CN116490517A - 过表达翻译因子的宿主细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达目的基因(GOI)的重组真核宿主细胞，所述重组真核宿主细胞通过遗传修饰工程化以与所述一种或多种遗传修饰之前的宿主细胞相比，增加编码信使核糖核蛋白(mRNP)的翻译起始因子的两种或更多种基因(TIF基因)的表达，其中所述TIF基因至少包括编码eIF4A的基因和编码eIF4G的基因，并且其中所述TIF基因中的至少一者的表达在启动子(该启动子不同于控制所述GOI的表达的启动子)的转录控制下。

Description

过表达翻译因子的宿主细胞

技术领域

本发明涉及改善重组蛋白生产的产量和经工程化以增加一种或多种翻译因子的表达的宿主细胞。

背景技术

在重组宿主细胞培养物中生产的蛋白质作为诊断剂和治疗剂变得越来越重要。为此，对细胞进行工程化和/或选择以生产异常高水平的重组或异源目的蛋白(protein ofinterest)。

已经在细胞培养物中使用真核宿主细胞成功生产了目的蛋白(POI)。真核宿主细胞(特别是哺乳动物宿主细胞、酵母或丝状真菌、或细菌)通常用作生物制药蛋白质以及散装化学品的生产宿主。最突出的实例是甲基营养型酵母(methylotrophic yeast)，诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，其以高效分泌异源蛋白质而闻名。2005年，巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)已经被重新分类为新属孔玛氏酵母(Komagataella)，并且被分为三个物种，巴斯德孔玛氏酵母(K.pastoris)、菲氏孔玛氏酵母(K.phaffii)和假巴斯德孔玛氏酵母(K.pseudopastoris)。通常用于生物技术应用的菌株属于两个提出的物种，巴斯德孔玛氏酵母和菲氏孔玛氏酵母。菌株GS115、X-33、CBS2612和CBS7435是菲氏孔玛氏酵母，而菌株DSMZ70382被归为巴斯德孔玛氏酵母模式种，它是所有可用的巴斯德毕赤酵母菌株的参考菌株(Kurtzman 2009,J Ind Microbiol Biotechnol.36(11):1435-8)。Mattanovich等人(Microbial Cell Factories 2009,8:29doi:10.1186/1475-2859-8-29)描述了巴斯德孔玛氏酵母模式株DSMZ70382的基因组测序，并且分析了其分泌蛋白质组和糖转运蛋白。

核糖体是进行蛋白质合成的复杂核糖核蛋白组装体。信使核糖核蛋白(mRNP)是mRNA-蛋白质复合物，其中转录物由一组变化的蛋白质结合，该蛋白质介导构成转录物生命周期的共转录和转录后事件。转录物首先经过5'端加帽、在许多情况下的剪接、3'切割和聚腺苷酸化、核外泌体的mRNA质量控制以及输出因子募集。然后它们被输出到细胞质，其中一些在细胞质中经历特异性亚细胞定位。转录物最终会被翻译(常常以受控方式)并被降解。

翻译起始在重组蛋白生产的关键途径上。正在讨论由mRNA、多种真核起始因子(eIF)和核糖体蛋白质构成的闭环结构的形成有助于翻译起始，并且因此提高整体翻译效率。

Mead等人(Biochem.J.2015,472:261-273)描述了闭环的关键组分(eIF(eIF3a、eIF3b、eIF3c、eIF3h、eIF3i和eIF4G1)、poly(A)结合蛋白(PABP)1和PABP相互作用蛋白1(PAIP1))在30个生产单克隆抗体(mAb)的重组CHO细胞系的组中的mRNA和蛋白质水平。发现了高产细胞系以维持参与闭环mRNA的形成的翻译起始因子的量，从而将这些蛋白质维持在适当的水平以提供增强的重组蛋白生产。

eIF4F复合物由帽结合蛋白eIF4E、eIF4G和RNA解旋酶eIF4A构成。eIF4G是带有PABP(PAB1)、eIF4E、eIF4A和(在哺乳动物中的)eIF3的结合结构域的支架蛋白。酵母和人eIF4G也都结合RNA。eIF4G中eIF4E和PABP的结合结构域及其RNA结合活性使eIF4G能够经由mRNA体中的帽、poly(A)尾和序列协调与mRNA的独立相互作用以组装稳定的环状信使核糖核蛋白(mRNP)，称为“闭环”结构。

闭环模型提出mRNA的5'端和3'端经由桥接机制相互作用，该桥接机制由包括数种翻译起始因子在内的多个蛋白质介导。闭环的核心桥在5'-帽、eIF4F(由eIF4A、eIF4E和eIF4G组成)、eIF3、poly(A)结合蛋白(PABP)相互作用蛋白1(PAIP1)、PABP1和poly(A)尾之间形成。普遍认为，这种mRNA环化通过增强核糖体的循环和/或通过确保eIF4F保持与mRNA的栓系且不必在每一轮翻译起始时都从游离eIF4F池中重新募集而提高翻译率。真核生物中翻译的延伸、终止和循环阶段由Dever等人(Cold Spring Harb Perspect Biol 2012；4:a013706)和Hinnebusch等人(Cold Spring Harb Perspect Biol 2012；4:a011544)综述。

Roobol等人(Metabolic Engineering 2020,59:98-105)检查了哺乳动物细胞系HEK和CHO细胞系中大eIF3复合物的eIF3i和eIF3v亚基的瞬时和稳定过表达分别对生长速率增加、蛋白质合成容量增加和细胞凋亡延迟的作用。eIF3i是真核起始因子3(eIF3)复合物的组分，该复合物包含12个不同亚基的单拷贝，其中5个亚基a、b、c、g和i从酵母到哺乳动物在体内都是保守的和必需的。

Archer等人(RNA Biol.2015Mar；12(3):248–254)研究了酵母中通过帽结构、poly(A)尾、eIF4E、eIF4G和PAB之间的相互作用形成的mRNA闭环。

Chan等人(eLife 2018；7:e32536)描述了抑制翻译起始会破坏单个转录物的稳定性并导致酵母中mRNA衰变加速。eIF4E的5'帽结合突变体的过表达导致了对生长的微妙抑制。同时下调eIF4E和eIF4G后，即观察到强烈的合成生长缺陷。

39S和57S翻译复合物中存在的翻译起始因子eIF4E、eIF4G1和eIF4G2与PAB1共纯化。此类复合物含有闭环因子eIF4E、eIF4G和PAB1，通过与mRNA帽结合的eIF4E以及与多聚腺苷酸尾结合的PAB1而与mRNA明显缔合(参见Denis et al.Nature Scientific Reports2018,8:11468)。

已知RLI1对于核糖体循环很重要，并且需要有效的终止密码子识别，从而刺激翻译终止。然而，RLI1在翻译起始和核糖体生物发生中具有双重功能。Yarunin等人(The EMBOJournal2005,24:580–588)描述了RLI1在与前体40S颗粒和成熟40S亚基相关联的核糖体形成中发挥作用。RLI1与MFC组分和40S核糖体特异性缔合(Dong et al.THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY 2004,279(40):42157-42168)。

Liao等人(Biotechnol Lett(2020).https://doi.org/10.1007/s10529-020-02977-z)公开了在甲醇诱导下翻译相关因子过表达菌株中eGFP的表达谱，并且将核糖体生物发生因子Bcy1鉴别为在甲醇诱导下过表达时显著增加eGFP表达的因子。eIF4A和eIF4G过表达子在此类表达系统中没有显著作用。Bcy1是环状AMP依赖性蛋白激酶(PKA)的调控亚基，并且调控核糖体蛋白基因、后二峰转换基因(postdiauxic shift gene)和应激应答元件基因，从而改善细胞生长和异源蛋白质表达。

WO2019173204A1公开了用于大规模乙醇生产的酵母，其过表达PAB1，从而减少乙酸盐形成。US5646009公开了杂交载体，其在一个开放阅读框中包括编码eIF4E的DNA片段和另一个编码目的蛋白的DNA片段，从而增加该蛋白质在真核宿主细胞、特别是HEK细胞中的表达。

CN110551750涉及通过过表达RLI1改善酵母mRNA表达的效率。

EP3663319公开了表达包含PAB1和eIF4G的融合蛋白，并且在酵母中表达目的蛋白。

发明内容

提供此发明内容是为了以简化的形式介绍下文在具体实施方式中进一步描述的一系列概念。本发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优点将从以下书面详细描述(包括附图中所示和所附权利要求中定义的那些方面)中显而易见。

本发明的目的是改善生产宿主细胞中的重组蛋白生产。一个特定的目的是通过增加翻译效率来增加重组蛋白的产量。

该目的由权利要求的主题且如本文进一步描述的那样来解决。

本发明提供了一种表达目的基因(gene of interest，GOI)的重组真核宿主细胞，该重组真核宿主细胞通过遗传修饰工程化以与所述一种或多种遗传修饰之前的宿主细胞相比，增加编码信使核糖核蛋白(mRNP)的翻译起始因子的两种或更多种基因(TIF基因)的表达。

具体地，所述两种或更多种TIF基因是至少包括编码eIF4A的基因和编码eIF4G的基因的TIF基因。

根据一个具体方面，TIF基因进一步包括编码eIF4E、PAB1或RLI1的基因中的任何一者或多者。

根据具体实施方案，所述TIF基因编码包括以下TIF或由以下TIF组成(特别是包括以下TIF组合或由以下TIF组合组成)的TIF：

a)eIF4A和eIF4G；

b)eIF4A、eIF4G和eIF4E；

c)eIF4A、eIF4G、eIF4E和PAB1；

d)eIF4A、eIF4G和PAB1。

具体地，以上实施方案a)至d)的TIF组合中的任一者可以任选地进一步包含RLI1。

根据一个具体方面，宿主细胞经工程化以过表达至少以下各项：

a)编码eIF4A和eIF4G的基因；

b)编码eIF4A、eIF4G和eIF4E的基因；

c)编码eIF4A、eIF4G、eIF4E和PAB1的基因；

d)编码eIF4A、eIF4G和PAB1的基因。

具体地，宿主细胞经工程化以过表达以上a)至d)中记载的基因组合中的任一者，并且可以任选地进一步被工程化以过表达RLI1。具体地，所述TIF基因中的至少一者的表达处于启动子的转录控制下，该启动子不同于控制所述GOI的表达的启动子。具体地，GOI由GOI表达盒(GOIEC)表达，并且相应TIF基因由TIF基因表达盒(TIFEC)表达。表达盒至少包含与待表达的基因可操作地连接的启动子或至少由与待表达的基因可操作地连接的启动子组成。

根据一个具体方面，GOIEC启动子不同于TIFEC启动子中的任何一者或多者或全部。

启动子具体包含在相应单独的表达盒中以表达TIF基因和GOI。

具体地，mRNP的TIF是存在于mRNP复合物或激活的mRNP中(诸如在与43S预起始复合物(PIC)结合之前)的TIF。在此类TIF中特别地是闭环因子(诸如eIF4E、eIF4A、eIF4G、PAB1和/或RLI1)中的一者或多者(其被理解为与闭环结构相关联)，并且特别地是eIF4F复合物的因子(诸如eIF4E、eIF4A或eIF4G)中的一者或多者。

具体地，所述eIF4G优选是酵母(诸如毕赤酵母属(Pichia)或酵母属(Saccharomyces))的eIF4G2(TIF4632，真核起始因子4F亚基p130)。

根据一个具体实施方案，宿主细胞经遗传工程化以过表达所述TIF基因中的至少两者、至少三者、至少四者或至少五者，其中所述TIF基因至少包括编码eIF4A和eIF4G的基因。

具体地，所述TIF中的至少两者属于eIF4F复合物，特别是eIF4A、eIF4G和任选的eIF4E。具体地，eIF4F复合物的TIF基因中的两者、三者或更多者或全部都被过表达，特别是eIF4A、eIF4G和任选的eIF4E。

具体地，所述TIF中的至少一者可以是闭环因子，特别是eIF4G，并且任选地是eIF4E或PAB1中的任何一者或两者。具体地，闭环因子中的一者、两者、三者或更多者或全部都被过表达，特别是eIF4G，以及任选的eIF4E或PAB1中的任何一者或两者。

具体地，TIF基因是真核生物或原核生物来源的，特别是酵母或哺乳动物来源的，包括天然存在的基因或其人工变体，特别是编码天然存在的TIF(包括天然存在的同种型)或具有高序列同一性且在生产宿主细胞中与激活的mRNP和/或翻译起始中的TIF具有大致相同或增加的功能的功能活性变体的那些。

具体地，TIF基因是真核生物来源的，诸如来源于本文进一步描述的宿主细胞物种中的任一者，诸如来源于：

a)选自由以下项组成的组中的属的酵母细胞：毕赤酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、孔玛氏酵母属(Komagataella)、酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、绪方酵母属(Ogataea)、耶氏酵母属(Yarrowia)和地丝菌属(Geotrichum)，优选巴斯德毕赤酵母、菲氏孔玛氏酵母(Komagataella phaffii)、巴斯德孔玛氏酵母(Komagataella pastoris)、假巴斯德孔玛氏酵母(Komagataellapseudopastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、小绪方酵母(Ogataeaminuta)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromesmarxianus)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)；或者

b)丝状真菌，诸如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或里氏木霉(Trichodermareesei)的细胞；或者

c)非人灵长类动物、人类、啮齿动物或牛细胞，诸如小鼠骨髓瘤(NSO)细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、HT1080、H9、HepG2、MCF7、MDBK Jurkat、MDCK、NIH3T3、PC12、BHK(幼仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、YB2/0、Y0、C127、L细胞、COS例如COS1和COS7、QC1-3、HEK-293、VERO、PER.C6、HeLA、EB1、EB2、EB3、溶瘤或杂交瘤细胞系；或者

d)昆虫细胞，诸如Sf9、Mimic^TMSf9、Sf21、High Five(BT1-TN-5B1-4)或BT1-Ea88细胞；或者

e)藻类细胞，诸如属于双眉藻属(Amphora)、硅藻属(Bacillariophyceae)、杜氏藻属(Dunaliella)、小球藻属(Chlorella)、衣藻属(Chlamydomonas)、蓝藻属(Cyanophyta，蓝藻细菌(cyanobacteria))、微拟球藻属(Nannochloropsis)、螺旋藻属(Spirulina)或棕鞭藻属(Ochromonas)；或者

f)植物细胞，诸如来自单子叶植物的细胞，优选玉米、水稻、小麦或狗尾草(Setaria)，或来自双子叶植物的细胞，优选木薯(cassava)、马铃薯、大豆、番茄、烟草、苜蓿(alfalfa)、小立碗藓(Physcomitrella patens)或拟南芥(Arabidopsis)。

根据一个具体方面，TIF基因是真核生物来源的，例如来源于与POI相同的物种起源。特别地，TIF基因可以是酵母来源的，诸如毕赤酵母属或酵母属；或哺乳动物来源的，诸如人类或非人类动物来源。根据一个具体方面，TIF中的任何一者、两者、三者、四者或五者是酵母或哺乳动物(诸如例如人类、小鼠、仓鼠或猿)蛋白质，包括天然存在的同种型。

根据具体实施方案，酵母或人类TIF基因中的任一者经选择以在宿主细胞中过表达。

具体地，用于本文提供的目的的TIF包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列与相应天然存在的(也称为天然或野生型)TIF、特别是与通过本文提供的序列鉴别的TIF中的任一者的序列具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性中的至少任一者。

根据一个具体方面，

a)所述TIF基因编码的eIF4E包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:1-11中任一者具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的至少任一者；

b)所述TIF基因编码的eIF4A包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:12-33中任一者具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的至少任一者；

c)所述TIF基因编码的eIF4G包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:34-44中任一者具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的至少任一者；

d)所述TIF基因编码的PAB1包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:45-55中任一者具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的至少任一者；并且

e)所述TIF基因编码的RLI1包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:56-65中任一者具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的至少任一者。

根据一个具体方面，

a)eIF4E蛋白质包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:1-11中任一者具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的至少任一者；

b)eIF4A蛋白质包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:12-33中任一者具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的至少任一者；

c)eIF4G蛋白质包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:34-44中任一者具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的至少任一者；

d)PAB1蛋白质包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:45-55中任一者具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的至少任一者；并且

e)RLI1蛋白质包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:56-65中任一者具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的至少任一者。

具体地，用于本文提供的目的的TIF基因是包含编码相应TIF的核苷酸序列或由编码相应TIF的核苷酸序列组成的核酸分子。TIF基因可包含以下或由以下组成：天然存在的(也称为天然或野生型)核苷酸序列，或被突变(例如，优化)以用于在宿主细胞中表达所述TIF基因，例如，密码子优化的序列，或金门优化序列。

具体地，用于本文提供的目的的TIF基因包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与相应天然存在的(也称为天然或野生型)TIF基因、特别是与通过本文提供的序列鉴别的TIF基因中的任一者的序列具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性中的至少任一者。

根据一个具体方面，所述一种或多种遗传修饰包括以下者的敲入、取代、中断、缺失或敲除：(i)一个或多个多核苷酸或其一部分；或(ii)表达控制序列，优选地，选自由启动子、核糖体结合位点、转录或翻译起始和终止序列、增强子和激活子序列组成的组的表达控制序列，优选地其中所述一种或多种遗传修饰包括将异源多核苷酸或表达盒整合到宿主细胞基因组中。

根据一个具体方面，所述一种或多种遗传修饰包括增加所述TIF基因的数量或包含所述TIF基因的表达盒的数量，和/或所述TIF基因中的功能获得性改变，从而增加所述TIF基因的水平或活性。

根据一个具体方面，所述一种或多种遗传修饰包括相应TIF基因中的功能获得性改变，从而使得例如通过过表达相应TIF基因和/或者通过减少降解或增加相应TIF基因或TIF mRNA的稳定性来增加TIF的水平或活性。

具体地，所述功能获得性改变包括相应TIF基因的敲入。

具体地，所述功能获得性改变上调所述细胞中的相应TIF基因表达。

具体地，所述功能获得性改变包括插入异源表达盒以在所述细胞中过表达相应TIF基因。

功能获得性改变具体地用于增加TIF基因的表达，包括例如将编码TIF(或包含此类多核苷酸的TIFEC)的多核苷酸引入宿主细胞基因组中，并任选地破坏与此类多核苷酸可操作地连接的启动子，用具有更高启动子活性的另一启动子替换此类启动子。

修饰基因表达的具体方法采用调节(例如，激活、上调、使失活、抑制或下调)的调控序列，该调控序列调节多核苷酸(基因)的表达，诸如使用在基于CRISPR的修饰宿主细胞的方法中使用的被RNA引导核糖核酸酶靶向至相关序列的相应转录调控因子(regulator)，例如选自由启动子、核糖体结合位点、转录起始或终止序列、翻译起始或终止序列、增强子或激活子序列、阻抑因子或抑制因子序列、信号或前导序列组成的组的调控序列，特别是控制蛋白质的表达和/或分泌的那些。

具体地，所述一种或多种增加TIF基因的表达的遗传修饰包括一个或多个基因组突变，包括插入或激活相应基因或基因组序列，该相应基因或基因组序列例如通过敲入异源基因，或增加内源性基因的拷贝数，与没有此类遗传修饰的相应宿主相比，将基因或部分基因的表达增加至少50％、60％、70％、80％、90％或95％，或甚至更多。

具体地，增加表达的一种或多种遗传修饰包含组成性地改善或以其他方式增加一个或多个内源性多核苷酸的表达的基因组突变。

具体地，增加表达的一种或多种遗传修饰包含引入一个或多个诱导型或阻抑型调控序列的基因组突变，该调控序列有条件地改善或以其他方式增加一个或多个内源性多核苷酸的表达。此类有条件的活性修饰特别地靶向那些依赖于细胞培养条件而具有活性和/或表达的调控元件和基因。

具体地，当在生产目的蛋白(POI)的方法中使用宿主细胞时，编码相应TIF的多核苷酸的表达增加。具体地，在遗传修饰后，在生产POI的宿主细胞培养的条件下，相应TIF基因的表达增加。

具体地，与没有所述修饰的宿主细胞相比，宿主细胞经遗传修饰以例如通过敲入一个或多个相应TIF基因来将相应TIF的量(例如，水平、活性或浓度)增加50％(mol/mol)、60％(mol/mol)、70％(mol/mol)、80％(mol/mol)、90％(mol/mol)或95％(mol/mol)中的至少任一者，或甚至更多。根据一个具体实施方案，宿主细胞经遗传修饰以包含(一个或多个)基因组序列的一个或多个插入，该基因组序列特别是编码相应TIF的基因组序列(其整合到宿主细胞基因组中)。此类宿主细胞通常作为敲入菌株提供。

根据一个具体实施方案，与在此类遗传修饰之前的或没有此类遗传修饰的宿主细胞表达或生产的参考量相比，或与相应宿主细胞培养物中生产的参考量相比，或与所述修饰之前的或没有所述修饰的宿主细胞相比，一旦在细胞培养物中培养本文所述的宿主细胞，则宿主细胞或宿主细胞培养物中相应过表达的TIF的总量增加50％、60％、70％、80％、90％或95％(活性％或mol/mol)中的至少任一者，或甚至100％或更多。

根据一个具体方面，所述TIF基因中的一者或多者对宿主细胞是内源的或异源的。具体地，所述TIF基因包含在相应TIF表达盒(TIFEC)中。具体地，所述TIF基因在一个或多个TIFEC中表达。

具体地，所述TIF基因包含在一个或多个异源表达盒中，特别是在包含异源表达构建体的异源表达盒中，该构建体含有一个或多个表达控制序列，诸如启动子(与TIF基因可操作地连接)。具体地，所述表达构建体非天然存在于所述宿主细胞中，或者在位点(该位点不同于相应内源性TIF基因或表达构建体所天然存在的位点)处整合在宿主细胞的基因组或染色体内，或者提供在游离型质粒上。

具体地，TIFEC中的任何一者、两者、三者、四者或五者或更多者或全部包含称为TIF表达盒(TIFEC)启动子的启动子。

具体地，TIFEC启动子是组成型启动子，或可调控启动子，诸如诱导型或去阻抑型启动子，该TIFEC启动子与待表达的TIF基因可操作地连接。

具体地，在同一宿主细胞内的TIF表达盒中使用的至少一个(诸如任何一个或多个)或全部TIFEC启动子都不是巴斯德毕赤酵母(特别是巴斯德孔玛氏酵母或菲氏孔玛氏酵母)的pAOX1，也不是甲醇诱导的。pAOX1启动子被理解为“AOX1”基因的天然启动子，其被称为编码由UniProtKB-F2QY27鉴别的巴斯德毕赤酵母醇氧化酶1的醇氧化酶1的天然基因。

根据一个具体方面，宿主细胞进一步包含表达盒，该表达盒包含GOI和一个或多个与所述GOI可操作地连接以在宿主细胞培养物中表达所述GOI的表达控制序列。

具体地，所述GOI在与TIF表达盒分开的GOI表达盒(GOIEC)中表达。

具体地，GOIEC包含称为GOI表达盒(GOIEC)启动子的启动子。

具体地，GOIEC启动子是可调控启动子，诸如诱导型或去阻抑型启动子，或组成型启动子，该GOIEC启动子与待表达的GOI可操作地连接。

优选地，在同一宿主细胞内的TIF表达盒中使用的TIFEC启动子中的至少一者(诸如任何一者或多者)或全部是除GOIEC启动子之外的任何启动子。

具体地，

a)任何一个或多个或全部TIFEC启动子都是组成型的，并且GOIEC启动子是诱导型或(去)阻抑型启动子；

b)任何一个或多个或全部TIFEC启动子都是诱导型或(去)阻抑型的，并且GOIEC启动子是组成型启动子；

c)任何一个或多个或全部TIFEC启动子都是组成型的，并且GOIEC启动子是类型或强度不同于此类TIFEC启动子中的任何一者或多者的组成型启动子；

d)任何一个或多个或全部TIFEC启动子都是诱导型或(去)阻抑型的，并且GOIEC启动子是类型或强度不同于此类TIFEC启动子中的任何一者或多者的诱导型或(去)阻抑型启动子。

根据一个具体方面，与TIFEC启动子中的任一者相比，GOIEC启动子具有更高的启动子强度。

在一个优选的实施方案中，编码相应TIF的多核苷酸的表达由组成型启动子驱动，并且编码POI的多核苷酸(基因)的表达由诱导型启动子驱动。在又一个优选的实施例中，编码相应TIF的多核苷酸的表达由诱导型启动子驱动，并且编码POI的多核苷酸(基因)的表达由组成型启动子驱动。

作为一个实例，编码TIF的多核苷酸的表达可由组成型GAP启动子驱动，并且编码POI的多核苷酸的表达可由甲醇诱导型启动子(诸如AOX1或AOX2启动子)驱动。

作为另一个实例，编码TIF的多核苷酸的表达可以由组成型启动子(诸如MDH3、POR1、PDC1、FBA1-1或GPM1)驱动(Prielhofer et al.2017,BMC Sys Biol.11:123)，并且编码POI的多核苷酸的表达可以由甲醇诱导型启动子(诸如AOX1或AOX2启动子)驱动。

作为另一个实例，编码TIF的多核苷酸的表达可以由组成型启动子(诸如GAP启动子)驱动，并且编码POI的多核苷酸的表达可以由去阻抑型启动子(诸如本文进一步描述的那些)驱动。

作为另一个实例，编码TIF的多核苷酸的表达可以由组成型启动子驱动，并且编码POI的多核苷酸的表达可以由去阻抑型启动子(诸如本文进一步描述的那些)驱动。

作为另一个实例，编码TIF的多核苷酸的表达可以由去阻抑型启动子驱动，并且编码POI的多核苷酸的表达可以由去阻抑型启动子(诸如本文进一步描述的那些)驱动。

具体地，本文所指的表达盒包括至少一个启动子和待在所述启动子的转录控制下表达的多核苷酸(或基因)，以及任选的诸如选自由核糖体结合位点、转录起始或终止序列、翻译起始或终止序列、增强子或激活子序列、阻抑因子或抑制因子序列、信号或前导序列组成的组的其他调控序列，特别是控制蛋白质表达和/或分泌的那些。

具体地，使用对宿主细胞异源的表达盒，特别地，其中表达盒包含与多核苷酸可操作地连接的启动子，其中启动子和多核苷酸彼此异源，这意味着它们不天然以此类组合存在，例如，其中启动子和多核苷酸中的任一者(或仅一者)是人工的或对另一者异源和/或对本文所述的宿主细胞异源；启动子是内源性启动子并且多核苷酸是异源多核苷酸；或者启动子是人工或异源启动子并且多核苷酸是内源性多核苷酸；其中启动子和多核苷酸都是人工的、异源的或来自不同来源，诸如来自与本文所述的宿主细胞相比不同物种或类型(株)的细胞。具体地，启动子与用作本文所述宿主细胞的细胞中的所述多核苷酸不天然缀合和/或不可操作地连接。

根据一个具体方面，异源表达盒包含在自主复制的载体或质粒中，或整合在所述宿主细胞的染色体内。

GOI表达构建体(GOI-expressing construct)可以包含表达控制序列或由表达控制序列组成，表达控制序列为诸如例如与GOI可操作地连接的启动子，这是在宿主细胞中从所述表达构建体表达所述GOI所必需的。GOI表达构建体可以包含在单独的表达盒中，或包含在另外表达所述TIF基因中的一者或多者的表达盒中。

根据一个具体方面，宿主细胞是包含至少一个异源GOIEC的重组宿主细胞，其中包含在GOIEC中的至少一种组分或组分的组合对宿主细胞是异源的。具体地，使用人工表达盒，特别地，其中启动子和GOI彼此异源，即不天然以此类组合存在，例如，其中启动子和GOI中的任一者(或仅一者)是人工的或对另一者异源和/或对本文所述的宿主细胞异源；启动子是内源性启动子并且GOI是异源GOI；或者启动子是人工或异源启动子并且GOI是内源性GOI；其中启动子和GOI都是人工的、异源的或来自不同来源，诸如来自与本文所述的宿主细胞相比不同物种或类型(株)的细胞。具体地，GOIEC启动子与用作本文所述宿主细胞的细胞中的所述GOI不天然缀合和/或不可操作地连接。

具体地，宿主细胞包含：

a)在一个或多个异源TIF表达盒中表达所述TIF基因中的一者或多者的表达系统，每个表达盒包含一个或多个与所述TIF基因可操作地连接的表达控制序列；和

b)包含GOI和一个或多个与所述GOI可操作地连接的表达控制序列的GOI表达盒；

其中a)的表达系统和b)的表达盒经工程化以当在细胞培养物中培养宿主细胞时表达相应TIF基因和GOI。

根据一个具体方面，宿主细胞包含在一个或多个异源表达盒中表达所述TIF基因中的一者、两者、三者、四者或五者或更多者的表达系统，每个表达盒包含一个或多个与所述TIF基因可操作地连接的表达控制序列。在具体实施方案中，各TIF基因与TIFEC启动子可操作地连接。

每个细胞的GOIEC或TIEFEC数量通常决定了相应表达产物的数量。宿主细胞具体包含至少一个GOIEC和至少一个TIFEC拷贝/细胞。一个表达盒通常称为“一个拷贝”。

根据一个具体方面，每个宿主细胞的一种类型的GOIEC或GOIEC拷贝的数量为至少(或最多)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任一者，或者甚至可以使用最多20、30、40或50的更高数量。

根据一个具体方面，每个宿主细胞的一种类型的TIFEC或TIFEC拷贝的数量为至少(或最多)1、2、3、4或5中的任一者。

根据一个具体方面，每个宿主细胞的异源TIFEC的数量为至少(或最多)1、2、3、4或5。

虽然TIFEC优选对宿主细胞异源，但GOIEC可以是异源或内源的。

根据一个具体方面，宿主细胞包含一个或多个(例如多个)异源表达盒，包括例如一个或多个表达TIF的表达盒，以及表达GOI的表达盒的一个或多个(多)拷贝，诸如TIFEC或GOIEC的至少1、2、3、4或5个拷贝(基因拷贝数，GCN)。每个拷贝可包含相同或不同的序列或由相同或不同的序列组成，包括与待表达的相应基因可操作地连接的表达控制序列。

具体地，对于在宿主细胞中过表达的TIF中的每一者，每个细胞的TIF编码多核苷酸的数量与编码其他过表达的TIF的多核苷酸的数量大约(+/-1)相同，以确保所有过表达的TIF的水平大约相同。

根据一个具体方面，

a)TIF表达盒中的至少一者(即任何一者或多者，或全部)包含组成型启动子；和/或

b)GOI表达盒包含诱导型、去阻抑型或其他可调控启动子，或组成型启动子。

具体地，GOI是不同于所述TIF基因的多核苷酸或基因。具体地，GOI表达目的蛋白(POI)。具体地，POI是不同于所述TIF的多肽或蛋白质。

根据一个具体方面，POI对宿主细胞物种是异源的。

根据一个具体方面，POI是治疗性或诊断性产品。优选地，POI是在哺乳动物中起作用的治疗性蛋白。

具体地，POI是选自由抗原结合蛋白、治疗性蛋白、酶、肽、蛋白质抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白质缀合物、结构蛋白、调控蛋白、疫苗抗原、生长因子、激素、细胞因子、加工酶和代谢酶组成的组的肽、多肽或蛋白质。

具体地，POI是真核蛋白质，优选哺乳动物来源或相关蛋白质，诸如人蛋白质或包含人蛋白质序列的蛋白质，或细菌蛋白质或细菌来源蛋白质。酵母宿主细胞中非天然存在的任何此类哺乳动物、细菌或人工蛋白质被理解为对宿主细胞异源。

在具体情况下，POI是多聚体蛋白质，具体是二聚体或四聚体。

具体地，抗原结合蛋白选自由以下项组成的组：

a)抗体或抗体片段，诸如以下中的任一者：嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体、Fab、Fd、scFv、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、Fv四聚体、微型抗体(minibody)、单结构域抗体如VH、VHH、IgNAR或V-NAR；

b)抗体模拟物，诸如Adnectin、亲和体(Affibody)、Affilin、Affimer、Affitin、α体、Anticalin、Avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单体或NanoCLAMPS；或者

c)包含一个或多个免疫球蛋白折叠结构域、抗体结构域或抗体模拟物的融合蛋白。

特异性POI是抗原结合分子，诸如抗体或其片段，特别是包含抗原结合结构域的抗体片段。在特异性POI中是抗体，诸如单克隆抗体(mAb)、免疫球蛋白(Ig)或免疫球蛋白G类(IgG)、重链抗体(HcAb)或其片段，诸如片段-抗原结合(Fab)、Fd、单链可变片段(scFv)或其工程化的变体，诸如例如Fv二聚体(双抗体)、Fv三聚体(三抗体)、Fv四聚体或微型抗体，以及单结构域抗体如VH、VHH、IgNAR或V-NAR，或任何包含免疫球蛋白折叠结构域的蛋白质。另外的抗原结合分子可以选自抗体模拟物或(替代的)支架蛋白，诸如例如工程化的Kunitz结构域、Adnectin、亲和体、Affiline、Anticalin或DARPin。

根据一个具体方面，POI是例如BOTOX、肉毒杆菌(Myobloc)、肉毒毒素制剂(Neurobloc)、丽舒妥(Dysport)(或肉毒菌神经毒素的其他血清型)、阿糖苷酶α(alglucosidase alpha)、达托霉素(daptomycin)、YH-16、绒毛膜促性腺激素α、非格司亭(filgrastim)、西曲瑞克(cetrorelix)、白细胞介素-2、阿地白介素(aldesleukin)、替西白介素(teceleulin)、地尼白介素(denileukin diftitox)、干扰素α-n3(注射)、干扰素α-nl、DL-8234、干扰素、桑托里(Suntory)(γ-1a)、干扰素γ、胸腺素α1、他索纳明(tasonermin)、DigiFab、ViperaTAb、EchiTAb、CroFab、奈西立肽(nesiritide)、阿巴西普(abatacept)、阿法西普(alefacept)、利比(Rebif)、阿法艾托特明(eptoterminalfa)、特立帕肽(骨质疏松症)、可注射降钙素(骨病)、降钙素(鼻用，骨质疏松症)、依那西普(etanercept)、血红蛋白谷氨酸250(牛)、多确克津α(drotrecogin alpha)、胶原酶、卡培立肽(carperitide)、重组人表皮生长因子(局部用凝胶，伤口愈合)、DWP401、达贝泊汀α(darbepoetin alpha)、依泊汀ω(epoetin omega)、依泊汀β(epoetin beta)、依泊汀α(epoetin alpha)、地西卢定(desirudin)、来匹卢定(lepirudin)、比伐卢定(bivalirudin)、诺那凝血素α(nonacogalpha)、霉诺耐(Mononine)、依他凝血素α(eptacog alpha)(激活的)、重组因子VIII+VWF、重组体(Recombinate)、重组因子VIII、因子VIII(重组)、阿法美特(Alphnmate)、辛凝血素α(octocog alpha)、因子VIII、帕利夫明(palifermin)、英迪激酶(Indikinase)、替奈普酶(tenecteplase)、阿替普酶(alteplase)、派替普酶(pamiteplase)、瑞替普酶(reteplase)、那替普酶(nateplase)、孟替普酶(monteplase)、促卵泡素α(follitropin alpha)、rFSH、hpFSH、米卡芬净(micafungin)、培非格司亭(pegfilgrastim)、来格司亭(lenograstim)、那托芬净(nartograstim)、舍莫瑞林(sermorelin)、胰高血糖素、艾塞那肽(exenatide)、普兰林肽(pramlintide)、阿糖脑苷酶(iniglucerase)、加硫酶(galsulfase)、乐克托品(Leucotropin)、莫革斯汀(molgramostirn)、醋酸曲普瑞林(triptorelin acetate)、组氨瑞林(histrelin)(皮下植入物，Hydron)、地洛瑞林(deslorelin)、组氨瑞林(histrelin)、那法瑞林(nafarelin)、亮丙瑞林缓释储库(ATRIGEL)、亮丙瑞林植入物(DUROS)、戈舍瑞林(goserelin)、欧托品(Eutropin)、KP-102计划、生长激素、美卡舍明(mecasermin)(成长失败)、恩法韦肽(enlfavirtide)、Org-33408、甘精胰岛素、谷氨酸胰岛素、胰岛素(吸入)、赖脯胰岛素、德特尼胰岛素(insulin deternir)、胰岛素(口腔，RapidMist)、美卡舍明林菲培(mecasermin rinfabate)、阿那白滞素、西莫白介素(celmoleukin)、99mTc-阿普西肽注射液、麦乐贝齐(myelopid)、倍泰龙(Betaseron)、醋酸格拉替雷(glatiramer acetate)、格旁(Gepon)、沙格司亭(sargramostim)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、人白细胞衍生的α干扰素、倍尔来福(Bilive)、胰岛素(重组)、重组人胰岛素、门冬胰岛素(insulin aspart)、美卡色宁(mecasenin)、罗扰素-A(Roferon-A)、干扰素-α2、阿尔法扰素(Alfaferone)、复合α干扰素-1、干扰素α、阿温耐克斯(Avonex)重组人黄体生成素、阿法链道酶(dornase alpha)、曲弗明(trafermin)、齐考诺肽(ziconotide)、他替瑞林(taltirelin)、阿法地博特明(diboterminalfa)、阿托西班(atosiban)、贝卡普勒明(becaplermin)、依替巴肽(eptifibatide)、扎马拉(Zemaira)、CTC-111、夏伐克(Shanvac)-B、HPV疫苗(四价)、奥曲肽、兰瑞肽、安克斯丁(ancestirn)、阿加西酶β(agalsidase beta)、阿加糖酶α、拉罗尼酶(laronidase)、醋肽铜(prezatide copper acetate)(局部用凝胶)、拉布立酶(rasburicase)、兰尼单抗(ranibizumab)、阿提姆尼(Actimmune)、PEG-内含子、确可宁(Tricomin)、重组屋尘螨过敏脱敏注射液、重组人甲状旁腺激素(PTH)1-84(sc、骨质疏松症)、红细胞生成素δ(epoetin delta)、转基因抗凝血酶III、格兰迪托品(Granditropin)、透明质酸酶(Vitrase)、重组胰岛素、干扰素-α(口服含片)、GEM-21S、伐普肽(vapreotide)、艾度硫酸酯酶(idursulfase)、奥纳帕确特(omnapatrilat)、重组血清白蛋白、赛妥珠单抗佩革(certolizumab pegol)、羧肽酶(glucarpidase)、人重组C1酯酶抑制剂(血管神经性水肿)、拉诺普酶(lanoteplase)、重组人生长激素、恩夫韦肽(enfuvirtide)(无针注射，Biojector 2000)、VGV-1、干扰素(α)、卢辛坦特(lucinactant)、艾帕它迪(aviptadil)(吸入，肺病)、艾替班特(icatibant)、艾卡拉肽(ecallantide)、欧米甘安(omiganan)、奥革比(Aurograb)、醋酸培西加南(pexiganan acetate)、ADI-PEG-20、LDI-200、加瑞克(degarelix)、白介假单胞菌外毒素(cintredelinbesudotox)、Favld、MDX-1379、ISAtx-247、利拉鲁肽(liraglutide)、特立帕肽(teriparatide)(骨质疏松症)、组织因子通路抑制剂(tifacogin)、AA4500、T4N5脂质体乳液、卡妥索单抗(catumaxomab)、DWP413、ART-123、魁萨琳(Chrysalin)、去氨普酶、安地普酶(amediplase)、绒促卵泡素α(corifollitropinalpha)、TH-9507、替度鲁肽(teduglutide)、戴麦德(Diamyd)、DWP-412、生长激素(持续释放注射)、重组G-CSF、胰岛素(吸入，AIR)、胰岛素(吸入，Technosphere)、胰岛素(吸入，AERx)、RGN-303、DiaPep277、干扰素β(丙型肝炎病毒感染(HCV))、干扰素α-n3(口服)、贝拉西普(belatacept)、透皮胰岛素贴片、AMG-531、MBP-8298、西雷西普(Xerecept)、奥培巴康(opebacan)、AIDSVAX、GV-1001、LymphoScan、瑞皮核糖核酸酶(ranpirnase)、利普散(Lipoxysan)、鲁丝普利肽(lusupultide)、MP52(β-三磷酸盐载体，骨再生)、黑色素瘤疫苗、西普勒塞尔-T(sipuleucel-T)、CTP-37、英色革(Insegia)、维特斯朋(vitespen)、人凝血酶(冷冻，手术出血)、凝血酶、TransMID、蛇毒纤溶酶(alfimeprase)、普瑞凯希(Puricase)、特利加压素(静脉，肝肾综合征)、EUR-1008M、重组FGF-I(可注射，血管疾病)、BDM-E、罗替盖普肽(rotigaptide)、ETC-216、P-113、MBI-594AN、耐久霉素(duramycin)(吸入，囊性纤维化)、SCV-07、OPI-45、内皮抑素(Endostatin)、血管抑素(Angiostatin)、ABT-510、包曼比瑞克(Bowman Birk)抑制剂浓缩液、XMP-629、99mTc-Hynic-膜联蛋白V、卡海拉利肽F(kahalalide F)、CTCE-9908、替维瑞克(teverelix)(延迟释放)、奥扎瑞克(ozarelix)、罗咪酯肽(rornidepsin)、BAY-504798、白介素4、PRX-321、佩斯坎(Pepscan)、依波介素(iboctadekin)、重组人乳铁蛋白(rhlactoferrin)、TRU-015、IL-21、ATN-161、西仑吉肽(cilengitide)、阿布富伦(Albuferon)、比费西克斯(Biphasix)、IRX-2、ω干扰素、PCK-3145、CAP-232、帕瑞肽、huN901-DMI、卵巢癌免疫治疗疫苗、SB-249553、Oncovax-CL、OncoVax-P、BLP-25、CerVax-16、多表位肽黑色素瘤疫苗(MART-1、gp100、酪氨酸酶)、奈米非肽(nemifitide)、rAAT(吸入)、rAAT(皮肤科)、CGRP(吸入，哮喘)、培那西普(pegsunercept)、胸腺素β4、普厉肽平辛(plitidepsin)、GTP-200、雷莫拉宁(ramoplanin)、GRASPA、OBI-1、AC-100、鲑鱼降钙素(口服，埃利根(eligen))、降钙素(口服，骨质疏松症)、艾沙瑞林(examorelin)、卡莫瑞林(capromorelin)、Cardeva、韦拉繁明(velafermin)、131I-TM-601、KK-220、T-10、乌拉立肽(ularitide)、地来司他(depelestat)、海明肽(hematide)、克瑞沙林(Chrysalin)(局部)、rNAPc2、重组因子V111(聚乙二醇化脂质体)、bFGF、聚乙二醇化的重组葡萄球菌激酶变体、V-10153、超声波降解尿激酶原(SonoLysis Prolyse)、NeuroVax、CZEN-002、胰岛细胞新生疗法、rGLP-1、BIM-51077、LY-548806、艾塞那肽(控释、Medisorb)、AVE-0010、GA-GCB、阿伏瑞林(avorelin)、ACM-9604、乙酸利那洛肽(linaclotid eacetate)、CETi-1、赫莫斯盘(Hemospan)、VAL(可注射)、速效胰岛素(注射用，Viadel)、鼻内胰岛素、胰岛素(吸入)、胰岛素(口服，埃利根)、重组甲硫氨酰人瘦素、皮创克纳(pitrakinra)皮下注射、湿疹)、皮创克纳(吸入干粉，哮喘)、多白介素(Multikine)、RG-1068、MM-093、NBI-6024、AT-001、PI-0824、Org-39141、Cpn10(自身免疫性疾病/炎症)、塔拉特弗利(talactoferrin)(局部)、rEV-131(眼科)、rEV-131(呼吸系统疾病)、口服重组人胰岛素(糖尿病)、RPI-78M、奥普瑞白介素(oprelvekin)(口服)、CYT-99007CTLA4-Ig、DTY-001、伐拉司特(valategrast)、干扰素α-n3(局部)、IRX-3、RDP-58、塔弗隆(Tauferon)、胆盐刺激脂肪酶、美瑞帕酶(Merispase)、丙氨酸磷酸酶、EP-2104R、美拉诺坦-II、布美诺肽(bremelanotide)、ATL-104、重组人微纤溶酶、AX-200、SEMAX、ACV-1、Xen-2174、CJC-1008、强啡肽A、SI-6603、LAB GHRH、AER-002、BGC-728、疟疾疫苗(病毒体，PeviPRO)、ALTU-135、细小病毒B19疫苗、流感疫苗(重组神经氨酸酶)、疟疾/HBV疫苗、炭疽疫苗、Vacc-5q、Vacc-4x、HIV疫苗(口服)、HPV疫苗、Tat类毒素、YSPSL、CHS-13340、PTH(1-34)脂质体乳膏(Novasome)、奥斯塔柏林-C(Ostabolin-C)、PTH类似物(局部，银屑病)、MBRI-93.02、MTB72F疫苗(结核病)、MVA-Ag85A疫苗(结核病)、FARA04、BA-210、重组瘟疫FIV疫苗、AG-702、OxSODrol、rBetV1、Der-p1/Der-p2/Der-p7过敏原靶向疫苗(尘螨过敏)、PR1肽抗原(白血病)、突变ras疫苗、HPV-16E7脂肽疫苗、迷路(labyrinthin)疫苗(腺癌)、CML疫苗、WT1-肽疫苗(癌症)、IDD-5、CDX-110、朋曲斯(Pentrys)、诺雷林(Norelin)、CytoFab、P-9808、VT-111、伊克卡品肽(icrocaptide)、替柏明(telbermin)(皮肤病学，糖尿病足溃疡)、芦平曲韦(rupintrivir)、瑞替克鲁(reticulose)、rGRF、HA、α-半乳糖苷酶A、ACE-011、ALTU-140、CGX-1160、血管紧张素治疗性疫苗、D-4F、ETC-642、APP-018、rhMBL、SCV-07(口服，结核)、DRF-7295、ABT-828、ErbB2特异性免疫毒素(抗癌)、DT3SSIL-3、TST-10088、PRO-1762、Combotox、胆囊收缩素-B/胃泌素受体结合肽、111In-hEGF、AE-37、曲妥珠单抗(trasnizumab)-DM1、拮抗剂G、IL-12(重组)、PM-02734、IMP-321、rhIGF-BP3、BLX-883、CUV-1647(局部)、基于L-19的放射免疫治疗药(癌症)、Re-188-P-2045、AMG-386、DC/1540/KLH疫苗(癌症)、VX-001、AVE-9633、AC-9301、NY-ESO-1疫苗(多肽)、NA17.A2肽、黑色素瘤疫苗(脉冲抗原治疗)、前列腺癌疫苗、CBP-501、重组人乳铁蛋白(干眼症)、FX-06、AP-214、WAP-8294A(可注射)、ACP-HIP、SUN-11031、肽YY[3-36](肥胖，鼻内)、FGLL、阿塞西普(atacicept)、BR3-Fc、BN-003、BA-058、人甲状旁腺激素1-34(鼻用，骨质疏松症)、F-18-CCR1、AT-1100(乳糜泻/糖尿病)、JPD-003、PTH(7-34)脂质体乳膏(Novasome)、耐久霉素(眼科，干眼)、CAB-2、CTCE-0214、GlycoPEG化促红细胞生成素、EPO-Fc、CNTO-528、AMG-114、JR-013、因子XIII、氨基康定、PN-951、716155、SUN-E7001、TH-0318、BAY-73-7977、替维瑞克(teverelix)(速释)、EP-51216、hGH(控释，生物圈)、OGP-I、西夫韦肽、TV4710、ALG-889、Org-41259、rhCC10、F-991、胸腺五肽(肺病)、r(m)CRP、肝选择性胰岛素、苏靶林、L19-IL-2融合蛋白、弹力素、NMK-150、ALTU-139、EN-122004、rhTPO、血小板生成素受体激动剂(血小板减少症)、AL-108、AL-208、神经生长因子拮抗剂(疼痛)、SLV-317、CGX-1007、INNO-105、口服特立帕肽(艾力更)、GEM-OS1、AC-162352、PRX-302、LFn-p24融合疫苗、EP-1043、肺炎球菌儿科疫苗、疟疾疫苗、脑膜炎奈瑟氏菌B组疫苗、新生儿B组链球菌疫苗、炭疽疫苗、HCV疫苗(gpE1+gpE2+MF-59)、中耳炎疗法、HCV疫苗(核心抗原+ISCOMATRIX)、hPTH(1-34)(透皮，ViaDerm)、768974、SYN-101、PGN-0052、阿维库明、BIM-23190、结核疫苗、多表位酪氨酸酶肽、癌症疫苗、恩卡斯替母、APC-8024、GI-5005、ACC-001、TTS-CD3、血管靶向TNF(实体瘤)、去氨加压素(口腔控释)、奥那西普或TP-9201、阿达木单抗(HUMIRA)、英利昔单抗(REMICADE^TM)、利妥昔单抗(RITUXAN^TM/MAB THERA^TM)、依那西普(ENBREL^TM)、贝伐单抗(AVASTIN^TM)、曲妥珠单抗(HERCEPTIN^TM)、派革利革斯丁(NEULASTA^TM)或任何其他合适的POI，包括生物类似物和生物改良剂。

