EA017803B1 - Система экспрессии - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способам увеличения секреции представляющего интерес белка (POI) из эукариотической клетки, предусматривающим коэкспрессию POI и по меньшей мере одного белка, который усиливает секрецию белка, причем указанный усиливающий (энхансерный) белок выбран из группы, состоящей из BMH2, BFR2, COG6, COY1, CUP5, IMH1, KIN2, SEC31, SSA4, SSE1, а также дополнительно к промоторной последовательности дрожжей, в частности промоторной последовательности гена PET9 P.pastoris, имеющей при сравнимых условиях увеличенную промоторную активность относительно промоторной последовательности белка GAP. Кроме того, изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему такую промоторную последовательность, и к применению такого экспрессирующего вектора для экспрессии POI в клетке-хозяине, а также к новым промоторным последовательностям генов из P.pastoris, которые применимы для экспрессии POI в дрожжах.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к области биотехнологии, в частности в области экспрессии генов, и относится к способу увеличения секреции представляющего интерес белка (РОГ) из эукариотической клетки, предусматривающему коэкспрессию рекомбинантной нуклеотидной последовательности, кодирующей представляющий интерес белок, и по меньшей мере одной рекомбинантной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, который увеличивает секрецию белка. Это изобретение дополнительно относится к промоторной последовательности дрожжей, в частности промоторной последовательности гена РЕТ9 РкЫа равГопв (Р.равГопв), которая применима, в частности, для экспрессии представляющего интерес белка в дрожжах, предпочтительно в штамме рода КотадаГае11а (Котада1ае11а равГопв, КотадаГае11а рвеийоравГопв или Котада1ае11а рйаГГи), и которая имеет увеличенную активность относительно активности промоторной последовательности гена глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (САР) РюЫа районе при сравнимых условиях. Это изобретение относится дополнительно к экспрессирующему вектору на основе молекулярного скелета рРи//1е, содержащего последовательность промотора РЕТ9 из Р.равГопв, а также к применению такого экспрессирующего вектора для экспрессии представляющего интерес белка в клетке-хозяине, в частности в штамме рода КошадаГае11а (К.равГопв, К.рвеийоравГопв или К.рйаГГи).

Это изобретение относится также к новым промоторным последовательностям дрожжей генов из Р.равГопв, которые применимы для экспрессии представляющего интерес белка в дрожжах, предпочтительно в штамме рода Котада1ае11а (К.равГопв, К.рвеийоравГопв или К.рНаГГи).

Уровень техники

Как прокариотическими, так и эукариотическими хозяевами осуществлялась успешная секреция белков. Наиболее известными примерами являются бактерии, такие как ЕвсНепсЫа сой, дрожжи, такие как Бассйагошусев сегеу151ае, Рю1иа районе или Напвепи1а ро1ушогрйа, мицелиальные грибы, такие как АврегдШив а\\атоп или ТпсНойегта геевег или клетки млекопитающих, такие как, например, клетки СНО. Хотя секреция некоторых белков легко достигается при высоких скоростях, многие другие белки секретируются только при сравнительно низких уровнях (РипГ еГ а1., 2002; Масаи1еу-РаГпск еГ а1., 2005; Рогго еГ а1., 2005).

Гетерологичная экспрессия гена в организме-хозяине требует вектора, позволяющего стабильную трансформацию организма-хозяина. Этот вектор должен обеспечивать ген с функциональным промотором, примыкающим к 5'-концу кодирующей последовательности. Посредством этого транскрипция регулируется и инициируется этой промоторной последовательностью. Большинство промоторов, используемых в настоящее время, были произведены из генов, которые кодируют метаболические ферменты, которые обычно присутствуют в клетке при высоких концентрациях.

ЕР 0103409 описывает применение промоторов дрожжей, ассоциированных с экспрессией конкретных ферментов в гликолитическом пути, т.е. промоторов, участвующих в экспрессии пируваткиназы, триозофосфатизомеразы, фосфоглюкозоизомеразы, фосфоглицератмутазы, гексокиназ 1 и 2, глюкокиназы, фосфофруктозокиназы, альдолазы и гена гликолитической регуляции.

\УО 97/44470 описывает промоторы дрожжей из Уагго\\1а йро1уГ1са для белка фактора 1 элонгации трансляции (ТЕГ1) и для рибосомного белка 87, которые пригодны для гетерологичной экспрессии белков в дрожжах.

\УО 2005/003310 обеспечивает способы экспрессии представляющей интерес кодирующей последовательности в дрожжах с использованием промотора глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы или фосфоглицератмутазы из масляных дрожжей Уагго\\1а йро1уйса.

Один подход к улучшению секреции рекомбинантного белка осуществляли случайным мутагенезом (Агсйег еГ а1., 1994; Ьаид апй Ьоотап, 1995). Основным недостатком этого способа является то, что положительные результаты обычно не могут переноситься на другие штаммы.

Секреторный путь - фолдинг и процессинг белков эукариотических организмов, например дрожжей, является очень сложным, включающим в себя многие взаимодействующие члены (участники). Некоторые из этих белков имеют каталитическую активность в отношении белков, такие как протеиндисульфидизомераза (ΡΌΙ), другие действуют посредством связывания с этими белками и предотвращения их агрегации (шапероны, например, В1Р) или посредством стимуляции высвобождения этого белка во внеклеточное пространство в более поздней стадии в этом секреторном пути (белки 88О). Вследствие этой взаимозависимости увеличение скорости одной стадии реакции в этом секреторном пути не может автоматически увеличивать секрецию представляющего интерес белка, но вместо этого может вызывать ограничение скорости по меньшей мере в одной или нескольких из последующих стадий реакции и, следовательно, может не удалять, а только смещать узкое место (узкие места) этой системы экспрессии.

Секреторный путь обычно начинается транслокацией трансмембранных полипептидов и полипептидов, предназначенных для секреции, в просвет эндоплазматического ретикулума (ЭР) (эндоплазматической сети, ЭПС). Для этой цели эти белки имеют аминоконцевую сигнальную последовательность. Эта сигнальная последовательность, также называемая лидерной последовательностью, обычно состоит из 13-36 довольно гидрофобных аминокислот; специальная консенсусная последовательность пока еще не была идентифицирована. На стороне просвета ЭР эта сигнальная последовательность удаляется сигналь

- 1 017803 ной пептидазой, тогда как возникающий полипептид связывается с шаперонами для предотвращения неправильного свертывания, пока не завершилась трансляция. Находящиеся в ЭР белки ответственны за механизмы правильного фолдинга. Они включают в себя, например, калнексин, калретикулин, Егр72, ОКР94 и ΡΌΙ, которая впоследствии катализирует образование дисульфидных связей, и пролилизомеразу. Кроме того, некоторые из посттрансляционных модификаций, такие как Ν-гликозилирование, инициируются в просвете ЭР. Белки экспортируются в аппарат Гольджи везикулярным транспортом (в виде пузырьков) только после того, как правильная конформация этих белков обеспечена контрольным механизмом качества ЭР. Если нет другого сигнала, белки, предназначенные для секреции, направляются из аппарата Гольджи к наружной стороне плазматической мембраны специфическими транспортными пузырьками (везикулами) (§1гусг апб ЕиЬей, 1995; СеЙппд апй ЗатЬгоок, 1992).

Было обнаружено, что в большинстве случаев ограничивающей скорость стадией в эукариотическом пути секреции является перемещение белков из ЭР в аппарат Гольджи (§йи81ег, 1991). Механизм, названный ЭР-ассоциированной деградацией белков (ΕΚ.ΛΌ), является ответственным за удерживание ошибочно уложенных или немодифицированных функциональных белков в ЭР и их последующее удаление.

В некоторых случаях было показано, что процесс секреции гетерологичных белков может ускоряться ко-сверхэкспрессией определенных белков, которые участвуют в этом секреторном пути и которые поддерживают фолдинг и/или процессинг других белков (Майапоу1ей е1 а1., 2004).

Коэкспрессия гена, кодирующего ΡΌΙ, и гена, кодирующего гетерологичный дисульфид-связанный белок, была впервые предложена в \УО 93/25676 в качестве средства увеличения получения этого гетерологичного белка. \¥О 93/25676 сообщает, что рекомбинантная экспрессия антистазина и антикоагулянтного белка клеща могла быть увеличена коэкспрессией с ΡΌΙ.

\УО 94/08012 обеспечивает способы увеличения секреции белка дрожжами посредством увеличения экспрессии белка-шаперона Н§р70, т.е. ΚΛΚ.2 и ΒίΡ, или белка-шаперона ΡΌΙ.

Гомологи синтаксина дрожжей 88О1 и 88О2 являются необходимыми для слияния секреторных пузырьков с мембраной плазмы, действующими в качестве 1-8ΝΛΚΕ.

\УО 94/08024 описывает процесс продуцирования увеличенных количеств секретируемых чужеродных или эндогенных белков коэкспрессией генов 88О1 и 88О2.

\УО 03/057897 обеспечивает способы рекомбинантной экспрессии представляющего интерес белка коэкспрессией по меньшей мере двух генов, кодирующих белки, выбранные из группы, состоящей из белков-шаперонов ОгоЕЬ, СРоЕ8. Эпак. Эпа1, СРре. С1рВ и их гомологов.

\УО 2005/0617818 и \УО 2006/067511 обеспечивают способы получения желаемого гетерологичного белка в дрожжах с использованием экспрессионной плазмиды на основе 2 мкм. Было показано, что продуцирование гетерологичного белка существенно увеличивается, когда гены одного или нескольких белков-шаперонов и гетерологичного белка, коэкспрессируются на одной и той же плазмиде.

Другим подходом к стимуляции секреторного пути является сверхэкспрессия фактора транскрипции НАС1, активирующего реакцию неуложенного белка (ϋΡΚ). Транскрипционные анализы показали, что до 330 генов регулируются НАС1, большинство из которых принадлежит к функциональным группам секреции или биогенезу секреторных органелл (например, находящимся в ЭР шаперонам, фолдазам, компонентам транслокона (комплекса белков, ассоциированных с транслокацией возникающих полипептидов в просвет ЭР).

\УО 01/72783 описывает способы увеличения количества гетерологичного белка, секретируемого из эукариотической клетки, индукцией увеличенной реакции неуложенного белка (ϋΡΚ.), где эта ϋΡΚ. модулируется коэкспрессией белка, выбранного из группы, состоящей из НАС1, ΡΤС2 и ΙΚΕ1.

Флавофермент ΕΚΌ1 необходим для окисления дитиолов белка в ЭР. Он окисляется молекулярным кислородом и действует в качестве специфического оксиданта ΡΌΙ. Дисульфиды, генерируемые бе поуо в ЕК.О1, переносятся к ΡΌΙ и затем к субстратным белкам реакциями обмена дитиол-дисульфид.

\УО 99/07727 описывает применение ЕРО1 для увеличения образования дисульфидных связей и тем самым для увеличения выхода правильно уложенных рекомбинантных белков.

Хотя эти подходы, после их установления, могут быть перенесены на другие штаммы и использованы также для других белков, они имеют недостаток, заключающийся в том, что отсутствует подлинное понимание функции таких белков, поддерживающих секрецию других белков.

Можно думать, что успешная секреция высокого уровня рекомбинантного белка может ограничиваться в ряде различных стадий, таких как фолдинг, образование дисульфидных мостиков, гликозилирование, транспорт внутри клетки или высвобождение из клетки. Поскольку многие из этих процессов все еще не выяснены полностью, можно также думать, что в них участвуют гораздо больше белков, которые поддерживают секрецию белка, чем это известно в настоящее время. Однако такие вспомогательные (хелперные) функции не могут быть предсказаны при существующем знании состояния в данной области, даже в случае доступности последовательности ДНК всего генома организма-хозяина.

Белки, о которых известно, что они участвуют в секреторном пути дрожжей, часто влияют на процесс фолдинга и последующую секрецию белков в различных стадиях процесса секреции.

- 2 017803

Таким образом, желательным является обеспечение новых способов увеличения получения секретируемых белков в прокариотических клетках, которые являются простыми и эффективными. Желательным является также обеспечение новых генов для применения в способах увеличенного получения секретируемых белков. Желательным является также обеспечение новых промоторов дрожжей, в частности, для применения в экспрессии гетерологичных или гомологичных генов в дрожжах, в частности в дрожжах рода Котада1ае11а, а также для экспрессии желаемого гена в любой другой эукариотической системе экспрессии.

Сущность изобретения

Целью данного изобретения является обеспечение способа увеличения секреции представляющего интерес белка (РОО из эукариотической клетки, предусматривающего коэкспрессию рекомбинантной нуклеотидной последовательности, кодирующей ΡΟΙ, и по меньшей мере одной рекомбинантной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, который увеличивает секрецию белка из клеткихозяина. Увеличение секреции ΡΟΙ определяют на основе сравнения выхода секреции этого белка в присутствии или в отсутствие коэкспрессии указанного белка, который увеличивает секрецию белка.

В одном аспекте это изобретение относится к такому способу, включающему в себя коэкспрессию рекомбинантной нуклеотидной последовательности, кодирующей ΡΟΙ, и по меньшей мере одной другой рекомбинантной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, который увеличивает секрецию белка, где указанный белок, который увеличивает секрецию белка, выбран из группы, состоящей из ВМН2, ВЕК2, СОС6, СОУ1, СИР5, ΙΜΗ1, ΚΙΝ2, 8ЕС31, 88А4, 88Е1 и биологически активного фрагмента любого из перечисленных белков.

В другом аспекте это изобретение относится к такому способу, в котором по меньшей мере одна другая рекомбинантная нуклеотидная последовательность получена из дрожжей, предпочтительно из Зассйаготусек сегеуШае или из Р1еЫа райогщ

В другом аспекте это изобретение относится к такому способу, в котором по меньшей мере одна рекомбинантная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, который увеличивает секрецию белка, получена из Зассйаготусек сегеуШае и является идентичной или соответствует или имеет функциональные характеристики последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 32, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 33, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 34, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 35, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 36, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 37, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 38, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 39, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 40 и 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 41.

В другом аспекте это изобретение относится к такому способу, в котором по меньшей мере одна рекомбинантная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, который увеличивает секрецию белка, получена из РюЫа райогк и является идентичной или соответствует или имеет функциональные характеристики последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 42, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 43, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 44, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 45, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 46, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 47, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 48, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 49, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 50 и 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 51.

Еще в одном аспекте это изобретение относится к применению такой нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, который увеличивает секрецию белка, в качестве энхансера секреции белка, в частности в качестве энхансера секреции ΡΟΙ из эукариотической клетки.

Другой целью этого изобретения является обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, который увеличивает секрецию белка из клетки-хозяина, где эта нуклеотидная последовательность выделена из РюЫа райогк и является идентичной или соответствует или имеет функциональные характеристики последовательности, выбранной из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ВМН2 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 42), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ВЕК.2 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 43), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок СΟС6 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 44), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ί.ΌΥ1 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 45), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок СИР5 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 46), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ΙΜΗ1 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 47), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ΚΙΝ2 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 48), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок 8ЕС31 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 49), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок 88Л4 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 50), и нуклеотидной последовательности, кодирующей белок 88Е1 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 51).

Другой целью этого изобретения является обеспечение последовательности промотора гена РЕТ9 дрожжей из Р1сЫа райогю, который применим для экспрессии ΡΟI в дрожжах, предпочтительно в штамме рода Котада1ае11а, в частности в штамме К.райогЕ, К.ркеиборайогю или К.рйайи, и который имеет при сравнимых условиях увеличенную промоторную активность относительно промоторной активности промоторной последовательности белка САР Рю1йа райогк.

Другой целью этого изобретения является обеспечение такой промоторной последовательности дрожжей, в частности промоторной последовательности дрожжей, идентичной или соответствующей и имеющей функциональные характеристики 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 125, или ее функционально эквивалентного варианта.

В другом аспекте это изобретение относится к экспрессирующему вектору на основе молекулярного скелета рРи7/1е, дополнительно содержащему промоторную последовательность дрожжей гена РЕТ9 из Р1сЫа ра81ог18, которая является идентичной или соответствует и имеет функциональные характери

- 3 017803 стики 8ЕО ГО N0: 125, или ее функционально эквивалентный вариант.

Еще в одном аспекте это изобретение относится к применению такой плазмиды для экспрессии Р0! в клетке-хозяине, причем эта клетка-хозяин предпочтительно является клеткой штамма рода Кошада1ае11а, в частности клеткой штамма К.ра81от18, К.рзеийоравФпв или К.рНаГПи.

Другой целью этого изобретения является обеспечение промоторной последовательности дрожжей из РюЫа ра81от18, которая применима для экспрессии Р01 в дрожжах, предпочтительно в штамме рода Кошада1ае11а, где эта промоторная последовательность дрожжей является идентичной или соответствует и имеет функциональные характеристики последовательности, выбранной из группы, состоящей из фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена 6ΝΏ1 (8Е0 ГО N0: 126), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена СРМ1 (8Е0 ГО N0: 127), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена Н8Р90 (8Е0 ГО N0: 128), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена КЛК2 (8Е0 ГО N0: 129), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена МСМ1 (8Е0 ГО N0: 130), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена Κ.ΆΌ2 (8Е0 ГО N0: 131), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена КР82 (8Е0 ГО N0: 132), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена КР831 (8Е0 ГО N0: 133), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена 88Л1 (8Е0 ГО N0: 134), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ТН13 (8Е0 ГО N0: 135), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена 1000 ТР11 (8Е0 ГО N0: 136), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ИВ14 (8Е0 ГО N0: 137), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ЕN01 (8Е0 ГО N0: 138), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена КР87Л (8Е0 ГО N0: 139), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена КРЬ1 (8Е0 ГО N0: 140), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ТКЬ1 (8Е0 ГО N0: 141), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена Р181 (8Е0 ГО N0: 142), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ЕЕТ3 (8Е0 ГО N0: 143), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ЕТК.1 (8Е0 ГО N0: 144), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ХМТ1 (8Е0 ГО N0: 145), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена РНО8 (8Е0 ГО N0: 146) и фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена предшественника ЕЕТ3 (ЕЕТ3рте) (8Е0 ГО N0: 147) или функционально эквивалентного варианта любой из перечисленных последовательностей.

В другом аспекте это изобретение относится к экспрессирующему вектору на основе молекулярного скелета рРи//1е. дополнительно содержащему такую промоторную последовательность дрожжей, идентичную или соответствующую и имеющую функциональные характеристики последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 126, 8Е0 ГО N0: 127, 8Е0 ГО N0: 128, 8Е0 ГО N0: 129, 8ЕО ГО N0: 130, 8ЕЕ) ГО N0: 131, 8ЕЕ) ГО N0: 132, 8ЕЕ) ГО N0: 133, 8ЕЕ) ГО N0: 134, 8ЕЕ) ГО N0: 135, 8ЕЕ) ГО N0: 136, 8ЕЕ) ГО N0: 137, 8ЕЕ) ГО N0: 138, 8ЕЕ) ГО N0: 139, 8ЕЕ) ГО N0: 140, 8ЕЕ) ГО N0: 141, 8ЕЕ) ГО N0: 142, 8ЕЕ) ГО N0: 143, 8ЕЕ) ГО N0: 144, 8ЕЕ) ГО N0: 145, 8ЕЕ) ГО N0: 146 и 8ЕЕ) ГО N0: 147, или функционально эквивалентный вариант любой из перечисленных последовательностей.

В другом аспекте это изобретение относится к применению такого экспрессирующего вектора для экспрессии Р01 в клетке-хозяине, причем эта клетка-хозяин предпочтительно является клеткой штамма рода Кошада1ае11а, в частности клеткой штамма К.раЧогщ К.р8еийора81от18 или К.рНаГПЕ

Принцип этого изобретения дополнительно описан в независимых пунктах формулы изобретения, тогда как различные варианты этого изобретения являются предметом зависимых пунктов формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает структуру и релевантные сайты расщепления рестрикционных ферментов (рестриктаз) молекулярного скелета вектора рРиххН содержащего маркер селекции ЛшрК для Е.со11, амплифицированный из клонирующего вектора рВК.322, и сайт инициации репликации (0К1), амплифицированный из клонирующего вектора рИС19. Подробное описание процедуры клонирования молекулярного скелета вектора рРихх1е можно найти в примере 3.

Фиг. 2 показывает структуру и релевантные сайты расщепления рестрикционных ферментов (рестриктаз) молекулярного скелета вектора рРих71е_хеоК_Р_РЕТ9_е6ЕР_А0ХТТ, где репортерный ген СЕР (зеленого флуоресцентного белка) находится под контролем фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена РЕТ9 Р.ра81от18. Этот вектор дополнительно содержит 0К1 Е.со11, амплифицированный из риС19, терминатор транскрипции гена цитохрома с из 8.сетеу181ае (сус1ТТ), маркер селекции зеоцина и промоторную последовательность гена АОХ1 Р.ра81от18 (А0ХТТ_раг! 1 и 2).

Подробное описание изобретения

Для лучшего понимания регуляции генов организма-хозяина во время продуцирования белка, проводили эксперименты по гибридизации микроматрицы ДНК с клонами Р.ра81от18, экспрессирующими рекомбинантный трипсиноген человека (гй-трипсиноген), в сравнении с непродуцирующим штаммом (в соответствии с 8аиет е! а1., 2004). Подробное описание экспериментальной процедуры можно найти в примере 1. Эти эксперименты позволяют определять уровни транскрипции приблизительно ¹/₃ всех генов в Р.ра81от18, но они не обеспечивают прямой информации о потенциале любого до сих пор не идентифицированного белка в отношении усиления секреции.

- 4 017803

Дополнительный анализ данных, полученных из гибридизации микроматриц ДНК, позволял идентифицировать потенциальные способствующие секреции белки или их гены соответственно. Для достижения этого относительные уровни экспрессии всех измеряемых генов штамма Р.разЮпз. трансформированного плазмидой, несущей ген гй-трипсиногена, сравнивали со штаммом дикого типа, культивируемого при тех же самых условиях. Затем эти гены располагали по относительному различию их уровней экспрессии и некоторые из 524 генов с наивысшим различием подвергали дополнительному анализу. Поскольку используемые для этих экспериментов микроматрицы ДНК были получены из последовательностей 8асс11аготусс5 сетеуЩае, только предположительные функции генов для Р.разЮпз могут быть отнесены в соответствии с гомологией к З.ссгсуыас. После ранжирования 524 дифференциально регулируемых генов на основе их предположительной внутриклеточной локализации и функции и сосредоточения на генах, участвующих в секреции и/или общей реакции на стресс, из количества 64 потенциально представляющих интерес генов были отобраны 15 генов для дополнительного анализа. Эти гены клонировали из З.ссгсуыас при помощи ПЦР и субклонировали в экспрессирующий вектор Р.разЮпз и затем трансформировали в штамм Р.раДотЦ экспрессирующий РаЬ-фрагмент моноклонального антитела (2Р5тАВ) против ВИЧ1. Посредством культивирования этих клонов, продуцирующих как РаЬ-фрагмент, так и различные предположительные хелперные белки секреции, в сравнении с клонами, продуцирующими только РаЬ-фрагмент, удалось идентифицировать благоприятное действие сверхэкспрессии следующих генов, кодирующих предположительные хелперные белки, на секрецию РаЬ-фрагмента: РЭП, СИР5, 88А4, ВМН2, ΚΙΝ2, КАВ2, НАС1, ЕК.О1, 88Е1, ВРК.2, СО66, 88О2, СОУ1, ΙΜΗ1 и 8ЕС31.

Белки ΡΌΙ1, КАК2, НАС1, ЕК.О1 и 88О2 уже известны в данной области как являющиеся успешно применимыми хелперными факторами фолдинга/секреции при коэкспрессии во время рекомбинантной экспрессии гетерологичных белков. Другие белки, идентифицированные в анализе с микроматрицами ДНК, т.е. СИР5, 88А4, ВМН2, ΚΙΝ2, 88Е1, ВРВ2, СО66, СОУ1, ΙΜΗ1 и 8ЕС31, еще не были описаны как имеющие благоприятное действие на секрецию рекомбинантно продуцируемого РОР

Таким образом, данное изобретение в его первом аспекте относится к способу увеличения секреции ΡОI из эукариотической клетки, предусматривающему:

обеспечение клетки-хозяина, содержащей рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую РОЕ и по меньшей мере одну рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который увеличивает секрецию белка; и экспрессию в этой клетке-хозяине рекомбинантной нуклеотидной последовательности, кодирующей РОЕ и по меньшей мере одной рекомбинантной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, который увеличивает секрецию белка, где указанный белок, который увеличивает секрецию белка, выбран из группы, состоящей из ВМН2, ВРВ2, СО66, СОУ1, СИР5, ]МН1, ΚΙΝ2, 8ЕС31, 88А4, 88Е1 и биологически активного фрагмента любого из перечисленных белков.

Термин представляющий интерес белок (РОЕ относится в данном контексте к белку, который получают посредством рекомбинантной технологии в клетке-хозяине. Более конкретно, этот белок может быть либо полипептидом, не встречающимся природно в клетке-хозяине, т.е. гетерологичным белком, либо может быть природным в отношении этой клетки-хозяина, т.е. гомологичным белком в отношении этой клетки-хозяина, но полученным, например, трансформацией вектором саморепликации, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую РОЕ или после интеграции рекомбинантными способами одной или более копий последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей РОЕ в геном клетки-хозяина или рекомбинантной модификации одной или более регуляторных последовательностей, контролирующих экспрессию гена, кодирующего РОЕ например промоторной последовательности.

Этот ΡОI может быть любым эукариотическим или прокариотическим белком. Этот белок может быть природно секретируемым белком или внутриклеточным белком, т.е. белком, который не секретируется природно. Данное изобретение включает в себя также биологически активные фрагменты природно секретируемых или природно не секретируемых белков.

Описанный здесь секретируемый ΡОI может быть, но не ограничивается им, белком, подходящим в качестве биофармацевтического вещества, такого как антитело или фрагмент антитела, фактор роста, гормон, фермент, вакцина или белок, который может быть использован для промышленного применения, такой как, например, фермент.

Внутриклеточный РОЕ описанный здесь, может быть, но не ограничивается ими, хелперным фактором для секреции белка или ферментом, используемым для целей метаболического конструирования.

В другом варианте осуществления ΡОI является эукариотическим белком или его биологически активным фрагментом, предпочтительно иммуноглобулином или фрагментом иммуноглобулина, таким как Рс-фрагмент или РаЬ-фрагмент. Наиболее предпочтительно ΡОI является РаЬ-фрагментом моноклонального анти-ВИЧ1-антитела 2Р5.

Обычно представляющие интерес белки, описанные здесь, могут быть получены способами рекомбинантной экспрессии, хорошо известными квалифицированному в данной области специалисту.

Понятно, что описанные здесь способы могут дополнительно включать в себя культивирование указанных рекомбинантных клеток-хозяев при условиях, позволяющих экспрессию РОТ Затем секрети

- 5 017803 рованный, рекомбинантно полученный ΡΟΙ может быть выделен из среды культуры клеток и дополнительно очищен способами, хорошо известными квалифицированному в данной области специалисту.

В данном контексте биологически активный фрагмент белка будет обозначать фрагмент белка, который проявляет биологическое действие, сходное или сравнимое с действием полноразмерного белка. Такие фрагменты могут быть получены, например, амино- или карбоксиконцевыми делециями, а также внутренними делециями.

Обычно клеткой-хозяином, из которой секретируются эти белки, может быть любая эукариотическая клетка, подходящая для рекомбинантной экспрессии ΡΟΙ.

