDNA를 제조하는데 주형으로 이용된다. 벡터의 라이브러리, 최초의 항원을 특이성을 각각 보유하는 하나의 중쇄 유전자 및 하나의 경쇄 유전자를 포함하며, 이는 증폭된 면역글로불린 cDNA의 적절한 부분을 발현 벡터로 삽입하여 제조된다. 결합성 라이브러리는 중쇄 유전자 라이브러리와 경쇄 유전자 라이브러리의 조합에 의해 구축된다. 복제된 라이브러리 결과물은 중쇄 및 경쇄 (항체 분자의 Fab 단편 또는 항원 결합 단편과 비슷함)를 동시 발현한다. 이러한 유전자를 전달하는 벡터는 숙주세포를 동시 형질전환시킨다. 항체 유전자의 합성이 형질전환된 숙주에서 유도될 때, 중쇄 및 경쇄 단백질은 자가 조립되어 항체 또는 면역원을 검출할 수 있는 활성 항체를 생산한다.
관심 서열을 암호화하는 항체는 본연의 서열뿐만 아니라 유전적 암호화의 축소에 의해 개시된 핵산과 일치하지 않은 핵산, 및 이의 변이체를 포함한다. 변이된 폴리펩티드는 아미노산 (aa) 치환, 삽입 또는 결실을 포함한다. 아미노산의 치환은 보존적 아미노산 치환일 수 있고, 예를 들어, 해당 위치의 변경과 같이 비-필수적 아미노산의 제거를 위하여, 또는 기능적으로 필수적이지 않은 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 치환 또는 제거하여 잘못된 접힘의 최소화를 위하여 치환될 수 있다. 변이체는 단백질의 특정 지역 (예를 들어, 기능적 도메인, 분해성 아미노산 잔기 등)의 생물학적 활성을 향상시키거나 보유하기 위하여 설계될 수 있다. 변이체는 또한, 본 발명에서 전술한 폴리펩티드의 단편, 특히 기능적 도메인과 상응하는 생물학적 활성 단편 및/또는 단편을 포함할 수 있다. 복제된 유전자의 in vitro 돌연변이 생성 기술은 알려져 있다. 본 발명의 대상은 치료 물질로서 보다 적합하기 위하여, 보편적인 분자 생물학적 기술을 이용하여 단백질 가수분해 저하에 대한 저항성을 향상시키거나 용해성을 최적화하도록 변형시킨 폴리펩티드를 포함한다.
키메릭 항체는 다양한 경쇄 또는 중쇄 부위(VL 및 VH)의 조합에 의한 재조합 기술에 의해 제조될 수 있고, 다른 종 유래의 경쇄 또는 중쇄 불변 부위를 포함하는 어느 한 종의 항체 생산 세포로부터 수득된다. 전형적으로, 뚜렷한 인간 도메인 항체를 생산하기 위하여, 키메릭 항체는 설치류 또는 토끼의 가변 부위 및 인간 불변 부위를 활용한다. 이러한 키메릭 항체의 생산은 당업계에 널리 알려져 있고, 표준화된 기술(미국 특허 번호 5,624,659에 기술)에 의해 달성될 수 있다.
인간화된 항체는 인간-유사 면역글로불린 도메인을 광범위하게 포함하고, 동물-유래 항체의 상보적 결정 지역만을 포함하도록 조작된다. 이는 모노클로날 항체의 가변 부위에서 높은 변화가 일어나는 고리의 서열을 조사하고 이를 인간 항체 사슬의 구조와 일치시킴으로써 달성될 수 있다. 한편, 페시얼리 복합체(facially complex), 상기 과정이 실제로 가장 간편한 방법이다. 미국 특허 번호 6,187,287를 참조.
완전한 형태의 면역글로불린 (또는 이들의 재조합 복제물)에 더하여, 에피토프 결합 부위 (예를 들어, Fab', F(ab')2, 또는 다른 단편)를 포함하는 면역글로불린 단편이 합성될 수 있다. "단편" 또는 최소의 면역글로불린은 재조합 면역글로불린 기술을 활용하여 설계될 수 있다. 예를 들어 본 발명에서 사용하기 위한 "Fv" 면역글로불린은 경쇄 가변 부위 및 중쇄 가변 부위의 합성에 의해 생산될 수 있다. 항체의 조합 예를 들어, 두 개의 뚜렷한 Fv 특이성을 포함하는 2가 항체 절편(diabody) 또한 고려될 수 있다.
면역글로불린은 번역 후 과정으로 변형될 수 있으며, 예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물에서 활용될 수 있는, 화학적 링커, 또는 형광 염료, 효소, 기질, 화학 발광 모이어티 등과 같은 검출 가능한 모이어티, 또는 스트렙트아비틴, 아비틴, 비오틴 등과 같은 특정 결합 모이어티를 첨가할 수 있다.
치료 단백질의 추가적인 예시로는 혈액 응고 인자 (VII, VIII, IX), 푸사리움 유래 알칼라인 프로테아제, 칼시토닌, CD4 수용체 다베포이에틴, DNase (낭포성 섬유증), 에리트로포이에틴, 유트로핀 (인간 성장 호르몬 유래), 여포 자극 호르몬 (폴리트로핀), 젤라틴, 글루카곤, 글루코세레브로시다아제 (고셔병), A.niger 유래 글루코아밀라아제, A.niger 유래 글루코스 옥시다아제, 성선 자극 호르몬, 성장 인자 (GCSF, GMCSF), 성장 호르몬 (소마토트로핀), 간염 B 백신, 히루딘, 인간 항체 단편, 인간 아포지질단백질 AI, 인간 칼시토닌 전구체, 인간 콜라게나아제 IV, 인간 표피 성장 인자, 인간 인슐린-유사 성장 인자, 인간 인터류킨 6, 인간 라미닌, 인간 프로-아포지질단백질 AI, 인간 혈청 알부민인슐린, 인슐린 및 뮤테인스, 인슐린, 인터페론 알파 및 뮤테인스, 인터페론 베타, 인터페론 감마(뮤테인), 인터류킨 2, 황체 호르몬, 모노클로날 항체 5T4, 마우스 콜라겐, OP-1 (골신생, 신경보호 인자), 오프렐베킨 (인터류킨 11-아고니스트), 오가노포스포하이드롤라제, PDGF-아고니스트, 피테이스, 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), 재조합 플라스미노겐-활성자 G, 스테필로카이나아제, 줄기 세포 인자, 티타누스 독소 단편, 조직-플라스미노겐- 활성자, 및 종양 괴사 인자를 포함한다 (Schmidt, Appl Microbiol Biotechnol (2004) 65:363-372 참고).
선도 서열
목적 단백질은 숙주세포로부터 상기 POI의 분비를 야기하는 선도 서열과 결합될 수 있다. 발현 벡터 내 이러한 분비 선도 서열의 존재는 재조합 발현 및 분비를 위한 목적 단백질이 자연적으로 분비되지 않고, 자연적 분비 선도 서열이 부족하거나, 자연적 분비 선도 서열이 없는 뉴클레오타이드 서열만 복제된 경우 필요로 한다. 일반적으로, 숙주세포부터 POI의 분비를 효과적으로 야기하는 분비 선도 서열이 본 발명에서 사용될 수 있다. 상기 분비 선도 서열은 효모 기원일 수 있으며, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애의 MFa와 같은 효모 알파-인자 또는 효모 포스파타아제일 수 있고, 포유류, 식물 또는 그 밖의 생물 유래일 수 있다. 적합한 분비 선도 서열의 선택은 당업자에게 명백하다. 선택적으로, 발현 벡터 내 뉴클레오티드 서열 또는 발현 벡터 내 복제된 자연적 선도 서열을 포함하는 POI를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 복제되기 전, 상기 분비 선도 서열은 당업자에게 알려져 있는 전통적인 복제 기술에 의해, 재조합 발현을 위한 POI를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 내 융합되어 있을 수 있다. 이러한 경우, 발현 벡터 내 분비 선도 서열은 필요로 하지 않는다.
프로모터
POI를 암호화하는 서열은 프로모터와 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "프로모터"는 특정 유전자의 전사를 돕는 지역을 나타낸다. 프로모터는 전형적으로 프로모터가 존재하지 않은 경우의 발현된 재조합 산물의 양에 비해 뉴클레오티드 서열로부터 발현된 재조합 산물의 양을 증가시킨다. 하나의 유기체로부터 프로모터는 다른 유기체 기원의 서열로부터 재조합 산물 발현을 향상시키도록 이용될 수 있다. 프로모터는 당업계의 방법(예를 들어, Datsenko et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97(12): 6640-6645 (2000))을 이용하여 상동성 재조합에 의해 숙주세포 염색체로 삽입될 수 있다. 추가적으로, 하나의 프로모터 엘리먼트는 동시에 결합된 다수의 서열에 대한 발현 산물의 양을 증가시킬 수 있다. 따라서, 하나의 프로모터 엘리먼트는 하나 또는 그 이상의 재조합 산물의 발현을 향상시킨다.
프로모터는 "유도성 프로모터" 또는 "항시적 프로모터"일 수 있다. "유도성 프로모터는 특정 인자의 존재 또는 부존재에 의해 유도될 수 있는 프로모터를 나타내며, 항시적 프로모터는 이와 관련된 유전자 또는 유전자들의 계속적인 전사를 가능하게 하는 비조절된 프로모터를 나타낸다.
바람직한 구현예로서, POI를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 유도성 프로모터에 의해 유도된다.
수많은 유도성 프로모터가 당업계에 알려져 있다. 상기 프로모터들은 Gatz, Curr. Op. Biotech., 7: 168 (1996) 및 Gatz, Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89 (1997))에 기술되어 있다. 예시로는 테트라사이클린 리프레서 시스템, Lac 리프레서 시스템, 구리-유도성 시스템 (예를 들어 PR1 시스템),글루코코르티코이드-유도성 (Aoyama et al., 1997), 알코올-유도성 시스템, 예를 들어 AOX 프로모터 및 ecdysome-유도성 시스템을 포함한다. 또한 포함되는 프로모터로 설폰아마이드-유도성(U.S. Patent No. 5,364,780) 및 알코올-유도성 시스템 (WO 97/06269 and WO 97/06268) 및 글루타티온 S-트랜스퍼라제 프로모터가 있다.
효모 숙주세포에서 이용하기 위한 적합한 프로모터 서열은 Mattanovich et al., Methods Mol. Biol. (2012) 824:329-58에 기술되어 있고 삼탄당인산 이성질체화 효소 (TPI), 포스포글리세르산 인산화 효소 (PGK), 글리세르알데히드-3-탈수소화 효소 (GAPDH or GAP) 및 이들의 변이체, 락타아제 (LAC) 및 갈락토시다제 (GAL), 피키아 파스토리스 글루코스-6-포스페이트 이성질체화 효소 프로모터 (PPGI), 3-포스포글리세르산 인산화 효소 프로모터 (PPGK), 글리세롤 포스페이트 탈수소화 효소 프로모터 (PGAP), 번역 신장 인자 프로모터 (PTEF), 및 피키아 파스토리스 에놀라아제 1의 프로모터 (PENO1), 삼탄당인산 이성질체화 효소 (PTPI), ㄹ리보솜 소단위 단백질들 (PRPS2, PRPS7, PRPS31, PRPL1), 알콜 산화 효소 프로모터 (PAOX) 또는 변형된 특성을 갖는 이들의 변이체, 포름알데하이드 탈수소화 효소 프로모터 (PFLD), 이소구연산염 분해 효소 프로모터 (PICL), 알파-케토이소카프로에이트 탈탄산 효소 프로모터 (PTHI), 열충격 단백질 패밀리 구성들 (PSSA1, PHSP90, PKAR2), 6-포스포클루콘산 탈수소화 효소 (PGND1), 포스포글리세르산 뮤타아제 (PGPM1), 케톨전달효소 (PTKL1), 포스파티딜이노시톨 합성효소 (PPIS1), 페로-O2-산화 환원 효소 (PFET3), 고-친화적 철 투과 효소 (PFTR1), 억제 가능한 알칼라인 인산가수분해효소 (PPHO8), N-미리스토일 전달 효소 (PNMT1), 페로몬 반응 전사 인자 (PMCM1), 유비퀴틴 (PUBI4), 단리 가닥의 DNA 핵산내부 가수분해 효소 (PRAD2), 미코콘드리아성 내막의 주요 ADP/ATP 교환수송체 프로모터 (PPET9) (WO2008/128701) 및 포름산 탈수소효소 (FMD) 프로모터와 같은 해당 효소를 포함한다. 특히, GAP 프로모터, AOX 프로모터 도는 GAP 또는 AOX 프로모터 유래의 프로모터가 바람직하다. AOX 프로모터는 메탄올에 의해 유도될 수 있고, 예를 들어 포도당에 의해 억제될 수 있다.
적합한 프로모터의 추가적인 예시로는 사카로마이세스 세레비지애 에놀라아제 (ENO-1), 사카로마이세스 세레비지애 갈락토스인산화효소 (GAL1), 사카로마이세스 세레비지애 알콜 탈수소화 효소/글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소화 효소 (ADH1, ADH2/GAP), 사카로마이세스 세레비지애 삼탄당인산 이성질체화 효소 (TPI), 사카로마이세스 세레비지애 메탈로티오네인 (CUP1), 및 사카로마이세스 세레비지애 3-포스포글리세르산 인산화효소 (PGK), 및 말타아제 유전자 프로모터 (MAL)를 포함한다.
효모 숙주세포의 다른 유용한 프로모터는 Romanos et al, 1992, Yeast 8:423-488에 개시되어 있다.
에스체리키아 콜리를 숙주로 이용하기 위한 플라스미드 내 적합한 프로모터는 T7 프로모터, T5 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터, 락토오스 (lac) 프로모터, 트립토판/락토오스 (tac) 프로모터, 지질단백질 (lpp) 프로모터, 및 λ 파지 PL 프로모터를 포함한다.
실시예에서 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 상기 유전자들을 저발현시킨 경우, 저발현하지 않은 숙주세포에 비해 POI (SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab)의 수율이 적어도 20% 증가됨을 발견하였다.
바람직한 구현예로서, KO1 유전자의 저발현은 조작하기 전의 숙주세포에 비해 모델 단백질 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab의 숙주세포 내 수율을 적어도 1%, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 적어도 200% 또는 그 이상 증가시킨다.
바람직한 구현예로서, KO2 유전자의 저발현은 조작하기 전의 숙주세포에 비해 모델 단백질 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab의 숙주세포 내 수율을 적어도 1%, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 적어도 200% 또는 그 이상 증가시킨다.
바람직한 구현예로서, KO3 유전자의 저발현은 조작하기 전의 숙주세포에 비해 모델 단백질 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab의 숙주세포 내 수율을 적어도 1%, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 적어도 200% 또는 그 이상 증가시킨다.
바람직한 구현예에서, 숙주세포가 배양되어 목적 단백질을 생산할 때, 상기 세포는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 저발현되며, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖고 목적 단백질을 발현한다.
추가적인 양태로서, 본 발명은 목적 단백질을 제조하기 위한 조작된 숙주세포의 용도를 제공한다. 상기 숙주세포는 하나 또는 그 이상의 POI(s)를 도입하기 위해 유리하게 사용될 수 있고, 이후, 목적 단밸질을 발현하기 위한 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 이러한 용도의 구체적인 사항은 본 발명의 방법과 관련된 후단에서 기술되어 있다.
폴리뉴클레오티드를 암호화하는 POI는 벡터 내 관련 유전자의 연결 및 상기 벡터를 이용한 숙주세포의 형질전환을 통해 숙주세포로 재조합될 수 있다. 추가적인 교시는 본 발명의 하기 단락에서 찾을 수 있다.
일반적으로, 목적 단백질은 적합한 배지에서 숙주세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 발현된 목적 단백질을 분리하고, 발현된 산물에 적합한 방법에 의해 정제, 특히 세포로부터 목적 단백질을 분리하여 생산될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 제공하며, 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현시키는 것을 포함하고, 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 것"은 저발현된 KO 단백질(들)이 없는 것을 제외하고 동일한 조건에서 동일한 POI를 발현하는 동일한 세포에 비해, 목적 단백질의 수율이 증가되는 것을 의미한다.
당업자에 의해 평가된 바와 같이, 본 발명의 KO 단백질(들)의 저발현은 POI의 수율 증가로 나타내어진다. 따라서, 증가된 수준의 목적 단백질을 발현하는 숙주세포는 KO 단백질(들) 저발현에 의하여 본 발명에 적용이 가능하다.
만일 숙주세포 내 보조 단백질이 존재하지 않는다면, 숙주세포 내 하나 또는 여러 목적 단백질을 발현시키고, 또는 만일 보조 단백질을 암호화하는 유전자가 숙주세포 내 이미 존재한다면, 상기 세포 내 보조 단백질의 발현 수준을 증가시킴으로써, 본 발명이 적용 가능하다.
추가적인 양태로서, 본 발명은 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (ⅰ) 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작하고, 여기에서 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%의 서열 상동성을 갖는 것이며, (ⅱ) 상기 숙주세포에서 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 재조합하고, (ⅲ) 목적 단백질을 발현하도록 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하는 것을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "재조합"은 본 발명의 숙주세포에 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드가 구비된, 예를 들어 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 함유하도록 조작되는 것을 의미한다. 상기 재조합은 예를 들어 형질전환 또는 형질주입 또는 숙주세포에 폴리뉴클레오티드를 도입할 수 있는 당업계에 알려진 어느 다른 적합한 기술에 의해 달성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 보조 단백질 및/또는 목적 단백질, 프로모터, 인헨서, 선도 서열 등을 조작하기 위해 사용되는 과정은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 예를 들어, J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)에 기술되어 있다.
