ES2964319T3

ES2964319T3 - Levadura metilotrófica Mut-

Info

Publication number: ES2964319T3
Application number: ES20714242T
Authority: ES
Inventors: Domen Zavec; Brigitte Gasser; Diethard Mattanovich
Original assignee: Universitaet fuer Bodenkultur Wien BOKU
Current assignee: Universitaet fuer Bodenkultur Wien BOKU
Priority date: 2019-04-01
Filing date: 2020-04-01
Publication date: 2024-04-05
Anticipated expiration: 2040-04-01
Also published as: HUE064229T2; KR20220009943A; AU2020252241A1; EP3947695A1; CA3135444A1; US20220170032A1; BR112021019477A2; JP2022528536A; EP3947695B1; EP3947695C0; CN114026239A; SG11202110695PA; AU2020252241B2; WO2020201369A1

Abstract

Una célula huésped de levadura metilotrófica (Mut-) deficiente en la ruta de utilización de metanol recombinante que está diseñada: a) mediante una o más modificaciones genéticas para reducir la expresión de un primer y un segundo gen endógeno en comparación con la célula huésped antes de dichas una o más modificaciones genéticas , donde i. el primer gen endógeno codifica la alcohol oxidasa 1 (AOX1) que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:1 o un homólogo de la misma, y ii. el segundo gen endógeno codifica la alcohol oxidasa 2 (AOX2) que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:3 o un homólogo de la misma, y b) mediante una o más modificaciones genéticas para aumentar la expresión de un gen de la alcohol deshidrogenasa (ADH2) en comparación con la célula huésped antes de dichas una o más modificaciones genéticas, en donde el gen ADH2 codifica una alcohol deshidrogenasa (ADH2). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Levadura metilotrófica Mut-

Campo técnico

La invención se refiere a la producción de una proteína de interés (POI) en una levadura metilotrófica recombinante que tiene deficiencia de alcohol oxidasa 1 (AOX1) y alcohol oxidasa 2 (AOX2).

Antecedentes

Las proteínas producidas en cultivos de células anfitrionas recombinantes se han vuelto cada vez más importantes como agentes diagnósticos y terapéuticos. Para este fin, las células se diseñan mediante ingeniería genética y/o seleccionan para producir niveles inusualmente altos de una proteína de interés recombinante o heteróloga. La optimización de las condiciones del cultivo celular es importante para el éxito de la producción comercial de proteínas recombinantes o heterólogas.

La producción exitosa de proteínas de interés (POI) se ha logrado tanto con células anfitrionas procarióticas como eucarióticas en cultivo celular. Las células anfitrionas eucarióticas, en particular células anfitrionas de mamíferos, levaduras u hongos filamentosos, o bacterias, se utilizan comúnmente como anfitriones de producción para proteínas biofarmacéuticas así como para productos químicos a granel. Los ejemplos más destacados son las levaduras metilotróficas como, por ejemplo,Pichia pastoris,que tiene buena reputación por su secreción eficiente de proteínas heterólogas.P. pastorisha sido reclasificada en un nuevo género,Komagataella,y se divide en tres especies,K. pastoris, K. phaffii,yK. pseudopastoris.Las cepas comúnmente utilizadas para aplicaciones biotecnológicas pertenecen a dos especies propuestas,K. pastorisyK. phaffii.Las cepas GS115, X-33, CBS2612 y CBS7435 sonK. phaffii,mientras que la cepa DSMZ70382 se clasifica en la especie tipo,K. pastoris,que es la cepa de referencia para todas las cepas deP. pastorisdisponibles (Kurtzman 2009, J Ind Microbiol Biotechnol. 36(11):1435-8). Mattanovich et al. (Microbial Cell Factories 2009, 8:29 doi:10.1186/1475-2859-8-29) describen la secuenciación del genoma de la cepa tipo DSMZ 70382 deK. pastoris,y analizan su secretoma y transportadores de azúcar.

Se han utilizado cepas deP. pastorisque presentan deficiencia de ambos genes AOX, AOX1 y AOX2 (denominadas Mut-), o deficiencia sólo en AOX2 (denominadas MutS), o no presentan deficiencia en ninguno de los genes AOX (denominadas Mut+).

Los promotores utilizados para la producción de proteínas en células anfitrionas recombinantes están regulados(p. e j,inducidos tras la adición de metanol al medio, controlados por metanol), o constantemente activos (constitutivos). Se ha descrito que el promotor inducible por metanol pAOX1 controla la expresión de proteínas en cepas Mut-, Mut+ o MutS.

Chiruvolu et al. (Enzyme Microb. Technol. 1997, 21:277-283) describen la construcción de una cepa Mut- utilizada para la producción de proteínas recombinantes. Se determinó que la cepa Mut- no crecía con metanol, lo que requería el uso de otra fuente de carbono para proporcionar crecimiento, mantenimiento y producción de proteínas. Se expresó una POI bajo el control de pAOX1, que se indujo mediante inyección de metanol en el fermentador para mantener una concentración de aproximadamente 0,5% (v/v).

Chauhan et al. (Process Biochemistry 1999, 34:139-145) describen la utilización de un anfitrión con AOX1 suprimido (designado como Mut-, sin embargo, se entiende que es MutS) que porta un gen para expresar HBsAg bajo el promotor pAOX1. La expresión de proteínas fue inducida por metanol, pero se encontró que una alta concentración de metanol en el caldo era tóxica para las células, ya que se encontró que las células MutS eran sensibles a la concentración de metanol.

Karaoglan et al. (Biotechnol. Lett. 1995, DOI 10.1007/s10529-015-1993-z) describen el análisis funcional de los genes de la alcohol deshidrogenasa (ADH) en P. pastoris. Los genes ADH3 (XM_002491337) y ADH (FN392323) estaban alterados. La cepa con doble bloqueo génico también produjo etanol. Se concluye que el gen ADH no juega papel en el metabolismo del etanol; yPpADH3fue el único gen responsable del consumo de etanol enP. pastoris.

Singh y Narang (bioRxiv, DOI:10.1101/573519, preimpresión) describen la expresión de p-galactosidasa en cepas Mut+, Muts (AOX1-) y Mut- (AOX1- AOX2-) deKomagataella phaffii (Pichia pastoris).Se concluyó que el formiato y/o el formaldehído son probablemente verdaderos inductores ya que ambos inducen la expresión de PAOX1 en Mut- que no puede sintetizar metanol intracelular a partir de formiato o formaldehído, y propone el formiato como un sustituto prometedor del metanol ya que no parece sufrir las deficiencias que afligen al metanol.

Wei Shen et al. (Microbial Cell Factories 2016, 15(1 ):1-11) describen un sistema de expresión de proteínas dePichia pastorislibre de metanol. Dos mutantes de quinasa, Agut1 y Adak, mostraron una fuerte actividad alcohol oxidasa en fuentes de carbono distintas del metanol y se utilizaron para construir sistemas de expresión sin metanol.

la Pla et al. (Biotechnol Prog, 2006, pág. 881-888) describen cepas deP. pastorisMutS y Mut+ para expresar scFv utilizando promotores de AOX e inducción por metanol.

El documento EP1905836A1 divulga cepas de P. pastoris para producir interferón alfa humano recombinante y sugiere utilizar un clon con AOX1 alterado que comprende un gen AOX1 mutado, pero sin una delecion completa del locus AOX1.

Ching-Hsiang Chang et al. (BMC Biotecnology 2018, 18(1):81) sugieren un sistema de inducción flexible de pAOX1 enP. pastorisutilizando células reprogramadas con regulador de expresión de metanol 1 (Mxr1).

Russmayer H. et al. (BMC Biology 2015, 13(1):80) describen la importancia de AOX en la regulación de sistemas de expresión deP. pastoris.

Tomás-Gamisans M. et al. (Microbial Biotecnology 2018, 11 (1):224-237) describen un modelo metabólico a escala del genoma deP. pastorispara mejorar la predicción del metanol o el glicerol como únicas fuentes de carbono.

Moser et al. (Microbial Cell Factories 2017, 16(1):49) describen la evolución adaptativa del laboratorio para mejorar el crecimiento y la producción de proteínas recombinantes enP. pastoris.

La producción de proteínas recombinantes enP. pastorisrequiere un esquema procedimental intenso, lo que lleva a una alta demanda de oxígeno, y producción de calor, demandando una alta concentración de biomasa y consumo de metanol. La transferencia de oxígeno, el enfriamiento y la separación de biomasa en el procesamiento posterior son costosos. Por tanto, es deseable desarrollar procedimientos de baja demanda de oxígeno y producción de calor. Adicionalmente es deseable aumentar el rendimiento de la producción de proteínas, en particular mediante el uso eficiente de una fuente de carbono.

Compendio de la invención

El objetivo de la invención es mejorar la producción de proteínas recombinantes en levaduras metilotróficas.

El objetivo se resuelve mediante el objeto de las reivindicaciones y como se describe más detalladamente en el presente documento.

La invención proporciona una célula anfitriona de levadura metilotrófica (Mut-) con deficiencia en la vía de utilización de metanol recombinante que está diseñada mediante ingeniería genética:

a) mediante una o más modificaciones genéticas para reducir la expresión de un primer y un segundo genes endógenos en comparación con la célula anfitriona antes de dichas una o más modificaciones genéticas, en donde i. el primer gen endógeno codifica la alcohol oxidasa 1 (AOX1) que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:1 o un homólogo de la misma, y

ii. el segundo gen endógeno codifica la alcohol oxidasa 2 (AOX2) que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:3 o un homólogo de la misma,

y

b) mediante una o más modificaciones genéticas para aumentar la expresión de un gen de alcohol deshidrogenasa(ADH2)en comparación con la célula anfitriona antes de dichas una o más modificaciones genéticas, en donde el genADH2codifica una alcohol deshidrogenasa (ADH2).

En concreto, la proteína ADH2 es una alcohol deshidrogenasa clasificada como EC 1.1.1.1.

Como se describe en el presente documento, el término "ADH2" se referirá a una alcohol deshidrogenasa nativa, tal como alcohol deshidrogenasa deP. pastorisque comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 50 (UniProtKB - F2QSX6_KOMPC; FR839629 Genomic DNA Translation: CCA38504.1; gen: PP7435_Chr2-0821), o una secuencia que tiene una cierta homología (o identidad de secuencia) con SEQ ID NO:50. Específicamente, la ADH2 puede originarse a partir de una cepa deP. pastoriso puede ser un homólogo u ortólogo de la misma que se origina naturalmente o es endógeno de una célula de tipo salvaje de un organismo, tal como eucariotas, incluyendo, p. ej., levadura, en particular de una cepa, especie o género de levadura metilotrófica, o que es un mutante de tal dicha ADH2 de origen natural.

Específicamente, la proteína ADH2 es de origen natural o endógena a la especie de la célula anfitriona, o un mutante de la misma.

En concreto, el gen que codifica la alcohol deshidrogenasa deP. pastoris,denominado en el presente documento genADH2,comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO:51, o un polinucleótido (gen) homólogo que codifica ADH2, cuya ADH2 tiene una cierta homología (o identidad de secuencia) con SEQ ID NO:50.

Específicamente, el genADH2es endógeno o heterólogo para la célula anfitriona Mut-. Específicamente, la célula anfitriona Mut- comprende una o más copias de dicho genADH2.

Específicamente, la ADH2 es cualquiera de:

a) una ADH2, que es ADH2 deP. pastorisque comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:50, o un homólogo de la misma que es endógeno para una especie de levadura, en particular levadura metilotrófica; o

b) un mutante de la ADH2 de a), que es al menos 60% idéntico a SEQ ID NO:50.

Las secuencias homólogas también se denominan homólogo de ADH2 u homólogo deADH2.

Los homólogos ilustrativos se describen en la Figura 1:

SEQ ID NO: 52: Secuencia de aminoácidos de ADH2 deKomagataella pastoris,ATCC 28485

SEQ ID NO: 53: Secuencia génica deADH2deKomagataella pastoris,ATCC 28485

SEQ ID NO: 54: Secuencia de aminoácidos de ADH2 deOgataea parapolymorpha,DL-1

SEQ ID NO: 55: Secuencia génica deADH2deOgataea parapolymorpha,DL-1

SEQ ID NO: 56: Secuencia de aminoácidos de ADH2 deOgataea parapolymorpha,DL-1

SEQ ID NO: 57: Secuencia génica deADH2deOgataea parapolymorpha,DL-1

SEQ ID NO: 58: Secuencia de aminoácidos de ADH deOgataea polymorpha,NCYC 495 leu1.1

SEQ ID NO: 59: Secuencia génica deADHdeOgataea polymorpha,NCYC 495 leu1.1

SEQ ID NO:60: Secuencia de aminoácidos de ADH deOgataea polymorpha,NCYC 495 leu1.1

SEQ ID NO: 61: Secuencia génica deADHdeOgataea polymorpha,NCYC 495 leu1.1

SEQ ID NO:62: Secuencia de aminoácidos de ADH2 deSaccharomyces cerevisiae,YJM627

SEQ ID NO: 63: Secuencia génica deADH2deSaccharomyces cerevisiae,YJM627

SEQ ID NO:64: Secuencia de aminoácidos de ADH2 deCandida maltosa,Xu316

SEQ ID NO: 65: Secuencia génica deADH2deCandida maltosa,Xu316

SEQ ID NO:66: Secuencia de aminoácidos de ADH4 deKluyveromyces marxianus,DMKU3-1042 SEQ ID NO: 67: Secuencia génica deADH4deKluyveromyces marxianus,DMKU3-1042

SEQ ID NO:68: Secuencia de aminoácidos de ADH1 deEscherichia coli,7.1982

SEQ ID NO: 69: Secuencia génica deADH1deEscherichia coli,7.1982

SEQ ID NO:70: Secuencia de aminoácidos de ADH1 deFusariumgraminearum,PH-1

SEQ ID NO: 71: Secuencia génica deADH1deFusarium graminearum,PH-1

Específicamente, el homólogo de ADH2 tiene al menos uno cualquiera de 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:50. En el presente documento se entiende que un homólogo deADH2codifica un homólogo de ADH2. Específicamente, la identidad de secuencia se determina como se divulga adicionalmente en el presente documento, por ejemplo, cuando se compara la secuencia de longitud completa.

Específicamente, el homólogo o secuencia homóloga se caracterizan por la misma función cualitativa de la proteína ADH2 en una célula anfitriona de tipo salvaje tal como enP. pastoris,en particularK. pastorisoK. phaffiip. ej., como alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1.).

Específicamente, las secuencias homólogas de SEQ ID NO:50 son de una especie distinta deP. pastoris,en particularK. pastoris o K. phaffii,p. ej., otra levadura del género Komagataella o Pichia, y la expresión de las respectivas secuencias codificantes endógenas aumenta (p. ej., “inserción génica dirigida”) como se describe en el presente documento.

Si la célula anfitriona es deP. pastoris, en particular K. pastorís o K. phaffii,la proteína ADH2 puede comprender o consistir en la secuencia endógena p. ej., SEQ ID NO:50, o un homólogo de SEQ ID NO:50 de una cepa o especie diferente, o una secuencia artificial de una proteína ADH2 mutante, que no se produce de forma natural en una cepa u organismo de tipo salvaje, en particular que no se encuentra naturalmente en una levadura metilotrófica.

Según un ejemplo específico, la secuencia homóloga tiene al menos uno cualquiera de 0,2 veces, 0,3 veces, 0,4 veces, 0,5 veces, 0,6 veces, 0,7 veces, 0,8 veces, 0,9 veces, 1 vez, 1,1 veces, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2 veces o incluso mayor actividad alcohol deshidrogenasa en comparación con la actividad de la alcohol deshidrogenasa deP. pastorisendógena de origen natural enP. pastorisde tipo salvaje. La actividad alcohol deshidrogenasa se puede medir en un ensayo adecuado p. ej., mediante un ensayo de alcohol deshidrogenasa utilizando extractos libres de células. Los extractos libres de células se pueden obtener mediante alteración mecánica del cultivo celular mediante cuentas de circonia/sílice/vidrio como describen Karaoglan et al. (Biotechnol Lett. 2016; 38(3):463-9). La actividad alcohol deshidrogenasa se puede medir después de la formación de NADH midiendo el aumento de la absorción a una longitud de onda de 340 nm como describe Walker (Biochemical Education. 1992 21 (1): 42-43). Se pueden utilizar NAD+ y alcohol como sustratos y se consumen a concentraciones equimolares. La producción de NADH está inversamente correlacionada con el consumo de NAD+. Alternativamente, se puede utilizar un kit de ensayo colorimétrico comercial de actividad alcohol deshidrogenasa (MAK053, Sigma-Aldrich). En la sección de ejemplos se describe en el presente documento ensayo ilustrativo.

Como se describe en el presente documento, el término "AOX1" se referirá a una alcohol oxidasa 1 nativa, tal como alcohol oxidasa 1 deP. pastorisque comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:1 (UniProtKB - F2QY27), o una secuencia que tiene una cierta homología (o identidad de secuencia) con SEQ ID NO:1, que puede ser un homólogo de la alcohol oxidasa 1 deP. pastorisque es endógena para una especie de levadura metilotrófica, en particular que es endógena para la levadura metilotrófica utilizada en el presente documento como célula anfitriona, antes de dichas una o más modificaciones genéticas para reducir la expresión de dicha alcohol oxidasa 1 endógena. En particular la proteína AOX1 es un ortólogo que es endógeno para la especie de la especie de célula anfitriona.

Específicamente, el gen que codifica la alcohol oxidasa 1 deP. pastoris,referida en el presente documento como genAOX1,comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO:2.

Las secuencias homólogas también se denominan homólogo de AOX1 o homólogo deAOX1.Específicamente, la proteína AOX1 u homólogo de AOX1 son una enzima alcohol oxidasa clasificada como EC 1.1.3.13.

Específicamente, el homólogo de AOX1 tiene al menos uno cualquiera de 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1. En el presente documento se entiende que un homólogo deAOX1codifica un homólogo de AOX1. Específicamente, la identidad de secuencia se determina como se divulga adicionalmente en el presente documento, por ejemplo, cuando se compara la secuencia de longitud completa.

Como se describe en el presente documento, el término "AOX2" se referirá a una alcohol oxidasa 2 nativa, tal como alcohol oxidasa 2 deP. pastorisque comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:3 (UniProtKB - F2R038), o una secuencia que tiene una cierta homología (o identidad de secuencia) con SEQ ID NO:3, que puede ser un homólogo de la alcohol oxidasa 2 deP. pastorisque es endógeno de una especie de levadura metilotrófica, en particular que es endógeno de la levadura metilotrófica utilizada en el presente documento como célula anfitriona, antes de dichas una o más modificaciones genéticas para reducir la expresión de dicha alcohol oxidasa 2 endógena. En particular, la proteína AOX2 es un ortólogo endógeno de la especie de la célula anfitriona.

Específicamente, el gen que codifica la alcohol oxidasa 2 deP. pastoris,denominado en el presente documento genAOX2,comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO:4.

Las secuencias homólogas también se denominan homólogo de AOX2 u homólogo deAOX2.Específicamente, la proteína AOX2 u homólogo de AOX2 es una enzima alcohol oxidasa clasificada como EC 1.1.3.13.

Específicamente, el homólogo de AOX2 tiene al menos uno cualquiera de 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:3. En el presente documento se entiende que un homólogo deAOX2codifica un homólogo de AOX2. Específicamente, la identidad de secuencia se determina como se divulga adicionalmente en el presente documento, por ejemplo, cuando se compara la secuencia de longitud completa.

Específicamente, las proteínas AOX1 y/o AOX2 se originan enP. pastoris,en particular se originan enK. pastorisoK. phaffii,si la célula anfitriona esP. pastoris,en particularK. pastorisyK. phaffii,respectivamente. Alternativamente, cada una de las proteínas AOX1 y AOX2 comprende una secuencia homóloga (u ortóloga) de la proteína respectiva deP. pastoris,en particular originada enK. pastorisoK. phaffii,cuya secuencia homóloga (ortóloga) es endógena para una célula anfitriona de tipo salvaje, si es de otro origen o especie. Por ejemplo, si la célula anfitriona esK. phaffii,una proteína AOX1 o AOX2 endógena comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3, respectivamente.

Según otro ejemplo, si la célula anfitriona esK. pastoris,la proteína AOX1 endógena comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 9 (Komagataella pastoris, ATCC 28485), que es 99,85% idéntica a SEQ ID NO: 1.

Según otro ejemplo, si la célula anfitriona esK. pastoris,la proteína AOX2 endógena comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:11, que es 99,40% idéntica a SEQ ID NO:3.

Los homólogos ilustrativos se describen en la Figura 1:

SEQ ID NO:9: Secuencia de aminoácidos AOX1 de Komagataella pastoris, ATCC 28485

SEQ ID NO: 10: Secuencia de nucleótidos deAOX1de Komagataella pastoris, ATCC 28485

SEQ ID NO:11: Secuencia de aminoácidos AOX2 de Komagataella pastoris, ATCC 28485

SEQ ID NO: 12: Secuencia de nucleótidos deAOX2de Komagataella pastoris, ATCC 28485

SEQ ID NO:13: Secuencia de aminoácidos MOD1 de Ogataea metanolica JCM 10240

SEQ ID NO: 14: Secuencia de nucleótidos deMOD1de Ogataea metanolica JCM 10240

SEQ ID NO:15: Secuencia de aminoácidos de MOD2 de Ogataea metanolica JCM 10240

SEQ ID NO: 16: Secuencia de nucleótidos deMOD2de Ogataea metanolica JCM 10240

SEQ ID NO: 17: Secuencia del promotor pMOD1 de Ogataea metanolica JCM 10240

SEQ ID NO:18: Secuencia del promotor pMOD2 de Ogataea metanolica JCM 10240

SEQ ID NO:19: Secuencia de aminoácidos MOX de Ogataea polymorpha NCYC 495 leu 1.1

SEQ ID NO: 20: Secuencia de nucleótidos deMOXde Ogataea polymorpha NCYC 495 leu 1.1

SEQ ID NO:21: Secuencia del promotor pMOX de Ogataea polymorpha NCYC 495 leu 1.1

Sin embargo, si la célula anfitriona es de una especie diferente (distinta deK. pastorisy/oK. phaffii),la secuencia de proteína AOX1 o AOX2 que es endógena para la célula anfitriona es un homólogo de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3, respectivamente, y la expresión de dicho homólogo en la célula anfitriona (la secuencia ortóloga de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3, respectivamente) se reduce para el propósito descrito en el presente documento.

Específicamente, cualquiera o cada una de las secuencias homólogas se caracteriza por la misma función cualitativa de las respectivas proteínas AOX1 y AOX2 en una célula anfitriona de tipo salvaje tal como enP. pastoris,en particularK. pastorisoK. phaffii,p. ej., que la alcohol oxidasa (EC 1.1.3.13).

Específicamente, las respectivas secuencias homólogas de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 son de una especie distinta deP. pastoris, en particular K. pastoris o K. phaffii,p. ej., otra levadura del género Komagataella o Pichia, y la expresión de las respectivas secuencias codificantes endógenas es reducida o abolida (inactivada) como se describe en el presente documento.

Específicamente, ambas proteínas, AOX1 y AOX2, son endógenas para la célula anfitriona y la expresión de los genes que codifican AOX1 y AOX2, respectivamente, está reducida o suprimida.

Específicamente, ambas proteínas, AOX1 y AOX2, son del mismo origen, se originan en, o son endógenas para, la misma célula anfitriona (o especie de célula anfitriona) antes de su modificación genética para reducir la expresión de dichos primer y segundo genes endógenos.

Específicamente, ambas proteínas, AOX1 y AOX2, se originan enP. pastoris,en particular proteínas codificadas por un gen respectivo que es endógeno de la célula anfitriona, en donde la célula anfitriona esP. pastoris.

Específicamente, ambas proteínas, AOX1 y AOX2, se originan enKomagataella phaffii,en particular proteínas codificadas por un gen respectivo que es endógeno de la célula anfitriona, en donde la célula anfitriona esKomagataella phaffii.

Específicamente, ambas proteínas, AOX1 y AOX2, se originan enKomagataella pastoris,en particular proteínas codificadas por un gen respectivo que es endógeno de la célula anfitriona, en donde la célula anfitriona esKomagataella pastoris.

Según un aspecto específico, dichas una o más modificaciones genéticas comprenden una alteración, sustitución, deleción, inserción gécnica dirigida o bloqueo génico dirigido de (i) uno o más polinucleótidos, o una parte de los mismos; o (ii) una secuencia de control de la expresión.

Según un aspecto específico, dichas una o más modificaciones genéticas son de uno o más polinucleótidos endógenos de la célula anfitriona descrita en el presente documento, tales como polinucleótidos codificantes, que incluyen p. ej., dicho polinucleótido (o gen) que codifica la respectiva proteína AOX1, AOX2 o ADH2, en particular la proteína de tipo salvaje (no modificada o nativa), que se produce de forma natural en la especie, tipo o cepa de célula anfitriona, o una secuencia de nucleótidos que controla la expresión de dicho polinucleótido (o gen).

Según un aspecto específico, dichas una o más modificaciones genéticas son de una secuencia de control de la expresión, incluyendo p. ej., un promotor, un sitio de unión al ribosoma, secuencias de inicio y parada de la transcripción o traducción, o de una secuencia potenciadora o activadora.

Se puede emplear una variedad de métodos de ingeniería genética de una célula anfitriona para modular (reducir o aumentar) la expresión de un polinucleótido endógeno, tal como

a) reducir la expresión de un gen que codifica la respectiva proteína AOX1 o AOX2, incluyendo, p. ej., alterar el polinucleótido que codifica la respectiva proteína AOX1 o AOX2, alterar el promotor que está conectado operablemente a tal polinucleótido, reemplazar tal promotor por otro promotor que tenga menor actividad promotora; o

b) aumentar la expresión de un gen que codifica la proteína ADH2, incluyendo, p. ej., introducir un polinucleótido que codifica la proteína ADH2 en el genoma de la célula anfitriona, alterar el promotor que está conectado operablemente a tal polinucleótido, reemplazar tal promotor con otro promotor que tenga mayor actividad promotora.

Los métodos específicos para modificar la expresión génica emplean la modulación (p. ej., activación, regulación por incremento, inactivación, inhibición o regulación por disminución) de secuencias reguladoras que modulan la expresión de un polinucleótido (un gen), tal como el uso de reguladores de transcripción respectivos dirigidos a las secuencias relevantes mediante una ribonucleasa guiada por ARN utilizada en un método basado en CRISPR de modificación de una célula anfitriona, p. ej., secuencias reguladoras seleccionadas del grupo que consiste en promotor, sitios de unión al ribosoma, secuencias de inicio o parada de la transcripción, secuencias de inicio o parada de la traducción, secuencias potenciadoras o activadoras, secuencias represoras o inhibidoras, secuencias señal o líder, en particular aquellas que controlan la expresión y/o la secreción de una proteína.

Según un aspecto específico, dichas una o más modificaciones genéticas incluyen una alteración de ganancia de función en el genADH2que da como resultado un aumento del nivel o actividad de ADH2.

Específicamente, dicha alteración de ganancia de función incluye una inserción dirigida del genADH2.

Específicamente, dicha alteración de ganancia de función regula por incremento laADH2expresión génica en dicha célula.

Específicamente, dicha alteración de ganancia de función incluye una inserción de un casete de expresión heterólogo para expresar en exceso el genADH2en dicha célula.

Específicamente, dicho casete de expresión heterólogo comprende un polinucleótido heterólogo que comprende un genADH2bajo el control de una secuencia promotora. Tal promotor puede ser cualquiera de un promotor constitutivo, reprimible o inducible.

Específicamente, dichas una o más modificaciones genéticas para aumentar la expresión de un gen incluyen una o más mutaciones genómicas que incluyen la inserción o activación de un gen o secuencia genómica que aumenta la expresión de un gen o parte de un gen en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%, o incluso más p. ej., mediante una inserción dirigida de un gen heterólogo, o aumenta el número de copias del gen endógeno, en comparación con el anfitrión respectivo sin tal modificación genética.