В предпочтительном варианте осуществления это изобретение относится к такому способу, в котором этой клеткой-хозяином является клетка грибов, например клетка дрожжей, или высшая эукариотическая клетка, например клетка млекопитающего или клетка растения.

Примеры клеток дрожжей включают в себя, но не ограничиваются ими, род ЗассЬаготусез (например, ЗассЬаготусез сегеук1ае), род Котада(ае11а (Котада(ае11а раз!опз, Котада1ае11а рзеибораз!опз или Котада1ае11а рЬаГГл), Р1сЬ1а те1ЬапоЬса, Напзепи1а ро1утогрЬа или К1иууеготусез 1ас(гз.

В предпочтительном варианте осуществления это изобретение относится к способу, в котором клеткой дрожжей является клетка рода Котада(ае11а, в частности клетка штамма Котада1ае11а раз!опз, Котада1ае11а рзеибораз!опз или Котада1ае11а рЬаГГн.

Прежний вид Р1сЫа разЮпз был подразделен и переименован в Котада1ае11а разЮпз и Котада(ае11а рЬаГГл (Кий/тап, 2005). Таким образом, Р1сЬ1а разЮпз является синонимом как для Котада(ае11а раз!опз, так и для Котада1ае11а рЬаГГн.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие белки, которые увеличивают секрецию белка, могут быть получены из различных источников. Указанные белки могут участвовать в секреторном пути эукариотических белков.

В одном аспекте это изобретение относится к такому способу, в котором по меньшей мере одна рекомбинантная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, который увеличивает секрецию белка, является нуклеотидной последовательностью дрожжей, предпочтительно, но без ограничения, нуклеотидной последовательностью вида дрожжей ЗассЬаготусез сегеу151ае или Р1сЬ1а раз!опз. Могут быть использованы также гомологичные нуклеотидные последовательности из других подходящих дрожжей, или других грибов, или из других организмов, таких как позвоночные.

Термин гомологичные нуклеотидные последовательности относится в этом контексте к нуклеотидным последовательностям, которые являются родственными, но не идентичными в их нуклеотидной последовательности с рассматриваемой нуклеотидной последовательностью, и выполняют, по существу, ту же самую функцию.

В следующем аспекте это изобретение относится к такому способу, в котором по меньшей мере одна рекомбинантная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, который увеличивает секрецию белка, получена из ЗассЬаготусез сегеу131ае и является идентичной или соответствует и имеет функциональные характеристики последовательности, выбранной из группы, состоящей из ЗЕО ΙΌ N0: 32, ЗЕО ΙΌ N0: 33, ЗЕО ΙΌ N0: 34, ЗЕО ΙΌ N0: 35, ЗЕО ΙΌ N0: 36, ЗЕО ΙΌ N0: 37, ЗЕО ΙΌ N0: 38, ЗЕО ΙΌ N0: 39, ЗЕО ΙΌ N0: 40 и ЗЕО ΙΌ N0: 41.

В этом контексте термин нуклеотидная последовательность, которая соответствует и имеет функциональные характеристики, включает в себя вариации в ее нуклеотидном составе, в том числе вариации вследствие вырожденности генетического кода, посредством чего эта нуклеотидная последовательность выполняет, по существу, ту же самую функцию.

Скринингом базы данных генома Р.раз1опз (ЕК.60™, Ю-66, [п(едга1еи Сепоннсз) с использованием нуклеотидных последовательностей хелперных факторов секреции, выделенных из ЗассЬаготусез сегеу1з1ае, были идентифицированы гомологичные нуклеотидные последовательности в Р1сЬ1а раз!опз. Предварительные экспериментальные результаты указывают на то, что эти гомологичные нуклеотидные последовательности, выделенные из Р1сЫа раз!опз, обнаруживают сходные действия на секрецию белка из клетки-хозяина в сравнении с соответствующими нуклеотидными последовательностями, выделенными из ЗассЬаготусез сегеу1з1ае.

В следующем аспекте это изобретение относится к такому способу, в котором по меньшей мере одна рекомбинантная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, который увеличивает секрецию белка, получена из Р1сЬ1а раз!опз и является идентичной или соответствует и имеет функциональные характеристики последовательности, выбранной из группы, состоящей из ЗЕО ΙΌ N0: 42, ЗЕО ΙΌ N0: 43, ЗЕО ΙΌ N0: 44, ЗЕО ΙΌ N0: 45, ЗЕО ΙΌ N0: 46, ЗЕО ΙΌ N0: 47, ЗЕО ΙΌ N0: 48, ЗЕО ΙΌ N0: 49, ЗЕО ΙΌ N0: 50 и ЗЕО ΙΌ N0: 51.

В дополнительном аспекте это изобретение относится к такому способу, в котором рекомбинантная нуклеотидная последовательность, кодирующая Р0Е обеспечена на плазмиде, подходящей для интеграции в геном клетки-хозяина, в единственной копии или во множественных копиях на клетку. Рекомбинантная нуклеотидная последовательность, кодирующая Р0Е может быть также обеспечена на плазмиде автономной репликации в единственной копии или во множественных копиях на клетку.

- 6 017803

Альтернативно, рекомбинантная нуклеотидная последовательность, кодирующая ΡΟΙ, и рекомбинантная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, который увеличивает секрецию белка, присутствуют на одной и той же плазмиде в единственной копии или множественных копиях на клетку.

Термины плазмида и вектор в данном контексте включают в себя нуклеотидные последовательности автономной репликации, а также интегрирующиеся в геном нуклеотидные последовательности.

В следующем аспекте это изобретение относится к такому способу, в котором эта плазмида является эукариотическим экспрессирующим вектором, предпочтительно экспрессирующим вектором дрожжей.

Экспрессирующие векторы определяются здесь как ДНК-последовательности, которые необходимы для транскрипции клонированных рекомбинантных последовательностей, т.е. рекомбинантных генов, и трансляции их мРНК в подходящем организме-хозяине. Такие экспрессирующие векторы обычно содержат сайт (ориджин) начала репликации в клетках-хозяевах, маркеры селекции (например, ген синтеза аминокислоты или ген, придающий устойчивость к антибиотикам, таким как зеоцин, канамицин, 0418 или гигромицин), ряд сайтов расщепления рестрикционных ферментов, подходящую последовательность промотора и терминатор транскрипции, причем эти компоненты функционально связаны вместе.

Термин функционально связанные относится в этом контексте к ассоциации нуклеотидных последовательностей на единственной молекуле нуклеиновой кислоты, например векторе, таким образом, что на функцию одной или более нуклеотидных последовательностей влияет по меньшей мере одна другая нуклеотидная последовательность, присутствующая на указанной молекуле нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью рекомбинантного гена, когда он способен влиять на экспрессию этой кодирующей последовательности.

Экспрессирующие векторы могут включать в себя, но не ограничиваются ими, клонирующие векторы, модифицированные клонирующие векторы и специфически сконструированные плазмиды. Экспрессирующим вектором этого изобретения может быть любой экспрессирующий вектор, подходящий для экспрессии рекомбинантного гена в клетке-хозяине, и его выбирают в зависимости от организмахозяина.

В другом аспекте это изобретение относится к такому способу, в котором экспрессирующий вектор содержит лидерную последовательность секреции, эффективную для вызывания секреции ΡΟΙ из клеткихозяина.

Присутствие такой лидерной последовательности секреции в экспрессирующем векторе необходимо, когда ΡΟΙ, предназначенный для рекомбинантной экспрессии и секреции, является белком, который в природе не секретируется и, следовательно, лишен природной лидерной последовательности секреции, или его нуклеотидная последовательность была клонирована без его природной лидерной последовательности секреции. Обычно любая лидерная последовательность секреции, эффективная для вызывания секреции ΡΟΙ из клетки-хозяина, может быть использована в данном изобретении. Эта лидерная последовательность секреции может происходить из дрожжевого источника, например из α-фактора дрожжей, такого как МРа 8ассйагошусе8 есгсуыас. или дрожжевой фосфатазы, из источника млекопитающего или растения или других источников. Выбор подходящей лидерной последовательности секреции является очевидным для квалифицированного лица.

Альтернативно, лидерная последовательность секреции может быть слита с нуклеотидной последовательностью, кодирующей ΡΟΙ, который предназначен для рекомбинантной экспрессии, общепринятыми способами клонирования, известными квалифицированному специалисту, перед клонированием этой нуклеотидной последовательности в экспрессирующем векторе, или нуклеотидную последовательность, кодирующую ΡΟΙ, содержащую природную лидерную последовательность секреции, клонируют в этом экспрессирующем векторе. В этих случаях не требуется присутствие лидерной последовательности секреции в этом экспрессирующем векторе.

Для возможности экспрессии рекомбинантной нуклеотидной последовательности в клетке-хозяине должна быть обеспечена рекомбинантная нуклеотидная последовательность с функциональным промотором, примыкающим к 5'-концу этой кодирующей последовательности. Посредством этого транскрипция регулируется и инициируется этой промоторной последовательностью.

В следующем аспекте это изобретение относится к такому способу, в котором экспрессирующий вектор содержит промоторную последовательность, эффективную для регуляции экспрессии ΡΟΙ в клетке-хозяине.

Промоторной последовательностью в этом контексте называют ДНК-последовательность, способную регулировать экспрессию кодирующей последовательности или функциональной РНК.

Подходящие промоторные последовательности для применения с клетками-хозяевами дрожжей могут включать в себя, но не ограничиваются ими, промоторы, полученные из генов, которые кодируют метаболические ферменты, о которых известно, что они присутствуют при высоких концентрациях в клетке, например гликолитические ферменты, такие как триозофосфатизомераза (ΤΡΙ), фосфоглицераткиназа (Ρ0Κ), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (0ΛΡΌΗ), алкогольоксидаза (АОХ), лактаза (ЬАС) и галактозидаза (ОЛЬ).

- 7 017803

Подходящие промоторные последовательности для применения с клетками-хозяевами млекопитающих могут включать в себя, но не ограничиваются ими, промоторы, полученные из геномов вирусов, гетерологичные промоторы млекопитающих, например промотор актина или промотор иммуноглобулина и промоторы белка теплового шока.

Для идентификации новых промоторных последовательностей для применения в клетках-хозяевах дрожжей, предпочтительно для применения в штамме рода Котада1ас11а. в частности для применения в штамме К.ракЮпк, К.ркеиборакЮпк или К.рйаГГн, для рекомбинантной экспрессии ΡΟΙ, данные, полученные из гибридизации ДНК-микроматриц, описанные в примере 1, оценивали специфическим образом.

Промоторные последовательности 23 представляющих наибольший интерес генов, идентифицированных этим анализом (до 1000 р.н. 5'-района соответствующих генов), амплифицировали из Р.ракЮпк при помощи ПЦР и клонировали в экспрессирующий вектор Р.ракФпк, который дополнительно несет усиленный зеленый флуоресцентный белок (еСЕР) в качестве репортерного гена. Для испытания свойств этих различных промоторов, т.е. промоторной активности, 25 векторов (в том числе два контрольных вектора) последовательно трансформировали в штамм Р.раЧопк. Эти клоны культивировали при разных условиях культивирования и количество рекомбинантного еСЕР определяли количественно с использованием проточного цитометрического анализа. Сравнительный анализ хорошо установленного дрожжевого промотора САР и этих 23 промоторных последовательностей приведен в примере 5.

Термин промоторная активность относится здесь к оценке транскрипционной эффективности промотора. Она может быть определена непосредственно измерением количества транскрипции мРНК от этого промотора, например, Нозерн-блоттингом или опосредованно измерением количества генного продукта, экспрессируемого от этого промотора.

Неожиданно было обнаружено, что фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена РЕТ9 Р.ракЮпк приводит к совершенно неожиданным высоким уровням экспрессии рекомбинантого еСЕР, в диапазоне от приблизительно 700 до приблизительно 1600% промоторной активности промотора САР, в зависимости от источника углерода во время культивирования, при экспериментальных условиях, описанных в примере 5.

РЕТ9 известен из 8.сегеуыае в качестве главного носителя АДФ/АТФ митохондриальной внутренней мембраны, который заменяет цитозольным АДФ синтезированный митохондриями АТФ.

В другом аспекте это изобретение относится к способу увеличения секреции РО1 из эукариотической клетки, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая РО1, контролируется промоторной последовательностью, которая является фрагментом 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена РЕТ9 Рю1па раЦопк, соответствующим 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 125, или его функционально эквивалентным вариантом, а клетка-хозяин является клеткой рода Котада1ае11а, в частности клеткой штамма К.раккпк, К.ркеибораЧопк или К.рНаГГн.

В другом аспекте это изобретение относится к применению нуклеотидной последовательности, выделенной из 8аесНаготусек еегеу151ае и кодирующей белок, который увеличивает секрецию белка и выбран из группы, состоящей из ВМН2, ВЕВ2, СОС6, СОУ1, СПР5, ΙΜΗ1, КШ2, 8ЕС31, 88А4, 88Е1, и биологически активного фрагмента любого из перечисленных белков, в качестве усилителя (энхансера) секреции РО1 из эукариотической клетки, предпочтительно в клетке дрожжей и наиболее предпочтительно в клетке штамма К.раккпк, К.ркеибораккпк или К.рНаГГн.

В следующем аспекте это изобретение относится к такому применению, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, который увеличивает секрецию белка, является идентичной или соответствует и имеет функциональные характеристики последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ ^: 32, 8ЕО ΙΌ ^: 33, 8ЕО ΙΌ ^: 34, 8ЕО ΙΌ ^: 35, 8ЕО ΙΌ ^: 36, 8ЕО ΙΌ ^: 37, 8ЕО ΙΌ 38, 8ЕО ΙΌ 39, 8ЕО ΙΌ 40 и 8ЕО ΙΌ 41.

В другом аспекте это изобретение относится к применению нуклеотидной последовательности, выделенной из Р|е1аа раЦопк и кодирующей белок, который увеличивает секрецию белка и выбран из группы, состоящей из ВМН2, ВЕВ2, СОС6, СОУ1, СИР5, ΙΜΗ1, КШ2, 8ЕС31, 88А4, 88Е1 и биологически активного фрагмента любого из перечисленных белков, в качестве энхансера, в частности в качестве энхансера секреции из эукариотической клетки, предпочтительно в клетке дрожжей и наиболее предпочтительно в клетке штамма К.раккпк, К.ркеибораккпк или К.рНаГГн.

В следующем аспекте это изобретение относится к такому применению, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, который увеличивает секрецию белка, является идентичной или соответствует и имеет функциональные характеристики последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ ^: 42, 8ЕО ΙΌ ^: 43, 8ЕО ΙΌ ^: 44, 8ЕО ΙΌ ^: 45, 8ЕО ΙΌ ^: 46, 8ЕО ΙΌ ^: 47, 8ЕО ΙΌ ^: 48, 8ЕО ΙΌ ^: 49, 8ЕО ΙΌ ^: 50 и 8ЕО ΙΌ ^: 51.

88А4 является членом Н8Р70-семейства молекулярных шаперонов. 88А4 участвует в 8КР-зависимом нацеливании белка на мембрану ЭР перед котрансляционной транслокацией этого белка в ЭР-просвет и индуцируется после реакции стресса.

Шаперонины подкласса 88Е/Н8Р110 Н8Р70-семейства, которые кодируются 88Е1 и 88Е2, способствуют фолдингу связыванием с возникающими пептидами и удерживанием их в фолдинг-компетентном состоянии, однако они не могут активно стимулировать реакции фолдинга. На основе их удерживающей

- 8 017803 (холдазной) активности взаимодействия с шаперонами, такими как 8за1р и 8зЬ1р Н8Р70-семейства, так же как и с комплексом Н8Р90, кажутся вероятными.

8ес31р является незаменимым фосфопротеиновым компонентом комплекса белка оболочки II (СОР11) пузырьков секреторного пути, в комплексе с 8ее13р.

Дефекты роста вследствие мутаций либо в 8ее13, либо в 8ее23 (а также в 8ее16 и УрИ) могут быть преодолены сверхэкспрессией незаменимого гена ВГК2 8.еегеуыае. Он был выделен в виде многокопийного супрессора лекарственного средства Брефелдина А, грибного метаболита, который препятствует притоку этого белка в аппарат Гольджи и разрушает структуру самого аппарата Гольджи.

Было обнаружено, что белки 14-3-3, кодируемые ВМН1 и ВМН2, участвуют во множественных стадиях в направленной миграции пузырьков, особенно в выходе белка из ЭР, прямой направленной миграции мультимерных белков мембраны клеточной поверхности, а также в ретроградной транспортировке в аппарате Гольджи.

СОО6 принадлежит к 1-8 генам, кодирующим консервативный олигомерный комплекс аппарата Гольджи (СОО), имеющий восемь субъединиц периферический белок Гольджи, который участвует в направленной мембранной миграции и синтезе гликоконъюгатов. Кроме того, комплекс СОО не только является необходимым для поддержания нормальной структуры и функции Гольджи, но также и непосредственно участвует в ретроградном транспорте пузырьков внутри аппарата Гольджи.

Молекулярная функция Соу1, белка, идентифицированного по сходству с СА8Р млекопитающих, еще не выяснена, но предполагается, что он играет роль в транспорте пузырьков Гольджи через взаимодействие с Соз1. Соз1 является 8ΝΑΚΕ (растворимым чувствительным к Ν-этилмалеимиду белком фактора присоединения), обычно используемым в качестве маркера более поздних компартментов Гольджи в 8.сегеу131ае.

Продукт гена 1МН1/8У83 является членом периферической мембраны Гольджи, участвующим в транспорте пузырьков между поздним компартментом Гольджи и предвакуолярным подобным эндосоме компартментом. 1МН1 рекрутируется аппаратом Гольджи посредством двух АКГ-подобных (АКБ) ОТР-аз, Аг11р и Аг13р.

Κίη2 и близкородственная Κίη1 являются двумя серин/треонин-протеинкиназами, локализованными на цитоплазматической стороне плазматической мембраны. Каталитическая активность Κίη2 является существенной для ее функции в регуляции экзоцитоза фосфорилированием ΐ-8NΑКΕ 8ес9 плазматической мембраны, белка, действующего в конечной фазе экзоцитоза. Генетический анализ указывает на то, что киназы ΚΙΝ действуют ниже в этом процессе, чем экзоцист, фактор привязывания пузырьков в участке экзоцитоза, и его регулятор 8ес4 (ОТР-связывающий белок семейства Как).

СИР5 кодирует с-субъединицу дрожжевого вакуолярного У₀-домена (Н)-АТФазы (У-АТФазы), принадлежащей к семейству АТФ-зависимых протоновых насосов, которые подкисляют центральную вакуоль дрожжей. Этот У₀-домен является интегральной мембранной структурой из пяти субъединиц, ответственных за транспорт протонов через мембрану. Сборка У₀-домена невозможна в отсутствие СИР5. У-АТФазная функция является важной для многих процессов, включающих в себя эндоцитоз, деградацию белка и сопряженный транспорт через мембрану. Дополнительно, сообщалась роль У-АТФазы в детоксификации меди, метаболизме железа и митохондриальной функции.

В другом аспекте это изобретение относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, который увеличивает секрецию белка из клетки-хозяина, где эта нуклеотидная последовательность выделена из Р1сЫа разЮпз и является идентичной или соответствует или имеет функциональные характеристики последовательности, выбранной из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ВМН2 (8ΕΟ ΙΌ NО: 42), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ВГК2 (8ΕΟ ΙΌ NО: 43), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок СОО6 (8ΕΟ ΙΌ NО: 44), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок СОУ1 (8ΕΟ ΙΌ NО: 45), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок СИР5 (8ΕΟ ΙΌ NО: 46), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок IМН1 (8ΕΟ ΙΌ NО: 47), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ΚΙΝ2 (8ΕΟ ΙΌ NО: 48), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок 8БС31 (8ΕΟ ΙΌ NО: 49), нуклеотидной последовательности, кодирующей белок 88А4 (8ΕΟ ΙΌ NО: 50), и нуклеотидной последовательности, кодирующей белок 88Ε1 (8ΕΟ ΙΌ NО: 51).

В следующем аспекте это изобретение относится к промоторной последовательности дрожжей, являющейся фрагментом 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена РБТ9, соответствующим 8ΕΟ ΙΌ NО: 125, или его функционально эквивалентным вариантом, и выделенной из Р1сЫа раз1опз.

Должно быть понятно, что промоторные последовательности различной уменьшающейся длины могут иметь идентичную промоторную активность и, следовдтельно, должны быть также включены в данное изобретение, так как точные границы регуляторной последовательности этого 5'-некодирующего района гена РБТ9 не были определены.

Таким образом, термин функционально эквивалентный вариант промоторной последовательности обозначает в данном контексте нуклеотидную последовательность, полученную из модификации этой нуклеотидной последовательности инсерцией, делецией или заменой одного или более нуклеотидов внутри этой последовательности или на любом дистальном конце или на обоих дистальных концах этой

- 9 017803 последовательности, причем модификация не должна влиять (в частности, не должна нарушать) на промоторную активность этой нуклеотидной последовательности.

В следующем аспекте это изобретение относится к такой промоторной последовательности дрожжей, которая имеет при сравнимых условиях улучшенные свойства в отношении экспрессии ΡΟΙ в дрожжах, предпочтительно в штамме рода Котада1ае11а, в частности в штамме Котада1ае11а раЧогА Котада1ае11а ркеиборайопк или Кошада1ае11а рПаГГН, относительно промотора дрожжей, известного в данной области, в частности родственного ΟΛΡ-промотору, выделенному из Р1сЫа раЧогА

В следующем аспекте это изобретение относится к такой промоторной последовательности дрожжей, имеющей при сравнимых условиях, по меньшей мере, ту же самую или по меньшей мере приблизительно 1,5-кратную, или по меньшей мере приблизительно 2-кратную, или по меньшей мере приблизительно 4-кратную, 7-кратную, 10-кратную, или по меньшей мере приблизительно 15-кратную промоторную активность относительно промоторной активности промотора САР, выделенного из РюЫа райогщ

Желательно иметь систему экспрессии для рекомбинантной экспрессии нуклеотидной последовательности в организме-хозяине, в частности в хозяине-дрожжах, более конкретно, в штамме рода Котада1ае11а, которая предоставляет возможность легкого изменения различных частей вектора, таких как маркер селекции, например зеоцин, канамицин/генетицин, гигромицин и др., промотор или терминатор транскрипции. Было бы также выгодно, если бы этот вектор мог быть либо интегрирован в геном хозяина (с использованием последовательностей гомологичной интеграции), либо локализован эписомально заменой части этого вектора, которая не является важной для экспрессии гетерологичного гена.

Для конструирования новой векторной системы ρΡιι/ζΕ, которая обеспечивает вышеупомянутые преимущества, в первой стадии был генерирован скелет вектора ρΡιιζζΕ, несущий сайт инициации репликации и маркер селекции для ЕксйепсЫа сой (Е.сой), который позволяет амплификацию этого скелета вектора в Е.со11. Кроме того, этот скелет вектора ρΡιιζζΚ содержит сайт множественного клонирования (см. фиг. 1 и пример 3).

Во второй стадии конструировали экспрессирующий вектор ρΡιιζζΕ, несущий эукариотический маркер селекции, промотор для рекомбинантной экспрессии гетерологичной или гомологичной нуклеотидной последовательности, терминатор транскрипции и, необязательно, последовательности для гомологичной интеграции этого вектора в геном хозяина (см. пример 4). Выбор промоторной последовательности и маркера селекции зависит от организма-хозяина, который используют для рекомбинантной экспрессии нуклеотидной последовательности. Терминатором транскрипции может быть, в принципе, каждый функциональный терминатор транскрипции и, в частности, им является терминатор транскрипции гена цитохрома с из Б.сегеуШае. Далее, присутствие последовательностей гомологичной интеграции зависит от того, предназначена или не предназначена эта нуклеотидная последовательность для интеграции в геном хозяина. Поскольку маркер селекции, промоторная последовательность и последовательности гомологичной интеграции фланкированы уникальными сайтами расщепления рестрикционных ферментов, они могут быть легко заменены, т.е. вырезаны и замещены, посредством чего этот вектор может легким и эффективным путем изменяться или адаптироваться для выбранного организма-хозяина.

Конкретно, маркер селекции клонируют в уникальном сайте рестрикции Крп1, последовательности гомологичной рекомбинации клонируют в уникальном сайте рестрикции ЫоП, промотор клонируют с использованием сайта рестрикции Ара1 и БЬП/Ааг1 и нуклеотидную последовательность, кодирующую ΡΟΙ, клонируют в МС8 (сайте множественного клонирования) с использованием сайтов рестрикции 8ЬП и 8Ш.

В дополнительном аспекте это изобретение относится к эукариотическому экспрессирующему вектору на основе молекулярного скелета рΡиζζ1е, дополнительно содержащему следующие компоненты, функционально связанные друг с другом:

рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую ΡΟΙ, необязательно связанную с лидерной последовательностью, эффективной для вызывания секреции ΡΟΙ из клетки-хозяина;

промотор, эффективный для контроля экспрессии белка в клетке-хозяине;

терминатор транскрипции;

маркер селекции;

последовательности гомологичной интеграции либо последовательности автономной репликации, где этим промотором является промотор 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ΡΕΤ9 ΡΕΙιίη раЧогЕ (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 125) или его функционально эквивалентный вариант, терминатором транскрипции является терминатор транскрипции гена цитохрома с из З.сегеуШае, маркером селекции является ген устойчивости к зеоцину, и клеткой-хозяином является клетка дрожжей, предпочтительно клетка штамма рода Котада1ае11а, в частности клетка штамма Котада1ае11а раЧогА Котада1ае11а ркеиборайопк или Котада1ае11а рПаГГП.

Подробное описание процедуры для конструирования такого вектора, который дополнительно содержит усиленный зеленый флуоресцентный белок еСЕТ в качестве репортерного гена (рΡиζζ1е_ζеоΒ_Ρреΐ9_еСΡΡ_АΟXΤΤ), можно найти в примерах 3-5 и на фиг. 2.

- 10 017803

Понятно, что любая гетерологичная или гомологичная нуклеотидная последовательность, предназначенная для рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине, может быть использована в положении еСРР.

В другом аспекте это изобретение относится к применению такого эукариотического экспрессирующего вектора для рекомбинантной экспрессии РО1 в клетке-хозяине.

В зависимости от подлежащей решению проблемы может быть желательным либо получение сильной экспрессии представляющего интерес белка в клетке-хозяине (например, рекомбинантного продуцирования РО1 в клетке-хозяине), либо получение слабой или уменьшенной экспрессии представляющего интерес белка в клетке-хозяине (например, при анализе молекулярной функции РО1 в клетке-хозяине).

Конкретно, в случае анализа молекулярной функции клеточного РО1 или в случае РО1, предназначенного для применений метаболического конструирования, когда белок не должен секретироваться и развивает его активность внутри желаемого компартмента клетки, было бы заманчивым иметь возможность регулировать уровень экспрессии этого представляющего интерес белка посредством промоторной активности. Может быть желательным либо получение сильной экспрессии РО1 (сравнимой с экспрессией от промотора САР или более сильной, чем от промотора САР). Таким образом, полезно иметь выбор из различных последовательностей промоторов, подходящих для рекомбинантной экспрессии гетерологичной или гомологичной нуклеотидной последовательности в организме-хозяине, в частности в хозяине-дрожжах, более конкретно, в штамме рода Кошада1ае11а, в частности в клетке штамма Кошада1ае11а радона Кошада1ае11а ркеиборайопк или Кошада1ае11а рйаГПк имеющих разные промоторные активности при сравнимых условиях культивирования клеток, варьирующие от сильной промоторной активности до слабой или уменьшенной промоторной активности, в сравнении с промотором САР. Это позволяет регулировать уровень экспрессии представляющего интерес белка выбором подходящей промоторной последовательности в соответствии с экспериментальной ситуацией.