具体地，POI对宿主细胞物种是异源的。

具体地，POI是分泌的肽、多肽或蛋白质，即从宿主细胞分泌到细胞培养物上清液中。

具体地，GOI用分泌信号序列表达，优选地其中分泌信号肽(或包含分泌信号肽的前导序列)融合到POI的N-末端。

本发明进一步提供了一种用于生产如本文所述的宿主细胞的方法。具体地，此类方法包括将宿主细胞遗传工程化以在一个或多个异源表达盒内包含所述TIF基因中的一者或多者以及目的基因(GOI)。

根据进一步的具体方面，本发明提供了一种用于生产本文所述的宿主细胞的方法，该宿主细胞能够通过将宿主细胞遗传工程化以在一个或多个表达盒内引入两个或更多个异源核酸分子和与异源核酸分子中的每一者可操作地连接的表达控制序列而在宿主细胞培养物中生产目的蛋白(POI)，其中核酸分子中的一者包含编码POI的目的基因(GOI)，并且另外的一个或多个核酸分子编码TIF诸如TIF基因(如本文进一步所描述)。

具体地，通过将野生型宿主细胞的遗传工程化来提供宿主细胞。

根据一个具体实例，可通过首先修饰以引入表达所述TIF基因的一个或多个表达盒来生产宿主细胞。此类修饰的宿主细胞然后可以被进一步工程化以包含用于POI生产的表达盒。

根据另一个具体实例，宿主细胞可通过首先工程化以包含用于POI生产的表达盒来生产。可进一步修饰此类工程化宿主细胞来引入一个或多个表达盒以表达TIF基因。

本发明进一步提供了一种通过在生产由目的基因(GOI)编码的目的蛋白(POI)的条件下培养本文所述的宿主细胞来生产所述POI的方法。

本发明进一步提供了一种在宿主细胞中生产目的蛋白(POI)的方法，该方法包括以下步骤：

(i)将宿主细胞遗传工程化以在一个或多个异源表达盒内包含本文所述的所述TIF基因以及编码POI的目的基因(GOI)，

(ii)在共表达所述TIF基因和所述GOI的条件下在培养基中培养所述宿主细胞，从而获得POI；以及

(iii)从宿主细胞或培养基中回收POI。

具体地，本文所述方法的步骤i)在步骤(ii)之前进行。

根据一个具体实例，野生型宿主细胞根据本文所述方法的步骤i)进行遗传修饰。

具体地，在将所述遗传修饰引入用于表达异源表达盒的野生型宿主细胞株中后提供宿主细胞。然而，根据一个具体实施方案，在根据步骤i)进行遗传修饰之前，宿主细胞可能已经经历了野生型宿主细胞的一种或多种进一步的遗传修饰，例如，以改善细胞表达和/或分泌蛋白质的能力或减少不需要的副产物，诸如宿主细胞蛋白质。

具体地，采用合适的方法步骤来生产如本文进一步描述的重组宿主细胞。

具体地，POI可以通过以下来生产：在合适的培养基中培养宿主细胞；从细胞培养物中，特别是从在分离细胞后的细胞培养物上清液或培养基中分离表达的POI；以及通过适合所表达的产物的方法将其纯化，特别是在将POI从细胞中分离出来并通过合适的方法纯化后。由此，可以生产纯化的POI制剂。

具体地，本文所述方法的特征在于本文进一步描述的特征，特别是在于本文进一步描述的重组宿主细胞和/或表达系统。

根据一个具体方面，本发明进一步提供了本文所述宿主细胞用于生产POI的用途。

具体地，通过在共表达或过表达所述TIF基因中的一者或多者的条件下培养宿主细胞的同时表达所述GOI来生产POI。具体地，通过此类方法，所述GOI的表达和所述POI的生产产量增加。

具体地，在共表达所述TIF基因中的一者或多者并将所述POI分泌到宿主细胞培养物中的条件下在培养基中培养宿主细胞，并且从宿主细胞培养物中回收POI。

具体地，宿主细胞是在细胞培养物中培养的细胞系，特别是生产宿主细胞系。

根据一个具体实施方案，细胞系在合适的分批、补料分批或连续培养条件下培养。培养可以在微量滴定板、摇瓶或生物反应器中进行，并且任选地从作为第一步骤的分批阶段开始，随后是作为第二步骤的补料分批阶段或连续培养阶段。

具体地，所述细胞培养采用在分批阶段生长细胞；并且在补料分批或连续培养阶段培养细胞以生产所述POI，任选地从作为第一步骤的分批阶段开始，随后是作为第二步骤的补料分批阶段或连续培养阶段。

根据一个具体方面，本文所述的方法包括生长阶段和生产阶段。

具体地，该方法包括以下步骤：

a)在生长条件(生长阶段(growing phase或growth phase))下培养宿主细胞；以及进一步的步骤

b)在生长限制条件(生产阶段)下培养宿主细胞，在此期间表达GOI以生产所述POI。

具体地，第二步骤b)在第一步骤a)之后。

具体地，宿主细胞被修饰以在如下水平下共表达所述TIF基因中的一者或多者，即该水平增加宿主细胞对所述POI的比生产率(μg/g酵母干质量(YDM)/小时和/或对所述POI的体积生产率(μg/L/小时)。

具体地，通过此类共表达，与未被工程化以共表达所述TIF的表达所述GOI的比较性宿主细胞相比，生产率或产量增加1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、11.5倍或12倍中的至少任一者。

当针对生产所述TIF的遗传修饰的作用来比较本文所述宿主细胞时，通常与进行此类遗传修饰之前或不进行此类遗传修饰的比较性宿主细胞进行比较。通常与没有此类遗传修饰的相同宿主细胞物种或类型进行比较，该宿主细胞物种或类型被工程化以生产POI(特别是当在生产所述POI的条件下培养时)。然而，也可以与未经进一步工程化以生产POI的相同宿主细胞物种或类型进行比较。可以通过宿主细胞生产的所述TIF的量(例如，水平或浓度)来确定表达相应编码序列后所述TIF的生产。具体地，该量可以通过合适的方法来确定，诸如采用蛋白质印迹(Western Blot)、免疫荧光成像、流式细胞术或质谱，特别地，其中质谱是液相色谱-质谱法(LC-MS)或液相色谱串联-质谱(LC-MS/MS)。

根据一个具体方面，本文所述的宿主细胞可以经历一种或多种进一步的遗传修饰，例如用于改善蛋白质生产。

具体地，宿主细胞可以被进一步工程化以修饰一种或多种用于生成蛋白酶缺陷菌株、特别是羧肽酶Y活性缺陷菌株的影响蛋白水解活性的基因。具体实例描述于WO1992017595A1中。在US6153424A中描述了在空泡蛋白酶诸如蛋白酶A或蛋白酶B中具有功能缺陷的蛋白酶缺陷型毕赤酵母属菌株的另外的实例。其他实例是由例如ThermoFisherScientific提供的毕赤酵母属菌株，其具有ade2缺失，和/或蛋白酶基因PEP4和PRB1中的一者或两者的缺失。

具体地，宿主细胞可以被工程化以修饰至少一个编码功能基因产物、特别是蛋白酶(其选自由PEP4、PRB1、YPS1、YPS2、YMP1、YMP2、YMP1、DAP2、GRHl、PRD1、YSP3和PRB3组成的组)的核酸序列，如WO2010099195A1中所公开的。

编码辅助因子的基因的过表达或低表达可用于增强GOI的表达，例如如WO2015158800A1中所述。

根据一个具体方面，宿主细胞是真核宿主细胞。

具体地，宿主细胞是：

a)选自由以下项组成的组中的属的酵母细胞：毕赤酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、孔玛氏酵母属(Komagataella)、酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、绪方酵母属(Ogataea)、耶氏酵母属(Yarrowia)和地丝菌属(Geotrichum)，优选巴斯德毕赤酵母、菲氏孔玛氏酵母(Komagataella phaffii)、巴斯德孔玛氏酵母(Komagataella pastoris)、假巴斯德孔玛氏酵母(Komagataellapseudopastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、小绪方酵母(Ogataeaminuta)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromesmarxianus)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)；或者

b)丝状真菌诸如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或里氏木霉(Trichodermareesei)的细胞；或者

c)非人灵长类动物、人类、啮齿动物或牛细胞，诸如小鼠骨髓瘤(NSO)细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、HT1080、H9、HepG2、MCF7、MDBK Jurkat、MDCK、NIH3T3、PC12、BHK(幼仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、YB2/0、Y0、C127、L细胞、COS例如COS1和COS7、QC1-3、HEK-293、VERO、PER.C6、HeLA、EB1、EB2、EB3、溶瘤或杂交瘤细胞系；或者

d)昆虫细胞，诸如Sf9、Mimic^TMSf9、Sf21、High Five(BT1-TN-5B1-4)或BT1-Ea88细胞；或者

e)藻类细胞，诸如属于双眉藻属、硅藻属、杜氏藻属、小球藻属、衣藻属、蓝藻属(蓝藻细菌)、微拟球藻属、螺旋藻属或棕鞭藻属；或者

f)植物细胞，诸如来自单子叶植物的细胞，优选玉米、水稻、小麦或狗尾草，或来自双子叶植物的细胞，优选木薯、马铃薯、大豆、番茄、烟草、苜蓿、小立碗藓或拟南芥。

根据一个具体方面，宿主细胞可以是任何酵母细胞。具体地，宿主细胞是选自由以下项组成的组的属的酵母细胞：毕赤酵母属、汉逊酵母属、孔玛氏酵母属、酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、绪方酵母属、耶氏酵母属和地丝菌属，具体地，酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、小绪方酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、解脂耶氏酵母或多形汉逊酵母；或丝状真菌如泡盛曲霉或里氏木霉的细胞。优选地，宿主细胞是甲基营养酵母，优选巴斯德毕赤酵母。在本文中，巴斯德毕赤酵母被同义地用于所有巴斯德孔玛氏酵母、菲氏孔玛氏酵母和假巴斯德孔玛氏酵母。

具体实例涉及以下的酵母细胞：毕赤酵母属(例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)和安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta))、孔玛氏酵母属(例如，巴斯德孔玛氏酵母、假巴斯德孔玛氏酵母或菲氏孔玛氏酵母)、酿酒酵母属(例如酿酒酵母、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum))、克鲁维酵母属(例如，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus))、假丝酵母属(例如，产朊假丝酵母(Candida utilis)、可可假丝酵母(Candida cacaoi)、博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii))、地丝菌属(例如，发酵地丝菌(Geotrichum fermentans))、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

优选巴斯德毕赤酵母物种。具体地，宿主细胞为选自由CBS704、CBS2612、CBS7435、CBS9173-9189、DSMZ 70877、X-33、GS115、KM71、KM71H和SMD1168组成的组中的巴斯德毕赤酵母菌株。

来源：CBS704(＝NRRL Y-1603＝DSMZ 70382)，CBS2612(＝NRRL Y-7556)，CBS7435(＝NRRL Y-11430)，CBS9173-9189(CBS菌株：CBS-KNAW真菌生物多样性中心(CBS-KNAWFungal Biodiversity Centre)，真菌培养物保藏中心(Centraalbureau voorSchimmelculturen)，荷兰乌得勒支(Utrecht,The Netherlands))和DSMZ 70877(德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and CellCultures))；来自Thermo Fisher的菌株，诸如X-33、GS115、KM71、KM71H和SMD1168。

优选的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株的实例包括W303、CEN.PK和BY系列(EUROSCARF保藏)。上述菌株中的全部均已成功用于生产转化体和表达异源基因。

本发明进一步提供了一种通过共表达一个或多个表达细胞培养物中信使核糖核蛋白(mRNP)的一种或多种TIF基因的异源表达盒来增加目的蛋白(POI)当由表达编码所述POI的目的基因(GOI)的宿主细胞生产时的产量的方法。

本发明进一步提供了一种多肽表达系统，该多肽表达系统包含一个或多个表达信使核糖核蛋白(mRNP)的一种或多种TIF基因(诸如本文进一步描述的TIF基因)的异源表达盒。此类表达盒在本文中也称为TIF表达构建体或TIF(TIF基因)表达盒(TIFEC)。具体地，异源表达盒包含一个或多个与所述TIF基因可操作地连接以表达所述TIF基因的表达控制序列，特别地，其中所述表达控制序列(诸如例如启动子、信号肽或前导序列)中的至少一者不是天然地与所述TIF基因可操作地连接。具体地，TIF表达盒的特征如本文进一步所述。

具体地，该表达系统进一步包含表达盒，该表达盒包含编码目的蛋白(POI)的GOI和一个或多个与所述GOI可操作地连接的表达控制序列。此类表达盒在本文中也称为GOI表达构建体(GOIEC)或GOI表达盒。具体地，GOI表达盒的特征如本文进一步所述。具体地，包含GOI的表达盒与表达TIF基因的其他表达盒是分开的。

具体地，本文所述的表达系统的特征在于如本文进一步描述的表达盒和重组表达构建体的特征。

具体地，通过所述遗传工程化过表达的TIF基因各自包含在分开的表达盒中。然而，可以使用包含TIF基因中的至少两者或三者并且任选地进一步包含GOI的表达盒。

本发明进一步提供了一种宿主细胞，特别是诸如本文所述的宿主细胞，其包含本文所述的表达系统，特别是包含表达TIF基因的表达盒和表达GOI的表达盒的表达系统。

根据一个具体方面，宿主细胞是包含至少一个异源GOIEC(其包含与GOI可操作地连接的表达盒启动子)的重组宿主细胞，其中GOIEC中包含的至少一种组分或组分组合对宿主细胞是异源的。

具体地，使用人工表达盒，特别地其中启动子和待在所述启动子控制下表达的基因彼此异源，即不天然以此类组合存在，例如，其中启动子和基因中的任一者(或仅一者)是人工的或对另一者异源和/或对本文所述的宿主细胞异源；启动子是内源性启动子并且待表达的基因是异源基因；或者启动子是人工或异源启动子并且基因是内源性基因；其中启动子和基因都是人工的、异源的或来自不同来源，诸如来自与本文所述的宿主细胞相比不同物种或类型(株)的细胞。

根据一个具体方面，异源表达盒中的任何一者或多者(或全部)包含在一个或多个自主复制的载体或质粒中，或整合在所述宿主细胞的染色体内。

可以将表达盒引入宿主细胞中并作为染色体内元件整合到宿主细胞基因组(或其染色体中的任一者)中(例如在特定整合位点处或随机整合)，由此选择高产宿主细胞系。可替代地，表达盒可以整合在染色体外遗传元件(诸如质粒或人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC))内。根据一个具体实例，表达盒通过载体、特别是表达载体引入宿主细胞中，该表达盒通过合适的转化或转染技术引入宿主细胞中。为此，可以将待表达的异源多核苷酸(特别是GOI)连接到表达载体中。

优选的酵母表达载体(其优选用于在酵母中表达)选自由衍生自pPICZ、pGAPZ、pPIC9、pPICZα、pGAPZα、pPIC9K、pGAPHis、pPUZZLE或GoldenPiCS的质粒组成的组。

用于转染或转化宿主细胞以引入载体或质粒的技术是本领域众所周知的。这些可以包括电穿孔、原生质球、脂质囊泡介导的摄取、热休克介导的摄取、磷酸钙介导的转染(磷酸钙/DNA共沉淀)、病毒感染，并且特别地使用经修饰的病毒诸如例如经修饰的腺病毒、显微注射和电穿孔。

如本文所用，术语“转化”酵母细胞应理解为涵盖“转染”该酵母细胞。

可通过将表达盒、载体或质粒DNA引入宿主中并选择表达相关蛋白质或选择标记物的转化体来获得本文所述的转化体。可以通过常规用于转化宿主细胞的方法来处理宿主细胞以引入异源或外源DNA，该方法为诸如电脉冲法、原生质体法、乙酸锂法及其改良方法。用于通过微生物摄取重组DNA片段的优选转化方法包括化学转化、电穿孔或原生质体转化。

根据一个具体方面，使用包含以下或由以下组成的表达盒：多核苷酸的人工融合物，包括与异源多核苷酸可操作地连接的启动子，以及任选的另外的序列，诸如信号序列、前导序列或终止子序列。

具体地，TIFEC将所述TIF表达为细胞内蛋白质。

具体地，GOIEC包含信号序列和前导序列，这是表达和生产作为分泌蛋白的POI所必需的。

根据一个具体方面，GOI在5'端融合到编码分泌信号序列、优选异源分泌信号序列的核苷酸序列。

根据一个具体方面，GOIEC包含编码能够分泌POI的信号肽的核苷酸序列。具体地，编码信号肽的核苷酸序列在GOI的5'端附近融合。

信号序列可以是天然信号序列，在本文中被理解为与天然存在的蛋白质共表达、融合或以其他方式缔合以在表达时分泌此类蛋白质的信号序列。例如，天然分泌信号序列通常是与待分泌的相应蛋白质共表达、融合或以其他方式缔合的信号序列。具体地，使用对所述POI异源的(或不天然缔合的)所述POI的天然分泌信号序列，诸如源自不同于所述POI的分泌蛋白的信号序列。

可替代地，可以使用人工分泌信号序列，特别是与天然存在的分泌信号序列具有85％、90％或95％序列同一性中的至少任一者的信号序列。

具体地，信号序列选自由以下项组成的组：来自酿酒酵母α-交配因子前体肽的信号序列、来自巴斯德毕赤酵母酸性磷酸酶基因(PHO1)的信号序列和胞外蛋白X(EPX1)(Heiss,S.,V.Puxbaum,C.Gruber,F.Altmann,D.Mattanovich&B.Gasser,Microbiology2015；161(7):1356-68)。

具体地，可以使用如WO2014067926 A1或WO2012152823 A1中描述的信号序列和/或前导序列中的任一者。

附图说明

图1：本文提及的序列

具体实施方式

除非另有说明或定义，否则本文使用的所有术语均具有其在本领域中的通常含义，这对本领域技术人员而言将是清楚的。例如，参考了标准手册，诸如Sambrook等人,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"(第2版),Vols.1 -3,Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)；Lewin,"Genes IV",Oxford University Press,New York,(1990)和Janeway等人,"Immunobiology"(第5版或更近版本),Garland Science,NewYork,2001。

如本文所用的术语“包含”、“含有”、“具有”和“包括”可以同义使用并且应被理解为开放性定义，允许另外的成员或部分或元素。“组成”被认为是最闭合性的定义，没有组成定义特征的另外的元素。因此，“包含/包括”的范围更广并且含有“组成”定义。

如本文所用的术语“约”是指相同的值或与给定值相差+/-10％或+/-5％的值。

整个说明书中使用的特定术语具有以下含义。

如本文所用的关于“宿主细胞”的术语“细胞”应指宿主细胞的单细胞、单细胞克隆或细胞系。

如本文所用的术语“细胞系”是指已获得在延长的时间段内增殖的能力的特定细胞类型的已建立克隆。细胞系通常用于表达内源或重组核酸分子或基因、或代谢途径的产物以生产多肽或由此类多肽介导的细胞代谢物。“生产宿主细胞系”或“生产细胞系”通常被理解为准备好用于在生物反应器中进行细胞培养以获得生产过程的产物(诸如POI)的细胞系。

本文所述的具体实施方案是指生产宿主细胞系，其被工程化以共表达至少两个不同的多核苷酸(核酸分子或基因)、至少一个编码本文所述的TIF的TIF基因和至少一个编码POI的目的基因(GOI)，特别地，其中通过共表达相应多核苷酸以高产量生产POI。

如本文所述的生产POI的宿主细胞也称为“生产宿主细胞”，并且相应细胞系被称为“生产细胞系”。本文所述的具体实施方案是指此类POI生产宿主细胞系，其被工程化以共表达所述TIF，并且其特征在于POI生产的高产量。

如本文所用的术语“宿主细胞”应特别适用于任何适合用于重组目的以生产POI或宿主细胞代谢物的细胞。众所周知，术语“宿主细胞”不包括人类。具体地，本文所述的重组宿主细胞是天然(野生型)宿主细胞的人工生物体和衍生物。众所周知，本文描述的宿主细胞、方法和用途，例如，具体指包含一种或多种遗传修饰、异源表达盒或人工表达构建体的那些，所述转染或转化的宿主细胞和重组蛋白是非天然存在的，是“人造的”或合成的，并且因此不被视为“自然法则”的结果。本文描述的遗传修饰可以采用本领域已知的工具、方法和技术，诸如J.Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版),ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2001)所描述的。

如本文关于宿主细胞所用的术语“细胞培养”或“培养(culturing或cultivation)”是指在人工(例如体外)环境中，在有利于细胞的生长、分化或持续存活的条件下，在细胞的活性或静止状态下，特别是在受控的生物反应器中，根据业内已知的方法，来维持细胞。

当使用合适的培养基来培养细胞培养物时，使细胞在适合支持在细胞培养物中培养细胞的条件下与培养容器中的培养基或与底物接触。标准细胞培养基和技术是本领域众所周知的。

如本文所述的细胞培养物特别地采用提供如下的技术，即在细胞培养基中生产分泌POI诸如以获得POI，该POI可与细胞生物量分离，本文称为“细胞培养物上清液”，并且可以纯化以获得更高纯度的POI。当在细胞培养物中通过宿主细胞生产并分泌蛋白质(诸如例如POI)时，本文中应当理解，此类蛋白质被分泌到细胞培养物上清液中，并且可通过将细胞培养物上清液与宿主细胞生物量分离，并任选地进一步纯化该蛋白质以生产纯化的蛋白质制剂而获得。

细胞培养基提供在受控、人工和体外环境中维持和生长细胞所必需的营养物。细胞培养基的特性和组成因特定的细胞需求而异。重要参数包括渗透压、pH和营养配制品。可以根据本领域已知的方法以连续或不连续的模式进行营养物的进料。

而分批过程是细胞培养模式，其中培养细胞所必需的所有营养物都被含在初始培养基中，而在发酵期间不额外供应另外的营养物，在补料分批或连续过程中，在分批阶段之后，发生补料阶段，其中通过进料而向培养物供应一种或多种营养物。尽管在大多数过程中，进料的模式是关键且重要的，但本文所述的宿主细胞和方法不限于某一种细胞培养模式。

可以使用本文所述的宿主细胞和相应细胞系，通过在合适的培养基中培养，从培养物中分离表达的产物或代谢物，以及任选地通过合适的方法将其纯化来生产重组POI。

优选用于生产本文所述的POI的几种不同方法。可以通过用带有编码相关蛋白质的重组DNA的表达载体转化或转染宿主细胞，制备经转化或转染的细胞的培养物，使培养物生长，诱导转录和POI生产，以及回收POI来表达、处理以及任选地分泌POI。

在某些实施方案中，细胞培养过程是补料分批过程。具体地，在生长阶段中培养转染有编码所需的重组POI的核酸构建体的宿主细胞，并过渡到生产阶段，以生产所需的重组POI。

在另一个实施方案中，本文所述的宿主细胞以连续模式培养(例如采用恒化器法)。连续发酵过程的特征在于以限定的、恒定的和连续的速率将新鲜的培养基进料到生物反应器中，由此培养液同时以相同的限定的、恒定的和连续的去除速率从生物反应器中去除。通过将培养基、进料速率和去除速率保持在相同的恒定水平，生物反应器中的细胞培养参数和条件保持恒定。

在另一个实施方案中，本文所述的宿主细胞以灌注模式培养，例如，在装置内培养细胞，同时供应新鲜培养基并去除上清液。

如本文所述的稳定细胞培养物具体地被理解为是指保持基因性质的细胞培养物，特别是将POI生产保持在高水平，例如至少保持在μg水平，甚至在约20代培养、优选地至少30代培养、更优选地至少40代培养、最优选地至少50代培养之后。具体地，提供了一种稳定的重组宿主细胞系，这当用于工业规模生产时被认为是一个很大的优势。

本文所述的细胞培养物与基于营养物的进料、特别是补料分批或分批过程、或连续或半连续过程(例如恒化器法)的培养模式相结合，对于工业生产规模的方法特别有利，例如就体积和技术系统而言。

通常测试本文描述的宿主细胞表达GOI以用于POI生产的能力，通过以下测试中的任一者来测试POI产量：ELISA、活性测定、毛细管电泳、HPLC或其他合适的测试，诸如SDS-PAGE和蛋白质印迹技术，或质谱。

为了确定与没有此类用于在相应细胞中共表达的遗传修饰的菌株相比，共表达一种或多种TIF的作用，例如，对POI生产的影响，可以使用补料分批或恒化器发酵而在微量滴定板、摇瓶或生物反应器中培养宿主细胞系。

本文所述的生产方法具体地允许在中试或工业规模上进行发酵。工业过程规模将优选地采用至少10L，具体地至少50L，优选至少1m³，优选至少10m³，最优选至少100m³的体积。

工业规模的生产条件是优选的，其是指例如在100L至10m³或更大的反应器体积中的补料分批培养(采用若干天的典型过程时间)，或在大约50L至1000L或更大的发酵罐体积中的连续过程，其中稀释速率为大约0.001h^-1至0.15h^-1。

用于本文所述目的的装置、设施和方法具体地适合用于培养任何所需的细胞系并与该细胞系一起使用。此外，该装置、设施和方法适合于培养任何酵母宿主细胞类型，并且特别适合于被配置成用于生产药物和生物制药产品(诸如多肽产品(POI)、核酸产品(例如DNA或RNA)，或细胞和/或病毒，诸如用于细胞和/或病毒疗法的那些)的生产操作。

在某些实施方案中，细胞表达或生产产物，诸如重组治疗性或诊断性产物。如本文更详细描述的，由细胞生产的产物的实例包括但不限于诸如本文例举的POI，包括抗体分子(例如，单克隆抗体、双特异性抗体)、抗体模拟物(与抗原特异性结合但在结构上不与抗体相关的多肽分子，诸如例如DARPin、亲和体、adnectin或IgNAR)、融合蛋白(例如，Fc融合蛋白、嵌合细胞因子)、其他重组蛋白(例如，糖基化蛋白、酶、激素)或病毒治疗剂(例如，抗癌溶瘤病毒、用于基因疗法和病毒免疫疗法的病毒载体)、细胞治疗剂(例如，多能干细胞、间充质干细胞和成体干细胞)、疫苗或脂质包封的颗粒(例如，外来体、病毒样颗粒)、RNA(诸如例如，siRNA)或DNA(诸如例如，质粒DNA)、抗生素或氨基酸。在实施方案中，装置、设施和方法可以用于生产生物类似物。

如所提到的，在某些实施方案中，装置、设施和方法允许生产真核细胞，诸如例如酵母细胞，和/或所述细胞的产物，例如POI(包括蛋白质、肽或抗生素)、氨基酸、核酸(诸如DNA或RNA)，它们由所述细胞以大规模方式合成。除非本文另有说明，装置、设施和方法可以包括任何所期望的容积或生产能力，包括但不限于实验室规模、中试规模和全生产规模能力。

此外并且除非本文另有说明，否则装置、设施和方法可以包括任何合适的反应器，包括但不限于搅拌釜、气升式、纤维、微纤维、中空纤维、陶瓷基、流化床、固定床和/或喷动床生物反应器。如本文所用，“反应器”可以包含发酵罐或发酵单元或任何其它反应容器，并且术语“反应器”与“发酵罐”可互换地使用。例如，在一些方面，示例生物反应器单元可以执行以下中的一项或多项或全部：营养物和/或碳源的进料、合适的气体(例如，氧气)的注射、发酵或细胞培养基的入口和出口流动、气相和液相的分离、温度的维持、氧气和CO₂水平的维持、pH水平的维持、搅动(例如，搅拌)和/或清洁/灭菌。示例反应器单元，如发酵单元可以含有在单元内的多个反应器，例如所述单元可以具有在每个单元中的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个或更多个生物反应器和/或设施可以含有多个单元，所述多个单元具有在所述设施内的单个或多个反应器。在各种实施方案中，生物反应器可以适用于分批、半补料分批、补料分批、灌注和/或连续发酵过程。可以使用任何合适的反应器直径。在实施方案中，生物反应器的体积可以介于约100mL与约50,000L之间。非限制性实例的体积为100mL、250mL、500mL、750mL、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10,000升、15,000升、20,000升和/或50,000升。另外，合适的反应器可以是多次使用的、单次使用的、一次性的或非一次性的，并且可以由任何合适的材料(包括金属合金诸如不锈钢(例如，316L或任何其他合适的不锈钢)以及铬镍铁合金(Inconel)、塑料和/或玻璃)形成。

在实施方案中并且除非本文另有说明，本文中所描述的装置、设施和方法还可以包括未另外提及的任何合适的单元操作和/或装备，诸如用于分离、纯化和离析此类产物的操作和/或装备。可以使用任何合适的设施和环境，如传统的构件式建造设施、模块化、移动和临时设施，或任何其他合适的建筑、设施和/或布局。例如，在一些实施方案中，可以使用模块化洁净室。另外并且除非另有说明，否则本文中所描述的装置、系统和方法可以容纳在单个位置或设施中和/或在单个位置或设施中执行，或可替代地容纳在单独或多个位置和/或设施中和/或在单独或多个位置和/或设施中执行。

合适的技术可以涵盖在生物反应器中的培养，从分批阶段开始，随后是高比生长速率的短指数补料分批阶段，进一步随后是低比生长速率的补料分批阶段。另一种合适的培养技术可以涵盖分批阶段，随后是任何合适的比生长速率或比生长速率的组合(诸如随着POI生产时间从高到低的生长速率，或者随着POI生产时间从低到高的生长速率)的补料分批阶段。另一种合适的培养技术可以涵盖分批阶段，随后是在低稀释速率下的连续培养阶段。

一个优选的实施方案包括提供生物量的分批培养，随后是用于高产量POI生产的补料分批培养。

优选在生长条件下在生物反应器中培养如本文所述的宿主细胞，以获得至少1g/L细胞干重、更优选地至少10g/L细胞干重、优选地至少20g/L细胞干重、优选地30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L或80g/L细胞干重中的至少任一者的细胞密度。在中试或工业规模下提供生物量生产的此类产量是有利的。

允许积累生物量的生长培养基(特别是基础生长培养基)通常包含碳源、氮源、硫源和磷酸盐源。通常，此类培养基还包含微量元素和维生素，并且可以进一步包含氨基酸、蛋白胨或酵母提取物。

优选的氮源包括NH₄H₂PO₄或NH₃或(NH₄)₂SO₄；

优选的硫源包括MgSO₄或(NH₄)₂SO₄或K₂SO₄；

优选的磷酸盐源包括NH₄H₂PO₄或H₃PO₄或NaH₂PO₄、KH₂PO₄、Na₂HPO₄或K₂HPO₄；

其他典型的培养基组分包括KCl、CaCl₂和微量元素，诸如：Fe、Co、Cu、Ni、Zn、Mo、Mn、I、B；

优选地，培养基补充有生长必需的维生素，例如B族维生素，诸如B₇；

用于巴斯德毕赤酵母的典型生长培养基包含甘油、山梨醇或葡萄糖、NH₄H₂PO₄、MgSO₄、KCl、CaCl₂、生物素和微量元素。

在生产阶段，生产培养基具体地仅与有限量的补充碳源一起使用。

优选地，宿主细胞系在具有合适碳源的矿物培养基中培养，从而进一步显著地简化分离过程。优选的矿物培养基的实例是这样的矿物培养基，其含有可利用的碳源(例如葡萄糖、甘油、山梨醇、甲醇、乙醇或其组合)、含有常量元素(钾、镁、钙、铵、氯化物、硫酸盐、磷酸盐)和微量元素(铜、碘、锰、钼酸盐、钴、锌和铁盐以及硼酸)的盐，以及任选的维生素或氨基酸的培养基，例如以补充营养缺陷型。

具体地，在适于对所需POI的表达起作用的条件下培养细胞，所述POI可以从细胞或培养基中纯化，这取决于表达系统和所表达的蛋白质的性质，例如蛋白质是否与信号肽融合以及蛋白质是可溶的还是膜结合的。如本领域技术人员将理解的，培养条件将根据包括宿主细胞的类型和所采用的特定表达载体的因素而变化。

典型的生产培养基包含补充碳源，以及另外的NH₄H₂PO₄、MgSO₄、KCl、CaCl₂、生物素和微量元素。

例如，添加到发酵中的补充碳源的进料可以包含具有最多50wt％的可利用糖或最多100％的可利用醇的碳源。

发酵优选以3至8范围内的pH进行。

典型的发酵时间为约24至120小时，其中温度范围为20℃至35℃，优选22℃至30℃。

优选地采用生产至少1mg/L、优选地至少10mg/L、优选地至少100mg/L、最优选地至少1g/L的产量的条件来表达POI。

术语“表达”或“表达盒”在本文中被理解为指核酸分子(本文中也称为多核苷酸)，其含有可操作地连接的所需编码序列(本文中称为基因)和控制序列，使得用这些分子转化或转染的宿主掺入相应序列，并能够生产编码的蛋白质或宿主细胞代谢物。如本文所用的术语“表达”是指多核苷酸或基因的表达，或相应多肽或蛋白质的表达。

一个或多个表达盒在本文中也被理解为“表达系统”。表达系统可以包括在表达构建体(诸如载体)中；然而，相关的DNA也可以整合到宿主细胞染色体中。表达可以指分泌的或非分泌的表达产物，包括多肽或代谢物。

表达盒方便地提供为表达构建体，例如呈“载体”或“质粒”的形式，它们通常是在合适的宿主生物体中转录克隆的重组核苷酸序列(即重组基因)及翻译其mRNA所需的DNA序列。表达载体或质粒通常包含用于自主复制的起点或用于在宿主细胞中基因组整合的基因座、选择性标记物(例如，氨基酸合成基因或赋予抗生素抗性的基因，该抗生素为诸如zeocin、卡那霉素(kanamycin)、G418或潮霉素(hygromycin)、诺尔丝菌素(nourseothricin))、多个限制性内切酶切割位点、合适的启动子序列和转录终止子，所述组分可操作地连接在一起。如本文所用的术语“质粒”和“载体”包括自主复制的核苷酸序列以及整合核苷酸序列的基因组，诸如人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)。

表达载体可包括但不限于克隆载体、修饰的克隆载体和专门设计的质粒。本文所述的优选表达载体是适合于在真核宿主细胞中表达重组基因的表达载体，并且根据宿主生物体进行选择。合适的表达载体通常包含适用于在真核宿主细胞中表达编码POI的DNA的调控序列。调控序列的实例包括启动子、操作子、增强子、核糖体结合位点以及控制转录和翻译起始和终止的序列。调控序列通常与待表达的DNA序列可操作地连接。

为了允许在宿主细胞中表达重组核苷酸序列，启动子序列通常调控和启动与其可操作地连接的下游核苷酸序列的转录。表达盒或载体通常包含启动子核苷酸序列，该启动子核苷酸序列与编码序列的5'端相邻，例如，在编码序列(例如，编码辅助因子)或目的基因(GOI)的上游和附近，或者如果使用信号或前导序列，则分别在所述信号和前导序列的上游和附近，以促进编码序列的翻译起始和表达，从而获得表达产物(例如TIF或POI)。

本文所述的特异性表达构建体包含在所述启动子的转录控制下与编码TIF或POI的核苷酸序列可操作地连接的启动子。具体地，可以使用不与所述编码序列天然缔合的启动子。

本文所述的特异性表达构建体包含编码与前导序列(例如，分泌信号肽序列(前序列(pre-sequence))或原序列(pro-sequence))连接的POI的多核苷酸，这引起POI转运到分泌途径和/或从宿主细胞分泌POI。当用于重组表达和分泌的POI是非天然分泌的并且因此缺乏天然分泌前导序列的蛋白质，或者其核苷酸序列已经在没有其天然分泌前导序列的情况下被克隆时，通常需要在表达载体中存在此类分泌前导序列。一般来说，可以使用任何有效引起从宿主细胞中分泌POI的分泌前导序列。分泌前导序列可以来源于酵母源，例如来源于酵母α因子诸如酿酒酵母的MFα，或来源于哺乳动物或植物源的酵母磷酸酶，或其他。

在具体实施方案中，可以使用多克隆载体，其是具有多克隆位点的载体。具体地，可在多克隆位点处将所需的异源多核苷酸整合或掺入以制备表达载体。在多克隆载体的情况下，启动子通常位于多克隆位点的上游。

如本文所用的术语“基因表达”或“表达多核苷酸”或“表达核酸分子”意在涵盖至少一个选自由以下项组成的组的步骤：将DNA转录成mRNA、mRNA翻译和加工、mRNA成熟、mRNA输出、翻译、蛋白质折叠和/或蛋白质转运。

如本文可互换使用的术语“多核苷酸”、“核酸分子”或“核酸序列”是指任何长度的聚合非支化形式的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者的组合)。优选地，多核苷酸是指任何长度的聚合非支化形式的脱氧核糖核苷酸。在这里，核苷酸由戊糖(脱氧核糖)、含氮碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶)和磷酸酯基团组成。

如本文所用的术语“共表达(co-express或co-expression)”是指在宿主细胞、细胞系或细胞培养物中，例如以大约相同或不同的数量或比例，伴随或连续(然而，当在同一细胞培养物或容器中培养细胞时)或同时表达至少两个或多个多核苷酸(核酸分子，诸如基因)。

如本文所述，可以共表达多核苷酸(如TIF基因)，使得多核苷酸(如GOI)中的至少一者被过表达。

将共表达TIF基因的宿主细胞(诸如本文所述的宿主细胞)特异性遗传工程化和修饰为增加宿主细胞培养物中所述TIF基因的表达，这在本文中也称为“过表达”或“共过表达”。

如本文所用，术语“过表达(overexpress或overexpression)”应指表达产物(诸如多肽或蛋白质)的表达水平高于相同表达产物在宿主细胞的遗传修饰之前的表达水平或在未在规定条件下进行遗传修饰的比较性宿主中的表达水平。如果此类宿主细胞正在表达此类TIF，则对宿主细胞异源的TIF总是被理解为过表达。例如，当本文所述的宿主细胞不天然表达所述TIF中的任一者时，将编码此类TIF蛋白质的异源多核苷酸新引入宿主细胞中进行表达；在此类情况下，此类TIF的任何可检测表达都涵盖在术语“过表达”中。

编码蛋白质的基因(诸如TIF基因)的过表达也称为蛋白质(诸如TIF)的过表达。可以以本领域技术人员已知的任何方式实现过表达。一般来说，它可以通过增加基因的转录/翻译来实现，例如通过增加基因的拷贝数或改变或修饰与基因的表达相关联的调控序列或位点来实现。例如，基因可以与强启动子可操作地连接以达到高表达水平。此类启动子可以是内源启动子或异源启动子，特别是重组启动子。可以用增加基因的表达的异源启动子取代启动子。使用诱导型启动子还可以增加培养过程中的表达。此外，还可以通过例如修饰特定基因的染色体位置，改变与特定基因(诸如核糖体结合位点或转录终止子)相邻的核酸序列，在开放阅读框中引入框移，修饰参与基因的转录和/或基因产物的翻译的蛋白质(例如，调控蛋白、遏抑因子(suppressor)、增强子、转录激活因子等)，或本领域常规的解除对特定基因的表达进行调控的任何其他常规手段(包括但不限于使用反义核酸分子，例如，以阻断阻抑蛋白的表达，或使通常阻抑期望过表达的基因的表达的转录因子的基因缺失或突变来实现过表达)。延长mRNA的寿命也可以改善表达水平。例如，某些终止子区域可用于延长mRNA的半衰期。如果包括基因的多个拷贝，则该基因或者可以位于可变拷贝数的质粒中，或者可以在染色体中整合和扩增。可以将一个或多个基因或基因组序列引入宿主细胞中进行表达。

根据一个具体实施方案，编码相应TIF的多核苷酸可以每个细胞单拷贝或多拷贝存在。该拷贝可以彼此相邻或远离。根据另一个具体实施方案，相应TIF的过表达采用编码TIF的重组核苷酸序列，该重组核苷酸序列以每个细胞单拷贝或多拷贝提供在一个或多个适合整合到宿主细胞基因组(即敲入)中的质粒上。该拷贝可以彼此相邻或远离。可以通过表达多核苷酸的多个拷贝(诸如所述多核苷酸的每个宿主细胞2、3、4、5、6或更多个拷贝)来实现过表达。

包含GOI和编码相应TIF的多核苷酸(基因)的重组核苷酸序列可以提供在一个或多个自主复制的质粒上，并以每个细胞单拷贝或多拷贝引入。

可替代地，包含GOI和编码TIF的多核苷酸(基因)的重组核苷酸序列可以存在于同一质粒上，并以每个细胞单拷贝或多拷贝引入。

编码相应TIF的异源多核苷酸(基因)或包含编码TIF的多核苷酸(基因)的异源重组表达构建体优选整合到宿主细胞的基因组中。

术语“基因组”通常是指编码在DNA(或RNA)中的生物体的全部遗传信息。它可能存在于染色体中，存在于质粒或载体或两者上。优选地，编码相应TIF的多核苷酸(基因)整合到所述细胞的染色体中。

编码相应TIF的多核苷酸(基因)可以整合在其天然基因座中。“天然基因座”意指特异性染色体上的位置，其中编码TIF的多核苷酸(基因)位于天然存在的野生型细胞中。然而，在另一个实施方案中，编码TIF的多核苷酸(基因)存在于宿主细胞的基因组中，不是在天然基因座处，而是异位整合。术语“异位整合”意指将核酸插入微生物的基因组中不同于其通常染色体基因座的位点，即预定或随机整合。在另一个实施方案中，编码TIF的多核苷酸(基因)被整合到天然基因座中并且异位整合。异源重组可用于实现随机或非靶向整合。异源重组是指具有显著不同序列的DNA分子之间的重组。

在具体实施方案中，编码相应TIF和/或GOI的多核苷酸(基因)可以整合在质粒或载体中。优选地，质粒是真核表达载体，优选酵母表达载体。合适的质粒或载体在本文中进一步描述。

内源或异源多核苷酸在重组宿主细胞中的过表达可以通过修饰表达控制序列来实现。表达控制序列是本领域已知的并且包括例如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、转录终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等，该表达控制序列提供多核苷酸序列在宿主细胞中的表达。表达控制序列与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用。示例性表达控制序列描述于例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Vol.185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中。

在一个优选的实施方案中，过表达通过使用增强子表达多核苷酸来实现。转录增强子是相对取向和位置独立的，已在转录单元的5'和3'、内含子内以及编码序列本身内被发现。增强子可以在编码序列的5'或3'位剪接到表达载体中，但优选位于启动子的5'位点。大多数酵母基因仅含一个UAS，通常位于帽位点的几百个碱基对内，并且大多数酵母增强子(UAS)在位于启动子的3'时无法发挥作用，但高等真核生物中的增强子在启动子的5'和3'均可发挥作用。

许多增强子序列已知来自哺乳动物基因(珠蛋白、RSV、SV40、EMC、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。还可以使用来自真核细胞病毒的增强子，诸如SV40晚期增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子。

具体地，如本文所述的GOI和/或TIF编码多核苷酸(基因)与提供在宿主细胞中表达的转录和翻译调控序列可操作地连接。如本文所用的术语“翻译调控序列”是指与基因核酸序列相关联并调控基因的翻译的核苷酸序列。转录和/或翻译调控序列可以位于质粒或载体中或整合在宿主细胞的染色体中。转录和/或翻译调控序列位于其调控的基因的同一核酸分子中。

具体地，相应TIF的过表达可以通过本领域已知的方法，例如通过遗传修饰它们的内源性调控区来实现，如Marx等人,2008(Marx,H.,Mattanovich,D.和Sauer,M.MicrobCell Fact7(2008):23)所述，此类方法包括例如整合增加基因的表达的重组启动子。