Específicamente, las una o más modificaciones genéticas que aumentan la expresión comprenden mutaciones genómicas que mejoran o aumentan constitutivamente la expresión de uno o más polinucleótidos endógenos.

Específicamente, las una o más modificaciones genéticas que aumentan la expresión comprenden mutaciones genómicas que introducen una o más secuencias reguladoras inducibles o reprimibles que mejoran condicionalmente o aumentan de otro modo la expresión de uno o más polinucleótidos endógenos. Tales modificaciones condicionalmente activas se dirigen particularmente a aquellos elementos reguladores y genes que son activos y/o se expresan dependiendo de las condiciones del cultivo celular.

Específicamente, la expresión del polinucleótido que codifica la proteína ADH2 aumenta cuando se utiliza la célula anfitriona en un método para producir una proteína de interés (POI). Específicamente, tras la modificación genética, la expresión de la proteína ADH2 aumenta en las condiciones del cultivo de células anfitrionas durante las cuales se produce la POI.

Específicamente, la célula anfitriona se modifica genéticamente para aumentar la cantidad (p. ej., el nivel, actividad o concentración) de la proteína ADH2, en al menos uno cualquiera de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% (moles/mol), o incluso más, en comparación con la célula anfitriona sin dicha modificación, p. ej., mediante una inserción dirigida de uno o más genesADH2respectivos. Según una realización específica, la célula anfitriona se modifica genéticamente para que comprenda una o más inserciones de (una o más) secuencias genómicas, en particular secuencias genómicas que codifican la proteína ADH2 respectiva, que están integradas en el genoma de la célula anfitriona. Tal célula anfitriona se proporciona típicamente como una cepa con inserción génica dirigida.

Según una realización específica, una vez que la célula anfitriona descrita en el presente documento se cultiva en un cultivo celular, la cantidad total de la proteína ADH2 en la célula anfitriona o cultivo de células anfitrionas se incrementa en al menos uno cualquiera de 50%, 60%, 70% , 80%, 90% o 95%, (% de actividad o moles/mol), o incluso en 100% o más, en comparación con una cantidad de referencia expresada o producida por la célula anfitriona antes o sin tal modificación genética, o comparada con una cantidad de referencia producida en un cultivo de células anfitrionas respectivo, o comparada con la célula anfitriona antes o sin dicha modificación.

Específicamente, dichas una o más modificaciones genéticas para reducir la expresión de un gen, tales como los genesAOX1y/oAOX2,incluyen una o más mutaciones genómicas, incluida la deleción o inactivación de un gen o secuencia genómica que reduce la expresión de un gen o parte de un gen en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%, o incluso suprime por completo su expresión, p. ej., mediante bloqueo dirigido del gen, en comparación con el anfitrión respectivo sin tal modificación genética.

Específicamente, las una o más modificaciones genéticas que reducen la expresión comprenden mutaciones genómicas que constitutivamente perjudican o reducen de otro modo la expresión de uno o más polinucleótidos endógenos.

Específicamente, las una o más modificaciones genéticas que reducen la expresión comprenden mutaciones genómicas que introducen una o más secuencias reguladoras inducibles o reprimibles que condicionalmente deterioran o reducen de otro modo la expresión de uno o más polinucleótidos endógenos. Tales modificaciones condicionalmente activas se dirigen particularmente a aquellos elementos reguladores y genes que son activos y/o se expresan dependiendo de las condiciones del cultivo celular.

Específicamente, la expresión de dichos uno o más polinucleótidos endógenos se reduce reduciendo así la expresión del polinucleótido que codifica la respectiva proteína AOX1 o AOX2 cuando se utiliza la célula anfitriona en un método para producir una proteína de interés (POI). Específicamente, tras la modificación genética, la expresión de ambas proteínas, AOX1 y AOX2, se reduce en las condiciones del cultivo de células anfitrionas durante las cuales se produce la POI.

Específicamente, la célula anfitriona se modifica genéticamente para reducir la cantidad (p. ej., el nivel, actividad o concentración) de las proteínas AOX1 y AOX2, en al menos uno cualquiera de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%, (% de actividad o moles/mol) en comparación con la célula anfitriona sin dicha modificación, o incluso en 100%, p. ej. a una cantidad no detectable, aboliendo así por completo la producción de las proteínas AOX1 y AOX2, p. ej., mediante bloqueo dirigido de los respectivos genesAOX1yAOX2.Según una realización específica, la célula anfitriona se modifica genéticamente para que comprenda una o más deleciones de (una o más) secuencias genómicas, en particular secuencias genómicas que codifican la proteína AOX1 y/o AOX2 respectiva. Tal célula anfitriona se proporciona típicamente como una cepa con deleción o bloqueo génico dirigido.

Según un aspecto específico, dichos primer y/o segundo genes endógenos son bloqueados por dichas una o más modificaciones genéticas. Específicamente, la célula anfitriona Mut- es una cepa con bloqueoAAOX1/AAOX2.

Según un aspecto específico, dichos primer y/o segundo genes endógenos son bloqueados por dichas una o más modificaciones genéticas; y dicho genADH2insertado por dichas una o más modificaciones genéticas. Específicamente, la célula anfitriona Mut- es una cepaAAOX1/AAOX2+ ADH2-OE.

Según una realización específica, una vez que la célula anfitriona descrita en el presente documento se cultiva en un cultivo celular, la cantidad total de la proteína AOX1 y/o AOX2 respectiva en la célula anfitriona o en el cultivo de células anfitrionas se reduce en al menos uno cualquiera de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% (moles/mol), o incluso 100%, p. ej. a una cantidad no detectable, en comparación con una cantidad de referencia expresada o producida por la célula anfitriona antes o sin dicha modificación genética, o en comparación con una cantidad de referencia producida en un cultivo de células anfitrionas respectivo, o en comparación con la célula anfitriona antes de, o sin dicha modificación.

Cuando se compara la célula anfitriona descrita en el presente documento en cuanto al efecto de dicha modificación genética para aumentar o reducir la producción de la proteína ADH2, AOX1 o AOX2 respectiva, típicamente se compara con la célula anfitriona comparable antes de, o sin tal modificación genética. La comparación se realiza típicamente con la misma especie o tipo de célula anfitriona sin (o antes de) tal modificación genética, que está diseñada mediante ingeniería genética para producir la POI recombinante o heterólogo, en particular cuando se cultiva en condiciones para producir dicha POI. Sin embargo, también se puede hacer una comparación con la misma especie o tipo de célula anfitriona que no está diseñada mediante ingeniería genética adicionalmente para producir la POI recombinante o heteróloga.

Según un aspecto específico, el aumento o reducción de la respectiva proteína ADH2, AOX1 o AOX2 están determinados por el aumento o reducción de la cantidad (p. ej., el nivel, actividad o concentración) de la proteína respectiva en la célula. Específicamente, la cantidad de dicha proteína se determina mediante un método adecuado, por ejemplo, empleando Transferencia Western, generación de imágenes por inmunofluorescencia, citometría de flujo o espectrometría de masas, en particular en donde la espectrometría de masas es cromatografía líquidaespectrometría de masas (LC-MS), o cromatografía líquida - espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) p. ej., como describen Doneanu et al. (MAbs. 2012; 4(1): 24-44). Según un ejemplo específico, la actividad alcohol deshidrogenasa se puede medir mediante un ensayo de actividad utilizando extractos libres de células. Los extractos libres de células se pueden obtener mediante alteración mecánica del cultivo celular mediante cuentas de circonia/sílice/vidrio como describen Karaoglan et al. (Biotechnol Lett. 2016; 38(3): 463-9). La actividad alcohol deshidrogenasa se mide siguiendo directamente la formación de NADH midiendo el aumento de la absorción a una longitud de onda de 340 nm como describe Walker (Biochemical Education. 1992 21 (1): 42-43). Se utilizan como sustratos NAD+ y un alcohol y se consumen en concentraciones equimolares. La producción de NADH está inversamente correlacionada con el consumo de NAD+. Alternativamente, se puede utilizar un kit de ensayo colorimétrico comercial de actividad alcohol deshidrogenasa (MAK053, Sigma-Aldrich). La actividad alcohol oxidasa se puede medir calorimétricamente con el ácido 2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico que reacciona con el peróxido de hidrógeno como describen Verduyn et al. (Journal of Microbiological Methods. 1984 (2)1: 15-25) o midiendo la cantidad de formaldehído formado como describen Couder y Baratti (Agric. Bioi. Chem. 1980; 44(10):2279-2289). En el presente documento se describe un ensayo detallado en la sección de ejemplos.

Según un aspecto específico, la célula anfitriona Mut- comprende un gen heterólogo de un casete de expresión de interés (GOIEC) que comprende un promotor de casete de expresión (ECP) conectado operablemente a un gen de interés (GOI) que codifica una proteína de interés (POI).

Según un aspecto específico, la célula anfitriona Mut- es una célula anfitriona recombinante que comprende al menos un GOIEC heterólogo, en donde al menos un componente o combinación de componentes comprendidos en el GOIEC son heterólogos de la célula anfitriona. Específicamente, se utiliza un casete de expresión artificial, en particular en donde el promotor y GOI son heterólogos entre sí y no se presentan en tal combinación en la naturaleza. p. ej., en donde uno cualquiera (o sólo uno) del promotor y el GOI es artificial o heterólogo con respecto al otro y/o con respecto a la célula anfitriona descrita en el presente documento; el promotor es un promotor endógeno y el GOI es un GOI heterólogo; o el promotor es un promotor artificial o heterólogo y el GOI es un GOI endógeno; en donde ambos, el promotor y GOI, son artificiales, heterólogos o de origen diferente, tal como de una especie o tipo (cepa) de células diferentes en comparación con la célula anfitriona descrita en el presente documento. Específicamente, el ECP no está asociada naturalmente y/o no unida operativamente a dicho GOI en la célula que se utiliza como célula anfitriona descrita en el presente documento.

Específicamente, el GOIEC comprende un promotor constitutivo, inducible o reprimible.

Los ejemplos específicos de promotor constitutivo incluyen p. ej., pGAP y sus variantes funcionales, cualquiera de los promotores constitutivos tales como pCS1, publicado en el documento WO2014139608.

Los ejemplos específicos de promotor inducible o reprimible incluyen p. ej., pAOX1 o pAOX2 nativos y sus variantes funcionales, cualquiera de los promotores reguladores, tales como pG1-pG8, y sus fragmentos, publicados en el documento WO2013050551; cualquiera de los promotores reguladores, tales como pG1 y pG1-x, publicados en el documento WO2017021541 A1.

Las secuencias promotoras adecuadas para su uso con células anfitrionas de levadura son descritas por Mattanovich et al. (Methods Mol. Biol. (2012) 824:329-58) e incluyen enzimas glicolíticas como triosafosfato isomerasa (TPI), fosfoglicerato quinasa (PGK), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH o GAP) y variantes de las mismas, lactasa (LAC) y galactosidasa (GAL), promotor de glucosa-6-fosfato isomerasa (PPGI) deP. pastoris,el promotor de 3-fosfoglicerato quinasa (PPGK), el promotor de glicerol aldehído fosfato deshidrogenasa (pGAP), el promotor del factor de alargamiento de la traducción (PTEF) y los promotores de enolasa 1 (PEN01) deP. pastoris,triosa fosfato isomerasa (PTPI), proteínas de las subunidades ribosómicas (PRPS2, PRPS7, PRPS31, PRPL1), el promotor de alcohol oxidasa (PAOX1, PAOX2) o variantes del mismo con características modificadas, el promotor de formaldehído deshidrogenasa (PFLD), el promotor de isocitrato liasa (PICL), el promotor de alfa-cetoisocaproato descarboxilasa (PTHI), promotores de los miembros de la familia de proteínas de choque térmico (PSSA1, PHSP90, PKAR2), 6-Fosfogluconato deshidrogenasa (PGND1), fosfoglicerato mutasa (PGPM1), transcetolasa (PTKL1), fosfatidilinositol sintasa (PPIS1), ferro-02-oxidorreductasa (PFET3), permeasa de hierro de alta afinidad (PFTR1), fosfatasa alcalina reprimible (PPH08), N-miristoil transferasa (PNMT1), factor de transcripción de respuesta a feromonas (PMCM1), ubiquitina (PUBI4) , ADN endonucleasa de hebra sencilla (PRAD2), el promotor del transportador de ADP/ATP principal de la membrana interna mitocondrial (PPET9) (documento WO2008/128701) y el promotor de la formiato deshidrogenasa (FMD).

Otros ejemplos de promotores adecuados incluyen enolasa (ENO1) deSaccharomyces cerevisiae,galactoquinasa (GAL1) deSaccharomyces cerevisiae,alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP) deSaccharomyces cerevisiae, triosa fosfato isomerasa (TPI) deSaccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) deSaccharomyces cerevisiae, y 3-fosfoglicerato quinasa (PGK) deSaccharomyces cerevisiaey el promotor del gen de la maltasa (MAL).

Se prefiere particularmente el promotor GAP (pGAP), AOX1 (pAOX1) o AOX2 (pAOX2) o un promotor que es una variante funcional del mismo y derivado de uno cualquiera de pGAP o pAOX1 o pAOX2. Los promotores pAOX pueden ser inducidos por metanol y reprimidos por glucosa. Específicamente, la variante funcional tiene al menos uno cualquiera de 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de identidad de secuencia con el promotor del que se obtiene, y tiene aproximadamente la misma actividad promotora (p. ej., / - uno cualquiera de 50%, 40%, 30%, 20% o 10%; aunque la actividad del promotor puede mejorarse) en comparación con el promotor del que se obtiene.

Según una realización específica, el ECP es inducible por metanol. En particular, el ECP está controlado por metanol. Específicamente, el ECP puede inducirse completamente en el cultivo celular que contiene metanol. En tal caso, el metanol puede utilizarse no sólo como fuente de energía suministrada al cultivo celular, sino también para inducir la expresión de la POI al inducir el ECP.

Según un aspecto específico, el ECP es inducible por metanol mediante la cantidad de metanol presente en el cultivo celular utilizado como fuente de carbono para producir la POI. Específicamente, la expresión del GOI mediante el casete de expresión heterólogo es inducible por el ECP inducible por metanol.

Específicamente, el ECP es inducible por metanol y p. ej., reprimido en ausencia de una cantidad de metanol que sea menor que uno cualquiera de 0,1%, 0,05% o 0,01% (v/v) en el medio de cultivo celular o sobrenadante (referida en el presente documento como cantidad represora del promotor).

Específicamente, el ECP es inducible por metanol y p. ej., inducido en presencia de una cantidad de metanol que es mayor que la cantidad represora del promotor p. ej., en al menos uno cualquiera de 0,1%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2,0%, 2,5% o 3% (v/v) en el medio de cultivo celular o sobrenadante (referida en el presente documento como cantidad inductora de promotor).

Específicamente, el ECP es inducido completamente por la cantidad de metanol utilizada en el método de cultivo celular descrito en el presente documento. Se considera que el promotor ECP está completamente inducido si las condiciones de cultivo proporcionan aproximadamente una inducción máxima.

Tales cantidades en el medio de cultivo celular o sobrenadante se entienden particularmente como la cantidad que puede ser detectable tras la alimentación de la célula anfitriona y su consumo por parte de la célula anfitriona. Típicamente, cuando se produce una POI durante la fase de producción de un cultivo celular, el cultivo celular se alimenta añadiendo una fuente de carbono complementaria, pero en una cantidad que las células consumen inmediatamente durante la producción de la POI, por lo que no queda nada o solo queda una cantidad baja restante en el medio de cultivo celular o sobrenadante, p. ej. una cantidad de hasta 1,0 g/L.

Específicamente, el ECP es endógeno o heterólogo con respecto a la célula anfitriona.

Específicamente, el ECP es uno cualquiera de los siguientes:

a) un promotor pAOX1 que comprende o consiste en al menos uno cualquiera de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:5; o

b) un promotor pAOX2 que comprende o consiste en al menos uno cualquiera de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:6; o

c) un promotor que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:36-49.

Específicamente, se puede utilizar cualquiera de los promotores inducibles por metanol que se enumeran en la Tabla 38, en particular aquellos que comprenden o consisten en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:36-49.

Las variantes funcionales de los promotores pAOX1 y pAOX2 caracterizadas por una identidad de secuencia de al menos 60% se ilustran mediante los promotores inducibles por metanol ilustrativos que se describen con más detalle en el presente documento. Por ejemplo, SEQ ID NO:17 (secuencia promotora pMOD1 deOgataea methanolicaJCM 10240) tiene una identidad de secuencia de 54,0% en comparación con SEQ ID NO:5; y SEQ ID NO: 18 (secuencia del promotor pMOD2 deOgataea methanolicaJCM 10240) tiene una identidad de secuencia de 53,7% en comparación con SEQ ID NO:6. La identidad de secuencia del promotor pMOD1 y pMOD2 en comparación con el promotor pAOX1 y pAOX2 respectivo se determinó mediante alineamiento utilizando LALIGN versión 36.3.8g, diciembre de 2017; los resultados se refieren a secuencias alineadas con la misma orientación de secuencia y el mayor solapamiento (Parámetros: Matriz: 5/-4; APERTURA DE ESPACIO: -5; Extensión de Espacio: -4; E() Umbral 10,0; Formato de salida: MARKX 0; Gráficos: Sí).

En la Tabla 38 se enumeran ejemplos adicionales de promotores inducibles por metanol, o pSHB17, pALD4, pFDHI, pDASI, pDAS2, pPMP20, pFBA1-2 pPMP47, pFLD, pFGH1, pTAL1-2, pDAS2, pCAM1, pPP7435_Chr1-0336 como describen Gasser.et al.(Gasser, Steiger y Mattanovich, 2015, Microb Cell Fact. 14: 196).

Como se describe en el presente documento, el término "pAOX1" se referirá tanto a un promotor que comprende la secuencia identificada como SEQ ID NO:5, como a una secuencia que tiene una cierta homología (o identidad de secuencia) con SEQ ID NO:5. La secuencia homóloga también se denomina homólogo de pAOX1. El homólogo de pAOX1 puede ser una secuencia nativa de origen natural o un mutante de la misma. p. ej., producido mediante cualquier método adecuado de mutagénesis.

Como se describe en el presente documento, el término "pAOX2" se referirá tanto a un promotor que comprende la secuencia identificada como SEQ ID NO:6, como a una secuencia que tiene una cierta homología (o identidad de secuencia) con SEQ ID NO:6. La secuencia homóloga también se denomina homólogo de pAOX2. El homólogo de pAOX2 puede ser una secuencia nativa de origen natural o un mutante de la misma. p. ej., producido mediante cualquier método adecuado de mutagénesis.

Un mutante pAOX1 o pAOX2 descrito en el presente documento se caracteriza específicamente por una fuerza del promotor que es de aproximadamente 0,5 veces a al menos una cualquiera de 1,1 veces, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2 veces, 2,1 veces, 2,2 veces, 2,3 veces, 2,4 veces, 2,5 veces, 2,6 veces, 2,7 veces, 2,8 veces, 2,9 veces, 3 veces, 3,3 veces, 3,5 veces, 3,8 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 5,5 veces o al menos 6 veces mayor en comparación con el respectivo promotor nativo pAOX1 o pAOX2 cuando está en el estado inducido, según se determina en un sistema de expresión comparable o línea celular anfitriona de producción.

Específicamente, la fuerza del promotor está determinada por el nivel de expresión de una POI, tal como una proteína modelo (p. ej., proteína de fluorescencia verde, GFP, que incluye p. ej., GFP mejorada, eGFP, Núm. Acceso Genbank U57607), y/o la fuerza de transcripción, en comparación con el promotor de referencia. Preferiblemente, el análisis de transcripción es cuantitativo o semicuantitativo, empleando preferiblemente qRT-PCR, micromatrices de ADN, secuenciación de ARN y análisis de transcriptoma.

Específicamente, la célula anfitriona recombinante descrita en el presente documento comprende sólo uno o múltiples GOIEC heterólogos, p. ej. múltiples copias de dichos casetes de expresión, tales como al menos 2, 3, 4 o 5 copias (número de copias del gen, GCN). Por ejemplo, la célula anfitriona recombinante comprende hasta 2, 3, 4 o cinco copias. Cada una de las copias puede comprender o consistir en la misma o diferente secuencia, pero incluye el ECP conectado operativamente al GOI.

Según un aspecto específico, el casete de expresión heterólogo está comprendido en un vector o plásmido que replica de forma autónoma, o está integrado dentro de un cromosoma de dicha célula anfitriona.

El casete de expresión puede introducirse en la célula anfitriona e integrarse en el genoma de la célula anfitriona (o cualquiera de sus cromosomas) como elemento intracromosómico. p. ej., en un sitio de integración específico o integrado aleatoriamente, tras lo cual se selecciona una línea celular anfitriona de alta producción. Alternativamente, el casete de expresión puede integrarse dentro de un elemento genético extracromosómico, tal como un plásmido o un cromosoma artificial, p. ej., un cromosoma artificial de levadura (YAC). Según un ejemplo específico, el casete de expresión se introduce en la célula anfitriona mediante un vector, en particular un vector de expresión, que se introduce en la célula anfitriona mediante una técnica de transformación adecuada. Para ello, el GOI puede ligarse a un vector de expresión.

Un vector de expresión en levadura preferido (que se utiliza preferiblemente para la expresión en levadura) se selecciona del grupo que consiste en plásmidos derivados de pPICZ, pGAPZ, pPIC9, pPICZalfa, pGAPZalfa, pPIC9K, pGAPHis, pPUZZLE o GoldenPiCs.

Los mecanismos para transfectar o transformar células anfitrionas para introducir un vector o plásmido son bien conocidos en la técnica. Estos pueden incluir electroporación, esferoplastia, captación mediada por vesículas lipídicas, captación mediada por choque térmico, transfección mediada por fosfato cálcico (co-precipitación de fosfato cálcico/ADN), infección viral y, en particular, el uso de virus modificados tales como, por ejemplo, adenovirus modificados, microinyección y electroporación.

Los transformantes que se describen en el presente documento se pueden obtener introduciendo el casete de expresión, vector o ADN plasmídico en un anfitrión y seleccionando transformantes que expresen la proteína o marcador de selección relevantes. Las células anfitrionas pueden tratarse para introducir ADN heterólogo o foráneo mediante métodos utilizados convencionalmente para la transformación de células anfitrionas, tales como el método del pulso eléctrico, el método del protoplasto, el método del acetato de litio y métodos modificados de los mismos.P. pastorisse transforma preferiblemente mediante electroporación. Los métodos de transformación preferidos para la absorción del fragmento de ADN recombinante por el microorganismo incluyen transformación química, electroporación o transformación mediante protoplastación.

Según un aspecto específico, el GOIEC heterólogo descrito en el presente documento comprende o consiste en una fusión artificial de polinucleótidos, incluido el ECP conectado operablemente al GOI, y opcionalmente secuencias adicionales, tales como una secuencia señal, líder o terminadora.

Específicamente, el casete de expresión comprende el ECP conectado operablemente al GOI, y opcionalmente comprende adicionalmente secuencias señal y líder, según sea necesario para expresar y producir la POI como una proteína secretada.

Según un aspecto específico, el GOIEC comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que permite la secreción de la POI.

Específicamente, la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal está fusionada adyacente al extremo 5' del GOI.

Específicamente, el péptido señal se selecciona del grupo que consiste en secuencias señal del prepropéptido del factor de apareamiento alfa de S.cerevisiae,los péptidos señal del gen de la fosfatasa ácida (PHO1) deP. pastorisy la proteína X extracelular (EPX1) (Heiss, S., V. Puxbaum, C. Gruber, F. Altmann, D. Mattanovich y B. Gasser, Microbiology 2015; 161(7): 1356-68).

Específicamente, se puede utilizar cualquiera de las secuencias señal y/o líder que se describe en el documento WO2014067926 A1, en particular SEQ ID NO:22 o SEQ ID NO:23.

Específicamente, se puede utilizar las secuencias señal que se describen en el documento WO2012152823 A1, en particular la secuencia señal del factor de apareamiento alfa nativo de S.cerevisiaeidentificada como SEQ ID NO:24, o mutantes de la misma.

Según un aspecto específico, la célula anfitriona descrita en el presente documento puede sufrir una o más modificaciones genéticas adicionales. p. ej., para mejorar la producción de proteínas.

Específicamente, la célula anfitriona se diseña mediante ingeniería genética adicionalmente para modificar uno o más genes que influyen en la actividad proteolítica utilizados para generar cepas con deficiencia de proteasa, en particular una cepa con deficiencia de la actividad carboxipeptidasa Y. Los ejemplos particulares se describen en el documento WO1992017595A1. Otros ejemplos de una cepa de Pichia con deficiencia de proteasa con una deficiencia funcional de una proteasa vacuolar, tal como proteinasa A o proteinasa B, se describen en el documento US6153424A. Se proporcionan otros ejemplos de las cepas de Pichia que tienen una deleciónade2y/o deleciones de uno o ambos genes de proteasa,pep4yPRB1,p. ej., por ThermoFisher Scientific.

Específicamente, la célula anfitriona está diseñada mediante ingeniería genética para modificar al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto génico funcional, en particular una proteasa, seleccionada del grupo que consiste en PEP4, PRB1, YPS1, Y<p>S2, YMP1, YMP2, YMP1, DAP2, GRHI, PRD1, YSP3 y PRB3, como se divulga en el documento WO2010099195A1.

La expresión de manera anormalmente alta o la expresión de manera anormalmente baja de genes que codifican factores auxiliares se aplica específicamente para mejorar la expresión de un GOI, p. ej. como se describe en el documento WO2015158800A1.

La POI puede ser uno cualquiera de péptidos, polipéptidos, proteínas o metabolitos eucarióticos, procarióticos o sintéticos de una célula anfitriona.

Según un aspecto específico, la POI es heteróloga con respecto a la célula anfitriona Mut o al ECP.

Específicamente, la POI es heteróloga con respecto a la especie de célula anfitriona.

Específicamente, la POI es un péptido, polipéptido o proteína secretados, es decir, secretados por la célula anfitriona al sobrenadante del cultivo celular.

Específicamente, la POI es una proteína eucariótica, preferiblemente una proteína derivada de, o relacionada con mamífero tal como una proteína humana o una proteína que comprende una secuencia de proteína humana, o una proteína bacteriana o proteína derivada de bacterias.

Preferiblemente, la POI es una proteína terapéutica que funciona en mamíferos.

En casos específicos, la POI es una proteína multimérica, específicamente un dímero o tetrámero.

Específicamente, la POI es un péptido o proteína seleccionados del grupo que consiste en una proteína de unión a antígeno, una proteína terapéutica, una enzima, un péptido, un antibiótico proteico, una proteína de fusión de toxina, un producto conjugado de carbohidrato-proteína, una proteína estructural, una proteína reguladora, un antígeno de vacuna, un factor de crecimiento, una hormona, una citocina, una enzima de procedimiento.

Específicamente, la proteína de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en

a) anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, tales como cualquiera de los anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos biespecíficos, Fab, Fd, scFv, dianticuerpos, trianticuerpos, tetrámeros de Fv, minianticuerpos, anticuerpos de dominio único como VH, VHH, IgNAR o V-NAR;

b) miméticos de anticuerpos, tales como Adnectinas, Aficuerpos, Afilinas, Afímeros, Afitinas, Alfacuerpos, Anticalinas, Avímeros, DARPins, Finómeros, péptidos de dominio Kunitz, Monoanticuerpos o NanoCLAMPS; o

c) proteínas de fusión que comprenden uno o más dominios de plegamiento de inmunoglobulinas, dominios de anticuerpos o miméticos de anticuerpos.