Из сравнительного анализа промоторных последовательностей, описанного в примере 5, т.е. из анализа промоторной активности, были обнаружены несколько промоторных последовательностей с различными промоторными активностями, находящимися в диапазоне от 0 до приблизительно 135% промоторной активности промотора САР, выделенного из РюЫа раДогб, при экспериментальных условиях, описанных в примере 5.

Суммирование промоторных активностей промоторных последовательностей дрожжей, испытанных в примере 5 (определяемых измерением относительного уровня экспрессии в % продукта репортерного гена еСРР и стандартизацией относительно экспрессии еСРР под контролем промотора САР), может быть найдено в табл. 8.

Более подробно, фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ΟΝΩ1 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 67% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена СРМ1 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 19 до приблизительно 41% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена Н8Р90 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 6 до приблизительно 81% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена КАК2 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 11 до приблизительно 135% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена МСМ1 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 6% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена КАЭ2 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 5% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена КР82 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 12% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена Р8Р31 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 8% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена 88А1 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 30% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ТН13 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 42% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ТР11 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 92% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ИВ14 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 4% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ΕNО1 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 17 до приблизительно 47% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена КР87А имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 1 до приблизительно 18% промо

- 11 017803 торной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена КРЬ1 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 11 промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ТКБ1 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 9% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена Р181 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 7% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ЕЕТ3 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 7% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ЕТВ1 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 6% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ΝΜΤ1 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 5 до приблизительно 30% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена РНО8 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 6% промоторной активности промотора САР. Фрагмент 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ЕЕТ3 имел, при экспериментальных условиях примера 5, промоторную активность в диапазоне от 0 до приблизительно 7% промоторной активности промотора САР.

В другом аспекте это изобретение относится к промоторной последовательности дрожжей, выделенной из Р|с1на райогк и являющейся идентичной или соответствующей и имеющей функциональные характеристики последовательности, выбранной из группы, состоящей из фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена СХО1 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 126), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена СРМ1 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 127), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена Н8Р90 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 128), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена КАК2 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 129), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена МСМ1 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 130), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена КАИ2 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 131), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ВР82 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 132), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ВР831 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 133), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена 88А1 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 134), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ТШ3 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 135), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ТРИ (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 136), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена υΒΙ4 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 137), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ΕΝΟ1 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 138), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена КР87А (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 139), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена КРЬ1 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 140), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ТКЬ1 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 141), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ΠΙ81 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 142), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ЕЕТ3 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 143), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ЕТВ1 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 144), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена ΝΜΜ (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 145), фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена РНО8 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 146) и фрагмента 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена предшественника ЕЕТ3 (ЕЕТ3рге) (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 147), или функционально эквивалентного варианта любой из перечисленных последовательностей.

Энолаза 1 ^ΝΟ1) является фосфопируватгидратазой, которая катализирует превращение 2-фосфоглицерата в фосфоенолпируват во время гликолиза и обратную реакцию во время глюконеогенеза.

Триозофосфатизомераза (ТРИ) является имеющимся в изобилии гликолитическим ферментом. Она катализирует взаимное превращение глицеральдегид-3-фосфата и дигидроксиацетонфосфата во время гликолиза.

ТШ3 является возможной декарбоксилазой, требуемой для экспрессии ферментов, участвующих в биосинтезе тиамина, и может играть роль в катаболизме аминокислот до длинноцепочечных и комплексных спиртов.

88А1 является АТФазой, участвующей в фолдинге белка и ядерном транспорте, направляемом сигналом ядерной локализации (ΝΌ8). 88А1 является членом семейства белка 70 теплового шока (Н8Р70).

КР87А является белковым компонентом малой субъединицы (408) рибосомы.

6-Фосфоглюконатдегидрогеназа (ΌΝΌ1) катализирует реакцию регенерации НАОРН в пентозофосфатном пути и необходима для роста на Ό-глюконо-дельта-лактоне и адаптации к окислительному стрессу.

СРМ1 кодирует фосфоглицератмутазу, которая является тетрамерным ферментом, ответственным за превращение 3-фосфоглицерата в 2-фосфоглицерат во время гликолиза и обращенную реакцию во время глюконеогенеза.

Транскетолаза (ТКЬ1) катализирует превращение ксилулозо-5-фосфата и рибозо-5-фосфата в седогептулозо-7-фосфат и глицеральдегид-3-фосфат в пентозофосфатном пути и необходима для синтеза ароматических аминокислот.

Белок 90 теплового шока (Н8Р90) является цитоплазматическим шапероном (Н§р90-семейства).

КР82 является белковым компонентом малой субъединицы (408) рибосом.

- 12 017803

ВР831 является слитым белком, который расщепляется с образованием рибосомного белка малой субъединицы (408) рибосом и убиквитина.

ВРЫЛ является белковым компонентом большой субъединицы (608) рибосом.

Фосфатидилинозитолсинтаза Р181 необходима для биосинтеза фосфатидилинозита, который является предшественником полифосфоинозитидов, сфинголипидов и гликолипидных якорей для некоторых из белков плазматической мембраны.

Ферро-О₂-оксидоредуктаза (ЕЕТ3) принадлежит к классу интегральных мембранных мульти-Сиоксидаз и необходима для высокоаффинного поглощения железа и участвует в опосредовании устойчивости к токсичности ионов меди, ЕЕТЗрте является ее предшественником.

Высокоаффинная Ее-пермеаза (ЕТВ1) участвует в транспорте железа через плазматическую мембрану и образует комплекс с Ее(3р.

РНО8 является репрессируемой щелочной фосфатазой.

Ν-Миристоилтрансфераза ΝΜΤ1 катализирует котрансляционное, ковалентное присоединение миристиновой кислоты к Ν-концевому остатку глицина нескольких белков, участвующих в клеточном росте и трансдукции сигнала.

Фактор транскрипции МСМ1 участвует в специфической в отношении клеточного типа транскрипции и феромоновой реакции.

Убиквитин (иВ14) становится конъюгированным с белками, маркируя их для селективной деградации через комплекс убиквитин-протеасома 268.

ΒΑΌ2, эндонуклеаза одноцепочечной ДНК, расщепляет одноцепочечную ДНК во время репарации с вырезанием нуклеотидов для вырезания поврежденной ДНК.

В следующем аспекте это изобретение относится к эукариотическому вектору экспрессии на основе молекулярного скелета рРи//1е. дополнительно содержащему следующие компоненты, функционально связанные друг с другом:

рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую РО1, функционально связанную с лидерной последовательностью, эффективной для вызывания секреции этого РО1 из клетки-хозяина;

промотор, эффективный для контроля (регуляции) экспрессии белка в клетке-хозяине;

терминатор транскрипции;

маркер селекции;

последовательности гомологичной интеграции либо последовательности автономной репликации, где этот промотор является последовательностью промотора дрожжей, выделенной из Р1сЫа райотЕ, и является идентичным или соответствует и имеет функциональные характеристики последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ NО: 125, 8ЕО ΙΌ NО: 126, 8ЕО ΙΌ NО: 127,

8ЕО ΙΌ ^: 128, 8ЕО ΙΌ ^: 129, 8ЕО ΙΌ ^: 130, 8ЕО ΙΌ ^: 131, 8ЕО ΙΌ ^: 132, 8ЕО ΙΌ ^:133,

8ЕО ΙΌ ^: 134, 8ЕО ΙΌ 135, 8ЕО ΙΌ 136, 8ЕО ΙΌ 137, 8ЕО ΙΌ 138, 8ЕО ΙΌ139,

8ЕО ΙΌ ^: 140, 8ЕО ΙΌ ^: 141, 8ЕО ΙΌ ^: 142, 8ЕО ΙΌ ^: 143, 8ЕО ΙΌ ^: 144, 8ЕО ΙΌ ^:145,

8ЕО ΙΌ NО: 146 и 8ЕО ΙΌ NО: 147, или функционально эквивалентного варианта любой из перечисленных последовательностей, и эта клетка-хозяин является клеткой дрожжей, предпочтительно клеткой штамма рода Котада1ае11а, в частности клеткой штамма Котада1ае11а райотЕ, Котада!ае11а ркеиборайотщ или Котада1ае11а рйаГГп.

В другом аспекте это изобретение относится к применению такого эукариотического экспрессирующего вектора для рекомбинантной экспрессии РОI в клетке-хозяине.

В случае, когда РОI является клеточным белком, предназначенным для применений метаболического конструирования, т.е. для экспрессии и развития его активности в желаемом компартменте клеткихозяина, этот РОI может быть экспрессирован из эукариотического экспрессирующего вектора на основе молекулярного скелета рРи//1е без лидерной последовательности, эффективной для вызывания секреции этого РОI из этой клетки-хозяина.

Если этот клеточный РОI является гомологичным белком для клетки-хозяина, т.е. белком, который природно встречается в этой клетке-хозяине, экспрессия этого РОI в клетке-хозяине может быть модулирована заменой его природной промоторной последовательности промоторной последовательностью дрожжей, выделенной из Р1сЫа ра^огЕ и являющейся идентичной или соответствующей и имеющей функциональные характеристики последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ ^: 125, 8ЕО ΙΌ ^: 126, 8ЕО ΙΌ ^: 127, 8ЕО ΙΌ ^: 128, 8ЕО ΙΌ ^: 129, 8ЕО ΙΌ ^: 130,

8ЕО ΙΌ ^: 131, 8ЕО ΙΌ ^: 132, 8ЕО ΙΌ ^: 133, 8ЕО ΙΌ ^: 134, 8ЕО ΙΌ ^: 135, 8ЕО ΙΌ ^: 136,

8ЕО ΙΌ ^: 137, 8ЕО ΙΌ ^: 138, 8ЕО ΙΌ ^: 139, 8ЕО ΙΌ ^: 140, 8ЕО ΙΌ ^: 141, 8ЕО ΙΌ ^: 142,

8ЕО ΙΌ ^: 143, 8ЕО ΙΌ ^: 144, 8ЕО ΙΌ ^: 145, 8ЕО ΙΌ ^: 146 и 8ЕО ΙΌ ^: 147 или функционально эквивалентного варианта любой из перечисленных последовательностей.

Эта цель может быть достигнута, например, трансформацией клетки-хозяина рекомбинантной молекулой ДНК, содержащей гомологичные последовательности гена-мишени для возможности специфической рекомбинации, желаемые промоторные последовательности дрожжей и маркер селекции, подходящий для этой клетки-хозяина. Сайт-специфическая рекомбинация будет иметь место для функционального связывания промоторной последовательности дрожжей с нуклеотидной последовательностью,

- 13 017803 кодирующей ΡΟΙ. Это приводит к экспрессии ΡΟΙ от промоторной последовательности дрожжей вместо экспрессии от природной промоторной последовательности.

В зависимости от подлежащей решению проблемы, выбранный промотор дрожжей может иметь либо увеличенную промоторную активность относительно промоторной активности природной промоторной последовательности, приводящую к увеличенной экспрессии ΡΟΙ в клетке-хозяине, либо может иметь уменьшенную промоторную активность относительно промоторной активности природной промоторной последовательности, приводящую к уменьшенной экспрессии ΡΟΙ в клетке-хозяине.

В другом аспекте это изобретение относится к применению промоторной последовательности дрожжей, выделенной из Ρχΐιίη раЧогЕ и являющейся идентичной или соответствующей и имеющей функциональные характеристики последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8РО ГО N0: 125, 8Ер ГО N0: 126, 8Ер ГО N0: 127, 8Ер ГО N0: 128, 8Ер ГО N0: 129, 8Ер ГО N0: 130,

8РО ГО N0: 131, 8РО ГО N0: 132, 8РО ГО N0: 133, 8РО ГО N0: 134, 8РО ГО N0: 135, 8РО ГО N0: 136,

8РО ГО N0: 137, 8РО ГО N0: 138, 8РО ГО N0: 139, 8РО ГО N0: 140, 8РО ГО N0: 141, 8РО ГО N0: 142,

8РО ГО N0: 143, 8РО ГО N0: 144, 8РО ГО N0: 145, 8РО ГО N0: 146 и 8РО ГО N0: 147 или функционально эквивалентного варианта любой из перечисленных последовательностей.

В другом аспекте это изобретение относится к такому применению, в котором эта промоторная последовательность дрожжей имеет увеличенную промоторную активность относительно промоторной активности природной промоторной последовательности этого Ρ0Ι.

В другом аспекте это изобретение относится к такому применению, в котором эта промоторная последовательность дрожжей имеет уменьшенную промоторную активность относительно промоторной активности природной промоторной последовательности этого Ρ0Ι.

Для лучшего понимания описанного здесь изобретения приведены следующие примеры. Эти примеры приведены только для иллюстративных целей и не должны пониматься как ограничивающие это изобретение в каком-либо отношении. Кроме того, понятно, что данное изобретение будет также включать в себя вариации специально описанных вариантов осуществления до такой степени, которая могла бы предполагаться специалистом с обычной квалификацией в данной области.

Примеры

Примеры 1 и 2 ниже иллюстрируют материалы и способы, используемые для исследования действия коэкспрессии различных белков, участвующих в эукариотическом пути секреции (секреции хелперных факторов) на выход представляющего интерес секретируемого гетерологичного белка, т.е. на секрецию РаЬ-фрагмента моноклонального анти-ВИЧ1-антитела 2Р5 в Ρ.ρа8ΐο^^8.

Пример 1. Идентификация и клонирование нескольких хелперных факторов секреции из 8асс11аготусе5 сегеуыае.

Для идентификации генов и их соответствующих белков, которые играют потенциальную роль во время продуцирования белков, например в секреторном пути белков Ρ.]χ·ΐ5ΐοπ5, картину (паттерн) экспрессии генов штамма Ρ.ρηδΙοπδ, содержащего ген трипсиногена 1 человека, сравнивали до и после индукции продуцирования гетерологичного белка (индукцию выполняли переключением с глицерина на метанол в качестве единственного источника углерода), т.е. продуцирования трипсиногена, посредством анализа с использованием микроматриц.

Поскольку последовательность генома Ρ.ρηδΙοπδ не была опубликована и немногие гены были охарактеризованы для Ρ.]χ·ΐ5ΐοπ5, для гетерологичной гибридизации с кДНК Ρ.ρπδΙοπδ использовали микроматрицы ДНК 8.сегеу151ае.

Экспериментальную процедуру гибридизации микроматриц и оценивание полученных данных проводили, как описано в 8аиег е! а1. (2004). Дополнительные подробности приведены ниже.

a) Штамм.

Экспрессирующим штаммом был штамм Ρ.ρηδΙοπδ Х33 (1пуйгодеп), штамм дикого типа, который может расти на минимальной среде без добавок. Механизмы отбора основывались на устойчивости к зеоцину ^οαη™) трансформирующего вектора. Трансформацию этого штамма проводили с использованием плазмиды, произведенной из ρΡΙί'ΖαΒ (1пуйгодеп), содержащей ген трипсиногена 1 человека (ΗοΙκηΝιιιη е! а1., 2003). ρΡΚΖαΒ использует промотор А0Х1 Ρ.]χ·ΐ5ΐοπ5, который репрессируется многими источниками углерода, такими как глюкоза, глицерин или этанол, но индуцируется таким источником углерода, как метанол, и лидерную последовательность α-фактора 8.сегеу151ае для секреции продукта. Выбранный штамм имел фенотип, положительный в отношении утилизации метанола (ти!⁺), что означает, что он полностью способен метаболизировать метанол в качестве единственного источника углерода.

b) Культура клеток.

Ферментация Ρ.ρηδΙοπδ.

Ферментации культур с подпиткой выполняли с использованием мини-биореактора МВР с конечным рабочим объемом 2 л, в основном, как описано ΗοΙκηΝιιιη е! а1., 2003).

- 14 017803

Среды были следующими.

Исходный раствор солей микроэлементов ΡΤΜι содержал на 1 л:

6,0 г Си8О₄-5Н₂О, 0,08 г Ν^, 3,0 г МпЗО₄-Н₂О, 0,2 г №₂МоО₄-2Н₂О, 0,02 г Н₃ВО₃, 0,5 г СоС1₂, 20,0 г 2пС1₂, 65,0 г Ре8О₄-7Н₂О, 0,2 г биотина и 5,0 мл Н₂ЗО₄ (95-98%). Все химикалии для исходного раствора солей микроэлементов были из К1ебе1-бе Наеп, за исключением биотина (81дта) и Н₂ЗО₄ (Мегск Еиго1аЬ).

Среда для периодической культуры содержала на 1 л:

23,7 мл Н^О₄ (85%), 0,6 г Са8О₄-2Н₂О, 9,5 г К₂ЗО₄, 7,8 г Мд8О₄-7Н₂О, 2,6 г КОН, 40 г глицерина,

4.4 мл исходного раствора солей микроэлементов ΡΤΜ₁.

Глицериновый раствор для среды с подпиткой содержал на 1 л:

632 г глицерина (100%) и 12 мл исходного раствора солей микроэлементов ΡΤΜ₁.

Раствор метанола для среды с подпиткой содержал на 1 л:

988 мл метанола (100%) и 12 мл исходного раствора солей микроэлементов ΡΤΜ₁.

Растворенный кислород контролировали при ИО=30% со скоростью мешалки (600-1200 об/мин). Скорость аэрации была 100 л/ч, и кислород добавляли (до 25%) после начала периодического процесса с подпиткой. Температура была равна 25°С и рН регулировали с использованием ΝΉ₃ (25%).

Перед началом ферментации рН 1,2 л среды для периодического процесса устанавливали на 5,0 при помощи ΝΉ₃ (25%). После периодической фазы в течение приблизительно 32 ч следовал 4-часовой период с подачей глицериновой среды (скорость подачи 15,6 мл/ч), что приводило к концентрации сухой массы приблизительно 40 г/л. Затем начинали подпитку метанольной средой со скоростью подачи 6,4 мл/ч. Метанол индуцирует продуцирование гетерологичного белка трипсиногена и служит одновременно в качестве источника углерода. Ферментацию заканчивали спустя 14 ч после начала подачи метанола. рН был равен 5,0 во время периодического процесса и поддерживался при 5,0 на протяжении всей ферментации.

Пробы брали в конце фазы подпитки глицерином (не экспрессирующие трипсиногена клетки) и в конце фазы подпитки метанолом (экспрессирующие трипсиноген клетки) соответственно. Клетки центрифугировали для отделения супернатанта культуры клеток, затем осадки клеток ресуспендировали в 10-кратном объеме реагента ΤΚΙ (81дта) и замораживали.

с) Выделение РНК.

Пробы оттаивали на льду и после добавления промытых кислотой стеклянных гранул клетки гомогенизировали в приборе КгЬо1у8ег (НуЬа1б Ыб.) в течение 2x20 с при охлаждении в промежутке на льду. После добавления хлороформа эти пробы центрифугировали и тотальную РНК преципитировали (осаждали) из водной фазы добавлением изопропанола. Осадок промывали 2 раза 70% этанолом, сушили и ресуспендировали в не содержащей РНКаз воде. мРНК выделяли с использованием набора для очистки мРНК Μ^с^оΡо1у(А) ΡιιπδΙ ιηΚΝΑ (АтЬюп) в соответствии с протоколом изготовителя.

б) Синтез и мечение кДНК.

мкг мРНК и 0,5 мкг олиго-бТ-праймера смешивали в 7 мкл воды, инкубировали в течение 5 мин при 70°С и затем при 42°С в течение приблизительно 3 мин. К 5 мкл указанной реакционной смеси добавляли следующие компоненты: 4 мкл реакционного буфера (5х) для обратной транскриптазы 8ирег5спр1 ΙΙ ([пубгодеп), 2 мкл 6ΤΤΡ (2 мМ), 2 мкл бАΤΡ, 6θΤΡ, бСТТ (5 мМ), 2 мкл ДТТ (100 мМ),

2.5 мкл РШйп (40 Е, йготеда) и либо 2 мкл ИиопЫпк Су3-бυΤΡ (1 мМ), либо 2 мкл НиопЫпк Су5-бυΤΡ (1 мМ, Атегкйат Вюкщепсек) соответственно и 1 мкл обратной транскриптазы Зирегаспр! ΙΙ геуегае 1гап5спр1а5е (200 Е, Шуйгодеп) с получением в целом 19,5 мкл. Эту смесь инкубировали в течение 1 ч при 42°С. После добавления дополнительно 200 Е обратной транскриптазы Зирегаспр! ΙΙ эту смесь инкубировали в течение еще 1 ч при 42°С. Добавляли 7 мкл 0,5 М №1ОН/50 мМ ЭДТА и эту смесь инкубировали при 70°С в течение 15 мин. Эту реакционную смесь нейтрализовали добавлением 10 мкл Τηδ-ΠΟ рН 7,5 (1 М). Меченую ДНК очищали с использованием колонок для очистки О|ас.|шск (С|адеп) в соответствии с протоколом изготовителя.

е) Чип-гибридизация и создание микроматриц.

Микроматрицами кДНК З.сетеуШае, используемыми для этого исследования, были микропроцессоры (чипы) Нурег Сепе УеаЧ СЫрк из НйасЫ Зой^ате Епдтееппд Еигоре АС. В соответствии с протоколом изготовителя приблизительно 0,1-0,3 нг ПЦР-амплифицированной кДНК (приблизительно 2008000 п.о.) наносили в виде пятен на покрытое поли-Ь-лизином предметное стекло и фиксировали отжиганием, блокированием янтарным ангидридом и денатурацией нагреванием.

Меченую кДНК ресуспендировали в приблизительно 70 мкл 5х88С/0,05% ДСН, денатурировали нагреванием при 95°С в течение 3 мин и охлаждали на льду. Появляющиеся кристаллы ДСН растворяли кратковременным и слабым нагреванием и эту смесь осторожно наносили на дрожжевой чип. Зону с пятнами покрывали покровным стеклом и чипы помещали в воздухонепроницаемый контейнер с увлажненной атмосферой при 60°С на 16 ч.

Покровные стекла удаляли в 2х88С/0,1% ДСН и эти чипы промывали последовательно в течение 5-10 мин в каждом случае в 2х88С/0,1% ДСН, 0,5х88С/0,1% ДСР и 0,2х88С/0,1% ДСН при комнатной температуре (ΚΤ). Эти чипы центрифугировали при 600 об/мин в течение 3 мин для высушивания. Усло

- 15 017803 вия сушки выбирали в соответствии с инструкциями изготовителя.

Каждую пробу (меченую кДНК из не экспрессирующих трипсиноген клеток и из экспрессирующих трипсиноген клеток) использовали для гибридизации двух параллельных микроматриц кДНК для испытания воспроизводимости этих сигналов.

ί) Получение данных и статистическое оценивание данных микроматриц.

Изображения сканировали при разрешении 50 мкм с использованием сканера микроматриц С2565АА (АдИей) и импортировали в программу анализа микроматриц СеиеР1х Рго 4.1 (Ахоп ШДгитеий). СеиеР1х Рго 4.1 использовали для количественного определения интенсивности пятен. Каждое появляющееся пятно гена усредняли. Затем этот набор данных импортировали в Сеие8ргшд 6.1 (8Шсои СеиеИск) для дальнейшей нормализации и анализа данных.

Все из величин каждого канала на каждом чипе делили на их соответствующую медиану для нормализации. Затем медианную интенсивность всех ТЕ-пятен (пятен с буфером, без ДНК) выводили из каждой величины и все величины пятен, меньшие стандартного отклонения указанных пороговых величин, считали не значимыми и относили к величине стандартного отклонения. Для определения индукции или репрессии активности гена эти нормализованные сигналы на каждом пятне сравнивали и все гены, обнаруживающие различие сигнала, превышающее порог ((1,5-кратные) на обеих параллельных независимых микроматрицах, оценивали как значимо регулируемые.

После определения этих относительных уровней экспрессии всех измеряемых генов эти гены выстраивали (ранжировали) по относительному различию их уровней экспрессии и 524 гена с наивысшим различием выбирали для дальнейшего анализа. При использовании для этих экспериментов ДНКмикроматриц, полученных из последовательностей генов 8ассйаготусе5 сегеуЩае, только предположительные функции генов для Р.райопк могут быть отнесены в соответствии с гомологией к 8.сегеу151ае. После ранжирования этих 524 дифференциально регулируемых генов на основе их предположительной внутриклеточной локализации и функции и фокусирования внимания на генах, участвующих в секреции и/или общей стрессовой реакции, из 64 потенциально представляющих интерес генов были выбраны 15 генов для дальнейшего анализа: РЭН, СИР5, 88А4, ВМН2, ΚΙΝ2, КАВ2, НАС1, ЕВО1, 88Е1, ВРВ2, СОС6, 88О2, СОУ1, ]МН1 и 8ЕС31.

д) Конструирование экспрессирующего вектора для клонирования идентифицированных хелперных факторов секреции.

Для генерирования вектора, содержащего промотор САР и ген Ы§4 в качестве маркера селекции, промотор АОХ1 вектора рРК',’9 (ИпуИгодеп) заменяли на промотор САР рСАР2 В ЦиуИгодеи) рестрикционным расщеплением обоих векторов с использованием ΝθΙΙ и Мрй11031 и последующим лигированием в соответствии со стандартным протоколом. Этот заново сконструированный вектор был назван рСАРН18.

й) Выделение генов хелперных факторов из 8ассНаготусе5 сегеуЩае и клонирование в рСАРНй.

Все эти гены, кроме НАС1, амплифицировали непосредственно из геномной ДНК 8ассйаготусе5 сегеуЩае при помощи ПЦР со специфическими олигонуклеотидными праймерами, изображенными в табл. 1. Последовательность Козака Р.райогЦ (АСС) инсертировали непосредственно перед стартовым кодоном АТС. Не кодируемые матрицей сайты рестрикции 8асП (ХМ для гена РОИ) и либо РтИ, либо 8ίϊΙ (ЕсоШ для гена РОИ) добавляли с использованием прямого и обратного праймера (см. табл. 1). После рестрикционного расщепления ПЦР-фрагментов правильной длины (проверяемой разделением на агарозном геле) 8асП (ХМ для гена РОИ) и либо РтИ, либо 8ίΐΙ (ЕсоШ для гена РЭП), как показано в табл. 1, эти фрагменты клонировали в вектор рСАРНщ (также расщепленный соответствующими рестрикционными ферментами и обработанный щелочной фосфатазой). Для конструирования индуцированного варианта гена НАС1 8.сегеу151ае ДНК-фрагмент, кодирующий первые 220 аминокислот, объединяли с фрагментом, кодирующим состоящий из 18 аминокислот экзон индуцированного Нас1р (Моп е1 а1., 2000) в двухступенчатой ПЦР-реакции, и полученный фрагмент лигировали в рСАРНЦ.

Все лигированные плазмиды трансформировали в Е.соИ Тор 10Р' (IиνИ^одеи) и высевали на содержащий ампициллин ЬВ-агар. Анализ с использованием рестрикционных ферментов выполняли для подтверждения точной идентичности соответствующих плазмид.