例如，内源或异源多核苷酸在重组宿主细胞中的过表达可以通过修饰控制此类表达的启动子，例如通过用另一个更强的启动子替换与所述多核苷酸可操作地连接的启动子(例如，内源性启动子或天然连接到所述野生型生物体中的多核苷酸的启动子)来实现，以达到高表达水平。此类启动子可以是诱导型的或组成型的。启动子的修饰也可以通过本领域已知的诱变方法来进行。

具体实施方案是指TIF(或TIF基因)与表达GOI的共表达。在本文所述的一些实施方案中，载体或核酸序列可以包括一个或多个用于共表达至少一种TIF分子和GOI的表达盒。可以构建载体或核酸序列以允许使用多种技术来共表达两个或更多个多核苷酸，包括共转染两个或更多个质粒、使用多向或双向启动子、或创建双顺反子或多顺反子载体。

具体实施方案是指稳定共表达至少一种、两种、三种、四种或五种TIF(例如在引入相应表达盒以稳定整合在宿主细胞基因组或染色体内后)的遗传修饰。

如本文所用的术语“功能活性变体”也称为“功能变体”，意指天然序列(“天然”被理解为野生型细胞中天然存在的序列)以外的任何序列，例如源自或涉及TIF或TIF的核苷酸序列或氨基酸序列的序列。本文描述的是任何(亲本)TIF或相应TIF基因(诸如包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1-65中的任一者；特别是SEQ ID No:1、12、23、34、45或56中的任一者)的与亲本序列具有某一序列同一性的特异性功能变体。

根据一个具体实施方案，功能变体源自天然序列并且包含预定序列或由预定序列组成，该预定序列在宿主细胞中具有已证实的功能，与它所源自的天然序列相比，该功能大约相同和/或甚至有所改善。

根据一个具体实施方案，功能变体是天然存在的亲本分子的同种型或直系同源物，该直系同源物天然存在于包含天然存在的亲本分子的物种(例如哺乳动物或真菌物种)以外的物种中。

在一些实施方案中，多核苷酸或核酸分子的功能变体包含经过序列优化的核苷酸序列，该优化例如用于改善核酸稳定性，增加宿主细胞中的翻译效率，减少表达的截短蛋白的数量，改善所表达蛋白质的折叠或防止所表达蛋白质的错误折叠，降低所表达产物的毒性，减少由所表达产物引起的细胞死亡，或增加和/或减少蛋白质聚集。根据一个具体实施方案，亲本核苷酸序列的功能变体是待在宿主细胞中表达的所述亲本核苷酸序列的密码子优化变体，其可通过对亲本核苷酸序列进行一种或多种遗传修饰以改善在宿主细胞的细胞环境中的表达来获得。

如果其具有与天然序列基本相同或改善的活性，特别是当在宿主细胞中共表达时改善POI生产，则如本文所述的TIF的功能变体被认为具有功能活性。

TIF的功能活性变体可以通过诱变相应天然(野生型)TIF基因以生产其变体，在宿主细胞中与异源POI编码基因伴随或同时表达该变体，以及评定变体改善宿主细胞生产POI的生存率的活性来制备。

TIF的活性可以按照众所周知的方法使用例如体外和体内方法来确定。

分析翻译活性的合适方法总结在Dermit等人(Mol Biosyst.2017Nov21；13(12):2477-24882017)中。

一些其他合适的方法采用放射性标记积极翻译的蛋白质(掺入放射性标记的氨基酸)，如Martin R(1998；Protein synthesis:methods and protocols.Methods inMolecular Biology,Volume77,Totowa,N.J.:Humana Press)所述。

在下面的实施例部分中描述了测量翻译活性的具体测试。

亲本蛋白质的功能变体包括例如其中一个或多个氨基酸残基在N末端或C末端以及在一个或多个内部结构域内被添加或缺失的蛋白质。特异性功能活性变体在N末端和/或在C末端包含额外的氨基酸，以将亲本序列延长例如少于100个氨基酸，具体地少于75个氨基酸，更具体地少于50个氨基酸，更具体地少于25个氨基酸，或者少于10个氨基酸。其他特异性功能活性变体可以是融合蛋白，其中本发明的序列由另一多肽或蛋白质的额外氨基酸残基延长。

特异性功能变体是亲本蛋白质或核酸分子的片段。

作为多核苷酸或核酸分子的片段的功能变体的范围可以从至少20个核苷酸，优选至少100个核苷酸，最多为编码本文所述的TIF的全长核苷酸序列。多核苷酸或核酸分子的功能活性片段可包含相应核苷酸序列的至少50％，优选60％、70％、80％、85％、90％或95％中的至少任一者。

作为多肽或蛋白质的片段的功能变体可包含以下或由以下组成：至少10个氨基酸，具体地至少25个氨基酸，更具体地至少50个氨基酸，更具体地至少75个氨基酸，或至少100个连续氨基酸，或最多为全长蛋白质中存在的氨基酸的总数。

如本文所用的术语“内源”意在包括那些分子和序列，特别是内源基因或蛋白质，它们在被修饰以减少相应内源基因的表达和/或减少内源蛋白质的生产之前存在于野生型(天然)宿主细胞中。特别地，在自然界中发现的特定宿主细胞中确实存在(并且可以从中获得)的内源性核酸分子(例如，基因)或蛋白质被理解为“宿主细胞内源性”或“对宿主细胞内源”。此外，“内源性表达”核酸或蛋白质的细胞就像在自然界中发现的相同特定类型的宿主中表达一样来表达该核酸或蛋白质。此外，“内源性生产(endogenously producing或endogenously produces)”核酸、蛋白质或其他化合物的宿主细胞就像在自然界中发现的相同特定类型的宿主细胞中生产一样来生产该核酸、蛋白质或化合物。

因此，即使宿主细胞不再生产内源性蛋白质，诸如在宿主细胞的其中蛋白质编码基因失活或缺失的敲除突变体中，该蛋白质在本文中仍被称为“内源性”。

如本文关于核苷酸序列、构建体(诸如表达盒)、氨基酸序列或蛋白质所用的术语“异源的”是指这样的化合物，即对于给定宿主细胞来说是外来的，即“外源的”，诸如不是天然发现于所述宿主细胞中；或者是在给定宿主细胞中天然发现的，例如，是“内源的”，然而，在异源构建体或整合在此类异源构建体中的背景下，例如，采用与内源性核酸融合或结合的异源核酸，从而使构建体异源。内源性发现的异源核苷酸序列也可以在细胞中以非天然量生产，例如以大于预期量或大于天然发现的量生产。异源核苷酸序列或包含异源核苷酸序列的核酸可能在序列上不同于内源性核苷酸序列但与内源发现的一样编码相同的蛋白质。具体地，异源核苷酸序列是那些未发现在自然界中与宿主细胞关系相同的核苷酸序列。任何重组或人工核苷酸序列都被理解为异源的。异源多核苷酸的实例是这样的核苷酸序列：不与启动子天然缔合例如以获得杂合启动子，或与编码序列可操作地连接，如本文所述。结果，可以获得杂合或嵌合多核苷酸。异源化合物的进一步实例是与转录控制元件例如启动子可操作地连接的POI编码多核苷酸，内源性、天然存在的POI编码序列通常不与该转录控制元件可操作地连接。

如本文所用的术语“翻译起始因子”缩写为“TIF”，是指翻译起始因子蛋白质或编码翻译起始因子的多核苷酸(核酸分子)。

具体地，本文描述的TIF中无一者是目的蛋白(POI)。应具体理解，本文所述的重组宿主细胞包含表达TIF并另外表达另一多核苷酸(不同于所述TIF编码多核苷酸)的表达系统，本文称为目的基因(GOI)。

如本文所用的术语“翻译起始因子”特别地指包含在mRNP中的因子中的任一者。

特异性TIF编码核苷酸序列是天然存在者或其功能活性变体，诸如变体核苷酸序列，该变体核苷酸序列与亲本(天然存在的)核苷酸序列的不同之处在于一个或多个优化序列的点突变(例如，最多为50、40、30、20或10个点突变中的任一者)，诸如通过核苷酸序列优化算法或通过密码子优化技术进行优化以改善其在重组宿主细胞中的表达。

具体的优化技术是改善宿主细胞中核苷酸序列的表达，诸如通过核苷酸序列优化算法或通过密码子优化技术进行改善。

具体的优化技术是改善克隆，诸如金门克隆或金门组装体的优化。

特异性优化核苷酸序列包含“沉默”突变，诸如以避免存在任何所用限制性内切酶(例如BsaI和BpiI)的识别位点。

本文所述的优化核苷酸序列通常允许一个或多个(例如几个)编码氨基酸序列中的点突变，例如最多10、9、8、7、6、5、4或3个点突变。

“eIF4E”，也称为真核翻译起始因子4E，是参与形成闭环mRNA(它是闭环因子)以及eIF4F帽结合复合物的一部分和mRNP的一部分的TIF。其特征在于SEQ ID NO:1-11中的任一者，或其他真核物种中的直系同源物。eIF4E由eIF4E编码核苷酸序列编码，该核苷酸序列可以是天然存在的eIF4E基因，或其编码与天然存在的eIF4E具有某一序列同一性的eIF4E的相应功能变体。示例性的eIF4E编码核苷酸序列由菲氏孔玛氏酵母的编码SEQ ID NO:1的SEQ ID NO:66或其功能活性变体鉴别。SEQ ID NO:67鉴别优化的编码核苷酸序列的实例(其已通过金门优化生产)，并且与SEQ ID NO:66的区别在于以下三个核苷酸取代：A276G、T354C、G492A。

eIF4A也称为真核翻译起始因子4A，是参与形成闭环mRNA(它是闭环因子)以及eIF4F帽结合复合物的一部分和mRNP的一部分的TIF。其特征在于SEQ ID NO:12-33中的任一者，或其他真核物种中的直系同源物。术语“eIF4A”包括TIF2a和Tif2b，其中TIF2b是TIF2a在5'端长出249个核苷酸(对应于83个氨基酸)的变体。这两个序列都是直接从巴斯德毕赤酵母基因组扩增而来的，并呈现出eIF4A的具有可替代的起始位置的两种变体。

eIF4A由eIF4A编码核苷酸序列编码，该核苷酸序列可以是天然存在的eIF4A基因，或其编码与天然存在的eIF4A具有某一序列同一性的eIF4A的相应功能变体。示例性的eIF4A编码核苷酸序列由菲氏孔玛氏酵母的分别编码SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:23的SEQID NO:68或SEQ ID NO:70或其功能活性变体鉴别。SEQ ID NO:69鉴别优化的编码核苷酸序列的实例(其已通过金门优化生产)，并且与SEQ ID NO:68的区别在于以下一个核苷酸取代：C45A。SEQ ID NO:71鉴别优化的编码核苷酸序列的实例(其已通过金门优化生产)，并且与SEQ ID NO:70的区别在于以下一个核苷酸取代：C294A。

eIF4G，也称为真核翻译起始因子4G，是参与形成闭环mRNA(它是闭环因子)以及eIF4F帽结合复合物的一部分和mRNP的一部分的TIF。其特征在于SEQ ID NO:34-44中的任一者，或其他真核物种中的直系同源物。eIF4G由eIF4G编码核苷酸序列编码，该核苷酸序列可以是天然存在的eIF4G基因，或其编码与天然存在的eIF4G具有某一序列同一性的eIF4G的相应功能变体。示例性的eIF4G编码核苷酸序列由菲氏孔玛氏酵母的编码SEQ ID NO:34的SEQ ID NO:72或其功能活性变体鉴别。SEQ ID NO:73鉴别优化的编码核苷酸序列的实例(其已通过金门优化生产)，并且与SEQ ID NO:72的区别在于以下四个核苷酸取代：A564G、A1923G、G2037C、T2100C。

PAB1，也称为聚腺苷酸结合蛋白1，是参与形成闭环mRNA以及mRNP的一部分的TIF。其特征在于SEQ ID NO:45-55中的任一者，或其他真核物种中的直系同源物。PAB1由PAB1编码核苷酸序列编码，该核苷酸序列可以是天然存在的PAB1基因，或其编码与天然存在的PAB1具有某一序列同一性的PAB1的相应功能变体。示例性的PAB1编码核苷酸序列由菲氏孔玛氏酵母的编码SEQ ID NO:45的SEQ ID NO:74或其功能活性变体鉴别。SEQ ID NO:75鉴别优化的编码核苷酸序列的实例(其已通过金门优化生产)，并且与SEQ ID NO:74的区别在于以下三个核苷酸取代：C150A、T384C、C707T。

RLI1，也称为ATP结合盒亚家族E成员1(ABCE1)，也称为RNase L抑制剂(RLI)，是ATP结合盒(ABC)蛋白质，在人类中由ABCE1基因编码。它是TIF，在翻译起始和核糖体生物发生以及在翻译终止和mRNP的一部分中具有双重作用。其特征在于SEQ ID NO:56-65中的任一者，或其他真核物种中的直系同源物。RLI1由RLI1编码核苷酸序列编码，该核苷酸序列可以是天然存在的RLI1基因，或其编码与天然存在的RLI1具有某一序列同一性的RLI1的相应功能变体。示例性的RLI1编码核苷酸序列由菲氏孔玛氏酵母的编码SEQ ID NO:56的SEQ IDNO:76或其功能活性变体鉴别。

包含由本文提供的SEQ ID NO:1、12、23、34、45和56鉴别的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成并且如实施例部分所用的TIF(包括相应的(优化的)核苷酸序列)是菲氏孔玛氏酵母起源的。包含由本文提供的SEQ ID NO:2、13、24、35、46和57鉴别的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的TIF是巴斯德孔玛氏酵母起源的。众所周知，在其他酵母宿主细胞中、特别是在甲基营养型酵母中存在同源序列，诸如图1中提供的那些，其可以如本文所述使用。例如，巴斯德毕赤酵母包含相应同源序列。巴斯德毕赤酵母已经被重新分类为孔玛氏酵母属，并且被分为三个物种，巴斯德孔玛氏酵母、菲氏孔玛氏酵母和假巴斯德孔玛氏酵母。

例如，可以使用具有本文描述的某一序列同一性的相应TIF的任何同源序列，特别是作为相应巴斯德毕赤酵母(诸如菲氏孔玛氏酵母、巴斯德孔玛氏酵母或假巴斯德孔玛氏酵母)TIF直系同源物的任何此类蛋白质。

如本文所用的术语“mRNP”是指信使RNP(信使核糖核蛋白)，其被理解为由具有结合蛋白质的mRNA组成的颗粒或复合物。mRNA在细胞质中被合成、剪接、输出和翻译时，由各种蛋白质结合。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指核苷酸序列在单个核酸分子例如载体或表达盒上的缔合，该缔合方式使得一个或多个核苷酸序列的功能受到存在于所述核酸分子上的至少一个其他核苷酸序列的影响。通过可操作地连接，核酸序列被置于与同一核酸分子上的另一个核酸序列的功能关系中。例如，启动子在能够对该编码序列的表达起作用时与重组基因的编码序列可操作地连接。作为进一步的实例，编码信号肽的核酸在能够表达分泌形式的蛋白质(诸如成熟蛋白质的预成型体或成熟蛋白质)时与编码POI的核酸序列可操作地连接。具体地，此类彼此可操作地连接的核酸可以直接连接，即在编码信号肽的核酸与编码POI的核酸序列之间没有另外的元件或核酸序列。可替代地，可以使用合适的连接序列，诸如例如位于启动子与GOI之间的克隆位点。

如果启动子控制编码序列的转录，则“启动子”序列通常被理解为与编码序列可操作地连接。如果启动子序列不与编码序列天然缔合，则其转录或者在天然(野生型)细胞中不受启动子控制，或者序列与不同的连续序列重组。

启动子在本文中被描述为启动、调控或以其他方式介导或控制蛋白质编码多核苷酸(DNA)(诸如POI编码DNA)的表达。启动子DNA和编码DNA可以来自相同的基因，或者可以来自不同的基因，并且可以来自相同或不同的生物体。

启动子的强度具体是指它的转录强度，由在该启动子处以高频率或低频率发生的转录起始效率来表示。转录强度越高，在该启动子处发生的转录就越频繁。启动子强度是启动子的典型特征，因为它决定了给定mRNA序列的转录频率，有效地赋予某些基因更高的转录优先级，从而使转录物的浓度更高。例如，编码被大量需要的蛋白质的基因通常需要相对强的启动子。RNA聚合酶一次只能执行一项转录任务，并且因此必须优先考虑安排工作以提高效率。选择启动子强度的差异以允许这种优先化。

启动子强度也可以指通常理解为转录速率的转录频率，例如通过合适的测定(例如RT-PCR或RNA印迹(Northern blotting))中的转录物的量所确定的。例如，本文所述的启动子的转录强度在巴斯德毕赤酵母宿主细胞中确定并与巴斯德毕赤酵母的天然pGAP启动子相比较。

启动子表达目的基因的强度通常被理解为表达强度或支持高表达水平/速率的能力。例如，本发明的启动子的表达和/或转录强度在巴斯德毕赤酵母宿主细胞中确定，并与巴斯德毕赤酵母的天然pGAP启动子进行比较，例如在被完全诱导或去阻抑时所测量的。

根据一个具体方面，GOIEC启动子强于TIFEC启动子。优选地，使用启动子，该启动子与天然pGAP启动子相比，转录速率或强度为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的至少任一者或甚至更高，诸如110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％中的至少任一者或甚至更高，诸如在被选作用于重组目的的宿主细胞以生产POI的(例如，真核)宿主细胞中所确定的。例如，表达速率可以由报告基因诸如eGFP的表达量来确定。

天然pGAP启动子通常启动编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的gap基因的表达，其是在大多数活生物体中存在的组成型启动子。GAPDH(EC 1.2.1.12)(糖酵解和糖异生的关键酶)在分解代谢和合成代谢性碳水化合物代谢中起关键作用。

与参考启动子相比的比较性转录强度可以通过标准方法来确定，诸如通过测量转录物的量，例如采用微阵列来确定，或者在细胞培养物中，诸如通过测量重组细胞中相应基因表达产物的量来确定。特别地，转录速率可以通过在微阵列、RNA印迹上的转录强度或利用定量实时PCR(qRT-PCR)或利用RNA测序(RNA-seq)来确定。

如本文所述，异源启动子可用于相应TIFEC中以表达TIF中的任何一者或多者或全部，和/或用于GOIEC中以表达GOI。异源启动子可以对待表达的多核苷酸和/或人工启动子是异源的，或者是源自野生型宿主细胞但位于异源表达盒内的宿主细胞基因组中或位于某一位置的启动子，在该位置中该启动子非天然存在于野生型宿主细胞中。

如本文所述，根据具体实施方案，GOIEC或TIF表达盒中的任一者可包含并采用组成型启动子，诸如本文进一步描述的启动子中的任一者。

组成型启动子的具体实例包括例如pGAP(例如SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101)及其功能变体，如下的任何组成型启动子诸如pCS1(例如SEQ ID NO:102，或其功能变体，其诸如公开于WO2014139608中)、pMDH3(例如，SEQ ID NO:103)、pPOR1(例如，SEQ ID NO:104)、pRPP1B、pPDC1、pGPM1、pFBA1-1，或前述中任一者的功能变体。

诱导型或阻抑型启动子的具体实例包括例如天然pAOX1或pAOX2及其功能变体，如下的任何调控启动子，诸如公开于WO2013050551中的pG1-pG8及其片段；如下的任何调控启动子，诸如WO2017021541 A1中公开的pG1和pG1-x。

特别地，可以使用可调控启动子(诸如去阻抑型或阻抑型(本文称为(去)阻抑型))或诱导型启动子，例如天然甲醇诱导型启动子pAOX1(SEQ ID NO:81)或pAOX2(SEQ ID NO:82)，或巴斯德毕赤酵母的天然甲醇诱导型启动子(例如，SEQ ID NO:83-96，由Gasser,Steiger,&Mattanovich,Microb Cell Fact.2015,14:196公开)中的任一者，或任何其他碳源可调控启动子，例如去阻抑型启动子，诸如pG1-pG8(pG1：SEQ ID NO:97，pG3：SEQ ID NO:105，pG4：SEQ ID NO:106，pG5：SEQ ID NO:107，pG7：SEQ ID NO:108，pG8：SEQ ID NO:109，以及前述中任一者的功能变体，诸如片段，例如pG1的片段，命名为pG1a-pG1f：SEQ ID NO:110-115)，以及命名为pG1-x的功能变体，特别是公开于WO2013050551和WO2017021541的pG1-3(例如，SEQ ID NO:98，诸如称为pG1-D1240)或pG1-4(例如，SEQ ID NO:99，诸如称为pG1-D1427)，或前述中长度为至少300bp、400bp或500bp(特别是包括3'-端)的任一者的功能变体，或前述中任一者的功能变体。

具体地，本文所述的启动子的功能变体在全长或在启动子序列的3'端的一部分(该部分长度为至少300bp、400bp或500bp)上与其来源的启动子的序列同一性为80％、85％、90％、95％或100％中的至少任一者，并且功能是可操作地控制待表达的多核苷酸的表达，特别是具有大约相同的启动子活性(例如，+/-50％、40％、30％、20％或10％中的任一者)，尽管启动子活性与其来源的启动子相比可能有所改善。pG1-3或pG1-4的特异性功能启动子变体是包含至少两个主要调控区和/或至少两个核心调控区和/或至少两个T基序的那些，如图1所示。

合适的启动子序列的其他实例描述于Prielhofer等人(BMC Syst Biol.2017.11(1):123)和Mattanovich等人(Methods Mol.Biol.(2012)824:329-58)中，并且包括糖酵解酶，如磷酸丙糖异构酶(TPI)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH或GAP)及其变体、乳糖酶(LAC)和半乳糖苷酶(GAL)；巴斯德毕赤酵母葡萄糖-6-磷酸异构酶启动子(PPGI)、3-磷酸甘油酸激酶启动子(pPGK)、甘油醛磷酸脱氢酶启动子(pGAP)、翻译延伸因子启动子(PTEF)以及巴斯德毕赤酵母烯醇化酶1的启动子(pEN01)、磷酸丙糖异构酶的启动子(pTPI)、核糖体亚基蛋白的启动子(pRPS2、pRPS7、pRPS31、pRPL1)、醇氧化酶启动子(pAOX1、pAOX2)或其具有修饰特性的变体、甲醛脱氢酶启动子(pFLD)、异柠檬酸裂解酶启动子(pICL)、α-酮异己酸脱羧酶启动子(pTHI)、热休克蛋白家族成员的启动子(pSSA1、pHSP90、pKAR2)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的启动子(pGND1)、磷酸甘油酸变位酶的启动子(pGPM1)、转酮醇酶的启动子(pTKL1)、磷脂酰肌醇合成酶的启动子(pPIS1)、铁-02-氧化还原酶的启动子(pFET3)、高亲和力铁通透酶的启动子(pFTR1)、阻抑性碱性磷酸酶的启动子(pPH08)、N-肉豆蔻酰转移酶的启动子(pNMT1)、信息素应答转录因子(pMCM1)的启动子、泛素的启动子(pUBI4)、单链DNA核酸内切酶的启动子(pRAD2)、线粒体内膜主要ADP/ATP载体的启动子(pPET9)(WO2008/128701)和甲酸脱氢酶(FMD)启动子。

合适的启动子的另外的实例包括酿酒酵母烯醇化酶(ENO1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2、GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶(PGK)以及麦芽糖酶基因启动子(MAL)。

如本文所用的术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指DNA或RNA。“核酸序列”或“多核苷酸序列”或简化地“多核苷酸”是指从5'至3'端读取的脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。它包括表达盒、自我复制质粒、感染性DNA或RNA聚合物以及非功能性DNA或RNA。

如本文所用的术语“目的蛋白(POI)”是指通过重组技术在宿主细胞中产生的多肽或蛋白质。更具体地，该蛋白质可以是非天然存在于宿主细胞中的多肽，即异源蛋白质，或者可以对宿主细胞是天然的，即对于宿主细胞的同源蛋白质，但是例如通过用含有编码POI的核酸序列的自我复制载体转化或转染而产生，或在通过重组技术将编码POI的核酸序列的一个或多个拷贝整合到宿主细胞的基因组中时产生，或通过控制编码POI的基因的表达的一个或多个调控序列(例如启动子序列)的重组修饰(例如启动子序列)而产生。在一些情况下，如本文所用的术语POI也指由如通过重组表达的蛋白质介导的宿主细胞的任何代谢产物。

与亲本核苷酸或氨基酸序列相比，变体、同源物或直系同源物的术语“序列同一性”表示两个或更多个序列的同一性程度。两个或更多个氨基酸序列在对应的位置可以具有相同或保守的氨基酸残基，在一定程度上最多100％。两个或更多个核苷酸序列可以在对应的位置具有相同或保守的碱基对，在一定程度上最多100％。

序列相似性搜索是用于鉴别具有过量(例如，至少50％)序列同一性的同源物的有效且可靠的策略。常用的序列相似性搜索工具是例如BLAST、FASTA和HMMER。

序列相似性搜索可以通过检测过量相似性以及反映共同祖先的统计学上显著的相似性来鉴别此类同源蛋白质或基因。同源物可以包括直系同源物，其在本文中理解为不同生物体中的相同蛋白质，例如，此类蛋白质在不同生物体或物种中的变体。

关于本文所述的氨基酸序列、同源物和直系同源物的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并引入间隙(gap)(如有必要)以获得最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与特异性多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。

为了本文所述的目的，使用NCBI BLAST程序版本BLASTP 2.8.1利用以下示例性参数来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性：程序：blastp，字长：6，期望值：10，Hitlist大小：100，间隙成本(Gapcost)：11.1，矩阵：BLOSUM62，过滤字符串：F，组成调整：条件组成分数矩阵调整。

对于两个氨基酸序列沿其整个长度的成对蛋白质序列比对，使用具有默认设置(矩阵：EBLOSUM62；间隙打开(Gap open)：10；间隙扩展(Gap extend)：0.5；末端间隙惩罚：假；末端间隙打开：10；末端间隙扩展：0.5)的EMBOSS Needle网络服务器(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)。EMBOSS Needle使用Needleman-Wunsch比对算法找到两个输入序列的最佳比对(包括间隙)并将它们的最佳全局序列比对写入文件。

关于核苷酸序列(例如启动子或基因的核苷酸序列)的“同一性百分比(％)”定义为在比对序列并引入间隙(如有必要)以获得最大的序列同一性百分比并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，候选DNA序列中与DNA序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比。用于确定核苷酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公开可用的计算机软件来实现。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。

为了本文所述的目的(除非另有说明)，使用NCBI BLAST程序版本BLASTN 2.8.1利用以下示例性参数来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性：程序：blastn，字长：11，期望阈值：10，Hitlist大小：100，间隙成本：5.2，匹配/不匹配分数：2,-3，过滤字符串：低复杂度区域，仅标记查找表。

如本文中关于POI使用的术语“分离的”或“分离”应指已经从其自然缔合的环境(特别是细胞培养物上清液)中充分分离从而以“纯化的”或“基本上纯的”形式存在的此类化合物。但是，“分离的”不一定意味着排除与其他化合物或材料的人工或合成混合物，或存在不干扰基本活性且可能存在(例如，由于不完全纯化)的杂质。可以进一步配制分离的化合物以制备其制剂，并且出于实际目的仍可分离，例如，当用于诊断或疗法时，可以将POI与药学上可接受的载体或赋形剂混合。

如本文所用的术语“纯化的”应指包含至少50％(mol/mol)、优选地至少60％、70％、80％、90％或95％的化合物(例如POI)的制剂。纯度通过适合化合物的方法(例如，色谱方法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等)来测量。如本文所述的分离的、纯化的POI可以通过纯化细胞培养物上清液以减少杂质来获得。

可以使用用于获得重组多肽或蛋白质产物的分离和纯化方法，即如下方法，诸如利用溶解度差异的方法(诸如盐析和溶剂沉淀)，利用分子量差异的方法(诸如超滤和凝胶电泳)，利用电荷差异的方法(诸如离子交换色谱法)，利用特异性亲和力的方法(诸如亲和色谱法)，利用疏水性差异的方法(诸如反相高效液相色谱法)，以及利用等电点差异的方法(诸如等电聚焦)。

以下标准方法是优选的：通过微过滤或切向流过滤器(TFF)或离心进行的细胞(碎片)分离和洗涤，通过沉淀或热处理进行的POI纯化，通过酶促消化进行的POI活化，通过色谱法(诸如离子交换(IEX)、疏水相互作用色谱法(HIC)、亲和色谱法、尺寸排阻法(SEC)或HPLC色谱法)进行的POI纯化，诸如通过超滤步骤进行的POI沉淀、浓缩和洗涤。

高度纯化的产物基本上不含污染蛋白质，并且优选地具有至少90％，更优选地至少95％，或甚至至少98％，最多100％的纯度。纯化的产物可以通过纯化细胞培养物上清液或从细胞碎片中获得。

分离和纯化的POI可以通过常规方法(诸如蛋白质印迹、HPLC、活性测定或ELISA)鉴别。

如本文所用的术语“重组”应指“通过遗传工程化制备或者是遗传工程化的结果”。“重组细胞”或“重组宿主细胞”在本文中被理解为已经被遗传工程化或修饰以包含非所述细胞天然的核酸序列的细胞或宿主细胞。重组宿主可以被工程化以使一个或多个核苷酸或核苷酸序列缺失和/或失活，并且可以具体地包含含有重组核酸序列的表达载体或克隆载体(特别是采用对宿主而言外来的核苷酸序列)。通过在宿主中表达相应重组核酸来生产重组蛋白。如本文关于POI所用的术语“重组”包括通过重组方式制备、表达、创建或分离的POI，诸如从经转化或转染以表达POI的宿主细胞分离的POI。根据本发明，可以采用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中被充分地解释。参见例如，Maniatis,Fritsch&Sambrook,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,(1982)。

某些重组宿主细胞是“工程化的”宿主细胞，其被理解为已经使用遗传工程化，即通过人类干预进行操纵的宿主细胞。当宿主细胞被工程化以表达、共表达或过表达给定的基因或相应蛋白质时，操纵宿主细胞，使得该宿主细胞与操纵前在相同条件下的宿主细胞相比，或与未被工程化为使得表达、共表达或过表达所述基因或蛋白质的宿主细胞相比，具有在更高的程度上分别表达此类基因和蛋白质的能力。如本文所述，与在相同培养条件下表达相同POI，但是编码TIF的多核苷酸未被共表达或过表达或者未被工程化以共表达或过表达编码TIF的多核苷酸的相同细胞相比时，可通过共表达或过表达本文所述的TIF来增加目的蛋白(POI)的产量。

令人惊讶地，结果是作为mRNP的一部分但不是eIF3亚基的一部分的TIF的过表达使得几种重组POI的生产和分泌增加。

根据本文所述的一个具体实例，TIF过表达增强了工程化细胞的翻译能力，并且还与更高水平的POI转录物和内源性转录物相关。

甚至更令人惊讶的是，在不同培养模式(筛选、补料分批和连续培养)中通过过表达单一TIF(诸如eIF4A、eIF4G、eIF4E、PAB1和RLI1及其组合)增加了POI生产的产量。

参考以下实施例将更充分地理解前述描述。然而，此类实施例仅代表实践本发明的一个或多个实施方案的方法，并且不应被理解为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：翻译因子(TIF)过表达菌株的构建

a)宿主菌株和表达载体：

将巴斯德毕赤酵母菌株CBS7435或CBS2612(CBS-KNAW真菌生物多样性中心，真菌培养物保藏中心，荷兰乌得勒支)(CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre,Centraalbureau voor Schimmelcultures,Utrecht,The Netherlands)用作背景菌株。为了评估翻译因子过表达的影响，使用了不同的分泌模型蛋白质作为报告蛋白。为此，将CBS2612_P_G1-3_vHH#4(描述于WO2020/144313A1)用于表达。为了生成额外的宿主菌株，将P_G1-3_HSA的表达盒转化到CBS2612中，并且将P_G1-3_vHH表达盒转化到CBS7435中，如WO2020144313A1中所描述。MutS P_AOX1-vHH(Zavec et al.2020,Biotechnol Bioeng.117(5):1394-1405)用于评估甲醇条件下的作用。

b)TIF过表达载体的生成

通过将靶标的相应表达盒同源重组到宿主菌株中来过表达靶标。用于此的质粒通过使用两种不同的克隆策略来生成。选择的靶翻译因子如表2和7所示。

通过基于pPuzzle的表达来构建和选择巴斯德毕赤酵母翻译因子过表达菌株

使用pPM2aK21质粒，该质粒是WO2008/128701A2中描述的pPuzzle_ZeoR载体骨架的衍生物，由以下组成：AOX终止子序列(用于整合到天然AOX1终止子基因座中)，大肠杆菌(E.coli)的复制起点(pUC19)，用于在大肠杆菌和酵母中进行选择的抗生素抗性盒(赋予对卡那霉素和G418的抗性的kanMX)，由GAP启动子、多克隆位点(MCS)和酿酒酵母CYC1转录终止子组成的目的基因(GOI)的表达盒。使用表8中所示的引物，通过PCR(高保真DNA聚合酶，New England Biolabs)从起始密码子到终止密码子来扩增所选的过表达基因。将序列克隆到具有两种限制性内切酶SbfI和SfiI的pPM2a表达载体的MCS中。通过Sanger测序来验证基因序列。

使用GoldenPiCS系统来构建和选择巴斯德毕赤酵母翻译因子过表达菌株

通过PCR(高保真DNA聚合酶，New England Biolabs)从起始密码子到终止密码子来扩增经选择用于过表达的基因或将所述基因分成两个到几个片段。GoldenPiCS系统(Prielhofer et al.2017.BMC Systems Biol.11,123,doi:10.1186/s12918-017-0492-3)需要在一些编码序列中引入沉默突变。这通过使用表3和9中的引物从一个编码序列扩增几个片段来进行。可替代地，获得gBlock(整合DNA技术IDT)。将来自巴斯德毕赤酵母菌株CBS2612的基因组DNA用作PCR模板。所得片段在用表3和9中的引物扩增后，通过使用限制性内切酶BsaI引入GoldenPiCS系统的BB1中。GoldenPiCS系统由骨架BB1、BB2和BB3组成。将携带相应编码序列的组装BB1与BB2中的启动子和终止子区域合并，然后进一步处理以创建所需的BB3整合质粒，如Prielhofer等人2017中所描述。用于在BB2或BB3骨架中组装表达盒的所有启动子和终止子描述于Prielhofer等人2017中。使用的BB3rN含有5′-RGI1基因组整合区域和用于在诺尔丝菌素上选择的NatMX选择标记物盒。所有质粒均含大肠杆菌的复制起点(pUC19)。

c)TIF过表达转化株的生成

在电穿孔之前使用AscI限制性内切酶将质粒线性化(使用Gasser et al.2013(Future Microbiol.8(2):191-208)中描述的标准转化方案转化为巴斯德毕赤酵母。阳性转化株的选择在YPD板(每升：10g酵母提取物、20g蛋白胨、20g葡萄糖、20g琼脂)上进行，该板含有500μg mL-1的G418或100μg mL^-1的诺尔丝菌素。菌落PCR用于确保转化的质粒存在于正确的基因座中。为此，通过在0.04M NaOH中蒸煮巴斯德毕赤酵母菌落获得基因组DNA，将其直接应用于利用适当引物的PCR。

d)确定过表达靶标的基因拷贝数(GCN)

表达强度通常与整合到巴斯德毕赤酵母基因组中的表达盒数量相关。因此，确定过表达靶标中的每一者的基因拷贝数。使用基因组DNA纯化试剂盒(PromegaCorporation,Cat.No.A1120)分离基因组DNA。然后，使用定量实时PCR(qPCR)确定基因拷贝数。为此，使用Blue S'Green qPCR试剂盒(Biozym)。将Blue S'Green qPCR主混合物与引物和样品混合，并应用于实时PCR循环仪(Rotor Gene,Qiagen)中的实时分析。表1显示了所用引物的列表。所有样品以三重复的方式进行分析。Rotor Gene软件用于数据分析。使用ACT1基因作为校准品。GCN通过使用用于单一过表达构建体的P_GAP引物(参见实施例4)和用于组合过表达构建体的TIF2引物(参见实施例5)来确定。结果分别示于表10和12中。由于选择的过表达靶标是巴斯德毕赤酵母的内源性基因，所以GCN为2表明成功整合了一个额外的基因拷贝，其中一个基因是原始基因，并且第二个基因是过表达盒。

表1：用于GCN确定的qPCR引物。将ACT1用作校准品。使用P_GAP来确定用于单一过表达构建体的GCN、用于组合过表达构建体的TIF2。

实施例2：分析TIF过表达对重组蛋白生产的作用

为了确定翻译因子过表达对重组蛋白分泌的作用，将工程化过表达菌株在适当的筛选条件下培养，诸如当使用pG启动子用于GOI时的葡萄糖限制条件(Prielhofer etal.2013.Microb Cell Fact 12,5)或在启动子来源于甲醇利用途径的情况下的甲醇诱导(Gasser et al.2015.Microb.Cell Fact 14:196)。通过将基于pPuzzle或基于GoldenPiCSBB3rN的TIF表达载体整合到巴斯德毕赤酵母基因组中，如实施例1中所述完成巴斯德毕赤酵母宿主菌株的工程化。然后小规模培养工程化巴斯德毕赤酵母菌株(筛选程序)，从而模拟补料分批培养。对分泌到上清液中的重组蛋白进行定量，并将不同工程化菌株的滴度和产量与亲本宿主菌株进行比较。

培养基：合成筛选培养基ASMv6，每升含有：6.30g(NH₄)₂HPO₄、0.8g(NH₄)₂SO₄、0.49MgSO₄*7H₂O、2.64g KCl、0.0535g CaCl₂*2H₂O、22.0g柠檬酸一水合物、1470μL PTM₀微量盐储备溶液、20mL NH₄OH(25％)、4mL生物素(0.1g L^-1)。添加固体KOH以将pH设置为6.4-6.6。

PTM₀微量盐储备溶液，每升含有：5.0ml H₂SO₄(95-98％)、65.0g FeSO₄*7H₂O、20gZnCl₂、6.00g CuSO₄*5H₂O、3.36g MnSO₄*H₂O、0.82g CoCl₂*6H₂O、0.20g Na₂MoO₄*2H₂O、0.08gNaI、0.02g H₃BO₃

a)在pG启动子的控制下筛选具有GOI表达的工程化巴斯德毕赤酵母菌株

为了筛选模型蛋白分泌，将单菌落(其中PCR验证基因整合到正确基因座中)接种到2mL液体YPG培养基(每升：20g蛋白胨、10g酵母提取物、12.6g甘油100％，pH 7.4-7.6)中，该培养基中含有50μg mL^-1Zeocin和500μg mL^-1G418或100μg mL^-1诺尔丝菌素(若适用)。此外，在每个板上，宿主菌株以四重复的方式培养以用于比较。该预培养物在25℃在24-DWP中以280rpm生长大约24小时。然后使用预培养物接种2mL合成筛选培养基ASMv6至起始OD₆₀₀为8。培养基含有50g L^-1的多糖(EnPump200多糖，Enpresso)和0.4％的葡萄糖释放酶(试剂A，Enpresso)作为碳源。培养条件类似于预培养条件。48小时后，将1mL细胞悬浮液转移至预先称重的1.5mL离心管中，并在室温以16,000g离心5分钟。将上清液小心地转移到一个新的小瓶中并储存在-20℃直至进一步使用。再次对含有沉淀的离心管称重以确定细胞湿重(WCW)。如下所述通过微流体毛细管电泳对上清液中的重组分泌蛋白进行定量。

b)在甲醇诱导型启动子的控制下筛选具有GOI表达的工程化巴斯德毕赤酵母菌株

给2mL YPD培养基(每升：20g蛋白胨、10g酵母提取物、22g D(+)-葡萄糖一水合物，pH 7.4-7.6)，该培养基含有50μg mL^-1Zeocin和500μg mL^-1G418或100μg mL^-1诺尔丝菌素(若适用)接种巴斯德毕赤酵母克隆的单菌落，并在25℃在24-DWP中以280rpm生长过夜。然后使用预培养物接种2mL合成筛选培养基ASMv6至起始OD600为8。培养基含有25g L^-1的多糖(EnPump200多糖，Enpresso)和0.35％的葡萄糖释放酶(试剂A，Enpresso)作为碳源。这些培养物在25℃在24-DWP中以280rpm孵育48小时。前3小时后，用10μL(0.5％)纯甲醇喂养细胞。然后在19小时、27小时和43小时培养时间后，再次用20μL(1％)纯甲醇喂养细胞。48小时后，将1mL细胞悬浮液转移至预先称重的1.5mL离心管中，并在室温以16,000g离心5分钟。将上清液小心地转移到一个新的小瓶中并储存在-20℃直至进一步使用。再次对含有沉淀的离心管称重以确定细胞湿重(WCW)。如下所述通过微流体毛细管电泳对上清液中的重组分泌蛋白进行定量。

c)通过微流体毛细管电泳(mCE)定量分泌的重组蛋白

‘LabChip GX/GXII系统’珀金埃尔默仪器有限(PerkinElmer)用于定量分析培养上清液中的分泌蛋白滴度。使用耗材‘蛋白质表达实验室芯片(Protein Express LabChip)’(760499，珀金埃尔默仪器有限公司)和‘蛋白质表达试剂试剂盒’(CLS960008，珀金埃尔默仪器有限公司)。芯片和样品制备根据制造商的建议进行。下面给出该过程的简要描述。

芯片制备：在试剂达到室温后，将520μL和280μL蛋白质表达凝胶基质转移到旋转过滤器中。将20μL蛋白质表达染料溶液添加到含有520μL凝胶基质的旋转过滤器中。以倒置取向短暂涡旋含染料的旋转过滤器后，将两个旋转过滤器以9300g离心10分钟。为清洗芯片，将120μL Milli-水添加到所有活性芯片孔中，并对芯片进行仪器洗涤程序。在用Milli-/>水再进行两个冲洗步骤后，将剩余的液体完全吸出，并将适量的过滤凝胶基质溶液以及蛋白质表达下标记物溶液添加到适当的芯片孔中。

样品和阶梯制备：对于样品制备，在96微量滴定板中将6μL样品与21μL样品缓冲液混合。使样品在100℃变性5分钟，并以1,200g离心2分钟。随后，添加105μL Milli-水。样品溶液通过移液简单混合，并在测量前再次以1,200g离心2分钟。为制备阶梯，使12μL蛋白质表达阶梯在PCR管中于100℃变性5分钟。随后，添加120μL Milli-/>水并短暂涡旋阶梯溶液，然后在微型离心机中旋转管15秒并开始测量。

通过采用制造商提供的LabChip软件并与BSA标准品进行比较来完成定量。

实施例3：翻译起始因子3(eIF3)亚基过表达对巴斯德毕赤酵母中重组蛋白分泌的作用。

首先，使翻译起始因子3(eIF3)的亚基过表达。在酵母中，该因子由6个亚基组成，它们自身被过表达并且以不同的组合被过表达。对于过表达，如实施例1所述，将eIF3亚基克隆到GoldenPiCS载体中并转化到宿主菌株CBS2612 P_G1-3 vHH#4中。然后如实施例2中所述筛选工程化菌株，并将产量与宿主菌株进行比较。

a)过表达eIF3的单个亚基。

如实施例1中所述，表2中所示的eIF3亚基通过使用表3中所示的引物进行扩增，并克隆到宿主菌株CBS2612 P_G1-3 vHH#4中。没有获得eIF3a的过表达载体。

表2：所选过表达靶标。已知所有给定基因都是酵母中eIF3的亚基。

翻译因子亚基	基因	基因标识符	基因长度
				eIF3a	RPG1	PP7435_Chr3-0875	2544bp
eIF3b	PRT1	PP7435_Chr3-0499	2148bp
				eIF3c	NIP1	PP7435_Chr3-0419	2433bp
eIF3g	TIF35	PP7435_Chr4-0549	867bp
				eIF3i	TIF34	PP7435_Chr1-0286	1032bp
eIF3j	HCR1	PP7435_Chr3-0147	771bp

表3：用于克隆eIF3亚基的引物。

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表4显示了eIF3亚基的单一过表达的结果。每个靶基因都用不同的启动子过表达，以实现大约10倍的过表达。这些近似的过表达强度显示在OE列中，并如实施例4a中所述进行计算。筛选结果显示为与宿主菌株相比的vHH产量的倍数变化。表4中的结果清楚地显示出单个eIF3亚基的过表达对巴斯德毕赤酵母中的重组蛋白分泌没有作用(工程化菌株与对照之间的vHH产量的倍数变化都在1左右，这意味着工程化菌株与亲本对照菌株之间的蛋白质生产没有差异)。这是出乎意料的，因为Roobol等人(Metabolic Engineering 2020,59:98-105)报道了在哺乳动物HEK和CHO细胞系中瞬时和稳定过表达eIF3i和eIF3v亚基后，生长速率即增加并且蛋白质合成能力增加。

表4：翻译起始因子eIF3亚基在菌株CBS2612 P_G1-3 vHH#4中的单一过表达。FC vHH产量列显示与宿主菌株相比vHH产量的倍数变化。

名称	启动子	基因	OE	FC vHH产量	克隆数量
						eIF3b	PGAP	PRT1	10	1.04±0.16	10
eIF3c	PMDH3	NIP1	10	0.93±0.12	10
						eIF3g	PRPP1B	TIF35	10	1.15±0.14	10
eIF3i	PSPI1	TIF34	10	1.12±0.06	10
						eIF3j	PPOR1	HCR1	10	0.82±0.11	10

a)eIF3亚基的过表达组合。

接下来，选择不同的eIF3亚基组合用于过表达，如表5中所述。如实施例1所述进行克隆和转化，并如实施例2所述筛选所得菌株。如实施例4a中所述，选择启动子以使细胞中的转录物浓度比与天然菌株中的相同。OE列显示计算的过表达强度。

表5：eIF3的所选过表达组合也与选定的启动子一起显示。OE显示与亲本菌株相比工程化菌株中TIF转录物水平的估计增加(依据Rebnegger et al.2014.Biotech J.9(4):511-25的基因表达数据)。将CBS2612 P_G1-3 vHH#4用作宿主菌株。