보조 단백질 또는 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 같이 외부 또는 표적 폴리뉴클레오티드는 다양한 수단, 예를 들어 상동성 재조합 또는 삽입 부위에서 표적 서열 특이적인 혼성 재조합 효소를 사용하여 염색체 내 삽입될 수 있다. 상기 기술된 외부 또는 표적 뉴클레오티드는 전형적으로 벡터 ("삽입 벡터") 내 존재한다. 이러한 벡터들은 전형적으로 상동성 재조합에 이용되기 전에 원형 및 선형화되어 있다. 선택적으로, 외부 또는 표적 뉴클레오티드는 이후, 숙주세포로 재조합되는 fusion PCR에 의해 결합된 DNA 단편 또는 합성적으로 구축된 DNA 단편일 수 있다. 상동 재조합 부위(homology arms)에 더하여, 벡터는 선택 또는 스크리닝을 위한 마커, 복제 개시점, 및 다른 엘리먼트들을 포함할 수 있다.
표적 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 또한 발현 벡터 상에 존재할 수 있다. 이러한 벡터는 당업계에 알려져 있고, 이미 상술되어 있다. 발현 벡터에서 프로모터는 이종 단백질을 암호화하는 유전자의 상위에 위치하고, 유전자의 발현을 조절한다. 다중-복제 벡터는 특히 이의 다중 복제 부위로 인해 유용하다. 발현을 위하여, 프로모터는 일반적으로 다중 복제 부위의 상위에 위치한다. POI를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 벡터는 우선, 전체 POI를 암호화하는 전체 DNA 서열을 포함하는 DNA 컨스트럭트를 제조하고, 이후 상기 컨스트럭트를 적절한 발현 벡터에 삽입하거나, 개별 엘리먼트, 예를 들어 선도 서열, 표적 DNA 서열에 대한 유전 정보를 포함하는 DNA 단편을 삽입하고, 뒤이어 접합하여 구축될 수 있다. 선택적인 단편의 제한 또는 접합으로서, 부착 부위 또는 효소에 기초한 재조합 기술이 벡터로 DNA 서열을 삽입하는데 이용될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 by Landy (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913-949에 기술되어 있고, 당업자에게 알려져 있다.
본 발명에 따른 숙주세포는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터 또는 플라스미드를 세포 내 도입하여 수득될 수 있다. 진핵세포를 형질감염 또는 형질전환하거나, 원핵 세포를 형질전환하기 위한 기술은 당업계에 알려져 있다. 이러한 기술로는 지질 소포 매개 흡수, 열 충격 매개 흡수, 칼슘 포스페이트 매개 형질감염 (칼슘 포스페이트/DNA 동시 발현), 변형된 바이러스, 예를 들어 변형된 아데노바이러스를 이용한 바이러스성 감염, 미세주사 및 전기 천공을 포함할 수 있다. 원핵세포의 형질전환을 위한 기술로는 열 충격 매개 흡수, 세균성 원생동물과 정상세포간 융합, 미세주사 및 전기 천공을 포함할 수 있다. 식물 형질전환을 위한 기술로는 아그로박테리움, 예를 들어 A. tumefaciens에 의한 매개 전환, 급속 추진형 텅스텐 또는 금 미세투사물, 및 전기 천공, 미세주사 및 폴리에틸렌 글리콜 매개 흡수를 포함한다. 상기 DNA는 단일 또는 이중 가닥일 수 있고, 선행 또는 원형, 느슨하거나 초나선형 DNA일 수 있다. 포유류 형질전환을 위한 다양한 기술로서, 예를 들어, Keown et al. (1990) Processes in Enzymology 185:527-537에 개시되어 있다.
추가적인 양태로서, 본 발명은 숙주세포에서 목적 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (ⅰ) 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작된 숙주세포를 제공하고, 여기에서 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%의 서열 상동성을 갖는 것이며, 여기에 상기 숙주세포는 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 및 (ⅱ) 목적 단백질을 발현하도록 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하는 것을 포함한다. 본 발명에서 개시된 방법은 POI 및 보조 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 상기 재조합 숙주세포를 배양하는 것을 추가로 포함하는 것으로 이해된다. 재조합되어 생성된 POI는 상기 세포 또는 세포 배지로부터 발현 시스템 및 발현 단백질의 특성, 예를 들어, 신호 펩티드에 융합되는 단백질인지 여부, 및 수용성 또는 막 결합 단백질인지 여부에 따라 분리될 수 있다. 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 배양 조건은 숙주세포의 형태, 특히 적용되는 발현 벡터를 포함하는 요소에 따라 다양할 수 있다. 신호 펩티드는 일반적으로 양 전하를 띄는 N-말단, 뒤이어 소수성 코어, 뒤이어 신호 펩티다아제로 알려져 있는 효소의 인식 부위를 포함한다. 상기 효소는 전좌 과정 동안 단백질로부터 신호 펩티드를 절단한다. 상기 단백질은 소포체에서 골지체로 전달되고, 이후, 단백질의 특성에 따라, 수많은 분비 기작의 경로 중 하나에 따르게 된다. 예를 들어, 상기 단백질은 배양 배지에 분비될 수 있고, 상기 세포의 표면에 부착되어 있을 수 있다. 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인을 포함하는 수용체들은 세포 막에 부착될 수 있는 단백질의 예시들이며, 세포외 도메인만이 세포의 바깥 쪽에 위치한다. 어떤 분비 단백질의 선도 서열은 신호 단백질의 C-말단에 위치하고, 신호 단백질의 절개 이후, 성숙한 목적 단백질로부터 처리(가공)되는 펩티드를 포함한다. 이러한 선도 서열은 종종 프리프로(prepro) 펩티드로 나타내며, 프리(pre) 지역은 신호 서열이고, 프로(pro) 지역은 선도 서열의 남은 부위를 나타낸다.
하나의 예시로서, 효모 α-인자 선도 서열로서, 신호 펩티드 (C- 말단 신호 펩티다아제 인식 부위 AlaLeuAla를 포함), 뒤이어 KEX2 프로테아제 처리 부위를 구성하는 염기성 아미노산 쌍 LysArg를 포함하는 프로 지역, 뒤이어 프로 지역의 C 말단에 펩티드 GluAlaGluAla를 포함한다. 선도 서열의 처리는 KEX2 프로테아제의 Lys와 Arg 잔기 사이의 절단에 의한, 신호 펩티다아제의 신호 펩티드 제거를 포함한다. 상기 GluAlaGluAla 잔기는 뒤이어 STE13 유전자의 산물인 펩티다아제에 의해 제거된다 (Julius et al., Cell (1983) 32:839). 상기 효모 α-인자 선도 서열은 미국 특허 4,546,082에 기술되어 있다. 효모 세포에 의해 자연적으로 분비되는 단백질로부터 유래한 신호 펩티드는 효모에서 이종 단백질 생산을 위한 재조합 발현 시스템으로 이용되어 왔다. 효모 발현 시스템에서 포유류 신호 펩티드의 사용도 보고된 바 있으나, 어떤 포유류 신호 펩티드는 효모에서 이종 단백질의 분비를 촉진하는데 효과적이지 않다.
상기 표현, "목적하는 폴리펩티드가 발현되기에 적합한 조건 하에서 배양하는 것"은 목적하는 폴리펩티드를 수득하거나 목적하는 화합물의 산물을 수득하기에 적절하거나 충분한 조건 (예를 들어, 온도, 압력, pH, 기간 등) 하에서 미생물을 유지 및/또는 성장시키는 것을 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 상기 숙주세포는 또한 보조 단백질을 발현한다. 보조 단백질은 본 발명의 후단에 기술되어있다. 보조 단백질(들) 및/또는 POI(s)를 위하여 다른 프로모터 및/또는 복제물 및/또는 삽입 부위를 이용할 경우, 보조 단백질의 발현은 POI(s)의 발현과 관계된 시점 및 유도 수준의 관점에서 조절될 수 있다. 예를 들어, POI(s)의 유도 전, 보조 단백질(들)이 우선 발현될 수 있다. POI(s)의 번역 초기에, 보조 단백질이 이미 존재하는 경우 이점을 갖는다. 선택적으로, 보조 단백질(들) 및 POI(s)는 동일한 시점에 유도될 수 있다.
POI 유전자의 형질전환에 의해 수득되는 본 발명에 따른 숙주세포는 바람직하게 이종 단백질의 발현에 대한 부담없이, 많은 세포 수로 효과적인 성장이 가능한 조건에 배양될 수 있다. 목적 단백질 발현을 위하여 상기 세포들이 제조된 경우, 적합한 배양 조건은 선택되고, 목적 단백질의 생산은 최적화된다.
유도성 프로모터는 유도 자극이 가해지는 순간, 활성화되도록 사용될 수 있고, 상기 프로모터의 조절 하에서 유전자의 전사를 직접 관여할 수 있다. 유도 자극이 있는 성장 조건에서, 일반적으로, 상기 세포는 정상 조건에 비해, 보다 느리게 성장되고, 상기 배양물은 종전 단계에서 많은 수의 세포로 이미 성장되어 있으므로, 전체로서 배양 시스템은 많은 양의 이종 단백질을 생산한다. 유도 자극은 바람직하게 적적한 시료 (예를 들어, AOX-프로모터를 위한 메탄올)의 첨가 또는 적절한 영양성분(예를 들어, MET3-프로모터를 위한 메티오닌)의 제거이다. 또한, 열 또는 삼투압 증진용 시약뿐만 아니라 에탄올, 메틸아민, 카드뮴 또는 구리의 추가도 발현을 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 숙주세포는 바람직하게, 적어도 1g/L의 세포 밀도, 바람직하게 적어도 10g/L의 세포 건조 중량, 보다 바람직하게 적어도 50g/L의 세포 건조 중량를 얻을 수 있는 최적화된 성장 조건 하의 바이오리엑터에서 배양된다. 이는 생체 분자의 실험실 규모뿐만 아니라 견본 또는 산업 규모의 수율을 달성하는데 이점이 있다.
본 발명에 따르면, KO 단백질의 저발현에 기인하여, 높은 수율로 POI를 수득할 수 있고 이는 mg POI/g 건조 바이오매스로 측정될 수 있다. 높은 수율은 1 내지 200의 범위, 예를 들어 50 내지 200, 예를 들어 100-200로서, 실험실, 견본, 및 산업 규모에서 실현될 수 있다. 본 발명에 따른 숙주세포의 산물의 구체적인 수율은, 상기 단백질의 저발현이 없는 산물의 발현에 비해, 적어도 1.1배, 보다 바람직하게 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배의 증가, 몇몇의 경우에서는 2배 이상의 증가를 제공한다.
본 발명에 따른 숙주세포는 표준화 시험, 예를 들어 ELISA, 활성 어세이, HPLC, 표면 플라즈마 공명(Biocore), 웨스턴 블롯, 모세관 전기영동(Caliper), 또는 SDS-Page에 의해 숙주세포의 발현/분비 능력 또는 수율이 테스트될 수 있다.
바람직하게, 상기 세포는 적합한 탄소원을 포함하는 최소 배지에서 배양될 수 있고, 이에 따라, 분리 과정이 현격하게 간소화된다. 예를 들어, 최소화 배지는 활용 가능한 탄소원 (예를 들어, 포도당, 글리세롤, 에탄올 또는 메탄올), 대량 원소 (칼륨, 마그네슘, 칼슘, 암모니움, 클로라이드, 설페이트, 포스페이트) 및 미량 원소 (구리, 요오드, 망간, 몰디브덴산염, 코발트, 및 철 염, 및 보론산)를 포함하는 염을 포함한다.
효모 세포의 경우, 상기 세포는 하나 또는 그 이상의 전술한 발현 벡터로 형질전환될 수 있다. 이는 이배체 균주를 형성하고, 및 유도성 프로모터에 적합하게 변형된 전통적인 영양 배지에서 배양되며, 형질전환체를 선별하거나 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시킨다. 효모의 성장에 적합한 수많은 최소 배지는 당업계 알려져 있다. 이러한 배지들 중 어느 하나는 염 (예를 들어, 소듐 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 버퍼 (예를 들어, HEPES, 시트릭산 및 포스페이트 버퍼), 뉴클레오사이드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항체, 미량 원소, 비타민, 및 포도당 또는 등가의 에너지원이 필수적으로 첨가될 수 있다. 이 밖의 필수적 첨가제는 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등의 조건은 발현을 위해 선별된 숙주세포에서 종래 이용된 조건일 수 있고, 이는 당업자에게 알려져 있다. 다른 형태의 숙주세포에 대한 세포 배양 조건도 알려져 있고, 당업자에 의해 손쉽게 결정될 수 있다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지의 설명은, 예를 들어, American Society for Bacteriology (Washington D.C, USA, 1981) 핸드북 "Manual of Methods for General Bacteriology"에 포함되어 있다.
세포는 액체 배지에서 배양 (예를 들어, 유지 및/또는 성장)될 수 있고, 바람직하게 연속적 또는 간헐적으로, 전통적인 배양 방법, 예를 들어 정치 배양, 시험관 배양, 진탕 배양 (예를 들어, 회전식 진탕 배양, 진탕 플라스크 배양 등), 환기 교반 배양, 발효일 수 있다. 몇몇의 구현예에서 세포는 진탕 플라스크 또는 딥 웰 플레이트에서 배양될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포는 바이오리엑터 (예를 들어, 바이오리엑터 배양 과정)에서 배양될 수 있다. 배양 과정은, 이에 제한되는 것은 아니나, 회분식 배양, 유가 배양, 및 연속적인 배양의 방법을 포함한다. 용어 "회분법" 및 "회분식 배양"은 배지, 영양, 보충 첨가제 등의 조성물이 배양 초기에 설정되어 있고, 배양 기간 동안 변경하지 않는 폐쇄적 시스템을 나타낸다; 그러나 이러한 배양은 배지의 과도한 산성화 및/또는 세포 사멸을 막기 위하여 pH 및 산소와 같은 인자의 조절이 가능할 수도 있다. 용어 "유가법" 및 "유가 배양"은 배양 과정에서 첨가(예를 들어, 정기적 또는 연속적인 첨가)되는 하나 또는 그 이상의 기질 또는 보충제가 제외된 회분식 배양을 나타낸다. 용어 "연속법" 및 "연속적인 배양"은 바이오리엑터에 정해진 배양 배지가 연속적으로 첨가되고, 목적하는 산물을 회수하기 위하여, 사용된 동일한 양 또는 "조건화된" 배지가 즉시 제거되는 시스템을 나타낸다. 이러한 수많은 배양 기술들은 발전해오고 있으며, 당업계에 널리 알려져 있다.
몇몇의 구현예에서, 세포는 약 12 내지 24시간 동안 배양되고, 다른 구현예에서, 세포는 약 24 내지 36시간, 약 36 내지 48시간, 약 48시간 내지 72시간, 약 72 내지 96시간, 약 96 내지 120시간, 약 120 내지 144시간, 또는 144시간 이상의 기간 동안 배양된다. 다른 구현예에서, 배양은 목적하는 목적 단백질의 생산 수율에 이를때까지의 충분한 기간 동안 이어진다.
전술된 방법은 발현된 POI를 분리하는 단계를 포함한다. 만일, POI가 세포로부터 분리되면, 최신의 기술을 이용하여 배양 배지로부터 분리되고 정제될 수 있다. 세포로부터 POI의 분비는 일반적으로, 세포가 파괴되고 세포 내 단백질이 분비되어 생성된 결과물인, 단백질의 복합체 혼합물보다는, 배양물의 상청액으로부터 이들의 산물을 회수하는 것이 보다 바람직하다. 프로테아제 억제제, 예를 들어 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드 (PMSF)는 정제 과정에서 단백질 분해성 퇴화를 억제하고, 항생제는 우발적인 오염물의 성장을 막기 위하여 포함될 수 있다. 상기 조성물은 당업계의 방법에 의해 농축, 여과, 투석될 수 있다. 선택적으로, 배양된 숙주세포는 세포 추출물에 포함된 목적 단백질을 수득하기 위하여, 초음파적으로, 기계적으로, 효소적으로, 또는 화학적으로 파쇄될 수 있고, 상기 목적 단백질은 분리 및 정제될 수 있다.
POI를 수득하기 위한 분리 및 정제 방법은 예를 들어, 염석, 용매 석출과 같이 용매의 차이를 활용한 방법, 초여과 및 겔 전기영동과 같이 분자량의 차이를 활용한 방법, 이온-교환 크로마토그래피와 같이 전기적 전하의 차이를 활용한 방법, 친화 크로마토그래피와 같이 특정 친화력 차이를 활용한 방법, 가역상 고성능 액상 크로마토그래피와 같이 소수성의 차이를 활용한 방법, 등전점 전기영동과 같이 등전점의 차이를 활용한 방법에 기초할 수 있다. 특정 정제 단계는 바람직하게, 함께 발현되어 POI 제조물을 오염시킬 수 있는 보조 단백질을 제거하기 위하여 실시된다.
분리 또는 정제된 POI는 전통적인 방법, 예를 들어 웨스턴 블롯, 단백질의 활성에 대한 특정 어세이와 같이 전통적인 방법에 의해 동정될 수 있다. 정제된 POI의 구조는 아미노산 분석, 아미노-말단 분석, 일차 구조 분석 등에 의해 정해질 수 있다. POI는 약학적 조성물의 활성 성분 또는 사료 또는 식품 첨가제로서의 필수요건을 충족시킬 수 있도록 대량 및 높은 정제율로 수득되는 것이 바람직하다.
보조 단백질
본 발명의 숙주세포는 보조 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 포함할 수 있다. 당업계에 알려진 어느 하나의 보조 단백질이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "보조 단백질"은 목적 단백질의 발현 및/또는 분비를 향상시키는 단백질을 의미한다. 상기 용어는 넓게 이해될 수 있고, 샤페론 또는 샤페론 유사 단백질로 제한되는 것은 아니다.