- 16 017803

Таблица 1

ПЦР-праймеры для амплификации хелперных факторов секреции из 8ассйаготусев сегеу151ае (8Еф ГО ЫО: 1-8Еф ГО ЫО: 31)

Прямой Праймер ВЕК.2 ГОКИ РтЦ (ЗЕ<2 Ю N0 1), 54°С: 5' - ТАААСАС6Т6АБСАТССАААААТСАСТАЕССБ - 3'

Обратный праймер Г'Ер. 2 ВАСК ЗасИ (ЗЕО 10 N0 2), 56°С: 5' - ТАСАССБСЕБТСААССАААСАТТТСЕАТАТС - 3'

Прямой праймер ВМН2 ГОКИ РтЦ (ЗЕ<2 10 N0 3), 56°С: 5' - ТААССАССТСАЕСАТБТСССАААСТССТБААС - 3'

Обратный праймер ВМН2 ВАСК ЗасИ (ΞΕΟ Ι0Ν04)/ 58 °С: 5' - ТАТСССОСССТТАТТТОСТТССТТСАССТТО - Зг

Прямой праймер СОСб ЕОКИ РтЦ (ЗЕО Ю N0 5), 56°С: 5' - ТААССАСОТОАССАТССАТТТССТТСТАСАСТАТ - 3'

Обратный праймер С0С6 ВАСК ЗасИ (5Е<2 10 N0 6), 60°С; 5' - ТААБССЕСЕБТСАЕТЕАТСААТАССТАТСААС - 3'

Прямой праймер ΟΟΥ1 ГОКИ РтЦ (ЗЕО Ю N0 7) , 54°С: 5' - ТАЕТСАССТСАЕСАТЕЕАТАСБТСАБТАТАТТС - 3'

Обратный праймер 00Υ1 ВАСК ЗасИ (ЗЕО 10 N0 8), 58°С: 5' - ТАСАСССССССТАТССАТТТАТНССАТСААС - 3'

Прямой праймер СЦР5 ГОКИ РтЦ (ЗЕО Ю N0 9), 54°С: 5' - ТАТССАСБТОАЕСАТБАСТЕААТТБТБТССТБ - 3'

Обратный праймер ССР5 ВАСК ЗасИ (ЗЕО ΣΒ N0 10), 54°С: 5' - ТАСАССССОСТТААСАСАСААСАТСТТСАС - 3'

Прямой праймер ЕК01 ЕОВИ 5£ίΙ (3Ξ0 ΙΌ N0 11)г 62 иС: 5' - ТАТАСССССАСССССССАССАТСАСАТТААСААССОССАТТС - 3'

Обратный праймер ЕК01 ВАСК ЗасИ (3Εζ) 10 N0 12), 58°С: 5' - ТЕТСССССБЕТТАТТЕТАТАТСТАБСТТАТАБС - 3'

Прямой праймер ΙΜΗ1 ГОКИ 3£ίΙ (ЗЕф Ю N0 13), 54°С: 5' - ТАТАСССССАСССОеССАССАТСТТСАААСАССТбТСАС - 3'

Обратный праймер ΙΜΗ1 ВАСК ЗасИ (5Е0 Ю N0 14), 58°С: 5' - ТАСАССССССТТАСТТСАСАСАСАТААССАС - 3'

Прямой праймер ΚΙΝ2 КОКИ 3£1Ι (ЗЕО И N0 15), 64°С: 5' - ТСААББСССАБСС6ЕССАСБАТБССТААТССБААТАЕА6САБ - 3'

Обратный праймер ΚΙΝ2 ВАСК ЗасИ (ЗЕ<2 Ю N0 16), 66°С: 5' - ТСТБССССБ6СТАТАЕ6ТТТААТТСТТТТААААТАТАС - 3'

- 17 017803

Прямой праймер КАК2 РОКИ ΡκιΙΙ (3Εζ) 10 N0 17), 56 °С: 5' - ТААССАССТЕАССАТЕТТТТТСААСАЕАСТААСС - 3'

Обратный праймер КАК2 ВАСК 5ас11 (ЗЕО Ιϋ ΝΟ 18), 5 6’С: 5' - ТАТССССССЕСТАСААТТС6ТССТСТТСС - 3'

Прямой праймер РОН РОКИ ΞοοΚΙ (ЗЕО ТО N0 19), 58°С: 5' - СССССААТТСАССАТСААЕТТТТСТССТСЕТеС - 3'

Обратный праймер ΡϋΗ ВАСК ХНо! (5Е0 10 N0 20), 58*С: 5' - ССТССТССАСТТАСААТТСАТСЕТСААТССС - 3'

Прямой праймер ЗЕС31 ГОКИ 5Г11 (ЗЕС 10 N0 21 ), 56°С: 5' - ТАТАСССССАОССССССАСЕАТЕСТСАААСТТССТЕДСТТ - 3'

Обратный праймер ЗЕС31 ВАСК 8ас11 (ЗЕО 10 N0 22), 58°С: 5' - ТАТСССССССТТААТТСАААЕТСССТТСАСС - 3'

Прямой праймер ЗЗА4 РОКИ Рт11 (3Εζ) Ιϋ N0 23), 60°С: 5' - ТАТЕСАССТСАССАТСТСААААССтеТТССТАТТЕ - 3'

Обратный праймер ЗЗА4 ВАСК 8ас11 (ЗЕ(2 Ιϋ N0 24), 58°С: 5' - таТССССССССТААТСААССТСТТСААССС - 3'

Прямой праймер 3302 ГОКИ ΡπιΙΙ (ЗЕО 10 N0 25), 62°С: 5' - ТАСАСАСЕТЕАССАТСАССААСССТААТССТТАТС - 3'

Обратный праймер 3302 ВАСК Зас11 (ЗЕО Ю N0 26), 60°С: 5' - ТАТСССССССТТАСТТТСТТСТТТССАСААСС - 3'

Прямой праймер 35Е1 РОЯМ Рт11 (ЗЕ£ 10 N0 27)г 6О°С: 5' - ТАСАСАССТСАССАТОАСТАСТССАТТТЗЗТТТАС - 3'

Обратный праймер ЗЗЕ1 ВАСК ЗасН (5Εζ> Ю N0 28), 60°С: 5' - ТАТССССССЕТТАЕТССАТСТСААСАТСАСС - 3'

Прямой праймер НАС1 РОКИ 5£1Ι (ЗЕО 10 N0 29), 58’С: 5' - ССААСЕСССАСССбесСАССАТССАААТСАСТСАТТТТСААС - 3'

Обратный праймер НАС ВАСК1 (8Е0 Ιϋ N0 30), содержащий 3'конец неактивного Иас1ри (5'-сайт сплайсинга)г 58°С: 5' _ ТССТСАТССТААТСАСССС - Зт

Обратный праймер НАС ВАСК2 Зас11 (5ЕС> Ιϋ N0 31) , содержащий последовательность, кодирующую последние 18 аминокислот активного Ъас1р, 58°С: 5' - ССТСССССеОТСАТСААСТОАТСААСАААТСАТТСААТТСАААТеАА ТТСАААССТЕАСТбСЕСТТСТСбАТТАССССААТТСТСААС - 3'

Пример 2. Исследование действия хелперных факторов секреции на продуцирование гетерологичного белка рекомбинантного ЕаЬ 2Е5 в Р.райопк.

Плазмидную ДНК из Е.сой из примера 1 использовали для трансформации штамма Р.ракЮпк 8ΜΌ1168, уже содержащего экспрессионные кассеты для ЕаЬ 2Е5 под контролем промотора САР, причем этот штамм был предварительно отобран на высокий уровень секреции ЕаЬ. Этот штамм 8ΜΌ1168 является Ык4-дефектным штаммом Р.ра81опк (рер4-мутантом). Отбор выполняли на основе устойчивости к зеоцину для генов антител и гистидиновой ауксотрофии для других генов.

а) Конструирование штамма Р.ракЮпк 8ΜΌ1168, секретирующего ЕаЬ-фрагмент моноклонального анти-ВИЧ1-антитела 2Е5.

Последовательности фрагмента антитела 2Е5 для легкой и тяжелой цепей ЕаЬ амплифицировали при помощи ПЦР из рКС/К8У, содержащей гуманизированное [дС1-тАЬ, как описано в Саккег е1 а1., 2006. Для клонирования использовали сайты рестрикции ЕсоК! и 8асП.

Более подробно, для генерирования ЕаЬ полные гены легкой цепи (уЬ и сЬ) и район νΗ и сН1 генов тяжелой цепи амплифицировали при помощи ПЦР. Фрагмент легкой цепи лигировали в модифицированную версию рСАР2аА, где сайт рестрикции ΑντΙΙ изменяли на сайт NάеI сайт-направленным мутагенезом для создания возможности последующей линеаризации плазмид, содержащих две кассеты. Фрагмент тяжелой цепи инсертировали в первоначальную версию рСАР2аА, которая содержит конститутивный промотор глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (САР) с последующей лидерной последовательностью ΜΕα 8.сегеу181ае (ΙηνίΐΐΌ^η, Саг1кЬаб, СА, И8А).

Плазмиды, соединяющие экспрессионные кассеты для обеих цепей ЕаЬ на одном векторе, получали двойным расщеплением вектора легкой цепи с использованием ВдШ и ВатН и последующим инсерти

- 18 017803 рованием в уникальный сайт ВатНб вектора р6ЛР2аЛ, уже содержащего единственную копию экспрессионной кассеты фрагмента тяжелой цепи. Затем плазмиды линеаризовали с использованием ΑντΙΙ перед электротрансформацией в Р.разФпз.

Все сконструированные экспрессионные кассеты проверяли секвенированием ДНК с прямым САР/обратным АОХ3-праймерами Впубгодеп).

b) Конструирование штаммов Р.раз1опз, коэкспрессирующих РаЬ 2Р5 и хелперный фактор секреции.

Трансформацию штаммов Р.разФпз, полученных в стадии а), проводили с плазмидами примера 1, которые были линеаризованы в локусе Н1з4. Эти плазмиды вводили в клетки электротрансформацией. Трансформированные клетки культивировали на КИВ-агаре (не содержащем гистидина) для отбора Н1зпрототрофных клонов, которые содержат экспрессионные кассеты для хелперных факторов секреции.

c) Культивирование трансформированных штаммов Р.разФпз в культурах во встряхиваемых колбах.

мл УР-среды (10 г/л дрожжевой экстракт, 20 г/л пептон), содержащей 20 г/л глицерина, инокулировали единственной колонией Р.разФпз, отобранной на ΒΌΒ-чашках, и выращивали в течение ночи при 28°С. Аликвоты этих культур, соответствующие конечной 0Ό₆₀₀ 0,1, переносили в 10 мл основной культуральной среды (на 1 л: 10 г дрожжевого экстракта, 10 г пептона, 100 мМ калий-фосфатный буфер рН 6,0, 13,4 г азотистого основания дрожжей с сульфатом аммония, 0,4 мг биотина) и инкубировали в течение 48 ч при 28°С при сильном встряхивании в колбах Эрленмейера на 100 мл. Для индукции экспрессии рекомбинантного белка культуры с промотором САР дополняли 10 г/л глюкозы. То же самое количество субстрата добавляли повторяемым образом 4 раза каждые 12 ч перед сбором клеток центрифугированием при 2500/д в течение 5 мин при комнатной температуре и готовили для анализа (определения биомассы измерением оптической плотности при 600 нм, ЕЫЗА для количественного определения РаЬ в культуральном супернатанте).

б) Оценивание действия ко-сверхэкспрессии отдельных хелперных факторов секреции по количественному определению РаЬ 2Р5.

Для определения количества секретированного рекомбинантно экспрессируемого РаЬ 2Р5, 96-луночные микротитрационные планшеты (Мах1ЗогЬ, Мшс, Эептагк) покрывали анти-Ыдб-антителом (РаЬ-специфическим) в течение ночи при комнатной температуре (З1дта Ι-5260; 1:1000 в ЗФР, рН 7,4), перед нанесением серийно разведенных супернатантов культур Р.разФпз, секретирующих РаЬ 2Р5, из стадии с) (начиная с разведения 1:200 в ЗФР/Твин 20 (0,1%) + 1% БСА), и инкубированием в течение 2 ч при комнатной температуре. В качестве стандартного белка использовали РаЬ нормального ΙβΟ человека (ВосИапб) при начальной концентрации 200 нг/мл. После каждой стадии инкубации эти планшеты промывали четыре раза ЗФР, содержащим 0,1% Твин 20, доведенным до рН 7,4. 100 мкл конъюгата антилегкая цепь каппа - АР в качестве вторичного антитела (1:1000 в ЗФР/Твин + 1% БСА) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания планшеты окрашивали рИРР (1 мг/мл п-нитрофенилфосфат в буфере для покрытия, 0,1н. №₂С0₃^аНС0₃; рН 9,6) и считывали при 405 нм (ссылочная длина волны 620 нм).

Из каждой из 15 различных конструкций хелперных факторов секреции 16 индивидуальных клонов культивировали в культурах встряхиваемых колб, как описано в стадии с), и сравнивали с 16 индивидуальными клонами контрольного штамма, который был трансформирован вектором рбАРШз, лишенным гена. Продуктивность РаЬ 2Р5 (мкг РаЬ/биомасса) определяли для всех анализируемых культур (первый раунд скрининга). 6 наилучших клонов каждой из этих конструкций повторно анализировали с использованием той же самой системы во втором раунде скрининга (в отношении результатов см. табл. 2).

Табл. 2 показывает среднюю относительную продуктивность 6 наилучших клонов каждой тестированной конструкции хелперного фактора, в том числе контрольной конструкции (пустой вектор рСАРН1з). Эта таблица показывает средний улучшающий фактор секреции РаЬ 2Р5 двух раундов скрининга, полученный ко-сверхэкспрессией хелперных факторов секреции, относительно контрольных культур. Хелперные факторы секреции, которые, как известно в данной области, улучшают секрецию гетерологичных белков при их ко-сверхэкспрессии (РЭМ, КАК.2, НАС1, ЕВ01 и ЗЗ02), включены в табл. 2 для сравнения.

- 19 017803

Таблица 2

Средняя относительная продуктивность тестированных хелперных факторов

Хелперный фактор секреции	Среднее улучшение
ΡΌΙ	1/ 7
си₽5	1/ 7
ЗЗА4	1,6
БМН2	1/5
ΚΙΝ2	1,5
КАК2	1,5
НАС1	1,5
ЕКО1	1,4
ΞΞΕ1	1,4
ВЕР.2	1,4
СОСб	1,2
3302	1,2
соу1	1,2
ΙΜΗ1	1,1
контроль	1, о

Как видно из табл. 2, секреция гетерологичного белка, т.е. секреция ЕаЬ 2Е5 увеличивалась для большинства анализированных хелперных факторов секреции в 1,2-1,7 раз. Кроме хелперных факторов секреции, уже известных в данной области, имеющих положительное действие на секрецию гетерологичного белка, ко-сверхэкспрессия хелперных факторов секреции СИР5, 88А4, ВМН2, ΚΙΝ2, 88Ε1 и ВЕК2 показала высокозначимое увеличение количества секретируемого гетерологичного белка, а косверхэкспрессия СОО6, СОУ1 и ГМН1 показала значимое увеличение количества секретируемого гетерологичного белка.

Информация последовательности для хелперных факторов РОИ, ΚΑК2, НАС1, ΕΚΌ1 и 88О2 описана в известном уровне техники.

Нуклеотидные последовательности хелперных факторов секреции, которые еще не известны в данной области, улучшающих секрецию гетерологичных белков при ко-сверхэкспрессии, показаны в табл. 3.

- 20 017803

Таблица 3

Нуклеотидные последовательности выделенных хелперных факторов секреции (8Еф ΙΌ N0: 32-8ЕЦ ГО N0: 41)

3. сегет±з1ае ВМН2 (ЗЕО Ю ΝΟ 32) ’

АТбТСССАААСТСБТБААСАТТСТСТТТАССТАССТАААТТАССТСААСААС

СССААСБТТАТБААБАААТбСТСбААААСАТСААБССССТТССТТСАТСАСС

ТСААБА6ТТАТСТБТСБАА6ААС6БААТСТАТТ6ТСББТТБСТТАСААБААС

БТСАТСББТБСТСБССБТБСТТСАТббАБААТАБТТТСТТСБАТСБААСААА

ААбААБААТСАААББАбАААТСТСААСАТСААбТТБААТТААТССБТТСТТА

ССБТТСТААААТТБАААСТСААТТСАССААААТСТСТБАССАСАТТТТАТСТе

ТБТТАБАТТСТСАТТТААТСССТТСТБСТАСТАСТББТБАБТСТАААеТАТТТТ

АСТАТААСАТ6ААССОТ6АСТАССАСС6ТТАТТТАОСТ6ААТТТТССАСССО

АСАТБСААБАБААААББСААССААСТССТСТТТББАББСТТАТААААССССТ

ТСССАААТСбССАСААСТСААТТБССТССААСТСАСССААТТСЕТТТАСбТСТ АССТТТеААТТТСТСССТСТТСТАТТАССАААТТСААААСТСТССТСАТААСС СТТБССАСТТББССАААСААСССТТТСАТСАТССТАТТССТБАБТТАСАТАСТ ТТАТСТБААБААТСАТАСААББАТАССАСТТТСАТСАТБСААТТАТТААССБ АСААСТТБАССТТАТББАССТСТСАТАТТТСТСААТСТСБТСААБААБАТСАА

СААСААСААСААСААСАБСААСАССААСАССААСААСАССААСААСААБСТ

ССАОСТОААСАААСТСААССТСААССААССАААТАА

3. сесеуГахае ΒΕΉ2 (8Е0 Ш N0 33)

АТССАААААТСАСТАССССАТСАААТТТСССАТАТССССАТТАААСССбТС

ААТАААБАСТТССАТАТТБААБАТСАЕСААААТБСАТСТТТАТТТСААСАС

ААТЕАААААААТЕЕАЕАААЕТБАТТТААЕССАСТАТССАААТАССААСАС

АБААСАААССААСААСЕСЕСАСТАТТТЕЕАССТБЕААААСТСТААОТТАА

ЕАБСАЕАААААЕСТТТАЕААСТАААССАТССААААТАТАСАбЕТБТТАААС

ЕТТСААСАСААЕСАТТАТАТБААСААСТТТССБАСААТСАСБАСБААБААЕ

ААСААСААЕААСАССААОААбАААААБАББААЕАТЕСТСТТТСАТТСАБЕ

АСАЕАТТСТЕААЕАТСААЕААЕТАБАБАТТ6АТЕАА6АА6ААТСАБАСБС

ББАСЕССББТеАААСбБАСбАбЕСТСААСАБААААЕЕСАТЕСАСТАТСЕА

ААСТААТТСААСААБАБАСТАААСААБСТАТТААСАААСТЕТСТСААТСАЕ

ТТСАААЕАЕАТЕСТТССААЕЕЕТТАТТССАТТТТАСААСАСАСААААТТАТТ

- 21 017803

ТЕАСААСАТСАТТЕАТТТСАЕААТААААСТАСАААААЕСТЕТААТТССАЕС АААТААССТСССАТТААСТАСАСАОТССТСЕСААЕАЕЕСТААААТСЕАТЕА ТТЕАЕАЕСАААСАААСССТТТЕСТСААСЕААААСЕАААААСТСТТСААТАА ТТТАТТСААТСЕЕТТЕАТАААТТТСАОААТААААТТССААСТТЕЕСЕАТСАТ АТСАСТСААААТЕААеАСбТЕбСЕААЕСАТАААТТбТССАААААААСАТСТ СТСАААСАЕСТТТАССААЕАААСТААТАЕСТТА6АСТСАСААСТААААЕА6 ТАСАЕСАСТЕССЕТАТТАААСААСТСОТСТАССАААСТТТСТТСТССАТСАЕ ЕТААСССТЕСТТТАТСАТСТААСАААТТСАААЕСТАТСААСТТАССТЕСАСА ТЕТАСААСТСЕААААССААТТАТСССАТАТЕТССССТТТСАТЕААААСААС АААЕТТЕААСАЕЕАСАААСАТААССССТТТЕТАТТТССАААААСАСТЕТЕС ТААТСССАСЕСТАССАСААТТЕАТТТСТССССТТСТСАААСАТАЕТегтеАТ ЕАСААТЕАЕААТТССЕАТЕАТЕЕЕСТТЕАТАТСССЕАААААСТАТЕАСССА АСААСАААбСАТААСААТеССАТТСАСАТТАСССААААСССАТАТбТТТТТ ЕАТЕАССААЕАТТТТТАССЕТСТТТТАСТАААССАТТТААТТСАСАААААСА ТТТССААСЕСТСАСААТТСТЕАААСТССАЕСААТТАСААТСАССТСААСТА АТЕСТС6ТТСЕААСААСАА6СТАААСААЕААТАТССАТАСТААСССТТССА АСССТАЕЕАААТТЕААСТАСТСАЕТТСААСАТССААТТЕСЕААТТАТЕААЕ СССССАТСАСАТССССАТАСАААТЕСТСАСАССАССАААТССАтеААТТСТ ТТССеЕСАТТбТТАЕбТСААСЕАЕТЕААСТТТААТСААААТеАССАТСАСС саасатсссаеаатасаааатсассаасааттасассстсттааааас САТЕАТАТССАААТСТТТЕЕТТСА

3. οβΓβνΪΒΪβθ СОбб (5Е0 10 N0 34)

АТЕЕАТТТССТТЕТАЕАСТАТСА6АССТАС6СААТСССССАТАСТЕССАСЕ ССАЕААТТАССАЕААССТСАСССААЕАСТАААСТТААССТСАЕАТЕСАСАЕ ТСАСАССССАСССЕТАААСТАСАТСТАСАСТТТААЕТТеСССЕАССТТСАА СЕТТАТТССААТААТААТССААСТТТЕССАеТАЕАТААТСАТСеТЕСТбЕТТ ССАААЕАССТАСАТААЕААААТЕАСАСАТТАСЕСААТСТСТТССАТТСАТА АААТАСАЕСТТТСАААТССААЕСАААСААТТАСЕССААААТТСССАОСАТС АААААСТАТСССАЕСААЕААТСТСААААТТТСАСЕААТТАССАЕССААААА АССТТЕАТТТАТСААААТТАСТАТСССССТСААСТЕЕТТССААСАААААТАС САСАААТТТЕЕТТСТТТСЕААТАААСТАТССААЕАТАТТСААСААТТАСАСА ТТСАТТААСТАТСАССССАСАСТССААСТААЕААААТСССТАААЕЕТТСТА СААЕАбААТАААСАСАЕАТТСТСССТТЕАТСААСААААЕСТСАТЕААТССТ СААТАТЕТАЕСТАСТТТСЕСААЕААЕАЕСАТТСАСЕАСТЕАТТТЕЕААТСТ СААСТЕСТАААбСААСАТАТТАССЕТАСТТЕАССААТТСАААССТАТСАТТ

- 22 017803

АСААСБАТТАААССАТТАТСТТСТТСССТССААААААТАСАААеААСБАБС БАААААТТАСТААБТААТСАСАСАААТБАСеттССААСАААТААССТСБТА СТТСАСБАААТА6АТСААТАСССТТТАААСЕСАБАССАСТТБААЕСТ6ААА АААААААТАСТБТТАТСТАТААБЕЕАТАЕБТТТАСТТТСААТСАБЕТАСАС БАСбАТБТААТСАССААТСЕТАСТАТАБАСААСАТСТТТТТСБАССТАЕТАА АСАААБТААТСААТАТТАААбАТбААТСААСТТТСТТОСТБАСССТТССТАА ТТТСААТССТССАААТССТТТЙАТААТСССАСТТААТбАААТТТТАСААААе АСАААСАААААААТСТТСААТТАТТТЕАТСБАТТТТТТАТАТАБТТТТЕААТ ССТСТТСАААТТТАТТАААТБАССАТБЕТАСТАСТЕААСААЕАААБСТТААА САТТТТТСБ6ААСАСТСТСЕТСТТССТБТСААБТСАТСТАСААТТАТТТААТ САБТТБТТСААААСАСТбАССАСАСТСАБАТССААЕАБТАТТСТБСАТЕАС ТТТТТЕТСТСААТТССАТАТЕААТТСААСТАССТСТАААСССАТСАТАТТАТС 6БСАСАССАТССААТТАББТАТАТТББТБАСБТАСТА6СБТССБТТСАТТСС АТСАТСБСАААТСААБСТСАТТТСБТСААСТСАСТАТТТБАСТТТСАБСАТБ ААСАСТТААААЕАТАССССААТТТСТАТАСТТСААСААААСААБАСАТТСТ ТСАААБССАТСОАСААСАААТТБСТСААССАТАТСАТССАБТСБСТАТССА АТТСЕТЕТСЕТАТТС0ТАТСЕАЕСАААТСЕТСАЕЕТТТ6ААСААААТСС6АТ САТСААТТТСБАБАТТСТСАЕБСТССТСАААСТТТАСАСАСТТАТЕТТССАС АСАААС0БААТТСАСБАСЕАТАБТТСТАТТАТТААСААТТТААА6ТСЕТТЕ СААБАСАТТТССАААААСАЕААТТАТТОбАТАСТАТБААЕАСТАТАТЕААС САААСАСТСАТБССССАААСААААААТТСТТСАСАТСАТТТАСТСССАССА САСТЕССТАТСАСАСТАТАТСААТАААТТЕБТАЕАЕТТАТТТЕАААТТТАТ6 ААААЕАСАСАТБСТеСССААСАТСАЕЕААТСАБААСАТААТАААТТССТСТ САТСТААОААТТТАСАААСААТТСТАБААСААССААТААААЗАТСТТСТЕТ Т А А А АС ААТ ТС САААС АТ СТТТТССТТТББ С БАΑΑΑΑΑΆΑ Т САААААСААА АСССАТСАТТБСТААСТАТАСАСАТАААСТБТТТССАТТТААТТАААТСТАЕ АСТТСААССТТТТЕАСБСАТТЕТТТБСАСААБАТЕАТСАСАСССССААААТ САССАТСТБЕСТТТБТСАТАААСТ6ААББААТАТАСТААБСАААТЕСТААС ТТТАСАААТААААТТССТАТТТСАСААТАСАССТТТАСАССТТТАСАССААТ ТТББТСААТАТБАТТТТТССТЕТСбАСТСАБТАААЕЕАТСААТТЕСАТТАТб АТАТеТАСТТАБСССТСАББСАТААТТСАТТСАТССААТТАБАСАТССТСАБ ААААААТЕТЕСАТЕАТААСТТЕААСТАТТАТСТАССТСАБСССТТААСАБА ТбТТСААЕЕТААТТТАСТАТТТАААТТААСБТСАССААТСАТАССТСАТБАА АТАТСССАТСААТСТТТСААБААСТТСТСЕСТАТТТТАТААТАТСТТСАССА ААСТЕТТСАТТСАТТТСТАТССбААСААСААбСАТСАББТАТТССАААТТТТ

- 23 017803

АААТТТТТССАСТСАТСААТТТСАСАТ6ТТЕАТА55ТАТТЕАТСАСТЕА

3. ΟΘΓβνίβίββ ΟΟΥΙ (3Ε0 Ιϋ ΝΟ 35}

АТССАТАСЕТСАСТАТАТТСТСАТССАТТССАТАТТТСССССААЕССАСАТТ

ТААССААТСТТСАЛАСАСААТТССАТССТСАТЕТТАТАЕАЕАТТААЕЕАТА

ААЕАААСССТЕТССТТЕААТТСААЕАААСТСАТТАЕССАСТСАСАСТАААА ААТТТААААААСТСеААССТЕАЕЕАААААТТЕААСААТЕТСААТААААТАА ТТААЕСАЕТАССААСеТСАААТТСАТААТТТСАСАСАСАСАТСААААТТСТ СТСААААБСТТСТТТТТЕАСЕТАТАСЕААААЕСТТТСАЕАЕЕСТССТЕАТСС