表6：菌株CBS2612 P_G1-3 vHH#4中eIF3亚基的组合过表达。FC产量是分泌的vHH产量的倍数变化

名称	FC vHH产量	克隆数量
			C21	1.01±0.13	10
C22	0.98±0.10	10
			C23	1.05±0.04	10
C24	0.93±0.02	10

表6显示了与宿主菌株相比vHH产量的倍数变化。即使是过表达eIF3的几个亚基的组合也不会增加筛选中的vHH生产。与实施例3a相同，倍数变化值都在1左右，这意味着当eIF3亚基单独或组合过表达时，重组蛋白分泌没有显著增加。

实施例4：mRNP的单一TIF的过表达对重组蛋白生产的作用

选择作用于翻译起始并作为mRNP和闭环复合物的一部分的翻译因子以用于过表达目的：eIF4A、eIF4E、eIF4G、PAB1和RLI1(表7)，并且过表达载体如实施例1b中所示使用表8和9中所示的引物构建。将CBS2612_P_G1-3_vHH#4(在WO2020/144313A1中描述)用作亲本宿主菌株，并用实施例1中描述的单一TIF过表达载体进行转化。

表7：选择用于过表达的翻译起始因子(TIF)

名称	翻译因子	基因	基因标识符	基因长度
					CDC33	eIF4E	CDC33	PP7435_Chr3-0197	609bp
TIF2 a	eIF4A	TIF2	PAS_chr3_0595	1212bp
					TIF2 b	eIF4A	TIF2	PP7435_Chr3-0610	1461bp
TIF4632	eIF4G	TIF4632	PP7435_Chr1-0352	3297bp
					PAB1	PAB1	PAB1	PP7435_Chr2-1212	1881bp
RLI1	RLI1	RLI1	PP7435_Chr2-1213	1821bp

a)单一OE载体的生成和OE强度的确定

表8：用于通过基于pPuzzle的表达来构建巴斯德毕赤酵母翻译因子过表达菌株的引物。每个相应基因的起始和终止密码子以斜体和粗体显示。

表9：用于使用GoldenPiCS系统来构建巴斯德毕赤酵母翻译因子过表达菌株的引物。BsaI限制性位点以下划线显示。每个相应基因的起始和终止密码子以斜体和粗体显示。沉默突变以粗体和下划线显示。

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对于所有描述的单一TIF过表达，使用强组成型pGAP启动子，并且TIF表达盒或者被整合到5′-RGI1基因座中或者被整合到AOX1转录终止子中。基于Rebnegger etal.2014.Biotech J.9(4):511-25中描述的基因表达数据，计算所选启动子的预期过表达程度。表10的“OE”栏中给出了与亲本菌株相比表达强度的估计增加。

表10还显示了所选克隆的测量GCN和筛选程序的结果。表10中显示的所有克隆都含有相应TIF基因的一个额外拷贝(由GCN＝2表示)。

b)在pG1-3作为报告基因的控制下使用vHH进行的单一TIF过表达对重组蛋白生产的作用

如实施例2a中所述来培养菌株并在培养48小时后通过mCE确定分泌的vHH滴度(实施例2c)。计算每个克隆的滴度(mg vHH L^-1)、WCW(g L^-1)和生物量特异性产物产量(mg vHHg^-1WCW)，然后求所有过表达一个因子的克隆以及亲本菌株的复制物的平均值。确定与在相同24-DWP中培养的亲本宿主菌株的平均值相比的滴度和产量的倍数变化(FC)。

表10：翻译起始因子的单一过表达对菌株CBS2612 P_G1-3 vHH#4中重组蛋白生产的作用。FC vHH产量是分泌的vHH产量的倍数变化。显示的结果在筛选培养48小时后测量。OE显示与亲本菌株相比工程化菌株中TIF转录物水平的估计增加

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出乎意料的是，即使是mRNP的选定TIF的单一过表达也明显增加了重组蛋白的生产和分泌(表10)。可以看到TIF4632(eIF4G)和PAB1过表达有最大的改善，它们都使重组蛋白分泌增加大约2.0倍。

实施例5：mRNP的TIF的过表达组合对重组蛋白分泌的作用。

为了分析在复合物中过表达几种翻译起始因子是否有作用，选择实施例4中测试的翻译因子的不同组合，并比较它们对重组蛋白生产的影响。如实施例1b中所述，该组合工程化使用GoldenPiCS工具箱完成。将所得质粒转化到宿主菌株CBS2612 P_G1-3 vHH#4中。然后如实施例2中所述小规模培养工程化的巴斯德毕赤酵母菌株。如实施例2c所示测量分泌到上清液中的蛋白质，并将不同工程化菌株的滴度和产量与亲本宿主进行比较。

a)翻译起始因子过表达的生成组合。

测试表11中描述的不同组合过表达。选择所述启动子以将每个基因过表达大约10倍。这样做是为了平衡细胞中不同靶基因的转录物浓度比。然而，如表10中可以看到的，也可以选择更强或更弱的过表达，这仍然会引起重组蛋白生产的增加。

表11：所选过表达组合也与选定的启动子一起显示。OE显示与亲本菌株相比工程化菌株中TIF转录物水平的估计增加(依据Rebnegger et al.2014.Biotech J.9(4):511-25的基因表达数据)。

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a)组合过表达对重组蛋白分泌的作用。

如实施例2所述筛选工程化菌株并分析数据。

表12：翻译起始因子在菌株CBS2612 P_G1-3 vHH#4中的组合过表达。FC产量是分泌的vHH产量的倍数变化。

表12显示了过表达不同TIF组合对重组蛋白生产的作用。表12中显示的所有克隆都被证实具有仅插入一次的过表达盒，这意味着它们显示出GCN为2。显示了与宿主菌株CBS2612P_G1-3 vHH#4相比vHH产量的倍数变化。虽然所有组合都显示出与亲本相比重组vHH分泌增加，但组合C3和C13清楚地显示出最大的作用。C3a和C3b含有不同版本的TIF2，其长度根据巴斯德毕赤酵母基因组序列中的不同注释而不同。不依赖于TIF2版本，这两种组合的vHH产量都增加超过2倍。C3b使vHH产量增加2.5倍。

b)C3b过表达对不同背景菌株中重组蛋白分泌的比较。

为比较不同背景菌株的作用，如实施例1a中所述，将P_G1-3_vHH表达盒转化到CBS7435中。然后如实施例1c中所述，将构建体C3b整合到所得CBS7435 P_G1-3 vHH生产宿主菌株的基因组中。然后如实施例2a中所述筛选C3b过表达的作用，并如实施例2c中所述确定分泌的vHH滴度。为了比较，筛选9种不同的CBS7435 P_G1-3 vHH C3b克隆，并与宿主菌株CBS7435P_G1-3 vHH的生物学四重复进行比较。

表13：背景菌株比较的筛选结果。显示与宿主菌株相比的过表达构建体的vHH产量的倍数变化。

	平均FC vHH产量	筛选的克隆
			CBS7435PG1-3vHH C3b	2.11±0.28	9

表13显示了宿主菌株CBS7435 P_G1-3 vHH中C3b过表达的vHH产量的倍数变化。这些结果显示出与背景菌株的选择无关，在具有C3b过表达的所有菌株中都可以看到对重组vHH分泌的强烈有益作用。

c)TIF过表达对甲醇诱导型重组蛋白分泌的作用。

为了确定C3b过表达对甲醇诱导型重组蛋白分泌的作用，将含有pAOX1-vHH表达盒的CBS7435 MutS(Zavec et al.2020,Biotechnol Bioeng.117(5):1394-1405)用作C3b过表达的宿主菌株。使用用于PAOX1诱导的甲醇注射如实施例2b中所述来筛选菌株，并如实施例2c中所述来确定蛋白质滴度。

用十个C3b过表达克隆进行的筛选显示出与亲本菌株相比vHH产量平均增加1.39±0.05倍。这证实了无论应用的碳源或启动子系统如何，都可以利用TIF过表达实现重组蛋白分泌的增加。

实施例6：翻译起始因子过表达对细胞过程的影响的表征。

为了评定哪些细胞过程受到翻译起始因子过表达的影响，除了观察到的重组蛋白分泌差异外，还采用了两种不同的方法：一方面，测量基因转录物水平以确定对转录物丰度的潜在影响(实施例6a)。另一方面，在巴斯德毕赤酵母中建立基于嘌呤霉素的方法(实施例6b)后直接测量细胞翻译活性。

a)用于比较性测量转录物水平的内参法。

首先，如实施例2中所述在24-DWP筛选程序中培养菌株30小时。这相当于收获时大约0.025h^-1的生长速率。收获1mL培养物并在4℃以16,000g离心5分钟。弃去上清液并将沉淀储存在-80℃直至进一步使用。

为了也能够测量常见管家基因的转录物浓度的潜在变化，将沉淀溶解在PBS中并根据WCW再次沉淀以使每个样品中的酵母团块量相同。然后向沉淀中的每一者中掺入1mL酿酒酵母S288c悬浮液(来自单个摇瓶培养物的等分试样)。将所得混合巴斯德毕赤酵母-酿酒酵母沉淀用于RNA分离。

对于RNA分离，将1mL TRI试剂(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma-Aldrich))和500μL酸洗玻璃珠添加到细胞中，然后在FastPrep-24(mpbio)中以5.5m/s的速度破碎该细胞40秒。然后添加200μL氯仿。随后，剧烈摇动样品，并且然后在室温静置5至10分钟。在以16,000g和4℃离心10分钟以促进相分离后，将含有RNA的上层无色水相转移到新管中，并添加500μL异丙醇以使RNA沉淀。孵育10分钟后，将样品以16,000g和4℃离心10分钟并弃去上清液。RNA沉淀用70％乙醇洗涤一次，风干并重新悬浮在不含RNAse的水中。

为了去除残留的DNA，根据制造商的手册，使用DNA-free^TM-试剂盒(Ambion)处理RNA样品。随后，使用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)通过凝胶电泳以及分光光度分析来分析RNA的质量、纯度和浓度。

根据制造商的手册，使用Biozym cDNA合成试剂盒完成cDNA的合成。简而言之，将1μg总RNA添加到含有逆转录酶、dNTP、RNase抑制剂和合成缓冲液的主混合物中。使用寡聚d(T)23VN(NEB)作为引物。将反应混合物在55℃孵育45分钟。随后，通过将反应混合物在99℃孵育5分钟来实现酶的失活。

对于定量实时PCR(qPCR)，使用了巴斯德毕赤酵母ACT1、TDH3和vHH特异性引物(参见表14)。通过与酿酒酵母ACT1表达水平比较来进行标准化(参见表14)。将工程化菌株的转录物水平与宿主菌株转录物水平进行比较。对两组ACT1引物进行测试和验证以仅与所需生物体的cDNA结合。对于qPCR，将1μL cDNA、水和引物与Blue S'Green qPCR主混合物(Biozym)混合，并在实时PCR循环仪(Rotor-Gene，Qiagen)中进行分析。所有样品都在技术上以三重复的方式进行测量。采用比较定量(QC)方法，使用Rotor-Gene软件进行数据分析。

表14：用于转录物分析的定量实时PCR引物

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b)TIF过表达对转录物丰度的影响

表15中所示的TIF过表达菌株以及宿主菌株CBS2612 PG1-3 vHH#4(以三重复的方式)如实例2a中所述在24-DWP筛选程序中培养30小时。如实例6a中所述来确定两个内源性基因和重组GOI的转录物丰度。

表15显示转录物水平测量的获得结果。测量显示vHH的转录物水平受TIF过表达的强烈影响。对于在实施例4和5中也已经显示出更高的重组蛋白分泌的过表达组合，可以看到尤其高的值。在过表达C3b的菌株中发现了最高的转录物水平。这种过表达使vHH转录物水平增加5.5倍。令人惊讶的是，TDH3的表达似乎也在所有的过表达菌株中增加，而ACT1的表达似乎增加，尤其是在组合过表达菌株中。管家基因ACT1和TDH3两者的转录物水平都增加表明细胞中所有转录物的增加。这些结果表明TIF过表达对细胞mRNA水平具有积极和/或稳定作用，这可能是引起生产率增加的一个因素。

表15：不同过表达菌株与宿主菌株相比的相对转录物水平。如实施例2a中所述在筛选培养30小时后进行测量。

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c)总翻译活性的测量。

类似于Nagelreiter et al.2018.Biotechnol J 13,e1700492，在优化用于酵母细胞的程序之后，用O-炔丙基标记的嘌呤霉素测量总翻译活性。简言之，将来自与实施例6a中相同的培养的细胞移液到96孔微量滴定板中的90μL“孵育溶液”中，结束OD₆₀₀为0.4。“孵育溶液”由ASMv6培养基(参见实施例2)与溶解在10％ DMSO和PBS(2mM KH₂PO₄、10mMNa₂HPO₄.2 H₂O、2.7mM g KCl、8mM NaCl，pH 7.4)中的0.6mM O-炔丙基嘌呤霉素(JenaBioscience，NU-931-05)以及1.5g L^-1丙咪嗪组成。悬浮液在摇床上于25℃孵育2小时，转移到冰冷的Eppendorf管中并在4℃以16,000g离心5分钟。用120μL PBS洗涤沉淀的细胞后，再次用1mL冰冷的70％乙醇固定沉淀的细胞。将这些固定样品在4℃储存1天与2周之间。

对于点击化学反应，通过以16,000g和4℃离心5分钟来收获固定样品。将沉淀转移至96孔微量滴定板中，并用100μL“点击化学缓冲液”(115mM Tris/HCl pH＝8.5、0.1％Triton X-100)洗涤。然后将样品在“点击化学混合物”(101mM Click-it点击化学缓冲液、1.9mM CuSO₄、1.9mg/mL抗坏血酸、20μM Alexa Fluor^TM488叠氮化物(Invitrogen))中在室温孵育30分钟。然后，细胞如前所述收获，在150μL PBS中洗涤并溶解在150μL新鲜PBS中。为了测量所得的荧光强度，通过流式细胞术分析细胞，其中激发波长为488nm，并且发射波长为525nm。每个样品测量40,000个事件。对于数据分析，使用每个样品的几何平均值并从每个样品中减去空白(未通过添加O-炔丙基嘌呤霉素处理的细胞)。

d)TIF过表达对全局细胞翻译的影响

表16显示了获得的荧光值与宿主菌株CBS2612 P_G1-3 vHH#4相比的倍数变化，由此显示了总翻译活性的平均倍数变化。为了测量翻译活性，使用与表15中所示相同的克隆。如实施例6c中所述确定翻译活性。

表16：TIF过表达菌株相对于宿主菌株CBS2612 P_G1-3 vHH#4(设置为1.0)的翻译活性。如实施例2a中所述在筛选培养30小时后进行测量。

单一过表达	每个细胞的相对翻译活性
		CDC33	0.97±0.005
TIF2a	1.24±0.01
		TIF2b	1.03±0.01
TIF4632	1.68±0.14
		PAB1	1.65
RLI1	1.39±0.09
		组合过表达	每个细胞的相对翻译活性
C1	1.58±0.17
		C2	1.98±0.10
C3a	2.21±0.06
		C3b	2.29±0.06
C13	1.73±0.03

表16清楚地显示出单一翻译起始因子的过表达引起每个细胞中翻译活性的增强。所选TIF组合的过表达显示出甚至更强的翻译活性增加。这也由在这些菌株中观察到的重组蛋白分泌增加(实施例4和5)所反映。最高的翻译活性(是宿主菌株中的2.3倍)可以通过过表达C3b来实现。这些结果显示出选定的翻译起始因子或其组合的过表达增加了总细胞翻译活性，而不仅仅是特异性蛋白质(诸如重组蛋白)的翻译。令人惊讶的是，vHH产量改善(表10和12)与相对翻译活性(相关系数R²＝0.84)之间存在明显的相关性，这表明翻译起始期间mRNP的形成是重组蛋白生产的限速步骤。

实施例7：翻译因子过表达在补料分批培养中的作用。

为了进一步验证筛选中的观察结果，对选定的过表达靶标进行类似于标准生产过程的补料分批培养。

a)在补料分批培养中TIF过表达对vHH产量的作用：

对于此实施例，选择过表达C3b或RLI1的CBS2612_P_G1-3_vHH#4进行培养。这些菌株在筛选中显示出对重组蛋白分泌的强烈有益作用(实施例4、5和9)。对于补料分批培养，应用不同的补料概况，同时使用相同的培养基，产生以下计算的在相应采样点的生长速率(表17)。培养基组成可以在下面找到。

表17：补料分批中不同采样点的生长速率。

培养基：

PTM₀微量盐储备溶液，每升含有：

5.0mL H₂SO₄(95-98％)、65.0g FeSO₄*7H₂O、20g ZnCl₂、6.00g CuSO₄*5H₂O、3.0gMnSO₄*H₂O、0.5g CoCl₂*6H₂O、0.20g Na₂MoO₄*2H₂O、0.08g NaI、0.02g H₃BO₃

甘油分批培养基每升含有：

2g柠檬酸一水合物(C₆H₈O₇*H₂O)、45g甘油、12.6g(NH₄)₂HPO₄、0.5g MgSO₄*7H₂O、0.9g KCl、0.022g CaCl₂*2H₂O、13.2mL生物素储备溶液(0.1g L^-1)和4.6mL PTM₀微量盐储备溶液。添加HCl(浓)以将pH设置为5。

葡萄糖补料培养基每升含有：

495g葡萄糖一水合物、4.6g MgSO₄*7H₂O、8.4g KCl、0.28g CaCl₂*2H₂O、23.6mL生物素储备溶液(0.1g L^-1)和10.1mL PTM₀微量盐储备溶液。

b)补料分批培养使用线性补料，最低生长速率达到0.04h^-1。

用宿主菌株CBS2612 P_G1-3 vHH#4和对应的过表达菌株CBS2612 P_G1-3 vHH C3b#13、CBS2612 P_G1-3 vHH C3b#16和CBS2612 P_G1-3 vHH PGAP RLI1#4在1L台式生物反应器(SR0700ODLS；Dasgip，德国；反应器组第A-B号)或1.8L台式生物反应器(SR1500ODLS；Dasgip，德国；反应器组第C号)中进行补料分批培养。对于预培养物，给在1L摇瓶中的含有50μg mL^-1Zeocin和100μg mL^-1诺尔丝菌素(若适用)的100mL YPG培养基接种1.0mL低温储备液，并以180rpm和25℃孵育24小时左右。分批培养物在0.5L的工作体积下操作，并接种至起始OD₆₀₀为1.5。上面给出了甘油分批培养基组成。在整个过程期间中，温度控制在30℃，通过自动调节搅拌器速度(在400rpm与1200rpm之间)和空气流量(在9.5sL h^-1与30sL h^-1之间)将DO保持在30％，并且通过自动添加12.5％ NH₄OH将pH调控为5.0。在DO突然飙升(表明分批结束(BE))后，应用了线性增量葡萄糖补料(培养基组成详见上文)，其引起快速的初始生长速率(μ)，随后是逐渐降低μ的延长阶段。补料的线性增加设置为遵循以下等式：F[mLh^-1]＝0.1431*t+2.0499。进行两次相同的补料分批培养以确认获得的结果。

在整个过程中的不同时间点分析酵母干质量(YDM)和分泌的重组蛋白(如表18所示)。对于YDM分析，将1mL培养液转移到2mL预干燥(在105℃下持续至少24小时)和预称重的离心管中。在以16,000g和4℃离心5分钟后，将上清液小心地转移到新的小瓶中并储存在-20℃直至进一步使用。细胞沉淀用0.1M HCl洗涤两次，并在105℃干燥至少24小时，然后再次测量重量。

如实施例2c中所述，通过微流体毛细管电泳(GXII，Perkin-Elmer)分析上清液。

表18：可以在此处看到两个补料分批培养组B289-B292和C037-C040的YDM以及滴度和产量的FC。在2或3个不同的时间点采集样品。FC vHH滴度/产量是在相同时间点，过表达构建体滴度/产量与宿主菌株滴度/产量相比的倍数变化。

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在表18中可以看出，TIF的过表达对补料分批培养中的生物量浓度没有影响。相反，在整个补料分批过程期间中，与亲本对照相比，产物滴度和产量有所增加。尤其是在后来的时间点F20和F46，可以看到RLI1过表达对产物滴度和产量的明显积极作用，在发酵结束时是亲本宿主菌株的滴度和产量的2.2倍。C3b的过表达引起甚至更高的增加，产物产量和滴度平均是2.7倍。

c)恒定补料培养，最小生长速率为0.02h^-1。

如实施例7a和7b中所述，用宿主菌株CBS2612 P_G1-3 vHH#4和对应的过表达菌株CBS2612 P_G1-3 vHH C3#16和CBS2612 P_G1-3 vHH PGAP RLI1#4进行另一补料分批培养。然而，在该培养中，选择不同的补料概况，其应用恒定的葡萄糖补料而不是实施例7b中描述的线性增量葡萄糖补料。在整个补料分批培养期间中，恒定补料保持在4mL h^-1。这使得开始时生长速度下降更快，并且生长缓慢时的培养时间更长。如上所述进行采样。除了YDM和上清液之外，还收集1mL细胞悬浮液，将其沉淀并冷冻在-80℃以用于转录物水平确定。

表19：可以在此处看到补料分批培养组C041-C044的YDM以及滴度和产量的FC。在3个不同的时间点采集样品。FC滴度/产量是在相同时间点，过表达构建体滴度/产量与宿主菌株滴度/产量相比的倍数变化。

表19显示，采用这种补料策略，RLI1和C3b过表达也均引起与宿主菌株相比增加的产物滴度和产量，同时生产相同量的YDM。与实施例7b一样，C3b过表达证明对重组蛋白生产非常有益，产物产量和滴度平均达到4倍。

总之，这表明单一TIF或其组合的过表达对重组蛋白生产具有强烈的积极作用，而与应用的补料策略无关。

d)翻译因子过表达对补料分批中转录物水平的作用。

为了评定当在补料分批中培养细胞时，实施例6b中所见的TIF过表达对转录物丰度的作用是否也持续存在，分析来自补料分批组C041-C044(实施例7b)的样品中PpACT1、vHH和TDH3的转录物水平。该程序如实施例6a中所述进行。如上所述，转录物水平被归一化为酿酒酵母ACT1。此外，然后在对应的采样点将它们归一化为宿主菌株，即反应器C041。表20显示了PpACT1、vHH和TDH3的相对转录物水平的倍数变化。

表20：两种巴斯德毕赤酵母管家基因ACT1和TDH3以及分泌的重组蛋白vHH的相对转录物水平。

虽然RLI1的过表达使得三个分析基因的转录物水平略有增加(两个天然巴斯德毕赤酵母基因在后来的时间点F31和F54的转录物水平平均为1.2倍)，但C3b过表达使得PpACT1的转录物水平增加高达1.5倍，vHH高达2.9倍，并且TDH3高达2.2倍(表20)。C3b中的vHH转录物水平增加似乎与相同补料分批培养中所见的滴度增加相关(表19)。两个管家基因ACT1和TDH3的转录物水平增加表明细胞中所有转录物的增加而与培养模式无关。

e)利用甲醇诱导型重组蛋白分泌的补料分批培养。

需要甲醇诱导的克隆的补料分批培养根据MutS菌株的标准过程和培养基进行，如Zavec等人2020中所述。对于预培养物，给在1L摇瓶中的含有50μg mL^-1Zeocin和100μg mL^-1诺尔丝菌素(若适用)的100mL YPG培养基接种1.0mL低温储备液，并以180rpm和25℃孵育24小时左右。

分批培养物在0.4L BSM培养基的工作体积下操作(Mellitzer等人，2014)，并接种至起始OD₆₀₀为2.5。对温度进行控制并保持在25℃，通过自动调节搅拌器速度(在200rpm与1250rpm之间)、空气流量(在9.5sL h^-1与50sL h^-1之间)和氧气补充将DO保持在20％。通过自动添加25％ NH₄OH将pH调控为5.0。在DO突然飙升(表明分批结束(BE))后，开始了甘油补料，随后是甘油/甲醇共同补料。甘油补料(60％w/w+12mL/L PTM1)呈线性增加(y＝0.225x+1.95)，甘油补料持续8小时。随后是18小时的60％甘油和100％甲醇的共同补料。在共同补料中，60％甘油补料呈线性下降(y＝3.75–0.111x)，并且甲醇补料呈线性增加(y＝0.028x+0.6)。最后，在仅甲醇补料阶段，应用线性增加的甲醇补料(y＝0.028x+1.10)，持续72小时。如实施例7b中所述进行采样、YDM确定和蛋白质定量。

表21：基于甲醇的补料分批培养组B365-B368的YDM以及滴度和产量的FC。在3个不同的时间点采集样品。补料开始后的时间对应于纯甘油补料开始后的时间。FC滴度/产量是在相同时间点，过表达构建体滴度/产量与两个宿主菌株滴度/产量的平均值相比的倍数变化。

表21显示，当使用基于甲醇的重组蛋白生产策略时，C3b过表达也引起与宿主菌株相比增加的产物滴度和产量，并且因此显示出明显的有益作用。该增加为1.7倍左右，从纯甲醇补料启动后不久开始并且一直持续到培养结束。

实施例8：TIF过表达在恒化器培养中的作用。

由于连续培养在生物制药生产领域越来越受到重视，因此也在恒化器培养中以固定生长速率分析了C3b过表达对重组蛋白分泌的作用。这种方法提供了在生产过程期间连续培养的可能性，并允许严格控制生长速率。

a)C3b过表达对恒化器中固定生长速率下的重组蛋白分泌的作用。

培养基：

恒化器微量元素溶液，每升含有：

15g EDTA、4.5g ZnSO₄*7H₂O、1.03g MnCl₂*4H₂O、0.3CoClo₂*6H₂O、0.3g CuSO₄、0.4g Na₂MoO₄*2H₂O、4.5g CaCl₂*2H₂O、3g FeSO₄*7H₂O、1g H₃BO₃、0.1KI

将EDTA和ZnSO₄*7H₂O溶解于H₂O中，用固体NaOH将pH设置为6，并且然后逐一溶解其他盐。然后用固体NaOH和浓HCl将pH设置为4。

恒化器葡萄糖培养基，每升含有(以达到10g L^-1的YDM)：

22g葡萄糖一水合物、10g(NH₄)₂SO₄、6g KH₂PO₄、1MgSO₄*7H₂O、0.5g PE6100、3mL恒化器微量元素溶液、1.6ml生物素储备溶液(0.1g L^-1)

通过添加固体KOH将pH设置为5。

对于恒化器法，在1.8L台式生物反应器(SR1500ODLS；Dasgip，德国)中以两重复的方式培养菌株CBS2612 P_G1-3 vHH#4和对应的C3b过表达菌株CBS2612 P_G1-3 vHH C3b#13。对于预培养物，给在1L摇瓶中的含有50μg mL^-1Zeocin和100μg mL^-1诺尔丝菌素(若适用)的100mL YPG培养基接种1.0mL低温储备液并在180rpm和25℃孵育约24小时。分批培养物在0.6L的工作体积下操作，并接种至起始OD₆₀₀为0.4。将上述培养基用于分批和连续培养。对于分批培养，通过自动调节搅拌器速度(在400rpm与1200rpm之间)和空气流量(在9.5sL h^-1与30sL h^-1之间)，将DO保持在30％。对于连续培养，搅拌器速度设置为700rpm，并且空气流量设置为30sL h^-1。在整个过程期间，温度保持在30℃，并且通过自动添加12.5％ NH₄OH将pH保持在5。设计培养基使得YDM在分批和连续培养中达到大约10g/L的浓度。在DO突然飙升(表明分批结束)后，开始连续培养。对于μ＝D＝0.015h^-1，所选的补料速率为9mL h^-1，并且培养物体积保持恒定在0.6L。这是通过使用液面传感器和只要体积超过0.6L就自动将额外的培养物泵出反应器来完成的。在333小时后采集样品，对应于反应器体积的5个体积变化，这被接受为稳态条件。

如实施例7b中所述，在所选的采样点分析酵母干质量(YDM)和分泌的重组蛋白。此外，如实施例6a中所述采集用于转录物水平分析的样品。此外，收集通过将1mL培养物以16,000g离心5分钟、弃去上清液并将沉淀储存在-20℃所制成的细胞沉淀。这些用于实施例8c中描述的总蛋白质测量。

表22显示上述恒化器法的结果。即使在这种固定且缓慢的生长速率和稳态条件下，TIF过表达后的滴度高达对照宿主菌株的1.75倍，而生物量浓度(YDM)与对照宿主菌株相似。C3b过表达菌株的比生产率相比宿主菌株增加1.5至1.8倍。这证实了在补料分批培养中看到的TIF过表达对重组蛋白生产的积极作用(实施例7)也可以在连续培养中实现。

表22：宿主菌株CBS2612 P_G1-3 vHH#4和C3b过表达菌株的vHH滴度、YDM和vHH的比生产率。

b)翻译因子过表达对连续培养中转录物水平的作用。

为进一步阐明C3b过表达的作用，使用实施例6a中描述的程序测量转录物水平。如上所述，转录物水平被归一化为酿酒酵母ACT1。此外，然后将它们归一化为宿主菌株(反应器C050)以接受PpACT1和vHH的相对转录物水平的倍数变化。

C3b的过表达使得vHH的相对转录物水平是1.40±0.04倍。PpACT1显示出类似的倍数变化，即1.46±0.04。这证实了在筛选和补料分批培养中获得的结果，表明转录物水平在过表达选定的翻译起始因子的细胞中普遍增加而与应用的培养模式无关。

c)总蛋白质浓度的确定。

为了确定这种增加的转录物水平的作用是否对细胞中总蛋白质的浓度有影响，使用了缩二脲法。

简言之，将实施例8a中描述的收集的细胞沉淀用水洗涤三次。然后将它们用水稀释以在每个管中接收8mg mL^-1YDM。将每个样品240μL的细胞悬浮液与125μL的3M NaOH混合两次，并在99℃煮沸5分钟。冷却后，添加125μL 2.5％ CuSO4，并将样品以16,000g离心5分钟。在获得的上清液中，每管200μL用于在Tecan Reader(Tecan Infinite M200)中在555nm波长下测量两次。对于校准曲线，牛血清白蛋白的稀释液(分子生物学的白蛋白组分V(Albumin Fraction V)≥98％)(13g L^-1、12g L^-1、10g L^-1、8g L^-1、6g L^-1、4g L^-1、2g L^-1、1gL^-1和0g L^-1)的处理方式与样品相同。

含有宿主菌株CBS2612 P_G1-3 vHH#4的两个反应器每mg干质量生产0.24±0.00mg蛋白质，而含有过表达菌株CBS2612 P_G1-3 vHH C3b#13的两个反应器每mg干质量生产0.29±0.00mg蛋白质。在过表达菌株中观察到总蛋白质增加1.2倍表明转录物水平的增加引起细胞中总蛋白质的增加。然而，对重组POI的作用(1.8倍)显著强于对总细胞蛋白的作用(1.2倍)，这再次强调了我们令人惊讶的发现，即mRNP的TIF在重组蛋白生产期间受到限制，并且它们的过表达引起更高的生产率。

实施例9：TIF的过表达对其他模型蛋白质的分泌的作用。

选择人血清白蛋白(HSA)作为另一种模型蛋白质来确认TIF过表达的作用。

a)HSA生产者菌株的生成

如实施例1a中所述，将P_G1-3_HSA的表达盒转化到CBS2612中以生成HSA生产菌株。如实施例2a所述筛选所得菌株，并如实施例2c所述通过微流体毛细管电泳(mCE)确定滴度。选择两个具有不同生产率的HSA生产克隆作为TIF过表达的宿主。选择CBS2612 P_G1-3 HSA#15作为平均生产者宿主菌株，而选择CBS2612 P_G1-3 HSA#10作为高生产者宿主菌株。将这两个菌株以四重复的方式重新筛选，并且结果可见于表23。此外，还确定了这些菌株的GCN以解释生产率的差异。根据实施例1d进行GCN确定。

表23：在第一次筛选中选择两个克隆用作后续TIF过表达的宿主菌株。滴度、WCW和产率是在两个所选克隆的以四重复的方式进行的重新筛选中获得的。另外显示的是针对这两个宿主菌株中的重组蛋白表达盒确定的GCN。

	HSA滴度[mg L-1]	WCW[g L-1]	HSA产量[mg g-1]	GCN
					CBS2612PG1-3HSA#10	208.4±19.1	90.4±1.4	2.3±0.2	6
CBS2612PG1-3HSA#15	38.9±3.5	97.3±2.1	0.4±0.0	1

表23中看到的滴度显示四重复的平均值。高生产者的产量超过平均生产者的5倍，这与较高的GCN密切相关。两种菌株都用于过表达所选的翻译起始因子构建体。

b)TIF过表达菌株的生成及其对HSA分泌的作用

选择组合过表达C3b以在实施例9a中描述的两种HSA生产菌株中进行测试。如实施例1所述进行克隆，随后如实施例2a和2c所述进行筛选和滴度确定。

表24：C3b过表达在两种不同的所选HSA生产者菌株中的筛选结果。除了HSA滴度、WCW和HSA产量之外，还显示了HSA产量的倍数变化。计算与各相应宿主菌株CBS2612PG1-3HSA#10或#15相比的倍数变化。此外，还显示了筛选中使用的克隆数。

表24显示筛选结果。尽管两种生产者宿主菌株之间的绝对HSA滴度存在差异，但TIF C3b过表达的影响大约相同，即增加1.4倍。这表明TIF过表达具有增加高生产者菌株以及平均生产者菌株中的重组蛋白分泌的作用。此外，表24中的结果显示C3b过表达不仅增加了vHH的重组蛋白分泌(如以上实施例中所验证的)，还增加了HSA的重组蛋白分泌，从而强化了TIF过表达对重组蛋白生产的普遍积极影响的概念。

c)过表达TIF的HSA生产者菌株的补料分批培养

接下来，将HSA宿主菌株和对应的C3b过表达菌株用于补料分批培养。如实施例7中所述进行补料分批培养。在这种情况下，使用以下线性增量葡萄糖补料的等式：F[mL h^-1]＝0.01*t+2。这使得采样点F9的大致生长速率为0.029h^-1。

表25：可以在此处看到补料分批培养组A499-A502的YDM以及滴度和产量的FC。在2个不同的时间点采集样品。FC滴度/产量是在相同时间点，过表达构建体滴度/产量与宿主菌株滴度/产量相比的倍数变化。

至于其他模型蛋白质和菌株，C3b过表达增加了两种生产者宿主菌株中的重组HSA分泌产量，如表25中可以看到的。特别地，高生产者菌株CBS2612 P_G1-3 HSA#10的分泌蛋白增加更为明显，即增加1.9倍。由此得出结论，mRNP的TIF对具有更高重组蛋白表达能力(例如，由于更高的GCN和/或具有高表达强度的启动子而引起更高的转录)的细胞造成更强的瓶颈，并且此类细胞通过TIF过表达收益甚至更多。

序列表

<110> 龙沙有限公司

<120> 过表达翻译因子的宿主细胞

<130> LO011P

<160> 196

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 202

<212> PRT

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 1

Met Ser Glu Thr Glu Asn Ala Pro His Glu Lys Ser Leu Leu Asp Asp

1 5 10 15

Gln Val Asp Phe Thr Val Lys His Pro Leu Asn Ser Glu Trp Thr Leu

20 25 30

Trp Tyr Thr Lys Pro Ala Val His Glu Gln Glu Ser Trp Ser Asp Leu

35 40 45

Leu Arg Pro Ile Ile Ser Phe Asn Ser Val Glu Glu Phe Trp Gly Ile

50 55 60

Phe Asn Ser Ile Pro Lys Ala Ser Asp Leu Pro Val Lys Ser Asp Tyr

65 70 75 80

His Leu Phe Arg Asp Gly Ile Lys Pro Glu Trp Glu Asp Glu Arg Asn

85 90 95

Ala Asn Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Gln Phe Ala Tyr Arg Lys Val Asp

100 105 110

Ile Asn Glu Leu Trp Ser Arg Gly Leu Leu Ser Val Ile Gly Glu Thr

115 120 125

Ile Gln Asp Asp Asp Gly Glu Thr Glu Val Asn Gly Ile Val Leu Ser

130 135 140

Ile Arg Arg Ala Ala Leu Lys Ile Ala Leu Trp Thr Lys Ser Lys Asp

145 150 155 160

Glu Ala Val Leu Arg Pro Ile Gly Glu Arg Phe Lys Lys Val Leu Lys

165 170 175

Leu Thr Ala Arg Asp His Ile Asp Phe Gln Pro His Lys Ser Gly Ala

180 185 190

Gly Ser Lys Asn Val Pro Ser Phe Ser Ile

195 200

<210> 2

<211> 202

<212> PRT

<213> 巴斯德孔玛氏酵母

<400> 2

Met Ser Glu Thr Glu Asn Ala Pro His Glu Lys Ser Leu Leu Asp Asp

1 5 10 15

Gln Val Asp Phe Thr Val Lys His Pro Leu Asn Ser Glu Trp Thr Leu

20 25 30

Trp Tyr Thr Lys Pro Ala Val His Glu Gln Glu Ser Trp Ser Asp Leu

35 40 45

Leu Arg Pro Ile Ile Ser Phe Asn Ser Val Glu Glu Phe Trp Gly Ile

50 55 60

Phe Asn Ser Ile Pro Lys Ala Ser Asp Leu Pro Val Lys Ser Asp Tyr

65 70 75 80

His Leu Phe Arg Asp Gly Ile Lys Pro Glu Trp Glu Asp Glu Arg Asn

85 90 95

Ala Asn Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Gln Phe Ala Tyr Arg Lys Val Asp

100 105 110

Ile Asn Glu Leu Trp Ser Arg Gly Leu Leu Ser Val Ile Gly Glu Thr

115 120 125

Ile Gln Asp Asp Asp Gly Glu Thr Glu Val Asn Gly Ile Val Leu Ser

130 135 140

Ile Arg Arg Ala Ala Leu Lys Ile Ala Leu Trp Thr Lys Ser Lys Asp

145 150 155 160

Glu Ala Val Leu Arg Pro Ile Gly Glu Arg Phe Lys Lys Val Leu Lys

165 170 175

Leu Thr Ala Arg Asp His Ile Asp Phe Gln Pro His Lys Ser Gly Ala

180 185 190

Gly Ser Lys Asn Val Pro Ser Phe Ser Ile

195 200

<210> 3

<211> 217

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Ala Thr Val Glu Pro Glu Thr Thr Pro Thr Pro Asn Pro Pro Thr

1 5 10 15

Thr Glu Glu Glu Lys Thr Glu Ser Asn Gln Glu Val Ala Asn Pro Glu

20 25 30

His Tyr Ile Lys His Pro Leu Gln Asn Arg Trp Ala Leu Trp Phe Phe

35 40 45

Lys Asn Asp Lys Ser Lys Thr Trp Gln Ala Asn Leu Arg Leu Ile Ser

50 55 60

Lys Phe Asp Thr Val Glu Asp Phe Trp Ala Leu Tyr Asn His Ile Gln

65 70 75 80

Leu Ser Ser Asn Leu Met Pro Gly Cys Asp Tyr Ser Leu Phe Lys Asp

85 90 95

Gly Ile Glu Pro Met Trp Glu Asp Glu Lys Asn Lys Arg Gly Gly Arg

100 105 110

Trp Leu Ile Thr Leu Asn Lys Gln Gln Arg Arg Ser Asp Leu Asn Arg

115 120 125

Phe Trp Leu Glu Thr Leu Leu Cys Leu Ile Gly Glu Ser Phe Asp Asp

130 135 140

Tyr Ser Asp Asp Val Cys Gly Ala Val Val Asn Val Arg Ala Lys Gly

145 150 155 160

Asp Lys Ile Ala Ile Trp Thr Thr Glu Cys Glu Asn Arg Glu Ala Val

165 170 175

Thr His Ile Gly Arg Val Tyr Lys Glu Arg Leu Gly Leu Pro Pro Lys

180 185 190

Ile Val Ile Gly Tyr Gln Ser His Ala Asp Thr Ala Thr Lys Ser Gly

195 200 205

Ser Thr Thr Lys Asn Arg Phe Val Val

210 215

<210> 4

<211> 247

<212> PRT

<213> 黑曲霉

<400> 4

Met Ala Ala Val Ala Glu Asn Gly His Ala Pro Val Ala Asp Glu Asn

1 5 10 15

Ala Ala Pro Val Ala Ala Ala Val Glu Gln Lys Glu Gln Thr Glu Lys

20 25 30

Thr Asn Gly Asp Ser Val Thr Val Phe His Asp Pro Glu Asn Phe Asn

35 40 45

Val Lys His Pro Leu Met His Glu Trp Thr Leu Trp Phe Thr Lys Pro

50 55 60

Pro Ser Gly Lys Gly Asp Asn Trp Asn Asp Leu Leu Lys Glu Val Val

65 70 75 80

Thr Phe Asn Ser Val Glu Glu Phe Trp Gly Ile Tyr Asn Asn Ile Ser

85 90 95

Pro Thr Ser Glu Leu Gly Leu Lys Ala Asp Tyr His Leu Phe Lys Lys

100 105 110

Gly Val Arg Pro Glu Trp Glu Asp Pro Gln Asn Lys His Gly Gly Lys

115 120 125

Trp Ser Tyr Ser Phe Lys Asp Lys Arg Ser Val Pro Ile Asp Asp Leu

130 135 140

Trp Leu His Ala Gln Leu Ala Ala Ile Gly Glu Thr Leu Glu Asn Asp

145 150 155 160

Gly Asp Asn Glu Val Met Gly Val Val Val Asn Val Arg Lys Gly Phe

165 170 175

Tyr Arg Val Gly Leu Trp Thr Arg Thr Val Gly Lys Ser Ile Pro Gly

180 185 190

Asp Lys Asn Gly Arg Thr Pro Ala Gln Gly Lys Glu Ile Leu Glu Asn

195 200 205

Ile Gly Arg Arg Phe Lys Glu Val Leu Arg Leu Lys Glu Ala Asp Ala

210 215 220

Val Glu Phe Ser Gly His Thr Asp Ser Ala His Ser Gly Ser Thr Arg

225 230 235 240

Ala Lys Ala Lys Tyr Thr Val

245

<210> 5

<211> 212

<212> PRT

<213> 中国仓鼠

<400> 5

Met Glu Thr Thr Pro Thr Thr Asn Pro Pro Pro Val Glu Glu Glu Lys

1 5 10 15

Thr Glu Ser Asn Gln Glu Val Ala Asn Pro Glu His Tyr Ile Lys His

20 25 30

Pro Leu Gln Asn Arg Trp Ala Leu Trp Phe Phe Lys Asn Asp Lys Ser

35 40 45

Lys Thr Trp Gln Ala Asn Leu Arg Leu Ile Ser Lys Phe Asp Thr Val

50 55 60

Glu Asp Phe Trp Ala Leu Tyr Asn His Ile Gln Leu Ser Ser Asn Leu

65 70 75 80

Met Pro Gly Cys Asp Tyr Ser Leu Phe Lys Asp Gly Ile Glu Pro Met

85 90 95

Trp Glu Asp Glu Lys Asn Lys Arg Gly Gly Arg Trp Leu Ile Thr Leu

100 105 110

Asn Lys Gln Gln Arg Arg Ser Asp Leu Asp Arg Phe Trp Leu Glu Thr

115 120 125

Leu Leu Cys Leu Ile Gly Glu Ser Phe Asp Asp Tyr Ser Asp Asp Val

130 135 140

Cys Gly Ala Val Val Asn Val Arg Ala Lys Gly Asp Lys Ile Ala Ile

145 150 155 160

Trp Thr Thr Glu Cys Glu Asn Arg Asp Ala Val Thr His Ile Gly Arg

165 170 175

Val Tyr Lys Glu Arg Leu Gly Leu Pro Pro Lys Ile Val Ile Gly Tyr

180 185 190

Gln Ser His Ala Asp Thr Ala Thr Lys Ser Gly Ser Thr Thr Lys Asn

195 200 205

Arg Phe Val Val

210

<210> 6

<211> 210

<212> PRT

<213> 乳酸克鲁维酵母

<400> 6

Met Ser Val Glu Glu Val Thr Gln Lys Thr Gln Asp Leu Thr Val Asp

1 5 10 15

Glu Ala Lys Pro Ala Thr Val Leu Ser Asp Ser Lys Glu Phe Gln Leu

20 25 30

Lys His Pro Leu Ser Ser Lys Trp Thr Leu Trp Tyr Thr Lys Pro Pro

35 40 45

Val Asp Ser Ser Glu Ser Trp Ser Asp Leu Leu Arg Pro Val Thr Ser

50 55 60

Leu Asp Thr Val Glu Glu Phe Trp Ala Ile Gln Asn Gly Ile Pro Lys

65 70 75 80

Pro Phe Asp Leu Pro Ile Lys Ser Asp Tyr His Leu Phe Arg Asn Asp

85 90 95

Ile Arg Pro Glu Trp Glu Asp Glu Ala Asn Ser Glu Gly Gly Lys Leu

100 105 110

Ser Tyr Gln Phe Lys Asn Lys Arg His Asn Ile Asp Asp Leu Trp Leu

115 120 125

Arg Thr Leu Leu Ala Val Ile Gly Glu Thr Ile Asp Glu Glu Glu Ser

130 135 140

Glu Ile Asn Gly Cys Val Leu Asn Val Arg Lys Ala Val Phe Lys Ile

145 150 155 160

Ala Leu Trp Thr Arg Thr Thr Asn Leu Asn Ala Leu Thr Asn Ile Ala

165 170 175

Thr Lys Phe Lys Gln Val Leu Gln Leu Gly Glu Gly Glu Lys Leu Glu

180 185 190

Phe Tyr Asn His Arg Thr Ser Asn Ser Gly His Ala Pro Pro Thr Ala

195 200 205

Leu Leu

210

<210> 7

<211> 211

<212> PRT

<213> 多形绪方酵母

<400> 7

Met Ser Glu Glu Leu Asn Gln Ala Ala Lys Asp Leu Ser Leu Asp Glu

1 5 10 15

Lys Lys Asp Val Thr Val Leu Asp Ser Arg Glu Glu Phe Asn Val Lys

20 25 30

His Pro Leu Asn Ser Lys Trp Thr Leu Trp Tyr Thr Lys Pro Ala Val

35 40 45

Asp Ser Ser Glu Ser Trp Ser Asp Leu Leu Lys Pro Val Val Ala Phe

50 55 60

Asp Thr Val Glu Glu Phe Trp Gly Ile Phe Asn Ser Ile Pro Lys Ala

65 70 75 80

Asp Glu Leu Pro Leu Lys Ser Asp Tyr His Leu Phe Arg Glu Asn Ile

85 90 95

Lys Pro Glu Trp Glu Asp Pro Ala Asn Ser Lys Gly Gly Arg Phe Ser

100 105 110

Phe Gln Phe Lys Gly Lys Arg Leu Glu His Gly Ile Asn Glu Ile Trp

115 120 125

Thr Arg Ala Leu Leu Ser Val Ile Gly Glu Thr Ile Glu Asp Asp Gln

130 135 140

Asn Glu Val Asn Gly Val Val Leu Asn Val Arg Lys Val Gly Tyr Arg

145 150 155 160

Val Cys Leu Trp Thr Lys Ser Cys Asp Arg Ala Ala Leu Val Pro Ile

165 170 175

Gly Glu Arg Leu Lys Lys Ile Leu Met Leu Arg Glu Gly Glu Ser Val

180 185 190

Glu Phe Ile Ser His Lys Asp Ser Asn Asp Arg Gly Ala Lys Pro Ala

195 200 205

Phe Tyr Val

210

<210> 8

<211> 213

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<400> 8

Met Ser Val Glu Glu Val Ser Lys Lys Phe Glu Glu Asn Val Ser Val

1 5 10 15

Asp Asp Thr Thr Ala Thr Pro Lys Thr Val Leu Ser Asp Ser Ala His

20 25 30

Phe Asp Val Lys His Pro Leu Asn Thr Lys Trp Thr Leu Trp Tyr Thr

35 40 45

Lys Pro Ala Val Asp Lys Ser Glu Ser Trp Ser Asp Leu Leu Arg Pro

50 55 60

Val Thr Ser Phe Gln Thr Val Glu Glu Phe Trp Ala Ile Ile Gln Asn

65 70 75 80

Ile Pro Glu Pro His Glu Leu Pro Leu Lys Ser Asp Tyr His Val Phe

85 90 95

Arg Asn Asp Val Arg Pro Glu Trp Glu Asp Glu Ala Asn Ala Lys Gly

100 105 110

Gly Lys Trp Ser Phe Gln Leu Arg Gly Lys Gly Ala Asp Ile Asp Glu

115 120 125

Leu Trp Leu Arg Thr Leu Leu Ala Val Ile Gly Glu Thr Ile Asp Glu

130 135 140

Asp Asp Ser Gln Ile Asn Gly Val Val Leu Ser Ile Arg Lys Gly Gly

145 150 155 160

Asn Lys Phe Ala Leu Trp Thr Lys Ser Glu Asp Lys Glu Pro Leu Leu

165 170 175

Arg Ile Gly Gly Lys Phe Lys Gln Val Leu Lys Leu Thr Asp Asp Gly

180 185 190

His Leu Glu Phe Phe Pro His Ser Ser Ala Asn Gly Arg His Pro Gln

195 200 205

Pro Ser Ile Thr Leu

210

<210> 9

<211> 243

<212> PRT

<213> 粟酒裂殖酵母

<400> 9

Met Ala Asp Ala Glu Asp Ser Arg His Ser Lys Asn Glu Gly Phe Pro

1 5 10 15

Asn Thr Ser Leu Ile Thr Glu Lys Leu Asp Leu Leu Asp Leu Phe Gly

20 25 30

Ser Pro Lys Val Lys Thr Glu Arg Glu Gly Arg Pro Ala Arg Leu Leu

35 40 45

Glu Gly Leu Ser Ala Val Asn Ala Glu Thr Ala Phe Val Lys Thr His

50 55 60

Pro Leu Gln His Glu Trp Thr Leu Trp Phe Leu Lys Pro Pro Thr Gln

65 70 75 80

Gly Leu Glu Trp Ser Asp Leu Leu Lys Glu Ile Ile Ser Phe Lys Thr

85 90 95

Val Glu Glu Phe Trp Gly Ile Phe Lys Thr Ile Ser Lys Ala Ser Met

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Leu Pro Ala Lys Ser Asp Tyr Ser Tyr Phe Leu Lys Gly Ile Arg Pro