보조 단백질은 예를 들어 사페론일 수 있다. 샤페론은 일반적으로 비안정적인 다른 단백질의 구성과 결합하여 안정화시키는 기능을 갖는다. 결합과 분비를 조절함으로써, 샤페론은 생체 내 이들의 확실한 운명, 예를 들어, 접힘, 올리고성 조립, 특정 세포 구획으로 전달 또는 퇴화에 의한 폐기를 가능하게 한다. 이러한 형태의 샤페론 단백질은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, Stanford Genome Database (SGD), http://db.yeastgenome.org 또는 http://www.yeastgenome.org에 개시되어 있고, 특히 바람직하게 샤페론은 TIM9, PAM18 (또한 TIM14로 알려짐) 및 TCP1 (또한 CCT1로 알려짐) 뿐만 아니라 AHA1, CCT2, CCT3, CCT4, CCT5, CCT6, CCT1, CCT8, CNS1, CPR3, CPR6, ERO1, EUG1, FMO1, HSP10, HSP12, HSP104, HSP26, HSP30, HSP42, HSP60, HSP78, HSP82, JEM1, MDJ1, MDJ2, MPD1, MPD2, PDI1, PFD1, ABC1, APJ1, ATP11, ATP12, BTT1, CDC37, CPR7, HSC82, KAR2, LHS1, MGE1, MRS11, NOB1, ECM10, SSA1, SSA2, SSA3, SSA4, SSC1, SSE2, SIL1, SLS1, ORM1, ORM2, PER1, PTC2, PSE1, UBI4 HAC1 및 절두되고 인트론이 없는 HAC1 (Valkonen et al. 2003, Applied Environ Micro., 69, 2065)을 포함하는 효모 사페론이다. 예를 들어, 숙주세포는 BMH2, BFR2, COG6, COY1, CUP5, IMH1, KIN2, SEC31, SSA4, SSE1 또는 KAR2 (WO 2008128701)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
바람직하게, 숙주세포는 본 발명의 보조 단백질, HP1, HP2, HP3, HP4, HP5, HP6, HP7, HP8, HP9, HP10로 명명되는 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 보조 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 162의 아미노산 서열 및 이의 기능적 상동체를 포함한다. 본 발명은 보조 단백질은 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 163의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 용어 "보조 단백질"은 HP1-HP10 의 문단에서, 각각 HP1, HP2, HP3, HP4, HP5, HP6, HP7, HP8, HP9, 및 HP10 뿐만 아니라, HP1, HP2, HP3, HP4, HP5, HP6, HP7, HP8, HP9, 및 HP10의 기능적 상동체도 포함하는 것으로 의미된다.
본 발명에서 사용되는, 이러한 보조 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 162로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어 적어도 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% 서열 상동성을 갖는다. 보조 단백질 HP1 내지 HP10의 아미노산 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 162로 목록화되었다.
본 발명의 보조 단백질은 본질적으로 피키아 파스토리스 CBS7435 균주로부터 분리된다. 메틸영양체 효모 피키아 파스토리스 (Komagataella phaffii) CBS7435는 일반적으로 이용되는 피키아 파스토리스 재조합 단백질 생산 숙주의 모 균주이다. 상기 숙주세포의 전체 유전자 서열은 Kuberl et al. (J Biotechnol. (2011) 154(4):312-20)에 기술된다. 본 발명에서 동정된 목적 단백질을 암호화하는 유전자는 단백질 수율에 미치는 이로운 효과와는 연관이 없는 것으로 알려져 왔다.
상기 보조 단백질은 숙주세포의 종 또는 속으로부터 유래하거나 다른 원핵 또는 진핵 유기체들로부터 수득 또는 유래될 수 있다. 상기 보조 단백질을 암호화하는 외부 DNA 서열은 다양한 시료, 예를 들어 식물, 곤충, 곰팡이 또는 포유류 종, 바람직하게 사카로미케스 강, 바람직하게 사카로미케스 목, 바람직하게 사카로미케스 과, 바람직하게 사카로미케스 종으로부터 수득될 수 있고, 바람직하게 바람직하게 코마가타엘라 속으로부터 수득될 수 있다. 척추동물과 같은 다른 유기체 유래의 상동성 뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있다.
각 보조 단백질의 아미노산 서열 및 이들에 상응하는 실시예에서의 명칭들은 하기 표 2에 목록화되었다.
[표 2]
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특히, 피키아 파스토리스 내 분비 보조 인자를 스크리닝하기 위하여, 동정된 55개 후보 유전자를 대상으로 실험동(wet lab) 발현 실험을 통해 검증하여 주요 후보 유전자를 선정하였다. 주요 후보 유전자는 하기 기술된 바와 같이 조작하기 전의 숙주세포, 예를 들어, 상기 주요 후보 유전자를 과발현하지 않는 피키아 파스토리아스 균주이 비해 하기 기술된 바와 같이 두 모델 단백질 SDZ-Fab#9 및/또는 HyHEL-Fab#8의 수율을 20% 또는 그 이상 향상시키는 유전자였다. 결국, 상기 55개의 유전자 중에서 9개의 주요 후보 유전자들이 동정되었다. 4개의 주요 후보 유전자들, 예를 들어, PP7435_Chr3-0607, PP7435_Chr3-0933, PP7435_Chr2-0220 (SBH1), PP7435_Chr3-0639 (CPR6)는 두 모델 단백질 SDZ-Fab 및 HyHEL Fab 모두에 대하여 20% 이상의 분비 및/또는 발현 향상을 보였다. 추가 5개의 후보 유전자들 (PP7435_Chr4-0108 (MXR2), PP7435_Chr1-1232, PP7435_Chr1-1225 (MDR1), PP7435_Chr1-0667, PP7435_Chr4-0448)은 각각 이들이 과발현되었을 때, 두 모델 단백질 SDZ-Fab 및 HyHEL Fab 중 하나에 대하여 >20-30% 분비 수율 향상을 보였다.
상기 스크리닝의 기초는 피키아 파스토리스 생산 균주 및 피키아 파스토리스 비생산 균주의 전사인자 프로파일간 직접 비교였으며, 그 결과, 55개의 유전자를 동정하였다. 이들 유전자들은 다양한 대사 기전과 관련된 것이며, 다른 기능을 갖거나 알려지지 않은 기능을 가지고 있다. 따라서, 상기 유전자 또는 이로부터 암호화된 단백질로부터 상기 획득한 보조 인자의 특성에 대한 뚜렷한 정보는 알 수는 없었다. 따라서, 실제 조건 하에서, 잠재적인 분비 보조 인자가 실제로 보조 인자인지 여부를 검증하기 위한 시험을 수행하여야 하였다. 그러나, 단지 상기 유전자들은 생산 균주에서 향상된 전사인자 발현에 의해 동정되었기 때문에, 잠재적인 보조 인자가 실제 보조 인자일지는 확실하지 않았다. 실제, 잠재적 보조 인자는 단백질 분비에 대한 아무런 긍정적 효과가 없을 수 있으며, 심지어 부정적 영향을 지닐 수도 있다. 이러한 점은 본 발명자들에 의해 실제 관찰되었으며, 55개의 유전자들 중 동정된 샤페론을 암호화하는, 분비를 향상시킬 것으로 일응 예측되는 두 유전자(SCJ1, HCH1)는 이와 반대되는 결과를 보였다. 따라서, 각 유전자에 대한 시험을 필요로 하였고, 약 60개의 유전자 중 하나에 의해 암호화되면서, 실제 분비 보조 인자인 단백질에 대한 어떠한 정보도 존재하지 않았다.
이러한 이유로, "실제" 분비 보조 인자인 유전자를 발견하는 것은 간단한 문제가 아니며, 즉, 이용 가능한 어떠한 정보도 없는 상태에서 단지 스크리닝에서의 유전자/단백질 서열 또는 동정된 단백질의 기능으로부터 이를 발견하는 것은 본 발명자들에 의한 독창적인 선택을 필요로 한다.
또한 과발현된 상기 주요 후보 유전자들의 특징적인 점은 하기 기술한 바와 같다- 이들은 일반적인 분비 보조 단백질이 아니며, 예를 들어, 단백질 분비에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지지 않은 기능을 갖거나, 기능이 알려지지 않은 단백질을 암호화는 유전자이다.
바람직한 구현예로서, 숙주세포는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 162로 표시되는 아미노산 서열을 갖은 보조 단백질을 암호화하는 적어도 하나, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는, 적어도 9개의 폴리뉴클레오티드를 발현 또는 과발현하도록 추가로 조작되며, 상기 기능적 상동체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 162로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%의 서열 상동성을 갖는다.
바람직하게, 본 발명은 목적 단백질을 제조하기 위한 재조합 숙주세포를 제공하며, 상기 숙주세포는 적어도 서열번호 1과 40% 서열 상동성, 서열번호 2과 45% 서열 상동성, 서열번호 3과 50% 서열 상동성, 서열번호 4와 45% 서열 상동성, 서열번호 5와 50% 서열 상동성, 서열번호 6과 45% 서열 상동성, 서열번호 7과 40% 서열 상동성, 서열번호 8과 40% 서열 상동성, 서열번호 9와 40% 서열 상동성 또는 서열번호 162와 45% 서열 상동성을 갖는 보조 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 과발현하도록 조작된다. 이러한 숙주세포는 하기 기술된 방법 및 용도에 적용된다.
바람직하게, 숙주세포는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 162로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 발현 또는 과발현하도록 조작된다. 만일 상기 폴리뉴클레오티드(들)가 이미 숙주세포에 존재할 때, 숙주세포는 후술한 바와 같이, 과발현되는 방식으로 조작될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에서 개시된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 형태의 보조 단백질은 과발현된다. 예를 들어, 숙주세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 형태의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 162로부터 선택되는 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 과발현하도록 조작되며, 상기 기능적 상동체는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 162와 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 아미노산을 갖는다.
용어 "과발현하다"는 일반적으로, 관찰되는 발현 수준이 참고 표준에 비해 증가하거나 동일한 양인 경우를 나타낸다. 본 발명에서 용어 "과발현하다", "과발현하는", "과발현되는" 및 "과발현"은 유전자 산물 또는 폴리펩티드의 발현이 유전적 변형 전의 숙주세포 또는 유전적으로 변형되지 않은 비교 가능한 숙주세포의 동일한 유전자 산물 또는 폴리펩티드의 발현에 비해 높은 수준인 경우를 나타낸다. 만일 숙주세포가 주어진 유전자 산물을 포함하지 않는다면, 발현을 위하여 숙주세포 내로 상기 유전자 산물을 유도하는 것이 가능하다; 이 경우, 용어 "과발현"은 어느 검출 가능한 발현을 포함한다. 한편, 바람직하게, 상기 숙주세포는 필수적인 것은 아니나, 보조 단백질 HP1-HP10 또는 이의 기능적 상동체를 과발현한다.
숙주세포에 의한 보조 단백질의 과발현
과발현은 구체적으로 당업자에게 알려진 어느 기술로 달성될 수 있다. 일반적으로서, 과발현은 유전자의 전사/번역 증가, 예를 들어 유전자 복제수 증가 또는 유전자 발현과 연관된 조절 서열 또는 부위의 변경 또는 변형을 통하여 달성될 수 있다. 예를 들어 상기 유전자는 고발현 수준에 도달하기 위하여 항시적 고발현 프로모터 및/또는 강력한 유비쿼터스 프로모터와 작동가능 하게 연결되어 있을 수 있다. 이러한 프로모터는 내인성 프로모터 또는 재조합 프로모터일 수 있다. 선택적으로, 상기 프로모터는 발현이 항시적으로 이루어지고자 조절 서열이 제거될 수 있다. 어느 프로모터의 경우, 유전자 본연의 프로모터가 유전자의 발현 증가 및 유전자의 항시적 발현을 이끄는 이종 프로모터로 치환될 수 있다. 예를 들어, 보조 단백질은 동일한 조건에서 배양된 조작되기 전의 숙주세포에 비해, 상기 숙주세포에 의해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300% 이상 과발현될 수 있다. 추가적으로 유도성 프로모터의 사용은 숙주세포 배양 과정에서 발현 증가를 가능하게 한다. 또한 과발현은 예를 들어, 특정 유전자의 염색체 위치 변형, 특정 유전자, 예를 들어 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결 부위 부근의 핵산 서열 변경, 유전자의 번역 및/또는 유전자의 전사와 관련된 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 억제자, 인헨서, 전사인자 활성자 등)의 변형, 또는 기술적으로 특정 유전자 발현을 저해하는 전통적인 다른 수단 (이에 제한되는 것은 아니나, 안티센스 핵산 분자의 사용, 예를 들어 과발현되는 목적 유전자의 발현을 저해하는 전사 인자에 대한 유전자를 결실 또는 변이시키거나, 리프레서 단백질의 발현을 차단)에 의해 달성될 수 있다. mRNA의 수명을 연장시키는 것 또한 발현 수준을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 어떤 종결 지역은 mRNA의 반감기를 연장하는데 이용될 수 있다(Yamanishi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2011) 75:2234 and US 2013/0244243). 만일 다수의 유전자 복제물이 포함되는 경우, 상기 유전자는 다양한 복제수의 플라스미드에 위치할 수 있거나 염색체에 도입되고 증폭될 수 있다. 만일 숙주세포가 보조 단백질을 암호화하는 유전자 산물을 포함하지 않는 경우, 상기 유전자 산물은 발현을 위해 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 이러한 경우, "과발현"은 당업자로부터 알려진 어느 방법을 이용하여 유전자 산물을 발현하는 것을 의미한다.
보조 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 과발현은 당업계에 다른 방법, 예를 들어 Marx et al., 2008 (Marx, H., Mattanovich, D. and Sauer, M. Microb Cell Fact 7 (2008): 23), and Pan et al., 2011 (Pan et al., FEMS Yeast Res. (2011) May; (3):292-8.)에 기술된 바와 같이 내인성 조절 지역을 유전적으로 변형시켜 달성될 수 있고, 이러한 방법은, 예를 들어, 보조 단백질의 발현을 증가시키는 재조합 프로모터의 삽입을 포함한다. 형질전환은 Cregg et al. (1985) Mol.　Cell. Biol. 5:3376-3385에 기술되어 있다.
이러한 당업자는 Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), EP 0 472 869, US 4,601,893, Schwarzer and Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001- 1007 (1993)), WO 96/15246, Malumbres et al. (Gene 134, 15- 24 (1993)), JP-A-10-229891, Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) 및 Makrides (Microbiological Reviews 60, 512-538 (1996)), 이 중에서도 유전자 및 분자 생물학에서 널리 알려져 있는 서적으로부터 관련 지침을 찾을 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 보조 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 세포마다 단일 또는 다수 복제물로 존재할 수 있다. 상기 복제물은 서로간 인접하거나 멀리 떨어져 있을 수 있다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 목적 단백질을 암호화하는 재조합 뉴클레오타이드를 실시하여, 숙주세포의 유전체에 세포마다 단일 또는 다수의 복제물로 도입되는데 적절한 하나 또는 그 이상의 플라스미드를 제공한다. 과발현은 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 다수의 복제물, 예를 들어, 숙주세포마다 상기 폴리뉴클레오티드의 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 복제물의 발현에 의해 달성될 수 있다.
POI(s)를 암호화하는 재조합 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 보조 단백질을 암호화하는 재조합 뉴클레오티드 서열은 세포마다 단일 또는 다수 복제 수를 갖는 하나 또는 그 이상의 자율적 복제 플라스미드 상에 제공될 수 있다.
선택적으로, POI를 암호화하는 재조합 뉴클레오티드 서열 및 보조 단백질을 암호화하는 재조합 뉴클레오티드 서열은 세포 마다 단일 또는 다수의 복제수를 갖는 동일한 플라스미드 상에 존재한다.
상기 보조 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 숙주세포의 유전체에 삽입된다. 용어 "유전체"는 일반적으로 DNA (또는 특정 바이러스 종에서 RNA)에서 암호화된 유기체의 모든 유전적 정보를 나타낸다. 이는 염색체, 플라스미드 또는 벡터, 이들 둘 모두 내 존재할 수 있다. 바람직하게, 보조 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 세포의 염색체 내 삽입될 수 있다.
보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 이의 자연적인 유전자자리 내 삽입될 수 있다. "자연적인 유전자자리 (Natural locus)"는 특정 염색체 상 자리로서, 보조 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 위치된다. 예를 들어, HP1 내지 9의 자연적인 유전자자리는 표 1에 나타내었다. 그러나, 또 다른 구현예에서, 보조 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 숙주세포의 유전체 내 자연적 유전자자리가 아닌 이소성으로 삽입된다. 용어 "이소성 삽입"은 일반적인 염색체 유전자자리가 아닌 다른 부위에서 미생물의 유전체로 핵산이 삽입되는 것, 예를 들어 미리 결정되거나 우발적 삽입을 나타낸다. 선택적으로, 상기 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 자연적 유전자자리 및 이소성으로 삽입될 수 있다. 우발적 또는 비-표적화된 삽입을 초래하는 이종 재조합을 이용하는 것도 가능하다. 이종 재조합은 현저하게 다른 서열을 지닌 DNA 분자간 재조합을 나타낸다. 재조합의 방법은 당업계 알려져 있고, 예를 들어 Boer et al., Appl Microbiol Biotechnol (2007) 77:513-523에 기술되어 있다. 또한 Principles of Gene Manipulation and Genomics by Primrose and Twyman (7th edition, Blackwell Publishing 2006)은 효모 세포의 유전자 조작에 대하여 나타내고 있다.
효모 세포에 있어서, 보조 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직한 유전자자리, 예를 들어 AOX1, GAP, ENO1, TEF, HIS4 (Zamir et al., Proc. NatL Acad. Sci. USA (1981) 78(6):3496-3500), HO (Voth et al. Nucleic Acids Res. 2001 June 15; 29(12): e59), TYR1 (Mirisola et al., Yeast 2007; 24: 761-766), His3, Leu2, Ura3 (Taxis et al., BioTechniques (2006) 40:73-78), Lys2, ADE2, TRP1, GAL1, ADH1 또는 5S 리보솜 RNA의 통합체 상에 삽입될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 보조 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 POI를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또는 벡터에 삽입될 수 있다. 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 독자적으로 복제하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라ㄷ유전체에 삽입한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 당업자는 사용되는 숙주세포에 의존하여 적합한 플라스미드 또는 벡터를 이용할 수 있다.