АСАБССЕСТАСТАСААЛ.ЕТТСБТТЕСАААААТТБСБСААААТТ6АТБАСТС

БААБСААСТТААССААААААТААЕСТАССТАЕААБАТААЕСТАЕССАААТ

АТССАСАТТАТСАЕАСТТТСАААТСААССТТАСТСБАССТАБАЕСААА6СТ СТССАААААСАТТеССАААААеАСТСАСТСССААААСТСААБАААТСААТТ СТАССТЕБСАЕбАААААЕСААБАААТТеСАААСАБАСАЕААеСАСАТСТА ТТСАААСААТТААСАААТ6ТАСАССАССААААСААБССАСТАСАСБССАА

ААТАТСТАААААТАТАЕАТАТАБААЕБТААТЕБАААСЕААБАТБЕТБАССА

АСААААСААТСАААААСААСТАТСТАСААССАТТССТСААТАТААТСТАБТ

ААСАСАеБАБТТБбАААСТАСБСАбЕСТАбААТАТАТСАБТТАБАБААААС АААТСАССААСТААСТССТБСТСТТССАААСЕСААСТАЕТСААССАЕАААА

АСАААСТСАСТТАСАТЕСАААОеААСТААААСТТААССАЕСТББАААБСБ

ААААТЕСАТТОТТСАБТССАТССТАТБАССАЕЕААССЕАААТСААСАТСАС

АТБСААТАААТСАСТТААААСААСААТТАААТАесеТТеТББСеСААТССб

ААТСТТАСААЕТССБАБСТАЕАААСТЕТТАОААЕААААСТАААСААТТАТТ

СТЕАТТАСААТААБАТААААСААСААСТТТСТССАТТСАААААААТТСАСТ

ТТеОССТАААССААСАТСАТТСТЕАТААТЕАСАТТСССТСТбААСАСААСА АТСАТААТАСТТТСЕАААСТТССТТАСТАТСтеСАААТААЕААССТССАССС

ТАСТТТСССЕСААТАССССТСАААААЕТАССССТСААСАЕЕААеААСЕАА

АССААТТСААААААТСТСТ66АССААТТБААЕСАЕСАААТАЕСТАСТСТСА

ААЕААССАААТЕАААААТТАСАСАСССАССТАСАААААЕТАСАСААСЕТС

АЕТССТСАСТТСААССАСАСТБСААСТАТБАТЕТСТСЕТЕТААСААЕАСАА

АТ0ААСААТС6ТАСБТСССАТААААТЕТССССААСЕАЕТТСТАТТАТТЕЕТА

ТТССАБААЕАТЕЕЕЕААСТТТСТЕСАААССААТСААССАТТТТАССААТАЕ

ТТАСТАААСАААОАЕАСАеАТТТСеТТСЕАбАААТАТЕЕАТСТСЕААААЕС

ААСТААЕАСААЕЕАААСТСАСААААСЕЕТААЕСТТАААСТАБАААТТТСЕА АССТААААССССАСААТАСЕААССТТТАТСААСЕЕАТТАЕЕТАТСТЕСААТ ССТАТААТААТААСААСССТСССОТТААТСАААЕТАСАСАСССТАТТСАСС

- 24 017803

ТСЕААТСССААТАСТСААЕЕЕТСТАТСАТЕААТСЕТТЕСАТССААТЕЕСАА

АТТТТАСАСАСААСЕААТТАААССАСТАСАААААСААСАААТТАТСАССТТ

ТАСАЕААеТТАТТТТССАЕТТТТССААААСТСАТТТТАСААААТААААТЕАС

ААСЕАТЕ6ТАТТССТСТТТТАСТСТАТСЕСТТТАСАСССАСТССТАТТСАТС АТСАССАТСТАТЕТСАТТААТАТТАСССЕСТАСАТЕАСАССТЕАЕЕТТССТА ТАСТАСААТСЕЕСАААСТСТТСТТСАААТСТСААССЕАЕЕАСТТЕЕЕЕеАЕ САЕАААААЕТАЕСТЕСАЕЕСЕТТЕЕТТСАСТТСАТСЕСАТАААТСЕАТА

3. сегеу151ае СЦР5 (3Ες Ιϋ N0 36) ’

АТЕАСТЕААТТЕТЕТССТеТСТАСОССССТТТСТТТеСТСССАТТСЕТТСТЕС СТСТЕСААТТАТСТТСАССТСАТТАЕЕТЕСТССТТАСССТАСТССТААбТСТ ЕЕТЕТТССТАТСТЕТЕССАСТТСТСТЕТТСАЕАССАСАССТАТТАТТСААСА АСАТТЕТТССТЕТТАТТАТеССТеЕТАТСАТТСССАТТТАСеСТТТАЕТТСТТ ТССЕТТТТССТТТСТТАТТССТТЕЕЕТСААААССААеСТТТСТАСАССЕЕТТТ САТССААТТСЕОТСССЕСТСТАТСАСТСССТТТЕАСТЕЕТСТАЕСТЕСТССТ ТТСЕСТАТТЕЕТАТТЕТСЕЕТСАТЗСАЕЕТСТТАСАССТТССТСТСААСААС СААЕАТТАТТСЕТСЕСТАТбАТТТТСАТТТТЕАТТТТТЕСТСААСТТТТСССТ СТАТАСССТТТСАТТСТТССТТТОТТЕТТСААСТССАЕЕЕСТАСТСААЕАТС ТТЕТСТЕТТАА

3. сегеухзхае ΙΜΗ 1 (ЗЕО 10 N0 37)

АТСТТСАААСАЕСТСТСАСАААТТСЕТААСААТСТТАССЕАТСААТТАССС

АА6ЕЕСТТАССССАТЕАТАТЕАССССТАССССЕТСА0ААСААСАААТСЕАА

ЕАТСАТААЕАСТСССТТЕССААААЕАААТАСААЕСТАААТТААЕААААТТТ САСАААТАТСААСАААААТАСССТТТЕСТАСТСТССЕСАТАСАААААТЕАА АААТТАААЕТСАЕАЕААСТТАЕАЕЕСТСТТСААААСАТТТТАССССААААТ АСАСССАТАТСТААТАТТСАССАСССАСТЕСАТАССТТЕССАЕЕТТТТТТСС АССАТТТАААСААСАААААТААССТАТТЕААТЕАТЕАеАТСААСАСАТТАА

СТААЕСАСААСТСЕЕАААТТССАЕАААЕСЕССТСТАЕТЕАААСТСТСААЕЕ АТАААЕААСАССААТТТТТЕААААААСАССААААТТАТАААААТСАСАТАЕ АСЕАТСТАААААААААААТССААССТТТАААСАТАСААТТСЕАТАСТбТАС АААААСАААААААТЕАТАСТЕТТТСАСЕТТТЕАСАБААААААТАЕТТЕСАС ТЕЕААААТАТАСТАААСЕААЕАААСССАСЕССААААААСАСАААЕААЕАА

ЕТАТСТАТАТСССААСТЕААССААСААТТЕССТАТАААСААССАТТСТСТС ЕАЕЕАСАЕТСЕААТЕААЕАТААСССААТТЕЗАеСААААТТТЕТСТТСбААА АЕТАСТАТААТ6ЕА66АААА6ТССТСАЕАСТТСССАСААСТАААТАТТАСТ ТТААААЕАЕАААСАССЕСААССТСАЕТЕААТТССАААААААААТЕААОЕА

- 25 017803

СТТАСССААЙЕССАТАТСТСАТСААААТСТАСЕАААСААТААСАСААСЕАА

АААЕААТАЕАААСААСББАААСАААААТААСССАСССАТААСТАССССТС

АТАТСАСТСААСАССАААСССТССАТААСТСААТСААТАСТСАА6ААТАТС

АТААЕСТТАААСААААТТТССААЕААТТАСААСАААААТАТАААСАТТСТС

ААСАТТеЕААССААААСТАТСААСАТАТАСААеСАСААСТААААСАТССТ

АААСААТТССААААСТСАСАССТСЕАААААТСАССАААСЕАССТССАААС

ССТТААСАСССАСТТБАТСЕАТАССААСААСТСАТТСАААбАААААААТТС

ССАССТАЙАССАСбТСАСАСАТАТеСТСАССАСТСТАСбСААТЕАеСТТСТ

ЕСАСССААААСАТСАСАТТАААБАСТСТТССАСТАААСААААТСААСААС

ТСААААСССТТААеСТСеАССТССАТСАТТТАССССАТАААААТеСААССА

ТСАТССАССССГАССААССТАААААТАСТСАСТТСАСААСТААСАТАСАСТ

ТАТТСАССААБАААСТАеАБСАТСТСААСААТТТАТСТАСАСААААбБАБА

ААСАССАСАСТАСАТСБСАСААСААСБТАБССАААТТАААТСАССАСАТА

ТСТСААСТТАССТАССАААААТСАААСАТААСАААББАБСТТАСТТСТТТА

АБААССТСТТАТАААСААААССАБААААСТБТОАСТТАСТТСБАСБААСАА

СТТАААСААТТТАБТБАССААААбСАСБТБССТБАААААТССАСАБААСАБ

СТБАБААААбАТСАТБСТААААТТТСТААСАБАТТАСАСТТАТТААААААБ

БААААТБАСАСАСТБСАТААТСАТАТСБСАААБААТТСТААТТССТАССАБ

САЕТАТТТСАААОААААТББТАААТТАТСББАААБАТТСААТАТТТТБСАА

ОАААААТАСААТАССТТБСААААТБТАААААЕТААТТССААТСААСАСАТА

БАТТСТАТСААААЕАСААТСТСАЕЕААСТАААТСТСААБТТСААБЕААТСТ

АСААААААААТТТТАТСТТТАЕААБАТБААСТАААТЕААТАТССТААТАТТС

ТТСААСАСААААССА6АБААБСТААСАСАТТЕАСААЕС1ТАЕТТТСЕСАСА

СТСАЕАСАСАТБАТТССАССАААСАААААЕАСТТБ6А6ААТАААТТБСССТ

АТТТААСССАТЕААААЕААТАААТТеБААЕСАБААТТАСАСТТАСАААСАТ

ССАБАДАБЕССАСТСААТТАСААСАЕТСЕАЛССАТАСАОТААСТСАССТС

АААТССЕАААТАСАСССТТТАААЕСТТССТбААБАбББАСТААААТСАБАБ

ЕТТСАСЕСАТТСАААСАТЕТТААСААТСАСАТСААААеЕААЕАСТСААЕСС

АСТТСАБАТБАТТССбАТСАБТТЕБААСАЕАТСАСАТСТААТТТААААСТСТ

САТТОТСТААОЕСТСАТСААААСААТТТТСАЕСТАСАБТСТСССААТЕАСА

ААСТТСТОААТТТАААТААСЕААСТТААСААЕАААТТТСАТССАТТАСТААА

АААТТАТСЕТТСАТтеТССТСТСААТТСААТОСТТТАААБСАААЕАСААТАС

АЕТОАСААСТСАСЕААСАЕТТАСТАББТСТСЕТТСТАТСББТАСТСТАОСТ

ААСБСБААТАТТСАТТССТСАССАЕСЕААТААСТСТААТССААСТАААТТА

БАСААОАТАСЕАТСАТСААЕТТСАТТСОАбТТАЕАСТСТОАБАААААТБАА

- 26 017803

ААААТТОСАТАТАТААААААТСТТТТСТТСССАТТТТТЕЕАЕСАСААСЕААС

ААС66ААССААТТАСТТССТСТААТТТСТАТСТТСТТАСААСТЕЕАСАЕТАС ТСАТЕААААААСАСТЕСТТАТ6ТСТСТСАА0ТАА

г. ΟθΓβνίδίββ ΚΙΝ2 (3Ες ΙΌ N0 38)

АТЕССТААТСССААТАСАЕСАЕАТТАСТТССТСААТССАААТТТСАССАСС АЕТААБеЕСеЕАТСТТТАТСЕССБАСЕССАСААССТТТСААССАСАСССЕА

СТТЕСТССАССАЕССАСТСТТСЕСАТЕАТЕЕЕСААБСААТСТСЕАССААСА

ААТЕАССАССААСААЕСАССАСТСАТЕССТССТЕСАЕАТАТСАААСАСБЕС ААСЗААСАСССАССТСАСАСАСААААТОАТЕСАТССАССССТААТСОССС ССТЕЕААТТААЕЕСААТТТСАТАСААСАТСТТТСЗСАСАТТСССАСТТССТТ САААСЕСТТЕЕСССАЕССТСТАТЕССТАААеТТАААТТЗОТСААЕСАТССТ

САААСАААСбАААТТТЕТЕТААТАААСАТТСТТААТАббССТТССААСССТ

ТАТСТССАТАААСАССАСТСТТТАССТТССССАААСААТСАЕАСТСАСАТАТ ТАСАААСАСААААССЕЕТТАСАААААСАААТТСССАЗЕСАТААААЕЗАСТ СТТАЗБСААСССТСТТТСССССАААТССТТТАССАТССТСАТАТСТСТСЕТТ ТАТТТБАААтеТеСАСТАТЗТСАААССАТТТТТАТАТССТТТТТЕААТАСбТТ ТССЗЗТеЕАСАЕСТСТТАСАТТАТАТТАТТСАЕСАТЗЕСТСАТТАААССААС АССАТЗССАЗЗАААТТТЗССАЕАСЕТАТАЕСТАСТССССТССААТАСТТАС АТСССААТААТАТТСТТСАТССАСАТСТСААААТТСАСААТАТААТСАТАТС ТАСТТСАССТСАААТТАА0АТСАТТЗАТТТТС0ТСТТТССААСАТТТТТЗАТТ

АТАЕЕАААСААТТАСАТАСЕТТТТЕТЕЕТТССТТЕТАСТТТЕСАОСАССАЕА

АСТАТТААААЕСЕСАОССАТАСАСАОСАССТСАССТАЗАТАТТТССТССТТ

ТССТАТТбТТСТТТАТСТСТТЗЗТСТСССЕТАААСТАССАТТТСАТСАТСАС

ААСТСААЕСАТТТТАСАТСААААААТАААААААЕСТАААСТАЕАСТАТССТ

ТСАСАСТТАТССАТТСААЕТТАТАТСТТТАТТААССАЗСАТСАТТЕТТЕТСС

АСССАТТААСААСАССААСАТТАААеААТСТСЗТТБАЕСАТССАТОСАТСА

АСАЕАЗЕАТАСЕАТТТТААбЗСТССАТСАТАТЗТТССТААТССТЗТТССАТТ

ААССССТСАААТБАТАЕАТАСССААЕТТСТЕААСЕАААТСТАТССССТАСА

АТТТАТТЕАССАТАТТЕААСАТАСААСААСАТСАТТЕАТСССАТТАЗТААСТ

СААААССААТАСАТССААСТТТСССААСААТАСТбеЕАСАААТТАТССААС

СССААС0ССТТЕАЗТТСАА6ТТТАААТААТААСТАССТАААТТСААСЕЗСА

СААСАААССТТААТАСААААТСАТАТТАСААСТААТССАТСССАААСТССТ

ТАТААТЕААССАЕАТАСТААТТТТЕААСАТССТАСТТТАССАТАТСАТССАТ ТАСТАТСААТАТАТСАСТТССТТТСАеАААТССТТЕСАССЕАААТТАЕСЕАА СТТССАААСААЕбСААССАТТЗеСССТеСААЕСЕСААЕСТСАеСАААЕЕС

- 27 017803

ААСААСАЕСААСААЕТАССАСТТЕЕСАСТААЕЕТССССТТАААТААТААСТ СССССЕАТАТТАТЕАССААААТЕАЕСАЕСССТСАЕАААЕААЕТАОТАССТА АТССТЕСТАТТТТТСААСТЕССЕЕСААТТЕСААСАТССССААССТСАААСА АСАСТААТАССТСАААСАААССТССАСТСЕАТЕТААТССТТССТССТАААСТ ААСААТАСССЕААСААБСССАТАСТТСТССААСАТСТАОСААЕАСТТСССА САТТСАТАСССААТТАААТСЕТСТТТТБАААТСААСАССАСТССССБТСТСТ БЕССААТАТСАБСААСЕТТСТССТТСАСССОТАЕТАОСТСААСАТСАББАА ААБААТАСААТАЕБССБСАТАТТСАБААСААТАТСАСАААСТССАСААТСТ САССАТСССАСАССЕСААСАЕОААССТСТТССАБАААБАСААССТССААС АТАТАТОТСААААТСАААТСАААТТТССАТСАААСТАСССААААЕССАТАЕ ТСЕТАСТАТАТСАБАТТАТАТТССТАБСБСТАБААБАТАТССАТСТТАССТС ССАААТТСТСТТСАТСТААААСАОАААЕССЕСТАААААСАСТАССАТАБСА ССТССТАТААОБТСАСТАТСАСААААССААААСАСТСАТСТТССАССТТТА ССТСАБААСЕСССААСТААТТЕТТСАААААСААС6ССАААААСТАТТАСАБ ЕААААТСТССАСАААТТАСАААТТААТСАТААТБАТААСААСААТСТЕААС БСТбТАЗТСбАТББТАТСААТААТБАТААТАСТБАССАТТАТСТСТССБТТС ССААЕСБТСЕТААБТТАСАТССТАЙТССААеСССТАААТСССТСССССАТС СТССТСЕТСААТСТТТЕАААТТТАСТАЕССССССТАТАССАССАЕСССТТСС ЕССАТСАбАТАТСАСАААСЕАТААСЕССТТТТТЕЕСАЕАСЕСАААСААССА ЕАСАТАСААТССТСТТАеСАЕТААСТТТТССАСССТТССТЕААСАТТСТАСС АСАТАСАЕТААСЕАТАСТААСААТАЕАСТСАСТТСББТСТАТТСТСАББАБ СТТАСТЕАБААБСАААТТТТБ6АББАА6СТТСАААСБСАССССССБСЕТСТ АТБССАТСААТТСАТТАТССАААБТСААТСТТТТТЕААЕСЕТТТТТТСТСТСТ АСАААСААССТССТСТАААССАТТСССТАТТСТТССТСАСААТАТСАТАТСТ ЕТТТТААСААЕААТЕААТАТТЕАТТТСАААЕААСТеАААЕЕСЕЕЕТТСАТА ТЕТСТССААСАААСЕССАТСТАТТСАСАСТССАЕСТСТСССТЕТТАТААССА СТАСТБЕСБТБСБТТТСБАТТСССБАААСЕССАТЕСАТСТЕСААААТАЕТТ ТАСАСАСТСААТТАТСАТССАЕТТАССАТАСТАСАСССТССТСАССАТСАА БАААТАСТТССАТААААС6ССААБСТТСТТАТААБАС0БЕССАЕААТААТА ТАССАСТААСАССТТТАЕССАССААТАСАСАТСАААСАААТТСАТСТАТСС СААТСТСТССАААСТАСССАААССАААЕТААТСЕТАСАТСАЕСССААСТАТ СТТССАТБТСАТТАБАТТАТЕТТСААСААСАБСАТЕАТАТТТТААСААСАТС ААСАЕСССААААТАТАААТААССТАААТССТСАААСАСАССАААССААТА СТТСТеСТАТААААСАААСЕССТССТАТТАААТТТЕАСАТТСАСАТТЕТААА ОетТСеТАТСЕТСЕЕССТАеСАЕБТЕТАСАТТТСАААААСЕТТТСТССТААТ

- 28 017803

АССТСССТАТАТАААСААТТСССАТССТАТАТТТТААААСААТТАААССТАТ АС

8. αβΓενΪΒίβθ 8ЕС31 (ЗЕО Ιϋ НО 39)

АТССТСАААСТТССТСАСТТТТСТССААСАСССАССТТТСССТССТСАСАТС АТААААТТССАТТАТТССТСТСТССТАСССТАТСТССТАСССТССАТССТАА ТТТСТССАСТСАТТСАТСТСТАСААТТСТССТСАТТСТТСССТССТСАТТССС АСААСССТАТТССТТССТТССААСТССАТТССАААТТСААТСАТТТССАТТС СТСТСАТААТААСААСАТТАТТССТССТССТСТССАТААСССТАСТТТССАА ТТСТАСТССАССААТСААССАААСААСССТАТСААСТССАТССССАСАТТТ АССААССАТТСТТССТСТЙТСААСАСССТАААСТТТААСССАААССААСАС ААССТТСТТССТТССССТССТААСААСС6ТСАААТТТТТАТТТСССАСАТСА АТАДАТССАСТСААТСССССТССААТТАТАСТССАТТСАСАСССССТСААТ ССАТСТССТСССТТСАССЗАССТСАТТТСССТАССАТССААССААТСТТТССС ССАТСТТТТТССАТСТССССССТССТСТААТТТСССАТСТАТТТСССАТТТСА АСССТААСААССААСТСАТТСАТСТААСТТАСАСТТСАССТААТТСАССТАТ саассаасасстстсссттсттсаатсссасссаааааастссасаасаст СССААССССТАСТС6ТАСССАТААТ6АТССАТСТАТССТСАТСТСССАТТТА АСАААССССААСАСАССАТТССАСАСТТТАААТСААССССАТСААААСССТ АТТТТСТСАТТАСАТТССТСТСАТСАССАССААСАТСТАТТАТТСТССАСТС СТДСАСАТААТАСССТТСТТСТАТССААСССТСАСТСАССССААСААСТСТ СССААТТСССАССТССТССАААСТССТСТТТТААСАССАААТТТССАССАС АСССТССАСАССТАТТТеСТТСТСССТССТТТСАТААСААААТТСАССТАСА САСТТТССААААТСТСАСАААСАСТТТБСАТСАССААСАААСС6АААСТАА ССАССААСААТСТСАААСАСАТТТТТСЕААТААТСТТТССССАСА66ААТС ААААСАСААСССАТСТСТТТТССАТТТАСААСССССААСТТССТАТСС5СА АССАТСТСССССАССТСАТТССССТТТСбСТСбТАААТТССТТСАААТТАСТ ССАСАТССТАААССТСТАТСТАТААСАААСССАААААТТТСАСССТТАСАА ТСАААСАСТАСТТТСАСТбААСССТТСААААСТААССАТТТСАААССАТТА АТАААТСАААСАСТССТСАААСТТАТТСАТСАССТТААТСААСААСАТТСС ААТТТАТТССААААСТТАТСААТССАСССТАСТСАССАСТТСТТСАААСАС ССТСТТССАТТССАСААССАТСААТСАСАТССАСААСАССАТСССААСААТ САСАААСААСАССАТССССААСААТТСТТТСААСАААТТСАААССААТТТС СААССССАСССССАТТТСТССТТСТСТССТААТАТССААСАААСТАТТТССА АСААСТТССТТТСтеССААСАТТААСАбСбСТСТСАААААТТСТСТАСАСА АТСАСТТАСТААТССАССССАТССТСАТСССАТТАСАТТСАААТААССААА

- 29 017803

ЕАТТАААСЕАААСТСТСААЕААТСССТАТТТТЕСЕААЕТАТееАТСТАААТ

САТСЕСТСТСбАбЕАТАСТАТАСТССАТТТСТААЕАССЕААЕТАСАТЕАТТТ

ССТТСААААТТТС6АТСТСТСТСАСТССААСТТТАТСТСТАААССААТТСАА ААСТТАТАТССАААТЕАТАТСССССАеАЕСААТЕАААТЕТТЕАТТАААТТС СЕАеАСАеСТТАААЕЕААААТССТСАТАЕАСААЕАТТСТТТСАСТТТеТАС

ТТСеСТССС66АТСАТТАСАТААССТСССТТСААТТТСеТТАТСА5ААТТТС САСАТТТебАССАТАААТТСААСАААСАТААТААСАСААТТТАТСААССТС АТТСССААТСТСТААСТЙАеТТСАТТбАААСАТТСАССОТАТТТТССААСТТ САТТААТССААССТСТАССАТТААТААТЕАЕСААТТААТТЕССАААТТТТТС СААТТТАТСААСТТААСТАСТТССАСАССАААТТТС6ААСТАСССАСТСААТ ТСТТАААТАСТТТАССААЕТСАСААТЕААСАССТТААААСАСААААСССАС СТСТСТТеАТТССТТССЕЕСАААТСАТТАСССССАСААААТССТЕСЕАСАЕ СЕАССАССАССАААЕССААЕТАТАСАААСЕССААЕАСАААТААЕААСЕТТ

ССТСТАСТАССААСТССТССААТСССТТСТАСТАСТТСТАТТССТАСТАТеС

АСССАССАТТТТАТССТАТСАСАССАСССЕССТСТЕСАААТССТСТАССТСС АААССССТАССТТССАССААССАССАСТАСТССТССТСТТСАТАСАСААСС ТАААТАТСССССАССААЗССААССТТССАТЕЕСЕТСАССТТТТЕТТААСАА ААСАААТАЕСТСЕАССАЕАТТСААТТСТТТТЕСТССТСССССТААСССАТАТ 6ССАСТССААСА6ТТССТССААСЕААССТАТСТАСААССТССАТТССССАА

ААСАСТТТТССТССТАТАСААССТСЕТАТСССТАТТАТСЕеССАСТАТААТЕ СТСААТСТАССТСТАТТССТТСАСААССТССААТТААТЕСТСТАТССЕЕТСА ААССССАСАТСТСААССЕТАААЕССААТСАТееТТеСААТ&АТТТеССТТТ СААСЕТСАААЕАААААССАТСТСЕТСССААСССТЕТАТСТСТТСССССТСС

АААТАТССТАТССАСАССААСТССАТТАААТССТАТСССТССАААТССТССТ АЕТАССАТСССТСССССАССТСТТТССАСАССТСССТСТТСтеТЕТСААТСЕ ТАТСАССАССТССТСТАСАСАААААТТСТАЕАСТСССАТССТТбЕТТеСААС ТТСТСАСТСАССААСееСАТССАТАТСАААТССАТАСССТССТССТСААТСА ТСАСААСААТТСССААТАЕСТАСТАТТТСТАСАССАААССАААССТСАААС

АССССТСАССТАССТТСАТССААССССТАТССТССАССАССАСААСАААЕА

СТАССААССССАТТАТСТ66АЕ0С6ТЕССТССА0СТСССТТЕССААА6ССС

ТСТААТССАТАТЕСТССААСТЕСААССАСТСААСССААССЕТТССТССТАТС СТССААССЕЕТССЕТАТАСТААТААССАТАССАТСАССТСТССТССТССССТ ТТТТААСАААССТСССАСТССССССССТСССАТТАССАТСААСААСАСААЕ СААСААЕТТАССТАСТАТАЕААСААААСССАТСТСААЕСТЕСТАСТТАТСС ТССААСССТТТССАССТСССССТСТССАТТЕСАЕССТТСТСААССЕССААСТ

- 30 017803

ТТБЕСТТСТСАЕЕТТААТАССТССССТЕАСААТСТСАЕТСАТСАААТТССАЕ

СТеАТСААСААСССАТТЕТССАСТТСТТЕАААСААЕААСТЕССТСЕСЕТАА

САССАТТ6АССССАААС6А6ТАСТССАААСААТТААА6ОАТТ6Т6АТАААС САТТАААСАТТСТТТТСТАССАТТТССААААЕСАОЕАТТТАТТААСССААСС ААСААТССАТТСТТТАСАТСАССТССТСССАТТААТСААССААААЕАААТА САААСААССТАТССТСАТССАТССТААТАТСССТАСАААССАТССТСААСА ЕСЕТССТААЕТЕССТОАСАСЕАСТСААЕАЕСТТЕАТТЕеСАТАССТЕААСС САСТТТСААТТАА