115 120 125

Glu Trp Glu Asp Pro Gln Asn Met Asn Gly Gly Lys Trp Ala Tyr Gln

130 135 140

Ser Lys His Lys Gly Ser Asn Leu Asp Glu Leu Trp Leu Tyr Met Val

145 150 155 160

Leu Ala Ala Ile Gly Glu Thr Leu Asp Pro Thr Gly Lys Glu Val Thr

165 170 175

Gly Val Val Cys Asn Met Arg Lys Gly Phe Tyr Arg Ile Ala Val Trp

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Thr Arg Asn Cys Asn Asp Lys Asp Val Leu Glu Lys Ile Gly Leu Arg

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210 215 220

Ala His Glu Asp Ser Ser Lys Ala Gly Ser Met Arg Ala Lys Thr Arg

225 230 235 240

Met Ser Leu

<210> 10

<211> 259

<212> PRT

<213> 里氏木霉

<400> 10

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Thr Lys Glu Asn Lys Asp Asp Gly Lys Pro Val Thr Val Phe His Asp

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Lys Asp Asn Phe Thr Val Lys His Pro Leu Gln Ser Lys Trp Thr Leu

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65 70 75 80

Leu Lys Glu Val Ile Thr Phe Asp Ser Val Glu Glu Phe Trp Gly Val

85 90 95

Tyr Asn Asn Val Ala Pro Val Ser Glu Leu Ala Leu Lys Ser Asp Tyr

100 105 110

His Leu Phe Lys Ala Gly Val Arg Pro Glu Trp Glu Asp Pro Gln Asn

115 120 125

Lys His Gly Gly Lys Trp Ser Tyr Gln Tyr Lys Asp Lys Arg Asn Val

130 135 140

Asp Val Asp Arg Leu Trp Leu Gln Val Met Met Ala Ala Ile Gly Glu

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Thr Leu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Glu Val Met Gly Val Val Val Asn

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210 215 220

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225 230 235 240

Gly His Thr Asp Ser Ala His Ala Gly Ser Thr Arg Ala Lys Ala Lys

245 250 255

Tyr Val Val

<210> 11

<211> 278

<212> PRT

<213> 解脂耶氏酵母

<400> 11

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1 5 10 15

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Glu Ala Val Ala Asn Leu Asn Ile Lys Glu Glu Ala Pro Val Ala Ser

35 40 45

Glu Pro Ala Glu Val Thr Glu Thr Val Glu Glu Glu Val Thr Pro Ala

50 55 60

Glu Pro Phe Ser Thr Val Phe Asp Ser Lys Thr Glu Phe Ala Thr Val

65 70 75 80

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85 90 95

Pro Ala Val Ala Trp His Asp Leu Ile Lys Glu Val Val Ser Phe Asp

100 105 110

Thr Val Glu Gly Phe Trp Ala Val Tyr Asn Asn Ile Pro Lys Leu Val

115 120 125

Glu Leu Pro Ile Arg Ser Asp Tyr Ala Phe Phe Arg Lys Gly Ile Arg

130 135 140

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145 150 155 160

Gln Phe Lys Pro Lys Ser Ala Asn Glu Phe Asp Glu Ile Trp Leu His

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Val Lys Ile Lys Gln Val Leu Arg Leu Pro Glu Lys Glu Glu Val Gln

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275

<210> 12

<211> 403

<212> PRT

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 12

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20 25 30

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35 40 45

Gln Ser Arg Ala Ile Leu Pro Ile Val Ala Gly Arg Asp Val Leu Ala

50 55 60

Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Ala Thr Phe Ala Ile Ser Ala

65 70 75 80

Leu Gln Arg Leu Asp Glu Lys Leu Lys Ala Ala Gln Val Leu Ile Leu

85 90 95

Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Ile Lys Lys Val Val Leu Ala

100 105 110

Leu Gly Met His Leu Asn Ile Ser Val His Ala Cys Ile Gly Gly Val

115 120 125

Asp Pro Ala Leu Asp Val Lys Ala Phe Asn Ser Gly Val Gln Ile Val

130 135 140

Val Gly Thr Pro Gly Arg Val Gln Asp Met Ile Glu Arg Gly Ala Phe

145 150 155 160

Arg Thr Glu Asn Val Lys Met Val Ile Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met

165 170 175

Leu Ser Thr Gly Phe Lys Glu Gln Ile Tyr Thr Leu Phe Thr Leu Leu

180 185 190

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195 200 205

Val Leu Glu Val Thr Thr Lys Phe Met Asn Asn Pro Ile Arg Ile Leu

210 215 220

Val Lys Lys Asp Gln Leu Thr Leu Glu Gly Ile Lys Gln Phe Tyr Val

225 230 235 240

Asp Val Gly Glu Glu Gln Tyr Lys Phe Asp Cys Leu Cys Asp Leu Tyr

245 250 255

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260 265 270

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<210> 13

<211> 403

<212> PRT

<213> 巴斯德孔玛氏酵母

<400> 13

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50 55 60

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65 70 75 80

Leu Gln Arg Leu Asp Glu Lys Leu Lys Ala Ala Gln Val Leu Ile Leu

85 90 95

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100 105 110

Leu Gly Met His Leu Asn Ile Ser Val His Ala Cys Ile Gly Gly Val

115 120 125

Asp Pro Ala Leu Asp Val Lys Ala Phe Asn Ser Gly Val Gln Ile Val

130 135 140

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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Leu Ala Arg Gly Ile Asp Val Gln Gln Val Ser Leu Val Ile Asn Tyr

325 330 335

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340 345 350

Gly Arg Phe Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile Asn Phe Val Thr Ser Lys

355 360 365

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370 375 380

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Asn Glu Ser

<210> 14

<211> 413

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

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50 55 60

Gln Gln Arg Ala Ile Lys Gln Ile Ile Lys Gly Arg Asp Val Ile Ala

65 70 75 80

Gln Ser Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Ala Thr Phe Ser Ile Ser Val

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Leu Gly Asp Tyr Met Asn Val Gln Cys His Ala Cys Ile Gly Gly Thr

130 135 140

Asn Val Gly Glu Asp Ile Arg Lys Leu Asp Tyr Gly Gln His Val Val

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165 170 175

Arg Thr Arg Ala Ile Lys Met Leu Val Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met

180 185 190

Leu Asn Lys Gly Phe Lys Glu Gln Ile Tyr Asp Val Tyr Arg Tyr Leu

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Val Lys Arg Asp Glu Leu Thr Leu Glu Gly Ile Lys Gln Phe Phe Val

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

Ser Ser Met His Gly Asp Met Pro Gln Lys Glu Arg Glu Ser Ile Met

305 310 315 320

Lys Glu Phe Arg Ser Gly Ala Ser Arg Val Leu Ile Ser Thr Asp Val

325 330 335

Trp Ala Arg Gly Leu Asp Val Pro Gln Val Ser Leu Ile Ile Asn Tyr

340 345 350

Asp Leu Pro Asn Asn Arg Glu Leu Tyr Ile His Arg Ile Gly Arg Ser

355 360 365

Gly Arg Tyr Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile Asn Phe Val Lys Asn Asp

370 375 380

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385 390 395 400

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<210> 15

<211> 398

<212> PRT

<213> 黑曲霉

<400> 15

Met Ala Ser Asn Asp Lys Gly Leu Glu Glu Ile Pro Glu Gly Gln Ile

1 5 10 15

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Ser Ala Ile Gln Gln Arg Ala Ile Lys Pro Ile Ile Ala Gly His Asp

50 55 60

Val Ile Ala Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Ala Thr Phe Ser

65 70 75 80

Ile Ser Ala Leu Gln Lys Ile Asp Gln Glu Leu Lys Ala Cys Gln Ala

85 90 95

Leu Ile Val Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Gln Gln Ile Gln Lys Val

100 105 110

Val Val Ala Ile Gly Asp Phe Met Asn Ile Glu Cys His Ala Cys Ile

115 120 125

Gly Gly Thr Asn Val Arg Asp Asp Met Asn Ala Leu Arg Ala Gly Pro

130 135 140

Gln Val Val Val Gly Thr Pro Gly Arg Ile His Asp Met Ile Glu Arg

145 150 155 160

Arg Val Leu Lys Thr Asp Gln Met Lys Leu Phe Ile Leu Asp Glu Ala

165 170 175

Asp Glu Met Leu Ser Arg Gly Phe Thr Glu Gln Ile Tyr Asp Ile Phe

180 185 190

Gln Leu Leu Pro Gln Ser Thr Gln Val Thr Leu Leu Ser Ala Thr Met

195 200 205

Pro Gln Asp Val Leu Glu Val Thr Thr Lys Phe Met Arg Asp Pro Ile

210 215 220

Arg Ile Leu Val Lys Lys Gln Glu Leu Thr Leu Glu Gly Ile Lys Gln

225 230 235 240

Phe Tyr Ile Ala Val Glu Lys Glu Glu Trp Lys Leu Asp Thr Leu Ser

245 250 255

Asp Leu Tyr Glu Thr Val Thr Ile Thr Gln Ala Val Ile Phe Cys Asn

260 265 270

Thr Arg Arg Lys Val Asp Trp Leu Thr Asp Lys Leu Thr Ala Arg Asp

275 280 285

Phe Thr Val Ser Ala Met His Gly Asp Met Glu Gln Gly Gln Arg Asp

290 295 300

Val Ile Met Lys Glu Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Val Leu Ile Ala

305 310 315 320

Thr Asp Leu Leu Ala Arg Gly Ile Asp Val Gln Gln Val Ser Leu Val

325 330 335

Ile Asn Tyr Asp Leu Pro Ala Asn Arg Glu Asn Tyr Ile His Arg Ile

340 345 350

Gly Arg Gly Gly Arg Phe Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile Asn Phe Val

355 360 365

Thr Ala Asp Asp Val Arg Met Met Arg Glu Ile Glu Gln Phe Tyr Ser

370 375 380

Thr Gln Ile Glu Glu Met Pro Met Asn Val Ala Asp Leu Ile

385 390 395

<210> 16

<211> 411

<212> PRT

<213> 中国仓鼠

<400> 16

Met Ala Ala Ala Ala Thr Met Ala Thr Ser Gly Ser Ala Arg Lys Arg

1 5 10 15

Leu Leu Lys Glu Glu Asp Met Thr Lys Val Glu Phe Glu Thr Ser Glu

20 25 30

Glu Val Asp Val Thr Pro Thr Phe Asp Thr Met Gly Leu Arg Glu Asp

35 40 45

Leu Leu Arg Gly Ile Tyr Ala Tyr Gly Phe Glu Lys Pro Ser Ala Ile

50 55 60

Gln Gln Arg Ala Ile Lys Gln Ile Ile Lys Gly Arg Asp Val Ile Ala

65 70 75 80

Gln Ser Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Ala Thr Phe Ser Ile Ser Val

85 90 95

Leu Gln Cys Leu Asp Ile Gln Val Arg Glu Thr Gln Ala Leu Ile Leu

100 105 110

Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Val Gln Ile Gln Lys Gly Leu Leu Ala

115 120 125

Leu Gly Asp Tyr Met Asn Val Gln Cys His Ala Cys Ile Gly Gly Thr

130 135 140

Asn Val Gly Glu Asp Ile Arg Lys Leu Asp Tyr Gly Gln His Val Val

145 150 155 160

Ala Gly Thr Pro Gly Arg Val Phe Asp Met Ile Arg Arg Arg Ser Leu

165 170 175

Arg Thr Arg Ala Ile Lys Met Leu Val Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met

180 185 190

Leu Asn Lys Gly Phe Lys Glu Gln Ile Tyr Asp Val Tyr Arg Tyr Leu

195 200 205

Pro Pro Ala Thr Gln Val Val Leu Ile Ser Ala Thr Leu Pro His Glu

210 215 220

Ile Leu Glu Met Thr Asn Lys Phe Met Thr Asp Pro Ile Arg Ile Leu

225 230 235 240

Val Lys Arg Asp Glu Leu Thr Leu Glu Gly Ile Lys Gln Phe Phe Val

245 250 255

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260 265 270

Asp Thr Leu Thr Ile Thr Gln Ala Val Ile Phe Cys Asn Thr Lys Arg

275 280 285

Lys Val Asp Trp Leu Thr Glu Lys Met Arg Glu Ala Asn Phe Thr Val

290 295 300

Ser Ser Met His Gly Asp Met Pro Gln Lys Glu Arg Glu Ser Ile Met

305 310 315 320

Lys Glu Phe Arg Ser Gly Ala Ser Arg Val Leu Ile Ser Thr Asp Val

325 330 335

Trp Ala Arg Gly Leu Asp Val Pro Gln Val Ser Leu Ile Ile Asn Tyr

340 345 350

Asp Leu Pro Asn Asn Arg Glu Leu Tyr Ile His Arg Ile Gly Arg Ser

355 360 365

Gly Arg Tyr Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile Asn Phe Val Lys Asn Asp

370 375 380

Asp Ile Arg Ile Leu Arg Asp Ile Glu Gln Tyr Tyr Ser Thr Gln Ile

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Asp Glu Met Pro Met Asn Val Ala Asp Leu Ile

405 410

<210> 17

<211> 396

<212> PRT

<213> 乳酸克鲁维酵母

<400> 17

Met Ser Asp Gly Ile Thr Asp Ile Asp Glu Asn Gln Ile Gln Ser Thr

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Leu Gln Asn Ile Asp Glu Lys Ile Lys Ala Pro Gln Gly Leu Ile Leu

85 90 95

Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Ile Gln Lys Val Val Met Ala

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Leu Ala Ile His Met Asp Val Lys Val His Ala Cys Ile Gly Gly Thr

115 120 125

Ser Leu Gln Glu Asp Ser Glu Ala Leu Arg Gly Gly Ala Gln Ile Ile

130 135 140

Val Gly Thr Pro Gly Arg Val Phe Asp Met Ile Asp Arg Arg Ile Phe

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Lys Thr Asp Asn Ile Lys Met Phe Ile Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met

165 170 175

Leu Ser Thr Gly Phe Lys Glu Gln Ile Tyr Asn Ile Phe Thr Met Leu

180 185 190

Pro Pro Thr Ser Gln Val Val Leu Leu Ser Ala Thr Met Pro Gly Asp

195 200 205

Val Leu Glu Val Thr Ser Lys Phe Met Lys Asp Pro Val Arg Ile Leu

210 215 220

Val Lys Lys Asp Glu Leu Thr Leu Glu Gly Ile Gly Gln Tyr Tyr Val

225 230 235 240

Asn Val Glu Glu Glu Gln Tyr Lys Tyr Asp Cys Leu Thr Asp Leu Tyr

245 250 255

Asp Ser Ile Ser Val Thr Gln Ala Val Ile Phe Cys Asn Thr Arg Arg

260 265 270

Lys Val Glu Glu Leu Thr Glu Arg Leu Arg Glu Asn Asn Phe Thr Val

275 280 285

Ser Ala Ile Tyr Ser Asp Leu Gln Gln Gln Glu Arg Asp Thr Ile Met

290 295 300

Lys Glu Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Ile Leu Ile Ser Thr Asp Leu

305 310 315 320

Leu Ala Arg Gly Ile Asp Val Gln Gln Val Ser Leu Val Ile Asn Tyr

325 330 335

Asp Leu Pro Ser Asn Lys Glu Asn Tyr Ile His Arg Ile Gly Arg Gly

340 345 350

Gly Arg Phe Gly Arg Lys Gly Ile Ala Ile Asn Phe Val Thr Asn Lys

355 360 365

Asp Ile Gly Ala Met Arg Glu Leu Glu Arg Phe Tyr Ser Thr Gln Ile

370 375 380

Glu Glu Leu Pro Ser Ser Ile Ser Glu Leu Phe Asp

385 390 395

<210> 18

<211> 397

<212> PRT

<213> 多形绪方酵母

<400> 18

Met Ala Ser Glu Asn Ile Gln Glu Val Asp Ser Asn Leu Ile Glu Ser

1 5 10 15

Asn Tyr Asp Asn Val Val Tyr Thr Phe Asp Glu Leu Asn Leu Lys Pro

20 25 30

Glu Ile Ile Arg Gly Ile Phe Ala Tyr Gly Tyr Glu Gln Pro Ser Ala

35 40 45

Ile Gln Gln Arg Ala Ile Leu Pro Ile Thr Glu Gly Arg Asp Val Leu

50 55 60

Ala Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Ala Thr Phe Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ala Leu Gln Arg Ile Asp Glu Lys Leu Lys Lys Thr Gln Ala Leu Ile

85 90 95

Leu Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Ile Gln Lys Val Val Leu

100 105 110

Ala Ile Gly Met His Leu Asp Leu Thr Val His Ala Ser Ile Gly Gly

115 120 125

Lys Ala Val Gln Glu Asp Met Glu Ala Leu Arg Asn Gly Ala Gln Ile

130 135 140

Val Val Gly Thr Pro Gly Arg Val Tyr Asp Met Ile Glu Arg Gly Tyr

145 150 155 160

Phe Lys Thr Asp Ala Ile Lys Met Phe Ile Met Asp Glu Ala Asp Glu

165 170 175

Met Leu Ser Ser Gly Phe Lys Glu Gln Ile Tyr Asn Val Phe Arg Phe

180 185 190

Leu Pro Thr Thr Thr Gln Val Val Leu Leu Ser Ala Thr Met Pro Gln

195 200 205

Asp Val Leu Glu Val Thr Thr Lys Phe Met Arg Asn Pro Val Arg Ile

210 215 220

Leu Val Lys Lys Asp Glu Leu Thr Leu Glu Gly Ile Lys Gln Phe Tyr

225 230 235 240

Ile Asp Val Asp Glu Glu Gln Tyr Lys Phe Asp Cys Leu Cys Asp Leu

245 250 255

Tyr Asp Ser Ile Ser Val Thr Gln Ala Val Ile Phe Cys Asn Thr Arg

260 265 270

Arg Lys Val Glu Thr Leu Thr Gln Gln Leu Thr Glu Asn Asn Phe Thr

275 280 285

Val Ser Ala Ile His Ser Asp Leu Ser Gln Gln Asp Arg Asp Thr Ile

290 295 300

Met Asn Glu Phe Arg Thr Gly Ser Ser Arg Ile Leu Ile Ser Thr Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Arg Gly Ile Asp Val Gln Gln Val Ser Leu Val Ile Asn

325 330 335

Tyr Asp Leu Pro Ser Asn Lys Glu Asn Tyr Ile His Arg Ile Gly Arg

340 345 350

Gly Gly Arg Phe Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile Asn Leu Ile Thr Arg

355 360 365

Glu Asp Thr Glu Met Leu Arg Glu Ile Glu Met Phe Tyr Ser Thr Gln

370 375 380

Ile Val Glu Met Pro Ser Ser Ile Asn Asp Leu Phe Asp

385 390 395

<210> 19

<211> 395

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<400> 19

Met Ser Glu Gly Ile Thr Asp Ile Glu Glu Ser Gln Ile Gln Thr Asn

1 5 10 15

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20 25 30

Leu Leu Arg Gly Val Phe Gly Tyr Gly Phe Glu Glu Pro Ser Ala Ile

35 40 45

Gln Gln Arg Ala Ile Met Pro Ile Ile Glu Gly His Asp Val Leu Ala

50 55 60

Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Gly Thr Phe Ser Ile Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gln Arg Ile Asp Thr Ser Val Lys Ala Pro Gln Ala Leu Met Leu

85 90 95

Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Ile Gln Lys Val Val Met Ala

100 105 110

Leu Ala Phe His Met Asp Ile Lys Val His Ala Cys Ile Gly Gly Thr

115 120 125

Ser Phe Val Glu Asp Ala Glu Gly Leu Arg Asp Ala Gln Ile Val Val

130 135 140

Gly Thr Pro Gly Arg Val Phe Asp Asn Ile Gln Arg Arg Arg Phe Arg

145 150 155 160

Thr Asp Lys Ile Lys Met Phe Ile Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu

165 170 175

Ser Ser Gly Phe Lys Glu Gln Ile Tyr Gln Ile Phe Thr Leu Leu Pro

180 185 190

Pro Thr Thr Gln Val Val Leu Leu Ser Ala Thr Met Pro Asn Asp Val

195 200 205

Leu Glu Val Thr Thr Lys Phe Met Arg Asn Pro Val Arg Ile Leu Val

210 215 220

Lys Lys Asp Glu Leu Thr Leu Glu Gly Ile Lys Gln Phe Tyr Val Asn

225 230 235 240

Val Glu Glu Glu Glu Tyr Lys Tyr Glu Cys Leu Thr Asp Leu Tyr Asp

245 250 255

Ser Ile Ser Val Thr Gln Ala Val Ile Phe Cys Asn Thr Arg Arg Lys

260 265 270

Val Glu Glu Leu Thr Thr Lys Leu Arg Asn Asp Lys Phe Thr Val Ser

275 280 285

Ala Ile Tyr Ser Asp Leu Pro Gln Gln Glu Arg Asp Thr Ile Met Lys

290 295 300

Glu Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Ile Leu Ile Ser Thr Asp Leu Leu

305 310 315 320

Ala Arg Gly Ile Asp Val Gln Gln Val Ser Leu Val Ile Asn Tyr Asp

325 330 335

Leu Pro Ala Asn Lys Glu Asn Tyr Ile His Arg Ile Gly Arg Gly Gly

340 345 350

Arg Phe Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile Asn Phe Val Thr Asn Glu Asp

355 360 365

Val Gly Ala Met Arg Glu Leu Glu Lys Phe Tyr Ser Thr Gln Ile Glu

370 375 380

Glu Leu Pro Ser Asp Ile Ala Thr Leu Leu Asn

385 390 395

<210> 20

<211> 392

<212> PRT

<213> 粟酒裂殖酵母

<400> 20

Met Val Asp Gln Leu Glu Asp Ser Val Ile Glu Thr Asn Tyr Asp Glu

1 5 10 15

Val Ile Asp Thr Phe Asp Asp Met Asn Leu Lys Pro Glu Leu Leu Arg

20 25 30

Gly Ile Tyr Ala Tyr Gly Phe Glu Arg Pro Ser Ala Ile Gln Gln Arg

35 40 45

Ala Ile Met Pro Ile Leu Gly Glu Arg Asp Val Leu Ala Gln Ala Gln

50 55 60

Ser Gly Thr Gly Lys Thr Ala Thr Phe Ser Ile Ser Val Leu Gln Lys

65 70 75 80

Ile Asp Thr Ser Leu Lys Gln Cys Gln Ala Leu Ile Leu Ala Pro Thr

85 90 95

Arg Glu Leu Ala Gln Gln Ile Gln Lys Val Val Val Ala Leu Gly Asp

100 105 110

Leu Met Asn Val Glu Cys His Ala Cys Ile Gly Gly Thr Leu Val Arg

115 120 125

Asp Asp Met Ala Ala Leu Gln Ala Gly Val His Val Val Val Gly Thr

130 135 140

Pro Gly Arg Val His Asp Met Ile Gln Arg Arg Ala Leu Pro Thr Asp

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Ala Val Gln Met Phe Val Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg

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Gly Phe Lys Asp Gln Ile Tyr Asp Ile Phe Gln Leu Leu Pro Pro Thr

180 185 190

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210 215 220

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275 280 285

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290 295 300

Arg Thr Gly Ser Ser Arg Ile Leu Ile Thr Thr Asp Leu Leu Ala Arg

305 310 315 320

Gly Ile Asp Val Gln Gln Val Ser Leu Val Ile Asn Tyr Asp Leu Pro

325 330 335

Ala Asn Arg Glu Asn Tyr Ile His Arg Ile Gly Arg Gly Gly Arg Phe

340 345 350

Gly Arg Lys Gly Val Ser Ile Asn Phe Val Thr Asn Asp Asp Val Arg

355 360 365

Met Met Arg Glu Ile Glu Gln Phe Tyr Asn Thr His Ile Glu Glu Met

370 375 380

Pro Met Asn Ile Ala Asp Leu Ile

385 390

<210> 21

<211> 396

<212> PRT

<213> 里氏木霉

<400> 21

Met Ala Asp Lys Gly Leu Glu Asp Val Pro Glu Gly Gln Ile Glu Ser

1 5 10 15

Asn Tyr Asp Glu Thr Val Asp Ser Phe Asp Asp Met Asn Leu Lys Ser

20 25 30

Glu Leu Leu Arg Gly Val Tyr Ala Tyr Gly Phe Glu Arg Pro Ser Ala

35 40 45

Ile Gln Gln Arg Ala Ile Met Pro Val Ile Lys Gly His Asp Val Ile

50 55 60

Ala Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Ala Thr Phe Ser Ile Ser

65 70 75 80

Val Leu Gln Lys Ile Asp Pro Ser Val Lys Gln Cys Gln Ala Leu Ile

85 90 95

Leu Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Gln Gln Ile Gln Lys Val Val Val

100 105 110

Ala Ile Gly Asp Phe Met Asn Val Glu Cys His Ala Cys Ile Gly Gly

115 120 125

Thr Ser Val Arg Glu Asp Met Lys Ala Leu Gln Asp Gly Pro Gln Val

130 135 140

Val Val Gly Thr Pro Gly Arg Val His Asp Met Ile Gln Arg Arg Phe

145 150 155 160

Leu Lys Thr Asp Ala Met Lys Met Phe Val Leu Asp Glu Ala Asp Glu

165 170 175

Met Leu Ser Arg Gly Phe Thr Asp Gln Ile Tyr Asp Ile Phe Gln Leu

180 185 190

Leu Pro Gln Ser Thr Gln Val Val Leu Leu Ser Ala Thr Met Pro Gln

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Ile Ala Val Glu Lys Glu Glu Trp Lys Leu Asp Thr Leu Ser Asp Leu

245 250 255

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260 265 270

Arg Lys Val Asp Trp Leu Thr Asp Lys Leu Thr Ala Arg Asp Phe Thr

275 280 285

Val Ser Ala Met His Gly Asp Met Asp Gln Ala Gln Arg Asp Leu Ile

290 295 300

Met Lys Glu Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Val Leu Ile Ala Thr Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Arg Gly Ile Asp Val Gln Gln Val Ser Leu Val Ile Asn

325 330 335

Tyr Asp Leu Pro Ala Asn Arg Glu Asn Tyr Ile His Arg Ile Gly Arg

340 345 350

Gly Gly Arg Phe Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile Asn Phe Val Thr Ala

355 360 365

Asp Asp Val Arg Met Met Arg Glu Ile Glu Gln Phe Tyr Ser Thr Gln

370 375 380

Ile Glu Glu Met Pro Met Asn Val Ala Asp Leu Ile

385 390 395

<210> 22

<211> 395

<212> PRT

<213> 解脂耶氏酵母

<400> 22

Met Ala Asp Gly Leu Thr Asp Ile Asp Ser Ser Gln Ile Thr Thr Asn

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Tyr Asp Glu Val Val Thr Ser Phe Asp Asp Leu Gly Leu Lys Asp Glu

20 25 30

Leu Leu Arg Gly Ile Tyr Gly Tyr Gly Phe Glu Asn Pro Ser Ser Ile

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50 55 60

Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Ala Thr Phe Ser Ile Ser Ala

65 70 75 80

Leu Gln Asn Ile Asp Glu Lys Ile Lys Lys Pro Gln Ala Leu Ile Ile

85 90 95

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100 105 110

Phe Gly Glu Tyr Met Lys Ile Glu Cys His Ala Cys Ile Gly Gly Thr

115 120 125

Ser Val Ala Glu Asp Ile Arg Val Ile Gln Glu Gly Val His Val Ile

130 135 140

Val Gly Thr Pro Gly Arg Ile His Asp Met Ile Glu Arg Arg Ile Leu

145 150 155 160

Lys Thr Asp Leu Ile Lys Met Phe Ile Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met

165 170 175

Leu Ser Arg Glu Phe Lys Asp Pro Ile Tyr Asp Ile Phe Thr Thr Leu

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Val Lys Lys Asp Glu Leu Thr Leu Glu Gly Ile Lys Gln Phe Tyr Ile

225 230 235 240

Asp Val Glu Gln Glu Ser Tyr Lys Phe Glu Val Leu Cys Asp Leu Tyr

245 250 255

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260 265 270

Lys Val Asp Tyr Leu Thr Gln Ala Leu Thr Glu Ala Asp Phe Thr Val

275 280 285

Ser Ser Met His Gly Glu Thr Glu Gln Ser Gln Arg Asp Val Ile Met

290 295 300

Lys Ala Phe Arg Thr Gly Ser Ser Arg Ile Leu Ile Thr Thr Asp Leu

305 310 315 320

Leu Ala Arg Gly Ile Asp Val Gln Gln Val Ser Leu Val Ile Asn Phe

325 330 335

Asp Leu Pro Ser Asn Arg Glu Asn Tyr Ile His Arg Ile Gly Arg Gly

340 345 350

Gly Arg Phe Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile Asn Phe Val Thr Ser Glu

355 360 365

Asp His Gly Met Leu Lys Glu Leu Glu Arg Phe Tyr Ser Thr Glu Ile

370 375 380

Val Glu Met Pro Thr Asn Ile Ala Asp Leu Ile

385 390 395

<210> 23

<211> 486

<212> PRT

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 23

Met His Pro Tyr Thr Val Val Phe Ala Arg Leu Leu Leu Gly Val Phe

1 5 10 15

Ser Thr Ala Ala Pro Asn Ser Pro Pro Pro Phe Cys Thr Ser Cys His

20 25 30

Leu Gly Asp Gln Arg Leu Trp Asn Leu Ala Gln Asn Leu Ala Cys Thr

35 40 45

Leu Pro Pro Gln Lys Asn Phe Pro Cys Leu Val Ala Arg Arg Ser Lys

50 55 60

Ile Lys Ser Phe Ser Thr Thr Phe Val Pro Asn Lys Ser Pro Phe Tyr

65 70 75 80

Leu Pro Ile Met Ser Glu Gly Ile Ile Glu Ile Asp Thr Asn Leu Ile

85 90 95

Glu Thr Asn Tyr Asp Gln Val Val Ser Thr Phe Asp Glu Leu Asn Leu

100 105 110

Lys Glu Gln Ile Leu Arg Ala Val Phe Ala Tyr Gly Tyr Glu Phe Pro

115 120 125

Ser Ala Ile Gln Ser Arg Ala Ile Leu Pro Ile Val Ala Gly Arg Asp

130 135 140

Val Leu Ala Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Ala Thr Phe Ala

145 150 155 160

Ile Ser Ala Leu Gln Arg Leu Asp Glu Lys Leu Lys Ala Ala Gln Val

165 170 175

Leu Ile Leu Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Ile Lys Lys Val

180 185 190

Val Leu Ala Leu Gly Met His Leu Asn Ile Ser Val His Ala Cys Ile

195 200 205

Gly Gly Val Asp Pro Ala Leu Asp Val Lys Ala Phe Asn Ser Gly Val

210 215 220

Gln Ile Val Val Gly Thr Pro Gly Arg Val Gln Asp Met Ile Glu Arg

225 230 235 240

Gly Ala Phe Arg Thr Glu Asn Val Lys Met Val Ile Leu Asp Glu Ala

245 250 255

Asp Glu Met Leu Ser Thr Gly Phe Lys Glu Gln Ile Tyr Thr Leu Phe

260 265 270

Thr Leu Leu Pro Ser Thr Thr Gln Val Val Leu Leu Ser Ala Thr Met

275 280 285

Pro Gln Glu Val Leu Glu Val Thr Thr Lys Phe Met Asn Asn Pro Ile

290 295 300

Arg Ile Leu Val Lys Lys Asp Gln Leu Thr Leu Glu Gly Ile Lys Gln

305 310 315 320

Phe Tyr Val Asp Val Gly Glu Glu Gln Tyr Lys Phe Asp Cys Leu Cys

325 330 335

Asp Leu Tyr Asp Ser Ile Ser Val Thr Gln Ala Val Ile Phe Cys Asn

340 345 350

Thr Arg Arg Lys Val Glu Glu Leu Thr Glu Arg Leu Thr Ala Gln Lys

355 360 365

Phe Thr Val Ser Ala Ile His Ser Glu Leu Ser Gln Thr Glu Arg Asp

370 375 380

Thr Ile Met Gln Glu Phe Arg Thr Gly Ser Ser Arg Ile Leu Ile Ser

385 390 395 400

Thr Asp Leu Leu Ala Arg Gly Ile Asp Val Gln Gln Val Ser Leu Val

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485

<210> 24

<211> 403

<212> PRT

<213> 巴斯德孔玛氏酵母

<400> 24

Met Ser Glu Gly Ile Ile Glu Ile Asp Thr Asn Leu Ile Glu Thr Asn

1 5 10 15

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Ile Leu Arg Ala Val Phe Ala Tyr Gly Tyr Glu Phe Pro Ser Ala Ile

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Gln Ser Arg Ala Ile Leu Pro Ile Val Ala Gly Arg Asp Val Leu Ala

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65 70 75 80

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Arg Thr Glu Asn Val Lys Met Val Ile Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met

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Asp Val Gly Glu Glu Gln Tyr Lys Phe Asp Cys Leu Cys Asp Leu Tyr

245 250 255

Asp Ser Ile Ser Val Thr Gln Ala Val Ile Phe Cys Asn Thr Arg Arg

260 265 270

Lys Val Glu Glu Leu Thr Glu Arg Leu Thr Ala Gln Lys Phe Thr Val

275 280 285

Ser Ala Ile His Ser Glu Leu Ser Gln Ser Glu Arg Asp Thr Ile Met

290 295 300

Gln Glu Phe Arg Thr Gly Ser Ser Arg Ile Leu Ile Ser Thr Asp Leu

305 310 315 320

Leu Ala Arg Gly Ile Asp Val Gln Gln Val Ser Leu Val Ile Asn Tyr

325 330 335

Asp Leu Pro Ser Asn Lys Glu Asn Tyr Ile His Arg Ile Gly Arg Gly

340 345 350

Gly Arg Phe Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile Asn Phe Val Thr Ser Lys

355 360 365

Asp Val Glu Met Met Lys Glu Ile Glu Lys Phe Tyr Ser Thr Gln Ile

370 375 380

Asp Glu Leu Pro Ser Ser Ile Thr Asp Leu Phe Glu Thr Glu Glu Val

385 390 395 400

Asn Glu Ser

<210> 25

<211> 411

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

Met Ala Thr Thr Ala Thr Met Ala Thr Ser Gly Ser Ala Arg Lys Arg

1 5 10 15

Leu Leu Lys Glu Glu Asp Met Thr Lys Val Glu Phe Glu Thr Ser Glu

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Glu Val Asp Val Thr Pro Thr Phe Asp Thr Met Gly Leu Arg Glu Asp

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Leu Leu Arg Gly Ile Tyr Ala Tyr Gly Phe Glu Lys Pro Ser Ala Ile

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Gln Gln Arg Ala Ile Lys Gln Ile Ile Lys Gly Arg Asp Val Ile Ala

65 70 75 80

Gln Ser Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Ala Thr Phe Ser Ile Ser Val

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115 120 125

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Asn Val Gly Glu Asp Ile Arg Lys Leu Asp Tyr Gly Gln His Val Val

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165 170 175

Arg Thr Arg Ala Ile Lys Met Leu Val Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

Ser Ser Met His Gly Asp Met Pro Gln Lys Glu Arg Glu Ser Ile Met

305 310 315 320

Lys Glu Phe Arg Ser Gly Ala Ser Arg Val Leu Ile Ser Thr Asp Val

325 330 335

Trp Ala Arg Gly Leu Asp Val Pro Gln Val Ser Leu Ile Ile Asn Tyr

340 345 350

Asp Leu Pro Asn Asn Arg Glu Leu Tyr Ile His Arg Ile Gly Arg Ser

355 360 365

Gly Gln Tyr Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile Asn Phe Val Lys Asn Asp

370 375 380

Asp Ile Arg Ile Leu Arg Asp Ile Glu Gln Tyr Tyr Ser Thr Gln Ile

385 390 395 400

Asp Glu Met Pro Met Asn Val Ala Asp Leu Ile

405 410

<210> 26

<211> 398

<212> PRT

<213> 黑曲霉

<400> 26

Met Ala Ser Asn Asp Lys Gly Leu Glu Glu Ile Pro Glu Gly Gln Ile

1 5 10 15

Glu Thr Asn Tyr Asp Glu Val Thr Asp Ser Phe Asp Ser Met Asp Leu

20 25 30

Lys Pro Glu Leu Leu Arg Gly Val Tyr Ala Tyr Gly Phe Glu Arg Pro

35 40 45

Ser Ala Ile Gln Gln Arg Ala Ile Lys Pro Ile Ile Ala Gly His Asp

50 55 60

Val Ile Ala Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Ala Thr Phe Ser

65 70 75 80

Ile Ser Ala Leu Gln Lys Ile Asp Gln Glu Leu Lys Ala Cys Gln Ala

85 90 95

Leu Ile Val Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Gln Gln Ile Gln Lys Val

100 105 110

Val Val Ala Ile Gly Asp Phe Met Asn Ile Glu Cys His Ala Cys Ile

115 120 125

Gly Gly Thr Asn Val Arg Asp Asp Met Asn Ala Leu Arg Ala Gly Pro

130 135 140

Gln Val Val Val Gly Thr Pro Gly Arg Ile His Asp Met Ile Glu Arg

145 150 155 160

Arg Val Leu Lys Thr Asp Gln Met Lys Leu Phe Ile Leu Asp Glu Ala

165 170 175

Asp Glu Met Leu Ser Arg Gly Phe Thr Glu Gln Ile Tyr Asp Ile Phe

180 185 190

Gln Leu Leu Pro Gln Ser Thr Gln Val Thr Leu Leu Ser Ala Thr Met

195 200 205

Pro Gln Asp Val Leu Glu Val Thr Thr Lys Phe Met Arg Asp Pro Ile

210 215 220

Arg Ile Leu Val Lys Lys Gln Glu Leu Thr Leu Glu Gly Ile Lys Gln

225 230 235 240

Phe Tyr Ile Ala Val Glu Lys Glu Glu Trp Lys Leu Asp Thr Leu Ser

245 250 255

Asp Leu Tyr Glu Thr Val Thr Ile Thr Gln Ala Val Ile Phe Cys Asn

260 265 270

Thr Arg Arg Lys Val Asp Trp Leu Thr Asp Lys Leu Thr Ala Arg Asp

275 280 285

Phe Thr Val Ser Ala Met His Gly Asp Met Glu Gln Gly Gln Arg Asp

290 295 300

Val Ile Met Lys Glu Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Val Leu Ile Ala

305 310 315 320

Thr Asp Leu Leu Ala Arg Gly Ile Asp Val Gln Gln Val Ser Leu Val

325 330 335

Ile Asn Tyr Asp Leu Pro Ala Asn Arg Glu Asn Tyr Ile His Arg Ile

340 345 350

Gly Arg Gly Gly Arg Phe Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile Asn Phe Val

355 360 365

Thr Ala Asp Asp Val Arg Met Met Arg Glu Ile Glu Gln Phe Tyr Ser

370 375 380

Thr Gln Ile Glu Glu Met Pro Met Asn Val Ala Asp Leu Ile

385 390 395

<210> 27

<211> 411

<212> PRT

<213> 中国仓鼠

<400> 27

Met Ala Ala Ala Ala Thr Met Ala Thr Ser Gly Ser Ala Arg Lys Arg

1 5 10 15

Leu Leu Lys Glu Glu Asp Met Thr Lys Val Glu Phe Glu Thr Ser Glu

20 25 30

Glu Val Asp Val Thr Pro Thr Phe Asp Thr Met Gly Leu Arg Glu Asp

35 40 45

Leu Leu Arg Gly Ile Tyr Ala Tyr Gly Phe Glu Lys Pro Ser Ala Ile

50 55 60

Gln Gln Arg Ala Ile Lys Gln Ile Ile Lys Gly Arg Asp Val Ile Ala

65 70 75 80

Gln Ser Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Ala Thr Phe Ser Ile Ser Val

85 90 95

Leu Gln Cys Leu Asp Ile Gln Val Arg Glu Thr Gln Ala Leu Ile Leu

100 105 110

Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Val Gln Ile Gln Lys Gly Leu Leu Ala

115 120 125

Leu Gly Asp Tyr Met Asn Val Gln Cys His Ala Cys Ile Gly Gly Thr

130 135 140

Asn Val Gly Glu Asp Ile Arg Lys Leu Asp Tyr Gly Gln His Val Val

145 150 155 160

Ala Gly Thr Pro Gly Arg Val Phe Asp Met Ile Arg Arg Arg Ser Leu

165 170 175

Arg Thr Arg Ala Ile Lys Met Leu Val Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met

180 185 190

Leu Asn Lys Gly Phe Lys Glu Gln Ile Tyr Asp Val Tyr Arg Tyr Leu

195 200 205

Pro Pro Ala Thr Gln Val Val Leu Ile Ser Ala Thr Leu Pro His Glu

210 215 220

Ile Leu Glu Met Thr Asn Lys Phe Met Thr Asp Pro Ile Arg Ile Leu

225 230 235 240

Val Lys Arg Asp Glu Leu Thr Leu Glu Gly Ile Lys Gln Phe Phe Val

245 250 255

Ala Val Glu Arg Glu Glu Trp Lys Phe Asp Thr Leu Cys Asp Leu Tyr

260 265 270

Asp Thr Leu Thr Ile Thr Gln Ala Val Ile Phe Cys Asn Thr Lys Arg

275 280 285

Lys Val Asp Trp Leu Thr Glu Lys Met Arg Glu Ala Asn Phe Thr Val

290 295 300

Ser Ser Met His Gly Asp Met Pro Gln Lys Glu Arg Glu Ser Ile Met

305 310 315 320

Lys Glu Phe Arg Ser Gly Ala Ser Arg Val Leu Ile Ser Thr Asp Val

325 330 335

Trp Ala Arg Gly Leu Asp Val Pro Gln Val Ser Leu Ile Ile Asn Tyr

340 345 350

Asp Leu Pro Asn Asn Arg Glu Leu Tyr Ile His Arg Ile Gly Arg Ser

355 360 365

Gly Arg Tyr Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile Asn Phe Val Lys Asn Asp