바람직하게, 플라스미드는 진핵세포 발현 벡터이며, 바람직하게 효모 발현 벡터이다.
바람직하게, 플라스미드는 진핵세포 발현 벡터이며, 바람직하게 효모 발현 벡터이다. 숙주로서 효모를 사용하는 플라스미드의 예시로는 YIp형 벡터, YEp형 벡터, YRp형 벡터, YCp형 벡터, pGPD-2, pAO815, pGAPZ, pGAPZα, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K, pPICZ, pPICZα, pPIC3K, pHWO10, pPUZZLE and 2μm 플라스미드를 포함한다. 이러한 벡터들은 알려져 있으며, 예를 들어, Cregg et al., Mol Biotechnol. (2000) 16(1):23-52에 기술되어 있다.
플라스미드는 예를 들어, 재조합 유전자 및 적합한 숙주 유기체 내 이들 mRNA의 번역과 같이 복제된 재조합 뉴클레오티드 서열의 전사를 위해 사용될 수 있다. 또한 플라스미드는 J. Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)에 기술된 바와 같이, 당업계에 알려져 있는 기술에 의해 표적 폴리뉴클레오티드를 숙주세포로 삽입하는데 이용될 수도 있다. "플라스미드"는 일반적으로 숙주세포 내 독자적인 복제를 위한 개시점, 선택적 마커, 수 많은 제한 효소 절개 부위, 적합한 프로모터 서열, 및 전사 종결 인자를 포함하고, 상기 구성들은 함께 작동 가능하도록 연결되어 있다. 목적 단백질의 서열을 암호화하는 폴리펩티드는 숙주세포에서 폴리펩티드의 발현을 위한 전사 또는 번역 조절 서열이 작동 가능하게 연결되어 있다.
대부분의 플라스미드는 세균 세포마다 오직 하나의 복제물이 존재한다. 그러나 몇몇의 플라스미드에서는 많은 복제수가 존재한다. 예를 들어, 플라스미드 CoIE1은 전형적으로 에스체리리카 콜리 내 염색체마다 10 내지 20 플라스미드 복제물이 존재한다. 만일 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 플라스미드내 포함되어 있다면, 상기 플라스미드는 숙주세포마다 20-30, 30-100 또는 그 이상의 복제수를 갖는다. 플라스미드의 많은 복제수에 따라 세포에 의한 보조 단백질들의 과발현이 가능하게 된다.
수많은 적합한 플라스미드 또는 벡터들이 당업계에 알려져 있고, 다수는 상업적으로 이용 가능하다. 적합한 벡터의 예시는 Sambrook et al, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), 및 Ausubel et al, eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1997)에 제시되어 있다.
본 발명의 벡터 또는 플라스미드는 인공 효모 염색체를 포함하고 이는 이형 DNA 서열 (예를 들어, 3000kb 크기의 DNA 서열)을 포함하도록 유전적으로 변형될 수 있는 DNA 컨스트럭트로 나타내며, 짧은 사슬 중합체, 중심립, 및 복제의 개시점(복제 개시점) 서열을 포함한다.
본 발명의 벡터 또는 플라스미드는 또한 인공 박테리아 염색체를 포함하고, 이는 이종 DNA 서열 (예를 들어, 3000kb 크기의 DNA 서열)을 포함하도록 유전적으로 변형될 수 있는 DNA 컨스트럭트로 나타내며, 복제의 개시점 서열 (Ori)을 포함하고, 하나 또는 그 이상의 헬리카제 (예를 들어 parA, parB, parC)를 포함할 수 있다.
숙주로서 에스체리키아 콜리를 사용하는 플라스미드의 예시는 pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pVC119, pSP64, pSP65, pTZ-18R/-18U, pTZ-19R/-19U, pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf(-), 및 pBluescript KSTM (Stratagene)을 포함한다. 에스체리키아 콜리에서 발현을 위한 적합한 플라스미드의 예시는 pAS, pKK223 (Pharmacia), pMC1403, pMC931, 및 pKC30을 포함한다.
보조 단백질 및 POI를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나의 벡터 내에 관련 유전자 각각을 연결하여 숙주세포 내에서 재조합될 수 있다. 유전자를 전달하는 단일 벡터 또는 두 개의 분리된 벡터, 어느 하나의 벡터는 보조 단백질 유전자 및 다른 벡터는 POI 유전자를 전달하는 벡터로 구성이 가능하다. 이들 유전자는 이러한 벡터 또는 벡터들을 이용하여 숙주세포를 형질전환하여 숙주세포 유전체에 삽입될 수 있다. 몇몇 구현예에서는, 보조 단백질을 암호화하는 유전자들은 유전체에 삽입되고, POI를 암호화하는 유전자는 플라스미드 또는 벡터에 삽입된다. 몇몇 구현예에서는, POI 및 보조 단백질을 암호화하는 유전자는 유전체에 삽입된다. 몇몇 구현예에서는, POI를 암호화하는 유전자 및 보조 단백질을 암호화하는 유전자는 플라스미드 또는 벡터에 삽입된다. 만일 POI를 암호화하는 다수의 유전자들이 이용되는 경우, POI를 암호화하는 몇몇 유전자는 유전체에 삽입되는 반면, 다른 유전자들은 같거나 다른 플라스미드 또는 벡터에 삽입된다. 만일 보조 단백질을 암호화하는 다수의 유전자들이 이용되는 경우, 보조 단백질을 암호화하는 몇몇 유전자는 유전체에 삽입되는 반면, 다른 유전자들은 같거나 다른 플라스미드 또는 벡터에 삽입된다.
재조합 세포에서 내인성 폴리펩티드의 과발현은 전사적 또는 번역적 조절인자, 예를 들어 프로모터, 인헨서, 폴리아데닐레이션 신호인자, 전사 종결인자, 내부 리보솜 유입점(IRES) 등의 변형에 의해 달성될 수 있고, 이는 숙주세포에서 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 한다. 이러한 서열은 전사와 관련된 세포성 단백질과 특히 상호작용을 한다(Maniatis et al., Science, 236: 1237-1245 (1987)). 예시적인 서열들은 예를 들어, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 기술되었다.
바람직한 구현예에서, 과발현은 보조 단백질의 발현을 유도하는 프로모터 활성을 향상시키는 인헨서를 사용하여 달성될 수 있다. 전사적 인헨서는 상대적으로 방향 및 위치 독립적이며, 상기 인헨서는 5' 및 3' 방향 전사 단위를 갖고, 인트론 내부 뿐만 아니라, 암호화 서열 자체 내부에서 발견된다. 상기 인헨서는 암호화 서열의 5' 또는 3' 위치에서 발현 벡터 내로 스플라이싱될 수 있으나, 바람직하게 프로모터로부터 5' 위치에 위치할 수 있다. 대부분의 효모 유전자는 오직 하나의 UAS를 포함하며, 이는 일반적으로 캡 (Cap) 위치에 몇 백개의 염기쌍 내부에 존재하므로, 대부분의 효모 인헨서 (UAS)가 프로모터의 3'에 위치하는 경우 제대로 기능을 발휘할 수 없을 수 있으나, 고등의 진핵세포의 인헨서는 프로모터의 5' 및 3'에서도 기능을 발휘할 수 있다.
현재, 많은 인헨서 서열은 포유류 유전자 (globin, RSV, SV40, EMC, elastase, albumin, a-fetoprotein 및 insulin) 유래로 알려져 있다. 또한 진핵세포 바이러스 유래의 인헨서, 예를 들어, SV40 후기 인헨서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인헨서, 복제 개시점의 후면에 존재하는 폴리오마 인헨서, 및 아데노바이러스 인헨서를 사용할 수도 있다, 사카로마이세스 세레비지애 유래 UAS/Gal 시스템과 같은 효모 인헨서는 상위 활성 서열 (UASs)로 명명되기도 하며, 이는 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용될 수 있다 (유럽 특허번호 0317254 및 Rudoni et al., The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, (2000), 32(2):215-224에 기술).
재조합 세포에서 내인성 폴리펩티드의 과발현은 전사적 또는 번역적 조절인자, 예를 들어 프로모터, 인헨서, 폴리아데닐레이션 신호인자, 전사 종결인자, 내부 리보솜 유입점(IRES) 등의 변형에 의해 달성될 수 있고, 이는 숙주세포에서 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 한다. 이러한 서열은 전사와 관련된 세포성 단백질과 특히 상호작용을 한다(Maniatis et al., Science, 236: 1237-1245 (1987)). 예시적인 서열들은 예를 들어, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 기술되었다. 상기 POI 및 보조 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 숙주세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 제공하는 전사적 및 번역적 조절 서열과 작동 가능하게 연결된다. 본 발명에서 사용되는 용어 "전사적 조절 서열"은 유전자 핵산 서열과 관련이 있으며, 유전자의 전사를 조절하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 본 발명에서 사용되는 용어 "번역적 조절 서열"은 유전자 핵산 서열과 관련이 있으며, 유전자의 번역을 조절하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 전사적 및/또는 번역적 조절 서열은 플라스미드 또는 벡터 내 위치하거나, 숙주세포의 염색체 내 삽입될 수 있다. 전사적 및/또는 번역적 조절 서열은 조절하는 서열의 동일한 핵산 분자에 위치된다.
예를 들어, 재조합 세포에서 내인성 보조 단백질의 과발현은 프로모터의 변형, 예를 들어, 높은 수준의 발현에 도달하기 위한 보조 단백질과 작동가능 하게 연결된 내인성 프로모터에 대한 다른 강력한 프로모터로의 교체에 의해 달성될 수 있다. 이러한 프로모터는 유도성 또는 항시적일 수 있다. 내인성 프로모터의 변형은 당업계의 방법을 이용한 돌연변이 또는 상동성 재조합에 의해 수행될 수 있다.
보조 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 과발현은 당업계에 다른 방법, 예를 들어 Marx et al., 2008 (Marx, H., Mattanovich, D. and Sauer, M. Microb Cell Fact 7 (2008): 23), and Pan et al., 2011 (Pan et al., FEMS Yeast Res. (2011) May; (3):292-8.)에 기술된 바와 같이 내인성 조절 지역을 유전적으로 변형시켜 달성될 수 있고, 이러한 방법은, 예를 들어, 보조 단백질의 발현을 증가시키는 재조합 프로모터의 삽입을 포함한다. 형질전환은 Cregg et al. (1985) Mol.　Cell. Biol. 5:3376-3385에 기술되어 있다. "재조합" 프로모터는 서열의 발현을 유도하는 것으로 나타낸다. 본 발명에서 사용되는 재조합 프로모터는 주어진 서열에 대한 본연의 프로모터가 아니며, 예를 들어, 상기 프로모터는 자연 발생 프로모터("본연의 프로모터")와 다르다. 본 발명에서 사용되는 용어 "프로모터"는 특정 유전자의 전사를 돕는 지역을 나타낸다. 프로모터는 전형적으로 프로모터가 존재하지 않은 경우의 발현된 재조합 산물의 양에 비해 뉴클레오티드 서열로부터 발현된 재조합 산물의 양을 증가시킨다. 하나의 유기체로부터 프로모터는 다른 유기체 기원의 서열로부터 재조합 산물 발현을 향상시키도록 이용될 수 있다. 프로모터는 당업계의 방법(예를 들어, Datsenko et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97(12): 6640-6645 (2000))을 이용하여 상동성 재조합에 의해 숙주세포 염색체로 삽입될 수 있다. 추가적으로, 하나의 프로모터 엘리먼트는 동시에 결합된 다수의 서열에 대한 발현 산물의 양을 증가시킬 수 있다. 따라서, 하나의 프로모터 엘리먼트는 하나 또는 그 이상의 재조합 산물의 발현을 향상시킨다.
프로모터 활성은 이의 전사적 효율에 의해 평가될 수 있다. 이는 프로모터 유래 mRNA 전사체의 양의 측정, 예를 들어, 노던 블롯팅, 정량적 PCR에 의해 직접적으로 확인될 수 있고, 프로모터로부터 발현된 유전자 산물의 양을 측정하여 간접적으로 확인될 수 있다.
프로모터는 "유도성 프로모터" 또는 "항시적 프로모터"일 수 있다. "유도성 프로모터"는 특정 인자의 존재 또는 부존재에 의해 유도될 수 있는 프로모터를 나타내며, "항시적 프로모터"는 이와 관련된 유전자 또는 유전자들의 계속적인 전사를 가능하게 하는 비조절된 프로모터를 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 보조 단백질 및 POI 모두를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 유도성 프로모터에 의해 유도된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 보조 단백질 및 POI 모두를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 항시적 프로모터에 의해 유도된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 보조 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 항시적 프로모터에 의해 유도되고, POI는 유도성 프로모터에 의해 유도된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 보조 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 유도성 프로모터에 의해 유도되고, POI는 항시적 프로모터에 의해 유도된다. 실시예서와 같이, HP는 항시적 GAP 프로모터에 의해 유도되고, POI는 유도성 AOX1 프로모터에 의해 유도된다. 일 구현예로서, 보조 단백질 및 POI를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터 활성 및/또는 발현 양상의 관점에서 동일한 프로모터 또는 유사한 프로모터에 의해 유도된다.
수많은 유도성 프로모터가 당업계에 알려져 있다. 상기 프로모터들은 Gatz, Curr. Op. Biotech., 7: 168 (1996) 및 Gatz, Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89 (1997))에 기술되어 있다. 예시로는 테트라사이클린 리프레서 시스템, Lac 리프레서 시스템, 구리-유도성 시스템 (예를 들어 PR1 시스템),글루코코르티코이드-유도성 (Aoyama et al., 1997), 알코올-유도성 시스템, 예를 들어 AOX 프로모터 및 ecdysome-유도성 시스템을 포함한다. 또한 포함되는 프로모터로 설폰아마이드-유도성(U.S. Patent No. 5,364,780) 및 알코올-유도성 시스템 (WO 97/06269 and WO 97/06268) 및 글루타티온 S-트랜스퍼라제 프로모터가 있다.
효모 숙주세포에서 이용하기 위한 적합한 프로모터 서열은 Mattanovich et al., Methods Mol. Biol. (2012) 824:329-58에 기술되어 있고 삼탄당인산 이성질체화 효소 (TPI), 포스포글리세르산 인산화 효소 (PGK), 글리세르알데히드-3-탈수소화 효소 (GAPDH or GAP) 및 이들의 변이체, 락타아제 (LAC) 및 갈락토시다제 (GAL), 피키아 파스토리스 글루코스-6-포스페이트 이성질체화 효소 프로모터 (PPGI), 3-포스포글리세르산 인산화 효소 프로모터 (PPGK), 글리세롤 포스페이트 탈수소화 효소 프로모터 (PGAP), 번역 신장 인자 프로모터 (PTEF), 및 피키아 파스토리스 에놀라아제 1의 프로모터 (PENO1), 삼탄당인산 이성질체화 효소 (PTPI), ㄹ리보솜 소단위 단백질들 (PRPS2, PRPS7, PRPS31, PRPL1), 알콜 산화 효소 프로모터 (PAOX) 또는 변형된 특성을 갖는 이들의 변이체, 포름알데하이드 탈수소화 효소 프로모터 (PFLD), 이소구연산염 분해 효소 프로모터 (PICL), 알파-케토이소카프로에이트 탈탄산 효소 프로모터 (PTHI), 열충격 단백질 패밀리 구성들 (PSSA1, PHSP90, PKAR2), 6-포스포클루콘산 탈수소화 효소 (PGND1), 포스포글리세르산 뮤타아제 (PGPM1), 케톨전달효소 (PTKL1), 포스파티딜이노시톨 합성효소 (PPIS1), 페로-O2-산화 환원 효소 (PFET3), 고-친화적 철 투과 효소 (PFTR1), 억제 가능한 알칼라인 인산가수분해효소 (PPHO8), N-미리스토일 전달 효소 (PNMT1), 페로몬 반응 전사 인자 (PMCM1), 유비퀴틴 (PUBI4), 단리 가닥의 DNA 핵산내부 가수분해 효소 (PRAD2), 미코콘드리아성 내막의 주요 ADP/ATP 교환수송체 프로모터 (PPET9) (WO2008/128701) 및 포름산 탈수소효소 (FMD) 프로모터와 같은 해당 효소를 포함한다. 특히, GAP 프로모터, AOX 프로모터 도는 GAP 또는 AOX 프로모터 유래의 프로모터가 바람직하다. AOX 프로모터는 메탄올에 의해 유도될 수 있고, 예를 들어 포도당에 의해 억제될 수 있다.
적합한 프로모터의 추가적인 예시로는 사카로마이세스 세레비지애 에놀라아제 (ENO-1), 사카로마이세스 세레비지애 갈락토스인산화효소 (GAL1), 사카로마이세스 세레비지애 알콜 탈수소화 효소/글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소화 효소 (ADH1, ADH2/GAP), 사카로마이세스 세레비지애 삼탄당인산 이성질체화 효소 (TPI), 사카로마이세스 세레비지애 메탈로티오네인 (CUP1), 및 사카로마이세스 세레비지애 3-포스포글리세르산 인산화효소 (PGK), 및 말타아제 유전자 프로모터 (MAL)를 포함한다.
효모 숙주세포의 다른 유용한 프로모터는 Romanos et al, 1992, Yeast 8:423-488에 개시되어 있다.
에스체리키아 콜리를 숙주로 이용하기 위한 플라스미드 내 적합한 프로모터는 T7 프로모터, T5 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터, 락토오스 (lac) 프로모터, 트립토판/락토오스 (tac) 프로모터, 지질단백질 (lpp) 프로모터, 및 λ 파지 PL 프로모터를 포함한다.