5. сегетлТзтае 35А4 (ΞΕ2 СТ НО 40)

АТЕТСААААЕСТСТТБЕТАТТСАТТТАЕСТАСААССТАТТСАТЕТЕТТССТС АТТТТЕСАААСЕАТАСЕбТТЕАААТТАТСеСТААСеАТСААЕСТААТАСАА СбАСЕССТТСТТАТЕТСЕСТТТТАСТСАСАСАСАААЕССТААТТеСТСАССС ТССеДАСААТСААССТСССАТСААСССАСАТААТАСАЕТАТТСЕАТССТАА ССЕТСТЕАТСЕЕАСЕТАААТТСЕАТЕАТССАСААЕТЕАСеААСЕАТССТАА ЕСАТТАСССАТТСАААСТЕАТТСАСААЕееАЕЕТАААССОСТАСТЕСААЕТ ЕСААТАТАААС6ССАСАСАААЕАСАТТТАСТССАСААЕАААТТТССТСААТ ОАТСТТбАСАААЕАТЕААЕОАОАСТССТЕАЕААСТТТТТАССААСАСААОТ бАААЕАТССТЕТАСТААСЕСТТССАЕССТАТТТСААССАТТСАСАААСССА АЕСААСААААЕАТССССЕТАСААТСЕСЕЕОСТТЕААСеТТСТТССТАТСАТ ТААТСААССТАСАЕСТЕССССТАТТеССТАТССЕСТССАСААЕАААТСЕСА СААСЕАССАСААСЕТСТТЕАТСТТТСАТТТАССТЕСТЕЕТАСТТТТСАТСТС ТСТСТССТАТССАТАСАТСААСЕТСТСТТТЕАССТТААСССТАСТССТССТС АСАСТСАСТТЕеСТССТСААСАТТТССАТАСТАСССТСеТТААСТТТСТАЕС СЕАЕСАСТТСААААЕААААААТАААААЕЕАТСТААСААСТААССАААСЕТ СССТААССАЕСТТААЕЕАССбССеСТЕАААССЕССААСАЕААСТСТЕТСТТ ССТСТССТСАСАСАТСТАТАЕАААТАЗАТТСАТТАТТТЕАСЕСТАТССАТТТ СТАТАСТТССАТТАСААСбССААЕАТТТЕААСААТТАТСТеСТСАТТТЕТТТ АСАТСТАСАТТСОАОССАЕТСЕАААААСТТТТЕЕСТСАТТСААААТТАеАТ ААСТСАСАААТТЕАТСАААТТСТАСТТЕТТЕЕТЕСТТСААСААЕААТТССАА ААСТАСАААААСТСЕТТТСТСАТТТТТТСААТСеТАААСААССАААСССТТС ЕАТТААСССТОАТбАСССССТСССТТАТЕСТССТССССТАСАСССТСССАТ СТТААССЕЕТБАССАЕТССТССАСОАСССААСАТТТАСТСТТЕСТСЕАТЕТТ еСАССАТТАТСТСТАС6ТАТТСАААСТССА6СТЕЕТАТТАТ6АСАААСТТСА ТСССААЕАААТТССАСТАТСССААСАААААААТСССААЕТСТТТТССАССТ АСССТСАСААССААССТЕЕТетеТТЕАТАСААСТТТТТЕАСЕОТЕАААЕЕА

- 31 017803

СААЕСАСААААЕАСААСААТСТАСТЕБЕТАААТТТЕАЕТТБАБСЕСТАТТС

САСССССТССААСАСеСОТАССАСАААТТСААСТТАСАТТТбАТАТССАТС

САААТЕБТАТТСТСААСЕТАТСТЕССЕТТСАААААЕСТАСТБОТАААТСТА

АСААСАТТАСААТТАСТААСБАТААБББААБАТТАТСЕААСБАА6АТАТСЕ АТААААТБСТТБСТСАББСАЕААААСТТСААБЕССЕААбАТСААСААБАА ССТСААССТСТТСААССТААСААТСАССТАЕААТССТАСЕСеТТТАСТТТеА

ААААТТСТСТОАССЕААААТААСТТСААББАБААСЕТОБСТЕААБАСБАТЕ

ССАССАААТТССААЕССЕССССССААЕАТССТАТАААТТОСТТАЕАТЕСТТ

СЕСААССЕЕССТССАССЕАЕСААТАСААЕСАААЕЕСААААЕЕААСТАСАА

ЕБТБТТБСАААССССАТТАТСАСТАААТТТТАСБСАССТССАЕСТСБТССС

ССА6БАБСАЕ6СССАБТТССБЕ6ТБСТ6БАББАББССССАСТББА6САСС

АБАСААСБЕСССААСЕБТТЕААБАСБТТЕАТТАЕ

5, сегеу±8±ае 23еГ (3Εθ“ ϊϋ N0 41)

АТСАСТАСТССАТТтееТТТАБАТТТАБЕТААСААТААСТСТеТССТТСССБ

ТТБСТАЕАААСАБАБ6ТАТСБАСАТТОТСЕТТААТОААСТСТСТААСССТТС

САССССАТСТбТТЕТТСЕТТТТББТССАААЕААСАСАТАСТТССЕТСАААСТ

ЕСТААБААСАА6САСАСТТССААСАТЕААСААСАСТБТСЕССААСТТЕААА

АСААТТАТТЕСТТТЕСАТТАССАССАТССАЕАТТТСБАССААБААТСТААБС АСТТСАССТСТААСТТЕСТТСААТТЕЕАТБАСААЕААЕАСТБСТБССЕААЕ ТТАБАТТСССТСЕТБАБАААСАТБТТТТТТСАБСТАСТСААСТАЕСТЕССАТ

СТТСАТССАСААА6ТСАА66АСАССБТСААЕСАССАСАСАААСЕСАААТА

ТТАССБАтеТТТБТАТТБСТСТСССАССТТСЕТАСАССБААБААСААСБТТА

СААСАТТЕСТБАТССТССТАЕААТТЕСТС6ТТТЕААСССТБТТА6ААТТБТС

ААСОАСЕТТАСТБСТЕССССТБТТТСТТАСБеТАТСТТСААЕАСТБАТТТБС

СТСААЕСССААСААААЕССААЕААТТБТТБССТТТЕТТОАТАТТОСТСАСТС

ТТССТАСАССТБТТСТАТСАТЕСССТТСААБААСЕЕТСААТТСАААЕТСТТА

БСААСТБССтеСБАСААССАТТТТССТБбТАОБбАСТТССАТТТББСТАТАА

САБААСАТТТСБССБАТБАСТТСААААСТАААТАСААБАТТСАСАТСАЕАС ААААТССАААСБСТТАСААСАБААТТСТААСТОСТБСТБААААБТТЕААБА ААБТТТТСТСТОСТААТАСТААТОССССАТТСТСтеТТЕААТСССТСАТЕАА СБАССТТБАТЕТТТССТСТСААТТАТСТССТбААБААТТАЕААЕААТТББТС

ААБССАТТБТТ0БААСЕТЕТТАСТ6ААССАСТТАССАААБСТТТАЕСТСАА

ЕССАААТТАТСТССТСААЕААЕТТЕАТТТТБТТБАААТТАТТОЕТЕЕТАСТА СТСБТАТСССААСАТТБАААСААТССАТТТСТБААБССТТСЕБСААБССАТТ СТССАССАСТТТСААССААЕАТСААОССАТСЕССААбБСТБССБССТТТАТ

- 32 017803

ТТСССССАТТСАСТСТССААСТСТААСАСТТАСАССАТТСААеТТТСАСБАТ АТССАТССТТАСТСТЕТСТСТТАСТСТТССЕАСААССААСТТСАЕСАССААС АССАСАТССААСТТТТСССАССТеСТТСАТССТТСССАТСТАСТАААТ'ГСАТ САСТТТСААСССТАССССТСАСТТТТСААТеССТЕСТАССТАСАСТСАСАТС АСАСАСТТАССАССАААСАСТССАСААСАААТСЙСТААСТС6САСАТСАСТ ССТСТТСААТТАССАОААССТСААСАСТСТСТТССТСТТААеТТАААеТТСА САТСССАССССТСТССТТТАСАСАСААТТеААбАЕЕСТТАСАСТАТТСААЕ АТАТТЙААСТТСААСААССТАТТССАТТАССАСАА5АТССТССАСАА5АТС СТЕАССЙАЕААТТТААбААСбТТАСТААААСтеТАААЕААССАТСАСТТАА ССАТССТТССАСАСАССТТТССССТАСАСССТАААААСТТСАЛТСААТТАА ТТСАААААСААААТСАААТКСТТеСТСААбАТААеСТАСТТБСТЕАеАСАб ААЕАСССТААСААСАСТСТТСААеАСТАСАТСТАСАСАТТССЙТССТААСТ ТСеААОААЕАБТАТССТССАТТТЕСТТССЙАТеСТСААААеАСЕААСТТАС ААССТАТБТТАААСААСССС&ААЕАеТЕбТТАТАССАТСААБСТТТССАТТ ССАТСАААеСТААСТАСАТТбССАААТАСЕААСААТТСССТТСТСТАССТА АСАТТАТТАСАССТАСАТАСТТСССТАААСААСААСААААСААССААССТА ТААСАТСТААССААСААЕСАТСССАААТбССТбСТАТЕССТеААААСТТСС СТЙСТСАААСАААСССАСААССТСААААСААЕСААЕААААЙААСЙАСАСТ САА6ЙТСАТСТТЗАСАТССАСТАА

- 33 017803

Посредством скрининга базы данных генома Р.равГопв (ЕЕ6О™, 1С-66, 1пГедгаГеп бепотгсв) с использованием нуклеотидных последовательностей хелперных факторов секреции, выделенных из 8ассНаготусев сегеу181ае (8Ер Ш ЫО: 32-8ЕР Ш ЫО: 41), гомологичные нуклеотидные последовательности в Р1сЫа равГопв были идентифицированы, и они показаны в табл. 4.

Таблица 4 Гомологичные нуклеотидные последовательности Р1сЫа равГопв (8Ер Ш ЫО: 42-8ЕР Ш ЫО: 51) и соответствующая информация базы данных ЕЕСО™

ВМН2 (ЗЕ <2 ΙΟ ΝΟ 42); ΚΡΡΑ07Ϊ90 - Р1сМа раа^оПз (16-66)

АТСТСААСАСААСАТТСТСТТТАТТТАССААААСТАССТСАССААЗСТСАСС

СТТАТСАССАСАТССТССАЗААСАТСААбАСССТССССТСТТСССССТТАСА

ОТТСТСТСТСбААеАСАСАААСТТССТТТСТСТТССАТАСАААААССТААТТС

ЗА6СТАСААСАССТТСТТССАСААТССТСТССТСААТТСААСАСААА6АС6А

АСССААОСеТААССААТСАСААСТСТСТТТСАТСАСАСААТАССССТССААС

АТТЗАСАСССААТТССССААСАТТТСТеАССАТАТТТТСТСТСТТТТСАаТЗА бСАССТТАТТССТТСТСССАСААСТССССААТССААССТСТТСТАСТТТААОА ТСААСССТСАТТАССАССОТТАТТТСССССААТТСССТСТТССТСАСААССе АААЗСААССТССТААТТТСТСАТТССАбССТТАСААСТСТЗССТСТСАСбТТ

ССТОТТАСССАССТАССТССААСТСАТССААТТАЗАТТСЗСТСТСССТСТСАА

ТТТСТСАСТСТТСТАСТАССА6АТТСТАААСТСТССТСАСССССССТСТСАТТ

ТАСССААЗСААССТТТССАССАТЗСТАТТССТСАСТТАаАААСССТАТСТСА

АСААТСТТАСАААСАСТССАСТТТСАТТАТССААСТССТСССТСАСААСТТС

АСТТТСТбеАССТСАСАСАТСТСТСАААСТССАСААСААСАС;ТСАТССААТА

СССААСАТААОАСАСААССТбСТСССАААОАТСААСАСТеААТА

ΒΕΉ2’ (“ЗЕСГ ГЙ КО 43) Г КРРА04523 - Р1сК£а’ра8Ъог15 (16-66)

АТСССТАСАААСАСАТТбССТСАААСАТТСССАСААТТСТСТСААССАбСС

ТСТЙСАСАТТТТСАТАТАСААСАССААСААССАС13А6САСТАСТТСАСТАТ

ССАСАТААТАСТТСТТТТСССТСССАСАСТСААСАССАТААААСТААССАС

ТАТСТТАААСТТСбСААбТСААССАТААбАбАСААСбСАСТТАААТТСССА

ССАСААТАССАЗСЗААААААСАСТАСТА6АССС5АТеТТТТТССАСАССА

ССАСбАТСАССАССАССАССАТСАССАТСТТСААСАТТССОАААСТСААб

АТССАСТТТСССТТТСАССАТСАбАСТССЗААТСССАТСАААААААТАСТС

АТСАААСССААбСТСАТТСТбАСАОТаААСААСААТСТААСТСАССТСААС

АТСТАСАСТАСААСАСАТСААААСТАСАССААСТТАТААССТССОАААОСА

АААССАТТСТАААССААТТАТСААСТТССААТАААСААСАТССАСТбАААС бСТТТбСАСТбТТСААТСАССАСАТАСАСТАТСАТСААТТОСТТаАССТСАС ААТААААТТАСАСАААССАТТАСТАССАТССААТССТСТАСССАТТААСАА АСААТАТТАССААСАСААТАААССАССАААСТСТТССАААСАССТСОАТАА ССТАСДАбАТАААСТАТАСААТТТАТТеСАтеТСАСТТТАбААСТСАЗАЗС СААССТАТТАААСААААССААСАТТСТСАСССААСАСТТТСССССТАТТСС

ААСТАА&АААССТА13ТТТАСА0САТТАТТТССАЗСААТСТТССААСТТССАТ

ААСАТАСТТААТ6ААТАТА6АА6СААССТССТССТТАААТС;СТСТСААААА

СТССААААТССТТССССАССААСТеСТТТСАССТСАТССАААТТСААСССТ

АТТААССААСАТАСТТССАСТСААеТССАСААСТАТТТСССАСАСАТСЗАТ

АСАТТААТСААААСААССАЗАСТСААСАСААСААССЗТАСТ6ССАТТАСС

АТАСАСССАСАСАСААСААСТАСТАСАТСАТСАТСААТТСАТССАСААССА

ТАААСАТААСААТСАСАССАААТАСТТСАССААСАТТ13АСССАТСТТТСАА (ЗСААААСАААТАТАТСТАТ0АТ6АТСАСЗАТТТСТАТАСАСТТСТТСТСААС

- 34 017803

ЕАТСТАЕТССАТААЕАААЕТТТСТЕАТАСАСАеААЕСТеАСАТСТАСАТСА

АСТЕТТАТТАСАТТТТССАААТССАААТТССАТААААбТТАТЕАААСААААб

СЕАСТААЕССТСЕТААЕСТЕАСЕТАТАСАЕТТСААСАТССАТТАТТСААТТТ

ТЕААЕССТССААСССАСАТЕССТАСААЕТЕЕААССАСТАССАААТТСАСЕА

СТТТТТТСССТСАТТАТТТССССААААССТСААСАТСААССАЕСАТСАССАТ

ААСЕААСАОЕТАСААЕЕТЕААТСАЕААЕЕАЕАЕСАСАТТТТСААЕЕАТСА

ТАТСАААСТСТТТССАТАА

С0Е6 (2Εζ> Ю N0 44) ; НРРА07651 - Р1сЫа рааЬоПз (ΙΕ-66)

АТСЕАСТТТеТАТАтеАеТАСТСАЕАТЕСТАССССТАЕТЕЕСАСАТТТСАТЕ

АСССАТТСССТЕСАЕАССССОААССАССАТТСААТТТЕТСАААСТТАААСТ

СЕТАСАААСАТЕАТТТЕАСТААААААТТСТССААААТЕАЕСАТТСТЕАААА

ЕТСТЕАААААТЕАСАССААТТСАСТТСАССАТЕТСЕАСЕАСТСАСААТССА

ТСТССААТСАСЕЕССАЕАЕЕЕСТТАТАААТАСЕССААТСАбТСТСТСбАТС

ТССТТААССАЕСАСАССАСТААТАААТСААТСАБААССАССАЕСЕАТЕААС

ААССТТСЕСТЕТССАСТСТТТТСАЕСААСАЕАСТЕАССАеАбТССТСААТА

АТАСТААТТАСеАСССТТСААССААеСААСТАСТСТССАТТСТССАЕААСА

АААТААААЕААеАТАСЕЕСССАТЕААТАССАСАААЕТТАСТЕАСССААЕТТ

ТТСТТЕЕАААССТТССТАСААСАААСТТСССТААССАСАТТСААСАТБАТЕ ТТеТАСАТЕССААСТТСААТТТСТТЕАААСААТТЕСААСССТТААЕАААЕАС

СТТЕЕЕССАЕАТТСАААСТСАСТТЕААТЕАААТСААСЕАССТСААСААТСА

ААТСАСТЕААААЕТТСТССТСТАСАЕТТСААСАТАССАСТАСЕТТСЕАТАА

ТТССАТАСАСЕАСТТЕСАТССААСТТССААСАТТАТТТССАТСАААААЕАА

ЕСТТТТССАСААТТТССАЕААССеСТАТАСТСТСТСССАТТТСЕААССАСАТ

СААТТАСАеТТТебТСАААТТЕАСЕАТТССТТТСТАЕАААТАСТСААААААЕ

СТЕАСТСААТТСАТСАТБАТТСТТСААТТТТЕТТААССАТОЕАЕААТЕСТАС

ТСТЕЕСТАТТААТАТТАТЕААССАСАТЕАААААЕСТТТССААТААТЕССАТС

ЗДСАСАТТЕТСЕАСАТТТЕТСАССАААСАТТТТТСТАЕЕТТААЕТТССТССА

АСААТАССТСССССТССАТАСАЕЕАТААеЕСАТТССТЕААААЕАТСТАТАС

ТСТТСАТТТССеАААеАТАСССЕСАССАЕСТСТСТСЕААТСАССААССААА ТАЕТСЕААТСААЕ6ТСААА0ТСТТТССТТЕАСЕАСТТССАААТАСААТТСАА

ТЕЕТТАТЕСАЕАТТСАССАТСААСАААСЕАААСССАТСТТААТАААССАТТ етТССТТТССЕСАТАТСАТТСАЕАААЕЕТТТСТССеАЕАТТТАСТТеСТТАТ аттсатсссасааттеттаатеаааеаеааассетссаааесттеттсает

ТТЕСААСАТЕА6ЕАЕААА6АТААТАТССТТТТЕАСААСАСТССТАСАЕТСА

АТТОТТТСАААЕААСАТСЕААТСТСТАЕСТАССССССТСААТТТАААЕАТТЕ

- 35 017803

ААСАЕАТСАТСАСАААТЕАЕТСТААССТЕАСАеССАТССААЕСТТТТТАТС

АССТССТСТСАСТТТАТТССАТСАТеСТТСААААААСТТТАеСТТСТААСАА ТССССТТТТеАСТАСААТСААСТСТТТААААСТТТСББСТТТСССТААСАТТ САААЗТТСААТСААСАТТАААСТТАААААСАТАбАССбСАСТСССААТЕАЕ АбСАТЕТСАТАТТАТААТЕААСАТСААСААСТАСАТеСТАСАААССАСААС

ТТТСТТТСАЕАААСТСАТТАСАТТСААЕАААТСАСАССТЕАеСТАеСТСТСС

СТЕАТТСЕТТЕАТСААТТТСТАТеЕТСАСЕТАСТТСССАТСТТТеАТААТСА

АААбСТНАСАААТСССАААСААСТбТАТСАССАТТТАСТСАААТАСТеТТТ ТСААСАААТСАТТСААСТТАТСОАЕАААСАААТАССТСАЕААТАААТТЕАА ТбАТесТАСАСАбАТАТТСАТТТТСАААТСАААСТОТТАССАТТТТСТТТАТТ

ССААААТТЕТЕАСССТЕААСАТСТТТААССАСАААСТССАТССАТТАЕАСС ТААТСАТАААЕСААТЕСЕААТСААААТТСАСССАААТТСАЕТАСАСТТАТС ТТСТСАААСААТСАЕССТТАТАТЕАТАТТСАСААССТТЕТСААСАТСАТАТС СТСААСТАЕСЕААЕАТТТСТТТЕАССТСТСССТТТАТЕААССААТТАСЕЕАС ААСТСАСТАТТСААТСЕТСАСАААТТСАААбАААТАТЕАЕАТССССТТСАА

САТТТТСТТССААТТОСАТТААТТЕАТТАССААЗАСЕАЗСЕАТТСТТЕТАТС

ТАТТАССТСССАСЕСТТЕТТААСТСТАТСАТТСААААСТССТСТСТССАТТТТ

ЕТСААСТТТТАТТТСАААТТАТСЕТТСАТССТСААЕСААТАТТТСАААЕССА СТСААССАТЙТСТСАСАТСССАТБАСАТССАССТ

ΟΟΥ1 частичная (ΞΕζ> Ιϋ N0 45) ; ’

НРРА05747 - Р1сЫа разЪогаз (16-66)

АЛААСТТААСТААТОАСТТССТТАеСТАСАСАТСЕАТААСААЕАСЕАСАТЕЕ ТТААТТСААТТСАЕЕААСТЕЕААБАСААССТТСССТТТТСТСААААССААеТА ЕАЕСАСТТАСАЕСАЕТТАААССАЕЕАТТТбСАЕААЕбАЕАСТАСТЕТЕЕААА АВД6ССАТССААТТТСААТЕАТТТСТ6ССАС6ССЕЕАСАСТТСААТАСАЕЕАС ААТТСЕТТЕАТТАСААТССТАТСАСААСАААЕАЕАТСЕАТТТААЕСАААЕСАА САААОАТСТТЕАААААСАСЕТТАЕАТТАСААТТЕААСААААТТТСТЕАССТТС АААСАААЕЕТССААТСАСТТТСТТСАСАСААТААТСААТТАТАСЕАЕАЕААТС АССТТТТТЕТСАТССТАТСАСАСТААТААЕААТСАСТССААССАСАСССАЕТС ССААСАСТАСТАСААСАСААЕТТАССААСАСАААТТССАТСССАТАЕААСАА ТТТАССАТАТТССАТСАЕССТССАСТТААТТСТСАТСТСААТСАССАТЕТАТЕТ САТСААТАТССАТААТСА

КРРА04443 - РхсЫа разЪогхз (ΙΘ-66)

ААТТСАТАСССТТЕТСАСЕТААТССССССССТАСТЕТССАТСССАТСЕТАТТ

Е6А6АСАТСТЕТСТСТТТТСТТСССТСАСАТССАААТАСААСТТСАССАТЕА

- 36 017803

СТСАСЕСТЕАСТТССААЕТАеТАТТТСААСССТСССААЕСТСТССАТСТАС

АСССТСТТААСААССТТЙТАСАТСАТБАСеСААААСАбАТТбАААЕТТССА

АЕТСТТСААЕТТТеСАТСАААЕАААССАСТТЕАЕТТТТААСАСЕААСЕАБТ

ТСААСАААТТССАС6АТБА5ССТАААТТОАСАСААТСЕАССТССТТСТТСА

АЕСАСТАТСААААСТАСАТТЕАТЕАТТТСАССААСЕБАААТААТС6Т6ТТ6

ТАСАЕАСАТТСТТЗСААТТССАТАААСТАЕТСЕТСБАТТТСААСЕАТССТАС

ААСТАСТТТеАЕСААБЕАССААБАСАСбААТАССБААТТАСАЕАААеСТБТ

СААААААСТТТССАСАЕААСТСАСЕСАТТСАЕААСААСАСТСЕЕСТТССЕА еААСАААЕСАТТСеААСАААААТТТААССТАССТААААСССАААСССААС

АЕААААЕТСТТСАТСАЕАТТААБАСАЕСССАААСТЕАААТАЕТССААТТСА

СССАТЕАЕСТСААССАААААТСТТСАОААААТЕААЕАЕСТТСААЕТСЕТСА

ТТСАААСССТТСАТеССААеСТААААААЕААСАСССААееАСААААТААТ

САТЕАТАСАТАСТССААТТАТбАСАТЕТТАААТАСАСАТТТЕСАЕТССААТА

ААСТАААеАТССТТЕААТТСЕАААССТТСААСААСТСТСТАААеСАебААТ

ТАССАААбАААСАТСАСАААСССТАССАЕСАЕАЕБСТСАССЕААСТСЕАА

ААЕЕАСАОТСТЕСАЕТАТСТСТСТТАААЕ

СЧР5 частичная (ЗЕф Ю N0 46);

КРРА09067 - Р±сЫа разЪог£з (1С-66)

ЕТССТЕТТТАТЕСТССАТТСТТТССАТССАТТССТТСТССТССССССАТСАТС

ТТТАССТЕТТТТЕСТСССЕССТАТССТАСТбСТААСТССЕСТСТАЕЕТАТТТ бТСССАССТСТЕТСТтеСЕТССАЕАСТТАСТЕАТСААСААТАСАЕТЕССТСТ ТАТТАТСОСТЕЕТАТСАТТЕСТАТТТАТЕССТТССТЕЕТЕТСТЕТЕТТеАТСТ

СТТСАТСЕТТЕСААСАСААЕСАСССТТТЗТАТАСТЕЕСТТТАТССААТТЕЕЕ

ТбССеСТТТАТСАЕТТСЕТСТСТСАСЕТСТСОСТЕЕТЕСТТТТСССАТСССА

АТТЕТТЕЕТСАТЕСТССТЕТСАСАССТАСТЕСТСААСАСССААЕАСТТТТСС

ТСЕЕТАТЕАТТСТСАТТТТЕАТТТТтеСТСААеТТТТбЕСТСТТТАСЕСТСТО

АТТЕТТССТСТТСТАСТЕААСТСТАЕАЕСТТСССААЕАТСТСАСТТСТТААА

ЕС

ΙΜΗ1 (8ЕЙ Ю N0 47); НРРА04985 - РхсЪха разЪох18 (1С-66)

АТЕТТСТСААААСТТТСССАСТТАТСССАЕААТТТАЕССЕААЕАЕСТСТСТА

ССАТТААТСАССАССТТЕСТСССТСТАЕААССААССААСТАААСААААССА ессаттссеасассеатасааасттссттаасатсаааастссссатссте ААБСТСТАСААСААСССЕСТСАТЕАССТСААТСААЕССЕСТЕАААССЕАА