370 375 380

Asp Ile Arg Ile Leu Arg Asp Ile Glu Gln Tyr Tyr Ser Thr Gln Ile

385 390 395 400

Asp Glu Met Pro Met Asn Val Ala Asp Leu Ile

405 410

<210> 28

<211> 396

<212> PRT

<213> 乳酸克鲁维酵母

<400> 28

Met Ser Asp Gly Ile Thr Asp Ile Asp Glu Asn Gln Ile Gln Ser Thr

1 5 10 15

Tyr Asp Lys Val Val Tyr Ser Phe Asp Asp Leu Lys Leu Lys Glu Glu

20 25 30

Leu Leu Arg Gly Ile Phe Gly Tyr Gly Phe Val Glu Pro Ser Ala Ile

35 40 45

Gln Gln Arg Ala Ile Leu Pro Ile Ile Glu Gly Lys Asp Val Leu Ala

50 55 60

Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Gly Thr Phe Ser Ile Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gln Asn Ile Asp Glu Lys Ile Lys Ala Pro Gln Gly Leu Ile Leu

85 90 95

Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Ile Gln Lys Val Val Met Ala

100 105 110

Leu Ala Ile His Met Asp Val Lys Val His Ala Cys Ile Gly Gly Thr

115 120 125

Ser Leu Gln Glu Asp Ser Glu Ala Leu Arg Gly Gly Ala Gln Ile Ile

130 135 140

Val Gly Thr Pro Gly Arg Val Phe Asp Met Ile Asp Arg Arg Ile Phe

145 150 155 160

Lys Thr Asp Asn Ile Lys Met Phe Ile Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met

165 170 175

Leu Ser Thr Gly Phe Lys Glu Gln Ile Tyr Asn Ile Phe Thr Met Leu

180 185 190

Pro Pro Thr Ser Gln Val Val Leu Leu Ser Ala Thr Met Pro Gly Asp

195 200 205

Val Leu Glu Val Thr Ser Lys Phe Met Lys Asp Pro Val Arg Ile Leu

210 215 220

Val Lys Lys Asp Glu Leu Thr Leu Glu Gly Ile Gly Gln Tyr Tyr Val

225 230 235 240

Asn Val Glu Glu Glu Gln Tyr Lys Tyr Asp Cys Leu Thr Asp Leu Tyr

245 250 255

Asp Ser Ile Ser Val Thr Gln Ala Val Ile Phe Cys Asn Thr Arg Arg

260 265 270

Lys Val Glu Glu Leu Thr Glu Arg Leu Arg Glu Asn Asn Phe Thr Val

275 280 285

Ser Ala Ile Tyr Ser Asp Leu Gln Gln Gln Glu Arg Asp Thr Ile Met

290 295 300

Lys Glu Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Ile Leu Ile Ser Thr Asp Leu

305 310 315 320

Leu Ala Arg Gly Ile Asp Val Gln Gln Val Ser Leu Val Ile Asn Tyr

325 330 335

Asp Leu Pro Ser Asn Lys Glu Asn Tyr Ile His Arg Ile Gly Arg Gly

340 345 350

Gly Arg Phe Gly Arg Lys Gly Ile Ala Ile Asn Phe Val Thr Asn Lys

355 360 365

Asp Ile Gly Ala Met Arg Glu Leu Glu Arg Phe Tyr Ser Thr Gln Ile

370 375 380

Glu Glu Leu Pro Ser Ser Ile Ser Glu Leu Phe Asp

385 390 395

<210> 29

<211> 397

<212> PRT

<213> 多形绪方酵母

<400> 29

Met Ala Ser Glu Asn Ile Gln Glu Val Asp Ser Asn Leu Ile Glu Ser

1 5 10 15

Asn Tyr Asp Asn Val Val Tyr Thr Phe Asp Glu Leu Asn Leu Lys Pro

20 25 30

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Lys Ala Val Gln Glu Asp Met Glu Ala Leu Arg Asn Gly Ala Gln Ile

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Met Leu Ser Ser Gly Phe Lys Glu Gln Ile Tyr Asn Val Phe Arg Phe

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<211> 395

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<400> 30

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Tyr Asp Lys Val Val Tyr Lys Phe Asp Asp Met Glu Leu Asp Glu Asn

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Leu Leu Arg Gly Val Phe Gly Tyr Gly Phe Glu Glu Pro Ser Ala Ile

35 40 45

Gln Gln Arg Ala Ile Met Pro Ile Ile Glu Gly His Asp Val Leu Ala

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65 70 75 80

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Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Ile Gln Lys Val Val Met Ala

100 105 110

Leu Ala Phe His Met Asp Ile Lys Val His Ala Cys Ile Gly Gly Thr

115 120 125

Ser Phe Val Glu Asp Ala Glu Gly Leu Arg Asp Ala Gln Ile Val Val

130 135 140

Gly Thr Pro Gly Arg Val Phe Asp Asn Ile Gln Arg Arg Arg Phe Arg

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Thr Asp Lys Ile Lys Met Phe Ile Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu

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Ser Ser Gly Phe Lys Glu Gln Ile Tyr Gln Ile Phe Thr Leu Leu Pro

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Ser Ile Ser Val Thr Gln Ala Val Ile Phe Cys Asn Thr Arg Arg Lys

260 265 270

Val Glu Glu Leu Thr Thr Lys Leu Arg Asn Asp Lys Phe Thr Val Ser

275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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385 390 395

<210> 31

<211> 392

<212> PRT

<213> 粟酒裂殖酵母

<400> 31

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100 105 110

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115 120 125

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195 200 205

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<210> 32

<211> 396

<212> PRT

<213> 里氏木霉

<400> 32

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65 70 75 80

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85 90 95

Leu Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Gln Gln Ile Gln Lys Val Val Val

100 105 110

Ala Ile Gly Asp Phe Met Asn Val Glu Cys His Ala Cys Ile Gly Gly

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Leu Lys Thr Asp Ala Met Lys Met Phe Val Leu Asp Glu Ala Asp Glu

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Met Leu Ser Arg Gly Phe Thr Asp Gln Ile Tyr Asp Ile Phe Gln Leu

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Arg Lys Val Asp Trp Leu Thr Asp Lys Leu Thr Ala Arg Asp Phe Thr

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Val Ser Ala Met His Gly Asp Met Asp Gln Ala Gln Arg Asp Leu Ile

290 295 300

Met Lys Glu Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Val Leu Ile Ala Thr Asp

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Leu Leu Ala Arg Gly Ile Asp Val Gln Gln Val Ser Leu Val Ile Asn

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Gly Gly Arg Phe Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile Asn Phe Val Thr Ala

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<210> 33

<211> 395

<212> PRT

<213> 解脂耶氏酵母

<400> 33

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100 105 110

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115 120 125

Ser Val Ala Glu Asp Ile Arg Val Ile Gln Glu Gly Val His Val Ile

130 135 140

Val Gly Thr Pro Gly Arg Ile His Asp Met Ile Glu Arg Arg Ile Leu

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Lys Thr Asp Leu Ile Lys Met Phe Ile Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met

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Leu Ser Arg Glu Phe Lys Asp Pro Ile Tyr Asp Ile Phe Thr Thr Leu

180 185 190

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275 280 285

Ser Ser Met His Gly Glu Thr Glu Gln Ser Gln Arg Asp Val Ile Met

290 295 300

Lys Ala Phe Arg Thr Gly Ser Ser Arg Ile Leu Ile Thr Thr Asp Leu

305 310 315 320

Leu Ala Arg Gly Ile Asp Val Gln Gln Val Ser Leu Val Ile Asn Phe

325 330 335

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Gly Arg Phe Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile Asn Phe Val Thr Ser Glu

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<210> 34

<211> 1098

<212> PRT

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 34

Met Ser Asn Lys Asn Val Asp Thr Ala Pro Asp Asn Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Asn Ser Pro Ala Ser Val Pro His Tyr Pro Gln Gln His Arg Ala

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Asn Tyr Asn Pro His Lys Asn His Thr Asn His Gly Gly Asn Asn Gly

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Asn Gln Asn Val Tyr Leu Val Pro Tyr Asn Thr Met Val Pro Gly Thr

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100 105 110

Pro Ser Pro Ala Phe Ala Ser Pro Gln Lys Thr His Val Pro Val Ser

115 120 125

Leu Arg Thr Pro Ser Gly Glu Pro Ile Asn Leu Val Pro Ala Gly Gln

130 135 140

Thr Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ala Ser Pro His Val Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Ile Pro Pro Ser Ala Val Thr Ser Pro Ala Ala Ser Ile Ala Pro Thr

165 170 175

Val Ala Ser Pro Thr Lys Ala Ala Ala Gly Ser Glu Asp Ala Gly Lys

180 185 190

Thr Arg Asp Ala Phe Lys Gln Met Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys Lys

195 200 205

Lys Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Glu Gly Lys Thr Asp Asp Lys Lys

210 215 220

Glu Ser Val Glu Ser Lys Pro Lys Ser Ala Val Gln Pro Glu Thr Lys

225 230 235 240

Pro Lys Val Glu Val Lys Leu Glu Pro Lys Pro Lys Val Glu Val Lys

245 250 255

Leu Glu Pro Lys Pro Lys Val Glu Ile Lys Leu Glu Pro Lys Pro Val

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Ser Thr Val Ala Thr Ile Lys Ser Glu Ser Thr Pro Ile Glu Glu Leu

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Lys Pro Lys Val Glu Val Thr Pro Glu Val Ala Ser Lys Pro Glu Gln

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Gly Pro Val Asn Ser Phe Ser Arg Gly Lys Ser Ser Arg Gln Ala Ser

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980 985 990

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Glu Glu Arg Glu Glu Glu Arg Glu Gln Glu Glu Glu Gln Glu Val

1085 1090 1095

<210> 35

<211> 1101

<212> PRT

<213> 巴斯德孔玛氏酵母

<400> 35

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Val Ala Ser Pro Ala Lys Pro Ala Ala Gly Ser Glu Asp Ala Gly Lys

180 185 190

Thr Arg Asp Ala Phe Lys Gln Met Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys Lys

195 200 205

Lys Ala Ala Ala Ala Lys Ala Glu Gly Lys Thr Asp Asp Lys Lys Glu

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Ser Val Glu Ser Lys Pro Lys Ala Ala Val Gln Pro Glu Ala Lys Pro

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Lys Val Glu Val Lys Leu Glu Pro Lys Pro Lys Val Glu Val Lys Leu

245 250 255

Glu Pro Lys Pro Lys Val Glu Ile Lys Leu Glu Pro Lys Pro Val Ser

260 265 270

Glu Ala Lys Leu Glu Thr Lys Thr Ala Pro Glu Val Glu Glu Pro Ser

275 280 285

Thr Val Ala Thr Ile Lys Ser Glu Thr Lys Pro Ile Glu Glu Leu Lys

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Glu Ser Ala Gln Glu Pro Ala Ala Asp Leu Asn Ser Ser Glu Val Ser

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Gln Glu Val Gln Glu Gln Thr Pro Glu Thr Ser Glu Thr Val Ser Ser

435 440 445

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450 455 460

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<212> PRT

<213> 中国仓鼠

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<213> 乳酸克鲁维酵母

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<213> 多形绪方酵母

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<210> 52

<211> 581

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<400> 52

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<210> 53

<211> 653

<212> PRT

<213> 粟酒裂殖酵母

<400> 53

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<212> PRT

<213> 里氏木霉

<400> 54

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275 280 285

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290 295 300

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Arg Glu Glu Glu Leu Arg Lys Ser Tyr Glu Ala Ala Arg Leu Glu Lys

325 330 335

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Glu Ala Lys Asp Gln Glu Lys Asp Lys Glu Asn Gln Lys Glu Gly Glu

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Lys Glu Gly Glu Ser Ala Glu Gly Ala Glu Lys Lys Thr Glu Lys Lys

405 410 415

Ser Asp Lys Lys Leu Gly Lys Ser Lys Gly Phe Gly Phe Val Cys Phe

420 425 430

Ser Asn Pro Asp Asp Ala Thr Lys Ala Val Ala Glu Met Asn Gln Arg

435 440 445

Met Ile Asn Asn Lys Pro Leu Tyr Val Ala Leu Ala Gln Arg Lys Asp

450 455 460

Val Arg Lys Ser Gln Leu Glu Ala Ser Ile Gln Ala Arg Asn Gln Leu

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Arg Met Gln Gln Ala Ala Ala Ala Ala Gly Met Pro Gln Gln Tyr Met

485 490 495

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Met Ala Ala Met Gln Gln Ala Gln Gln Ala Ala Ala Leu Ala Gly Gly

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Arg Gly Gly Ala Pro Gln Gly Gly Arg Gly Ala Met Ala Gly Met Pro

595 600 605

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Met Gly Arg Asn Asn Asn Gly Gly Asn Gly Asn Asn Ala Gly Arg Asn

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Gly Asn Phe Pro Asn Gln Ala Pro Arg Asp Ser Asn Thr Ala Ser Met

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Leu Gln Asn Gln Leu Ala Ala Ala Gln Pro Ala Gln Gln Lys Gln Ile

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Leu Gly Glu Leu Ile Phe Pro Lys Ile Gln Ala Ile Asn Ser Glu Leu

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Glu Lys Lys Glu Glu Glu Thr Lys Ala

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<210> 55

<211> 645

<212> PRT

<213> 解脂耶氏酵母

<400> 55

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Leu Ser Cys Lys Ile Ala Thr Asp Glu Phe Gly Asn Ser Arg Gly Phe

180 185 190

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<213> 中国仓鼠

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Pro Asn Leu Gly Arg Phe Asp Asp Pro Pro Glu Trp Gln Glu Ile Ile

130 135 140

Lys Tyr Phe Arg Gly Ser Glu Leu Gln Asn Tyr Phe Thr Lys Met Leu

145 150 155 160

Glu Asp Asp Ile Lys Ala Ile Ile Lys Pro Gln Tyr Val Asp Asn Ile

165 170 175

Pro Arg Ala Ile Lys Gly Pro Val Gln Lys Val Gly Glu Leu Leu Lys

180 185 190

Leu Arg Met Glu Lys Ser Pro Glu Asp Val Lys Arg Tyr Ile Lys Ile

195 200 205

Leu Gln Leu Glu Asn Val Leu Lys Arg Asp Ile Glu Lys Leu Ser Gly

210 215 220

Gly Glu Leu Gln Arg Phe Ala Ile Gly Met Ser Cys Val Gln Glu Ala

225 230 235 240

Asp Val Tyr Met Phe Asp Glu Pro Ser Ser Tyr Leu Asp Val Lys Gln

245 250 255

Arg Leu Asn Ala Ala Gln Ile Ile Arg Ser Leu Leu Ala Pro Thr Lys

260 265 270

Tyr Val Ile Cys Val Glu His Asp Leu Ser Val Leu Asp Tyr Leu Ser

275 280 285

Asp Phe Val Cys Ile Ile Tyr Gly Val Pro Ser Val Tyr Gly Val Val

290 295 300

Thr Leu Pro Ala Ser Val Arg Glu Gly Ile Asn Ile Phe Leu Asp Gly

305 310 315 320

His Ile Pro Ala Glu Asn Leu Arg Phe Arg Thr Glu Ala Leu Gln Phe

325 330 335

Arg Ile Ala Asp Ala Thr Glu Asp Leu Gln Asn Asp Ser Ala Ser Arg

340 345 350

Ala Phe Ser Tyr Pro Ser Leu Lys Lys Thr Gln Gly Asp Phe Val Leu

355 360 365

Asn Val Glu Glu Gly Glu Phe Ser Asp Ser Glu Ile Leu Val Met Met

370 375 380

Gly Glu Asn Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ile Lys Leu Leu Ala Gly

385 390 395 400

Ala Leu Lys Pro Asp Glu Gly Gln Asp Ile Pro Lys Leu Asn Val Ser

405 410 415

Met Lys Pro Gln Lys Ile Ala Pro Lys Phe Pro Gly Thr Val Arg Gln

420 425 430

Leu Phe Phe Lys Lys Ile Arg Gly Gln Phe Leu Asn Pro Gln Phe Gln

435 440 445

Thr Asp Val Val Lys Pro Leu Arg Ile Asp Asp Ile Ile Asp Gln Glu

450 455 460

Val Gln His Leu Ser Gly Gly Glu Leu Gln Arg Val Ala Ile Val Leu

465 470 475 480

Ala Leu Gly Ile Pro Ala Asp Ile Tyr Leu Ile Asp Glu Pro Ser Ala

485 490 495

Tyr Leu Asp Ser Glu Gln Arg Ile Ile Cys Ser Lys Val Ile Arg Arg

500 505 510

Phe Ile Leu His Asn Lys Lys Thr Ala Phe Ile Val Glu His Asp Phe

515 520 525

Ile Met Ala Thr Tyr Leu Ala Asp Lys Val Ile Val Phe Glu Gly Ile

530 535 540

Pro Ser Lys Asn Ala His Ala Arg Ala Pro Glu Ser Leu Leu Thr Gly

545 550 555 560

Cys Asn Arg Phe Leu Lys Asn Leu Asn Val Thr Phe Arg Arg Asp Pro

565 570 575

Asn Ser Phe Arg Pro Arg Ile Asn Lys Leu Asp Ser Gln Met Asp Lys

580 585 590

Glu Gln Lys Ser Ser Gly Asn Tyr Phe Phe Leu Asp Asn Thr Gly Ile

595 600 605

<210> 63

<211> 593

<212> PRT

<213> 粟酒裂殖酵母

<400> 63

Met Ser Glu Ser Leu Thr Arg Ile Ala Ile Val Ser Glu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Arg Pro Lys Lys Cys Arg Gln Glu Cys Arg Arg Ser Cys Pro Val Val