바람직하게, 보조 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 프로모터는 상기 보조 유전자의 프로모터에 내재하지 않을 수 있다. 바람직하게, 재조합 프로모터는 보조 단백질 유전자의 내인성 프로모터를 대신하여 사용될 수 있다. "재조합" 프로모터는 서열의 발현을 유도하는 것으로 나타낸다. 본 발명에서 사용되는 재조합 프로모터는 주어진 서열에 대한 본연의 프로모터가 아니며, 예를 들어, 상기 프로모터는 자연 발생 프로모터("본연의 프로모터")와 다르다. 이러한 프로모터는 때때로 이종 프로모터로도 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 과발현은 보조 단백질의 발현을 유도하는 프로모터 활성을 향상시키는 인헨서를 사용하여 달성될 수 있다. 전사적 인헨서는 상대적으로 방향 및 위치 독립적이며, 상기 인헨서는 5' 및 3' 방향 전사 단위를 갖고, 인트론 내부 뿐만 아니라, 암호화 서열 자체 내부에서 발견된다. 상기 인헨서는 암호화 서열의 5' 또는 3' 위치에서 발현 벡터 내로 스플라이싱될 수 있으나, 바람직하게 프로모터로부터 5' 위치에 위치할 수 있다. 대부분의 효모 유전자는 오직 하나의 UAS를 포함하며, 이는 일반적으로 캡 (Cap) 위치에 몇 백개의 염기쌍 내부에 존재하므로, 대부분의 효모 인헨서 (UAS)가 프로모터의 3'에 위치하는 경우 제대로 기능을 발휘할 수 없을 수 있으나, 고등의 진핵세포의 인헨서는 프로모터의 5' 및 3'에서도 기능을 발휘할 수 있다.
현재, 많은 인헨서 서열은 포유류 유전자 (globin, RSV, SV40, EMC, elastase, albumin, a-fetoprotein 및 insulin) 유래로 알려져 있다. 또한 진핵세포 바이러스 유래의 인헨서, 예를 들어, SV40 후기 인헨서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인헨서, 복제 개시점의 후면에 존재하는 폴리오마 인헨서, 및 아데노바이러스 인헨서를 사용할 수도 있다, 사카로마이세스 세레비지애 유래 UAS/Gal 시스템과 같은 효모 인헨서는 상위 활성 서열 (UASs)로 명명되기도 하며, 이는 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용될 수 있다 (유럽 특허번호 0317254 및 Rudoni et al., The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, (2000), 32(2):215-224에 기술).
KO 단백질을 저발현하는 본 발명의 숙주세포는 목적 단백질 및 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 162로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 보조 단백질과 동시 발현되는 것이 바람직하다.
바람직하게, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 162로부터 선택되는 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 과발현하도록 조작될 수 있다. 바람직한 구현예로서, 상기 숙주세포는 (1) 1, 2, 3, 또는 그 이상의 KO 단백질 KO1, KO2, KO3 및 이의 기능적 상동체를 저발현하고, (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 보조 단백질 HP1, HP2, HP3, HP4, HP5, HP6, HP7, HP8, HP9, HP10 또는 이의 기능적 상동체를 과발현하도록 조작될 수 있다.
그러나, 보조 단백질 HP3 (서열번호 2) 또는 이의 기능적 상동체 및 HP1 (서열번호 4) 또는 이의 기능적 상동체, 또는 보조 단백질 HP10 (서열번호 162) 또는 이의 기능적 상동체 및 HP3 (서열번호 2) 또는 이의 기능적 상동체의 구체적인 조합은 본 발명의 방법과 용도에 바람직하게 적용될 수 있는 본 발명의 숙주세포의 바람직한 구현예이다.
또한, 보조 단백질 HP2 (서열번호 1) 또는 이의 기능적 상동체 및 HP3 (서열번호 2) 또는 이의 기능적 상동체 및 KO 단백질 KO1 (서열번호 10), 또는 보조 단백질 HP2 (서열번호 1) 또는 이의 기능적 상동체 및 HP1 (서열번호 4) 또는 이의 기능적 상동체 및 KO 단백질 KO1 (서열번호 10)의 구체적인 조합은 본 발명의 방법과 용도에 바람직하게 적용될 수 있는 본 발명의 숙주세포의 바람직한 구현예이다.
이러한 조합을 반영하여 조작된 숙주세포는 바람직한 구현예에서 예상되어 진다. 바람직하게 이러한 숙주세포는 본 발명에서 기술된 바와 같은 방법 및 용도에 적용된다. "반영된"은 당업자가 본 발명의 교시 사항에 따라 보조 단백질은 과발현시키는 반면, KO 단백질은 저발현시키는 것을 인지함을 의미한다.
목적 단백질을 제조하기 위한 본 발명의 숙주세포는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현하고, 추가적으로 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 162로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 과발현하도록 조작되는 것이 바람직하며, 상기 기능적 상동체는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 162로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%, 예를 들어, 적어도 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 상동성을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 보조 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 과발현과 협력하여, KO 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 저발현은 KO 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작하기 전의 숙주세포에 비해 본 발명의 목적 단백질, 예를 들어, SDZ-Fab (서열번호 25 및 26) 또는 HyHEL-Fab (서열번호 29 및 20)의 수율을 적어도 1% 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 적어도 200% 또는 그 이상 증가시킬 수 있다.
여기에서 본 발명은 특정한 방법론, 프로토콜, 또는 시약에 한정되지 않으며 그러한 것들은 다양하게 변할 수 있음으로 이해된다. 여기에서 제공된 논의 및 실시예들은 오로지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적으로 제시되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 오로지 청구항에 의해서만 정의된다.
달리 명시하지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 당해 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본 발명에서 기술한 용어와 동일 또는 동등한 방법, 장치 및 물질이 본 발명의 관행 또는 실험으로 사용될 수 있다 할지라도, 바람직한 방법, 장치 및 물질은 여기 본 발명에서 기술한 바와 같다.
본 발명에서 언급한 모든 공개 문헌은 기술 또는 개시를 목적으로 하며, 예를 들어, 상기 공개 문헌들에 기술된 세포주, 컨스트럭트 및 방법론은 본 발명에서 기술된 발명과 연관지어 사용될 수 있다. 상기 공개 문헌은 종전에 개시되었던 것이며, 상기의 전체 내용은 오로지 본 출원일 전에 개시된 것이다. 본 발명자들은 선행 발명의 인해 본 발명의 개시가 이보다 앞설 자격이 없다는 것을 인정하는 것은 아니다.
본 발명의 실시예는 당업계의 일반적인 기술자에게 본 발명의 제조와 이용하기 위한 방법을 완전히 개시 및 기술하고자 제공하는 것으로서, 이로써 본 발명 및 청구항 기재의 범위를 한정하기 위한 의도는 아니다. 상용되는 수치 (예를 들어, 양, 온도, 농도 등)에 대한 정확성을 확보하고자 노력하였으나, 몇몇 실험적 오차 및 변수는 허용되어야 한다. 달리 명시하지 않으면, 부분은 중량에 대한 부분, 분자량은 평균 분자량, 온도는 섭씨 온도; 및 압력은 대기 또는 대기 부근의 압력이다.
실시예
이하의 실시예는 새롭게 동정된 보조 단백질 각각은, 이들의 과발현에 따라 재조합 단백질의 농도 (mg/L 부피당 산물) 및 수율 (mg/g 바이오매스당 산물, 바이오매스는 세포 건조 중량 또는 세포 함수 중량으로 측정됨)이 증가됨을 입증하고자 하였다. 실시예와 같이, 피키아 파스토리스 효모에서 재조합 항체 Fab 단편 및 재조합 효소의 수율은 증가된다. 진탕 배양 (진탕 플라스크 또는 딥웰 플레이트에서 수행됨) 및 실험 규모의 유가 배양에서 긍정적인 효과를 보여주었다.
실시예 1. P. pastoris 균주의 발생
a) 항체 Fab 단편 HyHEL을 분비하는 P. pastoris의 구축
P. pastoris CBS7435 (유전체는 CBS Kuberl et al. 2011에 의해 시퀀싱됨) mutS 변이체가 숙주 균주로 사용되었다. pPM2d_pGAP 및 pPM2d_pAOX 발현 벡터는 WO 2008/128701A2에 기술된 pPuzzle_ZeoR 벡터 골격의 유도체로서, PUC19 세균성 복제 개시점 및 Zeocin 항생제 저항성 카세트로 이루어진다. 이종 유전자의 발현은 P. pastoris 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소화효소 (GAP) 프로모터 또는 알콜 산화효소 (AOX) 프로모터, 각각, 및 S. cerevisiae CYC1 전사 종결 인자에 의해 매개된다. 항체 Fab 단편 HyHEL의 경쇄(LC) 및 중쇄(HC)는 (도 2) 벡터 DNA 주형 (N-말단 S. cerevisiae 알파 결합인자 신호 선도 서열과 목적 유전자를 전달)으로부터 표 3의 HyHEL-HC 및 HyGEL-LC에 대한 프라이머를 이용하여 증폭되었고, 이들 각각은 SbfI 및 SfiI으로 절단된 벡터 pPM2d_pGAP 및 pPM2d_pAOX 모두에 연결되었다. 상기 LC 단편은 pPM2d_pGAP 및 pPM2d_pAOX의 변이체에 연결되었고, 여기에서 이후 선형화를 가능하게 하기 위하여, 상기 프로모터 부위 내 하나의 제한효소 부위가 교체되었고 (pPM2d_pGAP에서 AvrII 대신 NdeI, pPM2d_pAOX에서 Bpu1102I 대신 Bsu36I), 상기 HC 단편은 변형되지 않은 벡터에 연결되었다. 경쇄 및 중쇄의 서열을 검증한 후, 두 사슬의 발현 카세트는 양립할 수 있는 제한 효소 MreI 및 AgeI을 이용하여 하나 벡터 상에서 조합되었다.
전기천공법에 의해 P. pastoris로 삽입하기 전(standard transformation protocol described in Gasser et al. 2013. Future Microbiol. 8(2):191-208), 플라스미드는 NdeI 제한 효소(pPM2d_pGAP) 또는 Bsu36I 제한 효소 (pPM2d_pAOX)를 사용하여 각각 선형화되었다. 50 μg/mL의 Zeocin을 함유하는 YPD 플레이트 (리터당: 10g 효모 추출액, 20g 펩톤, 20g 포도당, 20g agar-agar) 상에서 양성 형질전환체의 선별을 실시하였다. 콜로니 PCR이 변형된 플라스미드의 존재를 확인하는데 사용되었다. 따라서, 각각 5분간 P. pastoris 콜로니를 가열 및 동결하고, 적절한 프라이머로 PCR을 실시하여 유전체 DNA를 수득하였다.
b) 항체 Fab 단편 SDZ을 분비하는 P. pastoris 균주의 구축
항체 Fab 단편 SDZ의 경쇄 (LC) 및 중쇄(HC)는 (도 2)는 벡터 DNA 주형 (N-말단 알파 결합인자 신호 선도 서열과 목적 유전자를 전달)으로부터 표 3의 SDZ-HC 및 SDZ-LC에 대한 프라이머를 이용하여 증폭되었고, 이들 각각은 SbfI 및 SfiI으로 절단되고 Bsu36 제한효소 부위를 갖는, 벡터 pPM2d_pAOX 또는 pPM2d_pAOX의 변이체에 각각 연결되었다. 경쇄 및 중쇄의 서열을 검증한 후, 두 사슬의 발현 카세트는 양립할 수 있는 제한 효소 MreI 및 AgeI을 이용하여 하나 벡터 상에서 조합되었다.
전기천공법에 의해 P. pastoris로 삽입하기 전(standard transformation protocol described in Gasser et al. 2013. Future Microbiol. 8(2):191-208), 플라스미드는 Bsu36I 제한 효소를 사용하여 각각 선형화되었다. 50 μg/mL의 Zeocin을 함유하는 YPD 플레이트 (리터당: 10g 효모 추출액, 20g 펩톤, 20g 포도당, 20g agar-agar) 상에서 양성 형질전환체의 선별을 실시하였다. 콜로니 PCR이 변형된 플라스미드의 존재를 확인하는데 사용되었다. 따라서, 각각 5분간 P. pastoris 콜로니를 가열 및 동결하고, 적절한 프라이머로 PCR을 실시하여 유전체 DNA를 수득하였다.
표 3은 SDZ LC 및 HC 뿐만 아니라, HyHEL LC 및 HC의 PCR 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 나타낸다 (알파-결합인자_정방향(Alpha-mating factor_ forward)은 Fab 사슬 전체의 증폭을 위한 정방향 프라이머이다.).
[표 3]
Figure 112016112217397-pct00003
실시예 2 케모스태트 배양
배양은 최대 10L의 작업 액량(working volum)을 갖는 1.4 L DASGIP 리엑터 (Eppendorf, Germany)에서 실시되었다.
하기의 배지가 이용되었다:
하기를 함유하는 PTM 1 미량 염 저장 용액 (리터당): 6.0 g CuSO4·5H2O, 0.08 g NaI, 3.36 g MnSO4·H2O, 0.2 g Na2MoO4·2H2O, 0.02 g H3BO3, 0.82 g CoCl2, 20.0 g ZnCl2, 65.0 g FeSO4·7H2O, 및 5.0 mL H2SO4 (95 %-98 %).
하기를 함유하는 글리세롤 회분 배지 (리터당): 2 g Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O), 39.2 g Glycerol, 20.8 g NH4H2PO4, 0.5 g MgSO4·7H2O, 1.6 g KCl, 0.022 g CaCl2·2H2O, 0.8 mg 비오틴 및 4.6 mL PTM1 미량 염 저장 용액. HCl을 첨가하여 pH 5로 조정하였다.
하기를 함유하는 포도당 케모스태트 배지 (리터당): 2.5 g Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O), 55.0 g glucose monohydrate, 21.8 g NH4H2PO4, 1.0 g MgSO4·7H2O, 2.5 g KCl, 0.04 g CaCl2·2H2O, 4.0 mg 비오틴 및 2.43 mL PTM1 미량 염 저장 용액. HCl을 첨가하여 pH 5로 조정하였다.
하기를 함유하는 메탄올/글리세롤 케모스태트 배지 (리터당): 2.5 g Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O), 8.5 g methanol, 50.0 g glycerol, 21.8 g NH4H2PO4, 1.0 g MgSO4·7H2O, 2.5 g KCl, 0.04 g CaCl2·2H2O, 4.0 mg 비오틴 및 2.43 mL PTM1 미량 염 저장 용액. HCl을 첨가하여 pH 5로 조정하였다.
용존 산소는 교반 속도 (400-1200rpm) 및 환기 속도 (12-72 표준상태의 리터/시간 (sL/h))에서 DO=20%로 조절되었고, 온도는 25℃, pH 설정은 NH4OH(25%)를 첨가하여 5로 조정되었다. 생성되는 거품은, 필요한 경우 거품 방지제(5% Glanapon 2000)를 첨가하여 조절되었다.
배양을 시작하기 위하여, 0.4 L 회분 배지를 멸균 여과시키고 멸균된 작업대에 있는 발효조로 옮겼으며, 여기에 1의 광학 밀도 (OD500)로 시작되도록 접종되었다 (50 μg/mL Zeocin을 포함하는 YPG에서 180 rpm, 28℃로 밤새도록 전-배양시킨 P. pastoris로부터). 약 24시간의 회분 단계는 약 20g/L 농도의 건조 바이오매스에 도달하게 하였고, 이후, 40 mL/h (μ=D=0.1/h)의 케모스태트 배지를 일정하게 공급함과 동시에 배지를 일정하게 제거하여 전체 부피가 일정하게 유지되도록 하였다. 약 25g/L의 건조 바이오매스 농도는 7 잔류 시간 (70 시간)후 도달하였으며, 이 때, 마이크로어레이 실험을 위한 샘플이 수거되고 배양이 종결되었다. 케모스태트 배양은 각각의 생산 균주 (포도당 케모스태트 배지를 이용한 CBS7435 pGAP HyHEL-Fab 및 메탄올/글리세롤 케모스태트 배지를 이용한 CBS7435mutS pAOX HyHEL-Fab) 및 비생산 야생형 대조 균주 (CBS7435 pGAP control 및 CBS7435mutS pAOX control)에 대해 3회 실시하여, 믿을 만한 마이크로어레이 분석에 필요한 생물학적 복제물을 수득하였다.
샘플은 약 70시간 후, 케모스태트의 정상 상태 조건에서 수거되었다. 광학 밀도 또는 효모 건조 중량, 정성적인 현미경 관찰, 세포 생존 능력 검사와 같은 통상적인 샘플의 처리가 배양과 함께 진행되었다. 마이크로어레이 분석을 위하여 샘플은 수거되고 하기와 같이 처리되었다: 최적의 퀀칭을 위하여, 9mL 세포 배양 브로스는 즉시 4.5mL의 차가운 5% 페놀 (Sigma) 용액 (에탄올 abs 내)과 혼합되었고, 사용할 만큼 분주되었다. 2mL의 각 용액은 예냉된 수집 튜브 (GE healthcare, NJ),에서 원심분리되었으며 (1분간 13,200rpm), 상청액은 완전히 제거되고 세포 펠릿을 포함하는 상기 튜브는 RNA 분리 전까지 -80℃에서 보관되었다.