АСАЕАТеСТАСТЕАЕТСАААеЕеССААеТЕбТТССАААСАСАААТАТАСАС

ТТСААТЕАТСТСССТАТЕСАСАТТАССЕСССССТТСАААААСТТТЕССАААТ

- 37 017803

АТСАССАСАААТАТСССТТСТТЕТТССАСССТТАСААААСТСАСААЕЕССА ААТСТСАААТАСТТСАТССТТТТСААТСААСТТТАСААСААСТСАСТССТТТ ССАЕАСААТТСЕАЕАААТТСААСААТТСАААСАСТТТАТСАССААТАТСАС ССААААСЕСТАААТТААТСЕАТЕААСААТТ6АЕАЕССААААСТЕЕССАЕТТ СААТЕСССТААААААССААЕТЕАСАеАААТСАААЕАСАААТТСААСЕСТС ТТСААЕСТЕАОАТЕАААЕССААЕТСТбСТТТАеСАеААЕААТСТСССАТЕА ААЙСССАТСААСТТАСТСТБСАТСТТСААССАСТТСТСАСТСАССТАСААА АТТТеАААААееАААСеСААСАеАТТбТТАСССАССеТСАТеАеССААСС ААЕ6ААССТЕАСЕА0ТСААСААСАЕААА6А6АТАТСАТТСТАеААСААСТ САААТСТААТАААААТСААСААСТТТТббАббААТАСААЕТСТСАбТТАбА АСААССАААСААСЕСТСТТССАТТСАСААСТСАЕЕАСАТТСААААТСТААА сттеаасттесастстеааааетссссааасттатсаттасасестотаес АСАТСАССЕАЕАТСЕССТТАААССАААЕТТАЕААССССАААСААСТТССТТ ССАССгЛЕААТТАСАССААСТТТСТСААЕААСбСеАТСбТТТСААТТСТСА АСТААСААТАСЕАЕААААЕТСАСАЕАТАСАААТТЕАЕСААЕАААААААТЕ АССТСААЕАЕТСАЕТАСААТТСТЕАЕАТТААСТСАТС6СТТАСТАААСТЕЕ ААТССЕТААТТАААЕАААЕАААТ6АЕСТАСААСАЕСААТТЕЕААТСТСАА0 АеТСТТТААСТТТСЕААЕТСЕАТААЕСТСТСТАААСАЕАЕАЕАТСАЕСТАА еСАТЕСАЕТТЕЕАТАЕАЕАААААСААААТТСТЕСАААбССТАССАТСАССС сссасаастттеаоотталаастаааеттсаатссаасаасаасаттсаас сасстттатстеааеаастсасосаастсассаеасааасасатсасстаа ааестсаеттсттсстсаттсааааеаасссассассаастаасааеасса АТСААЕСАААССОТААСТТАЕАЕСССААСССТЕАААААААСТСССАТСАС СААААТЕСТССТСАСЕАТЕАТСТТАТСЕААССЕААСССТСАААСССБТАСА еатеаттсаааееатаатсаестоааастаатасассастсаассастатт АССАТЕТТСААТЕААСАЕАТТСААААСТТЕАААЕАТАТЕСТЕСЕТСАСЕТС ССАСАСЕАТСТТЕТАСТСЕСТАААСАСААССТТТСАСАЕСТСТСТССТ6ТТС АТСААААААААСАССАСЕСТСТТСАААССЕААСТССААТССТСАААЕТТСА АССТТССТСАЕАТТСААААеСАТТАСААСЕАСОАТАСАСТТЕАССТСААЕА АТСААТТСАААСТССТТАССЕАССААААССААААТСТТеААСАТСАЕААТб АААСАТТСАСТСАААЕСТТЕАССЕАЕСТТЕААААЕСТСАААСААСААеТСА АЕЕАЕАААССТСААСССеТТСАСААТТАТЕААТСТААСТАТТСЕАСАСТАТ СЕЕАТЕААТТАТСТТТАЕТССТСТССАААСЕАСАТСААТТЕСАААААСАСА АОЕАААЕТТТСАЕеСТЕАААТТЕАААЕАТТТССААСАСАААААТТСССАСА СТСААСААСААЕАССААТСССАСАСААСТЕЕААСТССАСАААТССААСАС

- 38 017803

САСТТССАСАСТТТЕААААСССАССТАСААССААССТСССАЕСССАТТСАС

САТТАТААССААААССААСТАСААСТАСАТЕАТСАААТАТСТСТТСТАССТ

ТСТСАААААСАТСААТТАСАСААААСЕАТААСТАСССТССААСААЕАССТС

СССАААСАСАААЕАСААТСТТААСТТАСТСССТСААААТАТСАТТССССАА

ЕАААААбССАААААТТСССАААААСТСЕСАСААААТЕТЕЕСбСАССТАЕА

САААТТСАААААССАССАСАТАТСАСТСААССТТСАСАТТЕСАААССТТЕА

АААТСТАААТССТЕАААААеССТСАААЕАТСААААСТТТССААСАССАТАТ

САСТТАТСТТААТАСАСАСАСССААТСТААТТАТ6АТСАСААТСАСАААСТ

САТСТСССАТАСТААТСАСАААТССААССАССАТТАСАСЕСАСТТАСТСАТ

ААААТТЕААСААЕТЕТСАЕТСАЕА6ААСААТА6АСТТАСАААА6ААТТЕАА

ССААТАСАААСАТАААСТААААСАТАТСААСАССТСАААЕСТСААСАЕТА

СССАСАСААТСЕАСТСААТСАСААЕАСААТСССААСААСТТААААТСАТС

ААТААТЕААТАТТСТТТЕААЕАТТЕАААЕТСТАСАТЕААЕААСТААЕТТСТТ

ССАЕТТСААТТТТАСАСЕААССТТССАЕАСАААТСААТАСТАТАССТАААС

ТССТАССТСАТАСТСАСТССАААТЕТЕАССАААСААТСАААСА6ТТААААЕ

СААСААТТСАТАЕСТТАеААБААСААААССАЕАССАСТАСССАТСАААЕС

ТСТБТССАСССААСАААБСТБАСТААААСААТССАССАСТТАААЕАААСЕ

СААЕААТСААТТЕТСАЕТССАЕСТАСААСААтеТААЕСТАЕАЕСТЕЕААСА

ТСТЕАААТССЕТСССАТСТАСАСТСеАТСТТЕАСААТАААААСЕСТССТТС

АААТСААААСАСТЕАТБААААССААТСТСАТАТТСААТСТСБААТТАТССА

АСАССТСАСАААСТСССТАААБСЕАТАТЕААЕААСААСТААААСААТАСС

ААЕАТТССААСЕТСТТАСТСААСААОСТТААССААСАССАЕТТССТСААЕТ

ТССАСАСАСТССАТТСАААТТТСААСАТТСТАТСТАААСААТАТАСААТЕСТ

САААЕАТСААААСЕАСЕААЕТСААТАССАЕААЕТАЕАААСААТТСАЕТТА

ТААЕТТСААСЕАСС6С6СЕСА2Т6АТСААААТЕА6АеАЕАТААА6ТтеССТ

АТАТТААЕААССТССТТСТАЕСАТТТТТЕЕААСАСАААЕАТСААССАЕСТАТ

ССТТТТТССТСТАСТСААСАТССТАСТТАТССТСЕАССАТСАТСААСАСАСА

АСЕТ

ΚΙΝ2 (ЗЕО ΙΠ ΝΟ 48); КРРА04639 - РхсЬха рааЬогхг (16-66)

АТССАТАСАСААСАССЕТАТТСТСССАСАССАТСССТТСТССААСТСССТС

САТСТАССАААСТТСАСАССТТСТТСТЕСТССССАСССАСАСААСССТСТА

АТАСААААТТСТССТСстеСТАСТбСТАЕСАТССТТСССААТЕСААСТТСАА

СТАССТСАССАССТТТСТТСАААСААТТАААСАСАСАТЕААСАСТСТСААС

БТСААСАТАСТССАСАЕАААСААССАТСАТТЕЕАТЕСССС66САЕСАТТСБ

ТТССАЕТТСААТСТСССАСААААСААТТССАСС6ААССТССАТТССАСАСТ

- 39 017803

СЕЕААТТТАЕТААТАСААТТеббЕСАЕЕСТСЕАТЕбЕТААЕЕТСАААЕТСЕ ССАААСАТАЕАЕТСАСТСАСЕАЕЕТАТбтеССАТСААААТАОТСАТТАЕЕТ САЕССААААТСТСССАЕАЕАААТСАССААААСЕАТССАЕААССТЕАААСТ ЕААСААААААСАААСААССТЕССТеАТбААТАСААСААЕЕААТТЕСААСО ССАТЕААССТАСТЕТСАСАЕАЕЕСАССАСТАССЗАААААТААТСТАССАССС АААТАТТТЕТССЕТТСТТСЕААТЕСТАТАСААТЕТСТААТСАСТАСТАСАТС СТТТТТЕАААТАСТССАЕЕСЕЕТАСАСТТАСТЕЕАТТАТАТТСТТТСТСАТЕ ЕСАААТТЕААЕСАААСАСССЕТТСЕССАЕТТТСССАСААЕСАТТССТТСТЕ СТТТАЕАТТАСТЕССАТТСТААТААСАТССТТСАСАЕАЕАТСТСААААТТЕА АААСАТААТЕАТТААСАААСАЕЕЕТЕАААТСААЕТТЕАТТЕАСТТТСЕССТ ТТССААСАТ6ТАТЕАТАЕААЕАААТСТССТЕААААССТТТТЕСЕЕСТСССТА ТАСТТТЕСАССАЕСЕСАЕСТТТТЕТСТТСССеТЕСТТАСАТТЕЕТССТЕААА ТТЕАТеТСТЕЕТСТТТТЕСеЕТТЕТАТТАТТтеТССТТСТТТСССЕТААЕЕТТ СССТТТЕАТСАСЕАСАЕССТЕССАААЕСТТСАТЕСТААААТСААААСАЕЕА ААА0ТТЕАСТАТССТЕА6ТТТАТТТСАССТТТАТЕТСАТТСАТТЕСТАТСТСА ЕАТбТТАЕТСеттААТССАЕАТСАТАСАСТСАСТТТСАААЕСТЕСААТССА ЕСАСССТТССАТЕАССТТАЕЕАТТТССАСССССТССАТСАААСТАТСТСССТ САССССТСАССТАТТЕТАТТАССЕТТСОАТТТААЕТЕТАЕТААЕАСАЕАТТЕ САААТСТЕССТТТАССАААТЕААСААСАААТТЕСТСЕАСАТАТЕАСАААСС ТЕАТСТССАЕСАСАСААТАТСААСССТЕТСТТСАСАСЕТСЕАААСТТСАТС ААСАСАААССТААТАТСААЕЕЕСТАТТССЕСЕСЕТСАССАТТСТЕСТАТСА ТСЕССТТССАССССТТАСТТТСААССТАСТАССТСЕТЕЕАТЕАААТеАЕЕАА ЕАЕЕААССТАЕСААААЕЕТССТСТСААЕСЕАСАСАССТССЕТАТТАЕАСАС ТСТСААЕСТСТСТССАЕАСАТТССАААЕАСАССАССТАТТССССАЕАААСТ АСАААСТАСЕЕАТСТЕЕААСАСССАТТЕСТТЕССАСТЕТСССАССТЕСТТА ТАСАТСТССССАТЕЕАСАСССАЕСТСААСТЕЕААССЕАГЕАТТСААССЕЕС АСАЕССА'ГТАТСТАСТЕСТСАТССТТТССАЕАТССАТАТСАСЕСАЕСААСА АСАТЕСТАЕСАЕАААЕАСССАТАТСААЕСАТЕСТССАЕААЕЕАСААСАТСЕ ТСОСЕЕСТАТААТЕТАСАСААЕААТААСТСТЕЕТЕСТСТТААСТСТТТАТТС ССААЕАСТСАЕТЕСААААСЕАССССАТААЕААТСАСССТСААТЕСЕАССС ТТСАТСТСССССАССТСААСТТСАТССАТТТТСАСТТААТЕАТесеЕАСАЕе АСТТСАЕТАСЕТЕбСЕТТТСАССААТТАСТСААССАбСТЕСТЕТЕААбААТЕ ТЕАССТССААТААСТССАААААСТАСЕТЕЕАСССТЕТТЕАТЕАТАЕТАААТТ АЕТТСЕТСЕТЕТАЕЕААЕТТТЕАСААТТАССААСАААбААААЕСААСААЕТ ЕАСАТСТСАСТТТССССЕАСТеСССААТТТТАСЕАТТССАЕАЕСААССЕССТ

- 40 017803

ААЕААТССТСССАТАСССАТАСАТЕСССААССТАССАСТАСАСЕТАСААСС

ТТТСААТССААТСАТСАТСАААТСАААААЕААЕТТАСАЕССТТССАСТАСТ

ССАААССААСААСЕТеЕЕССТССААСАТТЕЕСТССТАСТСААСАСАСАССЕ СТАСАТСССАСТССЕАЕАСССААЕТСАСТТССССАТТСТСССААССААТСЕ

СТТААТТТСАААТТСС6А66АССАССАААСААТСААТТАССТСССТТСССТА СТАААСААААТТАТЕАТЕтеТТТСААСАТССССАААТТАСССАТААСААТТТ АТТАААСССАЕААЕ66АААТАСТСТССТААТАСТААССТССАТАТСАААСС ААТСАСАСААТСССАААТТТТАТТТЕАСССАЕААСАТЕСТССАССТеСААС ТАТССССТСАЕТТЕАЕТАССССАЕЕАССТТСТТТСТСАААССАТТТТТСТСТ

СТТСАЕАСТАСАТССТССАА5ССЕТТАССТСТТАТТССАТАСААСАТТАТАС

САССТСТСТССАААСТТААСАТТСААТТСАСТЕААСТТААСССТСССТТТСТ

ТТЕССТТТАСАЕАААААСТЕААААТТТАСАААТТССССАТАТСАСАТСТСС

АЕТТАТАбАСТСААСАЕТСАССЕАТСАСАСТеАСТСССАТСТТССАААСТС ТТССАААТТЕТСАТСТТССТСААСАЕССААТАССАСАСТСААТСТТАТТСАС

САТСАТАЕТТСАТСССССТССТСАССАА6АТТСАААСАТСССССАААСТТТ ТСТСТТСЕАААСЕСААТССТТААССАТАТААССАААСССАСССТТСАСССС АСАСААТТТСАТЕАСТАССАТССААСССТАААТАССССТСТТАСТССТССА ССТЕСАААТСТТСАТТСТСЕТТСАТССТСТТАТСАТАСССАСАСТСАТААТС АСТССАТСОАЕТСССТССАТСАТАТААСАССТСССАСТСАТАТСАТСТТСА ААААТСТТССАЕАААСАААТССТАСАСАСАТАСАСАСАСТСААССААеАС САААСАСАТСАТСАТСАТСТТЕСТАСТАТСААССААССАТСААСАСАСССТ АСАССТТТЕАААТТТЕАААТТСАТАТТСТСАААСТСССТСТССТТЕЕАСТАТ

АТСеТСТСАСеТТСААЕААААТТСТСббАААТССТТбеАТТТАСААААССТ

ТСеССТСАААССТЕСТАСААЕААТТЕААТТТАТАЕТТС

ЗЕС31 рагЪ1а1 (ЗЕ<3 Ш N0 49);

КРРА06211 - РхсЬха разЪогхз (16-66)

АТССТСААААТААСТЕАААТАААААЕТАСТТСААСАТТТССАТССТССТСТСТ АСАСТСТААТЕТСТТСССТАСАСССАССТтеССТССеССТСТТСАССАСТСАТ ТСТСТАССАСТТС6ТСАТТСЕААСТТТСС6АТСТССТ6ААСАССТСАССТСССА ТАТТСССААССААТбТТССТССААСАТТТСАТЕАТСТТеССТббАЕТААТССА АТСТСТААЕТАССАСАСА66АСТАСТТССАССТССТТТТСАТААТССААСААТ ТСААТТСТСЕСАТТССТСАТСАТТССТСААТССАТСАТСТЕАСАСТТТААТАСА ЕСТАААСАААСАСАСТЕССССТЕТТААААСААТАТСТТТСААТССТАСАЕАЕТ САСАСАТАТТТЕСАТСТССТССТТССААТСбССААТТАТТСАТТТЕССАТАТАА АТСАТСТТТСАЕА6ССТАТТТСАСС666ТССТТСТАСТАССССТАТТААТ6АСА

- 41 017803

ТАААСТССАТТССТТССААСТССААСАТАССТСАТАТТТТСЕССТСТССТЕСА

АССТСАСССТАСЕСАТССАТТТЕЕСАТТТАААбАССААСАААСААСТАТТБАА СТТЕАЕТТАСАСТеСТССАТСАЕСТСАААбАЕСТААСТТААССАСССТТЕСАТ СОСАТССТАСТААТТСЕАСААСТСТААТААСАССТТСТЕАТТСЕЕАСССТЕТА ССАТТОАТААТБАСТТЕБОАТТТААССААТАСТААТСТАССТСТАССТАСТСТТ СААССТСАТСААААССЕТЕТАТТСТСССТЕСАТТССТСТТССТСЕЕАСТСАЕА АСТАТТАСТТТСТТСТСЕАААССАТААСТСТАСССТАТТСТССААТСССАТСАЕ АСССТСТТТСТТАЕСССААТАСССААССАССАСТААТТЕОЕССТТСААСАССС ССТТТТСТТССААЕСТТССТЕАСАТТТТТбСААССАСТТСАТТТЕАТЕЕТААЕА

ТААССЕТЕСАСАССТТАСАСЕАТАСТАСАССТССАЕАСССТСААСААЕСААА

АССТАТСААССАТЕАССААТТСТЕЕССАСАССТСТССААСАССЕАТААЕААА САТССТААТТТТТТАСААССТСАААСТССЕСССТББСТТАААСТСССТТССАС ССТТТСАТТТССАТТТССТССАААСАТтеТААААЕТТТССААЕЕССТСТЕАТАА ССАЕТСААТТЕТТСТААТТСАТААТТТСАСААСТААССАТАСССТСЕССААЕТ ССАСТТСССТТСТТССААЕСАССАТСАЕСАСАААССАТТАССАААСТСТТЕТС

САССАААААСТТССТАССЕААЕСАААТААССАССАСТббСААТТАТТЕААСЕ

АТСТАТТААААЕСССАТЕАТСТСАААСАТТАТТТСАСАТТТСАЕАТТЕТЕЕАТ

ССТТСССТАТТЕАААСАТЕАСААСТСТЕААСААААСЕТТСААААСЕЕАСААЕ

АСАТАТТТСААААСАТТЕАССАААСТЕАТСААСАСТТТТТСААСААТСТТЕАА

А555ААААСААТТСАСТТТСТСТСААСАТТССАТСАТАСТСТССААСТЕСТСТ САСССАССЕАСТААТССАЕСАСССТСТАЕТАТТСССТТТАБЕТеСАТСТСААТ САТТАСАСЕСТАААЕТТАССААТЕССТАТТТТААССАААСеСААААЕТССТСТ

СТАССААСАТТСАТТТАСАСТССТАСТССТААССАТ6ТТААТ6АССТССТТ6СТ

ААТСЕТАСТАТСТСТЕЕТТеЕАЕееАТАТАеСАбСТССТАТТТТТЕСТТАСТСТ

АСССАЕАААЕААЕАЕТТТТСАААЕТТСАТТЕТЕСААСТАС6ТСАТА66СТАТТ

АСССАСТТСССТТТСАСАТАЕАСССТСТСАТССТСТССТТТССТТССТТССТСС

ТЕЕТЕСЕСТСААСААЕССЕТСТАСААТТТЕ5ААТССС6АСТТСА6ТТСТССТС

ААЕАССТТСТСАААТСТЕААААСССТСАССТСТСАТСТТАТЕААССТСАТААТ АТТЕТЕТТЕАСТЕАЕТТТЕТТОААААААТТСССССАТТСААбТАТССАТТААС ЕАТСАЕСААТААЗТТСАСТЕОЕСАЕЕЕСЕТТААТАСбттеААСААТТСАТТСС ТАеАеТТТССТТСТТТССТЕТСАТСТСААЕСЕСААТТТСАТТТЕОССТТСААСТ ТАТТЕЕАСААСТТАТСТАССЕАЕСАТСААСАСАТТАААСТТСАЕАТАААССЕА АТСТСААСАЕСАТСАСЕАААААСТСТТТССАСТА

КРРА07281 - Р±сЫа рагЪогхз (1С-66)

ТССТСССЫСССТСАССССТСССЕИССТТССССТАТСССАТТТССАААЕЕТСТ

- 42 017803

ТСТСЕТЕОАЕЕСТСАТТСТССБТТССАССТССТААТССАТАСЕТАББТАБСТ

САСТСААТЕССААТЕСАССАСТЕСАСОЕАСЕСЕСАССАОСТАТССОТЕТТБ ссаасаасссттатсстаасаасаатсаааатссатсататсессааесаа АССЕТССАСТАААТЕСАТТТСТАССТСССССАССААТЕССТЕАЕААААТСЕ

БАБЕАСТТТССТСАСАБААТТАССССААЕАСАЕСАБСААСТАЕАССАААТА

ЕСАСТЕСТС6АТАТССБССАТСАСТАА6АТСЕСССАСТСТЕСААСААТТТС

ААССАССАССАССТССББСАСТАБСТСААСАТЕТБСААССБССАССАССТС

СТБААСТАБТТСАБСАЕ6ТАССТССАССС6С0ССЕТСТЕТАСААСАССААБ

ТАТСАСААСЕАТСТСААЕБАТОТСААЕЕТССОСОСССТССАСААСААСАБА

ССАЕАТТТСССАСТСЕАЕАТАеАТСАСАТАТААЕТСАТСАСЕСТТТСССТАТ

ТТАТСАЕТАССТСАСТААСЕАЕТТССААААТЕТТААСССТААСАТТССАЕА

ААЕАТТТАССАААСААСТСЕТАЕАСССТеАЕААЕАБАТТЕААТАТСТТСТТ

ТЕАТСАТТТСААТААСААТЕАБСТСТТААССеСТССТАСЕАТТАСАСТСТТЕ

ТСТААТСТТТСАААСТСТСТАЕСТСАССАТЕАСТТТААСАСТССТЕААТСЕТ

ТАСТбАТТСАААТТАСТАССАТТСАТААСААСБАСЕСАССАААСТБЕАССС

ТТЕЕТЕТЕАААЕСТСТТАТССАСАТЕТССТССССТСТСАСТАССТААСАА

ЗЗА4 (ЗЕО Ιϋ ΝΟ 50); ΚΡΡΑΙ 0651 - Р1сЫа разЬогхз (1С-66)

АТЕбЕТАААТСААТТСБААТТЕАТТТСЕЕТАССАСАТАСТСТТЕТОТСССАС

АТТТТЕОТААТЕАТСЕТЕТТСАСАТСАТАССТААСЕАССААСЕТААСАЕЕА

ССАСТССАТСЕТТССТСбССТТТАСССАСАСТЕАААСАТТБАТТеОТБАТЕС

ТССАААЕААССААЕСТСССАТЕААТССАССТААСАСТЕТТТТСБАТЕССАА

АССТТТААТС6СТА6АДААТТС6АССАССС5ЕАААСТСАЕБССЕАТАТТАА

БСАСТТСССТТТСАААБТТАТСААСААЕБЕЕ0БАААСССТААТАТССАА6Т

СБААТТТААБББТбАБАСТААЕБТТТТСАЕСССССААЕАСАТТТССТССАТ

0БТТСТААСАААААТЕААЕЕАТАСТССТСАССАЕТАТТТ6ССТ0АСААААТ

СААССАТССАСТТОТСАСТЕТТССТССТТАСТТСААТОАСТСТСАААСАСАА

СССАССААССАТССТЕСТТТБАТтеСТББТТТБААССТТСАААБААТСАТТА

АТСАБСССАССБСТБССБСААТТБСТТАССЕБТТСбАСААОААЕОАТЕСАБ

БССАСБЕТБАССАСААСАТТСТААТСТТСБАТСТАбЕТЕОАЕЕААОТТТСЕ

АТЕТТТСТСТАСТАТСТАТТЕАТОАЕЕЕТАТТТТСОААЕТСААЕЕССАССБС

АСЕТСАСАСССАСТТЕССТССТСАССАСТТСЕАТААСАЕАТТАЕТСААССА

СТТТАТСССССАСТТСААСАСАААСАССААСАААСАТСТТТСТАСАААССА

БАСАТСССТТАБААБАС.ТААБААССБСТТБТБАОСБтеСАААСАЕААСТТТ

ЕТСТТСТТСТССТСАСАССТССАТСЕАЕАТТЕАТТСТТТЕТТСЕАОЕЕТАТС

САСТТСТАСАССТССАТСАСТАСАССТАЕАТТСЕАССАССТСТОТОСССАС

- 43 017803

ТТСТТСАбАТССАССАТССАЕССТЕТТСАеАбАСТСТТЕАААСАСТССААС

ТТССАСАААТСТСААСТТСАТЗАСАТТСТТТТбЕТТСЕТеСТТСТАССАЗАА

ТТССАААССТТСАЕАААТТАЕТТТСТЕАСТТТТТСААТССТААСЕАСССААА

СААЕТССАТСААСССАСАССААеСССТТССАТАТССТССТССТЕТССААЕС

АЕСТАТТТТСТСТебАЕАТАСТТСТТССААСАСАСААЕАСТТСТТАТТССТЕ

САТСТТЕСТССТСТАТСТТТеСЕТАТТЕАААССССТЕСТЕЕТАТСАТСАССА

АеСТОАТСССААЕАААСТССАСААТСССАЕССАААААСТСАЕАААТСТТТТ

ССАСАТАТЕСТСАСААССААССАЕЕТСТТТТСАТТСААСТСТТТЕААССТСА

ЕАОААСТАЕААССААЕЗАСААСААССТЕТТЕСЕТААЕТТТЕААСТТТСТЕЕ

ТАТТССТССТССТССААСАСЕТСТТССТСАААТТСАЕбТСАССТТССАТАТС

САТСССААСССТАТТТТСААТЕТАТСТССТСТТСАСААЕСЕТАССЕСТААС

АСТСААААСАТТАСТАТТАССААССАТААССеААБАТТСТССААЕЙААСАС

АТСЕАСАЕААТОЕТТТСТЕААССТОАААААТТСААОЕАТОААОАСЙАСААЕ

СААССССАСАСАСТТССТСССААЕААТеССТТЗСААТСАТАТССТТАСТСТ

СТЕААСААСТСТЕСАССТЕААТСТОЕАТТСААСЕАСААЕСТТЕЙАЙАСЕАТ бАТСТТСССААбТТЙААСААЙТСАСТТСААСАСАСААТАТСТТЕЕТТАЕАТ

САЕТСАСААТСТЕСТТССАСАЕАСЕАСТАСААЕЕАСАЕЕСААААОЕААТТЕ

6ААЕААСТТССТААСССААТААТСАЕСААСТТСТАТССАССТССТССТССА еСТССТЕЕТССАЕСТССТЕСТСБСТТСССТССАЕСТТТСССТСЕСЕЕАЕСТС

ССССАССТСССССТЕССССАССТЕСТССТСССССАСеССЕАЕАСАЕСССА

ССААСССТЕСААСААСТСЕАТТАА

25Е1 (5Е<2 Ιϋ N0 51) ; ΚΡΡΑΙ 0049 - Р±сН±а разЬог±а (1С-66)

АТЕАЕТЕТТССАТТТССАЕТАЕАТСТАСЕТААСААСААСАСТСТЕАТСЕЕТ еТТЕСССбТААСАСАССТАТТСАТАТТСТТЕТСААТЕААСТСТСТААТССТС

АСАСССССАССАТТСТСССАТТТСССЕСТААЕТСТАСАСССАТСееСеААТ

САЕЕАААСАСССААСАСААСТСТААСТТбААЕААТАСССТТСААСАТТТей

ТССЙТАТТСТССЕЕСТТССТССАСАСТСТССТЕАСТАТСАААТТЕАСААСАА

СТТСТТСАСТТС5ССССТ5АТТСА6ААСЕАСААТСА6АТССТСТСТСАА6ТТ

ААСТТССААЕСТААСААЕАСТАССТТСАСАСССАТТСАЕСТОСТТЕССАТЙ тасстеаасаасаттаайаасастессатаааесааасааассеаааетт САСТЕАТАТСТбТСТТЕСТСТСССТбТТТеСТТСАССеАЕАААСАеАСААЕТ

ССТЕСТТСССАТЙСТТСТААССТТССТСЕТСТЕААСССАСТТАЕААТТЕТСА

АСЕАСАТСАСАССТССТЕСАСТТеСАТАТЕЙТеТСТТСААЕАСТСАССТАС

САСАСЕАТЕААСССААСААССТТССААТСЕТТСАТАТАССССАСТСТАССТ

АТТСТеТТТТбАТТССТЕСТТТСААеАААЕСТбАЕСТСАААСТЕТТАССАТС

- 44 017803

ТЕСТТСТ6АСААБСАТТТС66Т6БТСЕТ6АТТТССАСТАТБССАТСАССААЕ

САСТТТБСАБАббАОТТСААОАБСАААТАСААБАТТЕАТАТСАСТСААААТ

ССТААБССТТББТСТССТСТТТАСАСТБСТБСССАААССТТСААСААЕЕТТТ

Т6ТССССТААСАСТАСАБСТССАТТСААТЕТТСААТСТСТТАТ6ААССАССТ

ТСАТСТТТСТТСТТСССТСАСТАСАСАССАСТТАСААААССТССТССААССА

ТТАТТАСАСССТССТСАТАТТССССТТСАСССТССТСТССССАТСССАССТС ТСААБССТБААеАТСТЕСАСАСТБТТСАССТТЕТСОЕАЕЕТТЕТАСТССТЕТ ТССААССТТБАААССТАСТСТАТСТСААСТСТТТССАААССССТТАТСТТТС АСТТТАААССААСАТЕАЕЕСААТТЕСТСбТббТССАБСТТТСАТСТБТЕСАА ТССАСТССССТАСАСТТАСАЕТТССТССАТТСААЕТТТБАОБАСБТТААССС ТТАСТСТБТ6ТСАТАТТАТТ6Б6АСААА6АТССТ6ССБСТБАБ6АС6АТЕАС САСТТАЕАебТСТТСССАБТБЕСТССТТСТТТСССАТСААСТААбБТЕАТСА САСТТТАСС6ТТСАСАА6АТТТСААСАТТБАА6ССС6СТАСАС66АСААБА АТ6САСТТССА6СТСЕСАСТСА6БА6ТТСАТТБ6СА6БТССА0САТСААЕЕ БТЕТТБТТСТСААТСААББТбААСАТАСТАТССАСАСТААБАТТААССТБА БАААТБАТССАТСТББТТТССАТАТССТСБААТСТБСТТАСАСАБТССАБАА БААЕАСТАТТСАА6АБССААТС6АББАТССАСАА6СТЕАТБААБАТ6САЕ ААССТСАБТАСАББАСАЕТТБАОААБСТСЕТСАААААСААССАСТТЕСАС аттастсеасасасастссасстассасатсасстаттааастсттатсттс АЕАСАЕАЕЕСТЕССТТАЕАССТССААЕАСАААСТТБТТБСАСАСАСССАБО АССССААЕААСССТСТССАСЕАСТАСАТТТАССАЕСТТАСАЕСТААЕТТЕЕ ААЕАССАСТАСААСЕАЕТТТЕСТАЕСЕААСАЕЕААААААССААЕСТТАСА ЕСТААОСТАЕАЕАААЕСТСАСБААТСЕСТТТАССАССААЕЕТТАТСАТТСТ АСТАААбСТААСТАСАТТЕСТАААТАСОААЕАССТТСССТССАТТССАААТ БТТАТСССАББТСЕТТАТСТТЕССАААЕАЕЕАЕСАЕААСАААСААССТАТС СБТБААААББААЕААТСТААЕААЕЕСТТСТЕСТАТСеСТБААААБАТБССТ БСССАССетеСТТСТСБТБААБСТБСТББТТСТАСАААТЕААСААЕСССАЕ ААСААТСААБААААСАССАААЕАТСССЕАССЕТЕАТетТТСТАТБААССАА ЕАТЕАБСТАЕАТТАААСТ

Пример 3. Клонирование молекулярного скелета вектора рРи//1е.