Una POI específica es una molécula de unión a antígeno tal como un anticuerpo, o un fragmento del mismo, en particular un fragmento de anticuerpo que comprende un dominio de unión a antígeno. Entre las POI específicas se encuentran anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales (mAb), inmunoglobulina (Ig) o inmunoglobulina de clase G (IgG), anticuerpos de cadena pesada (HcAb) o fragmentos de los mismos, tales como la unión de fragmentoantígeno (Fab), Fd, fragmento variable de cadena sencilla (scFv), o variantes diseñadas mediante ingeniería genética del mismo tales como, por ejemplo, dímeros de Fv (dianticuerpos), trímeros de Fv (trianticuerpos), tetrámeros de Fv o minianticuerpos y anticuerpos de dominio único como VH, VHH, IgNAR o V-NAR, o cualquier proteína que comprenda un dominio de plegamiento de inmunoglobulina. Se pueden seleccionar otras moléculas de unión a antígeno entre miméticos de anticuerpos o proteínas armazón (alternativas) tales como p. ej., dominios Kunitz diseñados mediante ingeniería genética, Adnectinas, Aficuerpos, Afilinas, Anticalinas o DARPins.

Según un aspecto específico, la POI es p. ej., BOTOX, Myobloc, Neurobloc, Dysport (u otros serotipos de neurotoxina botulínica), alglucosidasa alfa, daptomicina, YH-16, coriogonadotropina alfa, filgrastim, cetrorelix, interleucina-2, aldesleucina, teceleulina, denileucina diftitox, interferón alfa-n3 (inyectable), interferón alfa-nl, DL-8234, interferón, Suntory (gamma-1a), interferón gamma, timosina alfa 1, tasonermina, DigiFab, ViperaTAb, EchiTAb, CroFab, nesiritida, abatacept, alefacept, Rebif, eptoterminalfa, teriparatida (osteoporosis) , calcitonina inyectable (enfermedad ósea), calcitonina (nasal, osteoporosis), etanercept, hemoglobina glutámero 250 (bovina), drotrecogina alfa, colagenasa, carperitida, factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (gel tópico, cicatrización de heridas), DWP401, darbepoetina alfa, epoetina omega, epoetina beta, epoetina alfa, desirudina, lepirudina, bivalirudina, nonacog alfa, mononina, eptacog alfa (activado), factor VIII recombinante VWF, Recombinate, factor VIII recombinante, factor VIII (recombinante), alfnmate, octocog alfa, factor VIII, palifermina, indiquinasa, tenecteplasa, alteplasa, pamiteplasa, reteplasa, nateplasa, monteplasa, folitropina alfa, rFSH, hpFSH, micafungina, pegfilgrastim, lenograstim, nartograstim, sermorelina, glucagón, exenatida, pramLintida, iniglucerasa, galsulfasa, Leucotropina, molgramostirn, acetato de triptorelina, histrelina (implante subcutáneo, Hydron), deslorelina, histrelina, nafarelina, leuprolida de liberación sostenida de depósito (ATRIGEL), implante de leuprolida (DUROS), goserelina, Eutropin, programa KP-102, somatropina, mecasermina (fallo de crecimiento), enlfavirtida, Org-33408, insulina glargina, insulina glulisina, insulina (inhalada), insulina lispro, insulina deternir, insulina (bucal, RapidMist), rinfabato de mecasermina, anakinra, celmoleukin, 99 mTc-apcitida inyectable, mielopida, Betaseron, acetato de glatiramero, Gepon, sargramostim, oprelvekin, interferones alfa derivados de leucocitos humanos, Bilive, insulina (recombinante), insulina humana recombinante, insulina aspart, mecasenina, Roferon-A, interferón-alfa 2, Alfaferona, interferón alfacón-1, interferón alfa, hormona luteinizante humana recombinante de Avonex , dornasa alfa, trafermina, ziconotida, taltirelina, diboterminalfa, atosiban, becaplermina, eptifibatida, Zemaira, CTC-111, Shanvac-B, vacuna contra el VPH (cuadrivalente), octreotida, lanreotida, ancestirna, agalsidasa beta, agalsidasa alfa, laronidasa, prezatida de cobre acetato (gel tópico), rasburicasa, ranibizumab, Actimmune, PEG-Intron, Tricomin, inyectable recombinante de desensibilización para la alergia a los ácaros del polvo doméstico, hormona paratiroidea humana (PTH) recombinante 1-84 (sc, osteoporosis), epoetina delta, antitrombina III transgénica, granditropina, Vitrasa, insulina recombinante, interferón alfa (pastilla oral), GEM-21S, vapreótida, idursulfasa, omnapatrilato, albúmina sérica recombinante, certolizumab pegol, glucarpidasa, inhibidor de la esterasa C1 recombinante humana (angioedema), lanoteplasa, hormona de crecimiento humana recombinante, enfuvirtida (inyectable sin aguja, Biojector 2000), VGV-1, interferón (alfa), lucinactant, aviptadil (inhalado, enfermedad pulmonar), icatibant, ecallantide, omiganan, Aurograb, pexigananacetate, ADI-PEG-20, LDI-200, degarelix , cintredelinbesudotox, Favld, MDX-1379, ISAtx-247, liraglutida, teriparatida (osteoporosis), tifacogina, AA4500, loción liposómica T4N5, catumaxomab, DWP413, ART-123, crisalina, desmoteplasa, amediplasa, corifolitropinalfa, TH-9507, tedug lutida, Diamyd, DWP-412, hormona del crecimiento (inyección de liberación sostenida), G-CSF recombinante, insulina (inhalada, AIR), insulina (inhalada, Technosphere), insulina (inhalada, AERx), RGN-303, DiaPep277, interferón beta (infección viral por hepatitis C (VHC)), interferón alfan3 (oral), belatacept, parches transdérmicos de insulina, AMG-531, MBP-8298, Xerecept, opebacan, AIDSVAX, GV-1001, LymphoScan, ranpirnasa, Lipoxysan, lusupultide, MP52 (portador de beta-fosfato tricálcico, regeneración ósea), vacuna contra el melanoma, sipuleucel-T, CTP-37, Insegia, vitespen, trombina humana (congelada, sangrado quirúrgico), trombina, TransMID, alfimeprasa, Puricase, terlipresina (intravenosa, síndrome hepatorrenal), EUR-1008M, FGF-I recombinante (inyectable, enfermedad vascular), BDM-E, rotigaptida, ETC-216, P-113, MBI-594AN, duramicina (inhalada, fibrosis quística), SCV-07, OPI-45, Endostatina, Angiostatina, ABT-510, producto concentrado inhibidor de Bowman Birk, XMP-629, 99 mTc-Hynic-Annexin V, kahalalide F, CTCE-9908, teverelix (liberación prolongada), ozarelix, rornidepsina, BAY-504798, interleucina4, PRX-321, Pepscan, iboctadekin, rlactoferrina, TRU-015, IL-21, ATN-161, cilengitida, Albuferón, Biphasix, IRX-2, interferón omega, PCK-3145,<c>A<p>-232, pasireotida, huN901-DMI, vacuna inmunoterapéutica contra el cáncer de ovario, SB-249553, Oncovax-CL, OncoVax-P, BLP-25, CerVax-16, vacuna contra el melanoma con péptidos multiepitópicos (MART-1, gp100, tirosinasa), nemifitida, rAAT (inhalada), rAAT (dermatológica), CGRP (inhalado, asma), pegsunercept, timosinbeta4, plitidepsina, GTP-200, ramoplanina, GRASPA, OBI-1, AC-100, calcitonina de salmón (oral, eligen), calcitonina (oral, osteoporosis), examorelina, capromorelina, Cardeva, velafermina, 131I-TM-601, KK-220, T-10, ularitida, depelestat, hematida, crisalina (tópica), rNAPc2, factor V111 recombinante (liposomal PEGilado), bFGF, variante de estafilocinasa recombinante PEGilada, V-10153, SonoLysis Prolyse, NeuroVax, CZEN-002, terapia de neogénesis de células de los islotes, rGLP-1, BIM-51077, LY-548806, exenatida (liberación controlada, Medisorb), AVE-0010, GA-GCB, avorelina, ACM-9604, acetato de linaclotida, CETi-1, Hemospan, VAL (inyectable), insulina de acción rápida (inyectable, Viadel), insulina intranasal, insulina (inhalada), insulina (oral, eligen), metionil leptina humana recombinante, inyección subcutánea de pitrakinra, eccema) , pitrakinra (polvo seco para inhalación, asma), Multikine, RG-1068, MM-093, NBI-6024, AT-001, PI-0824, Org-39141, Cpn10 (enfermedades autoinmunitarias/inflamación), talactoferrina (tópica), rEV -131 (oftálmico), rEV-131 (enfermedad respiratoria), insulina humana recombinante oral (diabetes), RPI-78M, oprelvekin (oral), CYT-99007 CTLA4-Ig, DTY-001, valategrast, interferón alfa-n3 (tópico), IRX-3, RDP-58, Tauferon, lipasa estimulada por sales biliares, Merispasa, fosfatasa alalina, EP-2104R, Melanotan-II, bremelanotida, ATL-104, microplasmina humana recombinante,<a>X-200, SEMAX, ACV-1, Xen-2174, CJC-1008, dinorfina A, SI-6603, LAB GHRH, AER-002, BGC-728, vacuna contra la malaria (virosomas, PeviPRO), ALTU-135, vacuna contra el parvovirus B19, vacuna contra la influenza (neuraminidasa recombinante), Vacuna contra la malaria/VHB, vacuna contra el ántrax, Vacc-5q, Vacc-4x, vacuna contra el VIH (oral), vacuna contra el VPH, Tat Toxoid, YSPSL, CHS-13340, crema liposomal PTH(1-34) (Novasome), Ostabolin-C, análogo de PTH (tópico, psoriasis), MBRI-93.02, vacuna MTB72F (tuberculosis), vacuna MVA-Ag85A (tuberculosis), FARA04, BA-210, vacuna recombinante FIV contra la peste, AG-702, OxSODrol, rBetV1, vacuna dirigida al alérgeno Der-p1/Der-p2/Der-p7 (alergia a los ácaros del polvo), antígeno peptídico PR1 (leucemia), vacuna ras mutante, vacuna contra el lipopéptido E7 del VPH-16, vacuna anti-labyrinthin (adenocarcinoma), vacuna contra la LMC, vacuna contra el péptido WT1 (cáncer), IDD-5, CDX-110, Pentrys, Norelin, CytoFab, P-9808, VT-111, icrocaptida, telbermin (dermatológico, úlcera del pie diabético), rupintrivir, reticulosa, rGRF, HA, alfa-galactosidasa A, ACE-011, a Lt U-140, CGX-1160, vacuna terapéutica de angiotensina, D-4F, ETC-642, APP-018, rhMBL, SCV-07 (oral, tuberculosis), D<r>F-7295, A<b>T-828, inmunotoxina específica de ErbB2 (anticancerosa), DT3SSIL-3, TST-10088, PRO-1762, Combotox, péptidos de unión al receptor de colecistoquinina-B/gastrina, 111 lnhEGF, AE-37, trasnizumab-DM1, antagonista G, iL-12 (recombinante), PM-02734 , IMP-321, rhlGF-BP3, BLX-883, CUV-1647 (tópico), agentes radioinmunoterapéuticos basados en L-19 (cáncer), Re-188-P-2045, AMG-386, vacuna DC/1540/k Lh (cáncer), VX-001, AVE-9633, AC-9301, vacuna NY-ESO-1 (péptidos), péptidos NA17.A2, vacuna contra el melanoma (terapia con antígeno pulsado), vacuna contra el cáncer de próstata, CBP-501, lactoferrina humana recombinante (ojo seco), FX-06, AP-214, WAP-8294A (inyectable), ACP-HIP, Su N-11031, péptido YY [3-36] (obesidad, intranasal), FGLL, atacicept, BR3-Fc, BN-003, BA-058, hormona paratiroidea humana 1-34 (nasal, osteoporosis), F-18-CCR1, AT-1100 (enfermedad celíaca/diabetes), JPD-003, crema liposomal PTH(7-34) (Novasome), duramicina (oftálmica, ojo seco), CAB-2, CTCE-0214, eritropoyetina GlicoPEGilada, EPO-Fc, CNTO-528, AMG-114, JR-013, Factor XIII, aminocandina, PN-951, 716155, SUN-E7001, TH-0318, BAY-73-7977, teverelix (liberación inmediata), EP-51216, hGH (liberación controlada, Biosphere), OGP-I, sifuvirtida, TV4710, ALG-889, Org-41259, rhCC10, F-991, timopentina (enfermedades pulmonares), r(m)CRP, insulina hepatoselectiva, subalina, proteína de fusión L19-IL-2, elafina, NMK-150,<a>L<t>U-139, EN-122004, rhTPO, agonista del receptor de trombopoyetina (trastornos trombocitopénicos), AL-108, AL-208, antagonistas del factor de crecimiento nervioso (dolor),<s>L<v>-317, CGX-1007, INNO-105, teriparatida oral (eligen), GEM-OS1, AC-162352, PRX-302, vacuna de fusión LFn-p24 (Therapore), EP-1043, vacuna pediátrica contra S. pneumoniae, vacuna contra la malaria, vacuna contra Neisseria meningitidis grupo B, vacuna neonatal contra estreptococos del grupo B, vacuna contra el ántrax, vacuna contra el VHC (gpE1+gpE2+MF-59), terapia para la otitis media, vacuna contra el VHC (antígeno central ISCOMATRIX), hPTH(1-34) (transdérmica, ViaDerm), 768974, SYN-101, PGN-0052, aviscumnina, BIM-23190, vacuna contra la tuberculosis, péptido tirosinasa multiepitópico, vacuna contra el cáncer, enkastim, APC-8024, GI-5005, ACC-001, TTS-CD3, TNF vascular dirigido (tumores sólidos), desmopresina (liberación controlada bucal), onercept o TP-9201, adalimumab (HUMIRA), infliximab (REMICADE™), rituximab (RITUXAN™/MAB THERA™), etanercept (ENBREL™), bevacizumab (AVASTIN™), trastuzumab (HERCEPTIN™), pegrilgrastim (NEULASTA™), o cualquier otra POI adecuada, incluidos biosimilares y biomejores.

Según un aspecto específico, se aísla un producto de fermentación del cultivo celular, cuyo producto de fermentación comprende la POI o un metabolito de la célula anfitriona obtenido a partir de la célula anfitriona Mut-.

Según un aspecto específico, la célula anfitriona Mut- es una célula de levadura del género Pichia, Komagataella, Hansenula, Ogataea o Candida.

Específicamente, la célula anfitriona Mut- se origina a partir de una cepa que es de una levadura seleccionada del grupo que consiste en una especie de Pichia, tal comoPichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri,yPichia angusta; especies de Komagataella, comoKomagataella pastoris, Komagataella pseudopastorisoKomagataella phaffii,especies de Hansenula, comoHansenula polymorpha,especies de Ogataea, comoOgataea polymorpha,oOgataea parapolymorpha,y especies de Candida, comoCandida utilis, Candida cacaoi,yCandida boidini.

La especie preferida esPichia pastoris.Específicamente, la célula anfitriona es una cepa dePichia pastorisseleccionada del grupo que consiste en CBS 704, CBS 2612, CBS 7435, CBS 9173-9189, DSMZ 70877, X-33, GS115, KM71, KM71H y SMD1168.

Fuentes: CBS 704 (=NRRL Y-1603 = DSMZ 70382), CBS 2612 (=NRRL Y-7556), CBS 7435 (=NRRL Y-11430), CBS 9173-9189 (cepas CBS: CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Centraalbureau voor Schimmelculturen, Utrecht, Países Bajos) y DSMZ 70877 (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares); cepas de Invitrogen, tales como X-33, GS115, KM71, KM71H y SMD1168.

Según un aspecto específico, la invención proporciona un método para producir una proteína de interés (POI) que comprende cultivar una célula anfitriona Mut- descrita en el presente documento utilizando metanol como fuente de carbono para producir la POI, en particular tales cantidades de metanol para su uso como fuente de energía, no (sólo) para la inducción por metanol de un ECP.

Según un aspecto específico, el método comprende cultivar la célula anfitriona Mut- utilizando metanol como fuente de carbono para producir la POI, cuya célula anfitriona Mut- comprende un casete de expresión del gen de interés heterólogo (GOIEC) que comprende un promotor del casete de expresión (ECP) conectado operablemente a un gen de interés (GOI) que codifica una proteína de interés (POI), en donde la célula anfitriona Mut- está diseñada mediante una o más modificaciones genéticas para reducir la expresión de un primer y un segundo genes endógenos en comparación con la célula anfitriona antes de dichas una o más modificaciones genéticas, en donde

a) el primer gen endógeno codifica la alcohol oxidasa 1 (AOX1) que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:1 o un homólogo de la misma, y

b) el segundo gen endógeno codifica la alcohol oxidasa 2 (AOX2) que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:3 o un homólogo de la misma.

Específicamente, la célula anfitriona Mut- se cultiva utilizando metanol como única fuente de carbono o en una mezcla con otras fuentes de carbono (o carbohidratos), en particular como fuente de energía, tal como para el crecimiento y/o la producción de POI (síntesis).

Específicamente, tal otra fuente de carbono (también denominada en el presente documento "fuente de carbono distinta de metanol" es un carbohidrato.

Específicamente, la fuente de carbono distinta del metanol se selecciona entre sacáridos, polioles, alcoholes o mezclas de uno cualquiera o más de los anteriores.

Específicamente, los sacáridos pueden ser uno cualquiera o más de monosacáridos, tales como una hexosa, p. ej., glucosa, fructosa, galactosa o mañosa, o disacáridos, tales como sacarosa; o un alcohol o poliol p. ej., etanol, o cualquier diol, o triol, p. ej., glicerol, o una mezcla de cualquiera de los anteriores. Además de la cantidad de metanol utilizada como fuente de carbono como se describe en el presente documento, se puede utilizar adicionalmente en el cultivo celular cualquier fuente de carbono distinta del metanol en una cantidad para producir dicha POI.

Según una realización específica, se cultiva una línea celular de la célula anfitriona Mut-.

Específicamente, la línea celular se cultiva en condiciones de cultivo discontinuo, por lotes alimentados o continuo. El cultivo se puede realizar en placas de microtitulación, matraces de agitación o un biorreactor, y opcionalmente comenzando con una fase discontinua como primera etapa, seguida de una fase por lotes alimentados o una fase de cultivo continua como segunda etapa.

Según un aspecto específico, el método descrito en el presente documento comprende una fase de crecimiento y una fase de producción.

Específicamente, el método comprende las etapas:

a) cultivar la célula anfitriona en condiciones de expansión (fase de expansión o "fase de crecimiento"); y una etapa más

b) cultivar la célula anfitriona en condiciones limitantes del crecimiento en presencia de metanol como fuente de carbono (fase de producción), durante el cual el GOI se expresa para producir dicha POI.

Específicamente, la segunda etapa b) sigue a la primera etapa a).

Específicamente,

a) una fase de crecimiento, durante la cual la célula anfitriona Mut- se cultiva utilizando una fuente de carbono basal como fuente de energía; está seguida por

b) una fase de producción, durante la cual la célula anfitriona Mut- se cultiva utilizando una alimentación de metanol produciendo así la POI.

Específicamente, la célula anfitriona se cultiva en la primera etapa en condiciones de crecimiento en un medio de cultivo celular que comprende la primera fuente de carbono. p. ej. en una cantidad suficiente para permitir el crecimiento de la célula anfitriona en cultivo celular, opcionalmente hasta que se consuma la cantidad de la fuente de carbono, y el cultivo adicional puede realizarse en condiciones limitantes del crecimiento.

Específicamente, la segunda fuente de carbono es metanol y opcionalmente una o más fuentes de carbono adicionales (distintas del metanol), denominándose dicha segunda fuente de carbono fuente de carbono complementaria.

Específicamente, dicha fuente de carbono basal y/o fuente de carbono complementaria (además de metanol) se pueden seleccionar entre sacáridos, polioles, alcoholes o mezclas de uno cualquiera o más de los anteriores.

Según una realización específica, la fuente de carbono basal es diferente de la fuente de carbono complementaria, p. ej. cuantitativa y/o cualitativamente diferentes. La diferencia cuantitativa típicamente prevé que las diferentes condiciones repriman o induzcan la actividad del promotor de ECP.

Según una realización específica adicional, las fuentes de carbono basal y complementaria comprenden el mismo tipo de moléculas o carbohidratos, preferiblemente a diferentes concentraciones. Según una realización específica adicional, la fuente de carbono es una mezcla de dos o más fuentes de carbono diferentes.

Se puede utilizar cualquier tipo de fuente de carbono orgánico, en particular las utilizadas típicamente para el cultivo de células anfitrionas, en particular para el cultivo de células anfitrionas eucarióticas. Según una realización específica, la fuente de carbono es una hexosa, tal como glucosa, fructosa, galactosa o manosa, un disacárido, tal como sacarosa, un alcohol, tal como glicerol o etanol, o una mezcla de los mismos.

Según una realización específicamente preferida, la fuente de carbono basal se selecciona del grupo que consiste en glucosa, glicerol, etanol o mezclas de los mismos. Según una realización preferida, la fuente de carbono basal es glicerol.

Según una realización específica adicional, la fuente de carbono complementaria comprende (además de metanol) una hexosa tal como glucosa, fructosa, galactosa y manosa, un disacárido, tal como sacarosa, un alcohol, tal como glicerol o etanol, o una mezcla de los mismos. Según una realización preferida, la fuente de carbono complementaria comprende glucosa además de metanol.

Ambas etapas de cultivo comprenden específicamente cultivar la línea celular en presencia de dichas fuentes de carbono.

Específicamente, dicho cultivo de la fase de crecimiento (etapa a)) se realiza en una fase discontinua; y dicho cultivo en la fase de producción (etapa b)) se realiza en una fase de cultivo por lotes alimentados o continua.

Específicamente, las células anfitrionas se cultivan en un medio rico en fuente de carbono que comprende una fuente de carbono basal durante la fase de alta tasa de crecimiento (en condiciones de expansión), etapa a) (p. ej., al menos 50%, o al menos 60%, al menos 70%%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o hasta la tasa de crecimiento máxima) y producir la POI durante una fase de baja tasa de crecimiento (bajo condiciones limitantes del crecimiento), etapa b) (p. ej., menos de 90%, preferiblemente menos de 80%, menos de 70%, menos de 60%, menos de 50%, o menos de 40%, menos de 30%, menos de 20% , menos de 10%, menos de 5%, menos de 3%, menos de 2%, menos de 1%, menos de 0,5%, menos de 0,4%, menos de 0,3% o menos de 0,2% de la tasa de crecimiento máxima) limitando al mismo tiempo la fuente de carbono, en particular alimentando un medio mínimo definido que comprende sólo la cantidad de fuente de carbono que se consume completamente cuando se mantiene el cultivo celular en la fase de producción.

Específicamente, se utiliza una concentración promedio de metanol de al menos uno cualquiera de 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 o 1,0% (v/v), p. ej., hasta uno cualquiera de 3%, 2,5%, 2%, 1,5% o 1% (v/v) en el cultivo de células anfitrionas, específicamente en el medio de cultivo celular o sobrenadante, en particular durante una fase de producción.

Específicamente, la concentración promedio de metanol se mantiene durante una fase de producción de al menos 24 horas, preferiblemente, al menos cualquiera de 0,1%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5% o 3% (v/v).

Según una realización específica, la concentración media de metanol es de 0,5-2% (v/v), durante la fase de producción de al menos 24 horas.

La cantidad o concentración promedio se puede calcular como la suma de las concentraciones de metanol medidas en el cultivo celular, en particular en el medio de cultivo celular o sobrenadante, al menos al inicio y al final de un período de observación, y durante el período de observación, p. ej., al menos cada 24 h, o por medición continua, dividido por el número de mediciones.

La concentración de metanol en el cultivo celular se puede medir utilizando un ensayo estándar adecuado tal como HPLC, p. ej. determinada como una concentración residual en el medio de cultivo tras el consumo por el cultivo celular.

Específicamente, la alimentación de metanol tiene una velocidad de alimentación promedio de al menos uno cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 mg de metanol/(g) de biomasa seca*h), o superior, p. ej., 2 20 o 2-15 mg de metanol/(g de biomasa seca*h) durante una fase de producción.

Se puede añadir metanol al cultivo celular en una o más cuotas. p. ej., mediante una o más inyecciones, o se puede añadir continuamente durante un cierto período de tiempo mientras se produce la POI. La cantidad promedio se puede calcular como la suma de todas las adiciones de metanol durante un período de observación dividida por la biomasa seca total promedio y por la duración del período de observación. La biomasa seca total promedio se calcula midiendo la concentración de biomasa seca al menos al inicio y al final de un período de observación, y opcionalmente durante el período de observación. A continuación, se interpola la concentración de biomasa seca entre el inicio y el final del período de observación. La concentración de biomasa seca interpolada se multiplica por el volumen del reactor en cada intervalo, los valores calculados para todos los intervalos se suman y se dividen por el número de intervalos. La duración de un intervalo es menor o igual a 1 h.

Específicamente, la velocidad de alimentación promedio se mantiene durante una fase de producción de al menos 24 horas, preferiblemente, al menos uno cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. o 15 mg de metanol/(g de biomasa seca*h), o más p. ej., 2-20 o 2-15 mg de metanol/(g de biomasa seca*h).

Por período de observación se entiende en el presente documento un cierto período de tiempo durante el cual el cultivo celular produce la POI, y se entiende particularmente como una fase de producción, en particular la fase de producción de un método de cultivo celular por lotes alimentados o continuo. Aunque el procedimiento de producción o la fase de producción de la POI real puede ser más largo que el período de observación, la cantidad promedio se calcula durante un período de observación definido.

Específicamente, la duración del procedimiento de producción de POI es de 10 a 500h.

Específicamente, se realiza una fase discontinua durante alrededor de 10 a 36 h.

El término "alrededor de" con respecto al tiempo de cultivo significará /-5% o /-10%.

Por ejemplo, el tiempo de ejecución del lote específico de aproximadamente 10 a 36 h puede ser de 18 a 39,6 h, específicamente de 19 a 37,8 h.

Según una realización específica, se realiza una fase discontinua utilizando de 10 a 50 g/L de glicerol, específicamente de 20 a 40 g/L de glicerol como fuente de carbono basal en medios discontinuos, y el cultivo se realiza a 25°C durante alrededor de 27 a 30 h., o a 30°C durante alrededor de 23 a 36h, o a cualquier temperatura entre 25°C y 30°C durante un tiempo de cultivo de 23 a 36h. La reducción de la concentración de glicerol en el medio discontinuo disminuiría la duración de la fase discontinua, mientras que el aumento del glicerol en el medio discontinuo incluso prolongaría la fase discontinua. Como alternativa al glicerol, se puede utilizar glucosa, p. ej. aproximadamente en las mismas cantidades.

En un sistema típico de cultivo celular y expresión de POI, en donde a una fase discontinua le sigue una fase por lotes alimentados, específicamente, el cultivo en la fase por lotes alimentados se realiza durante cualquiera de alrededor de 15 a 100 h, alrededor de 15 a 80 h, alrededor de 15 a 70h, alrededor de 15 a 60h, alrededor de 15 a 50h, alrededor de 15 a 45h, alrededor de 15 a 40h, alrededor de 15 a 35h, alrededor de 15 a 30h, alrededor de 15 a 35h, alrededor de 15 a 25h, o alrededor de 15 a 20h; preferiblemente alrededor de 20 a 40h. Específicamente, el cultivo en la fase por lotes alimentados se realiza durante cualquiera de alrededor de 100 h, alrededor de 80 h, alrededor de 70 h, alrededor de 60 h, alrededor de 55 h, alrededor de 50 h, alrededor de 45 h, alrededor de 40 h, alrededor de 35 h, alrededor de 33 h, alrededor de 30 h, alrededor de 25h, alrededor de 20h, o alrededor de 15h.

Específicamente, la tasa de formación de producto (rP) específica del volumen es la cantidad de producto (mg) formado por Unidad de Volumen (L) y Unidad de tiempo (h) (mg(Lh)-1). La tasa de formación de producto específica del volumen también se denomina rendimiento espacio-temporal (STY) o productividad volumétrica.