실시예 3. 마이크로 어레이 & 전사체 실험을 위한 데이터 분석
a) RNA 분리 및 마이크로어레이 혼성을 위한 샘플의 제조
제조사의 지침 (Ambion US)에 따른 TRI 시약을 이용하여, 케모스태트 샘플 세포로부터 RNA를 분리하였다. 세포 펠릿은 TRI 시약에 재현탁되었고, 40초 동안 5m s-1 속도의 FastPrep 24 (M.P. Biomedicals, CA)을 이용하여 글라스 비드로 균질화되었다. 클로로포름을 첨가한 후, 상기 샘플은 원심분리되고, 전체 RNA는 이소프로판올의 첨가에 의해 수상으로부터 침전되었다. 상기 펠릿은 70% 에탄올로 세척되었고, 건조된 뒤 RNAse 제거 증류수(RNAse free water)에 재현탁되었다. RNA 농도는 Nanodrop 1000 분광 광도계 (NanoDrop products, DE)를 이용하여 OD250을 측정하여 확인되었다. 상기 샘플로부터 잔존하는 DNA는 DNA free Kit (Ambion CA)를 이용하여 제거되었다. 10μg RNA와 같은 부피의 샘플은 RNAse free water에서 50μL로 희석되었으며, 이후 DNAse buffer I 및 rDNAse I이 첨가되었고 37℃에서 30분간 인큐베이션되었다. DNAase 불활성 시약을 첨가한 후, 샘플은 원심분리되고, 상청액은 새로운 튜브로 옮겨졌다. RNA 농도는 상기 전술한 바와 같이 재차 확인되었다. 추가적으로, RNA 순도는 RNA 나노 칩(Agilent)를 이용하여 분석되었다. 증폭 및 표지된 샘플의 혼성물 (혼합물)로 부터 마이크로어레이의 결과를 모니터링하기 위하여, Spike In Kit (Agilent, Product Nr.: 5188-5279)이 양성 대조군으로 사용되었다. 상기 대조군은 아데노바이러스 유래의 10개의 다른 폴리아데닐화된 전사체로서, 증폭 및 표지되고 상기 RNA 샘플과 함께 혼성되었다. 상기 샘플은 Quick Amp Labelling Kit (Agilent, Prod. Nr.5190-0444)을 이용하여 Cy3 및 Cy5로 표지되었다. 따라서 500ng의 정제된 RNA 샘플은 8.3μL RNAse free water에 희석되었고, 2 μL Spike A 또는 B, 및 1.2 μL T7 프로모터 프라이머가 첨가되었다. 상기 혼합물은 65℃에서 10분간 변성되었고, 5분간 아이스에서 보관되었다. 이후 8.5μL cDNA mastermix (샘플당: 4 μL 5x first strand buffer, 2 μL 0.1 M DTT, 1 μL 10 mM dNTP mix, 1 μL MMLV-RT, 0.5 μL RNAse out)이 첨가되고, 40℃에서 2시간 동안 인큐베이션된 뒤, 65℃에서 15분간 옮기고 아이스에 5분간 보관되었다. 상기 전사체 mastermix (샘플당: 15.3 μL nuclease free water, 20 μL transcription buffer, 6 μL 0.1 M DTT, 6.4 μL 50% PEG, 0.5 μL RNAse Inhibitor, 0.6 μL inorg. phosphatase, 0.8 μL T7 RNA Polymerase, 2.4 μL Cyanin 3 또는 Cyanin 5)가 제조되고, 각각의 튜브에 첨가되었으며, 40℃에서 2시간 동안 인큐베이션되었다. 수득한 표지된 cRNA를 정제하기 위하여, RNeasy Mini Kit (Qiagen, Cat.No. 74104)가 사용되었다. 샘플은 80℃에서 보관되었다. cRNA 농도 및 표지 효율의 정량화는 Nanodrop 분광 광도계에서 실시되었다.
b) 마이크로어레이 분석
Gene Expression Hybridisation Kit (Agilent, Cat. No. 5188-5242)가 표지된 샘플 cRNAs의 혼성을 위해 사용되었다. 혼성화 샘플의 제조를 위하여, 300 ng cRNA (Cy3 and Cy 5) 및 6 μL 10 배 차단제를 nuclease free water에 희석시켜 최종 부피가 24μL에 이르도록 하였다. 1 μL 25배 파쇄 버퍼를 첨가한 후, 상기 혼합물을 60℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 이후, 25 μL GEx 혼성 버퍼 HI-RPM이 반응을 정지시키기 위하여 첨가되었다. 13,200rpm으로 1분간 원심분리한 뒤, 상기 샘플은 아이스에서 냉각되었고, 즉시 혼성을 위하여 사용되었다. 인-하우스 설계된, P. pastoris 특이적 올리고뉴클레오티드 어레이 (AMAD-ID: 034821, 8x15K custom arrays, Agilent)가 사용되었다. 마이크로어레이 혼성은 마이크로어레이 혼성 챔버 사용자 가이드 (Agilent G2534A)에 의해 실시되었다. 우선, 게스킷 슬라이드를 벗겨내고 챔버 기저부에 올려두었으며, Agilent 표지가 위를 향하도록 하였다. 샘플 (어레이당 40 μL)는 8 제곱의 챔버 각각의 중앙에 로딩되었다. 이후, 마이크로어레이 슬라이드는 조심스럽게 게스킷 슬라이드 위에 두었고 (Agilent 표지가 아래를 향함), 챔버 커버가 놓여지고 클램프로 고정화되었다. 모든 샘플은 염료 스왑 방식으로 참조 샘플 군에 대하여 혼성화되었다. RNA 샘플 군은 동량의 다양한 배양물 유래의 RNA를 조합하여 제조되었다. 혼성은 65℃에서 17시간 동안 혼성화 오븐 내에서 진행되었다. 결과를 확인하기 전, 상기 마이크로어레이 칩은 세척되었다. 따라서, 상기 챔버는 해체되었고, 샌드위치 슬라이드가 세척 버퍼 1 내 잠겨있는 동안 각각으로부터 분리되었다. 마이크로어레이는 바로 세척 버퍼 1이 있는 다른 접시로 옮겨졌고, 1분간 세척되었다. 세척 버퍼 2로 옮겨지고(적어도 30℃ 온도), 1분간 세척되었다. 얇은 종이로 슬라이드를 가장 부위만을 건드려 마이크로어레이 슬라이드를 건조시킨 후, 슬라이드 홀더에 두었다 (Agilent 표지가 위를 향함). 슬리이드 홀더에서 결과의 스캐닝이 시작되었다.
c) 데이터 획득 및 마이크로어레이 데이터의 통계학적 평가
이미지는 G2565AA Microarray scanner (Agilent)를 사용하여 50 nm의 해상도로 스캐닝되었고, 그 결과는 Agilent Feature Extraction 9.5 software로 가져왔다. Agilent Feature Extraction 9.5은 점 강도의 정량화를 위하여 상용되었다. 추가적인 정규화 및 데이터 분석을 위하여, 원시 평균 점 강도의 데이터는 오픈 소스 소프트웨어 R로 옮겨졌다.
차등 발현 값을 산출하기 전에, 상기 강도 데이터는 정규화되었다 (배경의 수정은 없었고, Loess 슬라이드 정규화 방법 내 및 Aquantile 슬라이드 정규화 방법이 사용되었다.). 차등 발현 값과 연관된 P-value는 적합한 선형 모델(limma R package)을 사용하여 산출되었고, 뒤이어, Benjamini 및 Yekutieli (limma R package 방법에 의해)의 방법을 이용하여 수많은 실험에 적용되었다. 이들 각각의 대조군에 대한 HyHEL-Fab 생산 균주의 Log2 배 변화를 산출하였다.
마이크로어레이 데이터는 HyHEL-Fab를 생산하는 CBS7435의 케모스태트의 3회 배양물과 이의 비생산 대조 숙주간 발현 수준(배수값 변화 >1.5)에서의 유의차 (p-value<0.05)를 기준으로 확인하였다.
표 4는 HyHEL-Fab를 생산하는 P. pastoris의 마이크로어레이 분석에 따른 상향 조절 유전자를 나타내었다.
[표 4]
Figure 112016112217397-pct00004
Figure 112016112217397-pct00005
실시예 4 동정된 유전자를 과발현하는 균주의 제조
Fab 분비에 대한 긍정적인 효과를 조사하기 위하여, 동정된 유전자는 두 Fab 생산 균주: 마이크로어레이 데이터를 기반으로 하는 CBS7435 pPM2d_pAOX HyHEL (실시예 3) 및 CBS7435 pPM2d_pAOX SDZ (제조는 실시예 1 참조)에서 과발현되었다.
a) pPM2aK21 발현 벡터에서 동정된 잠재적 분비 보조 유전자의 증폭 및 복제
개시 코돈으로부터 종결 코돈 방향으로 표 5에 표시된 프라이머를 이용한 PCR (Phusion Polymerase, New England Biolabs)을 실시하여 실시예 3에서 동정된 유전자는 증폭되었다. 상기 서열은 두개의 제한 효소 SbfI 및 SfiI를 지닌 pPM2aK21 발현 벡터의 MSC 내에 복제되었다. pPMKaK21는 pPM2d (실시예 1a에 기술됨)의 유도체로서, AOX 종결인자 서열 (본래의 AOX 종졀 유전자자리에 삽입하기 위하여), E. coli (pUC19) 복제를 위한 개시점, E. coli 및 효모의 선별을 위한 항체 저항 카세트 (kanMX는 카나마이신 및 G418에 대한 저항성을 부여함), GAP 프로모터, 다중 복제 부위 (MCS)로 이루어진 목적 단백질 (GOI)을 위한 발현 카세트, S. cerevisiae CYC1 전사 종결 인자로 이루어진다. 유전자 서열은 Sanger 시퀀싱에 의해 검증되었다.
[표 5]
Figure 112016112217397-pct00006
Figure 112016112217397-pct00007
Figure 112016112217397-pct00008
b) Fab를 생산하는 P. pastoris 균주 내 동정된 유전자의 동시 발현
Fab를 과발현하는 P. pastoris 균주 CBS7435mutS pAOX HyHEL-Fab 및 CBS7435mutS pAOX SDZ-Fab는 실시예 3 에서 동정되고, 실시예 4a에서 복제된 유전자의 동시발현을 위한 숙주세포로 사용되었다. Fab를 생산하는 균주로 형전전환하기 전, 상기 실시예 3에서 동정된 분리 보조 유전자를 포함하는 pPM2aK21 벡터는 AOX 종결인자 서열 내에서 제한효소 AscI로 선형화되었다. 양성 형질전환체는 G418을 포함하는 YPD 아가 플레이트 상에서 선별되었다.
실시예 5 Fab 발현에 대한 스크리닝
소-규모의 스크리닝에 있어서, 분비 보조 유전자 각각에 대한 8 내지 12개의 형질전환체를 비-조작된 모 숙주와 비교 실험하였고, 세포 성장, Fab 농도 및 Fab 수율의 효과에 기초하여 이들의 순위를 부여하였다. PP7435_Chr3-0933, PP7435_Chr2-0220, PP7435_Chr3-0639, PP7435_Chr1-1232, PP7435_Chr1-1225, PP7435_Chr3-0607, PP7435_Chr4-0448, PP7435_Chr4-0108, PP7435_Chr1-0667의 경우, 매우 우수한 효과를 확인하였다 (적어도 1.2배의 Fab 농도 또는 수율의 증가).
이후, 실시예 7에서, 모든 이러한 복제물 (PP7435_Chr1-0667 제외)은 균주 개량을 검증하기 위하여 생산 과정의 조절 하에서 바이오리엑터 내 배양되었다.
a) Fab 생산 피키아 파스토리스 균주의 소 규모 배양
10 g/L 글리세롤 및 50 μg/mL Zeocin을 포함하는 2mL YP-배지 (10g/L 효모 추출물, 20g/L 펩톤)에 P. pastoris 균주의 단일 콜로니가 접종되었고, 25℃에서 밤새되록 성장되었다. 이러한 배양물의 부분 표본 (2.0의 최종 OD600에 상응)을 20 g/L 포도당 및 포도당 정제 (Kuhner, Switzerland; CAT# SMFB63319)를 포함하는 2mL의 합성 스크리닝 배지 M2 (배지 조성물은 하기에 기재)로 옮기고, 24 딥웰 플레이트 내 170 rpm, 25℃, 25 시간 동안 배양되었다. 상기 배양물은 원심분리에 의해 한번 세척되었고, 이후 펠릿은 합성 스크리닝 배지 M2에서 재현탁되었으며, 부분 표본 (4.0의 최종 OD600에 상응)은 새로운 24 딥웰 플레이트 내 2mL의 합성 스크리닝 배지 M2로 옮겨졌다. 실온, 2500xg에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수득하고 분식을 실시하기 전, 메탄올 (5g/L)은 48시간 동안 12시간 마다 반복적으로 첨가되었다. 바이오매스는 1mL 세포 부유액 당 세포 중량을 측정하여 확인되었고, 상청액 내 재조합 분비 단백질의 확인은 하기 실시예 5b-6c에 기술하였다.
리터 당 하기를 함유하는 합성 스크리닝 M2 : 22.0 g Citric acid monohydrate 3.15 g (NH4)2PO4, 0.49 g MgSO4*7H2O, 0.80 g KCl, 0.0268 g CaCl2*2H2O, 1.47 mL PTM1 미량 금속, 4 mg Biotin; pH는 KOH (고체)를 사용하여 5로 조정하였다.
b) SDS-PAGE & 웨스턴 블롯 분석
단백질 젤 분석을 위하여, 12 % Bis-Tris 또는 4-12 % Bis-Tris gels 및 MOPS 러닝 버퍼 (모두 Invitrogen 유래)를 이용한 NuPAGE® Novex® Bis-Tris 시스템이 사용되었다. 전기영동 후, 상기 단백질은 은 염색에 의해 가시화되거나, 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로스 막으로 옮겨졌다. 따라서 상기 단백질은 제조사의 지침에 따른 습식(tank) 전사를 위하여, XCell II™ Blot Module을 사용하여 니트로셀루로스 막에 일렉트로 블롯팅시켰다. 차단시킨 후, 웨스턴블롯은 하기의 항체에 의해 검출되었다: Fab 경쇄 :항-인간 카파 경쇄 (결합 또는 비결합)-알칼라인 포스포스파타아제 (AP) 결합된 항체, Sigma A3813 (1:5,000); Fab 중쇄: 1:1,000으로 희석된 마우스 항-인간 IgG 항체 (Ab7497, Abcam) 및 항-마우스 IgG (Fc 특이적)- 1:5,000으로 희석된 이차 항체로서, 염소에서 생산된 알칼라인 포스포스파타아제 항체 (A1418, Sigma) .
AP-결합체는 NBT/BCIP 시스템, 또는 HRP-결합체는 chemoluminescent Super Signal West Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific)에 기초한 colorimetric AP detection kit (BioRad)에 의해 검출되었다.
c) ELISA에 의한 Fab의 정량화
ELISA에 의한 순수 Fab의 정량화는, 코팅 항체로서 항-인간 IgG 항체 (ab7497, Abcam), 검출 항체로서 알칼라인 포스포스파타아제 결합된 항체 (Sigma A8542)를 사용하여 실시하였다. 인간 Fab/kappa IgG 단편 (Bethyl P80-115)은 최초 농도 100ng/mL를 표준으로 사용되었고, 이에 따라 상청액 샘플은 희석되었다. 검출은 pNPP (Sigma S0942)으로 실시되었다. 코팅-, 희석-, 세척 버퍼는 PBS (2 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4.2 H2O, 2.7 mM g KCl, 8 mM NaCl, pH 7.4)에 기초하였고, 이에 따라 BSA (1% (w/v)) 및/또는 Tween20 (0.1% (v/v))가 추가되었다.
실시예 6 선별에 의해 동정된 유전자를 저발현하는 균주의 제조
실시예 3에서 동정된 몇몇의 유전자는, HyHEL-Fab를 생산하는 P. pastoris 숙주 균주에서 과발현될 때 (실시예 4 및 5), Fab의 분비를 감소시킨다. 이러한 두 유전자는 샤페론을 암호화하며, 사이토솔릭 사페론 (cytosolic chaperone) PP7435_Chr3-1062 (KO2) 및 ER-거주 샤페론(ER-resident chaperone) PP7435_Chr1-0176 (KO3)으로 명명된다. 샤페론은 일반적으로 발현/분비 향상 효과를 갖는 것으로 여겨지는바, 이러한 발견은 매우 놀라운 것이다. 놀랍게도, PP7435_Chr1-0176의 과발현은 비-조작된 HyHEL-Fab 또는 SDZ-Fab 모 생산 균주에 비해 80% 이하로 Fab 농도 및 수율을 감소시켜 부정적인 효과를 나타냈다. 또한 PP7435_Chr3-1062의 과발현은 비-조작된 모 균주에 비해 80% 이하로 HyHEL Fab 농도 및 수율을 감소시켰다. 따라서, 이러한 유전자 (PP7435_Chr1-0176/SCJ1, PP7435_Chr3-1062/HCH1)는 두 숙주 균주에서 파괴되었다. 전사체학 실험(실시예 3)에서 많은 응집-관련 유전자들이 강력하게 하향-조절 (배수값 변화 <0.66)됨을 확인한 후, 응집 전사 인자 PP7435_Chr4-0252/FLO8이 추가적으로 넉-아웃 표적으로 선택되었다.
Fab를 과생산하는 P. pastoris 균주 CBS7435mutS pAOX HyHEL-Fab 및 CBS7435mutS pAOX SDZ-Fab는 숙주 균주로 사용되었다: 파괴된 유전자 자리를 갖는 형질전환체를 생산하기 위하여, Heiss et al. (2013) [Appl Microbiol Biotechnol. 97(3):1241-9.]에 기술된 스플릿 마커 카세트 접근법이 사용되었다. G418 첨가 배지에서 성장될 수 있는 형질전환체의 유전체 DNA, 및 파괴 카세트 바깥 프라이머 (표 6)를 사용한 PCR을 통해 양성 넉-아웃 균주의 검증이 실시되었다.