20 25 30

Arg Thr Gly Lys Leu Cys Ile Glu Val Asn Pro Thr Asp Arg Ile Ala

35 40 45

Phe Ile Ser Glu Thr Leu Cys Ile Gly Cys Gly Ile Cys Val Lys Lys

50 55 60

Cys Pro Phe Gly Ala Ile Asn Ile Ile Asn Leu Pro Thr Asn Leu Glu

65 70 75 80

Ser Glu Val Thr His Arg Tyr Ser Ala Asn Ser Phe Lys Leu His Arg

85 90 95

Leu Pro Thr Pro Arg Pro Gly Gln Val Leu Gly Leu Val Gly Thr Asn

100 105 110

Gly Ile Gly Lys Ser Thr Ala Leu Lys Ile Leu Ser Gly Lys Met Lys

115 120 125

Pro Asn Leu Gly Arg Tyr Asp Asn Pro Pro Asp Trp Ala Glu Val Val

130 135 140

Lys Tyr Phe Arg Gly Ser Glu Leu Gln Asn Phe Phe Thr Lys Val Val

145 150 155 160

Glu Asp Asn Ile Lys Ala Leu Ile Lys Pro Gln Tyr Val Asp His Ile

165 170 175

Pro Arg Ala Ile Lys Thr Gly Asp Lys Thr Val Ser Gly Leu Ile Lys

180 185 190

Ala Arg Ala Asn Asn Asn Asn Phe Glu Glu Val Met Asp His Thr Asp

195 200 205

Leu Gln Asn Leu Leu Asn Arg Glu Val Gly His Leu Ser Gly Gly Glu

210 215 220

Leu Gln Arg Phe Ala Ile Ala Ala Val Ala Thr Gln Lys Ala Asp Val

225 230 235 240

Tyr Met Phe Asp Glu Pro Ser Ser Tyr Leu Asp Ile Lys Gln Arg Leu

245 250 255

Lys Ala Gly Arg Val Ile Arg Ser Leu Leu Ala Thr Thr Asn Tyr Val

260 265 270

Ile Val Val Glu His Asp Leu Ser Val Leu Asp Tyr Leu Ser Asp Phe

275 280 285

Val Cys Val Leu Tyr Gly Val Pro Ser Met Tyr Gly Val Val Thr Leu

290 295 300

Pro Tyr Ser Val Arg Glu Gly Ile Asn Ile Phe Leu Asp Gly His Ile

305 310 315 320

Pro Thr Glu Asn Leu Arg Phe Arg Ser Glu Ala Leu Thr Phe Arg Leu

325 330 335

Ala Asp Ala Ser Asp Glu Ile Thr Ala Asp Arg Thr Ala Glu Tyr Asn

340 345 350

Tyr Pro Asp His Val Ile Glu Gln Gly Asp Phe Lys Leu Thr Ile Lys

355 360 365

Ser Gly Gly Phe Ser Asp Ala Glu Ile Ile Val Leu Leu Gly Glu Asn

370 375 380

Gly Thr Gly Lys Thr Thr Phe Cys Lys Trp Met Ala Lys Asn Ser Asp

385 390 395 400

Leu Lys Ile Ser Met Lys Pro Gln Thr Ile Ala Pro Lys Phe Gln Gly

405 410 415

Thr Val Arg Met Leu Phe Leu Lys Lys Ile Arg Ala Ala Phe Leu Asn

420 425 430

Gly Lys Phe Gln Ser Glu Val Cys Lys Pro Leu Ser Ile Asp Asn Ile

435 440 445

Ile Asp Gln Glu Val Leu Asn Leu Ser Gly Gly Glu Leu Gln Arg Val

450 455 460

Ala Ile Cys Leu Ala Leu Gly Met Pro Ala Asp Val Tyr Leu Ile Asp

465 470 475 480

Glu Pro Ser Ala Tyr Leu Asp Ser Glu Gln Arg Ile Ile Ala Ser Lys

485 490 495

Val Ile Arg Arg Phe Ile Val Asn Ser Arg Lys Thr Ala Phe Ile Val

500 505 510

Glu His Asp Phe Ile Met Ala Thr Tyr Leu Ala Asp Arg Val Ile Leu

515 520 525

Phe Glu Gly Gln Pro Ser Arg Asp Ala Arg Cys Asn Pro Pro Gln Ser

530 535 540

Leu Leu Thr Gly Met Asn Thr Phe Leu Lys Asn Leu Asp Val Thr Phe

545 550 555 560

Arg Arg Asp Pro Asn Thr Leu Arg Pro Arg Ile Asn Lys Phe Asp Ser

565 570 575

Gln Met Asp Gln Glu Gln Lys Asn Ala Gly Asn Tyr Phe Phe Leu Glu

580 585 590

Asn

<210> 64

<211> 253

<212> PRT

<213> 里氏木霉

<400> 64

Met Glu Lys Thr Leu Gly Asn Phe Arg Leu Arg Ile Asp Ala Gly Glu

1 5 10 15

Phe Thr Asp Ser Glu Ile Ile Val Met Met Gly Glu Asn Gly Thr Gly

20 25 30

Lys Thr Thr Phe Cys Arg Leu Leu Ala Gly Ala Leu Lys Pro Asp Ser

35 40 45

Lys Arg Ser Val Pro Asp Met Lys Ile Ser Met Lys Pro Gln Thr Ile

50 55 60

Thr Pro Lys Phe Glu Gly Thr Val Arg Gln Leu Phe Phe Lys Lys Ile

65 70 75 80

Lys Ala Ala Phe Leu Ser Pro Gln Phe Gln Thr Asp Val Val Lys Pro

85 90 95

Leu Lys Leu Asp Asp Phe Ile Asp Gln Glu Val Lys Asn Leu Ser Gly

100 105 110

Gly Glu Leu Gln Arg Val Ala Ile Val Leu Ala Leu Gly Met Pro Ala

115 120 125

Asp Ile Tyr Leu Ile Asp Glu Pro Ser Ala Tyr Leu Asp Ser Glu Gln

130 135 140

Arg Ile Ile Ala Ser Arg Val Ile Lys Arg Phe Ile Met His Ser Lys

145 150 155 160

Lys Thr Ala Phe Val Val Glu His Asp Phe Ile Met Ala Thr Tyr Leu

165 170 175

Ala Asp Arg Val Ile Val Phe Asp Gly Lys Pro Gly Ile Asp Ala His

180 185 190

Ala Asn Arg Pro Glu Ser Leu Leu Thr Gly Cys Asn Thr Phe Leu Lys

195 200 205

Asn Leu Asp Val Thr Phe Arg Arg Asp Pro Thr Asn Tyr Arg Pro Arg

210 215 220

Ile Asn Lys Leu Gly Ser Gln Leu Asp Gln Glu Gln Lys Leu Ser Gly

225 230 235 240

Asn Phe Phe Phe Leu Glu Glu Lys Pro Glu Glu Thr Ala

245 250

<210> 65

<211> 616

<212> PRT

<213> 解脂耶氏酵母

<400> 65

Met Pro Pro Lys Asn Lys Asn Glu Val Lys Asp Gly Asp Lys Asn Thr

1 5 10 15

Arg Ile Ala Ile Val Asn Val Asp Lys Cys Lys Pro Lys Lys Cys Arg

20 25 30

Gln Glu Cys Lys Lys Ser Cys Pro Val Val Arg Thr Gly Lys Leu Cys

35 40 45

Ile Glu Val Thr Pro Asp Ser Lys Ile Ala Phe Ile Ser Glu Thr Leu

50 55 60

Cys Ile Gly Cys Gly Ile Cys Pro Lys Lys Cys Pro Phe Gly Ala Leu

65 70 75 80

Gln Ile Ile Asn Leu Pro Thr Asn Leu Asp Ser Glu Val Thr His Arg

85 90 95

Tyr Ser Ala Asn Ser Phe Lys Leu His Arg Leu Pro Thr Pro Arg Pro

100 105 110

Gly Gln Val Leu Gly Leu Val Gly Thr Asn Gly Ile Gly Lys Ser Thr

115 120 125

Ala Leu Lys Ile Leu Ala Gly Lys Gln Lys Pro Asn Leu Gly Arg Tyr

130 135 140

Glu Asp Pro Pro Thr Trp Gln Glu Ile Leu Thr His Phe Arg Gly Ser

145 150 155 160

Glu Leu Gln Asn Tyr Phe Thr Arg Val Leu Glu Asp Asn Leu Lys Ala

165 170 175

Ile Ile Lys Pro Gln Tyr Val Asp Asn Leu Pro Arg Ala Ile Lys Gly

180 185 190

Pro Leu Gln Lys Val Gly Glu Leu Leu Lys Ala Lys Leu Glu Arg Lys

195 200 205

Asp Asp Phe Glu Asn Ile Val Asn Thr Leu Glu Leu Lys Gly Val Trp

210 215 220

Lys Arg Glu Val Ser Leu Leu Ser Gly Gly Glu Leu Gln Arg Phe Ala

225 230 235 240

Ile Gly Met Ser Cys Val Gln Leu Ala Gln Val Tyr Met Phe Asp Glu

245 250 255

Pro Ser Ser Tyr Leu Asp Val Lys Gln Arg Leu His Ala Ala Ala Met

260 265 270

Ile Arg Ser Leu Ile Asp Ser Thr Gly Tyr Ile Ile Val Val Glu His

275 280 285

Asp Leu Ser Val Leu Asp Tyr Leu Ser Asp Phe Val Cys Ile Leu Tyr

290 295 300

Gly Val Pro Ser Val Tyr Gly Val Val Thr Leu Pro Ser Ser Val Arg

305 310 315 320

Glu Gly Ile Asn Ile Phe Leu Asp Gly His Ile Pro Thr Glu Asn Leu

325 330 335

Arg Phe Arg Thr Glu Ser Leu Gln Phe Arg Leu Ala Asp Ala Thr Glu

340 345 350

Ile Ile Pro Leu Asp Gln Ser Arg Ser Phe Lys Tyr Pro Thr Met Ser

355 360 365

Arg Thr Gln Gly Asp Phe Lys Leu Asn Val Glu Ser Gly Glu Phe Thr

370 375 380

Asp Ser Glu Ile Ile Val Met Met Gly Glu Asn Gly Thr Gly Lys Thr

385 390 395 400

Thr Leu Cys Arg Leu Leu Ala Gly Ala Val Ala Pro Asp Glu Gly Gln

405 410 415

Lys Ala Pro Lys Leu Asn Val Ser Met Lys Pro Gln Lys Ile Ala Pro

420 425 430

Lys Phe Thr Gly Thr Val Arg Gln Leu Phe Leu Lys Lys Ile Arg Ser

435 440 445

Ser Met His His Pro Gln Phe Gln Thr Asp Val Tyr Lys Pro Leu Arg

450 455 460

Ile Asp Asp Ile Ile Asp Gln Glu Val Gln Asn Leu Ser Gly Gly Glu

465 470 475 480

Leu Gln Arg Val Ala Ile Val Leu Ala Leu Gly Gln Pro Ala Asp Ile

485 490 495

Tyr Leu Ile Asp Glu Pro Ser Ala Tyr Leu Asp Ser Glu Gln Arg Ile

500 505 510

Ile Cys Ala Lys Val Ile Arg Arg Phe Ile Leu His Ser Lys Lys Thr

515 520 525

Ala Phe Ile Val Glu His Asp Phe Ile Met Ala Thr Tyr Leu Ala Asp

530 535 540

Arg Val Ile Val Phe Asp Gly Gln Pro Ser Val Glu Ala Phe Ala Arg

545 550 555 560

Arg Pro Glu Ser Leu Leu Thr Gly Cys Asn Arg Phe Leu Lys Ser Leu

565 570 575

Asn Val Thr Phe Arg Arg Asp Pro Thr Ser Phe Arg Pro Arg Ile Asn

580 585 590

Lys Lys Asp Ser Gln Met Asp Lys Glu Gln Lys Ala His Gly Asn Tyr

595 600 605

Phe Phe Leu Asp Thr Ala Glu Ala

610 615

<210> 66

<211> 609

<212> DNA

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 66

atgtcagaga ctgaaaacgc tcctcacgaa aagtcactgc ttgacgacca agttgatttc 60

actgttaagc atccgctcaa ctctgagtgg acactatggt atacgaagcc agccgttcat 120

gaacaagaaa gttggtcaga tttgctacgt cctatcattt cattcaactc ggtagaggag 180

ttctggggaa tcttcaactc cattccaaag gcctccgatt tgccagtcaa gtcggactat 240

catcttttta gagatggaat caaacctgaa tgggaagacg agcgcaatgc taacggagga 300

aaactgacat accagtttgc ctacagaaag gttgatatca atgaattgtg gtctcgcggt 360

ctgttgagtg tgattggtga aacgattcag gatgatgacg gagaaactga ggtgaacggt 420

attgttctga gcattcgtcg tgccgctttg aagattgccc tctggaccaa gtccaaggat 480

gaggcagttt tgagaccaat tggcgagaga ttcaagaaag ttttgaagtt gacagcccgt 540

gatcatattg actttcaacc tcataagagt ggtgctggta gcaagaacgt accttctttc 600

agcatttag 609

<210> 67

<211> 609

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> eIF4E基因突变体

<400> 67

atgtcagaga ctgaaaacgc tcctcacgaa aagtcactgc ttgacgacca agttgatttc 60

actgttaagc atccgctcaa ctctgagtgg acactatggt atacgaagcc agccgttcat 120

gaacaagaaa gttggtcaga tttgctacgt cctatcattt cattcaactc ggtagaggag 180

ttctggggaa tcttcaactc cattccaaag gcctccgatt tgccagtcaa gtcggactat 240

catcttttta gagatggaat caaacctgaa tgggaggacg agcgcaatgc taacggagga 300

aaactgacat accagtttgc ctacagaaag gttgatatca atgaattgtg gtcccgcggt 360

ctgttgagtg tgattggtga aacgattcag gatgatgacg gagaaactga ggtgaacggt 420

attgttctga gcattcgtcg tgccgctttg aagattgccc tctggaccaa gtccaaggat 480

gaggcagttt taagaccaat tggcgagaga ttcaagaaag ttttgaagtt gacagcccgt 540

gatcatattg actttcaacc tcataagagt ggtgctggta gcaagaacgt accttctttc 600

agcatttag 609

<210> 68

<211> 1212

<212> DNA

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 68

atgtctgaag gtattattga aatcgacact aacttaatcg agaccaacta cgaccaggtt 60

gtcagcacct tcgatgagct gaacctgaag gagcaaatcc tgagagccgt ttttgcttac 120

ggttacgagt tcccatctgc cattcaatct cgtgccattt tgccaattgt tgctggtcgt 180

gatgtcttgg cccaagccca gtccggtacc ggtaagactg ctacctttgc catctccgct 240

ttgcagagat tggatgagaa gctgaaggct gcccaagttt tgatcttggc cccaaccaga 300

gagttggccc tgcagatcaa gaaggttgtt ttggccctcg gtatgcactt gaacatctct 360

gtccatgcct gtatcggtgg tgttgaccca gctttggatg tcaaggcctt caactccggt 420

gttcaaatcg tcgttggtac cccaggtaga gtccaagaca tgatcgaacg tggagctttc 480

agaactgaga acgtcaagat ggtcattttg gatgaggccg atgagatgtt gtccactgga 540

ttcaaggagc aaatctacac cttgttcaca ttgttaccat ccactacaca ggttgttctt 600

ctatccgcca ccatgcctca agaggtgttg gaggttacca ccaagttcat gaacaaccct 660

attcgtatct tggtcaagaa ggaccaattg accttggaag gtattaagca attctacgtc 720

gacgtcggtg aagaacaata caagttcgac tgtctgtgtg atctgtacga ctccatctcc 780

gtcacccagg ccgttatctt ctgtaacacc agacgaaagg tcgaggagtt gactgagcgt 840

ttgaccgccc agaagttcac cgtctctgct atccactctg agctgtcaca aaccgagaga 900

gacaccatca tgcaagagtt cagaaccggt tcttccagaa tcttaatctc caccgacttg 960

ctggccagag gtatcgatgt ccaacaagtc tcattggtta tcaactacga cttaccatct 1020

aacaaggaaa actacatcca cagaatcggt agaggtggtc gtttcggtag aaagggtgtt 1080

gctatcaact tcgtcaccag caaggacgtt gagatgatga aggagatcga gaagttctac 1140

tctacccaaa tcgacgagtt gccatcttcc atcactgact tgtttgagac tgaggaagtt 1200

aatgagtctt ag 1212

<210> 69

<211> 1212

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> eIF4A基因突变体

<400> 69

atgtctgaag gtattattga aatcgacact aacttaatcg agacaaacta cgaccaggtt 60

gtcagcacct tcgatgagct gaacctgaag gagcaaatcc tgagagccgt ttttgcttac 120

ggttacgagt tcccatctgc cattcaatct cgtgccattt tgccaattgt tgctggtcgt 180

gatgtcttgg cccaagccca gtccggtacc ggtaagactg ctacctttgc catctccgct 240

ttgcagagat tggatgagaa gctgaaggct gcccaagttt tgatcttggc cccaaccaga 300

gagttggccc tgcagatcaa gaaggttgtt ttggccctcg gtatgcactt gaacatctct 360

gtccatgcct gtatcggtgg tgttgaccca gctttggatg tcaaggcctt caactccggt 420

gttcaaatcg tcgttggtac cccaggtaga gtccaagaca tgatcgaacg tggagctttc 480

agaactgaga acgtcaagat ggtcattttg gatgaggccg atgagatgtt gtccactgga 540

ttcaaggagc aaatctacac cttgttcaca ttgttaccat ccactacaca ggttgttctt 600

ctatccgcca ccatgcctca agaggtgttg gaggttacca ccaagttcat gaacaaccct 660

attcgtatct tggtcaagaa ggaccaattg accttggaag gtattaagca attctacgtc 720

gacgtcggtg aagaacaata caagttcgac tgtctgtgtg atctgtacga ctccatctcc 780

gtcacccagg ccgttatctt ctgtaacacc agacgaaagg tcgaggagtt gactgagcgt 840

ttgaccgccc agaagttcac cgtctctgct atccactctg agctgtcaca aaccgagaga 900

gacaccatca tgcaagagtt cagaaccggt tcttccagaa tcttaatctc caccgacttg 960

ctggccagag gtatcgatgt ccaacaagtc tcattggtta tcaactacga cttaccatct 1020

aacaaggaaa actacatcca cagaatcggt agaggtggtc gtttcggtag aaagggtgtt 1080

gctatcaact tcgtcaccag caaggacgtt gagatgatga aggagatcga gaagttctac 1140

tctacccaaa tcgacgagtt gccatcttcc atcactgact tgtttgagac tgaggaagtt 1200

aatgagtctt ag 1212

<210> 70

<211> 1461

<212> DNA

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 70

atgcatccat acaccgtagt atttgcgcgc ctcctcctgg gtgttttctc aactgccgcc 60

cccaactcgc cccccccctt ttgcacttct tgccaccttg gagatcagag attgtggaac 120

cttgctcaaa atctggcatg cacactacct cctcaaaaaa attttccttg ccttgttgca 180

aggcgctcaa aaatcaaaag tttttctaca acttttgttc ccaacaaatc acctttttac 240

ttacccatta tgtctgaagg tattattgaa atcgacacta acttaatcga gaccaactac 300

gaccaggttg tcagcacctt cgatgagctg aacctgaagg agcaaatcct gagagccgtt 360

tttgcttacg gttacgagtt cccatctgcc attcaatctc gtgccatttt gccaattgtt 420

gctggtcgtg atgtcttggc ccaagcccag tccggtaccg gtaagactgc tacctttgcc 480

atctccgctt tgcagagatt ggatgagaag ctgaaggctg cccaagtttt gatcttggcc 540

ccaaccagag agttggccct gcagatcaag aaggttgttt tggccctcgg tatgcacttg 600

aacatctctg tccatgcctg tatcggtggt gttgacccag ctttggatgt caaggccttc 660

aactccggtg ttcaaatcgt cgttggtacc ccaggtagag tccaagacat gatcgaacgt 720

ggagctttca gaactgagaa cgtcaagatg gtcattttgg atgaggccga tgagatgttg 780

tccactggat tcaaggagca aatctacacc ttgttcacat tgttaccatc cactacacag 840

gttgttcttc tatccgccac catgcctcaa gaggtgttgg aggttaccac caagttcatg 900

aacaacccta ttcgtatctt ggtcaagaag gaccaattga ccttggaagg tattaagcaa 960

ttctacgtcg acgtcggtga agaacaatac aagttcgact gtctgtgtga tctgtacgac 1020

tccatctccg tcacccaggc cgttatcttc tgtaacacca gacgaaaggt cgaggagttg 1080

actgagcgtt tgaccgccca gaagttcacc gtctctgcta tccactctga gctgtcacaa 1140

accgagagag acaccatcat gcaagagttc agaaccggtt cttccagaat cttaatctcc 1200

accgacttgc tggccagagg tatcgatgtc caacaagtct cattggttat caactacgac 1260

ttaccatcta acaaggaaaa ctacatccac agaatcggta gaggtggtcg tttcggtaga 1320

aagggtgttg ctatcaactt cgtcaccagc aaggacgttg agatgatgaa ggagatcgag 1380

aagttctact ctacccaaat cgacgagttg ccatcttcca tcactgactt gtttgagact 1440

gaggaagtta atgagtctta g 1461

<210> 71

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> eIF4A基因突变体

<400> 71

atgcatccat acaccgtagt atttgcgcgc ctcctcctgg gtgttttctc aactgccgcc 60

cccaactcgc cccccccctt ttgcacttct tgccaccttg gagatcagag attgtggaac 120

cttgctcaaa atctggcatg cacactacct cctcaaaaaa attttccttg ccttgttgca 180

aggcgctcaa aaatcaaaag tttttctaca acttttgttc ccaacaaatc acctttttac 240

ttacccatta tgtctgaagg tattattgaa atcgacacta acttaatcga gacaaactac 300

gaccaggttg tcagcacctt cgatgagctg aacctgaagg agcaaatcct gagagccgtt 360

tttgcttacg gttacgagtt cccatctgcc attcaatctc gtgccatttt gccaattgtt 420

gctggtcgtg atgtcttggc ccaagcccag tccggtaccg gtaagactgc tacctttgcc 480

atctccgctt tgcagagatt ggatgagaag ctgaaggctg cccaagtttt gatcttggcc 540

ccaaccagag agttggccct gcagatcaag aaggttgttt tggccctcgg tatgcacttg 600

aacatctctg tccatgcctg tatcggtggt gttgacccag ctttggatgt caaggccttc 660

aactccggtg ttcaaatcgt cgttggtacc ccaggtagag tccaagacat gatcgaacgt 720

ggagctttca gaactgagaa cgtcaagatg gtcattttgg atgaggccga tgagatgttg 780

tccactggat tcaaggagca aatctacacc ttgttcacat tgttaccatc cactacacag 840

gttgttcttc tatccgccac catgcctcaa gaggtgttgg aggttaccac caagttcatg 900

aacaacccta ttcgtatctt ggtcaagaag gaccaattga ccttggaagg tattaagcaa 960

ttctacgtcg acgtcggtga agaacaatac aagttcgact gtctgtgtga tctgtacgac 1020

tccatctccg tcacccaggc cgttatcttc tgtaacacca gacgaaaggt cgaggagttg 1080

actgagcgtt tgaccgccca gaagttcacc gtctctgcta tccactctga gctgtcacaa 1140

accgagagag acaccatcat gcaagagttc agaaccggtt cttccagaat cttaatctcc 1200

accgacttgc tggccagagg tatcgatgtc caacaagtct cattggttat caactacgac 1260

ttaccatcta acaaggaaaa ctacatccac agaatcggta gaggtggtcg tttcggtaga 1320

aagggtgttg ctatcaactt cgtcaccagc aaggacgttg agatgatgaa ggagatcgag 1380

aagttctact ctacccaaat cgacgagttg ccatcttcca tcactgactt gtttgagact 1440

gaggaagtta atgagtctta g 1461

<210> 72

<211> 3297

<212> DNA

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 72

atgtccaata agaacgtgga tacagctcca gataatggtt ctggtggctc caattcccca 60

gcttctgtgc cgcattatcc acagcaacac cgtgctaatt ataatcctca taagaatcat 120

actaatcatg ggggcaataa tggaggcgcc cagggttaca tgcagcatca gcaacagcaa 180

caaatgtatt acaatcagat gggctaccct atgccgtatc cgaatgctgg tggcaatttc 240

aaccagaatg tatacttggt tccttataat actatggttc caggtactcc atatggtgca 300

ggtgccccgg gcgtgcctcc aagctaccca gtgtctcctt ctccagcatt cgcctctcca 360

caaaagactc atgtgccagt aagtctgcgt accccttctg gagaacctat aaatttggtt 420

cctgctgggc aaacgagttc cagttcatcc aatgcctctc ctcatgttaa gtctacctct 480

attcctcctt ctgctgtcac tagtcctgct gcttccattg ctccaactgt tgcatcaccg 540

actaaggccg cggctggatc tgaagacgct ggcaagacta gagatgcatt caagcagatg 600

gttcaggctt tagctgctaa aaagaaggct gcagctgctg ccaaggctga aggtaaaaca 660

gatgataaaa aggagtctgt ggagtctaag cctaagtctg ctgtacagcc cgagacaaag 720

ccaaaagttg aggttaagtt agagccaaaa ccaaaagttg aggtcaaatt agagccaaag 780

ccaaaggttg agattaaact agagcccaaa ccagtatcgg aggctaaacc agagacaaaa 840

acagtacctg aggttgaaga accttcaaca gttgcaacga tcaaatcaga atccacacca 900

attgaggagc tcaaacccaa agttgaggta accccagaag ttgcatccaa gcctgaacag 960

gttgagtctg cacaggagcc ggctaacgat gtaaaaccat ctgaagtctc agctaaagag 1020

gttcaagaat ccaaggagga gtctttgaaa caacctaagg aagctttgaa tgacattaaa 1080

tccaccgagg agtcaaataa aaagttttct cttccagaag aggagtctaa cgatcaccag 1140

acactttccc aaattcaagg agttaaagat acagaacaat cgcaagaatt tgaagaacct 1200

caaggaaccc aggaaactca ggaaactcag gaaacgcagg aaaccgcaaa gcctttggaa 1260

gctcaagcac ctcaagaaat tcaagaaacc caagaacctg aggaagttca ggaacaaact 1320

cctgaaacat ctgagactgt ttcttctgtc acagaagaag tgtctccagc tccagcacct 1380

ggattgcccc tttcaaagtt cttggacaga atcagaaagg ctcccgccat ttcaaaccca 1440

ttcaagcatg agtactcagg tgatttccat ggtccagacg aaagtttaag tggtctgaaa 1500

accatcaaat atgatccggg tttcttgatc caattcgcca ccttcaactt ccatattgat 1560

gaagatttca tcaacgatgt cggttctaag gttgtgatcc ctgtcaacac cagaagagac 1620

aatttttcca agagcatgtc taccagcaat ttcaaaggtt ctggtagaaa tatgggttct 1680

aatttcagaa atgattttgg atctagaaac aactccaagc aaggttccaa gaaaaagaat 1740

aaatctcaaa agagccaatc taggaggggt ccaaagtact ccaatgaaga agaacctgct 1800

gaaccagccg tgcctgctga attgcctaat agagctgcaa gcaagtgggt acctcgttcg 1860

ttaagaaata aggaggctga agtcaagact gctccagacg gatctataat agtatcagaa 1920

gaagacatca aaaggaaaac taaatccctt ttgaataagt tgacgttgga attctttgat 1980

gatatctcaa acgatataat tgctttgacc aagcaagctc aatgggaaga tgacgtgaag 2040

actttgaaac aagttattga gtctatattt gcaaaggctt gtgacgaacc ctactggtct 2100

tctatgtacg ctaaattatg cgccaaaatg tgcaaggaca ccccacctga gatcaaggaa 2160

actaatgaga agggaaatac tttcaccggt ggtgatttgg tgagaagagt gttgattaat 2220

agatgtcaaa ccgaatatca gaaaggatgg attgaccagc taccaaccaa cgaggatggt 2280

tcacctctag agccagaact gatgtctgac gaatattaca aacaagctgc tgctaaacgt 2340

agaggtcttg gtctggttaa gttcattggt caattgtacc agttgaactt attatcagac 2400

aatgtcattt tccactgtgt ccttggtcag tccaaagaaa cagacaatcc atcagaagat 2460

actatggaga acctggttca attattggaa gctgtaggtt atagaatgga gatgtccagt 2520

gaacctaaga ttagaagggt tcttgatctc gcctttgcca acatcaaggc cattgttgac 2580

gctaacaaga ttccttcaag aataagattt atgctcatgg atttgatgga tctaagaaga 2640

aatggctggg ctacaacaga agagaacgct ggtccaaaga ccattcaaga gattcactta 2700

gaggctgaga tcaagagatc agaggaggag agagaaaaag aaagagacag gcattctcgt 2760

agaggacgtt acaacgactc caaacctaac tctcgtcaaa agtcatcttg gggaagttca 2820

gtggtttcac ctaatgatat tagaaatgca ggctatgtta gaaactctga caaatctctg 2880

gggcctgtca acagtttttc caggggcaag tcatcccgtc aagcttcaaa gcaatcaaac 2940

agtgatttta ccagtgttcc tatcacttcc agtggtagta gaactgctct aaaccactct 3000

ggcgacagct caacgtctct gaacgaacct caatcaagag aatattcaaa aaaatctgaa 3060

tctaggcccg ctccttccaa catttttgct gcattagagg atcacgatca tgatcatgaa 3120

catggccacg aacaagaaga aaacaagcat tccaaggatc tccaaaacgg agaggccgaa 3180

gcacctgagg acgacaatgt gggagaaata gcccaagctg acgaaaatgt gcaagggcaa 3240

gagcaagagg aagaacgaga ggaagagcga gagcaagaag aggaacagga agtttaa 3297

<210> 73

<211> 3297

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> eIF4G基因突变体

<400> 73

atgtccaata agaacgtgga tacagctcca gataatggtt ctggtggctc caattcccca 60

gcttctgtgc cgcattatcc acagcaacac cgtgctaatt ataatcctca taagaatcat 120

actaatcatg ggggcaataa tggaggcgcc cagggttaca tgcagcatca gcaacagcaa 180

caaatgtatt acaatcagat gggctaccct atgccgtatc cgaatgctgg tggcaatttc 240

aaccagaatg tatacttggt tccttataat actatggttc caggtactcc atatggtgca 300

ggtgccccgg gcgtgcctcc aagctaccca gtgtctcctt ctccagcatt cgcctctcca 360

caaaagactc atgtgccagt aagtctgcgt accccttctg gagaacctat aaatttggtt 420

cctgctgggc aaacgagttc cagttcatcc aatgcctctc ctcatgttaa gtctacctct 480

attcctcctt ctgctgtcac tagtcctgct gcttccattg ctccaactgt tgcatcaccg 540

actaaggccg cggctggatc tgaggacgct ggcaagacta gagatgcatt caagcagatg 600

gttcaggctt tagctgctaa aaagaaggct gcagctgctg ccaaggctga aggtaaaaca 660

gatgataaaa aggagtctgt ggagtctaag cctaagtctg ctgtacagcc cgagacaaag 720

ccaaaagttg aggttaagtt agagccaaaa ccaaaagttg aggtcaaatt agagccaaag 780

ccaaaggttg agattaaact agagcccaaa ccagtatcgg aggctaaacc agagacaaaa 840

acagtacctg aggttgaaga accttcaaca gttgcaacga tcaaatcaga atccacacca 900

attgaggagc tcaaacccaa agttgaggta accccagaag ttgcatccaa gcctgaacag 960

gttgagtctg cacaggagcc ggctaacgat gtaaaaccat ctgaagtctc agctaaagag 1020

gttcaagaat ccaaggagga gtctttgaaa caacctaagg aagctttgaa tgacattaaa 1080

tccaccgagg agtcaaataa aaagttttct cttccagaag aggagtctaa cgatcaccag 1140

acactttccc aaattcaagg agttaaagat acagaacaat cgcaagaatt tgaagaacct 1200

caaggaaccc aggaaactca ggaaactcag gaaacgcagg aaaccgcaaa gcctttggaa 1260

gctcaagcac ctcaagaaat tcaagaaacc caagaacctg aggaagttca ggaacaaact 1320

cctgaaacat ctgagactgt ttcttctgtc acagaagaag tgtctccagc tccagcacct 1380

ggattgcccc tttcaaagtt cttggacaga atcagaaagg ctcccgccat ttcaaaccca 1440

ttcaagcatg agtactcagg tgatttccat ggtccagacg aaagtttaag tggtctgaaa 1500

accatcaaat atgatccggg tttcttgatc caattcgcca ccttcaactt ccatattgat 1560

gaagatttca tcaacgatgt cggttctaag gttgtgatcc ctgtcaacac cagaagagac 1620

aatttttcca agagcatgtc taccagcaat ttcaaaggtt ctggtagaaa tatgggttct 1680

aatttcagaa atgattttgg atctagaaac aactccaagc aaggttccaa gaaaaagaat 1740

aaatctcaaa agagccaatc taggaggggt ccaaagtact ccaatgaaga agaacctgct 1800

gaaccagccg tgcctgctga attgcctaat agagctgcaa gcaagtgggt acctcgttcg 1860

ttaagaaata aggaggctga agtcaagact gctccagacg gatctataat agtatcagaa 1920

gaggacatca aaaggaaaac taaatccctt ttgaataagt tgacgttgga attctttgat 1980

gatatctcaa acgatataat tgctttgacc aagcaagctc aatgggaaga tgacgtcaag 2040

actttgaaac aagttattga gtctatattt gcaaaggctt gtgacgaacc ctactggtcc 2100

tctatgtacg ctaaattatg cgccaaaatg tgcaaggaca ccccacctga gatcaaggaa 2160

actaatgaga agggaaatac tttcaccggt ggtgatttgg tgagaagagt gttgattaat 2220

agatgtcaaa ccgaatatca gaaaggatgg attgaccagc taccaaccaa cgaggatggt 2280

tcacctctag agccagaact gatgtctgac gaatattaca aacaagctgc tgctaaacgt 2340

agaggtcttg gtctggttaa gttcattggt caattgtacc agttgaactt attatcagac 2400

aatgtcattt tccactgtgt ccttggtcag tccaaagaaa cagacaatcc atcagaagat 2460

actatggaga acctggttca attattggaa gctgtaggtt atagaatgga gatgtccagt 2520

gaacctaaga ttagaagggt tcttgatctc gcctttgcca acatcaaggc cattgttgac 2580

gctaacaaga ttccttcaag aataagattt atgctcatgg atttgatgga tctaagaaga 2640

aatggctggg ctacaacaga agagaacgct ggtccaaaga ccattcaaga gattcactta 2700

gaggctgaga tcaagagatc agaggaggag agagaaaaag aaagagacag gcattctcgt 2760

agaggacgtt acaacgactc caaacctaac tctcgtcaaa agtcatcttg gggaagttca 2820

gtggtttcac ctaatgatat tagaaatgca ggctatgtta gaaactctga caaatctctg 2880

gggcctgtca acagtttttc caggggcaag tcatcccgtc aagcttcaaa gcaatcaaac 2940

agtgatttta ccagtgttcc tatcacttcc agtggtagta gaactgctct aaaccactct 3000

ggcgacagct caacgtctct gaacgaacct caatcaagag aatattcaaa aaaatctgaa 3060

tctaggcccg ctccttccaa catttttgct gcattagagg atcacgatca tgatcatgaa 3120

catggccacg aacaagaaga aaacaagcat tccaaggatc tccaaaacgg agaggccgaa 3180

gcacctgagg acgacaatgt gggagaaata gcccaagctg acgaaaatgt gcaagggcaa 3240

gagcaagagg aagaacgaga ggaagagcga gagcaagaag aggaacagga agtttaa 3297

<210> 74

<211> 1881

<212> DNA

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 74

atgtctgtcg ataccaagga agttcaagaa tcccttgatc aacttaacat ttcagaatca 60

ccagctactg ctgtgactga agagactcca gctacctcta ccgaggccgc tgaagagtcc 120

aacgagtcat cgactcaagc ttccgagacc ttggcttcat tgtatgttgg tgagctggac 180

cctaccgtta ctgagagtga cttgtatgag ttcttctctc caatcggtag tgttaattcc 240

atccgtgtgt gtcgtgatgc agtcaccaag cgttcgttgg gttatggata cgttaacttt 300

cacagccaag ctgccggcga gcgtgccttg gaggagctga actacgctga gatcaaaggt 360

gtccgttgta gattgatgtg gtctcaacgt gacccttcct tgcgtcgtag tggttccggt 420

aacatcttca tcaagaactt agaccctgct attgagaaca agactttgca cgatactttc 480

tcctcttttg gaaaagtttt gtcctgtaag gttgccactg atgagaatgg aaactcaaag 540

ggattcggat tcgttcatta cgaaagcgat gaagcagctc aagctgccat tgagaacatc 600

aacggtatgc tgttgaatgg tcgtgaaatc tacgttggac ctcacttggc caagaaggac 660

cgtgaatcta gattccagga gatgatcaag aactacacca atgtcttcgt caagaacttt 720

gacactgagt ccactgagga tgaactgaga gagctgtttg agtcatacgg tccaatcact 780

tcgatccact tgcaagttga ttctgagggt cacaacaagg gttttggttt cgtcaacttt 840

gctgaacacg acgatgctgt taaggccgtt gaagccttga acgacaagga gtacaagggc 900

aagccattgt acgttggacg tgctcagaag aaaaacgaga gagtccacga acttaccaag 960

aagtacgagg ctgatcgtct tgaaaaattg caaaagtatc aatcagttaa cttgttcatc 1020

aagaacttgg atgagtccat tgatgatgcc cgtcttgagg aagagttcaa accatttgga 1080

accatcacct ctgccaaggt catgttggac gaaaatggaa aatctagagg tttcggtttc 1140

gtttgtctct ctactccaga ggaagccact aaggctatca gtgagatgaa ccaacgtatg 1200

gttgccaaca agccattata cgttgctttg gctcaaccaa aagccatcag acgctctcaa 1260

ttggctcagc agatccaagc tagaaaccaa atgagaatgc aacaacaagc tggtccaggt 1320

ataccaaacc agttcgttca acctatcttt tacgggcaac agccaggtat gttgccacca 1380

ggtgctagag tcccaccaat gggtaaccag attcctcaat ttgctggtat gccaagacca 1440

ggcccatttc cccaaggcca attccctaga atggctccta acggtcagcc aatgcctgtg 1500

tatggccaac ctgtattcaa cggtaacggt cctcagcagc gtggctacta cccaaacaac 1560

agacagaaca agaacaggaa tcaaaaggag gaaggaaact ctttggctgc aatcttgcct 1620

cagttgccat tagagcaaca aaagagagta ctgggtgagg agctttatcc aaaggttgtt 1680

gctactaaca agacccaaga tccagaagct gcaggtaaaa tcactggtat gatcttggat 1740

ttggacaacc aagaaatttt gcaactgttg gaagatgaag aacttttcaa cactcatttc 1800

aacgaagctc tccaagctta cgaggagtac aagagtaaga ctgttgaaca gcaacagcaa 1860

gcggatgcac aagcaaacta g 1881

<210> 75

<211> 1881

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PAB1基因突变体

<400> 75

atgtctgtcg ataccaagga agttcaagaa tcccttgatc aacttaacat ttcagaatca 60

ccagctactg ctgtgactga agagactcca gctacctcta ccgaggccgc tgaagagtcc 120

aacgagtcat cgactcaagc ttccgagaca ttggcttcat tgtatgttgg tgagctggac 180

cctaccgtta ctgagagtga cttgtatgag ttcttctctc caatcggtag tgttaattcc 240

atccgtgtgt gtcgtgatgc agtcaccaag cgttcgttgg gttatggata cgttaacttt 300

cacagccaag ctgccggcga gcgtgccttg gaggagctga actacgctga gatcaaaggt 360

gtccgttgta gattgatgtg gtcccaacgt gacccttcct tgcgtcgtag tggttccggt 420

aacatcttca tcaagaactt agaccctgct attgagaaca agactttgca cgatactttc 480

tcctcttttg gaaaagtttt gtcctgtaag gttgccactg atgagaatgg aaactcaaag 540

ggattcggat tcgttcatta cgaaagcgat gaagcagctc aagctgccat tgagaacatc 600

aacggtatgc tgttgaatgg tcgtgaaatc tacgttggac ctcacttggc caagaaggac 660

cgtgaatcta gattccagga gatgatcaag aactacacca atgtctttgt caagaacttt 720

gacactgagt ccactgagga tgaactgaga gagctgtttg agtcatacgg tccaatcact 780

tcgatccact tgcaagttga ttctgagggt cacaacaagg gttttggttt cgtcaacttt 840

gctgaacacg acgatgctgt taaggccgtt gaagccttga acgacaagga gtacaagggc 900

aagccattgt acgttggacg tgctcagaag aaaaacgaga gagtccacga acttaccaag 960

aagtacgagg ctgatcgtct tgaaaaattg caaaagtatc aatcagttaa cttgttcatc 1020

aagaacttgg atgagtccat tgatgatgcc cgtcttgagg aagagttcaa accatttgga 1080

accatcacct ctgccaaggt catgttggac gaaaatggaa aatctagagg tttcggtttc 1140

gtttgtctct ctactccaga ggaagccact aaggctatca gtgagatgaa ccaacgtatg 1200

gttgccaaca agccattata cgttgctttg gctcaaccaa aagccatcag acgctctcaa 1260

ttggctcagc agatccaagc tagaaaccaa atgagaatgc aacaacaagc tggtccaggt 1320

ataccaaacc agttcgttca acctatcttt tacgggcaac agccaggtat gttgccacca 1380

ggtgctagag tcccaccaat gggtaaccag attcctcaat ttgctggtat gccaagacca 1440

ggcccatttc cccaaggcca attccctaga atggctccta acggtcagcc aatgcctgtg 1500

tatggccaac ctgtattcaa cggtaacggt cctcagcagc gtggctacta cccaaacaac 1560

agacagaaca agaacaggaa tcaaaaggag gaaggaaact ctttggctgc aatcttgcct 1620

cagttgccat tagagcaaca aaagagagta ctgggtgagg agctttatcc aaaggttgtt 1680

gctactaaca agacccaaga tccagaagct gcaggtaaaa tcactggtat gatcttggat 1740

ttggacaacc aagaaatttt gcaactgttg gaagatgaag aacttttcaa cactcatttc 1800

aacgaagctc tccaagctta cgaggagtac aagagtaaga ctgttgaaca gcaacagcaa 1860

gcggatgcac aagcaaacta g 1881

<210> 76

<211> 1821

<212> DNA

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 76

atgagtgaga aaaacacacg tattgccatt gtttcagacg atagatgcaa acctaagaaa 60

tgtcgtcagg aatgcagaaa atcctgtcct gttgttaaga caggaaagct ttgtattgaa 120

gttgaagcat actccaaaat tgccttcatc agtgagactc tgtgtatagg ttgtggtatt 180

tgtgtgaaaa agtgtccatt tggagcaatt aacattatca atctgcccac taacttggag 240

aaggaggtca cccacagata cagtgccaac tcattcaaat tgcacagatt gccaacacct 300

aggccaggtc aagtcctagg tcttgttgga accaatggta ttgggaaatc caccgcattg 360

aaaattcttg caggtaagca gaaaccaaat ttaggtagat acgacgcgcc acctgactgg 420

gaagaaattt tgaaatactt cagaggaagt gaattgcaaa attattttac caaagttttg 480

gaggacaata ttaaagcaat tattaagcct caatatgttg acaaccttcc aagggcaatc 540

aaaggtcctg ttaataaggt tggtgagctt ttgaaagcca aactggaaag aaaggaagag 600

ggaaagcata tcatccaagt tttggaattg aaacacgtat tgaacagaga agtcgctaag 660

ctttctggtg gtgagcttca aagatttgca attggtatga cttgtgtcca agatgctaat 720

gtgtacatgt ttgatgaacc ttcatcctat ttggatgtta agcaacgttt gaatgctgct 780

cagattatta gatctttgtt gcatgccacc tgttatgtta ttgttgttga gcacgatctg 840

tctgttttgg attatctttc tgattttgtt tgtattttgt atggtgtacc atcggtttac 900

ggtgttgtca ctttgccagc ctctgtcaga gaaggtatca atattttcct tgatggtcat 960

atccctaccg agaatttgag gttcagaact gagtctttaa aattcaaact tacagatgct 1020

tcggactctg tattaattga acaaagtaga gcttttgaat accccaaaat ggttaagact 1080

caaggtgatt tcaagttaac cgtcaacgct ggtgacttct cagactcgga aattattgtg 1140

atgatgggtg aaaatggtac cggtaagacc actttatgta agctgttagc tggtgccatt 1200

gaaggtgatg aaggcaccaa ggtacccaaa ttgaatgttt ctatgaagcc ccaaaagatt 1260

gctccaaaat tcacaggaac agttagacaa ctgttcttga aaaagattag atcatctttc 1320

ttacatccac aattcaacac cgatgtgatg aaacctttaa aagttgacga tgtcattgat 1380

caagaagtcc agcatttgtc tggtggtgaa ttgcaaagag ttgccatcgt cttagcttta 1440

ggaaaagagg cagacatcta cttgattgac gagccatctg cttacttgga ctctgaacag 1500

cgtattatct gttcgaaggt tattagaaga ttcatcctgc attccaagaa aactgctttc 1560

attgtggaac acgatttcat catggccaca tacttagccg ataaagtgat ggtatttgaa 1620

ggtcagcctt ccaagaatgc tgttgctaac cgcccagaaa cccttttgac tggttgtaac 1680

aggttcttga aaaacctgaa cgtcactttc agaagagatc caaactcttt tagacccaga 1740

atcaacaaac tggactccca gatggataga gagcaaaaac tgagtggtaa ttacttcttc 1800

cttgagaaca ctgagttata a 1821

<210> 77

<211> 362

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> vHH表达构建体

<400> 77

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu

85 90 95

Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg

100 105 110

Thr Phe Thr Ser Phe Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys

115 120 125

Glu Arg Glu Phe Val Ala Ser Ile Ser Arg Ser Gly Thr Leu Thr Arg

130 135 140

Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ala

145 150 155 160

Lys Asn Thr Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Asn Pro Asp Asp Thr

165 170 175

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Leu His Arg Pro Tyr Gly Pro Gly

180 185 190

Thr Gln Arg Ser Asp Glu Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

195 200 205

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Glu

225 230 235 240

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

245 250 255

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Asn Arg Tyr Ser

260 265 270

Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ala

275 280 285

Gly Met Ser Ser Ala Gly Asp Arg Ser Ser Tyr Glu Asp Ser Val Lys

290 295 300

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Thr Val Tyr Leu

305 310 315 320

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

325 330 335

Val Asn Val Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

340 345 350

Ser Ser Gly Gly His His His His His His

355 360

<210> 78

<211> 1092

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> vHH核苷酸序列

<400> 78

atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60

cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120

tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctaa ctccactaac 180

aacggtttgt tgttcattaa caccactatc gcttccattg ctgctaagga agagggtgtc 240

tctctcgaga agagacaggt tcagctgcag gagtccggtg gtggtctggt tcaagccggt 300

ggttcattaa gattgtcctg tgctgcctct ggtagaactt tcacttcttt cgcaatgggt 360

tggtttagac aagcacctgg aaaagagaga gagtttgttg cttctatctc cagatccggt 420

actttaacta gatacgctga ctctgccaag ggtagattca ctatttctgt tgacaacgcc 480

aagaacactg tttctttgca aatggacaac cttaacccag atgacaccgc agtctattac 540

tgtgccgctg acttgcacag accatacggt ccaggaaccc aaagatccga tgagtacgat 600

tcttggggtc agggaactca agtcactgtc tcttcaggtg gtggatctgg tggtggaggt 660

tcaggtggtg gaggatccgg tggtggtggt tctggtggtg gtggatctgg tggaggtgaa 720

gttcaacttg tcgaatccgg tggtgcactt gtccaacctg gtggatctct tagactttct 780

tgtgccgcct ccggttttcc tgttaaccgt tactctatgc gttggtacag acaagcccct 840

ggaaaagaac gtgaatgggt tgccggaatg tcctcagctg gtgacagatc ctcctacgaa 900

gattctgtga agggacgttt caccatctcc agagatgacg cccgtaacac cgtttacctt 960

caaatgaact cccttaagcc tgaggatact gccgtctact attgtaacgt gaatgtcgga 1020

tttgaatact ggggacaggg aacccaagtt actgtctctt ccggtggaca tcaccaccac 1080

catcactaat ag 1092

<210> 79

<211> 609

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人血清白蛋白表达构建体

<400> 79

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

35 40 45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

115 120 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

130 135 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145 150 155 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

180 185 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

210 215 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

245 250 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

275 280 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

290 295 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305 310 315 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

325 330 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385 390 395 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

405 410 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

450 455 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465 470 475 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

530 535 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

565 570 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

580 585 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

595 600 605

Leu

<210> 80

<211> 1830

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人血清白蛋白表达构建体

<400> 80

atgaagtggg ttactttcat ctccttgttg ttcttgttct cctcagctta ctccagaggt 60

gttttcagaa gagatgctca caagtccgag gttgctcaca gattcaagga cttgggtgaa 120

gagaacttca aggctttggt tttgatcgct ttcgctcagt acttgcagca gtgtccattc 180

gaggaccacg ttaagttggt taacgaggtt actgagttcg ctaagacttg tgttgctgac 240

gaatccgctg agaactgtga taagtccttg cacactttgt tcggtgacaa gttgtgtact 300

gttgctactt tgagagaaac ttacggtgag atggctgact gttgtgctaa gcaagagcct 360

gagagaaacg agtgtttctt gcaacacaag gacgacaacc caaacttgcc aagattggtt 420

agaccagagg ttgacgttat gtgtactgct ttccacgaca acgaagagac tttcttgaag 480

aagtacttgt acgagatcgc tagaagacac ccatacttct acgctccaga gttgttgttc 540

ttcgctaaga gatacaaggc tgctttcact gagtgttgtc aggctgctga taaggctgct 600

tgtttgttgc caaagttgga cgagttgaga gatgagggta aggcttcttc cgctaagcag 660

agattgaagt gtgcttcctt gcagaagttc ggagagagag cttttaaggc ttgggctgtt 720

gctagattgt cccagagatt cccaaaggct gagttcgctg aggtttccaa gttggttact 780

gacttgacta aggttcacac agagtgttgt cacggtgact tgttggaatg tgctgatgac 840

agagctgact tggctaagta catctgtgag aaccaggatt ccatctcctc caagttgaaa 900

gaatgttgtg agaagccttt gttggagaag tcccactgta tcgctgaggt tgaaaacgac 960

gaaatgccag ctgacttgcc atctttggct gctgacttcg ttgaatccaa ggacgtctgc 1020

aagaactacg ctgaggctaa ggacgttttc ttgggtatgt tcttgtatga gtacgctaga 1080

agacatccag actactccgt tgttttgttg ttgagattgg ctaagactta cgagactact 1140

ttggagaagt gttgtgctgc tgctgaccca catgagtgtt acgctaaggt tttcgacgag 1200

ttcaagccat tggttgagga accacagaac ttgatcaagc agaactgtga gttgttcgag 1260

cagttgggtg agtacaagtt ccagaacgct ttgttggtta gatacactaa gaaggttcca 1320

caggtttcca ctccaacttt ggttgaggtt tccagaaact tgggtaaggt tggttccaag 1380

tgttgtaagc acccagaggc taagagaatg ccatgtgctg aggactactt gtctgttgtt 1440

ttgaaccagt tgtgtgtctt gcacgaaaag acaccagttt ccgacagagt tactaagtgt 1500

tgtactgaat ccttggttaa cagaagacct tgtttctccg ctttggaggt tgacgagact 1560

tacgttccaa aagagttcaa cgctgagact ttcactttcc acgctgacat ctgtactttg 1620

tccgagaaag agagacagat caagaagcag actgctttgg ttgagttggt taagcacaag 1680

ccaaaggcta caaaagagca gttgaaggct gttatggacg acttcgctgc tttcgttgag 1740

aaatgttgta aggctgacga caaagagact tgtttcgctg aagagggtaa gaagttggtt 1800

gctgcttccc aagctgcttt gggtctgtaa 1830

<210> 81

<211> 1001

<212> DNA

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 81

catgttggta ttgtgaaata gacgcagatc gggaacactg aaaaataaca gttattattc 60

gagatctaac atccaaagac gaaaggttga atgaaacctt tttgccatcc gacatccaca 120

ggtccattct cacacataag tgccaaacgc aacaggaggg gatacactag cagcagaccg 180

ttgcaaacgc aggacctcca ctcctcttct cctcaacacc cacttttgcc atcgaaaaac 240

cagcccagtt attgggcttg attggagctc gctcattcca attccttcta ttaggctact 300

aacaccatga ctttattagc ctgtctatcc tggcccccct ggcgaggttc atgtttgttt 360

atttccgaat gcaacaagct ccgcattaca cccgaacatc actccagatg agggctttct 420

gagtgtgggg tcaaatagtt tcatgttccc caaatggccc aaaactgaca gtttaaacgc 480

tgtcttggaa cctaatatga caaaagcgtg atctcatcca agatgaacta agtttggttc 540

gttgaaatgc taacggccag ttggtcaaaa agaaacttcc aaaagtcggc ataccgtttg 600

tcttgtttgg tattgattga cgaatgctca aaaataatct cattaatgct tagcgcagtc 660

tctctatcgc ttctgaaccc cggtgcacct gtgccgaaac gcaaatgggg aaacacccgc 720

tttttggatg attatgcatt gtctccacat tgtatgcttc caagattctg gtgggaatac 780

tgctgatagc ctaacgttca tgatcaaaat ttaactgttc taacccctac ttgacagcaa 840

tatataaaca gaaggaagct gccctgtctt aaaccttttt ttttatcatc attattagct 900

tactttcata attgcgactg gttccaattg acaagctttt gattttaacg acttttaacg 960

acaacttgag aagatcaaaa aacaactaat tattcgaaac g 1001

<210> 82

<211> 1000

<212> DNA

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 82

gcttaaagga ctccatttcc taaaatttca agcagtcctc tcaactaaat ttttttccat 60

tcctctgcac ccagccctct tcatcaaccg tccagccttc tcaaaagtcc aatgtaagta 120

gcctgcaaat tcaggttaca acccctcaat tttccatcca agggcgatcc ttacaaagtt 180

aatatcgaac agcagagact aagcgagtca tcatcaccac ccaacgatgg tgaaaaactt 240

taagcataga ttgatggagg gtgtatggca cttggcggct gcattagagt ttgaaactat 300

ggggtaatac atcacatccg gaactgatcc gactccgaga tcatatgcaa agcacgtgat 360

gtaccccgta aactgctcgg attatcgttg caattcatcg tcttaaacag tacaagaaac 420

tttattcatg ggtcattgga ctctgatgag gggcacattt ccccaatgat tttttgggaa 480

agaaagccgt aagaggacag ttaagcgaaa gagacaagac aacgaacagc aaaagtgaca 540

gctgtcagct acctagtgga cagttgggag tttccaattg gttggttttg aatttttacc 600

catgttgagt tgtccttgct tctccttgca aacaatgcaa gttgataaga catcaccttc 660

caagataggc tatttttgtc gcataaattt ttgtctcgga gtgaaaaccc cttttatgtg 720

aacagattac agaagcgtcc tacccttcac cggttgagat ggggagaaaa ttaagcgatg 780

aggagacgat tattggtata aaagaagcaa ccaaaatccc ttattgtcct tttctgatca 840

gcatcaaaga atattgtctt aaaacgggct tttaactaca ttgttcttac acattgcaaa 900

cctcttcctt ctatttcgga tcaactgtat tgactacatt gatctttttt aacgaagttt 960

acgacttact aaatccccac aaacaaatca actgagaaaa 1000

<210> 83

<211> 991

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 83

gcaaggcaac tgagaaattg aatagtggtt tcaagcccgc tgactttttg tattatctca 60

atgtcggtgt ttcacagtcc ccagaagggg gctttgcctt caagggagac ggaagagaca 120

tcgtcaaccc tggggagaag tatttcaaat ggcgcaagtt cgctaatttt tacgattaag 180

cagtgctgta tggggtagtt aataaatcgg gaatatcctt ctgacgtgac tgtaacaaat 240

ctctttttac gtggtgcgca tactggacag aggcagagtc tcaatttctt cttttgagac 300

aggctactac agcctgtgat tcctcttggt acttggattt gcttttatct ggctccgttg 360

ggaactgtgc ctgggttttg aagtatcttg tggatgtgtt tctaacactt tttcaatctt 420

cttggagtga gaatgcagga ctttgaacat cgtctagctc gttggtaggt gaaccgtttt 480

accttgcatg tggttaggag ttttctggag taaccaagac cgtcttatca tcgccgtaaa 540

atcgctctta ctgtcgctaa taatcccgct ggaagagaag ttcgaacaga agtagcacgc 600

aaagctcttg tcaaatgaga attgttaatc gtttgacagg tcacactcgt gggctatgta 660

cgatcaactt gccggctgtt gctggagaga tgacaccagt tgtggcatgg ccaattggta 720

ttcagccgta ccactgtatg gaaaatgaga ttatcttgtt cttgatctag tttcttgcca 780

ttttagagtt gccacattcg taggtttcag taccaataat ggtaacttcc aaacttccaa 840

cgcagatacc agagatctgc cgatccttcc ccaacaatag gagcttacta cgccatacat 900

atagcctatc tattttcact ttcgcgtggg tgcttctata taaacggttc cccatcttcc 960

gtttcatact acttgaattt taagcactaa a 991

<210> 84

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 84

cttttctttg ggcaaggaaa aatcaagaaa aagcagaggt taaagttttc aggggaatgg 60

caattgcttt atatatggga gaaagttaac tacgtcggtg ctgtaggcgt agagagcgac 120

tggagaatgc gtgatgaggt cgtctctttt cgccccccct tggcggggta aaaattgcac 180

tactgcagaa ttactacacc cctattccga ggagacggag tgcgacaaaa atggtaaagt 240

tcaccctagt ctgcgacttt taattgacgg acaccggcgt ttacatgcga aaaaaactaa 300

agtgcgcgca tttcacggcc gaggggggtc ccacttggga ctgagagggg gtgggatctg 360

aaatcgagga ggtatcaaga ccccccgttt ctcaactccc taatcaaaaa ttacgaagtc 420

ctcgttggaa aggagttaaa ataattaagc ggggtcggac gccataccga ggttatcttg 480

caggcatttt actaatattg gaattcggag ctcaacttgc aaccaggcag ggtttagcta 540

tgtaatcaat gtaatcaata taataaagca ctaccacatc gaaggtttgg gagggaggcc 600

aatagtgtcc cccacagggt gctgatatcg cgattcttgg gtgaggagac acatatttca 660

ctcctctcac caaccaacca agcggctcct cgcaagatga tttatccgat tatccggaca 720

ctatactccc atccagtttg atgccgattt catcgattgt cctaaataat ccttaaatat 780

gtatagaacg gtaccctggg gttacataat ccttatttaa taatccctcc cccaccgctt 840

ttcttttttt ttcttcttat tgtc 864

<210> 85

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 85

aaatggcaga aggatcagcc tggacgaagc aaccagttcc aactgctaag taaagaagat 60

gctagacgaa ggagacttca gaggtgaaaa gtttgcaaga agagagctgc gggaaataaa 120

ttttcaattt aaggacttga gtgcgtccat attcgtgtac gtgtccaact gttttccatt 180

acctaagaaa aacataaaga ttaaaaagat aaacccaatc gggaaacttt agcgtgccgt 240

ttcggattcc gaaaaacttt tggagcgcca gatgactatg gaaagaggag tgtaccaaaa 300

tggcaagtcg ggggctactc accggatagc caatacattc tctaggaacc agggatgaat 360

ccaggttttt gttgtcacgg taggtcaagc attcacttct taggaatatc tcgttgaaag 420

ctacttgaaa tcccattggg tgcggaacca gcttctaatt aaatagttcg atgatgttct 480

ctaagtggga ctctacggct caaacttcta cacagcatca tcttagtagt cccttcccaa 540

aacaccattc taggtttcgg aacgtaacga aacaatgttc ctctcttcac attgggccgt 600

tactctagcc ttccgaagaa ccaataaaag ggaccggctg aaacgggtgt ggaaactcct 660

gtccagttta tggcaaaggc tacagaaatc ccaatcttgt cgggatgttg ctcctcccaa 720

acgccatatt gtactgcagt tggtgcgcat tttagggaaa atttacccca gatgtcctga 780

ttttcgaggg ctacccccaa ctccctgtgc ttatacttag tctaattcta ttcagtgtgc 840

tgacctacac gtaatgatgt cgtaacccag ttaaatggcc gaaaaactat ttaagtaagt 900

ttatttctcc tccagatgag actctccttc ttttctccgc tagttatcaa actataaacc 960

tattttacct caaatacctc caacatcacc cacttaaaca 1000

<210> 86

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 86

aatgatataa acaacaattg agtgacaggt ctactttgtt ctcaaaaggc cataaccatc 60

tgtttgcatc tcttatcacc acaccatcct cctcatctgg ccttcaattg tggggaacaa 120

ctagcatccc aacaccagac taactccacc cagatgaaac cagttgtcgc ttaccagtca 180

atgaatgttg agctaacgtt ccttgaaact cgaatgatcc cagccttgct gcgtatcatc 240

cctccgctat tccgccgctt gctccaacca tgtttccgcc tttttcgaac aagttcaaat 300

acctatcttt ggcaggactt ttcctcctgc cttttttagc ctcaggtctc ggttagcctc 360

taggcaaatt ctggtcttca tacctatatc aacttttcat cagatagcct ttgggttcaa 420

aaaagaacta aagcaggatg cctgatatat aaatcccaga tgatctgctt ttgaaactat 480

tttcagtatc ttgattcgtt tacttacaaa caactattgt tgattttatc tggagaataa 540

tcgaacaaa 549

<210> 87

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 87

attactgttt tgggcaatcc tgttgataag acgcattcta gagttgtttc atgaaagggt 60

tacgggtgtt gattggtttg agatatgcca gaggacagat caatctgtgg tttgctaaac 120

tggaagtctg gtaaggactc tagcaagtcc gttactcaaa aagtcatacc aagtaagatt 180

acgtaacacc tgggcatgac tttctaagtt agcaagtcac caagagggtc ctatttaacg 240

tttggcggta tctgaaacac aagacttgcc tatcccatag tacatcatat tacctgtcaa 300

gctatgctac cccacagaaa taccccaaaa gttgaagtga aaaaatgaaa attactggta 360

acttcacccc ataacaaact taataatttc tgtagccaat gaaagtaaac cccattcaat 420

gttccgagat ttagtatact tgcccctata agaaacgaag gatttcagct tccttacccc 480

atgaacagaa atcttccatt taccccccac tggagagatc cgcccaaacg aacagataat 540

agaaaaaaga aattcggaca aatagaacac tttctcagcc aattaaagtc attccatgca 600

ctccctttag ctgccgttcc atccctttgt tgagcaacac catcgttagc cagtacgaaa 660

gaggaaactt aaccgatacc ttggagaaat ctaaggcgcg aatgagttta gcctagatat 720

ccttagtgaa gggttgttcc gatacttctc cacattcagt catagatggg cagctttgtt 780

atcatgaaga gacggaaacg ggcattaagg gttaaccgcc aaattatata aagacaacat 840

gtccccagtt taaagttttt ctttcctatt cttgtatcct gagtgaccgt tgtgtttaat 900

ataacaagtt cgttttaact taagaccaaa accagttaca acaaattata acccctctaa 960

acactaaagt tcactcttat caaactatca aacatcaaaa 1000

<210> 88

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 88

gtcaactgcg tactcttttg tcgaatggac tactgaatct gcctcgatag ccactatagg 60

aaggtccata gaggccagtt tttcaactag tcttggtgga aagaaaccga caaagccttt 120

catggagtca ccgatactga aaggttcaaa caaagaatgc ttgggtagtc tcttaatacc 180

catggcaacg aaaaaggggt cttcattgtt caacatgaat tcgtatccac ctttaatgta 240

gtcataaagc tgctgaagtt ccgaatcagt gatggaactg tctacagtga caatatagga 300

gttctcaatc accttatatc cagtcgaata tatctggata gggtcgggtc tcactgtgga 360

agattcaaat gggttagatc cctgtaattt cagcgatgga gactcagtat gatggggcaa 420

ggaaaacggc aattggatat tcaattggtc aagagatggt atcaaaagcg agtgtgccag 480

ggtagccacg gtagccactg atgctaatct gataattttc atttctggag tgtcaaaaca 540

gtagtgataa aaggctatga aggaggttgt ctaggggctc gcggaggaaa gtgattcaaa 600

cagacctgcc aaaaagagaa aaaagaggga atccctgttc tttccaatgg aaatgacgta 660

actttaactt gaaaaatacc ccaaccagaa gggttcaaac tcaacaagga ttgcgtaatt 720

cctacaagta gcttagagct gggggagaga caactgaagg cagcttaacg ataacgcggg 780

gggattggtg cacgactcga aaggaggtat cttagtcttg taacctcttt tttccagagg 840

ctattcaaga ttcataggcg atatcgatgt ggagaagggt gaacaatata aaaggctgga 900

gagatgtcaa tgaagcagct ggatagattt caaattttct agatttcaga gtaatcgcac 960

aaaacgaagg aatcccacca agcaaaaaaa aaaatctaag 1000

<210> 89

<211> 704

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 89

aaattaatcc ataagataag gcaaatgtgc ttaagtaatt gaaaacagtg ttgtgattat 60

ataagcatgg tatttgaata gaactactgg ggttaactta tctagtagga tggaagttga 120

gggagatcaa gatgcttaaa gaaaaggatt ggccaatatg aaagccataa ttagcaatac 180

ttatttaatc agataattgt ggggcattgt gacttgactt ttaccaggac ttcaaacctc 240

aaccatttaa acagttatag aagacgtacc gtcacttttg cttttaatgt gatctaaatg 300

tgatcacatg aactcaaact aaaatgatat cttttactgg acaaaaatgt tatcctgcaa 360

acagaaagct ttcttctatt ctaagaagaa catttacatt ggtgggaaac ctgaaaacag 420

aaaataaata ctccccagtg accctatgag caggattttt gcatccctat tgtaggcctt 480

tcaaactcac acctaatatt tcccgccact cacactatca atgatcactt cccagttctc 540

ttcttcccct attcgtacca tgcaaccctt acacgccttt tccatttcgg ttcggatgcg 600

acttccagtc tgtggggtac gtagcctatt ctcttagccg gtatttaaac atacaaattc 660

acccaaattc taccttgata aggtaattga ttaatttcat aaat 704

<210> 90

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 90

agctcagatt ggaaatgatt tttgatccta ccaagaagcc tttgatttcc agaatctccg 60

ctaagtaagt aacccccgca aacgcatgca tccatgcaaa caaaatacta acaattttag 120

ccccgttgtt gagaaaccca gaaaattgaa tgttcaacca atccagacga tcaataagaa 180

aaaaggccca aaggctactt ccaaacctgc tgccgccaaa cctgctcctt caaaagccgg 240

tcccaaggga ggtaagaagg tgagaaagcc aaagaagaca gttgaagaat tggatcagga 300

aatggctgac tactttgaaa ataagaatta gcccaacaaa atatgtacaa gtattatata 360

aatgaatcta catggtgtgt tttatttaga tcctccaaac caaggaaaga aactaaactt 420

atctccggac ttacgagtca aataactatc cgcagttcct tggaactcag actttcttcc 480

ataagcggtc atatcatctt tggactgtgg gaatcctgga cgaatctttg aaatgtcata 540

atcttgctct ctatctccaa gcacagcgtc cggtaaatgc tggttcttct ttctcagatg 600

aatcttggat ttaacaaata aagccgtgcc tatggctaat gtactcaaaa acaaagtctg 660

cttccagaat ttcgcaaacg atggaatgcc atttcctgta aatgtactca ttgaacctat 720

gtttgattaa agttggtgtg aagtcatcaa acgagagtaa aatcagatac tcgtgcaccg 780

gccaaaattg actgagctaa tctctgcagg cttgacatcc gaacacaaca aataggcgac 840

aaatcttaac tatctaatcg taggctatgg tagaactttg tgggggtaga ggaagactac 900

aacagcaaga caaaacaaaa gagtcatagt ttgactctct gcttttttct tctttctctt 960

ctttttcttc ctccatattc gttatttatt tcgaactgga 1000

<210> 91

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 91

cagccattaa tctcacctca gtttttgaat cagtagaatt tttaatgaaa caaacggttg 60

gtatattatt tgatagagtt gccaaatttc caaagataaa tttttcatca ggtaatatcc 120

tgaataccgt aacatagtga ctattggaag acactgctat catattatat ttcggataaa 180

aatccaaacc ccagaccgac ctcttgagtc tcaactccaa gtcagccgca actttaatta 240

tccgtggatt gggagctagt ttggacaacg catcagtata atataacttt acggttccat 300

tatcagacgc tattgcaaga acttcctttc cattgatctc gccaatgcgg cagtaattga 360

tatcgtaggg taggtctgga aagacgctgg cgcttgtgtc ccattctgca ggaatctctg 420

gcacggtgct aatggtagtt atccaacgga gctgaggtag tcgatatatc tggatatgcc 480

gcctatagga taaaaacagg agagggtgaa ccttgcttat ggctactaga ttgttcttgt 540

actctgaatt ctcattatgg gaaactaaac taatctcatc tgtgtgttgc agtactattg 600

aatcgttgta gtatctacct ggagggcatt ccatgaatta gtgagataac agagttgggt 660

aactagagag aataatagac gtatgcatga ttactacaca acggatgtcg cactctttcc 720

ttagttaaaa ctatcatcca atcacaagat gcgggctgga aagacttgct cccgaaggat 780

aatcttctgc ttctatctcc cttcctcata tggtttcgca gggctcatgc cccttcttcc 840

ttcgaactgc ccgatgagga agtccttagc ctatcaaaga attcgggacc atcatcgatt 900

tttagagcct tacctgatcg caatcaggat ttcactactc atataaatac atcgctcaaa 960

gctccaactt tgcttgttca tacaattctt gatattcaca 1000

<210> 92

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 92

tggttccctc tcggtccaat accaaaaata ttatcaccat acaggtctcc cttcgatacc 60

agtgcaaagt tgaaccgtgg gattaccttg gaatctacaa aaatagtgtc actcacaagt 120

ttgtcatcaa ccacgctgcc gcttgcaaag gagaactgaa catgaaggtt gttagggttt 180

gttatattgg aataagtggt ggatttgttg aaggcgaacg caccaaagct acatccgtcc 240

tgagcacact gtgaatttgt cacggaattg accaagaggt cagacgatcc tgtatcccat 300

tgagccgtta tgctttgtgg gggaaaccct atttctatcg tactaagaaa accaatggtg 360

aactcatatt cggtatcaat ggcgacgatt ccagcatagc ctgtagacag taacaacact 420

agggcaacag caactaacat atcttcattg atgaaacgtt gtgatcggtg tgacttttat 480

agtaaaagct acaactgttt gaaataccaa gatatcattg tgaatggctc aaaagggtaa 540

tacatctgaa aaacctgaag tgtggaaaat tccgatggag ccaactcatg ataacgcaga 600

agtcccattt tgccatcttc tcttggtatg aaacggtaga aaatgatccg agtatgccaa 660

ttgatactct tgattcatgc cctatagttt gcgtagggtt taattgatct cctggtctat 720

cgatctggga cgcaatgtag accccattag tggaaacact gaaagggatc caacactcta 780

ggcggacccg ctcacagtca tttcaggaca atcaccacag gaatcaacta cttctcccag 840

tcttccttgc gtgaagcttc aagcctacaa cataacactt cttacttaat ctttgattct 900

cgaattgttt acccaatctt gacaacttag cctaagcaat actctggggt tatatatagc 960

aattgctctt cctcgctgta gcgttcattc catctttcta 1000

<210> 93

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 93

gatatcgatc tacacttaat agtagatgac gaggcatctc tccaataggt accatatctg 60

gtgtttcttg taatttaaga atctgttggt ctatgaatgt agatttgtca tgaacaatga 120

tatatgggtc aggaggacaa gatggtttct ctgagttggg ttgttgaggt gcctggcaag 180

acttcggagc gttgatatcc ccaagacttg tagtgaccga tagttgaagc gtgtgtttgc 240

aggaacggca catcaatgca actttcgtaa ctttggaatt gagagttgat gcactgatga 300

cgatacccga aattttgacg attttaccaa tatgacttga agacaagtct ctcattgaaa 360

ccttattatc gttactaagc aaaacgagct gacaagaagg gaaggtggtc ggtatttcct 420

cgttgttcaa atatatgatt ctcctggcaa tatctgtgat ggcctgttca aaaagtggaa 480

tcatttctgc aggatcatct accaactttt tattgagctc ctcattgaat acgattaagt 540

ggtcattttg aatcgtcagt aagtacttgt ttacaagtaa attctgtctg agttgttctc 600

tgtagatgta ctgattttcc atacgaaact ccaaaatgaa cgaacggaat gccttaatga 660

cctcactgaa ctggtcatcg ttctgttctc cgggaaggac acttgtgtta aagactgatg 720

ctctatcaaa ggacattgca acaaagtata aacggttgtg agcgggaaaa agatgtgtag 780

gtaattgtcg tagatgagac tgattcagta gaaaacgcgt cctgcactat ttttttcttt 840

cttcattaca tttcctaatc gggacaaaat gaatctaaag acgtggttat gtagtacacg 900

catcgatagg ctatccccat accaaaacac tattttaccc catccttgac aggttataaa 960

tatgcgatag tatgagtatc ttcaaattca gctgaaatat c 1001

<210> 94

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 94

aataaaaaaa cgttatagaa agaaattgga ctacgatatg ctccaatcca aattgtcaaa 60

attgaccacc gaaaaagaac aattggaatt tgacaagagg aacaactcac tagattctca 120

aacggagcgt cacctagagt cagtttccaa gtcaattaca gaaagtttgg aaacagaaga 180

ggagtatcta caattgaatt ccaaacttaa agtcgagctg tccgaattca tgtcgctaag 240

gctttcttac ttggacccca tttttgaaag tttcattaaa gttcagtcaa aaattttcat 300

ggacatttat gacacattaa agagcggact accttatgtt gattctctat ccaaagagga 360

ttatcagtcc aagatcttgg actctagaat agataacatt ctgtcgaaaa tggaagcgct 420

gaaccttcaa gcttacattg atgattagag caatgatata aacaacaatt gagtgacagg 480

tctactttgt tctcaaaagg ccataaccat ctgtttgcat ctcttatcac cacaccatcc 540

tcctcatctg gccttcaatt gtggggaaca actagcatcc caacaccaga ctaactccac 600

ccagatgaaa ccagttgtcg cttaccagtc aatgaatgtt gagctaacgt tccttgaaac 660

tcgaatgatc ccagccttgc tgcgtatcat ccctccgcta ttccgccgct tgctccaacc 720

atgtttccgc ctttttcgaa caagttcaaa tacctatctt tggcaggact tttcctcctg 780

ccttttttag cctcaggtct cggttagcct ctaggcaaat tctggtcttc atacctatat 840

caacttttca tcagatagcc tttgggttca aaaaagaact aaagcaggat gcctgatata 900

taaatcccag atgatctgct tttgaaacta ttttcagtat cttgattcgt ttacttacaa 960

acaactattg ttgattttat ctggagaata atcgaacaaa 1000

<210> 95

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 95

attgttgtga atactctcct tcatttggat ttcttggact tcggactctc ttgatctctc 60

ttcgaaagtt ttaactctgt tcatgtataa ttttacccgc tgtaggtcgc tcataatacc 120

atgagtatgc acatctttta ctccattaac tttcaggtat gcaaaataca atgaagatag 180

tatatagctc aaagaattta gcattttgca ttgatctaat tgtgacattt tctctatgat 240

atcatctagc ttcttaaact cgagaatctc gtccaacgag gcagaaacat tgtccagtct 300

tacgtcaaga ttattcacga gtttctggac cgtatcaacg ttttccatct taagattaca 360

gtaagtatcg tccttttgaa ctgcaaaggt agaaaagtta atttttgatt tggtagtaca 420

ctatgaaact tgctcacccc aatctttcct cctgacaggt tgatctttat ccctctacta 480

aattgcccca agtgtatcaa gtagactaga tctcgcgaaa gaacagccta ataaactccg 540

aagcatgatg gcctctatcc ggaaaacgtt aagagatgtg gcaacaggag ggcacataga 600

atttttaaag acgctgaaga atgctatcat agtccgtaaa aatgtgatag tactttgttt 660

agtgcgtacg ccacttattc ggggccaata gctaaaccca ggtttgctgg cagcaaattc 720

aactgtagat tgaatctctc taacaataat ggtgttcaat cccctggctg gtcacgggga 780

ggactatctt gcgtgatccg cttggaaaat gttgtgtatc cctttctcaa ttgcggaaag 840

catctgctac ttcccatagg caccagttac ccaattgata tttccaaaaa agattaccat 900

atgttcatct agaagtataa atacaagtgg acattcaatg aatatttcat tcaattagtc 960

attgacactt tcatcaactt actacgtctt attcaacaat 1000

<210> 96

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 96

tatacggtct atccactttg gaaacgatgt agttgaaacg gggaagtaat agtggttccc 60

aaacgacatg aagaggttat ataagtttgc aagagggtga caccatttta gttgtggttc 120

ccgggtattt ttttaatctt tttagtctaa gatagcctcc ccagatatta ccgagttggg 180

ccatttgggg cggtatcggt ggtatctgat ggtagcgcgt ttttacatgc ctgtgcattg 240

aactggcaaa gagtatacta tcgtggggcc ctgaaggagg cagcaaatgg accgtcaatt 300

ggttgatcag ggactcaaga caggtattga gcttttcaaa caaaaagagt ataggcgctg 360

ctacaaggca tttacttcta ctatcaattt cattgagaat gatcccgagt tggccgccag 420

ctgtgtatct caactgatat ctctgttaga ttgtagggca gcctgtttgg aaaagctaga 480

tcaattgaat atggccttga aagatggtct taaaatgatc aagagagagt gccacaactg 540

caagggttat ttgagaactt gcaaaatttt agacctacaa gggaagatca gtgaggcttt 600

gtctacagca agagaaggga tctccataat agaaactaga agagatcagg ataatcaatt 660

tagatattcc aaggttcttt tggaacaatt aaaggaactg aaaaatgcac tgaaaatcaa 720

attggacaag aaaaatcagc tacacttcaa agttttaaag tttgacgcac cagtgccttg 780

tacaaagaaa ctaagattag tcactccaag aacaatagat ccttccattt ttttgccgat 840

agagctagtg aagctgatct ttcgcctgtt gaatttctca gacatgtatg cctgtttatt 900

ggtctcaaca aaatggaact caattatatc ctcatcaccg gaactgtttc gaaaacttca 960

gttgaaatcc caactgtcca acaaggcgtt aaacaattgt 1000

<210> 97

<211> 951

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pG1启动子

<220>

<221> misc_特征

<222> (578)..(578)