Específicamente, se realiza un cultivo por lotes alimentados del método descrito en el presente documento de modo que se obtenga un rendimiento espacio-temporal de alrededor de 30 mg (L h)-1 (es decir, 30 mg (Lh)-1 /-5% o /-10%). Específicamente se logra un rendimiento espacio-temporal de alrededor de 30 mg (L h)-1 en el plazo de alrededor de 30 h de alimentación del lote, específicamente se puede lograr al menos cualquiera de 27, 28, 29, 30, 31,32 o 33 mg (L h) -1 en menos de 33 h, 32 h, 31 h, 30 h, 29 h, 28 h, 27 h, 26 h o 25 h del tiempo del lote alimentado.

Específicamente, la POI se expresa en la fase de producción bajo condiciones limitantes del crecimiento, p. ej.

cultivando la línea celular a una tasa de crecimiento menor que la tasa de crecimiento máxima, típicamente menos de 90%, preferiblemente menos de 80%, menos de 70%, menos de 60%, menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5%, menos de 3%, menos de 2%, menos de 1%, menos de 0,5%, menos de 0,4%, menos de 0,3%, o menos de 0,2% de la tasa máxima de crecimiento de las células. Típicamente, la tasa de crecimiento máxima se determina individualmente para cada tipo de célula anfitriona.

Según un aspecto específico, la célula anfitriona Mut- se cultiva durante una fase de producción en condiciones que limitan el crecimiento de la célula anfitriona a menos de cualquiera de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% (p/p de biomasa).

Específicamente, la fase de producción emplea un medio de alimentación que proporciona una fuente de carbono complementaria en una cantidad limitante del crecimiento para mantener la tasa de crecimiento específica dentro del rango de 0,0001 h-1 a 0,2h-1, preferiblemente 0,005 h-1 a 0,15h-1.

Según un aspecto específico, la invención proporciona el uso de una célula anfitriona de levadura metilotrófica (Mut-) con deficiencia en la vía de utilización de metanol recombinante en un método para producir un producto de fermentación, cuyo método comprende cultivar dicha célula anfitriona Mut- en condiciones que permitan a célula anfitriona Mut- la utilización de metanol como sustrato para la alcohol deshidrogenasa (ADH2) y para producir el producto de fermentación.

Específicamente, dicha célula anfitriona Mut- tiene deficiencia de alcohol oxidasa 1 (AOX1) y alcohol oxidasa 2 (AOX2).

Específicamente, en dicha célula anfitriona Mut-, los genes que codifican la alcohol oxidasa 1 (AOX1) y la alcohol oxidasa 2 (AOX2) están inactivados o suprimidos.

Según un aspecto específico, la invención proporciona el uso de una célula anfitriona de levadura metilotrófica (Mut-) con deficiencia de la vía de utilización de metanol recombinante en un método para producir un producto de fermentación, cuyo método comprende cultivar dicha célula anfitriona Mut- en condiciones que permitan a célula anfitriona Mut- producir el producto de fermentación utilizando metanol como fuente de carbono, cuya célula anfitriona Mut- está diseñada mediante una o más modificaciones genéticas

a) para reducir la expresión de un primer y un segundo genes endógenos en comparación con la célula anfitriona antes de dichas una o más modificaciones genéticas, en donde

i. el primer gen endógeno codifica la alcohol oxidasa 1 (AOX1) que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:1 o un homólogo de la misma, y

ii. el segundo gen endógeno codifica la alcohol oxidasa 2 (AOX2) que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:3 o un homólogo de la misma, y

b) aumentar la expresión de un gen de alcohol deshidrogenasa(ADH2),en donde el genADH2codifica una alcohol deshidrogenasa (ADH2).

Según un aspecto específico, la invención proporciona un método para producir una proteína de interés (POI) en una célula anfitriona, que comprende las etapas de:

a) diseñar mediante ingeniería genética la célula anfitriona para reducir la expresión (expresar de manera anormalmente baja) de dichos primer y segundo genes que codifican AOX1 y AOX2, respectivamente;

b) diseñar mediante ingeniería genética la célula anfitriona para aumentar la expresión (expresar de manera anormalmente alta) un gen que codifica ADH2;

c) introducir en la célula anfitriona un casete de expresión heterólogo que comprende un gen de interés (GOI) que codifica dicha POI bajo el control de un promotor del casete de expresión (ECP);

d) cultivar dicha célula anfitriona en condiciones para producir dicha POI utilizando metanol como fuente de carbono, proporcionando de este modo particularmente energía para el crecimiento y/o la producción de la POI;

e) opcionalmente aislar dicha POI del cultivo celular; y

f) opcionalmente purificar dicha POI.

Específicamente, la etapa a) del método descrito en el presente documento se lleva a cabo antes, después o concomitantemente a la etapa b).

Específicamente, las etapas a) y b) del método descrito en el presente documento se llevan a cabo antes, después o concomitantemente a la etapa c).

Según un aspecto específico, la célula anfitriona primero se modifica genéticamente para reducir la expresión de dichos primer y segundo genes que codifican AOX1 y AOX2, respectivamente, y para aumentar la expresión de un gen que codifica ADH2, antes de diseñarse mediante ingeniería genética para producir la POI. Según un ejemplo específico, una célula anfitriona de tipo salvaje se modifica genéticamente según las etapas a) y b) del método descrito en el presente documento. Específicamente, la célula anfitriona se proporciona al introducir dichas una o más modificaciones genéticas en una cepa de células anfitrionas de tipo salvaje para la reducción de dichos primer y segundo genes que codifican AOX1 y AOX2, respectivamente, y para aumentar la expresión del gen que codifica ADH2.

Según un aspecto adicional, la célula anfitriona se diseña mediante ingeniería genética primero para producir la POI heteróloga o recombinante, antes de modificarse genéticamente adicionalmente para reducir dichos primer y segundo genes que codifican AOX1 y AOX2, respectivamente, y para aumentar la expresión del gen que codifica ADH2. Según un ejemplo específico, primero se puede diseñar mediante ingeniería genética una célula anfitriona de tipo salvaje para que comprenda el casete de expresión para la producción de la POI. Después, dicha célula anfitriona diseñada mediante ingeniería genética se puede modificar adicionalmente para reducir dichos primer y segundo genes que codifican AOX1 y AOX2, respectivamente, y para aumentar la expresión del gen que codifica ADH2.

Según un aspecto adicional, la célula anfitriona está experimentando las etapas de diseño mediante ingeniería genética, que incluyen el diseño mediante ingeniería genética para la producción de la POI y la modificación genética para la reducción de dichos primer y segundo genes que codifican AOX1 y AOX2, respectivamente, y para aumentar la expresión del gen que codifica ADH2, concomitantemente, es decir, en una etapa del método, p. ej., que emplea el respectivo casete de expresión, reactivos y herramientas en una o más mezclas de reacción.

Específicamente, el método emplea etapas del método para producir la célula anfitriona Mut- recombinante como se describe con más detalle en el presente documento.

Específicamente, el casete de expresión heterólogo comprende el ECP como se describe más detalladamente en el presente documento.

Específicamente, la POI se puede producir cultivando la célula anfitriona Mut- en un medio apropiado, produciendo la POI durante una etapa de cultivo utilizando un medio de producción de cultivo celular que comprende metanol, y aislando la POI expresada del cultivo celular, en particular del sobrenadante o medio de cultivo celular al separar las células, y opcionalmente purificarlo mediante un método apropiado para el producto expresado. De este modo, se puede producir una preparación de POI purificada.

Sorprendentemente, resultó que la célula anfitriona Mut- era insensible al metanol y podía absorber y utilizar eficazmente cantidades significativas de metanol según fuera necesario para proporcionar energía para la producción de POI. Esto fue sorprendente porque en la técnica anterior, se encontró que el metanol era tóxico para una cepa MutS.

Según un ejemplo específico del cultivo celular como se describe en el presente documento, el crecimiento de las células anfitrionas Mut- se limitó ventajosamente durante la fase de producción, lo que redujo la necesidad de suministro de oxígeno y enfriamiento.

Fue aún más sorprendente que el rendimiento de la producción de POI aumentara mediante un mecanismo hasta ahora subestimado de la alcohol deshidrogenasa y la actividad de la ADH2 en la levadura metilotrófica, lo que dio como resultado la absorción de metanol y el consumo efectivo de metanol a pesar del bloqueo de los genes de AOX1 y AOX2 en la levadura metilotrófica con deficiencia de vía de utilización de metanol.

Según un ejemplo específico, en un GOIEC se ha utilizado ventajosamente un ECP inducible por metanol. Las cantidades de metanol utilizadas en el cultivo celular como fuente de carbono fueron suficientes para inducir la expresión del GOI.

Figuras

Figura 1: Secuencias a las que se hace referencia en el presente documento

Descripción detallada de la invención

Los términos específicos utilizados a lo largo de la memoria descriptiva tienen el siguiente significado.

El término "fuente de carbono" como se emplea en el presente documento significará un sustrato de carbono fermentable, típicamente una fuente de carbohidrato, adecuada como fuente de energía para microorganismos, tales como aquellos capaces de ser metabolizados por organismos anfitriones o líneas celulares de producción, en particular fuentes seleccionadas del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, alcoholes, incluido glicerol, en forma purificada, en medios mínimos o proporcionados en materias primas, tales como un material nutritivo complejo. La fuente de carbono se puede utilizar como se describe en el presente documento como una única fuente de carbono o como una mezcla de diferentes fuentes de carbono.

Como se describe en el presente documento, el metanol se utiliza como fuente de carbono, p. ej., como única fuente de carbono durante una fase de producción, o en mezcla con una fuente de carbono distinta del metanol. Específicamente, el metanol se alimenta conjuntamente al cultivo celular con cualquier fuente de carbono distinta del metanol.

Por fuente de carbono distinta de metanol se entiende en el presente documento una fuente de carbono que es cualquier otra distinta de metanol, en particular una fuente de carbono libre de metanol.

Una "fuente de carbono basal" tal como se describe en el presente documento típicamente es una fuente de carbono adecuada para el crecimiento celular, tal como un nutriente para células anfitrionas, en particular para células eucariotas. La fuente de carbono basal puede proporcionarse en un medio, tal como un medio basal o un medio complejo, pero también en un medio químicamente definido que contiene una fuente de carbono purificada. La fuente de carbono basal típicamente se proporciona en una cantidad que permita el crecimiento celular, en particular durante la fase de crecimiento en un procedimiento de cultivo, por ejemplo, para obtener densidades celulares de al menos 5 g/L de masa seca celular, preferiblemente al menos 10 g/L de masa seca celular, o al menos 15 g/L de masa seca celular, p. ej. exhibiendo viabilidades de más de 90% durante las etapas de subcultivo convencional, preferiblemente más de 95%.

La fuente de carbono basal se utiliza típicamente en exceso o excedente, entendido como un exceso que aporta energía para incrementar la biomasa. p. ej. durante el cultivo de una línea celular con una alta tasa de crecimiento específica, tal como durante la fase de crecimiento de una línea celular en un procedimiento de cultivo discontinuo o por lotes alimentados. Esta cantidad excedente es particularmente superior a la cantidad limitada de una fuente de carbono complementaria (como se emplea en condiciones de crecimiento limitado) para lograr una concentración residual en el caldo de fermentación que sea mensurable y típicamente al menos 10 veces mayor, preferiblemente al menos 50 veces mayor o al menos 100 veces mayor que durante la alimentación con la cantidad limitada de la fuente de carbono complementaria.

Una "fuente de carbono complementaria" tal como se describe en el presente documento típicamente es un sustrato complementario que facilita la producción de productos de fermentación mediante líneas celulares de producción, en particular en la fase de producción de un procedimiento de cultivo. A la fase de producción le sigue específicamente una fase de crecimiento, p. ej., en un procedimiento de cultivo discontinuo, por lotes alimentados y continuo. La fuente de carbono complementaria puede estar contenida específicamente en la alimentación de un procedimiento por lotes alimentados. La fuente de carbono complementaria se emplea típicamente en un cultivo celular en condiciones limitadas de sustrato de carbono, es decir, utilizando la fuente de carbono en una cantidad limitada.

Específicamente, en un método descrito en el presente documento se utiliza metanol como fuente de carbono complementaria.

Se entiende en el presente documento que una "cantidad limitada" de una fuente de carbono o una "fuente de carbono limitada" se refieren específicamente al tipo y cantidad de un sustrato de carbono que facilita la producción de productos de fermentación mediante líneas celulares de producción, en particular en un procedimiento de cultivo con tasas de crecimiento controladas inferiores a la tasa de crecimiento máxima. A la fase de producción le sigue específicamente una fase de crecimiento, p. ej., en procedimiento de cultivo discontinuo, por lotes alimentados y continuo. Los procedimientos de cultivo celular pueden emplear cultivo discontinuo, cultivo continuo y cultivo por lotes alimentados. El cultivo por discontinuo es un procedimiento de cultivo mediante el cual se añade una pequeña cantidad de una solución de cultivo de semillas a un medio y las células se cultivan sin añadir un medio adicional ni descargar una solución de cultivo durante el cultivo.

El cultivo continuo es un procedimiento de cultivo mediante el cual se añade y descarga continuamente un medio durante el cultivo. El cultivo continuo también incluye el cultivo de perfusión. El cultivo por lotes alimentados, que es un intermedio entre el cultivo discontinuo y el cultivo continuo y también conocido como cultivo semidiscontinuo, es un procedimiento de cultivo mediante el cual se añade un medio de forma continua o secuencial durante el cultivo, pero, a diferencia del cultivo continuo, la solución de cultivo no se descarga continuamente.

Se prefiere específicamente un procedimiento por lotes alimentados que se basa en la alimentación de un sustrato nutritivo que limita el crecimiento a un cultivo. La estrategia por lotes alimentados, que incluye fermentación por lotes alimentados única o por lotes alimentados repetida, se utiliza típicamente en procedimientos bioindustriales para alcanzar una alta densidad celular en el biorreactor. La adición controlada del sustrato de carbono afecta directamente la tasa de crecimiento del cultivo y ayuda a evitar el metabolismo desbordado o la formación de subproductos metabólicos no deseados. En condiciones limitadas de fuente de carbono, la fuente de carbono puede estar contenida específicamente en la alimentación de un procedimiento por lotes alimentados. De este modo, el sustrato de carbono se proporciona en una cantidad limitada.

Además, en cultivo quimiostático o continuo como se describe en el presente documento, la tasa de crecimiento se puede controlar estrictamente.

La cantidad limitada de una fuente de carbono se entiende en el presente documento particularmente como la cantidad de una fuente de carbono necesaria para mantener una línea celular de producción en condiciones de crecimiento limitado, p. ej., en una fase de producción o modo de producción. Tal cantidad limitada se puede emplear en un procedimiento por lotes alimentados, donde la fuente de carbono está contenida en un medio de alimentación y se suministra al cultivo a velocidades de alimentación bajas para un suministro sostenido de energía, p. ej., para producir una POI, manteniendo la biomasa a tasas de crecimiento específicas bajas. Típicamente se añade un medio de alimentación a un caldo de fermentación durante la fase de producción de un cultivo celular.

La cantidad limitada de una fuente de carbono se puede determinar, por ejemplo, por la cantidad residual de la fuente de carbono en el caldo de cultivo celular, que está por debajo de un umbral predeterminado o incluso por debajo del límite de detección medido en un ensayo convencional (de carbohidratos). La cantidad residual típicamente se determinaría en el caldo de fermentación al recoger un producto de fermentación.

La cantidad limitada de una fuente de carbono también se puede determinar definiendo la tasa de alimentación promedio de la fuente de carbono al fermentador, p. ej., según lo determinado por la cantidad añadida durante todo el procedimiento de cultivo, p. ej., la fase por lotes alimentados, por tiempo de cultivo, para determinar una cantidad promedio calculada por tiempo. Esta tasa de alimentación promedio se mantiene baja para garantizar el uso completo de la fuente de carbono complementaria por parte del cultivo celular, p. ej., entre 0,6 g L-1 h-1 (g de fuente de carbono por L de volumen inicial de fermentación y h de tiempo) y 25 g L-1 h-1, preferiblemente entre 1,6 g L-1 h-1 y 20 g L-1 h-1.

La cantidad limitada de una fuente de carbono también se puede determinar midiendo la tasa de crecimiento específica, tasa de crecimiento específica que se mantiene baja, p. ej., inferior a la tasa de crecimiento específica máxima, durante la fase de producción, p. ej. dentro de un rango predeterminado, tal como en el rango de 0,001 h-1 a 0,20h-1, o 0,005 h-1 a 0,20h-1, preferiblemente entre 0,01 h-1 y 0,15 h-1.

Específicamente, se utiliza un medio de alimentación que está químicamente definido y que comprende metanol.

El término "definido químicamente" con respecto a un medio de cultivo celular, tal como un medio mínimo o un medio de alimentación en un procedimiento por lotes alimentados, significará un medio de cultivo adecuado para el cultivo celularin vitrode una línea celular de producción, en la que se conocen todos los componentes químicos y (poli)péptidos. Típicamente, un medio químicamente definido está completamente libre de componentes de origen animal y representa un entorno de cultivo celular puro y uniforme.

El término "célula" o "célula anfitriona", como se emplea en el presente documento, se referirá a una única célula, un único clon celular o una línea celular de una célula anfitriona. El término "célula anfitriona" se aplicará particularmente a una célula de levadura metilotrófica, que se utiliza adecuadamente con fines de recombinación para producir una POI o un metabolito de la célula anfitriona. Se entiende bien que el término "célula anfitriona" no incluye a los seres humanos. Específicamente, las células anfitrionas como se describe en el presente documento son organismos artificiales y derivados de células anfitrionas nativas (de tipo salvaje). Se entiende bien que las células anfitrionas, los métodos y usos descritos en el presente documento, p. ej., refiriéndose específicamente a aquellos que comprenden una o más modificaciones genéticas, dichos casetes o construcciones de expresión heterólogas, dichas células anfitrionas transfectadas o transformadas y proteínas recombinantes, no son de origen natural, "elaboradas por el hombre" o sintéticas, y por lo tanto no se consideran como un resultado de la "ley de la naturaleza".

El término "línea celular", como se emplea en el presente documento, se refiere a un clon establecido de un tipo celular particular que ha adquirido la capacidad de proliferar durante un período de tiempo prolongado. Típicamente se utiliza una línea celular para expresar un gen endógeno o recombinante, o productos de una vía metabólica para producir polipéptidos o metabolitos celulares mediados por tales polipéptidos.

La célula anfitriona que produce la POI como se describe en el presente documento también se denomina "célula anfitriona de producción", y la línea celular respectiva "línea celular de producción". Comúnmente se entiende que una "línea celular de producción" es una línea celular lista para su uso para cultivo celular en un biorreactor para obtener el producto de un procedimiento de producción, tal como una POI.

Las realizaciones específicas descritas en el presente documento se refieren a una célula anfitriona de producción de Mut-, que puede utilizar eficazmente ADH2 para procesar enzimáticamente metanol, proporcionando así energía a la célula.

Las realizaciones específicas descritas en el presente documento se refieren a una línea celular de producción que está diseñada mediante ingeniería genética para expresar de manera anormalmente baja genes endógenos que codifican las proteínas AOX1 y AOX2, y para expresar de manera anormalmente alta un gen que codifica ADH2, y se caracteriza por un alto rendimiento de producción de POI bajo el control de un ECP descrito en el presente documento, utilizando metanol como fuente de carbono.

Los términos "cultivo celular" o "cultivar" o "cultivo" como se emplea en el presente documento con respecto a una célula anfitriona se refieren al mantenimiento de células en un entorno artificial, p. ej.,in vitro,en condiciones que favorezcan el crecimiento, la diferenciación o la viabilidad continua, en estado activo o quiescente, de las células, específicamente en un biorreactor controlado según métodos conocidos en la industria.

Cuando se cultiva un cultivo celular utilizando medios de cultivo apropiados, las células se ponen en contacto con los medios en un recipiente de cultivo o con un sustrato en condiciones adecuadas para soportar el cultivo de las células en el cultivo celular. Como se describe en el presente documento, se proporciona un medio de cultivo que se puede utilizar para el crecimiento de células anfitrionas. p. ej., levadura metilotrófica. Los mecanismos de cultivo celular convencionales son bien conocidos en la técnica.

Los cultivos celulares como se describen en el presente documento emplean particularmente técnicas que proporcionan la producción de una POI secretada, por ejemplo, para obtener la POI en el medio de cultivo celular, que es separable de la biomasa celular, denominado en el presente documento "sobrenadante de cultivo celular", y puede purificarse para obtener la POI con un mayor grado de pureza. Cuando una proteína (tal como p. ej., una POI) es producida y secretada por la célula anfitriona en un cultivo celular, se entiende en el presente documento que tales proteínas se secretan en el sobrenadante del cultivo celular, y pueden obtenerse separando el sobrenadante del cultivo celular de la biomasa de la célula anfitriona, y opcionalmente purificando nuevamente la proteína para producir una preparación de proteína purificada.

Los medios de cultivo celular proporcionan los nutrientes necesarios para mantener y hacer crecer las células en un entorno controlado, artificial ein vitro.Las características y composiciones de los medios de cultivo celular varían dependiendo de los requisitos celulares particulares. Los parámetros importantes incluyen la osmolalidad, el pH y las formulaciones de nutrientes. La alimentación de nutrientes se puede realizar de forma continua o discontinua según métodos conocidos en la técnica.

Mientras que un procedimiento discontinuo es un modo de cultivo celular en el que todos los nutrientes necesarios para cultivar las células están contenidos en el medio de cultivo inicial, sin suministro adicional de nutrientes adicionales durante la fermentación, en un procedimiento por lotes alimentados, después de una fase discontinua, tiene lugar una fase de alimentación en la que uno o más nutrientes se suministran al cultivo mediante la alimentación. Aunque en la mayoría de los procedimientos el modo de alimentación es crítico e importante, la célula anfitriona y los métodos descritos en el presente documento no están restringidos con respecto a un determinado modo de cultivo celular.

Se puede producir una POI recombinante utilizando la célula anfitriona y la línea celular respectiva descritas en el presente documento, cultivando en un medio apropiado, aislando el producto o metabolito expresado del cultivo y, opcionalmente, purificándolo mediante un método adecuado.

Se prefieren varios enfoques diferentes para la producción de la POI como se describe en el presente documento. Una POI se puede expresar, procesar y opcionalmente secretar transfectando o transformando una célula anfitriona con un vector de expresión que alberga ADN recombinante que codifica la proteína relevante, preparando un cultivo de la célula transfectada o transformada, haciendo crecer el cultivo, induciendo la transcripción y la producción de POI, y recuperando la POI.

En ciertas realizaciones, el procedimiento de cultivo celular es un procedimiento por lotes alimentados. Específicamente, una célula anfitriona transformada con una construcción de ácido nucleico que codifica una POI recombinante deseada se cultiva en una fase de crecimiento y se pasa a una fase de producción para producir una POI recombinante deseada.

En otra realización, las células anfitrionas descritas en el presente documento se cultivan en modo continuo, p. ej., empleando un quimiostato. Un procedimiento de fermentación continuo se caracteriza por una velocidad de alimentación definida, constante y continua de medio de cultivo de nueva aportación a un biorreactor, mediante el cual el caldo de cultivo se retira al mismo tiempo del biorreactor a la misma velocidad de eliminación definida, constante y continua. Al mantener el medio de cultivo, la tasa de alimentación y la tasa de eliminación al mismo nivel constante, los parámetros y condiciones del cultivo celular en el biorreactor permanecen constantes.

Se entiende específicamente que un cultivo celular estable como se describe en el presente documento se refiere a un cultivo celular que mantiene las propiedades genéticas, específicamente manteniendo alto el nivel de producción de POI, p. ej., al menos a un nivel de gg, incluso después de aproximadamente 20 generaciones de cultivo, preferiblemente al menos 30 generaciones, más preferiblemente al menos 40 generaciones, lo más preferido de al menos 50 generaciones. Específicamente, se proporciona una línea celular anfitriona recombinante estable que se considera una gran ventaja cuando se utiliza para la producción a escala industrial.

El cultivo celular descrito en el presente documento es particularmente ventajoso para métodos a escala de fabricación industrial. p. ej. tanto con respecto al volumen como al sistema técnico, en combinación con un modo de cultivo basado en la alimentación de nutrientes, en particular un procedimiento por lotes alimentados o discontinuo, o un procedimiento continuo o semicontinuo (p. ej. quimiostato).

La célula anfitriona descrita en el presente documento típicamente se prueba para determinar su capacidad de expresar el GOI para la producción de POI, se prueba para determinar el rendimiento de POI mediante cualquiera de las siguientes pruebas: ELISA, ensayo de actividad, HPLC u otras pruebas adecuadas, tales como SDS-PAGE y técnicas de Transferencia Western o espectrometría de masas.

Para determinar el efecto de una o más modificaciones genéticas sobre la expresión anormalmente baja o reducción de la expresión de los genes que codifican la proteína o proteínas AOX1 y/o AOX2 en el cultivo celular respectivo y p. ej., sobre a su efecto sobre la producción de POI, la línea celular anfitriona se puede cultivar en placas de microtitulación, matraz agitado o biorreactor utilizando fermentaciones por lotes alimentados o quimiostatos en comparación con cepas sin tales modificaciones genéticas en la célula respectiva.

El método de producción descrito en el presente documento permite específicamente la fermentación a escala piloto o industrial. La escala del procedimiento industrial emplearía preferiblemente volúmenes de al menos 10 L, específicamente al menos 50 L, preferiblemente al menos 1 m3, preferiblemente al menos 10 m3, lo más preferiblemente al menos 100 m3.

Se prefieren las condiciones de producción a escala industrial, que se refieren a p. ej., cultivo por lotes alimentados en volúmenes de reactor de 100 L a 10 m3 o más, empleando tiempos de procedimiento típicos de varios días, o procedimientos continuos en volúmenes de fermentador de aproximadamente 50 - 1000 L o más, con velocidades de dilución de aproximadamente 0,02 - 0,15 h-1.

Los dispositivos, instalaciones y métodos utilizados para el fin descrito en el presente documento son específicamente adecuados para su uso en y con el cultivo de cualquier línea celular deseada, incluidas líneas celulares procarióticas y/o eucarióticas. Adicionalmente, en realizaciones, los dispositivos, instalaciones y métodos son adecuados para cultivar cualquier tipo de célula, incluidas células en suspensión o células dependientes de anclaje (adherentes) y son adecuados para operaciones de producción configuradas para la producción de productos farmacéuticos y biofarmacéuticos, tales como productos polipeptídicos (POI), productos de ácidos nucleicos (por ejemplo ADN o ARN), o células y/o virus tales como los utilizados en terapias celulares y/o virales.

En ciertas realizaciones, las células expresan o producen un producto, tal como un producto terapéutico o de diagnóstico recombinante. Como se describe con más detalle en el presente documento, los ejemplos de productos producidos por células incluyen, pero sin limitarse a, POI tales como las ilustradas en el presente documento que incluyen moléculas de anticuerpos (p. ej., anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos), miméticos de anticuerpos (moléculas polipeptídicas que se unen específicamente a antígenos pero que no están relacionadas estructuralmente con anticuerpos tales como p. ej. DARPins, aficuerpos, adnectinas o IgNAR), proteínas de fusión (p. ej., proteínas de fusión de Fc, citocinas quiméricas), otras proteínas recombinantes (p. ej., proteínas glicosiladas, enzimas, hormonas) o agentes terapéuticos virales (p. ej., virus oncolíticos anticancerosos, vectores virales para terapia génica e inmunoterapia viral), agentes terapéuticos celulares (p. ej., células madre pluripotentes, células madre mesenquimales y células madre adultas), vacunas o partículas encapsuladas en lípidos (p. ej., exosomas, partículas similares a virus), ARN (tal como p. ej. ARNip) o ADN (tal como p. ej. ADN plasmídico), antibióticos o aminoácidos. En realizaciones, los dispositivos, instalaciones y métodos pueden utilizarse para producir biosimilares.

Como se mencionó, en ciertas realizaciones, los dispositivos, instalaciones y métodos permiten la producción de células eucariotas, tales como por ejemplo células de levadura, p. ej., POI que incluyen proteínas, péptidos o antibióticos, aminoácidos, ácidos nucleicos (tales como ADN o ARN), sintetizados por dichas células a gran escala. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, los dispositivos, instalaciones y métodos pueden incluir cualquier volumen o capacidad de producción deseados, incluidas, pero sin limitarse a, capacidades a escala de laboratorio, a escala piloto y a escala de producción completa.