표 6은 넉-아웃 카세트의 구축을 위해 사용된 모든 프라이머를 목록화하였다 (넉-아웃 표적 마다 2 중복 스플릿 마커 카세트): 프라이머 쌍, A_forward/A_backward, B_forward/B_backward, C_forward/C_backward, D_forward/ D_backward은 PCR을 통한 단편 A, B, C, 및, D를 증폭하기 위하여 사용되었다 (Phusion Polymerase, New England Biolabs). 단편 A는 유전체 P. pastoris DNA로부터 증폭된 것으로서, 각 ATG (표적 유전자의)의 5' 방향으로 1700bp에서 시작하여, ATG의 5' 방향으로 200bp까지이다. 단편 D는 유전체 P. pastoris DNA로부터 증폭된 것으로서, 각 ATG (표적 유전자의)의 3' 방향으로 200bp에서 시작하여, ATG의 3' 방향으로 1700bp까지이다. 단편 B는 KanMX 선별 마커 카세트의 앞 2/3로 이루어지고, pPM2aK21 벡터 DNA 주형으로부터 증폭된다. 단편 B는 KanMX 선별 마커 카세트의 뒤 2/3로 이루어지고, pPM2aK21 벡터 DNA 주형으로부터 증폭된다. 단편 A 및 B는 프라이머 A_forward 및 B_backward를 이용한 오버랩 PCR에 의해 함께 어닐링된다 (AB). 단편 C 및 D는 프라이머 C_forward 및 D_backward를 이용한 오버랩 PCR에 의해 함께 어닐링된다 (CD). 넉-아웃 균주를 제조하기 위하여, Fab 생산 숙주세포는 전체 0.5 μg 단편 AB 및 CD의 DNA로 형질전환되었고, 또한 모두 중첩되었다. 세포는 500μg/mL G418을 포함하는 YPD 아가 플레이트에서 선별되었다. 양성 넉-아웃 복제물은 프라이머 쌍 check_forward (primer A_forward 서열은 5' 부위 부근에 결합) 및 check_backward (primer D_backward 서열은 3' 부위 부근에 결합)을 사용한 PCR에 의해 검증되었다. 400 bp 부위 (ATG 부근)이 KanmX 카세트로 교체됨에 따라, 양성 넉-아웃 균주의 PCR 밴드는 야생형 서열의 균주에 비해 크게 관찰되었다.
[표 6]
Figure 112016112217397-pct00009
실시예 7. 유가 배양
소-규모 배양에서 가장 우수한 효과 (적어도 1.2 배 모델 단백질의 수율 증가)를 보였던 실시예 5 및 6에 따른 보조 단백질로 조작된 균주를 유가 바이오리엑터 배양에서 분석하여, 생산 균주의 개량을 검증하였다. 두 가지의 프로토콜이 사용되었다.
a) 유가 배양 프로토콜 A
유가 배양은 1.0 L의 최대 부피를 갖는 1.4 L DASGIP 리엑터 (Eppendorf, Germany)에서 수행되었다. 배양 온도는 25℃로 조절되었고, pH는 25% 암모늄 하이드라이드를 첨가하여 5.0으로 조정되었으며, 용존 산소 농도는 400 내지 1200의 교반 속도 조절 하에서 20% 이상으로 유지되었고, 환기 속도는 24 내지 72 sL/h 였다.
유가 배양을 위한 접종물은 20 g/L glycerol 및 50 μg/mL Zeocin를 포함하는 100mL의 YP 배지를 포함하는 진탕 플라스크에서 배양되었고, 약 24시간 동안 180rpm 및 28℃에서 배양되었다. 상기 배양물은 1.0의 최초 광학밀도 (600nm) 및 바이오리엑터 내 0.4L의 최초 부피로서 접종하는데 사용되었다. 상기 배양은 약 24시간 후 마무리되었고, 처음으로 염 성분(10mL)이 주어졌다.
이후, 글리세롤 유가 용액은 5시간 동안 5mL/h의 일정한 속도로 제공되었다. 이후, 상기 배양물에 메탄올 (2 g)이 첨가되고, 염 성분(10 mL)이 주어졌다. 배양물 내 용존 산소의 증가에 의해 메탄올의 소비를 확인한 후, 메탄올 유가 용액의 연속적인 공급이 공급 속도 1.0 g/h로 시작되었다. 10 mL의 염 성분은 새로 형성된 10g의 바이오매스마다 주어졌고, 이는 ~43g 메탄올 공급 배지에 상응한다. 바이오매스의 농도가 증가함에 따라, 메탄올 공급 속도는 증가되었고, 이때, 메탄올 축적은 배양물 내 용존 산소의 갑작스런 증가 또는 짧은 기간 동안의 공급 차단에 의해 제거될 수 있었다. 메탄올의 최종 공급 속도는 2.5 g/h였다.
샘플은 Fab의 정량화 및 바이오매스 확인을 위하여 자주 수거되었다 (실시예 6에 기술). 약 10시간 후, 세포 밀도가 100g/L 세포 건조 중량 이상이 되었을 때, 배양물은 수득되었다.
상기 배지는 하기와 같다:
하기를 함유하는 회분 배지(리터당): 2.0 g citric acid, 12.4 g (NH4)2HPO4, 0.022 g CaCl2·2H2O, 0.9 g KCl, 0.5 g MgSO4·7H2O, 40 g glycerol, 4.6 mL PTM1 미량 염 저장 용액. pH는 25% HCl에 의해 5.0으로 설정되었다.
하기를 함유하는 글리세롤 유가 용액(리터당): 623 g glycerol, 12 mL PTM1 미량 염 저장 용액 및 40 mg biotin. PTM1 조성물은 실시예 1에 주어졌다.
하기를 함유하는 순수 메탄올의 메탄올 유가 용액 (리터당): 12 mL PTM1 미량 염 저장 용액 및 40 mg biotin.
하기를 함유하는 염 성분 용액(리터당): 20.8 g MgSO4·7H2O, 41.6 KCl, 1.04 g CaCl2·2H2O.
b) 유가 배양 프로토콜 B
각각의 균주는 50 mL의 YPhyG로 채워져 있는, 넓은-목, 칸막이를 지니며, 덮혀 있는 300 mL 진탕 플라스크에 접종되었고, 28℃에서 110rpm으로 밤새도록 교반되었다 (전-배양물 1). 전-배양 2 (넓은-목, 칸막이를 지니며, 덮혀 있는 300 mL 진탕 플라스크 내 100 mL YPhyG)는 전-배양물 1로부터 OD600 (600nm에서 측정된 광학 밀도)이 늦은 오후 (배가 시간: 약 2시간)에 약 20에 도달하도록 접종되었다. 전-배양물 2의 인큐베이션 역시 28℃에서 110rpm으로 실시되었다.
유가 배양은 1.0 L의 최대 부피를 갖는 바이오리엑터 (Minifors, Infors, Switzerland)에서 수행되었다. 모든 바이오리엑터 (약 5.5 pH에서 400mL BSM-배지로 채워짐)는 OD600이 2일때, 전-배양물 2로부터 각각 접종되었다. 일반적으로, 바이오매스를 생산하기 위하여 글리세롤 상에서 성장된 P. pastoris 및 배양물은 글리세롤이 공급된 후 뒤이어 메탄올이 공급되었다.
최초의 회분 단계에서, 온도는 28℃로 설정되었다. 생산 단계의 시작 전, 남은 기간에 걸쳐 온도는 25℃로 감소되었고, 이러한 수준은 남은 과정 동안 유지되었으며, 이러한 과정 동안 pH는 5.0으로 떨어졌고, 이러한 수준은 유지되었다. 산소 포화도는 전체 과정 동안 30%로 설정되었으며 (연속적인 조절: 교반, 흐름, 산소 공급) 교반은 700 내지 1200 rpm으로 적용되었고, 공기의 흐름 (flow)은 1.0-2.0 L/min의 범위로 선택되었다. 25% 암모늄을 사용하여 pH는 5.0으로 조정되었다. 생성되는 거품은, 필요한 경우 거품 방지제 5% Glanapon 2000를 첨가하여 조절되었다.
회분 단계 동안, 바이오매스는 110-120g/L의 함수 세포 중량 (WCW)에 이를 때까지 생성된다(μ-0.30/h). 보편적인 회분 단계 (바이오매스 생성)는 14시간 동안 지속된다. 6 g/(L*h)의 일정한 속도 글리세롤-공급은 11시간 후 시작되었고, 5시간 동안 지속되었다. 첫 샘플 채취 시점은 16시간째 (이하에서는 "O 시간"의 유도 시간으로 명명함)였다.
전체 290g의 메탄올이 약 95 시간 동안 제공되었다 (식 1 + 0.04 * t (g/L)에 의해 선형으로 증가하는 공급 속도).
샘플은 하기의 과정에 의해 다양한 시점에 수거되었다: 첫 3mL의 샘플화된 배양 브로스는 (실린지 이용) 폐기되었다. 1mL의 새롭게 수득된 샘플(3-5mL)은 1.5mL 원심분리 튜브에 옮겨졌고, 13,200 rpm (16,100g)에서 5분간 원심분리되었다. 상청액은 조심스럽게 분리된 바이알로 옮겨졌다.
1 mL의 배양 브로스는 에펜돌프 바이알에서 13,200rpm으로 5분간 원심분리되었고, 생성된 상청액은 제거되었다. 상기 바이알의 중량을 측정하였고 (정확도 0.1mg), 빈 바이알의 용기는 세포 함수 증량을 수득하는데 이용되었다.
상기 배지는 하기와 같다:
하기를 함유하는 YPhyG 전배양 배지 (리터당): 20 g Phytone-Peptone, 10 g Bacto-Yeast Extract, 20 g glycerol
회분 배지: 하기를 함유하는 변형된 염기성 염 배지 (BSM)(리터당): 13.5mL H3PO4 (85%), 0.5 g CaCl·2H2O, 7.5 g MgSO4·7H2O, 9 g K2SO4, 2 g KOH, 40 g glycerol, 0.25 g NaCl, 4.35 mL PTM1, 8.7 mg biotin, 0.1 mL Glanapon 2000 (antifoam)
하기를 함유하는 글리세롤 공급 용액: 600 g glycerol, 12 mL PTM1
하기를 함유하는 메탄올 공급 용액: 순수 메탄올
c) 결과
표 7은 유가 생산 과정에서, 과발현된 경우, Fab를 생산하도록 조작되지 않은 대조 균주에 비해 P. pastoris의 Fab 분비 증가를 보여준 유전자를 목록화하였다. Fab 산물 농도는 ELISA (실시예 5c)에 의해 정량화되었다. 바이오매스는 세포 함수 중량 또는 세포 건조 중량으로 확인되었다. Fab 산물 농도 및 수율의 변화는 대조군에 대한 상대적인 배수 값으로 나타내었다. 이러한 배수 값은, 직접적인 비교를 위하여 성장 및 샘플화된 AOX HyHEL 및 AOX SDZ 모 숙주에 비해, 유가 생산 과정에서 산물의 농도 및 수율이 향상됨을 보여준다.
[표 7]
Figure 112016112217397-pct00010
나타낸 바와 같이, 목록화된 모든 서열은 이들의 과발현에 의해 모델 단백질 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab 수율이 적어도 20% (배수 값>1.2) 증가되었다.
표 8은 유가 생산 과정에서, Fab를 생산하도록 조작되지 않은 대조 균주에 비해, P. pastoris의 Fab 분비 증가를 보여주는 결실된 유전자를 목록화하였다. 상기 Fab 산물은 ELISA (실시예 5c)에 의해 정량화되었다. Fab 산물 농도 및 수율의 변화는 대조군에 대한 상대적인 배수 값으로 나타내었다.
[표 8]
Figure 112016112217397-pct00011
나타낸 바와 같이, 목록화된 모든 서열은 이들의 저발현에 의해 모델 단백질 SDZ-Fab 또는 HyHEL-Fab의 Fab 농도(mg/L) 또는 Fab 수율(mg/바이오매스)이 적어도 28% (배수 값 >1.28) 증가될 수 있었다.
실시예 8: HPs 및 HPs와 KO 단백질의 조합
과발현 표적 유전자의 조합을 위하여, 항시적인 pGAP 프로모터 조절 하에서 HP3 ('3') 또는 HP10 ('34')을 과발현하는 CBS7435mutS pAOX SDZ-Fab 균주가 사용되었다 (실시예 4a 및 b 에 이들의 제조가 기술). 상기의 과발현과 저발현 표적 유전자와의 조합을 위하여, KO1 유전자 자리가 파괴된 CBS7435mutS pAOX SDZ-Fab 균주가 사용되었다 (실시예 6에 기술). 모든 균주에서 모델 단백질 SDZ-Fab를 암호화하는 플라스미드는 선별 마커인 Zeocin을 기초로 하였고, 여기서 HP 또는 KO 유전자 자리의 파괴를 위해 사용된 카세트를 동시 발현하기 위한 플라스미드는 동시-방향성 loxP 인식 부위의 측면에 위치한 KanMX 저항성 카세트를 지니도록 하였다.
HP 또는 KO 카세트로 형질전환하기에 앞서서, 마커 유전자 발현 카세트 (KanMX- loxP 부위 측면)는 Cre 재조합효소에 의해 재사용되었다. 따라서 기초 균주는 에피좀성 pTAC_Cre_HphMX4 플라스미드로 현질전환되었고, 이는 S. cerevisiae TPI 프로모터 조절하에서 Cre 재조합효소를 발현하였으며, 이는 배양 배지 내 존재하는 hygromycin(Hyg)에 의해 선택 압력만큼 일시적으로 P. pastoris 내 유지되었다. 형질전환체는 28℃에서 2일 동안 YPD/Zeo/Hyg 아가 플레이트에서 성장되었고, 28℃에서 추가 2일 동안 성장을 위한 선택적 아가 배지에서 복제되었다. 2-3회 플레이팅 후, G148 및 Hyg 상에서 성장하는 능력을 상실한 복제 산물만을 24 딥웰 플레이트 (DWP) 스크리닝을 위해 선택하였다 (실시예 5a에 기술). Fab 농도 및 수율은 실시예 5c에서 기술하였다. Fab 수율 및/또는 농도 면에서 가장 우수한 균주는 HP 단백질을 과발현하는 다른 플라스미드로 형질전환되었다 (실시예 4a 및 b). HP 또는 KOs가 조합된 형질전환체는 선택적 아가 배지 (Zeo 및 G418 포함) 상에서 선별되었고, 실시예 5에 기술한 바와 같이 Fab 분비를 스크리닝하였다. 추가적인 재조합 단계를 위하여, 전술한 과정을 반복하였고, 따라서, 3개의 조합 등으로 이루어진 균주가 제조되었다. 모든 스크리닝 실험에서, 모 균주(=앞선)는 참조로서 사용되었다.
상기의 결과는 하기와 같다. - 표 9
[표 9]
Figure 112016112217397-pct00012
"본래 균주"는 각각 HP 또는 넉-아웃이 없는 P. pastoris 균주 pAOX-SDZ-Fab#9를 의미한다.