<223> n...(T)x，其中x为14-16

<400> 97

caaacatttg ctccccctag tctccaggga aatgtaaaat atactgctaa tagaaaacag 60

taagacgctc agttgtcagg ataattacgt tcgactgtag taaaacagga atctgtattg 120

ttagaaagaa cgagagtttt ttacggcgcc gccatattgg gccgtgtgaa aacagcttga 180

aaccccacta ctttcaaagg ttctgttgct atacacgaac catgtttaac caacctcgct 240

tttgacttga ctgaagtcat cggttaacaa tcaagtaccc tagtctgtct gaatgctcct 300

ttccatattc agtaggtgtt tcttgcactt ttgcatgcac tgcggaagaa ttagccaata 360

gcgcgtttca tatgcgcttt taccccctct tttgtcaagc gcaaaatgcc tgtaagattt 420

ggtgggggtg tgagccgtta gctgaagtac aacaggctaa ttccctgaaa aaactgcaga 480

tagacttcaa gatctcaggg attcccacta tttggtattc tgatatgttt ttcctgatat 540

gcatcaaaac tctaatctaa aacctgaatc tccgctanga tgaccccgtt ttcgtgacaa 600

attaatttcc aacggggtct tgtccggata agagaatttt gtttgattat ccgttcggat 660

aaatggacgc ctgctccata tttttccggt tattacccca cctggaagtg cccagaattt 720

tccggggatt acggataata cggtggtctg gattaattaa tacgccaagt cttacatttt 780

gttgcagtct cgtgcgagta tgtgcaataa taaacaagat gagccaattt attggattag 840

ttgcagcttg accccgccat agctaggcat agccaagtgc tatgggtgtt agatgatgca 900

cttggatgca gtgagttttg gagtataaaa gatccttaaa attccaccct t 951

<210> 98

<211> 1238

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pG1-3启动子

<400> 98

caaacatttg ctccccctag tctccaggga aatgtaaaat atactgctaa tagaaaacag 60

taagacgctc agttgtcagg ataattacgt tcgactgtag taaaacagga atctgtattg 120

ttagaaagaa cgagagtttt ttacggcgcc gccatattgg gccgtgtgaa aacagcttga 180

aaccccacta ctttcaaagg ttctgttgct atacacgaac catgtttaac caacctcgct 240

tttgacttga ctgaagtcat cggttaacaa tcaagtaccc tagtctgtct gaatgctcct 300

ttccatattc agtaggtgtt tcttgcactt ttgcatgcac tgcggaagaa ttagccaata 360

gcgcgtttca tatgcgcttt taccccctct tttgtcaagc gcaaaatgcc tgtaagattt 420

ggtgggggtg tgagccgtta gctgaagtac aacaggctaa ttccctgaaa aaactgcagc 480

tcagggattc ccactatttg gtattctgat atgtttttcc tgatatgcat caaaactcta 540

atctaaaacc tgaatctccg ctattttttt tttttttgat gaccccgttt tcgtgacaaa 600

ttaatttcca acggggtctt gtccggataa gagaattttg tttgattatc cgttcggata 660

aatggacgcc tgctccatat ttttccggtt attaccccac ctggaagtgc ccagaatttt 720

ccggggatta cggataatac ggtggtctgg attaattaat acgagatctc agggattccc 780

actatttggt attctgatat gtttttcctg atatgcatca aaactctaat ctaaaacctg 840

aatctccgct attttttttt tttttgatga ccccgttttc gtgacaaatt aatttccaac 900

ggggtcttgt ccggataaga gaattttgtt tgattatccg ttcggataaa tggacgcctg 960

ctccatattt ttccggttat taccccacct ggaagtgccc agaattttcc ggggattacg 1020

gataatacgg tggtctggat taattaatac gccaagtctt acattttgtt gcagtctcgt 1080

gcgagtatgt gcaataataa acaagatgag ccaatttatt ggattagttg cagcttgacc 1140

ccgccatagc taggcatagc caagtgctat gggtgttaga tgatgcactt ggatgcagtg 1200

agttttggag tataaaagat ccttaaaatt ccaccctt 1238

<210> 99

<211> 1425

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pG1-4启动子

<400> 99

caaacatttg ctccccctag tctccaggga aatgtaaaat atactgctaa tagaaaacag 60

taagacgctc agttgtcagg ataattacgt tcgactgtag taaaacagga atctgtattg 120

ttagaaagaa cgagagtttt ttacggcgcc gccatattgg gccgtgtgaa aacagcttga 180

aaccccacta ctttcaaagg ttctgttgct atacacgaac catgtttaac caacctcgct 240

tttgacttga ctgaagtcat cggttaacaa tcaagtaccc tagtctgtct gaatgctcct 300

ttccatattc agtaggtgtt tcttgcactt ttgcatgcac tgcggaagaa ttagccaata 360

gcgcgtttca tatgcgcttt taccccctct tttgtcaagc gcaaaatgcc tgtaagattt 420

ggtgggggtg tgagccgtta gctgaagtac aacaggctaa ttccctgaaa aaactgcagc 480

tcagggattc ccactatttg gtattctgat atgtttttcc tgatatgcat caaaactcta 540

atctaaaacc tgaatctccg ctattttttt tttttttgat gaccccgttt tcgtgacaaa 600

ttaatttcca acggggtctt gtccggataa gagaattttg tttgattatc cgttcggata 660

aatggacgcc tgctccatat ttttccggtt attaccccac ctggaagtgc ccagaatttt 720

ccggggatta cggataatac ggtggtctgg attaattaat acgccaagtc ttacattttg 780

ttgcagtctc gtgcgagtat gtgcaataat aaacaagatg agccaattta ttggattagt 840

tgcagcttga ccccgccata gctaggcata gccaagtgct atgggtgtta gatgatgcac 900

ttggatgcag tgagttttgg agtataaaag atccttaaaa ttccaccctt agatctcagg 960

gattcccact atttggtatt ctgatatgtt tttcctgata tgcatcaaaa ctctaatcta 1020

aaacctgaat ctccgctatt tttttttttt ttgatgaccc cgttttcgtg acaaattaat 1080

ttccaacggg gtcttgtccg gataagagaa ttttgtttga ttatccgttc ggataaatgg 1140

acgcctgctc catatttttc cggttattac cccacctgga agtgcccaga attttccggg 1200

gattacggat aatacggtgg tctggattaa ttaatacgcc aagtcttaca ttttgttgca 1260

gtctcgtgcg agtatgtgca ataataaaca agatgagcca atttattgga ttagttgcag 1320

cttgaccccg ccatagctag gcatagccaa gtgctatggg tgttagatga tgcacttgga 1380

tgcagtgagt tttggagtat aaaagatcct taaaattcca ccctt 1425

<210> 100

<211> 491

<212> DNA

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 100

cttttttgta gaaatgtctt ggtgtcctcg tccaatcagg tagccatctc tgaaatatct 60

ggctccgttg caactccgaa cgacctgctg gcaacgtaaa attctccggg gtaaaactta 120

aatgtggagt aatggaacca gaaacgtctc ttcccttctc tctccttcca ccgcccgtta 180

ccgtccctag gaaattttac tctgctggag agcttcttct acggccccct tgcagcaatg 240

ctcttcccag cattacgttg cgggtaaaac ggaggtcgtg tacccgacct agcagcccag 300

ggatggaaaa gtcccggccg tcgctggcaa taatagcggg cggacgcatg tcatgagatt 360

attggaaacc accagaatcg aatataaaag gcgaacacct ttcccaattt tggtttctcc 420

tgacccaaag actttaaatt taatttattt gtccctattt caatcaattg aacaactatc 480

acctgcaggc c 491

<210> 101

<211> 488

<212> DNA

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 101

cttttttgta gaaatgtctt ggtgtcctcg tccaatcagg tagccatctc tgaaatatct 60

ggctccgttg caactccgaa cgacctgctg gcaacgtaaa attctccggg gtaaaactta 120

aatgtggagt aatggaacca gaaacgtctc ttcccttctc tctccttcca ccgcccgtta 180

ccgtccctag gaaattttac tctgctggag agcttcttct acggccccct tgcagcaatg 240

ctcttcccag cattacgttg cgggtaaaac ggaggtcgtg tacccgacct agcagcccag 300

ggatggaaaa gtcccggccg tcgctggcaa taatagcggg cggacgcatg tcatgagatt 360

attggaaacc accagaatcg aatataaaag gcgaacacct ttcccaattt tggtttctcc 420

tgacccaaag actttaaatt taatttattt gtccctattt caatcaattg aacaactatc 480

aaaacaca 488

<210> 102

<211> 985

<212> DNA

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 102

agggcatcat tgaggtttcc acaaaaggaa gaaacatgga tccagagaca tcaacagaga 60

ggaaagcggg tagtgaagcc gaagccacaa cacagcccga tttggaaggg agttcacaat 120

caaggtgagt ccagccattt tttttctttt tttttttttt attcaggtga acccacctaa 180

ctatttttaa ctgggatcca gtgagctcgc tgggtgaaag ccaaccatct tttgtttcgg 240

ggaaccgtgc tcgccccgta aagttaattt ttttttcccg cgcagcttta atctttcggc 300

agagaaggcg ttttcatcgt agcgtgggaa cagaataatc agttcatgtg ctatacaggc 360

acatggcagc agtcactatt ttgcttttta accttaaagt cgttcatcaa tcattaactg 420

accaatcaga ttttttgcat ttgccactta tctaaaaata cttttgtatc tcgcagatac 480

gttcagtggt ttccaggaca acacccaaaa aaaggtatca atgccactag gcagtcggtt 540

ttatttttgg tcacccacgc aaagaagcac ccacctcttt taggttttaa gttgtgggaa 600

cagtaacacc gcctagagct tcaggaaaaa ccagtacctg tgaccgcaat tcaccatgat 660

gcagaatgtt aatttaaacg agtgccaaat caagatttca acagacaaat caatcgatcc 720

atagttaccc attccagcct tttcgtcgtc gagcctgctt cattcctgcc tcaggtgcat 780

aactttgcat gaaaagtcca gattagggca gattttgagt ttaaaatagg aaatataaac 840

aaatataccg cgaaaaaggt ttgtttatag cttttcgcct ggtgccgtac ggtataaata 900

catactctcc tcccccccct ggttctcttt ttcttttgtt acttacattt taccgttccg 960

tcactcgctt cactcaacaa caaaa 985

<210> 103

<211> 975

<212> DNA

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 103

gtagcttggg taggacttga caagtacggc ttccgtggtc ataccaaacg cctttgttac 60

cgttggctat acctaatgac caaggcattt gtggattata acggtatcgt agttgaaaaa 120

tatgacgtaa ccactggtac tagcccccac aaggttgatg ctgaatacgg gaatcaaggt 180

gccgatttta aaggagtagc cactgaaggg tttggctggg tcaatgcctc ttttattttg 240

ggattaacct acttagatgt ccaaggcatc cgtgcgatag gcgccgttac gtcccctgat 300

gtatttttca ggaagctcaa accttgggaa cgcgcaagtt atggcctaag gccatgtaac 360

gagatagtca agtcaaacta gaagtatacg gtttccccgc agaaatagca gaaataggcg 420

acaaatacat acaacatttt cattgtgata gggggcggcg gttcctagga gggacaaccc 480

ccagaaacct tgtagactac gttttcacga cgatgggtta ttactgtaaa ggaagaatat 540

actacccacc agttgaatgt ttgaacggat caaaggtcga agggagtaca cggcccaacc 600

aacgtagcta ccggagaaag caagactttc ccaaaccaaa tagctccggg tttcttctcc 660

ggcaacccgt cagtttttgt gtggccggac aaaaattcgc accctcagtc taattgaaag 720

gtcgggctcc gagctctagg cgtttgcgca tgtaatattg catcccctcc catagataat 780

actgcgcgaa cacagggtgc aaattatgat gaccacacat gccagtgacc aaaacagttt 840

tttagtcttt aaaaaccctc ggaacttctg agtatataaa ggcttctcat ttcctacaag 900

caaacaaaga agaaacttcc actttctaac tttttatcta tagactttag agttacaacc 960

aacgaacaat aacaa 975

<210> 104

<211> 699

<212> DNA

<213> 菲氏孔玛氏酵母

<400> 104

cgcattattt gggtcggcta ctgtcattgg ttatgatggc cttaccgagc acgaaggtgg 60

ttggatagac cacaactgga aacagttgta caaacagatt gcattcattt ttgcttgtat 120

tggatactcg atggccatca ccgctcttat ctgtttcatc ctcaaccgta ttccattttt 180

gcaactgcga gcttcagaag aggctgagga gaaaggtatg gatgaggatc agattggaga 240

gttcgcttat gactacgtgg aagtacgtcg tgattttttg gcttggggat caggcccaaa 300

caatggcttc aaggagccgg aagttctgga tcaggtagtt ccggttaatg atttcagcag 360

tgaccagaat gtgactaatc agaccaacga atctgagaag cagtagagta aatatagaga 420

tgatatttag tgtattctaa tgcttatgta atgtattaag caaaaagttg tgtttatgag 480

ttagcatttg tcttagcaaa cataaaatta tgtcgacatt tgcaacccgc atgtctagtg 540

tttttagatc gatcttcgat gtgtagaata atgcctccac gtgatgcccc gcgattttgt 600

tgggtcgcaa tgcctccaac ataaacccat cacgtataaa aagccctctt aaccctcccc 660

cctgtttcgt ttgcttcatc acttaacctg aactatcaa 699

<210> 105

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pG3启动子

<400> 105

gtaaatagcg gcagcaatcc agtaaccttt tctgaatagc agagccttaa ctaaaataat 60

ggccagggta aaaaattcga aatttgacac caaaaataaa gacttgtcgt tataagtctt 120

aacaaagtcc gcaattttgg agctaacggt ggcggttgct gggatattca ataatggtag 180

aatgttgctg cgggtatatg acagagcgtg aaacacactg aacaaggtaa atggaacaac 240

agcaattgca atatggggga ggatagtcaa gaacaaagca gcaatggcaa agtactgaat 300

attctccaaa gccaaaaggt ccagtggttt caacgacaaa gtcttgttgg tatagctttg 360

gaacaaaagg acaccgaaag actcgacagc gcccacaaat acagcgttgt agaagaacga 420

attgattgct ccagagcttc taatagtcag aagatacccc aaacctccga gcaacgttag 480

cacatgacct aagaaccagg cgaagtgaag agtctggaat aacgacaccc agtcagtttt 540

tcctgagctc ctggtgggat tggtagaagc atttgatttg cttggagtgg ttttatttga 600

agatggtgtt gaagccattg ttgctaaaga gtcggagttt tgcttttagg gtttgttaag 660

caaaggagga aaaactgcgc cgtttgaagt cccaggtagt ttcgcgtgtg aggccagcca 720

gggaaagctt ccttcggtac ttttttttct tttgcaggtt ccggacggat taagcttcgg 780

gttatgaggg gggcggtagc caattccgga cacaatattg cgtcgcagct agtcaccccg 840

ccataaatat acgcaggatt gaggtaataa catcgatagt cttagtaatt aatacaattc 900

agtggcgaat ttggcaacat gacgtaaggc ccactgttgt ctataaaagg ggatgaattt 960

tcatgttttt gaggcctccc ggacaattta ttgaactcaa 1000

<210> 106

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pG4启动子

<400> 106

tggactgttc aatttgaagt cgatgctgac gatgtcaaga gagatgctca attatatttg 60

tcatttgctg gttacactgg aaacgctact tttgttggcg gaaactctac cagtttggcc 120

gtccatgtaa acgatgtcgt tctgggccgt gaccgtttca acacgaacat aaccaatgac 180

aaatccactt acaggtctag ttcatatgga ggcaattggt accttacttc tttggatgtc 240

ccaagtgggg ctttaacgtc tggtactaac aatgtctcgt ttgtcactac aaactccgag 300

gtaaataaag gattcttgtg ggattctctc aagtttgttt ggaagttgta acaggtttat 360

aagcatatcg tgcgcttgtc cacaattgaa tcatttattg ttgcgagata catgaacaaa 420

gtgtgaactg ggacccatta ctacaattcc cacgcaaccg ttgtttcaaa gcccatattt 480

tttgacaatt gtttcgttac acccccagtt tgatgtacat cgcttgcaat gatgtgtgtc 540

ccggagtatt ttccatattc agcttgaatt cgtatactca accaatatct gggggtatac 600

ttttatgtaa cctatacaaa tcaactatac tatttcacct ttcgaccaat catctcccat 660

cttgttaagt tttgcttcct atatccctga ccctgacatc acccatgatt ccgctcaacg 720

gttctcctct acatcgtccc tcttttggag agggtgttca gtttgacatt caaattaccc 780

cccgccatca cgcgcaaccg agaccgcacc cccgaatttt cacaaattac cccacaccct 840

atactccacc actatgaggg ttattagaac tgatcacgta taaataccac cgcaagttcc 900

caagggatcg tgttcttctt ctccaattgc aatcatattt ctgactcttt ctagttcaga 960

ttaattcctt tacacttgct tttttccctt acctttatcc 1000

<210> 107

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pG5启动子

<400> 107

agaccagcag tttaactacg caaatccaca ggaatttcta catcacaata ccaatggtaa 60

taccacgacg tcaaggaatg gaaacgacga cttggaggaa gacttcgtca acctcttgcg 120

gagtacccga ggctaagaca ataagaagaa aaaaaaaaga aaagcggtgg gggagggatt 180

attaaataag gattatgtaa ccccagggta ccgttctata catatttaag gattatttag 240

gacaatcgat gaaatcggca tcaaactgga tgggagtata gtgtccggat aatcggataa 300

atcatcttgc gaggagccgc ttggttggtt ggtgagagga gtgaaatatg tgtctcctca 360

cccaagaatc gcgatatcag caccctgtgg gggacactat tggcctccct cccaaacctt 420

cgatgtggta gtgctttatt atattgatta cattgattac atagctaaac cctgcctggt 480

tgcaagttga gctccgaatt ccaatattag taaaatgcct gcaagataac ctcggtatgg 540

cgtccgaccc cgcttaatta ttttaactcc tttccaacga ggacttcgta atttttgatt 600

agggagttga gaaacggggg gtcttgatac ctcctcgatt tcagatccca ccccctctca 660

gtcccaagtg ggacccccct cggccgtgaa atgcgcgcac tttagttttt ttcgcatgta 720

aacgccggtg tccgtcaatt aaaagtcgca gactagggtg aactttacca tttttgtcgc 780

actccgtctc ctcggaatag gggtgtagta attctgcagt agtgcaattt ttaccccgcc 840

aagggggggc gaaaagagac gacctcatca cgcattctcc agtcgctctc tacgcctaca 900

gcaccgacgt agttaacttt ctcccatata taaagcaatt gccattcccc tgaaaacttt 960

aacctctgct ttttcttgat ttttccttgc ccaaagaaaa g 1001

<210> 108

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pG7启动子

<400> 108

aattgattaa gttcagtgaa atttcaaacc gctatacaca acaggacaac tttgagttta 60

gaaaaatccg atgtagtgta acggctagca cggtccgctt tcaccgggca gacccgggtt 120

cgactcccgg catcggagtt tatttttcca tttcgttctt tagagtattc tcctcagcat 180

gcccccctga atttttcctt ttttccatgt gtcccatttt tccacttttt ttacagtttt 240

cctcgtgatg ttaattggct acacaaaagc tgccacacga aaccttaatc acgaaaaact 300

atacagcctt cactaatccg tagccccata atatgttgtc cacgtgctgt tgggtactac 360

ctgtagactc tcatacccca ctccgtcttt ctccaacaat taacgcagta ccgagattta 420

tcagcagact caaattgggc aaactctgta tttttccttg cccgcataat ttatgggtct 480

caggcctcca cgtttcctgt ttacttgaag aatattggct gcggaaaaag tggtaaggac 540

aacccccttt taattggatc cagtttttcc gaaatgttcc gatccgtacg tcatctccga 600

agccgtacat tttcactcaa tctacgtagc tttggactca gcgctcctgg aattgccagg 660

acagtttact tgagttgata ttcccttgta gattgtgtgc ttctttttcc aaaatttgag 720

gcttcgtttg aaaagtggaa tctggtcgct agatcacttc atgcctattt ttcacggaaa 780

aataagtggt actatgcacc ccttaaacct aaagaaaaac ggaaaaatta ccccaaaacc 840

tggtgatgtt tttcgcccct ttctttttat ccgagttttt cttttttctt gtctgccaaa 900

ttcctctcct gaccttagcg tccccggaaa aaattaacta cttaaggacc gaatgagccc 960

cagcttttcc ccttctcttc attattcccc ataatataat 1000

<210> 109

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pG8启动子

<400> 109

ctgcacaacc attgccagta aggacgaaga gaaggcccca ctacccaaaa ttcaggataa 60

cgtcttcata ccatgcagcg acgcctacaa gacgctgtca agacatgcca acttcaacga 120

agtgaacttt aacacattga tcgggaaatt gaccaccaag ggaatgctgg ttgaggctgg 180

aagcgttgcc agtgtcctga gggaactgga ccgaaagttt agtaatgcat aagaggatat 240

atataggaat gcagtaataa tattagtacc cattaagtgg gctaagccat tggaaggccg 300

tctgactgat ggtggtgttc ttctcattta gatagtgcat ttgcaactac cgtctgagat 360

tgagtttgat gtgaagctcc agcgccaaaa cagtataaga accttatctc cgcattattg 420

ttcttgcgta aaagtttgtg tgaagaaaca ggggtagttg cgcagattag ttgtaatatg 480

cgcataggat gggtcattga cttctttcct cgaaagagcc acaccgttag ctaaaaaagg 540

acgcgcatct accccaaaat agaatgtggg gaaataggac gcgcaacttc ctctcaatca 600

ctggacgtca gaaaaacaaa tgcgcaatcg agtcaccctc cgtgataccc tccgtgatac 660

cccctctccg tctattctga cagcgtctcc ccatgacgtt tcaatctact tagaaaagat 720

ttcgtttttt tttccttcaa ttacacgatc tcatcttctg caagggtctg gaggacatca 780

ccaatctgcg actccataac ttagtcctga gtttatattt acgcttcatc tgatgagtag 840

gaagaaaaag tttcacgaaa ttcccccgcc aacttgccct tcggaataag cagccactct 900

ccttctgccc atagtaagct tgcgcgaggc cccaacttgg ccagaaactt taaatatgcc 960

aaacaatctc ccccaatcta agttctccct cttctaaaaa 1000

<210> 110

<211> 859

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pG1a启动子

<400> 110

ggaatctgta ttgttagaaa gaacgagagt tttttacggc gccgccatat tgggccgtgt 60

gaaaacagct tgaaacccca ctactttcaa aggttctgtt gctatacacg aaccatgttt 120

aaccaacctc gcttttgact tgactgaagt catcggttaa caatcaagta ccctagtctg 180

tctgaatgct cctttccata ttcagtaggt gtttcttgca cttttgcatg cactgcggaa 240

gaattagcca atagcgcgtt tcatatgcgc ttttaccccc tcttttgtca agcgcaaaat 300

gcctgtaaga tttggtgggg gtgtgagccg ttagctgaag tacaacaggc taattccctg 360

aaaaaactgc agatagactt caagatctca gggattccca ctatttggta ttctgatatg 420

tttttcctga tatgcatcaa aactctaatc taaaacctga atctccgcta tttttttttt 480

ttttttgatg accccgtttt cgtgacaaat taatttccaa cggggtcttg tccggataag 540

agaattttgt ttgattatcc gttcggataa atggacgcct gctccatatt tttccggtta 600

ttaccccacc tggaagtgcc cagaattttc cggggattac ggataatacg gtggtctgga 660

ttaattaata cgccaagtct tacattttgt tgcagtctcg tgcgagtatg tgcaataata 720

aacaagatga gccaatttat tggattagtt gcagcttgac cccgccatag ctaggcatag 780

ccaagtgcta tgggtgttag atgatgcact tggatgcagt gagttttgga gtataaaaga 840

tccttaaaat tccaccctt 859

<210> 111

<211> 664

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pG1b启动子

<400> 111

ccatattcag taggtgtttc ttgcactttt gcatgcactg cggaagaatt agccaatagc 60

gcgtttcata tgcgctttta ccccctcttt tgtcaagcgc aaaatgcctg taagatttgg 120

tgggggtgtg agccgttagc tgaagtacaa caggctaatt ccctgaaaaa actgcagata 180

gacttcaaga tctcagggat tcccactatt tggtattctg atatgttttt cctgatatgc 240

atcaaaactc taatctaaaa cctgaatctc cgctattttt tttttttttt tgatgacccc 300

gttttcgtga caaattaatt tccaacgggg tcttgtccgg ataagagaat tttgtttgat 360

tatccgttcg gataaatgga cgcctgctcc atatttttcc ggttattacc ccacctggaa 420

gtgcccagaa ttttccgggg attacggata atacggtggt ctggattaat taatacgcca 480

agtcttacat tttgttgcag tctcgtgcga gtatgtgcaa taataaacaa gatgagccaa 540

tttattggat tagttgcagc ttgaccccgc catagctagg catagccaag tgctatgggt 600

gttagatgat gcacttggat gcagtgagtt ttggagtata aaagatcctt aaaattccac 660

cctt 664

<210> 112

<211> 493

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pG1c启动子

<400> 112

ctgcagatag acttcaagat ctcagggatt cccactattt ggtattctga tatgtttttc 60

ctgatatgca tcaaaactct aatctaaaac ctgaatctcc gctatttttt tttttttttt 120

gatgaccccg ttttcgtgac aaattaattt ccaacggggt cttgtccgga taagagaatt 180

ttgtttgatt atccgttcgg ataaatggac gcctgctcca tatttttccg gttattaccc 240

cacctggaag tgcccagaat tttccgggga ttacggataa tacggtggtc tggattaatt 300

aatacgccaa gtcttacatt ttgttgcagt ctcgtgcgag tatgtgcaat aataaacaag 360

atgagccaat ttattggatt agttgcagct tgaccccgcc atagctaggc atagccaagt 420

gctatgggtg ttagatgatg cacttggatg cagtgagttt tggagtataa aagatcctta 480

aaattccacc ctt 493

<210> 113

<211> 370

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pG1d启动子

<400> 113

gaccccgttt tcgtgacaaa ttaatttcca acggggtctt gtccggataa gagaattttg 60

tttgattatc cgttcggata aatggacgcc tgctccatat ttttccggtt attaccccac 120

ctggaagtgc ccagaatttt ccggggatta cggataatac ggtggtctgg attaattaat 180

acgccaagtc ttacattttg ttgcagtctc gtgcgagtat gtgcaataat aaacaagatg 240

agccaattta ttggattagt tgcagcttga ccccgccata gctaggcata gccaagtgct 300

atgggtgtta gatgatgcac ttggatgcag tgagttttgg agtataaaag atccttaaaa 360

ttccaccctt 370

<210> 114

<211> 328

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pG1e启动子

<400> 114

ccggataaga gaattttgtt tgattatccg ttcggataaa tggacgcctg ctccatattt 60

ttccggttat taccccacct ggaagtgccc agaattttcc ggggattacg gataatacgg 120

tggtctggat taattaatac gccaagtctt acattttgtt gcagtctcgt gcgagtatgt 180

gcaataataa acaagatgag ccaatttatt ggattagttg cagcttgacc ccgccatagc 240

taggcatagc caagtgctat gggtgttaga tgatgcactt ggatgcagtg agttttggag 300

tataaaagat ccttaaaatt ccaccctt 328

<210> 115

<211> 283

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pG1f启动子

<400> 115

gcctgctcca tatttttccg gttattaccc cacctggaag tgcccagaat tttccgggga 60

ttacggataa tacggtggtc tggattaatt aatacgccaa gtcttacatt ttgttgcagt 120

ctcgtgcgag tatgtgcaat aataaacaag atgagccaat ttattggatt agttgcagct 180

tgaccccgcc atagctaggc atagccaagt gctatgggtg ttagatgatg cacttggatg 240

cagtgagttt tggagtataa aagatcctta aaattccacc ctt 283

<210> 116

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 116

cctgaggctt tgttccaccc atct 24

<210> 117

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 117

ggaacatagt agtaccaccg gacataacga 30

<210> 118

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 118

taaaattctc cggggtaaaa c 21

<210> 119

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 119

ctctccagca gagtaaaatt tc 22

<210> 120

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 120

cacagaatcg gtagaggtg 19

<210> 121

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 121

cagtgatgga agatggc 17

<210> 122

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 122

agactttcac tttccacgct 20

<210> 123

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 123

caacgaaagc agcgaagtc 19

<210> 124

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 124

gatcggtctc acatgtcttg ggacgacg 28

<210> 125

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 125

gatcggtctc agtcctgctt tgtctctag 29

<210> 126

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 126

gatcggtctc tggactatgt gaacctcc 28

<210> 127

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 127

gatcggtctc aaagcctaca tgaaatcgtc atcacc 36

<210> 128

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 128

gatcggtctc acatgacaaa cgaaccagaa 30

<210> 129

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 129

gatgggtctc agaccggttt ggaaatcc 28

<210> 130

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 130

gatcggtctc aggtctgcct tgtagaac 28

<210> 131

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 131

gatcggtctc agagcctgca ttcaaagttg 30

<210> 132

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 132

gatcggtctc agctctggtg accttg 26

<210> 133

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 133

gatcggtctc aaagcctaat ccacaatttc ttctttctc 39

<210> 134

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 134

gatgggtctc acatgtcccg tttctttgcg tcag 34

<210> 135

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 135

gatcggtctc taagcttatt tactatagat cttcttttgg tctttgacat tggaggactg 60

<210> 136

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 136

gatcggtctc acatggctcc aaactacaac 30

<210> 137

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 137

gatcggtctc agtgaagaat tcgtagattg tctc 34

<210> 138

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 138

gatcggtctc atcacctcca aaagggttag 30

<210> 139

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 139

gatcggtctc agttatgtgt ctcgacctta c 31

<210> 140

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 140

gatcggtctc ataacaggct aaagagaatg g 31

<210> 141

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 141

gatcggtctc taagcttata ttcttccttg acgctttag 39

<210> 142

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 142

gatcggtctc acatgaggcc aattttactg aag 33

<210> 143

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 143

gaagggtctc attggacacc gaaaatagc 29

<210> 144

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 144

gatcggtctc tccaaggatt cggtagc 27

<210> 145

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 145

gatcggtctc aaagcctaag aggcagtctg taaag 35

<210> 146

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 146

gatcggtctc acatggcaac agcagtag 28

<210> 147

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 147

gatcggtctc accttgacac aatctacaca cc 32

<210> 148

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 148

gatcggtctc aaaggagatc atttcactac c 31

<210> 149

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 149

gaagggtctc actccgagtc cagagc 26

<210> 150

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 150

gatcggtctc aggaggctct ggaagctc 28

<210> 151

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 151

atcggtctct aagcctacac cttaggcttt ggcttg 36

<210> 152

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACGCCCTGCAGGATGTCTGAAGGTATTATTGAAATCGACACTAACTTAATCG

<400> 152

acgccctgca ggatgtctga aggtattatt gaaatcgaca ctaacttaat cg 52

<210> 153

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 153

gactggccga ggcggcccta agactcatta acttcctcag tctcaaacaa gtc 53

<210> 154

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 154

gtctcctgca ggatgtccaa taagaacgtg gatacagctc ca 42

<210> 155

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 155

gactggccga ggcggcctta aacttcctgt tcctcttctt gctctc 46

<210> 156

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 156

gaggcctgca ggatgtctgt cgataccaag gaagttcaag 40

<210> 157

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 157

gagcggccga ggcggcccta gtttgcttgt gcatccgctt 40

<210> 158

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 158

gatcggtctc ccatgtcaga gactgaaaac g 31

<210> 159

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 159

gatcggtctc tattcaggtt tgattccatc tc 32

<210> 160

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 160

gatcggtctc agaatgggag gacgag 26

<210> 161

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 161

gatcggtctc acgcgggacc ac 22

<210> 162

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 162

gatcggtctc tcgcggtctg ttgag 25

<210> 163

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 163

gatcggtctc acatccttgg acttggtc 28

<210> 164

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 164

gatcggtctc agatgaggca gttttaagac c 31

<210> 165

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 165

gatcggtctc aaagcctaaa tgctgaaaga aggtacg 37

<210> 166

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 166

gatcggtctc acatgtctga aggtattatt gaaatcgaca ctaacttaat cgagacaaac 60

tac 63

<210> 167

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 167

gatcggtctc aaagcctaag actcattaac ttcctcagtc tcaaacaagt cagtg 55

<210> 168

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 168

gactggtctc acatgcatcc atacaccg 28

<210> 169

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 169

gatcggtctc aggtcgtagt ttgtctcg 28

<210> 170

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 170

gatcggtctc agaccaggtt gtcagc 26

<210> 171

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 171

gatcggtctc aaagcctaag actcattaac ttcctcag 38

<210> 172

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 172

gatcggtctc acatgtccaa taagaacgtg g 31

<210> 173

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 173

gatcggtctc accagcgtcc tcagat 26

<210> 174

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 174

gatcggtctc actggcaaga ctagagatg 29

<210> 175

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 175

gactggtctc acttaacgaa cgaggtacc 29

<210> 176

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gBlock

<400> 176

ccattgggtc tcataagaaa taaggaggct gaagtcaaga ctgctccaga cggatctata 60

atagtatcag aagaggacat caaaaggaaa actaaatccc ttttgaataa gttgacgttg 120

gaattctttg atgatatctc aaacgatata attgctttga ccaagcaagc tcaatgggaa 180

gatgacgtca agactttgaa acaagttatt gagtctatat ttgcaaaggc ttgtgacgaa 240

ccctactggt cctctatgta cgctaaatta tgcgccaaaa tgtgcaagga caccccacct 300

gagatcaagg aaactaatga gaagggaaat actttcaccg gtggtgattt ggtgagaaga 360

gtgttgatta atagatgtca tgagaccgat tcg 393

<210> 177

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 177

agctggtctc agtcaaaccg aatatcagaa ag 32

<210> 178

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 178

gatcggtctc aaagcttaaa cttcctgttc ctcttc 36

<210> 179

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 179

gtacggtctc acatgtctgt cgataccaag 30

<210> 180

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 180

gatcggtctc agaagccaat gtctcgg 27

<210> 181

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 181

gatcggtctc tcttcattgt atgttggtga g 31

<210> 182

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 182

gatcggtctc acacgttggg accac 25

<210> 183

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 183

gatcggtctc acgtgaccct tccttg 26

<210> 184

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 184

gatcggtctc agttcttgac aaagacattg g 31

<210> 185

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 185

gatcggtctc tgaactttga cactgagtcc 30

<210> 186

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 186

gatcggtctc taagcctagt ttgcttgtgc atcc 34

<210> 187

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 187

gatcggtctc gcatgagtga gaaaaacaca cg 32

<210> 188

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 188

gatcggtctc aaagcttata actcagtgtt ctcaagg 37

<210> 189

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 189

agcggtgatt tccttttgca ttctttcg 28

<210> 190

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 190

tttgggtttg gaatctgccg gta 23

<210> 191

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 191

cctgaggctt tgttccaccc atct 24

<210> 192

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 192

ggaacatagt agtaccaccg gacataacga 30

<210> 193

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 193

cgagagatcc tccatcttcg acgc 24

<210> 194

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 194

gtgttgcaac aagtcgacga ctctg 25

<210> 195

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 195

tgtaacgtga atgtcggatt tg 22

<210> 196

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 196

tagtgatggt ggtggtgatg 20

Claims (21)

1.一种表达目的基因(GOI)的重组真核宿主细胞，所述重组真核宿主细胞通过遗传修饰工程化以与所述一种或多种遗传修饰之前的宿主细胞相比，增加编码信使核糖核蛋白(mRNP)的翻译起始因子的两种或更多种基因(TIF基因)的表达，其中所述TIF基因至少包括编码eIF4A的基因和编码eIF4G的基因，并且其中所述TIF基因中的至少一者的表达在不同于控制所述GOI的表达的启动子的启动子的转录控制下。

2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中

a)所述eIF4A与SEQ ID NO:12-33中的任一者具有至少60％序列同一性；并且

b)所述eIF4G与SEQ ID NO:34-44中的任一者具有至少60％序列同一性。

3.根据权利要求1或2所述的宿主细胞，其中所述TIF基因进一步包括以下中的任何一者或多者

a)编码eIF4E的基因；

b)编码PAB1的基因；或

c)编码RLI1的基因。

4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其中

a)所述eIF4E与SEQ ID NO:1-11中的任一者具有至少60％序列同一性；

b)所述PAB1与SEQ ID NO:45-55中的任一者具有至少60％序列同一性；并且

c)所述RLI1与SEQ ID NO:56-65中的任一者具有至少60％序列同一性。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞，其中所述TIF基因中的一者或多者被优化以用于在宿主细胞中表达所述TIF基因。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的宿主细胞，其过表达至少以下各项：

a)编码eIF4A和eIF4G的基因；

b)编码eIF4A、eIF4G和eIF4E的基因；

c)编码eIF4A、eIF4G、eIF4E和PAB1的基因；

d)编码eIF4A、eIF4G和PAB1的基因。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞被另外工程化以过表达编码RLI1的基因。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的宿主细胞，其中所述遗传修饰包括以下者的敲入、取代、中断、缺失或敲除：(i)一个或多个多核苷酸或其一部分；或(ii)表达控制序列，优选地，选自由启动子、核糖体结合位点、转录或翻译起始和终止序列、增强子和激活子序列组成的组的表达控制序列，优选地其中所述一种或多种遗传修饰包括将异源多核苷酸或表达盒整合到宿主细胞基因组中。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的宿主细胞，其中所述遗传修饰包括增加所述TIF基因的数量或包含所述TIF基因的表达盒的数量，和/或所述TIF基因中的功能获得性改变，从而增加所述TIF基因的水平或活性。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述TIF基因对所述宿主细胞是内源的或异源的。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的宿主细胞，其包含

a)表达系统，其在一个或多个异源TIF表达盒中表达所述TIF基因中的一者或多者，每个表达盒包含一个或多个与所述TIF基因可操作地连接的表达控制序列；和

b)GOI表达盒，其包含GOI和一个或多个与所述GOI可操作地连接的表达控制序列；

其中a)的所述表达系统和b)的所述表达盒经工程化以当在细胞培养物中培养所述宿主细胞时表达相应TIF基因和GOI。

12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中

a)所述TIF表达盒中的至少一者包含组成型启动子；和/或

b)所述GOI表达盒包含诱导型、去阻抑型或其他可调控启动子，或组成型启动子。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的宿主细胞，其是：

a)选自由以下项组成的组中的属的酵母细胞：毕赤酵母属、汉逊酵母属、孔玛氏酵母属、酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、绪方酵母属、耶氏酵母属和地丝菌属，优选巴斯德毕赤酵母、菲氏孔玛氏酵母、巴斯德孔玛氏酵母、假巴斯德孔玛氏酵母、酿酒酵母、小绪方酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、解脂耶氏酵母或多形汉逊酵母；

b)丝状真菌，诸如泡盛曲霉或里氏木霉的细胞；

c)非人灵长类动物、人类、啮齿动物或牛细胞，诸如小鼠骨髓瘤(NSO)细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、HT1080、H9、HepG2、MCF7、MDBK Jurkat、MDCK、NIH3T3、PC12、BHK(幼仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、YB2/0、Y0、C127、L细胞、COS例如COS1和COS7、QC1-3、HEK-293、VERO、PER.C6、HeLA、EB1、EB2、EB3、溶瘤或杂交瘤细胞系；

d)昆虫细胞，诸如Sf9、Mimic^TMSf9、Sf21、High Five(BT1-TN-5B1-4)或BT1-Ea88细胞；

e)藻类细胞，诸如属于双眉藻属、硅藻属、杜氏藻属、小球藻属、衣藻属、蓝藻属(蓝藻细菌)、微拟球藻属、螺旋藻属或棕鞭藻属；或者

f)植物细胞，诸如来自单子叶植物的细胞，优选玉米、水稻、小麦或狗尾草，或来自双子叶植物的细胞，优选木薯、马铃薯、大豆、番茄、烟草、苜蓿、小立碗藓或拟南芥。

14.一种用于生产根据权利要求1至13中任一项所述的宿主细胞的方法，其包括将宿主细胞遗传工程化以在一个或多个异源表达盒内包含所述TIF基因中的一者或多者以及目的基因(GOI)。

15.一种生产由目的基因(GOI)编码的目的蛋白(POI)的方法，通过在生产所述POI的条件下培养根据权利要求14所述的宿主细胞。

16.根据权利要求15所述的方法，其中在共表达所述TIF基因中的一者或多者并将所述POI分泌到宿主细胞培养物中的条件下在培养基中培养所述宿主细胞，并且从所述宿主细胞培养物中回收所述POI。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述宿主细胞被修饰以在如下水平下共表达所述TIF基因中的一者或多者，所述水平增加所述宿主细胞对所述POI的比生产率(μg/g酵母干质量(YDM)/小时)和/或对所述POI的体积生产率(μg/L/小时)。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述POI是治疗性或诊断性产品，优选地，选自由抗原结合蛋白、治疗性蛋白、酶、肽、蛋白质抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白质缀合物、结构蛋白、调控蛋白、疫苗抗原、生长因子、激素、细胞因子、加工酶和代谢酶组成的组中的肽、多肽或蛋白质。

19.一种增加由表达编码所述POI的目的基因(GOI)的宿主细胞生产时的目的蛋白(POI)产量的方法，通过共表达一个或多个表达细胞培养物中的信使核糖核蛋白(mRNP)的一种或多种TIF基因的异源表达盒。

20.一种多肽表达系统，其包含一个或多个表达信使核糖核蛋白(mRNP)的一个或多个TIF基因的异源表达盒。

21.根据权利要求20所述的表达系统，其包含表达盒，所述表达盒包含编码目的蛋白(POI)的目的基因(GOI)和一个或多个与所述GOI可操作地连接的表达控制序列。