Además, y a menos que se indique lo contrario en el presente documento, los dispositivos, instalaciones y métodos pueden incluir cualquier reactor adecuado, incluidos, pero sin limitarse a, tanque agitado, circulación neumática de líquido "airlift", fibra, microfibra, fibra hueca, matriz cerámica, lecho fluidizado, lecho fijo y/o biorreactores de lecho en surtidor. Como se emplea en el presente documento, "reactor" puede incluir un fermentador o unidad de fermentación, o cualquier otro recipiente de reacción y el término "reactor" se utiliza indistintamente con "fermentador". Por ejemplo, en algunos aspectos, una unidad de biorreactor ilustrativa puede realizar uno o más, o todos, de los siguientes: alimentación de nutrientes y/o fuentes de carbono, inyección de gas adecuado (p. ej., oxígeno), flujo de entrada y salida del medio de fermentación o cultivo celular, separación de fases gaseosas y líquidas, mantenimiento de la temperatura, mantenimiento de niveles de oxígeno y CO2, mantenimiento del nivel de pH, sacudimiento (p. ej., agitación) y/o limpieza/esterilización. Las unidades de reactor ilustrativas, tales como una unidad de fermentación, pueden contener múltiples reactores dentro de la unidad, por ejemplo, la unidad puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más biorreactores en cada unidad y/o una instalación pueden contener múltiples unidades que tienen uno o múltiples reactores dentro de la instalación. En diversas realizaciones, el biorreactor puede ser adecuado para procedimientos de fermentación discontinuos, semidiscontinuos, por lotes alimentados, de perfusión y/o continuos. Puede utilizarse cualquier diámetro de reactor adecuado. En realizaciones, el biorreactor puede tener un volumen entre aproximadamente 100 mL y aproximadamente 50.000 L. Los ejemplos no limitantes incluyen un volumen de 100 mL, 250 mL, 500 mL, 750 mL, 1 litro, 2 litros, 3 litros, 4 litros, 5 litros, 6 litros, 7 litros, 8 litros, 9 litros, 10 litros, 15 litros, 20 litros, 25 litros, 30 litros, 40 litros, 50 litros, 60 litros, 70 litros, 80 litros, 90 litros, 100 litros, 150 litros, 200 litros, 250 litros, 300 litros, 350 litros, 400 litros, 450 litros, 500 litros, 550 litros, 600 litros, 650 litros, 700 litros, 750 litros, 800 litros, 850 litros, 900 litros, 950 litros, 1000 litros, 1500 litros, 2000 litros, 2500 litros, 3000 litros, 3500 litros, 4000 litros, 4500 litros, 5000 litros, 6000 litros, 7000 litros, 8000 litros, 9000 litros, 10.000 litros, 15.000 litros, 20.000 litros, y/o 50.000 litros. Además, los reactores adecuados pueden ser de uso múltiple, de un solo uso, desechables o no desechables y pueden estar formados de cualquier material adecuado, incluidas aleaciones metálicas tales como acero inoxidable (p. ej., 316L o cualquier otro acero inoxidable adecuado) e Inconel, plásticos y/o vidrio.

En realizaciones y a menos que se indique lo contrario en el presente documento, los dispositivos, instalaciones y métodos descritos en el presente documento también pueden incluir cualquier operación unitaria adecuada y/o equipo no mencionado de otro modo, tal como operaciones y/o equipo para la separación, purificación y aislamiento de tales productos. Se puede utilizar cualquier instalación y entorno adecuados, tales como instalaciones prefabricadas tradicionales, instalaciones modulares, móviles y temporales, o cualquier otra construcción, instalación y/o diseño adecuado. Por ejemplo, en algunas realizaciones se pueden utilizar salas limpias modulares. Además, y a menos que se indique lo contrario, los dispositivos, sistemas y métodos descritos en el presente documento pueden alojarse y/o realizarse en una única ubicación o instalación o, alternativamente, alojarse y/o realizarse en ubicaciones y/o instalaciones separadas o múltiples.

Las técnicas adecuadas pueden abarcar el cultivo en un biorreactor comenzando con una fase discontinua, seguida de una fase por lotes alimentados exponencial corta con una tasa de crecimiento específica alta, seguida adicionalmente por una fase por lotes alimentados con una tasa de crecimiento específica baja. Otra técnica de cultivo adecuada puede abarcar una fase discontinua seguida de una fase por lotes alimentados a cualquier tasa de crecimiento específica adecuada o combinaciones de tasas de crecimiento específicas tales como pasar de una tasa de crecimiento alta a una baja durante el tiempo de producción de la POI, o de una tasa de crecimiento baja a alta a lo largo del tiempo de producción de la POI. Otra técnica de cultivo adecuada puede abarcar una fase discontinua seguida de una fase de cultivo continuo a una tasa de dilución baja.

Una realización preferida incluye un cultivo discontinuo para proporcionar biomasa seguido de un cultivo por lotes alimentados para una producción de POI de alto rendimiento.

Se prefiere cultivar una célula anfitriona como se describe en el presente documento en un biorreactor en condiciones de crecimiento para obtener una densidad celular de al menos 1 g/L de peso seco celular, más preferiblemente al menos 10 g/L de peso seco celular, preferiblemente al menos 20 g/L de peso seco celular, preferiblemente al menos uno cualquiera de 30, 40, 50, 60, 70 u 80 g/L de peso seco celular. Es ventajoso proporcionar tales rendimientos de producción de biomasa a escala piloto o industrial.

Un medio de crecimiento que permite la acumulación de biomasa, específicamente un medio de crecimiento basal, comprende típicamente una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de azufre y una fuente de fosfato. Típicamente, tal medio comprende además oligoelementos y vitaminas, y puede comprender adicionalmente aminoácidos, peptona o extracto de levadura.

Las fuentes de nitrógeno preferidas incluyen NH<4>H<2>PO<4>, o NH<3>o (NH<4>)<2>SO<4;>

Las fuentes de azufre preferidas incluyen MgSO<4>, o (NH<4>)<2>SO<4>o K<2>SO<4;>

Las fuentes de fosfato preferidas incluyen NH<4>H<2>PO<4>, o H<3>PO<4>, o NaH<2>PO<4>, KH<2>PO<4>, NaH<2>PO<4>o K<2>HPO<4;>

Otros componentes típicos del medio son KCI, CaCl<2>y Oligoelementos tales como: Fe, Co, Cu, Ni, Zn, Mo, Mn, I, B;

Preferiblemente el medio se complementa con vitamina B<7>;

Un medio de crecimiento típico paraP. pastoriscomprende glicerol, sorbitol o glucosa, NH<4>H<2>PO<4>, MgSO<4>, KCI, CaCl<2>, biotina y oligoelementos.

En la fase de producción se utiliza específicamente un medio de producción con sólo una cantidad limitada de una fuente de carbono complementaria.

Preferiblemente, la línea celular anfitriona se cultiva en un medio mineral con una fuente de carbono adecuada, simplificando así aún más significativamente el procedimiento de aislamiento. Un ejemplo de un medio mineral preferido es uno que contiene una fuente de carbono utilizable (en particular metanol como se describe en el presente documento opcionalmente combinado con p. ej., glucosa, glicerol o sorbitol), sales que contienen macroelementos (potasio, magnesio, calcio, amonio, cloruro, sulfato, fosfato) y oligoelementos (cobre, yoduro, manganeso, molibdato, cobalto, zinc y sales de hierro, y ácido bórico), y opcionalmente vitaminas o aminoácidos, p. ej., para complementar auxotrofías.

Específicamente, las células se cultivan en condiciones adecuadas para efectuar la expresión de la POI deseada, que puede purificarse a partir de las células o del medio de cultivo, dependiendo de la naturaleza del sistema de expresión y de la proteína expresada. p. ej., si la proteína está fusionada a un péptido señal y si la proteína es soluble o está unida a una membrana. Como entenderá el experto en la técnica, las condiciones de cultivo variarán según factores que incluyen el tipo de célula anfitriona y el vector de expresión particular empleado.

Un medio de producción típico comprende una fuente de carbono complementaria y adicionalmente NH4H2PO4, MgSO4, KCI, CaCl2, biotina y oligoelementos.

Por ejemplo, la alimentación de la fuente de carbono complementaria añadida a la fermentación puede comprender una fuente de carbono con hasta 50% en peso de azúcares utilizables.

La fermentación se lleva a cabo preferiblemente a un pH que oscila entre 3 y 8.

Los tiempos de fermentación típicos son de aproximadamente 24 a 120 horas con temperaturas en el rango de 20°C a 35°C, preferiblemente 22-30°C.

La POI se expresa preferiblemente empleando condiciones para producir títulos de al menos 1 mg/L, preferiblemente al menos 10 mg/L, preferiblemente al menos 100 mg/L, lo más preferiblemente al menos 1 g/l.

Los términos "expresión" o "casete de expresión" como se emplean en el presente documento se refieren a moléculas de ácido nucleico que contienen una secuencia codificante deseada y secuencias de control en una conexión operable, de modo que los anfitriones transformados o transfectados con estas secuencias sean capaces de producir las proteínas codificadas o los metabolitos de la célula anfitriona. Para efectuar la transformación, el sistema de expresión puede incluirse en un vector; sin embargo, el ADN relevante también puede integrarse en el cromosoma de una célula anfitriona. La expresión puede referirse a productos de expresión secretados o no secretados, incluidos polipéptidos o metabolitos.

Los casetes de expresión se proporcionan convenientemente como construcciones de expresión, p. ej., en forma de "vectores" o "plásmidos", que son típicamente secuencias de ADN necesarias para la transcripción de secuencias de nucleótidos recombinantes clonadas, es decir de genes recombinantes y la traducción de su ARNm en un organismo anfitrión adecuado. Los vectores de expresión o plásmidos típicamente comprenden un origen para la replicación autónoma o un locus para la integración del genoma en las células anfitrionas, marcadores seleccionables (p. ej., un gen de síntesis de aminoácidos o un gen que confiere resistencia a antibióticos tal como Zeocina, kanamicina, G418 o Higromicina, Nourseotricina), varios sitios de escisión de enzimas de restricción, una secuencia promotora adecuada y un terminador de la transcripción, cuyos componentes están conectados operablemente entre sí. Los términos "plásmido" y "vector", como se emplean en el presente documento, incluyen secuencias de nucleótidos que se replican de forma autónoma, así como secuencias de nucleótidos que integran el genoma, tales como cromosomas artificiales. p. ej., un cromosoma artificial de levadura (YAC).

Los vectores de expresión pueden incluir, pero sin limitarse a, vectores de clonación, vectores de clonación modificados y plásmidos diseñados específicamente. Los vectores de expresión preferidos descritos en el presente documento son vectores de expresión adecuados para expresar un gen recombinante en una célula anfitriona eucariótica y se seleccionan dependiendo del organismo anfitrión. Los vectores de expresión apropiados típicamente comprenden secuencias reguladoras adecuadas para expresar ADN que codifica una POI en una célula anfitriona eucariótica. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, operadores, potenciadores, sitios de unión al ribosoma y secuencias que controlan el inicio y la terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias reguladoras típicamente están conectadas operablemente a la secuencia de ADN que se va a expresar.

Las construcciones de expresión específicas descritas en el presente documento comprenden un promotor conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos que codifica una POI bajo el control transcripcional de dicho promotor. Específicamente, el promotor no está asociado de forma nativa con la secuencia codificante de la POI.

Para permitir la expresión de una secuencia de nucleótidos recombinante en una célula anfitriona, el casete o vector de expresión descrito en el presente documento como GOIEC comprende un ECP, típicamente una secuencia de nucleótidos promotora que es adyacente al extremo 5' de la secuencia codificante, p. ej., aguas arriba de y adyacente a un gen de interés (GOI), o si se utiliza una secuencia señal o líder, aguas arriba de y adyacente a dicha secuencia señal y líder, respectivamente, para facilitar la expresión y secreción de la POI. La secuencia promotora típicamente regula e inicia la transcripción de la secuencia de nucleótidos aguas abajo, con la que está conectada operablemente, incluyendo en particular el GOI.

Las construcciones de expresión específicas descritas en el presente documento comprenden un polinucleótido que codifica la POI conectado con una secuencia líder que provoca la secreción de la POI de la célula anfitriona. La presencia de tal secuencia líder de secreción en el vector de expresión se requiere típicamente cuando la POI destinada a la expresión y secreción recombinantes es una proteína que no se secreta naturalmente y por lo tanto carece de una secuencia líder de secreción natural, o su secuencia de nucleótidos se ha clonado sin su secuencia líder de secreción natural. En general, se puede utilizar cualquier secuencia líder de secreción eficaz para provocar la secreción de la POI desde la célula anfitriona. La secuencia líder de secreción puede originarse a partir de una fuente de levadura, p. ej. del factor a de levadura tal como MFa deSaccharomyces cerevisiae,o fosfatasa de levadura, de origen mamífero o vegetal, u otros.

En realizaciones específicas, se pueden utilizar vectores de multiclonación, que son vectores que tienen un sitio de multiclonación. Específicamente, se puede integrar o incorporar un gen heterólogo deseado en un sitio de multiclonación para preparar un vector de expresión. En el caso de vectores de multiclonación, típicamente se coloca un promotor aguas arriba del sitio de multiclonación.

Se pretende que los términos "expresión génica", o "expresar un polinucleótido" como se emplean en el presente documento, abarquen al menos una etapa seleccionada del grupo que consiste en transcripción de ADN a ARNm, procesamiento de ARNm, maduración de ARNm, exportación de ARNm, traducción, plegamiento de proteínas y/o transporte de proteínas.

El término "aumentar la expresión" en el presente documento también denominado "expresión anormalmente alta" se refiere a cualquier cantidad superior a un nivel de expresión exhibido por un patrón de referencia, que puede ser la célula anfitriona antes de la alteración génica para aumentar la expresión de un determinado polinucleótido, o que de otro modo se expresa en una célula anfitriona del mismo tipo o especie que no está diseñada mediante ingeniería genética para aumentar la expresión de dicho polinucleótido.

Si una célula anfitriona no comprende un producto génico determinado, es posible introducir el producto génico en la célula anfitriona para su expresión; en este caso, cualquier expresión detectable está abarcada por el término "expresión anormalmente alta ".

La expresión anormalmente alta de un gen que codifica una proteína (tal como ADH2) también se denomina expresión anormalmente alta de una proteína (tal como ADH2). La expresión anormalmente alta se puede lograr de cualquier forma conocida por un experto en la técnica. En general, esto se puede lograr aumentando la transcripción/traducción del gen, p. ej., aumentando el número de copias del gen o alterando o modificando secuencias reguladoras o sitios asociados con la expresión de un gen. Por ejemplo, el gen puede conectarse operablemente a un promotor fuerte para alcanzar altos niveles de expresión. Tales promotores pueden ser promotores endógenos o heterólogos, en particular promotores recombinantes. Se puede sustituir un promotor por un promotor heterólogo que aumente la expresión del gen. El uso de promotores inducibles permite también aumentar la expresión durante el cultivo. Además, la expresión anormalmente alta también se puede lograr, por ejemplo, modificando la ubicación cromosómica de un gen particular, alterando secuencias de ácido nucleico adyacentes a un gen particular, tal como un sitio de unión a ribosomas o un terminador de la transcripción, introduciendo un desplazamiento en el marco de lectura abierto, modificando proteínas (p. ej., proteínas reguladoras, supresores, potenciadores, activadores transcripcionales y similares) implicados en la transcripción del gen y/o la traducción del producto génico, o cualquier otro medio convencional para desregular la expresión de una rutina génica particular en la técnica (incluidos, pero sin limitarse a, uso de moléculas de ácido nucleico antisentido, por ejemplo para bloquear la expresión de proteínas represoras o eliminar o mutar el gen de un factor transcripcional que normalmente reprime la expresión del gen que se desea expresar de manera anormalmente alta. Prolongar la vida del ARNm también puede mejorar el nivel de expresión. Por ejemplo, ciertas regiones terminadoras pueden utilizarse para prolongar las semividas del ARNm. Si se incluyen múltiples copias de genes, los genes pueden ubicarse en plásmidos de número de copias variable o integrarse y amplificarse en el cromosoma. Es posible introducir uno o más genes o secuencias genómicas en la célula anfitriona para su expresión.

Según una realización específica, un polinucleótido que codifica la proteína ADH2 puede presentarse en una única copia o en múltiples copias por célula. Las copias pueden estar adyacentes o distantes entre sí. Según otra realización específica, la expresión anormalmente alta de la proteína ADH2 emplea secuencias de nucleótidos recombinantes que codifican la proteína ADH2 proporcionadas en uno o más plásmidos adecuados para la integración en el genoma (es decir., inserción génica dirigida) de la célula anfitriona, en una sola copia o en múltiples copias por célula. Las copias pueden estar adyacentes o distantes entre sí. La expresión anormalmente alta se puede lograr expresando múltiples copias del polinucleótido, tales como 2, 3, 4, 5, 6 o más copias de dicho polinucleótido por célula anfitriona.

Una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende un GOI y un polinucleótido (gen) que codifica la proteína ADH2 puede proporcionarse en uno o más plásmidos que se replican de forma autónoma e introducirse en una única copia o en múltiples copias por célula.

Alternativamente, la secuencia de nucleótidos recombinante que comprende un GOI y un polinucleótido (gen) que codifica la proteína ADH2 puede estar presente en el mismo plásmido e introducirse en una única copia o en múltiples copias por célula.

Un polinucleótido (gen) heterólogo que codifica la proteína ADH2 o una construcción de expresión recombinante heteróloga que comprende el polinucleótido (gen) que codifica la proteína ADH2 se integra preferiblemente en el genoma de la célula anfitriona.

El término "genoma" generalmente se refiere a toda la información hereditaria de un organismo que está codificada en el ADN (o ARN). Puede estar presente en el cromosoma, en un plásmido o en un vector, o en ambos. Preferiblemente, el polinucleótido (gen) que codifica la proteína ADH2 se integra en el cromosoma de dicha célula.

El polinucleótido (gen) que codifica la proteína ADH2 puede integrarse en su locus natural. "Locus natural" significa la ubicación en un cromosoma específico, donde el polinucleótido (gen) que codifica la proteína ADH2 está ubicado en una célula de tipo salvaje de origen natural. Sin embargo, en otra realización, el polinucleótido (gen) que codifica la proteína ADH2 está presente en el genoma de la célula anfitriona no en su locus natural, sino integrado ectópicamente. El término "integración ectópica" significa la inserción de un ácido nucleico en el genoma de un microorganismo en un sitio distinto de su locus cromosómico habitual, es decir, integración predeterminada o aleatoria. En otra realización, el polinucleótido (gen) que codifica la proteína ADH2 se integra en el locus natural y de forma ectópica. La recombinación heteróloga se puede utilizar para lograr una integración aleatoria o no dirigida. La recombinación heteróloga se refiere a la recombinación entre moléculas de ADN con secuencias significativamente diferentes.

Para células de levadura, el polinucleótido (gen) que codifica la proteína ADH2 y/o el GOI se pueden insertar en un locus deseado, tal como AOX1 , GAP, ENO1, t Ef , HIS4 (Zamir et al., Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa (1981) 78(6):3496-3500), HO (Voth et al. Nucleic Acids Res. 15 de junio de 2001; 29(12): e59), TYR1 (Mirisola et al., Yeast 2007; 24: 761-766), His3, Leu2, Ura3 (Taxis et al., BioTechniques (2006) 40:73-78), Lys2, ADE2, TRP1, GAL1, ADH1 o en la integración del gen del ARN ribosómico 5S.

En otras realizaciones, el polinucleótido (gen) que codifica la proteína ADH2 y/o el GOI se pueden integrar en un plásmido o vector. Preferiblemente, el plásmido es un vector de expresión eucariótico, preferiblemente un vector de expresión de levadura. Los plásmidos o vectores adecuados se describen con más detalle en el presente documento.

La expresión anormalmente alta de un polinucleótido endógeno o heterólogo en una célula anfitriona recombinante se puede lograr modificando las secuencias de control de la expresión. Las secuencias de control de la expresión se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores de la transcripción, sitios de entrada a ribosomas internos (IRES) y similares, que proporcionan la expresión de la secuencia de polinucleótidos en una célula anfitriona. Las secuencias de control de la expresión interactúan específicamente con proteínas celulares implicadas en la transcripción. Las secuencias de control de la expresión ejemplares son descritas, por ejemplo, por Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzimology, vol. 185, Academic Press, San Diego, California (1990).

En una realización preferida, la expresión anormalmente alta se logra utilizando un potenciador para expresar el polinucleótido. Los potenciadores transcripcionales son relativamente independientes de la orientación y la posición, habiéndose encontrado en 5' y 3' de la unidad de transcripción, dentro de un intrón, así como dentro de la propia secuencia codificante. El potenciador se puede empalmar en el vector de expresión en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante, pero preferiblemente se localiza en un sitio 5' del promotor. La mayoría de los genes de levadura contienen sólo un UAS, que generalmente se encuentra a unos cientos de pares de bases del sitio de la protección terminal y la mayoría de los potenciadores de levadura (UAS) no pueden funcionar cuando se encuentran en 3' con respecto al promotor, pero los potenciadores en eucariotas superiores pueden funcionar tanto en 5' como en 3' del promotor.

Se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, RSV, SV40, EMC, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). También se puede utilizar un potenciador de un virus de células eucarióticas, tal como el potenciador tardío SV40, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus.

Específicamente, el GOI y/o el polinucleótido (gen) que codifica ADH2, como se describen en el presente documento, están conectados operablemente a secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción que proporcionan la expresión en las células anfitrionas. El término "secuencias reguladoras de la traducción" como se emplea en el presente documento se refiere a secuencias de nucleótidos que están asociadas con una secuencia de ácido nucleico de un gen y que regulan la traducción del gen. Las secuencias reguladoras de la transcripción y/o la traducción pueden ubicarse en plásmidos o vectores o integrarse en el cromosoma de la célula anfitriona. Las secuencias reguladoras de la transcripción y/o la traducción están ubicadas en la misma molécula de ácido nucleico del gen que regula.

Específicamente, la expresión anormalmente alta de la proteína ADH2 se puede lograr mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, modificando genéticamente sus regiones reguladoras endógenas, como describen Marx et al., 2008 (Marx, H., Mattanovich, D. y Sauer, M.Microb Cell Fact 7(2008): 23), tales métodos incluyen, por ejemplo, la integración de un promotor recombinante que aumenta la expresión de un gen.

Por ejemplo, la expresión anormalmente alta de un polinucleótido endógeno o heterólogo en una célula anfitriona recombinante se puede lograr modificando los promotores que controlan tal expresión, por ejemplo, reemplazando un promotor (p. ej., un promotor endógeno o un promotor que está unido de forma nativa a dicho polinucleótido en un organismo de tipo salvaje) que está conectado operablemente a dicho polinucleótido por otro promotor más fuerte para alcanzar altos niveles de expresión. Tal promotor puede ser inductivo o constitutivo. La modificación de un promotor también puede realizarse mediante métodos de mutagénesis conocidos en la técnica.

En una realización preferida, la expresión de ambos, el polinucleótido que codifica la proteína ADH2 y el polinucleótido que codifica la POI, está dirigida por un promotor inducible. En otra realización preferida, la expresión de ambos, el polinucleótido que codifica la proteína ADH2 y el polinucleótido que codifica la POI, está dirigida por un promotor constitutivo. En otra realización preferida más, la expresión del polinucleótido que codifica la proteína ADH2 está dirigida por un promotor constitutivo y la expresión del polinucleótido que codifica la POI está dirigida por un promotor inducible. En otra realización preferida más, la expresión del polinucleótido que codifica la proteína ADH2 está dirigida por un promotor inducible y la expresión del polinucleótido que codifica la POI está dirigida por un promotor constitutivo.

Específicamente, se puede emplear un promotor inducible por metanol en construcciones de expresión utilizadas para expresar de manera anormalmente alta el gen que codifica ADH2 y/o para expresar un GOI, como se describe más detalladamente en el presente documento.

Como ejemplo, la expresión del polinucleótido que codifica la proteína ADH2 puede ser dirigida por un promotor GAP constitutivo y la expresión del polinucleótido que codifica la POI puede ser dirigida por el promotor de AOX1 o AOX2 inducible por metanol.

En una realización, la expresión de los polinucleótidos que codifican la proteína ADH2 y la POI está dirigida por el mismo promotor o el mismo tipo de promotores en términos de actividad del promotor (p. ej., la fuerza del promotor) y/o el comportamiento de expresión (p. ej., inducible o constitutivo).

El término "reducir la expresión" en el presente documento también denominado "expresión anormalmente baja" se refiere a cualquier cantidad o nivel (p. ej., actividad o concentración) inferior a una cantidad o nivel expresado (p. ej., actividad o concentración) exhibidos por un patrón de referencia, que puede ser la célula anfitriona antes de la alteración génica para reducir la expresión de un determinado polinucleótido, o que de otro modo se expresa en una célula anfitriona del mismo tipo o especie que no está diseñada mediante ingeniería genética para reducir la expresión de dicho polinucleótido. La reducción de la expresión como se describe en el presente documento se refiere específicamente a un polinucleótido o gen que codifica una proteína AOX1 o una proteína AOX2 definidas, en particular un gen que es endógeno con respecto a la célula anfitriona antes del diseño mediante ingeniería genética. En particular, el producto génico respectivo es la proteína AOX1 o la proteína AOX2 definidas como se describe en el presente documento. Tras diseñar mediante ingeniería genética la célula anfitriona mediante modificación genética para reducir la expresión de dicho gen, la expresión de dicho producto génico o polipéptido está a un nivel que es menor que la expresión del mismo producto génico o polipéptido antes de una modificación genética de la célula anfitriona o en un anfitrión comparable que no haya sido modificado genéticamente. "Menos de" incluye, p. ej., 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80, 90% o más. Ninguna expresión del producto génico o de un polipéptido está abarcada por el término "reducción de la expresión" o "expresión anormalmente baja".

Según realizaciones específicas descritas en el presente documento, la célula anfitriona está diseñada mediante ingeniería genética para reducir la expresión o bloquear (para la inactivación o deleción de un gen o una parte del mismo) el gen endógeno de la célula anfitriona que codifica la proteína AOX1 o la proteína AOX2 (como se define en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, homólogos u ortólogos de las secuencias que se producen naturalmente enP. pastorisde tipo salvaje), u otras secuencias de nucleótidos (codificantes o no codificantes) que confieren la capacidad de la célula anfitriona para expresar o producir dicha proteína AOX1 o proteína AOX2.

Específicamente, se proporciona una cepa de deleción, en donde se altera una secuencia de nucleótidos.

El término "alterar", como se emplea en el presente documento, se refiere a la reducción significativa hasta la eliminación completa de la expresión o actividad de una o más proteínas endógenas en una célula anfitriona, tal como mediante reducción de la expresión o bloqueo génico. Esto se puede medir como la presencia de esta una o más proteínas endógenas en un cultivo celular o medio de cultivo de la célula anfitriona, tal como mediante espectrometría de masas en donde el contenido total de una proteína endógena puede ser inferior a un umbral o no detectable. Alternativamente, puede medirse como la actividad enzimática de la proteína endógena.

El término "alterado" se refiere específicamente a un resultado de diseño mediante ingeniería genética mediante al menos una etapa seleccionada del grupo que consiste en silenciamiento génico, reducción de la expresión génica, bloqueo génico, suministro de una construcción negativa dominante, inactivación génica condicional y/o mediante alteración génica con respecto a un gen específico.