Для конструирования новой векторной системы рРи//1е фрагмент 2884 п.о., несущий сайт инициации репликации и маркер селекции для Е.со11 (АтрВ-кассету), амплифицировали из обычно используемого клонирующего вектора рВВ322 (Еегтеи1а§ Ь1Ге 8с1епсе, Сегтаиу, #8Ό0041 рВВ322 ΌΝΑ) при помощи ПЦР. Два не кодируемых матрицей сайта рестрикции добавляли с использованием прямого праймера рВВ322_ЕОВ_№П и обратного праймера рВВ322_ВАСК_№П. Этот ПЦР-фрагмент использовали в качестве челнока временного сайта инициации репликации и маркера селекции для амплификации искусственного сайта множественного клонирования в Е.со11. Синтетический ДНК-фрагмент 244 п.о. (синтезированный и субклонированный в сайте ЕсоВУ плазмиды рИС57, Сепе8спр1 Согр. РРсайпуау, N1 08854 И8А) вырезали и лигировали с обработанным и щелочной фосфатазой челночным фрагментом и амплифицировали в Е.сой. Полученный продукт был назван рВВ322¹/2ат1МС8. Для генерирования рЕВ^^З'/заПМС^ОВ! фрагмент 670 п.о., несущий сайт инициации репликации из коммерчески доступного клонирующего вектора рИС19 (Ееттейак Ь1Ге 8с1еисе Сегтаиу; #8Ό0061 рИС19 ΌΝΑ; основания 812-1481) амплифицировали при помощи ПЦР с использованием прямого праймера рυС19ОΒI #18аО и обратного праймера рυС19ОΒI #2-8а^ и клонировали в уникальном сайте 8аО рВВ322¹/2ат1МС8.

Для генерирования молекулярного скелета вектора рРи//1е (см. фиг. 1) ген устойчивости к ампициллину (РСВ-амплифицированный из рИС19 с праймерами атрВ#1 ΗίηάΙΙΙ и атрВ#2Н1и4Ш) клонируют в сайт рестрикции ΗίηάΙΙΙ рВΒ322¹/₂а^ιΜС8_ОΒI, полученную плазмиду разрезают ΝθΐΙ и повторно лигируют.

В следующей стадии клонирования терминатор транскрипции гена цитохрома с из 8.сегеуыае (фрагмент 276 п.о. 3'-района гена цитохрома с, изоформы 1 гена СУС1 из оснований 526663-526937 хромосомы X 8.сегеуыае) амплифицировали при помощи ПЦР (прямой праймер сус1ТТ_иете_РОВ_ВатШ и обратный праймер сус1ТТ #2-АдеБ для геномной ДНК и инсертировали в сайт ВатН и Α^Ι (обработанные щелочной фосфатазой) рВΒ322¹/₂а^ιΜС8_ОΒI с получением вектора, названного рВΒ322¹/2а^ιΜС8_ОΒI_сус1ΤΤ.

- 45 017803

Пример 4. Конструирование экспрессирующего вектора рРихх1е_хеоВ_еСРР.

Маркер селекции зеоцина для Е.соИ и Р.разФпз состоит из ОВР гена 81 Ь1е из 81гер1оа11о1ею1ш5 ЫиИийаиик под контролем промотора ТЕР1 (фактора 1 элонгации транскрипции) из 8.сегеуыае и искусственного промотора ЕМ7 Е.соИ. Ген 81 Ь1е фланкирован терминатором транскрипции гена цитохрома с из 8.сегеуыае. Промотор ТЕР1 (5'-район промотора ТЕР1 альфа оснований 700170-700578 хромосомы ΧνΙ 8.сегеуыае) амплифицировали при помощи ПЦР из геномной ДНК 8.сегеуыае с использованием прямого праймера 7еоВ_иеи_#1_кри1 (с добавлением не кодируемого матрицей сайта и обратного праймера ТЕР1_Ьаск:_#1. Искусственную последовательность промотора ЕМ7 Е.соИ и сайт рестрикции №о1 добавляли на 3'-конце промотора ТЕР1 удлинением праймера с использованием прямого праймера 7еоВ_иеи_#1_кри1 и обратного праймера ТЕР1_Ьаск:_#2№оР Полученный ПЦР-фрагмент обрабатывали ΝΜ и сливали с сайтом ΝΜ 5'-конца ОВР гена 81 Ь1е. ОВР 81 Ь1е амплифицировали при помощи ПЦР с использованием прямого праймера 81 Ь1е_РОВ_#1_NсоI (с добавлением не кодируемого матрицей сайта ΝΜ) и обратного праймера 81 Ь1е_Ьаск_#2_АаИ (с добавлением не кодируемого матрицей сайта ЛаИ зИе) из плазмиды рИТ737 (Сау1а Тои1ои8е, Ргаисе рИТ737 са1а1од # νΈ^ 7371). Продукт этого слияния использовали в качестве матрицы для ПЦР (прямой праймер 7еоВ_иеи_#1_кри1 и обратный праймер 81 Ь1е_Ьаск_#2_АаИ) с получением фрагмента 893 п.о.

Терминатор транскрипции гена цитохрома с (СНС1) из 8.сегеуыае (ген цитохрома с, изоформы 1 гена из оснований 526663-526937 хромосомы X 8.сегеу151ае) амплифицировали при помощи ПЦР из геномной ДНК с использованием прямого праймера сус1ТТ_РОВ_#1_ааИ (с добавлением не кодируемого матрицей сайта АаИ) и обратного праймера суДТТдющЬасМЦэЫ (с добавлением не кодируемого матрицей сайта обрабатывали АаИ и сливали с обработанным АаИ гибридом 893 п.о. промотора ТЕР1 и ОВР 81 Ь1е. Эту содержащую ген зеоцина кассету с конечным размером 1170 п.о. амплифицировали при помощи ПЦР с использованием прямого праймера 7еоЯ_иеи_#1_кри1 и обратного праймера сус1ТТ_иеи_Ьаск_Κри1. Этот продукт ПЦР очищали электрофорезом в агарозном геле и фрагмент правильной длины использовали в качестве матрицы для второй ПЦР. Второй фрагмент ПЦР обрабатывали клонировали в сайтах вектора рВВ322¹/2а^ίΜС8_ОВ[_сус1ТТ с получением вектора, названного рВК322¹/2аПМС8_ОК1_сус1ТТ_хеоВ.

Для интеграции векторной системы рРихх1е в геноме Р.райопз было решено использовать последовательность-мишень в 3'-зоне гена АОХ1 Р.разФпз. Два фрагмента 400 п.о., названные АОХТТрагН и АОХТТрагН (последовательности из базы данных Щед^еИ-Сеиот^, СНсадо И8А, ЕВСО, Р.разФпз Ю66 Контиг из 1471 основания 52189-52588 и 52589-52979) амплифицировали при помощи ПЦР из геномной ДНК Р.разФпз. С использованием прямого праймера 5_АОХ ТТ #1 НтИШ^оП и обратного праймера 5_АОХ ТТ #2 АМ/ВатЮ, не кодируемые матрицей сайты рестрикции НшИШ и №И добавляли к 5'-стороне, а сайты рестрикции АзН и ВатШ добавляли к 3'-стороне фрагмента АОХТТрагН. Для добавления 5'-сайта ВатШ, 3'-сайта №И и 5'-сайта ЕсоК! к фрагменту АОХТТраИ2 использовали прямой праймер 3_АОХ ТТ #3 ВатШ и обратный праймер 3_АОХ ТТ #4аNоΐI/ΕсоВI. Для сборки АОХТТрагН и АОХТТрагН в соответствии с их ориентацией в геноме фрагмент АОХТТрагН субклонировали в сайте ЕсоВУ р8ТВ1ие-1 с использованием наборов для клонирования №уодеи РегТесИу В1ии1® С1ошид Κΐΐδ, р8ТВ1ие-1 (Мегск Вюзаеисез, Сегтаиу). Фрагмент 500 п.о. амплифицировали при помощи ПЦР с использованием прямого праймера Т7 и обратного праймера 5_АОХ ТТ #2 АзН/ВатН! Этот фрагмент разрезали ВатШ и лигировали с обработанным ВатШ фрагментом АОХТТрай2. Эту смесь для лигирования использовали непосредственно в качестве матрицы для ПЦР с использованием Т7 в качестве прямого праймера и 3_АОХ ТТ #4NоΐI/ΕсоВI в качестве обратного праймера. Фрагмент правильного размера (~900 п.о.) очищали электрофорезом в агарозном геле и использовали в качестве матрицы для второй ПЦР с 5_АОХ ТТ #1 НтИШ^оИ и 3_АОХ ТТ #4№Н/ЕсоВР Присутствие сайта рестрикции АзН в середине этого ПЦР-фрагмента проверялось по продукту расщепления эндонуклеазой АзН полученного фрагмента 800 п.о., названного АОХТТрагН + 2. Для удаления челнока рВВ322 в векторе рВВ322¹/₂а^ίΜС8_ОВI_сус1ТТ_ζеоВ, его разрезали при помощи №И и молекулярный скелет вектора 2270 п.о. рРихх1е_хеоВ отделяли от челночного фрагмента 2884 п.о. рВВ322 электрофорезом в агарозном геле, обрабатывали щелочной фосфатазой и лигировали с обработанным ΝθΙΙ фрагментом ПЦР АОХТТрагН + 2. Полученный вектор был назван рРихх^хео^АОХТТ.

С использованием молекулярного скелета вектора рРихх^хео^АОХТТ ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (еСРР) инсертировали в МС8 с использованием сайтов рестрикции 8ЬН и 8ίϊΙ. Ген еСРР (718 п.о.) амплифицировали при помощи ПЦР, например, из вектора рс^NА™6.2и-ΕтСРΡЭЕ8Т (ШуЦ-одеи АизИа). Два не кодируемых матрицей сайта рестрикции 8ЬП и 8Ρ1Ι присоединяли удлинением праймеров с использованием прямого праймера еСРΡ#1Ла^[/8ЬΠ и обратного праймера еСРР#28Ш. Обработанный 8ЬН и 8ίΐΙ ПЦР-продукт еСРР инсертировали в обработанные щелочной фосфатазой сайты 8ЬН и 8ίΐΙ рРихх^хео^АОХТТ. Полученный вектор был назван рРихх1е_хеоВ_еСРР.

В табл. 5 суммированы последовательности праймеров ПЦР, использованные в процедурах клонирования примеров 3 и 4.

- 46 017803

Таблица 5

Праймеры ПЦР для клонирования ρΡиζζ1е_ζеοΒ_еОРΡ (81Т) ΙΌ N0: 52-8ЕЦ ΙΌ N0: 74) ρΒΚ322_ΓΟΚ_Νοί! (5Е<2 Ю N0 52) ;

5' - ААТАССЕЕССЕСЕСАТСТСССЕСАЕССТТССЕТССТЕ - 3' рВВ32 2_ВАСК_Ио£I (ЗЕО Ю N0 53) :

5' - ЕАТТСССЕССССЕАССТСАЕЕТЕЕСАСТТТТСССЕСАААТ - 3' рис190К1 #1 -Зас1 (ЗЕф Ю N0 54):

5' - ЕАТС6АССТСТСАССААААССССАССАААЕ - 3'

Рис190К1 #2-Зас1 (ЗЕО 10 N0 55):

5' - САААСАОСТСССетАСААААСАТСАААСС - 3' атрК #1 Ηίηό III (ЗЕО Ю N0 56):

5' - ЕСССААЕСТТАСААТААСССТСАТАААТСС - 3' атрК #2 Ηίηά III (ЗЕ<2 Ю N0 57) :

5' - ЕСССААЕСТТАААТСААТСТАААЕТАТАТ - 3'

сус1ТТ пеи Е0Е ВатН1 (5Еф ϊϋ N0 58): 5Г - СААТССАТССССТТТТССТТТСТССАТАТСАТСТААТТАСТТ - 3'

СУС1ТТ #2-Аде I (5Е<2 10 ЫО 59) ; 5' - ЕТЕСАССССТАССТТЕСАААТТАААСССТТССАЕ - 3'

геоК_пеи_#1_крп I (ЗЕО 10 N0 60): 5' - САТСЕЕТАСССАСАСАССАТАССТТСААААТЕТТТСТАСТССТ - 3'

ТЕЕ1_Ьаск:_#1 (ЗЕО Ю N0 61 ): 5' - ТАСТАТССССАТЕАТТААТТСТСААСАССЕСССТТАЕАТТАСАТТЕСТАТ ССТТТСТТТСТА - 3'

'1Ег'1_ Ьас:к:_у-2_Нсо1 (ЗЕС 10 N0 62) : 5' - ТТССССАТЕЕТТТАСТТССТСАССТТСТССТАТТАТАСТАТССССАТАТА СТАТССССАТСАТтаАТТБТСААСАСССССС - 3'

ЗН Ь1е ТОК #1 Νοοί (ЗЕО Ю N0 63): 5'- ТАААССАТСЕССААСТТЕАССАСТССССТТССЕЕТССТСАССе - 3'

ЗН Ые_Ьаск_#2_аа£1 (5Е<Э Ю N0 64): 5' - ТСССАССССТССЕАСССЕТЕЕЕСССССЕТСЕСАССТеТСАСТССТЕСТС СТСССССАССААЕТССАСССА - 3'

сус1ТТ_Г0К_#1_аа£1 (ЗЕ<2 10 N0 65) : 5' - ТСССАССССТСССАСАТСССТСССССТТТТССТТТСТССАТАТСАТЕТАА ТТАСТТАТЗТСА - 3'

сус1ТТ пей Ьаск Крп1 (ЗЕ£> 10 N0 66) : 5' - АСАТССТАССТССАААТТАААСССТТССАеССТСССААААССТТС - 3'

капК #1-Κρη I (8Е0 10 N0 67): 5'’ - СССАССТАСССАСАТССАСССССА5ААТА - 3'

капК #2-Κρη I (ЗЕО Ю N0 68): 5' - ССЕАССТАССАСТАТАЕСЕАССАССАТТСА - 3'

5_А0Х ТТ #1 ΗιηάΙΙΙ/ΝοΡί (ЗЕО Ιϋ N0 69): 5' - САТТААССТТССССССЕСАСАСЕАТЕТСАЕААТЕССАТТТЕССТЕ - 3'

5_А0Х ТТ #2 Азс1/ВатН1 (ЗЕО Ю N0 70): 5' - ЕАТТССАТСССССЕСЕССОАТАСТСЕАОААТТАТЕЕСТТААТСААС ТС - 3'

З^АОХ ТТ #3 ВатН! (ΞΕβ 10 N0 71): 5' - САТТССАТССТАТЗАТТССААЗТАТЗЗСААТССТСАТАСС - 3'

3-АОХ ТТ #4 ЫоЫ/ЕсоК I (ЗЕО Ю N0 72) : 5' , ТАААСААТТССССЕССССАССААССТТСТСАСТЕААСТТСЕСАТСА - 3'

еСРР#1 Ааг 1/ЗЬ£ I (ЗЕО Ю N0 73):

5' - ЕАТССАССТОСАЕбССАТССТЕАССААССЕСЕАЕЕАССТЕТТСА - 3' еСБТ#2 3£И (ЗЕ<2 Ю N0 74) :

5' - ЕСАТЕССССАеССбЕССТТАСТТСТАСАССТСЕТССАТСССЕАЕАС - 3'

- 47 017803

Пример 5. Сравнительные исследования активности промотора дрожжей в Ρ.ра8ΐоπ8.

а) Стратегия амплификации и клонирования промоторных последовательностей из Ρ.ра8ΐоπ8.

Для идентификации новых промоторных последовательностей для применения в штамме рода Котада1ае11а для рекомбинантной экспрессии гетерологичного белка нормализованные сигналы всех измеренных генов, продуцирующих трипсиноген и не продуцирующих трипсиноген клеток соответственно, полученные из гибридизации с использованием микроматриц ДНК, описанной в примере 1, ранжировали по их относительным уровням экспрессии. Затем относительный уровень экспрессии каждого измеренного гена сравнивали между продуцирующими и не продуцирующими трипсиноген клетками. Из этих данных 23 гена с наивысшим уровнем экспрессии в продуцирующих трипсиноген и не продуцирующих трипсиноген клетках использовали для дополнительного анализа. Список генов, отобранных для дополнительного анализа, представлен в табл. 6. Далее, только такие гены, для которых доступны данные геномных последовательностей, были включены в этот отбор. Промоторные последовательности этих 23 представляющих интерес генов (до 1000 п.о. 5'-некодирующего района соответствующих генов) были идентифицированы с использованием базы данных генома ГфаЧопх (ЕК.СО™, Ю-66, Iηΐед^аΐеб Сепоткк) и амплифицированы из Ρ.ра8ΐоπ8 при помощи ПЦР. Кроме того, хорошо известные промоторные последовательности АОХ и САГ были амплифицированы посредством ПЦР из Ρ.ра8ΐоπ8 для сравнения (праймеры и последовательности праймеров см. в табл. 6 и 7). В 25 конечных стадиях клонирования эти 25 промоторов (в том числе две последовательности контрольных промоторов), полученные из Ρ.ра8ΐоπ8, инсертировали справа от стартового кодона гена еСΕΡ с использованием сайтов рестрикции АраХ и ЗЬП сайта множественного клонирования вектора рΡиζζ1е_ζеоΚ_еСΕΡ или в случае промотора ΕΈΤ3]31ό с использованием сайтов рестрикции АраI и АаН (см. табл. 6).

Таблица 6 Обзор генов, праймеров ПЦР, использованных для амплификации промоторных последовательностей, рестрикционных ферментов, использованных для клонирования этих промоторных последовательностей, и длин фрагментов этих промоторных последовательностей из Ρ.ра8ΐо^^8

Тен	5'-праймер	3'-праймер	Клонирующий фермент	Длина фрагмента
5'	3'
АОХ	Раск #1 Ара I	Раох #2 ЗЬ£ I	Ара I	5Ь£ I	1000 п.о.
САР	Рдар #1 Ара I	Рдар #2 ЗЪ£ I	Ара I	ЗЬГ I	480 п.о.
6ΝΌ1	РдпсН #1 Ара I	РдпШ #2 ЗЬ£ I	Ара I	ЗЬ£ I	ЮОО п.о.
СРМ1	Рдрт1 #1 Ара I	Рдрт1 #2 ЗЬ£ I	Ара I	ЗЬ£ I	1000 п.о.
НЗР90	РНЗР90 #1 Ара I	РНЗР90 #2 ЗЬ£ I	Ара I	ЗЬ£ I	ЮОО п.о.
КАН2	Ркаг2 #1 Ара I	Ркаг2 #2 Ара I	Ара I	ЗЬ£ I	ЮОО п.о.
МСМ1	Ртст1 #1 Ара I	Ртст1 #2 5Ь£ I	Ара I	5Ь£ I	1000 п.о.
РЕТ9	РреЬЭ #1 Ара I	РреЪЭ #2 ЗЬ£ I	Ара I	5Ь£ I	ЮОО п.о.
КАО2	Ргас12 #1 Ара I	Рга62 #2 ЗЬ£ I	Ара I	ЗЬ£ I	ЮОО п.о.
ΚΡΞ2	Ргрз2 #1 Ара I	Ргрз2 #2 ЗЬ£ I	Ара I	ЗЬ£ I	1000 п.о.
ЕР331	Ргре31 #1 Ара I	Ргрз31 #2 ЗЬ£ I	Ара I	ЗЬ£ Т	ЮОО п.о.
Ξ3Α1	Рз5а1__2 #1 Ара I	Рзза1_2 #2 ЗЬ£ I	Ара 1	5Ъ£ I	1000 п.о.
ΤΗΙ3	ΡίΜΙ #1 Ара I	Ρΐφίΐ #2 5Ь£ I	Ара I	5Ь£ I	ЮОО п.о.
ТРИ	Ρΐιρί #2 Ара I	РОр! #2 5Ь£ I	Ара I	1	1000 п.о.
ив!4	РиЫ4 #1 Ара I	РиЫ4 #2 ЗЬ£ I	Ара I	ЗЬ£ I	1000 п.о.
ΕΝΟ1	Репо #1 Ара I	Репо #2 ЗЬ£ I	Ара I	ЗЬ£ I	ЮОО п.о.
КР57А	Ргзр7 #1 Ара I	Ргар7 #2 ЗЬ£ 1	Ара I	ЗЬ£ I	ЮОО п.о.
КРЫ	Ргр1 #1 Ара I	РгрИ #2 ЕЬ£ 1	Ара I	ЗЬ£ Σ	1000 п.о.
ТКЫ	Р0к1 #1 Ара 1	РС21 #2 ЗЬ£ I	Ара I	5Ь£ I	1000 п.о.
ριει	РрЗз #1 Ара I	Ррл.5 #2 5Ь£ I	Ара I	ЗЬ£ I	ЮОО п.о.
ЕЕТЗ	Р£е£3'1 Ара I	Р£е£3 #2 ЗЪ£ I	Ара I	ЗЬ£ I	1000 п.о.
ЕТК1	Р££г1 # 1 Ара	ΡϊΈιγΙ # 2 £Ь£ 1	Ара I	ЗЬ£ I	ЮОО п.о.
ЫМТ1	РпглЫ #1 Ара I	Рпт£1 #2 ЗЬ£ 1	Ара I	5Ь£ I	ЮОО п.о.
РНО8	РрйоЭ #1 Ара I	РрЬо8 #2 ЗЬ£ 1	Ара I	5Ь£ I	1000 п.о.
ЕЕТЗрге	Р£е£3рге #1 Ара I	Р£е£3рге #2 Ааг 1	Ара I	Ааг I	ЮОО п.о.

Claims (6)

1. Промоторная последовательность дрожжей, выделенная из Пс^а ра51оп5 и идентичная фрагменту в 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена Τ4Ι3 (8Е0 ГО Ν^ 135) или соответствующая указанному фрагменту в 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена Τ4Ι3 (8Е0 ГО Ν^ 135) и имеющая его функциональные характеристики.

2. Эукариотический экспрессирующий вектор на основе молекулярного скелета рΡиζζ1е, дополнительно содержащий следующие компоненты, функционально связанные друг с другом:

рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую ΡΌI, необязательно связанную с лидерной последовательностью, эффективной для вызывания секреции Ρ^ из клетки-хозяина;

промотор, эффективный для контроля экспрессии белка в клетке-хозяине;

терминатор транскрипции;

маркер селекции;

последовательности гомологичной интеграции, либо последовательности автономной репликации, где промотор представляет собой промоторную последовательность дрожжей, выделенную из Ρ^сЫа раз1ог18, где указанная последовательность идентична фрагменту в 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена Τ4Ι3 (8Е0 ГО Ν^ 135) или соответствует указанному фрагменту в 1000 п.о. из 5'-некодирующего района гена Τ4Ι3 (8Е0 ГО Ν^ 135) и имеет его функциональные характеристики и где клеткой-хозяином является клетка дрожжей, предпочтительно клетка штамма рода Котада1ае11а, в частности клетка штамма Котада1ае11а разХопз, Котада1ае11а рзеибораз^опз или Котада1ае11а рйайй.

3. Применение экспрессирующего вектора по п.2 для рекомбинантной экспрессии Ρ^ в клеткехозяине.

4. Применение промоторной последовательности дрожжей, выделенной из Ρ^сИ^а ра51оп5 и идентичной 8Е0 ГО Ν^ 135 или соответствующей 8ЕР ГО Ν^ 135 и имеющей ее функциональные характеристики, для модуляции экспрессии гомологичного ΡΜ в клетке-хозяине.

5. Применение по п.4, в котором эта промоторная последовательность дрожжей имеет увеличенную промоторную активность относительно промоторной активности природной промоторной последовательности Ρ^.

6. Применение по п.4, в котором эта промоторная последовательность дрожжей имеет уменьшенную промоторную активность относительно промоторной активности природной промоторной последовательности Ρ^.