"모 균주"는 각각 이후 HP 또는 KO에 의한 형질전환을 위한 숙주세포로서의 역할을 수행하는 SDZ-Fab를 발현하는 P. pastoris 균주 (예를 들어, HP3 및 HP1의 조합에 대한 HP3만을 과발현하는 균주, HP3 또는 HP1을 갖는 KO1 HP2의 조합에 대한 HP2 과발현, KO1 넉-아웃을 갖는 균주)를 의미한다. 본래 균주 및 모 균주 모두와 비교하여, 이들 각각에 대한 조합은 모델 단백질 SDZ-Fab의 Fab 농도 증가로 이어짐을 확인할 수 있었다. 모 균주와의 비교에 의한 상기 Fab 농도의 증가는, HPs 또는 HPs 및 KO 단백질의 조합을 통해, 예시적인 POI인 모델 단백질 SDZ-Fab의 수율을 보다 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
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gcgcgatctc ccaaaccaat tccagtcaag 120 gttgtgatag tgggagatgg tggatgtgga aagacatgtc ttctcaatgt ctttgccact 180 ggaacgtttc ctgaggcgta tgtccccaca atcatagaaa atgtggttat tacattggtg 240 accccaactg gccagatagc tgccgttact ctgtgggata ctgcagggca agaagagtac 300 gacagattga gacccctaag ctactccgac gttgacgtgg tcttgctgtg ctacagcata 360 gacaatctgt ccacctttca taatgtggcc gacaaatggt acccagaagt ggcacatttt 420 tgtccaaaca caccgatcat cttggtaggt accaaatctg atatgcggcg tcatcagaag 480 agtcagccgc actttgtatc tccccaggat tcgtcgcagt tggcaaggca gatgggggca 540 gtgatgaaca tcgagtgttc tgcgaaggag gtttcaaacg tcaatatcgt ttttgatgct 600 gctgtgtcgt actgtttgag taacagcagg cccaagacca gaggggataa tgacaacaat 660 aggagtaaca gacggctaag tagagccaag cgagccagca tgtttataag gggtaaggat 720 gttagctcaa cgtcaggaaa ctctcgggaa gaacttgttg aatacgatca agatgggttg 780 gcaataatac cggacagaaa gaaacgcaaa tgtagcatta tttga 825 <210> 17 <211> 384 <212> DNA <213> Pichia pastoris <400> 17 atgactaact ggaaagcgat attgactccc gctcaatacc aagtcctccg tttgggcgga 60 acagaaagac 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tggacgagca tgaccaaaga tacttgaaag ctgaagagta cattcaaata 540 gtttatgagc tgttgttatc gtcttggaga gatgatgcag tagttttaga caagaaagct 600 ggtgtttata ctgacccaac aagatttcga aagatcaact ttgaaggtaa atttttcaaa 660 gttccgggac cacatattgt tgaccccacc cctcaaagac tgcctgtgat tcttcaagct 720 ggtacttcta aagttggtaa ggagtttgct gctaagcatg ccgagattgt gtttgtcatt 780 tcattttctc cagatgattt gaaacccaag attgcagaag ttcgtcaact ggccaaagaa 840 aagtttggta gaaaccacga cgatattaag tttgttgccc ttgcaacccc tgttattgga 900 gccacacatg aactagctga agaaaagtac caagagttac taagttatgg tgatattgaa 960 ggtgctcaag ccttatttgg agggtggact ggcattgacc tctctcaata tggcgaagat 1020 gaagaactag gaaatgttag ttccaatgct atgcgtggcg ctgtacaaaa ctggactaaa 1080 gcaattccaa atgagaagcg ttggacacgt aaggttattg ctaaacagat taccgttggt 1140 ggtctaggtc cagctttcgt tggaacccca gaagaaatcg ccgatgagct ggaacactgg 1200 tccgaccacg ctggtttgga cggattcaac ttcacttatg ctgtcaaccc gctttctttc 1260 gaagagatag tggaagactt gattccagtt cttcagcgaa gagggttggc ccaaaaggaa 1320 tacccaaatc cagaaactgg aagcacattc cgtaaaaacc tttttggaac agactttgta 1380 ccatctaccc acccagctta taacttaaga tggagggctg gtgtgtccaa ggaagaattc 1440 gaaaagtccc taaacgccac aacaaattgg tattccagtt tcgctaggtc aggtgctcta 1500 ggtgaattgc ataatacatg caggattctc tatctccaaa tagtgaaata taaatatagg 1560 cttcgagtcc gttcagaagg gaatagcatc cccttcgcca aaatgaccaa ggaaaatgaa 1620 gccaagaggc agaaaacctc tcaaccaaaa gcgaagaagc aattgattat caatgctttc 1680 atgtcaggct cttcgggtaa ccaatcgcca ggactgtggt cgtaccctgg agacaaatca 1740 acagagtata ctaccctaga ttactgggtg gagttagctc aaaagctgga aaaggccaaa 1800 ttccattcta tcttcattgc cgatgttctg ggtggatatg acgtttacaa tggacctgga 1860 aactacagtg ctgctgcaaa atctggtgcc caatttccaa tgattgaacc aagtgctgca 1920 gttactgcca tggctgctgc taccaagtca ataacgttcg gagtgacttt ttccactata 1980 agtgaggcac cttatcattt tgcaagaaga ttgggaactt tagatctgct gacaaacgga 2040 agagtcggct ggaatatcgt ctcttcgtat cttgacagtg ccgccagaaa tcttttgaat 2100 ggagaaccac tccctctcca tgcagaccgt tataagagag ccgaagaatt cctacaagtt 2160 gtatatcggt tattcctttc ttcatggaga gacgatgctt ataaattgga taagaaaacc 2220 agaacctttg ctgacccaaa acttattaga actatcgacc acgttggaga gttcttcaat 2280 gtcccaggcc cccagttcct accacccact cctcagagac taccgctgat tttgcaggct 2340 ggtacttcca aggttggtat ggattatgct gcaaaacatg cagaggttgt ctttttagct 2400 tcatttgacc cagagtcact ccaagaaaaa atcaaaacag tgagagatat cgctgaaacc 2460 aagtacaaca gaccaagaga ttcaatcaaa ttcttaattt tgataacagt agtcatagct 2520 gatacacacg aagatgccgt gaagagatac gaagatctcg ccagttatgc tgatctggaa 2580 ggggcccaag cactgttcag tggttggact ggaatagata ttggaaagta tggtgaagat 2640 gaacctcttg agcatgtgga atctaacgct attaagagcc atgttaagaa ctggactaag 2700 ttcaaggaca ataagcctag agccagaaaa gatatcgcta aacagattgg agttggaggc 2760 tcaggtccct tacttgttgg atctgtacaa gagatagccg acgagcttga gagatgggca 2820 gaagtctctg acctcgatgg ctttaacttc gcttacgcag attaccccca aacttttgat 2880 gatatcattg aaaaactgct tccagagttg aacaagagag gtgtgttctg ggatgattat 2940 aaaattccag gtggaacctt cagagagagc gtgtttggaa gaaagttcgt tgataaggat 3000 catcctgctt atgatctgag 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artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 ctatggccga ggcggcccta ttaacactca cctctgttg 39 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 tatcggccga ggcggcccta ttacttacct ggggacaag 39 <210> 37 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 ctatggccga ggcggcccta ttaacactca cctctgttg 39 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 cttgcctgca ggatgctaac ggccagttgg tc 32 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 gatcggccga ggcggcctca gcagtattcc caccagaatc 40 <210> 40 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 cttgcctgca ggatgtcagt tcatttcgtt atagcagc 38 <210> 41 <211> 52 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 41 gatcggccga ggcggcctca tataaaaggt ttatcataat tctcatcctc ag 52 <210> 42 <211> 43 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 gaaacctgca 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ttcttttcat caaaactcaa c 51 <210> 80 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 80 gatacctgca ggatggtggt gcacaaccct aataac 36 <210> 81 <211> 49 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 81 gatcggccga ggcggcccta ggtactatgc tgaacatcct gagtatgag 49 <210> 82 <211> 41 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 82 gaaacctgca ggatgagatt ttctaacgtc gttttaactg c 41 <210> 83 <211> 42 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 83 gatcggccga ggcggcctta caaggcaaag actccgaaag tg 42 <210> 84 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 84 gacacctgca ggatgactgt gcctgatctg aaagaaac 38 <210> 85 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 85 gatcggccga ggcggcctca ggccagcgca acg 33 <210> 86 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 86 cttgcctgca ggatgaagat atggctggta cttcttttag tttttg 46 <210> 87 <211> 43 <212> DNA <213> 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gacacctgca ggatgactcc ccgttctcat attttc 36 <210> 95 <211> 50 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 95 gatcggccga ggcggcccta ctcaaagaac ttagacaaag cagctttctc 50 <210> 96 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 96 gatccctgca ggatggcaga agaagaacc 29 <210> 97 <211> 54 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 97 gatcggccga ggcggcccta attagtaata cttgcttcta tttcctggta caac 54 <210> 98 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 98 gaaccctgca ggatgatttt gagcaagctg tcgtttagac 40 <210> 99 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 99 gatcggccga ggcggcctta tttattaaca atgacatcat cttcaaactc g 51 <210> 100 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 100 cttgcctgca ggatgggtgc cattggaatg 30 <210> 101 <211> 44 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 101 gatcggccga ggcggcccta ttgcagaaca ttcgatatcc aatc 44 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<400> 116 cttgcctgca ggatgtccac aactactaag aaaaacaaga acagg 45 <210> 117 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 117 gatcggccga ggcggcctta ccatgcaccc tttcctctc 39 <210> 118 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 118 cttgcctgca ggatgtcaga ggagtaagaa ccacaaacag 40 <210> 119 <211> 45 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 119 gatcggccga ggcggcctca atttattcta ggttttttgg ttcgg 45 <210> 120 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 120 gtaccctgca ggatgatggc aagtccaacc g 31 <210> 121 <211> 34 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 121 gatcggccga ggcggcccgc aacaacgctg gttg 34 <210> 122 <211> 42 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 122 cttgcctgca ggatgagtaa ccagtataat ccgtatgagc ag 42 <210> 123 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 123 gatcggccga ggcggcccta tcttccccag tttccgacac 40 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artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 131 gatcggccga ggcggcccta ctcgtccttc ttgttgctct tctc 44 <210> 132 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 132 cgaacatcca tcaccaaaac ac 22 <210> 133 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 133 gttgtcgacc tgcagcgtac ggtgttgccg cgaaatg 37 <210> 134 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 134 catttcgcgg caacaccgta cgctgcaggt cgacaac 37 <210> 135 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 135 cggtgagaat ggcaaaagct tatg 24 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 136 aagcccgatg cgccagagtt g 21 <210> 137 <211> 41 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 137 cgtctcttgg gcaaattgat cagtggatct gatatcacct a 41 <210> 138 <211> 41 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 138 taggtgatat cagatccact gatcaatttg cccaagagac g 41 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 139 gactgttgcg attgctggtg 20 <210> 140 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 140 atccaggaca cgctcatcaa g 21 <210> 141 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 141 gtgtgtgctc tggaattgga tc 22 <210> 142 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 142 agaggaggtt gaatgcgaag aag 23 <210> 143 <211> 49 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 143 gttgtcgacc tgcagcgtac ttctggtgag cttatatggc agtagttac 49 <210> 144 <211> 49 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 144 gtaactactg ccatataagc tcaccagaag tacgctgcag gtcgacaac 49 <210> 145 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 145 cggtgagaat ggcaaaagct tatg 24 <210> 146 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 146 aagcccgatg cgccagagtt g 21 <210> 147 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 147 ctcgggatca ccaagcacaa gtggatctga tatcaccta 39 <210> 148 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 148 taggtgatat cagatccact tgtgcttggt gatcccgag 39 <210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 149 tcaaagtatg ctgggaagaa tgg 23 <210> 150 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 150 tggattgtct cggaggcg 18 <210> 151 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 151 tactatgact atgggagacc tgggtg 26 <210> 152 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 152 tgaagcatcc cacccactg 19 <210> 153 <211> 44 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 153 gttgtcgacc tgcagcgtac ccttcgcaga ctgtaattat tggc 44 <210> 154 <211> 44 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 154 gccaataatt acagtctgcg aagggtacgc tgcaggtcga caac 44 <210> 155 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 155 cggtgagaat ggcaaaagct tatg 24 <210> 156 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 156 aagcccgatg cgccagagtt g 21 <210> 157 <211> 44 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 157 gttgactttg acggttgcag atacagtgga tctgatatca ccta 44 <210> 158 <211> 44 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 158 taggtgatat cagatccact gtatctgcaa ccgtcaaagt caac 44 <210> 159 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 159 ttctctcctt gattatcggt ctctttc 27 <210> 160 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 160 tggcagatga cttcacaaac g 21 <210> 161 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 161 gtggcatctt tcataacgac atctc 25 <210> 162 <211> 478 <212> PRT <213> Pichia pastoris <400> 162 Met Ser Ser Phe Arg Val Leu Asp Leu Val Lys Pro Phe Thr Pro Phe 1 5 10 15 Leu Pro Glu Val Ile Ser Pro Glu Arg Lys Val Pro Phe Gln Gln Lys 20 25 30 Leu Met Trp Thr Gly Val Thr Leu Leu Ile Phe Leu Val Met Ser Glu 35 40 45 Ile Pro Leu Tyr Gly Ile Thr Ser Ser Asp Ser Ser Asp Pro Leu Phe 50 55 60 Trp Leu Arg Met Met Leu Ala Ser Asn Arg Gly Thr Leu Met Glu Leu 65 70 75 80 Gly Ile Ser Pro Ile Val Thr Ser Gly Met Val Phe Gln Leu Leu Gln 85 90 95 Gly Ile Gln Ile Leu Asp Val Asn Met Glu Asn Lys Ala Asp Arg Glu 100 105 110 Leu Phe Gln Thr Ala Gln Lys Val Phe Ala Ile Leu Leu Ser Ile Gly 115 120 125 Gln Ala Thr Val Tyr Val Leu Thr Gly Met Tyr Gly Pro Pro Gly Glu 130 135 140 Leu Gly Val Gly Val Cys Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu Val Phe Ala 145 150 155 160 Gly Ile Val Val Ile Leu Leu Asp Glu Leu Leu Gln Lys Gly Tyr Gly 165 170 175 Leu Gly Ser Gly Ile Ser Leu Phe Met Ala Thr Asn Ile Cys Glu Gln 180 185 190 Ile Phe Trp Lys Thr Phe Ala Pro Thr Thr Val Asn Arg Gly Arg Gly 195 200 205 Lys Glu Phe Glu Gly Ala Phe Ile Ser Phe Phe His Leu Ile Leu Thr 210 215 220 Lys Lys Asp Lys Lys Arg Ala Leu Leu Glu Ser Phe Tyr Arg Asp Asn 225 230 235 240 Ala Pro Asn Met Phe Gln Val Ile Ala Thr Leu Val Val Phe Phe Thr 245 250 255 Val Val Tyr Leu Gln Gly Phe Arg Leu Glu Ile Pro Val Lys Ser Thr 260 265 270 Arg Gln Arg Gly Pro Tyr Gly Thr Tyr Pro Ile Arg Leu Phe Tyr Thr 275 280 285 Ser Asn Met Pro Ile Met Leu Gln Ser Ala Leu Thr Ser Asn Ile Phe 290 295 300 Ile Ile Ser Gln Met Leu Tyr Ser His Phe Pro Asp Asn Ala Phe Val 305 310 315 320 Lys Leu Ile Gly Thr Trp Glu Ala Gln Pro Gly Ser Ala Gln Leu Phe 325 330 335 Ala Ala Ser Gly Leu Ala Tyr Tyr Met Gln Pro Pro Met Ser Leu Ser 340 345 350 Gln Ala Leu Leu Asp Pro Ile Lys Thr Val Val Tyr Val Val Phe Val 355 360 365 Leu Thr Thr Cys Ala Ile Phe Ser Lys Thr Trp Ile Glu Ile Ser Gly 370 375 380 Ser Ser Pro Arg Asp Val Ala Lys Gln Phe Lys Asp Gln Gly Leu Val 385 390 395 400 Ile Ala Gly His Arg Asp Ala Thr Val Tyr Lys Glu Leu Lys Lys Ile 405 410 415 Ile Pro Thr Ala Ala Ala Phe Gly Gly Ala Thr Ile Gly Ala Leu Ser 420 425 430 Val Val Ser Asp Leu Leu Gly Thr Leu Gly Ser Gly Thr Ser Ile Leu 435 440 445 Leu Ala Val Thr Thr Ile Tyr Gly Tyr Tyr Glu Leu Ala Val Lys Glu 450 455 460 Gly Gly Phe Ser Lys Gly Gly Pro Ser Gly Phe Val Asp Leu 465 470 475 <210> 163 <211> 1437 <212> DNA <213> Pichia pastoris <400> 163 atgagcagct tcagagttct agacttggta aagcccttta ccccatttct gcctgaggtt 60 atctctccag agagaaaggt cccctttcaa cagaagttga tgtggactgg agtcactctt 120 ctgatcttct tggtcatgag tgaaattccc ctgtatggta tcacttcaag tgactcctct 180 gaccctttgt tttggctgcg tatgatgttg gcctctaaca gaggaacgct gatggagtta 240 ggtatctctc ctattgtcac ttctggaatg gtgttccaac tgttgcaggg aatccaaatc 300 ttggacgtga acatggaaaa caaagcagac agagagttgt tccaaactgc tcaaaaagtg 360 ttcgccattt tgctgagtat cggacaagct actgtttatg ttttaactgg aatgtatggc 420 ccccctggtg aactaggagt tggtgtctgt cttttgttgg ttcttcaatt ggtgtttgca 480 ggtattgtgg tcattttgtt ggatgaactc ttacaaaaag gttacggttt aggaagtgga 540 atttctcttt tcatggccac caacatttgt gagcagattt tttggaagac ttttgctcct 600 accaccgtta accgtggaag aggtaaggaa 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Claims (15)

  1. 목적 단백질을 제조하기 위한 재조합 숙주세포로서,
    상기 숙주세포는 유전자 조작 전의 숙주세포에 비해 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작되어 있고,
    상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 50%의 서열 상동성을 갖는 것인, 숙주세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 KO 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작하는 것은 조작하기 전의 숙주세포에 비해 모델 단백질 SDZ-Fab(서열번호 25 및 26) 및/또는 HyHEL-Fab(서열번호 29 및 30)의 수율을 증가시키는 것인, 숙주세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 저발현은 상기 숙주세포의 유전체로부터 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 넉아웃시키거나, 상기 숙주세포 내 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 파괴시키거나, KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 프로모터를 파괴시키거나, 또는 전사후 유전자 억제(post-transcriptional gene silencing)에 의해 달성되는 것인, 숙주세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 캔디다 보이디니이(Candida boidinii), 코마가타엘라(Komagataella), 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)인, 숙주세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질은 효소, 치료 단백질, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제, 또는 항체 또는 항체 단편인, 숙주세포.
  6. 제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 보조 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 숙주세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 보조 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 162로 표시되는 아미노산 서열을 갖거나 이의 기능적 상동체이고,
    상기 기능적 상동체는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 162로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30% 서열 상동성을 갖는, 숙주세포.
  8. 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 1 (KO1), 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 2 (KO2), 및/또는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 3 (KO3), 또는 이의 기능적 상동체를 발현하는 세포를 제공하고, KO1, KO2 및/또는 KO3, 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 유전자를 저발현하도록 상기 세포를 조작하여 수득한 숙주세포로,
    상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 50%의 상동성을 갖는 것인, 숙주세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주세포는,
    (ⅰ) 서열번호 10으로 표시되는 아미노산을 갖는 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하고, 추가적으로 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체, 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 과발현하도록 조작되거나, 또는
    (ⅱ) 서열번호 10으로 표시되는 아미노산을 갖는 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하고, 추가적으로 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체, 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 과발현하도록 조작된 것인, 숙주세포.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 숙주세포를 포함하는 목적 단백질을 제조하기 위한 조성물.
  11. 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현시키는 것을 포함하고,
    상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%의 서열 상동성을 갖는 것인, 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증진시키는 방법.
  12. - 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작하고, 여기에서 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%의 서열 상동성을 갖는 것이며,
    - 상기 숙주세포에서 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 재조합하고,
    - 목적 단백질을 발현하도록 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하고, 선택적으로
    - 상기 세포 배양물로부터 목적 단백질을 분리하는 것을 포함하는, 숙주세포에서 목적 단백질의 수율을 증진시키는 방법.
  13. - 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KO 단백질 또는 이의 기능적 상동체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작된 숙주세포를 제공하고, 여기에서 상기 기능적 상동체는 서열번호 10, 11, 또는 12로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 30%의 서열 상동성을 갖는 것이며, 여기에 상기 숙주세포는 목적 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며;
    - 목적 단백질을 발현하도록 적합한 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하고, 및 선택적으로
    - 상기 세포 배양물로부터 목적 단백질을 분리하는 것을 포함하는, 숙주세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적 단백질은 효소, 치료 단백질, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 또는 해독 효소인, 방법.
  15. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 KO 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 저발현하도록 조작하는 것은 조작하기 전의 숙주세포에 비해 모델 단백질 SDZ-Fab 및/또는 HyHEL-Fab의 수율을 증가시키는 것인, 방법.
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