Los términos "reducción de la expresión", "reducción" o "deleción" en el contexto de la expresión genética como se emplean en el presente documento se refieren a enfoques experimentales que conducen a una reducción de la expresión de un gen determinado en comparación con la expresión en una célula de control. La reducción de la expresión de un gen se puede lograr mediante diversos medios experimentales, tales como la introducción de moléculas de ácido nucleico en la célula que hibridan con partes del ARNm del gen que conducen a su degradación (p. ej., ARNhc, ARNi, miARN) o la alteración de la secuencia del gen de una manera que conduce a una reducción de la transcripción, una reducción de la estabilidad del ARNm, una disminución de la traducción del ARNm o una reducción de la actividad de la proteína codificada.

Una inhibición completa de la expresión de un gen determinado se denomina "bloqueo". El bloqueo de un gen significa que no se sintetizan transcritos funcionales a partir de dicho gen, lo que conduce a una pérdida de la función que normalmente proporciona este gen. La inactivación génica se logra alterando la secuencia de ADN que conduce a la alteración o eliminación del gen o sus secuencias reguladoras, o parte de tal gen o secuencias reguladoras. Las tecnologías de bloqueo génico incluyen el uso de técnicas de recombinación homóloga para reemplazar, interrumpir o eliminar partes cruciales o la secuencia génica completa o el uso de enzimas modificadoras del ADN tales como dedos de zinc o meganucleasas para introducir roturas de doble hebra en el ADN del gen diana, p. ej., descritas por Gaj et al. (Trends Biotechnol. 2013;31(7):397-405).

Realizaciones específicas emplean uno o más plásmidos o casetes de bloqueo génico que se transforman o transfectan en las células anfitrionas. Mediante recombinación homóloga se puede alterar el gen diana en las células anfitrionas. Este procedimiento típicamente se repite hasta que todos los alelos del gen diana se eliminen de manera estable.

Un método específico para bloquear un gen específico como se describe en el presente documento son los métodos CRISPR-Cas9 como describen, p. ej., Weninger et al. (J. Biotechnol. 2016, 235: 139-49). Otro método incluye el enfoque de marcador dividido como describen, p. ej., Heiss et al. 2013 (Appl Microbiol Biotechnol. 97(3):1241-9).

Otra realización se refiere a la degradación del ARNm diana mediante el uso de ARN de interferencia pequeño (ARNip) para transfectar la célula anfitriona y dirigirse a un ARNm que codifica la proteína diana expresada endógenamente por dicha célula anfitriona.

La expresión de un gen puede inhibirse o reducirse mediante métodos que interfieren directamente en la expresión génica, abarcando, pero sin limitarse a, la inhibición o reducción de la transcripción del ADN, p. ej., mediante el uso de represores específicos relacionados con el promotor, mediante mutagénesis específica de sitio de un promotor determinado, mediante intercambio de promotor, o inhibición o reducción de la traducción, p. ej., por silenciamiento génico postranscripcional inducido por ARNi o ARN no codificante. La expresión de un producto génico disfuncional o inactivo con actividad reducida se puede lograr, por ejemplo, mediante mutagénesis, inserciones o deleciones específicas de sitio o aleatorias dentro del gen codificante.

La inhibición o reducción de la actividad del producto génico se puede lograr, por ejemplo, mediante la administración de, o la incubación con, un inhibidor de la enzima respectiva, antes de, o simultáneamente a, la expresión de la proteína. Los ejemplos de tales inhibidores incluyen, pero sin limitarse a, un péptido inhibidor, un anticuerpo, un aptámero, una proteína de fusión o un anticuerpo mimético contra dicha enzima, o un ligando o receptor del mismo, o un péptido o ácido nucleico inhibidor, o una molécula pequeña con actividad de unión similar.

El silenciamiento génico, la reducción de la expresión génica y el bloqueo génico se refieren a técnicas mediante las cuales se reduce la expresión de un gen, ya sea mediante modificación genética o mediante tratamiento con un oligonucleótido con una secuencia complementaria a un transcrito de ARNm o a un gen. Si se realiza una modificación genética del ADN, el resultado es un organismo con la expresión gécnica reducida o bloqueada. Si el cambio en la expresión génica es causado por la unión de un oligonucleótido a un ARNm o por la unión temporal a un gen, esto da como resultado un cambio temporal en la expresión génica sin modificación del ADN cromosómico y se denomina reducción de la expresión transitoria.

En una reducción de la expresión transitoria, que también está incluida en el término anterior, la unión de este oligonucleótido al gen activo o sus transcritos provoca una disminución de la expresión mediante el bloqueo de la transcripción (en el caso de la unión de genes), la degradación del transcrito del ARNm (p. ej., mediante ARN de interferencia pequeño (ARNip) o ARN antisentido) o el bloqueo de la traducción del ARNm.

El experto en la técnica conoce otros enfoques para llevar a cabo el silenciamiento, la reducción de la expresión o el bloqueo de genes a partir de la bibliografía respectiva, y su aplicación en el contexto de la presente invención se considera rutinaria. El bloqueo génico se refiere a técnicas mediante las cuales se bloquea completamente la expresión de un gen, es decir, el gen respectivo no funciona o incluso se elimina. Los enfoques metodológicos para lograr este objetivo son múltiples y conocidos por el experto en la técnica. Un ejemplo es la producción de un mutante que es dominantemente negativo para el gen dado. Tal mutante puede producirse mediante mutagénesis dirigida al sitio (p. ej., deleción, deleción parcial, inserción o sustitución de ácido nucleico), mediante el uso de transposones adecuados, o mediante otros enfoques que son conocidos por el experto en la bibliografía respectiva, cuya aplicación en el contexto de la presente invención se considera, por tanto, rutinaria. Un ejemplo es el bloqueo génico mediante el uso de nucleasas de dedos de zinc dirigidas. Sigma Aldrich proporciona el kit respectivo como "CompoZR knockout ZFN". Otro enfoque abarca el uso de nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN).

El suministro de una construcción negativa dominante implica la introducción de una secuencia que codifica un producto de expresión génica disfuncional, p. ej., por transfección. Dicha secuencia codificante está funcionalmente acoplada a un promotor fuerte, de tal manera que la expresión génica de la enzima disfuncional anula la expresión natural del producto de expresión génica, lo que, a su vez, conduce a un defecto fisiológico eficaz de la actividad respectiva de dicho producto de expresión génica.

Un bloqueo génico condicional permite bloquear la expresión génica de una manera específica del tejido o del tiempo. Esto se realiza, por ejemplo, introduciendo secuencias cortas llamadas sitios loxP alrededor del gen de interés. De nuevo, el experto conoce otros enfoques a partir de la bibliografía respectiva y su aplicación en el contexto de la presente invención se considera rutinaria.

Otro enfoque es la alteración génica que puede conducir a un producto génico disfuncional o a un producto génico con actividad reducida. Este enfoque implica la introducción de mutaciones por desplazamiento de marco, mutaciones sin sentido (es decir, introducción de un codón de parada prematuro) o mutaciones que conducen a una sustitución de aminoácidos que hace que todo el producto génico sea disfuncional o provoque una actividad reducida. Tal alteración génica puede producirse, por ejemplo, mediante mutagénesis (p. ej., deleción, deleción parcial, inserción o sustitución de ácido nucleico), ya sea mutagénesis inespecífica (aleatoria) o mutagénesis dirigida al sitio. Los protocolos que describen la aplicación práctica de silenciamiento génico, reducción de la expresión génica, bloqueo génico, suministro de una construcción negativa dominante, bloqueo génico condicional y/o alteración génica están comúnmente disponibles para el experto en la técnica y están dentro de su rutina. Por lo tanto, la enseñanza técnica proporcionada en el presente documento está completamente habilitada con respecto a todos los métodos imaginables que conducen a una inhibición o reducción de la expresión génica de un producto génico, o a la expresión de un producto génico disfuncional, o inactivo, o con actividad reducida.

Las modificaciones genéticas descritas en el presente documento pueden emplear herramientas, métodos y mecanismos conocidos en la técnica, tales como los descritos por J. Sambrook et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2001).

Se pretende que el término "endógeno", como se emplea en el presente documento, incluya aquellas moléculas y secuencias, en particular genes o proteínas endógenos, que están presentes en la célula anfitriona de tipo salvaje (nativa), antes de su modificación para reducir la expresión de los genes endógenos respectivos y/o reducir la producción de las proteínas endógenas. En particular, una molécula de ácido nucleico endógena (p. ej., un gen) o proteína que se encuentra en (y puede obtenerse de) una célula anfitriona particular tal como se encuentra en la naturaleza, se entiende como "endógena para la célula anfitriona" o "endógena con respecto a la célula anfitriona". Por otra parte, una célula que "expresa endógenamente" un ácido nucleico o proteína expresa ese ácido nucleico o proteína al igual que un anfitrión del mismo tipo particular que se encuentra en la naturaleza. Además, una célula anfitriona de "producción endógena" o que "produce endógenamente" un ácido nucleico, proteína u otro compuesto produce ese ácido nucleico, proteína o compuesto al igual que una célula anfitriona del mismo tipo particular que se encuentra en la naturaleza.

Por lo tanto, incluso si una célula anfitriona ya no produce una proteína endógena, tal como en un mutante inactivado de la célula anfitriona, donde el gen que codifica la proteína está inactivado o suprimido, la proteína todavía se denomina en el presente documento "endógena".

El término "heterólogo", como se emplea en el presente documento con respecto a una secuencia de nucleótidos, una construcción tal como un casete de expresión, una secuencia de aminoácidos o una proteína, se refiere a un compuesto que es foráneo a una célula anfitriona determinada, es decir "exógeno", por ejemplo, que no se encuentra en la naturaleza en dicha célula anfitriona; o que se encuentra naturalmente en una determinada célula anfitriona, p. ej., es "endógeno", sin embargo, en el contexto de una construcción heteróloga o integrado en tal construcción heteróloga, p. ej., empleando un ácido nucleico heterólogo fusionado o junto con un ácido nucleico endógeno, haciendo así que la construcción sea heteróloga. La secuencia de nucleótidos heteróloga como se encuentra endógenamente también puede producirse de forma no natural, p. ej., cantidad mayor de lo esperado o mayor de lo que se encuentra naturalmente en la célula. La secuencia de nucleótidos heteróloga, o un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos heteróloga, posiblemente difiere en secuencia de la secuencia de nucleótidos endógena, pero codifica la misma proteína que se encuentra endógenamente. Específicamente, las secuencias de nucleótidos heterólogas son aquellas que no se encuentran en la misma relación con una célula anfitriona en la naturaleza. Se entiende por heteróloga cualquier secuencia de nucleótidos recombinante o artificial. Un ejemplo de un polinucleótido heterólogo es una secuencia de nucleótidos no asociada de forma nativa con un promotor, p. ej., para obtener un promotor híbrido, o conectado operablemente a una secuencia codificante, como se describe en el presente documento. Como resultado, se puede obtener un polinucleótido híbrido o quimérico. Un ejemplo adicional de un compuesto heterólogo es un polinucleótido que codifica una POI conectado operablemente a un elemento de control de la transcripción, p. ej., un promotor, al que normalmente no está conectada operablemente una secuencia codificante de POI endógena, de origen natural.

El término "conectado operablemente" como se emplea en el presente documento se refiere a la asociación de secuencias de nucleótidos en una única molécula de ácido nucleico, p. ej., un vector, o un casete de expresión, de manera que la función de una o más secuencias de nucleótidos se vea afectada por al menos otra secuencia de nucleótidos presente en dicha molécula de ácido nucleico. Al conectarse operablemente, una secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico en la misma molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está conectado operablemente con una secuencia codificante de un gen recombinante, cuando es capaz de efectuar la expresión de esa secuencia codificante. Como ejemplo adicional, un ácido nucleico que codifica un péptido señal está conectado operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una POI, cuando es capaz de expresar una proteína en la forma secretada, tal como una preforma de una proteína madura o la proteína madura. Específicamente, tales ácidos nucleicos conectados operablemente entre sí pueden conectarse inmediatamente, es decir sin elementos adicionales o secuencias de ácido nucleico entre el ácido nucleico que codifica el péptido señal y la secuencia de ácido nucleico que codifica una POI.

El término "levadura metilotrófica" como se emplea en el presente documento se refiere a géneros y especies de levadura que comparten una ruta metabólica común que les permite utilizar metanol como única fuente de carbono para su crecimiento. En una respuesta transcripcionalmente regulada a la inducción por metanol, varias de las enzimas se sintetizan rápidamente a niveles elevados. Dado que los promotores que controlan la expresión de estos genes se encuentran entre los promotores de levadura más fuertes y estrictamente regulados, las levaduras metilotróficas son atractivas como anfitriones para la producción a gran escala de proteínas recombinantes.

La levadura metilotrófica como se describe en el presente documento se muta mediante una o más modificaciones genéticas para hacer que presente deficiencia en la vía de utilización del metanol, en particular expresando de manera anormalmente baja uno o ambos genes que codifican las proteínas endógenas AOX1 y AOX2, respectivamente. Se entiende como "Mut-" en el presente documento una levadura metilotrófica que expresa de manera anormalmente baja o de otro modo presenta deficiencia en la expresión de ambos, el gen que codifica la proteína AOX1 y el gen que codifica la proteína AOX2. Para los fines descritos en el presente documento, tal levadura Mut- todavía se denomina "levadura metilotrófica", porque comprende una vía de utilización de metanol funcional antes de tal o tales modificaciones genéticas.

Típicamente se entiende que una secuencia "promotora" está conectada operablemente a una secuencia codificante, si el promotor controla la transcripción de la secuencia codificante. Si una secuencia promotora no está asociada de forma nativa con la secuencia codificante, su transcripción no está controlada por el promotor en células nativas (tipo salvaje) o las secuencias se recombinan con diferentes secuencias contiguas.

El promotor que se utiliza para el fin descrito en el presente documento se denomina en el presente documento "ECP". El ECP puede ser un promotor constitutivo, inducible o reprimible. En una realización específica, el ECP es un promotor que es inducible por metanol y una fuente de carbono de metanol, respectivamente.

El ECP, como se describe en el presente documento, en particular inicia, regula o media o controla de otro modo la expresión de un ADN codificante de POI. El ADN promotor y el ADN codificante pueden ser del mismo gen o de genes diferentes, y pueden ser del mismo organismo o de organismos diferentes.

Se entiende específicamente que un ECP inducible como se describe en el presente documento es un promotor regulable, que tiene diferente fuerza del promotor en el estado reprimido e inducido. El término "regulable" con respecto a un elemento regulador inducible o reprimible, tal como un promotor descrito en el presente documento, se referirá a un elemento que se reprime en una célula anfitriona en presencia de una cantidad excesiva de una sustancia (tal como un nutriente en el medio de cultivo celular) p. ej., en la fase de crecimiento de un cultivo discontinuo y se desreprime para inducir una fuerte actividad, p. ej., en la fase de producción (tal como después de alimentar con un sustrato complementario o añadir metanol para la inducción por metanol), de acuerdo con una estrategia de lotes alimentados. Un elemento regulador también puede diseñarse para que sea regulable, de modo que el elemento sea inactivo sin la adición de un aditivo de cultivo celular y activo en presencia de tal aditivo. Por tanto, la expresión de una POI bajo el control de tal elemento regulador puede inducirse tras la adición de tal aditivo.

La fuerza del ECP se refiere específicamente a su fuerza de transcripción, representada por la eficiencia del inicio de la transcripción que se produce en ese promotor con alta o baja frecuencia. Cuanto mayor sea la fuerza de la transcripción, más frecuentemente se producirá la transcripción en ese promotor. La fuerza del promotor es una característica típica de un promotor, porque determina la frecuencia con la que se transcribe una secuencia de ARNm determinada, proporcionando efectivamente mayor prioridad a la transcripción de algunos genes sobre otros, lo que lleva a una mayor concentración del transcrito. Un gen que codifica una proteína que se requiere en grandes cantidades, por ejemplo, típicamente tiene un promotor relativamente fuerte. La ARN polimerasa sólo puede realizar una tarea de transcripción a la vez y, por lo tanto, debe priorizar su trabajo para ser eficiente. Las diferencias en la fuerza del promotor se seleccionan para permitir esta priorización.

En el presente documento se prefiere un ECP fuerte, en particular un ECP que sea relativamente fuerte en el estado completamente inducido, que típicamente se entiende como el estado de actividad aproximadamente máxima. La fuerza relativa se determina comúnmente con respecto a un promotor comparable, denominado aquí promotor de referencia, que puede ser un promotor estándar, tal como el respectivo promotor pGAP de la célula utilizada como célula anfitriona.

La frecuencia de transcripción se entiende comúnmente como la tasa de transcripción, p. ej., según lo determinado por la cantidad de transcrito en un ensayo adecuado, p. ej., RT-PCR o transferencia Northern. Por ejemplo, la fuerza de transcripción de un promotor según la invención se determina en la célula anfitriona que esP. pastorisy se compara con el promotor pGAP nativo deP. pastoris.

La fuerza de un promotor para expresar un gen de interés se entiende comúnmente como la fuerza de expresión o la capacidad de soportar un alto nivel/tasa de expresión. Por ejemplo, la fuerza de expresión y/o transcripción de un promotor de la invención se determina en la célula anfitriona que esP. pastorisy se compara con el promotor pGAP nativo deP. pastoris.

La fuerza de transcripción comparativa en comparación con un promotor de referencia puede determinarse mediante métodos convencionales, por ejemplo, midiendo la cantidad de transcritos, p. ej., empleando una micromatriz, o también en un cultivo celular, por ejemplo, midiendo la cantidad de los respectivos productos de expresión génica en células recombinantes. En particular, la tasa de transcripción puede determinarse mediante la fuerza de la transcripción en una micromatriz, transferencia Northern o con PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) o con secuenciación de ARN (sec ARN) donde los datos muestran la diferencia del nivel de expresión entre condiciones con alta tasa de crecimiento y condiciones con baja tasa de crecimiento, o condiciones que emplean diferente composición de medios, y una alta intensidad de señal en comparación con el promotor de referencia.

La tasa de expresión puede determinarse, por ejemplo, mediante la cantidad de expresión de un gen informador, tal como eGFP.

El ECP, como se describe en el presente documento, ejerce una fuerza de transcripción relativamente alta, p. ej., reflejada por una tasa de transcripción o fuerza de transcripción de al menos 15% en comparación con el promotor pGAP nativo en la célula anfitriona, también llamado "promotor pGAP homólogo". Preferiblemente, la tasa o fuerza de transcripción es al menos cualquiera de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%, o incluso mayor, tal como al menos uno de 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% o 200%, o incluso mayor, en comparación con el promotor pGAP nativo, tal como se determina en la célula anfitriona (p. ej. eucariótica) seleccionada como célula anfitriona con fines de recombinación para producir la POI.

El promotor pGAP nativo típicamente inicia la expresión del gengapque codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), que es un promotor constitutivo presente en la mayoría de los organismos vivos. GAPDH (EC 1.2.1.12), una enzima clave de la glicólisis y la gluconeogénesis, desempeña un papel crucial en el metabolismo de los carbohidratos catabólicos y anabólicos.

El promotor pGAP nativo es específicamente activo en una célula eucariótica recombinante de manera similar a lo que ocurre en una célula eucariótica nativa de la misma especie o cepa, incluyendo la célula eucariótica no modificada (no recombinante) o recombinante. Comúnmente se entiende que tal promotor pGAP nativo es un promotor endógeno y, por tanto, homólogo para la célula anfitriona, y puede servir como promotor estándar o de referencia con fines de comparación. La fuerza relativa de expresión o transcripción de un promotor como se describe en el presente documento generalmente se compara con el promotor pGAP nativo de una célula de la misma especie o cepa que se utiliza como anfitrión para producir una POI.

El término "mutagénesis", como se emplea en el presente documento, se referirá a un método para proporcionar mutantes de una secuencia de nucleótidos, p. ej., mediante inserción, deleción y/o sustitución de uno o más nucleótidos, para obtener variantes de las mismas con al menos un cambio en la región codificante o no codificante. La mutagénesis puede ser mediante mutación aleatoria, semialeatoria o dirigida al sitio. Se pueden producir variantes mediante un método de mutagénesis adecuado utilizando una secuencia parental como referencia. Ciertos métodos de mutagénesis abarcan aquellos métodos de diseño mediante ingeniería genética del ácido nucleico o de síntesisde novode una secuencia de nucleótidos utilizando la información de la secuencia parental respectiva como molde. Los métodos de mutagénesis específicos aplican el diseño mediante ingeniería genética racional de un mutante.

Los términos "secuencia de nucleótidos" o "secuencia de ácidos nucleicos" utilizados en el presente documento se refieren a ADN o ARN. "Secuencia de ácido nucleico" o "secuencia de polinucleótidos" o simplemente "polinucleótido" se refieren a un polímero de hebra sencilla o doble de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leídas desde el extremo 5' al 3'. Incluye casetes de expresión, plásmidos autorreplicantes, polímeros infecciosos de ADN o ARN y ADN o ARN no funcional.

El término "proteína de interés (POI)" como se emplea en el presente documento se refiere a un polipéptido o una proteína que se producen mediante tecnología recombinante en una célula anfitriona. Más específicamente, la proteína puede ser un polipéptido que no se encuentra naturalmente en la célula anfitriona, es decir, una proteína heteróloga, o bien puede ser nativa de la célula anfitriona, es decir, una proteína homóloga para la célula anfitriona, pero se produce, por ejemplo, mediante transformación con un vector autorreplicante que contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica la POI, o tras la integración mediante técnicas recombinantes de una o más copias de la secuencia de ácido nucleico que codifica la POI en el genoma de la célula anfitriona, o mediante modificación recombinante de una o más secuencias reguladoras que controlan la expresión del gen que codifica la POI, p. ej., de una secuencia promotora. En algunos casos, el término POI, como se emplea en el presente documento, también se refiere a cualquier metabolito producto de la célula anfitriona mediado por la proteína expresada de forma recombinante.

El término "identidad de secuencia" de una variante, homólogo u ortólogo en comparación con una secuencia de nucleótidos o aminoácidos parental indica el grado de identidad de dos o más secuencias. Dos o más secuencias de aminoácidos pueden tener restos de aminoácidos iguales o conservados en una posición correspondiente, hasta cierto punto, hasta el 100%. Dos o más secuencias de nucleótidos pueden tener pares de bases iguales o conservados en una posición correspondiente, hasta cierto punto, hasta el 100%.

La búsqueda de similitud de secuencias es una estrategia eficaz y confiable para identificar homólogos con exceso (p. ej., al menos 50%) de identidad de secuencia. Las herramientas de búsqueda de similitud de secuencias que se utilizan con frecuencia son p. ej., BLAST, FASTA y HMMER.

Las búsquedas de similitud de secuencias pueden identificar proteínas o genes homólogos detectando un exceso de similitud y una similitud estadísticamente significativa que refleje una ascendencia común. Los homólogos pueden abarcar ortólogos, que en el presente documento se entienden como la misma proteína en diferentes organismos. p. ej., variantes de tal proteína en diferentes organismos o especies.

Una secuencia ortóloga de la misma proteína en diferentes organismos o especies es típicamente homóloga a la secuencia de la proteína, específicamente de ortólogos que se originan en el mismo género. Típicamente, los ortólogos tienen al menos aproximadamente uno cualquiera de 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad, hasta 100% de identidad de secuencia.

Específicamente, los ortólogos de una proteína se pueden determinar tras el reemplazo de dicha proteína o el gen que codifica dicha proteína por las secuencias ortólogas en una célula anfitriona inactivada, cuya célula anfitriona ha sido modificada para inactivar el gen o proteína respectivos antes de tal reemplazo.

Por ejemplo, si una supuesta proteína ADH2, AOX1 o AOX2 es funcional en una célula anfitriona deP. pastorisreemplazando la proteína endógena respectiva en una célula anfitriona deP. pastorisen la que se ha eliminado el gen que codifica tal proteína endógena, tal supuesta proteína ADH2, AOX1 o AOX2 puede considerarse un homólogo respectivo para el propósito descrito en el presente documento.

La proteína AOX1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:1 es originada enK. phaffii.Se entiende bien que existen secuencias homólogas presentes en otras células anfitrionas de levadura metilotróficas. Por ejemplo, la levadura dePichia pastoriscomprenden las respectivas secuencias homólogas.Pichia pastorisse ha reclasificado en un nuevo género,Komagataella,y dividido en tres especies,K. pastoris, K. phaffii,yK. pseudopastoris.

Las secuencias homólogas específicas de SEQ ID NO:1 se encuentran, p. ej., enK. pastoris(p. ej., SEQ ID NO: 9, por ejemplo, codificada por la secuencia de nucleótidos que comprende o consiste en SEQ ID NO: 10),Ogataea polymorpha(p. ej., SEQ I<d>NO: 19 por ejemplo, codificada por la secuencia de nucleótidos que comprende o consiste en SEQ ID NO: 20) oOgataea methanolica(p. ej., SEQ ID NO:13 tal como codificada por la secuencia de nucleótidos que comprende o consiste en SEQ ID NO:14).

La proteína AOX2 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:3 es originada enK. phaffii.Se entiende bien que existen secuencias homólogas presentes en otras células anfitrionas de levadura metilotróficas. Por ejemplo, la levadura dePichia pastoriscomprende las respectivas secuencias homólogas.Pichia pastorisse ha reclasificado en un nuevo género,Komagataella,y dividido en tres especies,K. pastoris, K. phaffii,yK. pseudopastoris.

Las secuencias homólogas específicas de SEQ ID NO:3 se encuentran, p. ej., enK. pastoris(p. ej., SEQ ID NO:11, por ejemplo, codificada por la secuencia de nucleótidos que comprende o consiste en SEQ ID NO:12),Ogataea polymorpha(p. ej., SEQ ID NO:19, por ejemplo, codificada por la secuencia de nucleótidos que comprende o consiste en SEQ ID NO:20), oOgataea methanolica(p. ej., SEQ ID NO:15, por ejemplo, codificada por la secuencia de nucleótidos que comprende o consiste en SEQ ID NO:16).

Ogataea polymorphatiene sólo una alcohol oxidasa, ilustrada en el presente documento por SEQ ID NO:19. Por lo tanto, la reducción de la expresión de AOX1 y AOX2 enOgataea polymorphacomo se describe en el presente documento se lleva a cabo eficazmente reduciendo la expresión de la alcohol oxidasa endógena paraOgataea polymorpha.

Cualquier secuencia homóloga de una proteína AOX1 o AOX2 con una determinada identidad de secuencia descrita en el presente documento, en particular cualquier proteína que sea un ortólogo de la proteína AOX1 o AOX2 deP. pastorisestá incluida en la definición de la proteína AOX1 o proteína AOX2 respectiva, como se describe en el presente documento.

La proteína ADH2 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:50 se origina enK. phaffii.Se entiende bien que existen secuencias homólogas presentes en otras células anfitrionas de levadura metilotróficas. Por ejemplo, la levadura dePichia pastoriscomprende las respectivas secuencias homólogas.Pichia pastorisse ha reclasificado en un nuevo género,Komagataella,y dividido en tres especies,K. pastoris, K. phaffii,yK. pseudopastoris.

Las secuencias homólogas específicas de SEQ ID NO:50 son, p. ej., uno cualquiera de SEQ ID NO:52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 o 70.

Cualquier secuencia homologa de una proteína ADH2 con una determinada identidad de secuencia descrita en el presente documento, en particular cualquier proteína que sea un ortólogo de la proteína ADH2 deP. pastoris, como se describe en el presente documento.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de aminoácidos, homólogos y ortólogos descritos en el presente documento se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia polipeptídica específica, después de alinear la secuencia e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluido cualquier algoritmo necesario para lograr el alineamiento máximo en toda la longitud de las secuencias que se comparan.

Para los fines descritos en el presente documento, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el programa NCBI BLAST versión BLASTP 2.8.1 con los siguientes parámetros ilustrativos: Programa: blastp, Tamaño de palabra: 6, Valor esperado: 10, Tamaño de lista de resultados: 100, Penalización por espacio: 11,1, Matriz: BLOSUM62, Cadena de filtro: F, Ajuste de composición: Ajuste de matriz de puntuación de composición condicional.

"Porcentaje (%) de identidad" con respecto a una secuencia de nucleótidos p. ej., de un promotor o de un gen, se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia de ADN candidata que es idéntico a los nucleótidos en la secuencia de ADN, después de alinear la secuencia e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de la secuencia. El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de nucleótidos se puede lograr de diversas maneras que están dentro de los conocimientos especializados en la técnica, por ejemplo, utilizando soporte lógico informático disponible públicamente. Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluido cualquier algoritmo necesario para lograr el alineamiento máximo en toda la longitud de las secuencias que se comparan.

Para los fines descritos en el presente documento (a menos que se indique lo contrario), la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el programa NCBI BLAST versión BLASTN 2.8.1 con los siguientes parámetros ilustrativos: Programa: blastn, Tamaño de palabra: 11, Umbral esperado: 10, Tamaño de la lista de resultados: 100, Penalización por espacio: 5,2, Puntuaciones de coincidencia/no coincidencia: 2, -3, Cadena de filtro: Regiones de baja complejidad, Marcar solo para tabla de búsqueda.

Los términos "aislado" o "aislamiento" como se emplean en el presente documento con respecto a una POI se referirán a tal compuesto que ha sido suficientemente separado del entorno con el que estaría asociado naturalmente, en particular un sobrenadante de cultivo celular, para existir en forma "purificada" o "sustancialmente pura". Sin embargo, "aislado" no significa necesariamente la exclusión de mezclas artificiales o sintéticas con otros compuestos o materiales, o la presencia de impurezas que no interfieren en la actividad fundamental y que pueden estar presentes, por ejemplo, debido a una purificación incompleta. Los compuestos aislados se pueden formular adicionalmente para producir preparaciones de los mismos y aún aislarse con fines prácticos; por ejemplo, una POI se puede mezclar con portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables cuando se utiliza en diagnóstico o terapia.

El término "purificado" como se emplea en el presente documento se referirá a una preparación que comprende al menos 50% (moles/mol), preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de un compuesto (p. ej., una POI). La pureza se mide mediante métodos apropiados para el compuesto (p. ej., métodos cromatográficos, electroforesis en gel de poliacrilamida, análisis por HPLC y similares). Se puede obtener una POI aislada y purificada como se describe en el presente documento purificando los sobrenadantes del cultivo celular para reducir las impurezas.

Como métodos de aislamiento y purificación para obtener un polipéptido o producto proteico recombinante, se pueden utilizar métodos, tales como métodos que utilizan diferencia de solubilidad, tales como precipitación por adición de sal y precipitación con disolvente, métodos que utilizan diferencia de peso molecular, tales como ultrafiltración y electroforesis en gel, métodos que utilizan diferencia de carga eléctrica, tales como cromatografía de intercambio iónico, métodos que utilizan afinidad específica, tales como cromatografía de afinidad, métodos que utilizan diferencia de carácter hidrófobo, tales como cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa, y métodos que utilizan diferencia de punto isoeléctrico, tales como isoelectroenfoque.

Se prefieren los siguientes métodos convencionales: separación y lavado de células (desechos) mediante Microfiltración o Filtro de Flujo Tangencial (TFF) o centrifugación, purificación de POI mediante precipitación o tratamiento térmico, activación de POI mediante digestión enzimática, purificación de POI mediante cromatografía, tal como intercambio iónico (IEX), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), Cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) o cromatografía HPLC, precipitación de POI por concentración y lavado mediante etapas de ultrafiltración.

Un producto altamente purificado está esencialmente libre de proteínas contaminantes y preferiblemente tiene una pureza de al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, o incluso al menos 98%, hasta 100%. Los productos purificados pueden obtenerse mediante purificación del sobrenadante del cultivo celular o también a partir de desechos celulares.

Una POI aislada y purificada puede identificarse mediante métodos convencionales tales como T ransferencia Western, HPLC, ensayo de actividad o ELISA.

El término "recombinante" como se emplea en el presente documento significará "preparado por o como resultado de diseño mediante ingeniería genética". Un anfitrión recombinante puede diseñarse mediante ingeniería genética para suprimir y/o inactivar uno o más nucleótidos o secuencias de nucleótidos, y puede comprender específicamente un vector de expresión o vector de clonación que contiene una secuencia de ácido nucleico recombinante, en particular que emplea una secuencia de nucleótidos foránea para el anfitrión. Una proteína recombinante se produce expresando un ácido nucleico recombinante respectivo en un anfitrión. El término "recombinante" con respecto a una POI como se emplea en el presente documento, incluye una POI que se prepara, expresa, crea o aísla por medios recombinantes, tal como una POI aislada de una célula anfitriona transformada para expresar la POI. De acuerdo con la presente invención, se pueden emplear mecanismos convencionales de biología molecular, microbiología y ADN recombinante dentro del conocimiento práctico del experto. Tales mecanismos se explican detalladamente en la bibliografia. véase p. ej., Maniatis, Fritsch y Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1982).

Determinadas células anfitrionas recombinantes son células anfitrionas "diseñadas mediante ingeniería genética", es decir, células anfitrionas que han sido manipuladas mediante ingeniería genética, es decir, por intervención humana. Cuando se diseña mediante ingeniería genética una célula anfitriona para reducir la expresión o expresar de manera anormalmente baja un gen determinado o la proteína respectiva, la célula anfitriona se manipula de tal manera que la célula anfitriona ya no tiene la capacidad de expresar tal gen y tal proteína, respectivamente, en comparación con la célula anfitriona bajo la misma condición antes de la manipulación, o en comparación con las células anfitrionas que no están diseñadas mediante ingeniería genética de manera que dicho gen o dicha proteína se expresen de manera anormalmente baja.

La descripción anterior se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, tales ejemplos son meramente representativos de métodos para poner en práctica una o más realizaciones de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de cepas de Pichia p astoris negativas para la utilización de metanol.

Para generar las cepas negativas para utilización de metanol (Mut-) se suprimieron dos genes responsables de la utilización del metanol denominadosAOX1yAOX2del genoma dePichia pastoris(sin.Komagataella phaffii).

a) A estos efectos la cepa deP. pastoris(CBS2612, CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Países Bajos) se hizo electrocompetente. La cepa se inoculó en 100 mL de medio YPD (cultivo principal) durante 16-20 horas (25°C; 180 rpm) y se cosechó a una densidad óptica (DO600) de 1,8 -3 mediante centrifugación (5 min; 1500 g; 4°C) en dos tubos Falcon de 50 mL. El sedimento celular se resuspendió en 10 mL de YPD HEPES 20 mM DTT 25 mM y se incubó (30 min; 25°C; 180 rpm). Después del período de incubación, los tubos Falcon se cargaron con 40 mL de agua destilada estéril enfriada con hielo y se centrifugaron (5 min; 1500 g; 4°C) (Eppendorf AG, Alemania). El sedimento celular se resuspendió en tampón HEPES 1 mM estéril enfriado con hielo, pH 8 y se centrifugó (5 min; 1500 g; 4°C). El sedimento celular se resuspendió en 45 mL de sorbitol 1 M enfriado con hielo y se centrifugó (5 min; 1500 g; 4°C). El sedimento se resuspendió en 500 pl de sorbitol 1 M enfriado con hielo y se dividieron en alícuotas de 80 pl en tubos Eppendorf de 1,5 mL enfriados con hielo. Las células electrocompetentes en alícuotas se mantuvieron a -80°C hasta su uso.

b) El cultivo de cepas de levadura se realizó en medio YPD (10 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de peptona, 20 g/L de glucosa) o placas de agar YPD (10 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de peptona, 20 g/L de glucosa, 20 g/L de agar-agar) que contenían 500 pg/mL de Geneticina o 200 pg/mL de Higromicina cuando era necesario para la selección.

c) Para generar las cepas de deleción deAOX1yAOX2se utilizó el enfoque del casete de marcador dividido (Gasser et al., 2013). Los fragmentos de ADN para generar las deleciones de genes se encuentran en la Tabla 1. El casete de marcador dividido portaba un casete de resistencia a antibióticos para Geneticina flanqueado por sitios LoxP.

d) Las deleciones se realizaron añadiendo 0,5 pg del casete 1 de marcador dividido de AOX1 y 0,5 pg del casete 2 de marcador dividido de AOX1 a las alícuotas de células electrocompetentes y se incubaron durante 5 minutos en hielo. La electroporación se realizó a 2 kV durante 4 milisegundos (Gene Pulser, Bio-Rad Laboratories, Inc, EE. UU.). Después de la transformación, las células sometidas a electroporación se suspendieron en 1 mL de medio YPD y se regeneraron durante 1,5 h a 3 h en agitación a 30°C a 700 rpm en un termoagitador (Eppendorf AG, Alemania). Posteriormente, se sembraron 20 pl y 150 pl de la suspensión celular en placas YPD que contenían 500 pg/mL de Geneticina para la selección y se incubaron a 28°C durante 48 horas. Las colonias que aparecieron se volvieron a sembrar en placas YPD de nueva aportación que contenían 500 pg/mL de Geneticina. La interrupción correcta del locusAOX1se verificó mediante PCR en ADN genómico utilizando los cebadores AOX1 ctrl_Fwd y AOX1_ctrl_Rev (Tabla 2) que se unen fuera del casete de deleción. Se seleccionó un clon basándose en la amplificación por PCR y la secuenciación del amplicón de PCR que confirma la deleción correcta del gen deseado creando una cepa aox1A::KanMX deP. pastoris.Se incubó un cultivo líquido a partir de una única colonia positiva y se hizo electrocompetente como se explica en el Ejemplo 1a), excepto por la adición de 500 pg/mL de Geneticina al medio líquido para generar el cultivo principal. Las cepas se sometieron a electroporación con 500 pg de plásmido pTAC_Cre_Hph_Mx4 que portaba una recombinasa Cre necesaria para la deleción del casete de resistencia al antibiótico Geneticina entre las regiones LoxP y un casete de resistencia a Higromicina para la selección (Marx, Mattanovich y Sauer, 2008). La electroporación se realizó como se describe y se seleccionó determinar para la pérdida de resistencia a la Geneticina volviendo a sembrar los transformantes en paralelo en YPD con 500 pg/mL de Geneticina y 200 pg/mL de Higromicina y placas YPD con solo 200 pg/mL de Higromicina. Se seleccionaron clones que no podían crecer en placas YPD con 500 pg/mL de Geneticina y 200 pg/mL de Higromicina, pero que podían crecer en placas YPD con sólo 200 pg/mL de Higromicina. La deleción exitosa de la región codificante deAOX1y el marcador antibiótico se verificó mediante amplificación por PCR con los cebadores AOX1_ctrl_Fwd y AOX1_ctrl_Rev (Tabla 2) y secuenciación del amplicón por PCR (Microsynth AG, Suiza). La cepa generada se denomina CBS2612AaoxldeP. pastorisy tiene un fenotipo mutS. Esta se seleccionó para la manipulación genética adicional.

e) Se utilizó CBS2612AaoxldeP. pastorispara generar células electrocompetentes con el protocolo descrito en a) y se sometió a electroporación con 0,5 pg del casete 1 de marcador dividido de AOX2 y 0,5 pg del casete 2 de marcador dividido de AOX2 (Tabla 1) con el procedimiento descrito en d). El marcador antibiótico se eliminó con el mismo procedimiento descrito en d). La deleción exitosa de la región codificante deAOX2y el marcador antibiótico se verificó mediante amplificación por PCR con los cebadores AOX2_ctrl_fwd y AOX2_ctrl_rev (Tabla 2) y secuenciación del amplicón por PCR (Microsynth AG, Suiza). La cepa generada se denomina CBS2612Aaox1Aaox2deP. pastorisy tiene un fenotipo negativo para la utilización de metanol (Mut-).

f) Se aisló ADN genómico para amplificaciones por PCR con el Kit de Purificación de ADN Genómico Wizard® (Promega Corporation, EE. UU.) según recomendación del fabricante. Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron con la polimerasa Q5 (New England Biolabs, Inc., EE. UU.) según las recomendaciones del fabricante.

Tabla 1: Secuencia de ADN del casete de marcador dividido utilizada para generar las cepas de deleción AOX1 y

AOX2.

Tabla 2: Cebadores de reacción en cadena de la polimerasa

Ejemplo 2: Producción de eGFP intracelular conñ.aox1deP. pastorisyAaox1Aaox2deP. pastorisbajo el promotorAOX1inducible por metanol.

Para probar la capacidad de producción de proteínas y la actividad promotora, se transformaron las cepasAaox1Aaox2deP. pastorisyAaoxldeP. pastoriscon construcciones de expresión para la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) (Tabla 4). La secuencia codificante de eGFP estaba bajo el control de la expresión de Paox1 : PP7435_chr4 (237941... 238898).

a) La construcción de expresión BB3aN_pAOX1_GFP_ScCYCtt se ensambló utilizando el procedimiento de ensamblaje Golden Gate como se describe (Prielhofer et al., 2017) a partir de los plásmidos BB1_12_pAOX1, BB1_23_eGFP, BB1_34_ScCYC1tt y BB3aN_14*. Los plásmidos y las secuencias están disponibles en el kit Golden PiCS Núm. 1000000133 (Addgene, Inc., EE. UU.). Antes de la electroporación, los plásmidos se linealizaron con la enzima de restricción Ascl (New England Biolabs, Inc., EE. UU.) según el protocolo del fabricante y se purificaron con Kits de extracción de fragmentos de ADN en gel/PCR Hi Yield® (Süd-Laborbedarf GmbH, Alemania). 500 nanogramos del plásmido linealizado se transformaron enAaox1Aaox2deP. pastorisyAaoxldeP. pastoriselectrocompetentes como se describió anteriormente en el Ejemplo 1a) y 1d). Los transformantes positivos se seleccionaron en YPD con 100 pg/L de Nourseotricina y se utilizaron para experimentos de escrutinio posteriores.

b) Experimentos de escrutinio a pequeña escala de expresión intracelular de eGFP enAaox1Aaox2deP. pastorisyAaoxldeP. pastoris.Diez transformantes del ejemplo 2a) se recogieron e inocularon en un cultivo nocturno en placas de 24 pocillos profundos que contenían 2 mL de YPD y 100 pg/L de Nourseotricina por pocillo. Todos los transformantes se probaron por duplicado. Las placas de 24 pocillos se sellaron con una membrana con aire permitido y se incubaron a 25°C y 280 rpm. Para el escrutinio del nivel de expresión intracelular de eGFP, los cultivos nocturnos se transfirieron a placas de 24 pocillos profundos con 2,5 mL de medio ASMv6 mínimo con 25 g/L de polisacárido y amilasa al 0,3% (m2p-labs GmbH, Alemania) para una liberación lenta de glucosa y se incubaron durante dos horas, seguido de una adición de 0,2% (v/v) o 1% (v/v) de metanol para la inducción de la producción de eGFP. Las mediciones de eGFP se realizaron 4 y 20 horas después de la inducción utilizando un citómetro de flujo Gallios (Beckman Coulter, Inc., EE. UU.). Para ello, las células se diluyeron hasta una DO600 de 0,5 en solución salina tamponada con fosfato que contenía 0,24 g/L de KH2PO4, 1,8 g/L de Na2HPO4*2H2O, 0,2 g/L de KCl, 8 g/L de NaCl. Se midieron 20.000 eventos. Los valores de FX se calcularon con el soporte lógico FACS Express versión 3 (De Novo Software, EE. UU.) utilizando la ecuación:

8000

FX = Valor adimensional

FL1 = Fluorescencia medida con un filtro a505 - 545nm

FSC = dispersión frontal

El método ya se había descrito (Ata, Prielhofer, Gasser, Mattanovich y Qalik, 2017; Hohenblum, Borth y Mattanovich, 2003; Prielhofer et al., 2013).

c) Medio mínimo ASMv6: 6,3 g/L (NH4)2HPO4, 0,8 g/L (NH4)2SO4, 0,49 g/L de MgSO4*7H2O, 2,64 g/L de KCI, 0,054 g/L de CaCl2*2H2O, 22 g/L de ácido cítrico monohidratado, 1,47 mL/L de metales traza de PTM0, 0,8 mg/L de biotina, 20 mL/L de NH4OH (25%); el pH se ajustó a 6,5 con KOH.

d) Los resultados se muestran en la Tabla 3. La fluorescencia fue un indicador para determinar los niveles de eGFP intracelular y los niveles de eGFP intracelular fueron un indicador para determinar la actividad de Paox1. Los resultados muestran que a las 20 horas bajo inducción con metanol al 1% el promotor es activo en la cepaAaox1Aaox2deP. pastorisy se produce eGFP. La inducción de la cepaAaox1Aaox2deP. pastorisBB3aN_pAOX1_GFP_ScCYCtt es mejor con 1% que con 0,2% de metanol después de 20 h, no se observa diferencia entre las concentraciones de metanol en la cepaAaox1deP. pastoris.

Tabla 3: Resultados (valores FX) con desviación estándar del experimento descrito en el Ejemplo 2b)

Tabla 4: Secuencias codificantes de los Genes de interés expresados enP. pastoris Aaoxl Aaox2yP. pastoris

Aaoxl.

Ejemplo 3: Generación de cepas L a o x l de P. pastoris y A aox1A aox2 de P. pastoris que producen HSA y VHH secretadas bajo el promotor AOX1 inducible por metanol.

Para probar la capacidad de producir proteínas recombinantes secretadas en la cepaAaox1Aaox2deP. pastorisy compararla con la cepaAaoxldeP. pastoris,las cepas se transformaron con construcciones de expresión para dos proteínas modelo secretadas: (1) albúmina sérica humana con su líder de secreción nativo (HSA) o (2) región variable de un anticuerpo de camélido con el líder de secreción del factor de apareamiento a (VHH) de S.cerevisiae.La secuencia codificante de estos genes de interés (con codones optimizados y sintetizados por proveedores externos) se puede encontrar en la Tabla 4.

a) Las construcciones de expresión pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT y pPM2pZ30_pAOX1_aMF-vHH_CycTT utilizadas para la producción de<h>S<a>y VHH son derivados del vector pPuzzle ZeoR descrito en el documento WO2008128701A2, consistente en ori pUC19 deE. co liy el casete de resistencia al antibiótico Zeocina. En este caso de pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT, la resistencia a Zeocina se intercambia por resistencia a Nourseotricina mediante restricción y ligación. Además, los vectores portan una secuencia de integración que es homologa al locus PGI PP7435_Chr3 (1366329... 1367193) para una integración eficiente. El vector de expresión se describe con más detalle en otra parte (Gasser et al., 2013; Stadlmayr et al., 2010). La expresión del gen de interés (GOI) estuvo mediada por el Paox1 PP7435_chr4 (237941...238898) y el terminador de transcripción CYC1 deSaccharomyces cerevisiae.El gen de la albúmina sérica humana (HSA) (GenBank NP_000468) tenía codones optimizados paraP. pastorisy se sintetizó. Tiene un líder de secreción nativo y, por tanto, se secreta al sobrenadante. El gen para VHH tiene codones optimizados paraP. pastorisy se sintetiza (Tabla 4), tiene un líder de tipo de apareamiento a N-terminal de S.cerevisiaepara la secreción al sobrenadante. Con el fin de transformar las construcciones de expresión, los vectores circulares se linealizaron mediante restricción en la secuencia homóloga de PGI1 con Xmnl (New England Biolabs, Inc., EE. UU.) y se purificaron con Kits de extracción de fragmentos de ADN en gel/PCR Hi Yield® (Süd-Laborbedarf GmbH, Alemania).

b) Electroporación de.P. pastoris AaoxlAaox2yP. pastoris Aaoxlelectrocompetentes con 500 nanogramos de plásmidos pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT y pPM2pZ30_pAOX1_aMF-vHH_CycTT linealizados y la selección se llevó a cabo como se describió previamente en el Ejemplo1a)y Ejemplo1d). La selección se realizó en placas YPD con 100 pg/mL de Nourseotricina o 25 pg/mL de Zeocina, respectivamente.

Ejemplo 4: Escrutinio a pequeña escala de P. pastoris A a o x l A ao x2 y P. pastoris A a o x l que producen HSA y VHH.

a) Para el precultivo, los transformantes se inocularon en 2 mL de YPD con 100 pg/mL de Nourseotricina o 25 pg/mL de Zeocina según la resistencia a los antibióticos utilizada para la selección. Para cada construcción de expresión se seleccionaron doce transformantes para su escrutinio. Los cultivos previos al cultivo y de escrutinio se cultivaron en placas de 24 pocillos selladas con una membrana permeable al aire y se incubaron a 25°C a 280 rpm. El cultivo de escrutinio se inoculó con una densidad óptica inicial (DO600) de 8 en 2 mL de medio mínimo (ASMv6) con un sistema de liberación lenta de glucosa basado en cuentas de alimentación de 6 mm (Kuhner Shaker GmbH, Alemania) para mantener los cultivos en el límite de glucosa. Las cepas se compararon con diferentes procedimientos de alimentación de metanol que diferían en el metanol total recibido y la duración (Tabla 5).

b) Después del período de incubación, se extrajo 1 mL de cada cultivo y se centrifugó en un tubo Eppendorf pesado previamente. Se eliminó el sobrenadante y se midió la concentración de proteína con el Caliper LabChip GXII Touch (PerkinElmer, Inc., EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. El peso húmedo celular se determinó pesando el tubo Eppendorf con el sedimento celular y se calculó de la siguiente manera: Peso (lleno) - Peso (vacío) = Peso húmedo celular (WCW) (g/L). A partir de estos datos se calculó el rendimiento: Rendimiento (pg/g) = Concentración de proteína/Peso húmedo celular. Los datos de transformantes que tenían el doble de concentración o que no tenían proteína detectable en el sobrenadante se eliminaron del análisis como valores atípicos. Los valores atípicos se consideran transformantes que tienen dos copias de la construcción de expresión o ninguna copia (Aw y Polizzi, 2013; Schwarzhans et al., 2016).

Tabla 5: Descripción general de las estrategias de escrutinio utilizadas para probar el rendimiento de producción de proteína secretada de las cepas transformadas. * La primera inyección fue 0,5% de metanol.

c) Los resultados muestran queP. pastoris AaoxlAaox2puede producir proteínas secretadas bajo la inducción de Paox1 y que el rendimiento es comparable al deP. pastoris Aaoxlutilizado como patrón de la industria (Tabla 6). En la estrategia "Dos inyecciones - prolongado",P. pastoris AaoxlAaox2muestra un mejor rendimiento, lo que indica que bajo tiempos de cultivo más prolongados con menos metanol,P. pastoris AaoxlAaox2tiene una ventaja de rendimiento. Además, esto muestra que es posible utilizar condiciones de glucosa limitadas para detectar cepasAaox1Aaox2deP. pastorisproductoras de proteínas secretadas controladas por Paox1 e inducción por metanol.

Tabla 6: Rendimiento promedio del producto secretado con desviación estándar en pg de producto/g WCW de las cepas probadas en diferentes condiciones de escrutinio.

Ejemplo 5: Cultivos en biorreactor

Para determinar el comportamiento y parámetros de procedimiento deP. pastoris Aaox1Aaox2en modo de lotes alimentados en un entorno de producción de proteínas recombinantes, se realizaron cultivos en biorreactores. Los cultivos se realizaron de la siguiente manera.

a) Se utilizaron biorreactores DASGIP con un volumen de trabajo de 0,7 L (Eppendorf AG, Alemania). Un sistema de Biorreactor consiste en cuatro reactores dispuestos en un biobloque para controlar la temperatura. Cada reactor estaba conectado a 4 bombas peristálticas controladas por soporte lógico. Además, cada reactor tenía 2 balanzas disponibles que estaban conectadas al soporte lógico de control DASGIP (Eppendorf AG, Alemania) para ajustar gravimétricamente la velocidad de la bomba. Cada reactor estaba conectado con un suministro de gas controlable (podrían mezclarse en cualquier cantidad deseada aire a presión, N2, O2) y un analizador de gas para la medición de la concentración de O2 y CO2 en los gases de escape del reactor. Los reactores contaban con una sonda de pH y una sonda de Oxígeno Disuelto (OD) conectadas al soporte lógico de control DASGIP. El soporte lógico de control DASGIP registraba todos los parámetros a intervalos de un minuto.

b) El medio de cultivo del biorreactor consistió en medio BSM (Mellitzer et al., 2014): 11,48 g/L H3PO4, 0,5 g/L CaCl2*2H2O, 7,5 g/L de MgSO4*7H2O, 9 g/L-K2SO4, 2 g/L de KOH, 40 g/L de glicerol, 0,25 g/L de NaCl, 4,35 mL/L de PTM0, 0,87 mg/L de biotina, 0,1 mL/L de Glanapon 2000, pH ajustado a 5,5 con 25% de NH3.

c) PTM0 consistió en: 6,0 g CuSO4*5H2O, 0,08 g de Nal, 3,36 g de MnSO4*H2O, 0,2 g de Na2MoO4*2H2O, 0,02 g H3BO3, 0,82 g de CoCl2, 20,0 g de ZnCl2, 65,0 g FeSO4*7H2O, 5 mL/L H2SO4 (95%-98%).

d) El medio de alimentación de Glucosa consistió en: 50% (p/p) de glucosa, 2,08 mg/kg de biotina, 10,4 mL/kg de PTM0. El medio de alimentación de metanol fue: 50% (v/v) o 100% (v/v) de metanol. El medio de alimentación de glicerol consistió en: 60% (p/p) de glicerol, 2,08 mg/kg de biotina, 10,4 mL/kg de PTM0.

e) El punto de ajuste del Oxígeno Disuelto (OD) fue de 20%. En ciertos casos, se desactivó el control de OD y la agitación y aireación se ajustaron manualmente a 750 rpm constantes y 9,5 sL/h. El pH se ajustó a 5,0 o 5,5 con 12,5% o 25% de NH3 controlado por el soporte lógico de control DASGIP. El control de ácido se logró con 10% de H3PO4 mediante adición manual cuando fue necesario. La temperatura se fijó en 25°C. La DO600 inicial fue 2 y el volumen inicial fue 300 mL más 15 mL de cultivo de inoculación.

f) El muestreo se realizó diariamente (aproximadamente cada 24 horas). Primero se tomó un producto aspirado de 3 mL del reactor para eliminar el volumen muerto del puerto de muestreo. Después se tomaron 9 mL de muestra. Se pipetearon 3 x 2 mL en tubos Eppendorf de 2 mL pesados de nuevo y 1 x 1,5 mL en un tubo Eppendorf de 1,5 mL. Las muestras se centrifugaron (16.000 g, 10 min, 4°C). El sobrenadante se recogió para análisis de proteínas y HPLC y se almacenó a -20°C. El sedimento se lavó mediante resuspensión en 1 mL de HCl 0,1 M para eliminar las trazas de sales y se centrifugó nuevamente (16.000 g, 10 min, 4°C). Después se secó el sedimento durante 24 horas a 105°C para determinar el peso seco celular. El peso seco celular se calculó de la siguiente manera: (Peso (lleno) - Peso (vacío)) / 2 = Peso seco de las células (g/L) y se calculó como el promedio de tres réplicas. Si solo se necesitaba una muestra de HPLC, solo se tomaron 2 mL de muestra.

g) La viabilidad celular se midió tiñendo la suspensión celular con yoduro de propidio. Para ello, la suspensión celular de la muestra del reactor se diluyó con solución salina tamponada con fosfato hasta una DO600 de 0,5 y se mezcló con una solución de partida de yoduro de propidio hasta una concentración final 10 pM antes de la medición con el citómetro de flujo Gallios (Beckman coulter, Inc., EE. UU.) con un filtro de 590 - 650 nm. Se midieron 50.000 eventos por muestra.

Ejemplo 6: Determinación de la tasa de evaporación de metanol de los Biorreactores sin células.

Para evaluar la tasa de evaporación de metanol de los reactores mediante aireación y agitación, los reactores se cargaron con medios estériles y se pulsaron con metanol; se tomaron muestras para determinar la concentración de metanol.

a) Para este ejemplo, se cargaron dos reactores con 310 mL de medio BSM sin glicerol y dos reactores se cargaron con 500 mL de medio BSM sin glicerol para simular los medios al final de la fase discontinua donde el cultivo en crecimiento consume el glicerol.

b) La velocidad del agitador del reactor se ajustó a 760 rpm y la gasificación a 9,5 sL/h como sería el caso en un cultivo de P.pastoris Aaox1Aaox2.Los parámetros se pueden encontrar en la Tabla 7.

c) Se añadió manualmente un pulso de 50% (v/v) de metanol para aumentar la concentración de metanol a 1% (v/v) y se tomó una muestra para determinar la concentración real alcanzada. Las muestras se tomaron a las 3,4, 6,5, 22,4, 31,0 y 47,9 horas retirando primero 3 mL de volumen muerto del puerto de muestra y desechando el producto aspirado. Inmediatamente después se tomó una muestra de 4 mL.

d) La medición por HPLC de la concentración de metanol se realizó como se describió anteriormente (Blumhoff, Steiger, Marx, Mattanovich y Sauer, 2013). Para la identificación y cuantificación se utilizaron patrones puros. La columna era una Aminex HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc, e E. UU.) ejecutada a 60°C con una fase móvil de H2SO44 mM a 0,6 mL/min. El detector fue un detector de índice de refracción RID-10 A (Shimadzu, Corp., Japón) y los cálculos se realizaron con el soporte lógico LabSolutions v5.85 (Shimadzu, Corp., Japón).

e) La tasa de evaporación se calculó solo a partir de la primera y la última muestra con la mayor diferencia de tiempo y concentración. Los cambios de concentración entre las muestras adyacentes fueron marginales y el error de medición podría tener un impacto significativo en el cálculo. Los datos se pueden encontrar en la Tabla 8. R1 y R2 cargados con 500 mL de medio tuvieron un valor medio de 0,063 g*L-1*h-1.

Tabla 7: Parámetros del reactor y volumen del pulso de metanol.

Tabla 8: Concentración de metanol en los momentos de muestreo y tasa de evaporación calculada.

Ejemplo 7: Determinación de la tasa de absorción de metanol de P. pastoris A aox1A aox2

Para determinar la tasa de absorción de metanol, la cepaAaox1Aaox2deP. pastorispPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT se cultivó en un biorreactor. El cultivo se hizo crecer hasta una cierta concentración de biomasa. Después se aplicó un pulso de metanol y se tomaron muestras inmediatamente después del pulso y aproximadamente 20 horas más tarde. El objetivo era determinar la tasa de absorción de metanol de la cepa Mut- y compararla con la tasa de evaporación de metanol medida en el Ejemplo 6.

a) Precultivo: Veinticuatro horas antes de la inoculación en el reactor, se inocularon 50 mL de YPD que contenían 100 pg/L de Nourseotricina conP. pastoris úaox1úaox2pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT. Tres horas antes de la inoculación de los reactores, el precultivo se diluyó con otros 50 mL de YPD que contenían 100 pg/L de Nourseotricina. Antes de la inoculación, se centrifugó la cantidad adecuada de cultivo (1500 g, 5 min, 20°C) y se resuspendió en 15 mL de medio BSM con una DO600 de 42.

b) A los reactores cargados con 300 mL de medio BSM se les inocularon 15 mL de cultivo deP. pastoris úaox1úaox2pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT. La DO600 de la inoculación objetivo en el reactor era 2. Al final de la fase discontinua, como lo indica un pico de oxígeno disuelto, se inició una alimentación de glucosa al 50% (p/p) a 2,4 mL/h durante 24 horas para aumentar la biomasa. Dos horas después del inicio de la alimentación con glucosa, se administró una inyección de 9,5 mL de metanol al 50% (v/v) para aumentar la concentración de metanol a 1,5% (la concentración medida fue R1 = 1,47% y R2 = 1,48%). Esto se hizo para inducir el consumo de metanol. Al final de la fase de alimentación de glucosa, se tomaron muestras para determinar el peso seco celular y para la HPLC.

c) Después de la fase de glucosa, la agitación y la gasificación se fijaron a 750 rpm constantes y 9,5 sL/h. Se añadió un pulso adicional de metanol al 50% para aumentar la concentración a 1,5% e inmediatamente se tomó una muestra (la concentración medida fue R1 = 1,36% y R2 = 1,36%). La concentración se midió nuevamente después de 19,5 horas y se utilizó para determinar la tasa de absorción específica de metanol (qmetanol).

d) La disminución de la concentración de metanol (dc/dt) para este experimento fue sustancialmente mayor a 0,37 g L-1 h"1 como promedio en comparación con los valores obtenidos para la tasa de evaporación en el Ejemplo 6e), Tabla 8 que va de 0,022 a 0,063 g L-1 h-1.

La tasa de absorción específica de metanol se calculó basándose en los datos representados en la Tabla 9 como sigue.

El volumen fue constante durante el período de tiempo medido. La tasa media específica de absorción de metanol (qmetanol) sin evaporación restada fue de 5,07 mg g-1 h-1. Para los cálculos de la tasa específica de absorción de metanol con evaporación restada, se estimó una tasa de evaporación de 22 mg L-1 h-1 basándose en los resultados del Ejemplo 6e), Tabla 8. Este resultado fue completamente nuevo e inesperado. Hasta ahora, se informó y aceptó en la bibliografía publicada que Mut- es incapaz de metabolizar el metanol y que la disminución de metanol se debe a la pérdida por evaporación (Looser et al., 2015).

Tabla 9: Resumen de datos de la tasa específica de absorción de metanol (qmetanol) y la pérdida aparente de metanol

(dc/dt).

Ejemplo 8: Estrategia de cultivo 1: Aplicación de una alimentación conjunta constante de glucosa/metanol aP. pastoris Aaox1Aaox2

La cepa deP. pastoris Aaox1Aaox2pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT se cultivó en un escenario de producción de proteínas recombinantes. La cepa se alimentó con una alimentación constante limitada de glucosa y se indujo con metanol para la producción de proteínas.

a) La inoculación se realizó como se describe en el Ejemplo 7a) b). El cultivo se dividió en dos fases. (1) Fase uno: el lote se inició a DO600 de 2 en medio BSM. El final de la fase discontinua se indicó mediante un pico de oxígeno disuelto a las 22,27 h para el reactor R1 y a las 21,52 h para el reactor R2.

b) (2) Fase dos: Después de la fase uno se inició una fase por lotes alimentados con una alimentación de glucosa al 50% (p/p) a una velocidad de alimentación de 2,4 mL/h durante 97 horas. Al mismo tiempo se añadió un pulso de metanol al 50% (v/v) con el objetivo de aumentar la concertación de metanol a 1,5% (v/v). Se tomó una muestra de HPLC como se describe en el Ejemplo 6d) para medir la concentración exacta y se añadió un pulso adicional si fue necesario. Una alimentación de metanol se calculó basándose en la concentración de biomasa prevista y la tasa de absorción específica de metanol de 5 mg g '1 h'1 como se midió en el Ejemplo 7d). La concentración de metanol se midió diariamente en línea mediante HPLC.

c) La alimentación de metanol se calculó a intervalos de una hora de la siguiente manera:

qmetanoi=tasa específica de absorción de metanol (mgh'1)

Xpronosticada=biomasa total previstaen peso seco celular (g)

tintervaio = intervalo de tiempo (h)

Rmetanoi=consumo de metanol en intervalo (mg)

tmetanol=metanol total (mg)

Ametanol = adición de metanol (mg)

Fmetanol= 50%(v/v) alimentación de metanol (mL)

Cmetanol diana=concentración diana de metanol (mg/ml)

Vreactor=volumen del reactor (mL)

Fglucosa= 50% (v/v)alimentación de glucosa (mL)

Vmuestra=volumen de muestra si corresponde en el intervalo; de lo contrario, es0

j —rendimientoCe bromase sobreglucosa (g/g)

d) Debido a la tasa de absorción de metanol específica prevista basada en el ejemplo 7d), fue posible mantener la concentración de metanol en exceso durante el cultivo en el biorreactor del 1,19% al 1,5% (v/v) de metanol con mediciones de concentración solo una vez al día en la línea de metanol y ajuste de alimentación.

e) Los datos del procedimiento y la productividad se pueden encontrar en la Tabla 10. La productividad específica promedio general fue de 29,4 pg g-1 h-1. La concentración de metanol al final del cultivo fue de 10,4 y 10,0 g/L (1% (v/v) de metanol corresponde a 7,92 g/L) para los reactores R1 y R2. La cantidad total de metanol consumido en la fase dos por los reactores R1 y R2 fue de 25,03 g y 24,07 g. Esto se calculó mediante la siguiente ecuación:

tmetanol consumido=metanol total consumido (g)

minicial=Peso del contenedor de metanol al 50% en la íase inicial (g)

míinal=Peso del contenedor de metanol al 50% al final de la alimentación (g)

P50% metanoi =densidad de metanol al 50% (g/ml)

Pmetanoi = densidad de metanol al100%(g/ml)

Cmetanoi-finai =concentración de metanol al final de la alimentación (g/L)

Vreactor-finai=volumen del reactor al final de la alimentación (L)

Tabla 10: Datos del procedimiento de cultivo en biorreactor y productividad específica (qp) para el Ejemplo 8. La concentración de metanol se ajustó 2,22 horas después de que se tomara la muestra mediante un pulso adicional de metanol al 50 % (v/v) para R1 = 5,6 ml, R2 = 2,3 ml.

Ejemplo 9: Estrategia de cultivo 2: Una estrategia de alimentación con una fase de alimentación de glucosa separada y una fase de alimentación solo de metanol.

La cepa deP. pastoris Úaox1úaox2pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT se probó en un escenario de producción de proteína recombinante donde primero se aplicó una alimentación limitada de glucosa para aumentar la biomasa, seguida de una fase separada con un pulso de metanol y alimentación para inducir la producción de proteína.

a) El cultivo en el biorreactor se separó en tres fases. (1) La fase uno consistió en la fase discontinua en medios BSM con una DO600 inicial de 2. La inoculación se realizó como se describe en el Ejemplo 7a) b). La fase discontinua duró 19,68 y 19,50 horas para los reactores R3 y R4, respectivamente. (2) La fase dos fue una alimentación de glucosa al 50% (p/p) a 4,8 mL/h durante 25 horas para aumentar la concentración de biomasa. (3) La fase tres se inició con un pulso de metanol al 50% (v/v) para alcanzar una concentración objetivo de 1,5% (v/v) y un perfil de alimentación de metanol calculado basándose en el peso seco celular previsto y la tasa de absorción específica de metanol como se describe en el Ejemplo 8c) durante 72,7 horas. La concentración de metanol se midió en línea con HPLC todos los días como se describe en el Ejemplo 6d) para medir la concentración exacta y se añadieron pulsos de compensación adicionales si fue necesario. En esta fase, la velocidad del agitador del reactor se ajustó a 760 rpm constantes y la gasificación a 9,5 sL/h.

b) Los datos del procedimiento y la productividad se pueden encontrar en la Tabla 11. La concentración máxima y mínima de metanol en todos los cultivos osciló entre 4,3 g/L y 12,55 g/L. La productividad específica promedio global fue de 32,9 pg g-1 h-1. La concentración de metanol al final del cultivo fue de 7,10 y 7,47 g/L para los reactores R3 y R4. La cantidad de metanol consumido en la Fase tres por los reactores R3 y R4 fue de 12,0 g y 12,6 g. Esto se calculó como en el Ejemplo 8e). Debido a que la biomasa fue constante en la fase tres, la tasa de absorción de metanol (qmetanol) para la fase tres se calculó como en la siguiente ecuación.

En la fase tres la qmetanoi para el reactor R3 es 3,79 mg g-1 h-1 y para el reactor R4 es 3,92 mg g-1 h-1.

c) La biomasa total en la Tabla 11 se corrigió para la extracción de muestra de 12 mL y muestra que la biomasa no estaba aumentando. En general, la biomasa total en la fase tres disminuyó 4,5% y 3,4% para los reactores R3 y R4. Sorprendentemente, el cultivo todavía producía proteínas recombinantes secretadas. Esto demuestra que la cepa deP. pastoris Aaox1Aaox2pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT puede producir eficientemente proteínas secretadas recombinantes incluso cuando se alimenta solo con metanol sin crecimiento aparente. La cantidad promedio total de proteínas producidas en la fase tres con metanol como única fuente de carbono es de 105 mg.

Tabla 11: Datos del procedimiento de cultivo del biorreactor y productividad (qp) para el Ejemplo 9. La biomasa total se corrigió para un muestreo de 12 mL como en el Ejemplo 9 b).

Ejemplo 10: Estrategia de cultivo 3: Una estrategia de alimentación con una fase de alimentación conjunta de glucosa/metanol y una fase de alimentación separada solo de metanol.

La cepa deP. pastoris Aaox1Aaox2pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT se probó en un escenario de producción de proteína recombinante donde después de la fase discontinua se aplicó una alimentación limitada de glucosa y un pulso y alimentación adicional de metanol para lograr un aumento de biomasa y producción de proteína recombinante simultáneamente. Una vez alcanzada la biomasa deseada, se detuvo la alimentación de glucosa, pero la alimentación de metanol continuó durante el resto del cultivo.

a) Este cultivo en biorreactor se separó en tres fases. (1) La fase uno fue la fase discontinua. Para ello a los reactores se les inoculó la cepa de producción deP. pastoris Aaox1Aaox2pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT con una DO600 inicial de 2. La inoculación se realizó como se describe en el Ejemplo 7a) b). La fase discontinua duró 19,35 y 19,37 horas para los reactores R1 y R2, respectivamente. El final de la fase discontinua se indicó mediante un pico de oxígeno disuelto. (2) En este punto se inició la Fase dos. La fase dos consistió en una alimentación de glucosa al 50% (p/p) a 4,8 mL/h durante 25 horas. Al inicio de la Fase dos, se aplicó un pulso de metanol al 50% (v/v) para aumentar la concentración de metanol hasta el objetivo de 1,5% (v/v) y se inició una alimentación de metanol posterior para contrarrestar el consumo, la evaporación y la dilución de metanol por parte de la alimentación de glucosa. (3) La fase tres consistió en una alimentación únicamente de metanol durante 72,9 horas. En esta fase, la velocidad del agitador del reactor se ajustó a 760 rpm constantes y la gasificación a 9,5 sL/h. La concentración de metanol se midió en línea con HPLC todos los días como se describe en el Ejemplo 6d). Si fue necesario, se añadió un pulso de compensación adicional.

b) La alimentación de metanol se calculó en intervalos de una hora como en el Ejemplo 9b):

c) Los datos del procedimiento y la productividad se pueden encontrar en la Tabla 12. La concentración máxima y mínima de metanol durante todo el cultivo de las dos repeticiones osciló entre 6,9 g/L y 11,4 g/L. La productividad específica promedio global fue de 45,8 pg g-1 h-1, la productividad específica promedio en la fase tres fue de 34,0 pg g-1 h-1. La concentración de metanol al final del cultivo fue de 8,0 g/L para los reactores R1 y R2. La cantidad de metanol consumido en la fase tres por los reactores R1 y R2 fue de 14,4 g y 14,1 g. Esto se calculó mediante la ecuación que se muestra en el Ejemplo 9b). Debido a que la biomasa fue constante en la fase tres, se calculó la tasa de absorción de metanol (qmetanol) para la fase tres como se muestra en el Ejemplo 9b). En la fase tres la qmetanol para el reactor R1 fue de 4,61 mg g-1 h-1 y para el reactor R2 fue de 4,54 mg g-1 h-1. En general, la biomasa disminuyó 5,7% y 5,5% para los reactores R1 y R2 en la fase tres. Nuevamente, esto demuestra que con la cepa deP. pastoris Aaox1Aaox2es posible la producción de cepas sin crecimiento aparente. La cantidad total promedio de proteína recombinante producida en la fase tres con metanol como única fuente de carbono es de 106 mg, que es similar a los 105 mg de proteína recombinante producida en el Ejemplo 9, fase tres. Esto también se ilustra por la productividad específica similar en la fase tres del Ejemplo 9 a 32,9 pg g-1 h-1 y a 34,0 pg g-1 h-1 en este ejemplo. En conclusión, la productividad en la fase tres (fase de alimentación solo con metanol) no dependió de si los cultivos fueron inducidos en la fase dos (fase de alimentación con glucosa) o no. Debido a que la producción de proteína recombinante es independiente del crecimiento, la estrategia de alimentación únicamente con metanol tiene varias ventajas cuando se utiliza con la cepa deP. pastoris Aaox1Aaox2.En un cultivo en biorreactor sin una fase de alimentación solo de metanol como en el Ejemplo 8, el procedimiento está limitado por el volumen máximo del reactor y la concentración de masa seca de levadura. Después de un cierto tiempo, estas limitaciones detienen el procedimiento de cultivo, ya sea alcanzando el volumen máximo o la concentración máxima de biomasa deseada. Al utilizar una fase de alimentación de metanol combinada conP. pastoris Aaox1Aaox2como en el Ejemplo 9, el tiempo de cultivo ya no está limitado por la concentración o el volumen de biomasa ya que la biomasa no aumenta y el aumento de volumen es insignificante. Como consecuencia, los cultivos con altas concentraciones de biomasa se pueden mantener en el biorreactor durante períodos de tiempo más prolongados sin alcanzar estas limitaciones y permiten fases de producción más largas que aumentan la concentración de la proteína de interés. También se aplica una fase de alimentación solo de metanol cuando se emplea la cepa deP. pastoris Aaoxlde utilización lenta de metanol como se muestra en el siguiente Ejemplo 12, pero estas ventajas no están presentes allí ya queP. pastoris Aaoxlestá creciendo continuamente con una alimentación solo de metanol y, por lo tanto, presenta las mismas limitaciones que las analizadas. La restricción deP. pastoris Aaoxla la misma velocidad de alimentación de metanol queP. pastoris AaoxlAaox2da como resultado pérdida de productividad. Otras mejoras relacionadas con el procedimiento de la cepa deP. pastoris AaoxlAaox2se analiza en el Ejemplo 12.

Tabla 12: Datos del procedimiento de cultivo en biorreactor y productividad específica (qp) para el Ejemplo 10. La biomasa total se corrigió para un muestreo de 12 mL como en el Ejemplo 9 b).

Ejemplo 11: Estrategia de cultivo 3: Una estrategia de alimentación con una fase de alimentación conjunta de glucosa/metanol y una fase de alimentación separada solo de metanol aplicada a P. pastoris A a o x lA a o x 2 que secreta VHH.

Para comprobar la producción de proteína recombinante secretada con otra proteína secretada, se repitió el cultivo en biorreactor descrito en el Ejemplo 10a) con la cepa deP. pastoris AaoxlAaox2pPM2pZ30_pAOX1_aMF-vHH_CycTT.

a) Como en el Ejemplo 10a), este cultivo en biorreactor se separó en tres fases. (1) La fase uno fue la fase discontinua. Para ello a los reactores se les inoculó la cepa de producción deP. pastoris Aaox1Aaox2pPM2pZ30_pAOX1_aMF-vHH_CycTT con una DO600 inicial de 2 como se describe en el Ejemplo 7a) b). La fase discontinua duró 18,79 y 19,33 horas para los reactores R1 y R2, respectivamente. El final de la fase discontinua se indicó mediante un pico de oxígeno disuelto. (2) En este punto se inició la Fase dos. La fase dos consistió en una alimentación de glucosa al 50% (p/p) a 4,8 mL/h durante 33,9 horas para aumentar la biomasa incluso más que en el Ejemplo10. Al comienzo de la Fase dos, se añadió un pulso de metanol al 50% (v/v) para aumentar la concentración de metanol al valor objetivo de 1,5% (v/v) y se inició una alimentación de metanol posterior para contrarrestar el consumo, la evaporación y la dilución de metanol por la alimentación de glucosa. (3) La fase tres consistió en una alimentación solo de metanol durante 63,9 horas. La velocidad del agitador se ajustó a 760 rpm constantes y la gasificación a 9,5 sL/h. La concentración de metanol se midió en línea con HPLC todos los días como se describe en el Ejemplo 6d). Si fue necesario, se añadió un pulso de compensación adicional.

b) La alimentación de metanol se calculó como se describe en el Ejemplo 9b)

Los datos del procedimiento y de la productividad se pueden encontrar en la Tabla 13. La concentración máxima y mínima de metanol durante el cultivo de las dos repeticiones osciló entre 8,7 g/L (R1) y 11,3 g/L (R1). La productividad específica promedio global fue de 118,0 pg g-1 h-1 y en la fase tres 88,2 pg g-1 h-1. La concentración de metanol al final del cultivo fue de 10,5 y 10,8 g/L para los reactores R1 y R2. La cantidad de metanol consumido por los reactores R1 y R2 fue de 26,6 g y 26,0 g. Esto se calculó mediante la siguiente ecuación como se muestra en el Ejemplo 8e). Esta cantidad es mayor que en el Ejemplo 10 debido a la mayor concentración de biomasa, pero aun así es significativamente (5 veces) menor que en una cepa MutS (como se describe en el Ejemplo 12). Debido a que la biomasa fue constante en la fase tres, la tasa de absorción de metanol (qmetanol) se calculó para la fase tres como se muestra en el Ejemplo 9b). En la fase tres la qmetanol para el reactor R1 fue de 4,75 mg g-1 h-1 y para el reactor R2 fue de 4,68 mg g-1 h-1.

c) En general, la biomasa disminuyó 4,4% y 4,9% para los reactores R1 y R2 en la fase tres como en los ejemplos anteriores. Los datos de la Tabla 13 muestran claramente que las cepas deP. pastoris AaoxlAaox2pueden producir proteínas recombinantes secretadas incluso en cantidades de gramos por litro. En la fase de alimentación solo de metanol, la concentración de vHH aumentó en 815,5 mg/L, lo que significa que se produjo un promedio total de 323,1 mg de fragmento de anticuerpo utilizando metanol como única fuente de carbono.

Tabla 13: Datos del procedimiento de cultivo en biorreactor y productividad (qP) para el Ejemplo 11. La biomasa total se corrigió para un muestreo de 12 mL como en el Ejemplo 9 b).

Ejemplo 11.1: Parámetros de procedimiento obtenidos con las cepas de P. pastoris A aox1A aox2 (Mut‘) en comparación con P. pastoris A a o x l (MutS) de utilización lenta de metanol cultivada con un protocolo de cultivo en biorreactor establecido.

Para comparar se cultivóP. pastoris AaoxlpPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT con un protocolo de cultivo establecido para el fenotipo MutS (Potvin, Ahmad y Zhang, 2012).

a) Este cultivo en biorreactor se separó en cuatro fases. (1) La fase uno fue la fase discontinua. Para ello a los reactores se les inoculó la cepa de producción deP. pastoris AaoxlpPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT con una DO600 inicial de 2 como se describe en el Ejemplo 7a) b). La fase discontinua tuvo una duración de 20,17 y 20,30 horas para los reactores R1 y R2, respectivamente. El final de la fase discontinua se indicó mediante un pico de oxígeno disuelto. (2) La fase dos fue una alimentación de 60% de glicerol que aumenta linealmente (y = 0,225x 1,95) durante 8 horas. (3) La fase tres fue una fase de alimentación conjunta con una alimentación de 60% de glicerol linealmente decreciente (y = 3,75 - 0,111x) y una alimentación de 100% de metanol linealmente creciente (y = 0,028x 0,6) durante 18 horas (4) La fase cuatro es una fase de alimentación solo de metanol con una alimentación de 100% de metanol que aumenta linealmente (y = 0,028x 1,10) durante 72 horas. El tiempo total de ejecución fue de 119,25 horas.

b) La alimentación de glicerol y metanol se controló gravimétricamente según las ecuaciones en a) mediante el soporte lógico de control DASGIP (Eppendorf AG, Alemania)

c) Los datos de procedimiento y productividad se pueden encontrar en la Tabla 13.1. La productividad específica promedio general de las fases tres a cuatro (las fases de producción) fue de 61,7 |ug g-1 h-1. La cantidad total promedio de metanol consumido fue de 165,8 g durante todo el período de cultivo y de 150,6 g en la fase cuatro (fase de alimentación solo de metanol). La concentración de metanol residual en el caldo de cultivo se consideró cero ya que se trataba de un cultivo limitado en metanol. La fase cuatro en este ejemplo corresponde a la fase tres en los Ejemplos 9, 10 y 11. Basándose en la biomasa promedio en la fase cuatro, se calculó la tasa de absorción de metanol (qmetanol) como se muestra en el Ejemplo 9b). La qmetanol en la fase cuatro para el reactor R1 es 37,1 mg g-1 h-1 y 37,6 mg g-1 h-1 para el reactor R2. La qmetanol en la fase cuatro facilita un aumento no deseado de biomasa. 53,2% (R1) y 52,4% (R2) de la biomasa total al finalizar el cultivo se generan durante la fase cuatro de crecimiento en metanol.

d) La comparación de los parámetros del procedimiento relacionados con la cepa se muestra en la Tabla 13.2 y en la Tabla 13.3 se puede encontrar una descripción general de las tasas de absorción de metanol específicas y las tasas de alimentación de los ejemplos presentados. Al utilizar elP. pastoris Aaox1Aaox2Mut- para la producción de proteínas recombinantes, varios de los parámetros clave del procedimiento mejoraron considerablemente en comparación con un procedimiento conP. pastoris ñaox l.El calor de reacción se reduce sustancialmente en más de 80%, lo que conduce a una menor necesidad de enfriamiento. La tasa de absorción de oxígeno específica y la tasa de transferencia de oxígeno se reducen en más de 80%, lo que lleva a una menor necesidad de mezcla y aireación, reduciendo el caudal de aireación, así como la necesidad de suministrar oxígeno puro a los recipientes del biorreactor. La menor tasa de absorción específica de metanol reduce la cantidad de metanol necesaria en un cultivo. El metanol es tóxico e inflamable.

El uso de cepas Mut- representa una mejora técnica y de seguridad ya que reduce las cantidades de metanol que deben manipularse y almacenarse en una instalación de producción. Otra ventaja es la menor sensibilidad deP. pastoris AaoxlAaox2a altas concentraciones de metanol. Esto lo confirman los datos de viabilidad celular de la cepa deP. pastoris AaoxlAaox2en el Ejemplo 10 yP. pastoris Aaoxlen este ejemplo. En el Ejemplo 10 la viabilidad de las células Mut- en los reactores R1 y R2 al final del procedimiento fue de 99,8% y 99,7%. En contraste, la viabilidad celular de las células MutS en los reactores R1 y R2 en este ejemplo fue de 95,9% y de 96,5%. La menor sensibilidad y mayor viabilidad de la cepa deP. pastoris AaoxlAaox2tiene un efecto sobre la pureza de la proteína secretada producida recombinante. Las células lisadas liberan proteasas que degradan la proteína de interés y añaden proteína soluble no deseada en el sobrenadante; ambos efectos conducen a una menor pureza y pérdida de la proteína de interés en el sobrenadante. La pureza delP. pastoris Aaoxlen este ejemplo fue de 72% y 77% para los reactores R1 y R2, en comparación la pureza deP. pastoris AaoxlAaox2en el Ejemplo 10 fue del 85% para ambos reactores R1 y R2.

Tabla 13.1: Datos del procedimiento de cultivo en biorreactor y productividad específica (qproducto) para el Ejemplo

11.1.

Tabla 13.2: Comparación de los parámetros clave de cultivo del biorreactor en conjunto y en las fases de alimentación sólo con metanol deP. p a s to r is A a o x 1 A a o x 2pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT en el Ejemplo 10 yP. p a s to r is A a o x1pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT en el Ejemplo 11.1.

Tabla 13.3: Tasas específicas de absorción de metanol y tasas de alimentación de metanol basadas en el peso seco promedio celular en la fase de alimentación solo con metanol. *Como el Ejemplo 11.1 tiene una alimentación de metanol limitada, la qmetanol y la velocidad de alimentación se consideran iguales.

Ejemplo 12: Generación de cepas negativas para la utilización de metanol y con deficiencia de alcohol deshidrogenasa.

El consumo de metanol de la cepa deP. pastorisMut- observada en el Ejemplo 7 fue inesperada y nueva. Basándose en este conocimiento se formó la hipótesis de que las alcohol deshidrogenasas podrían ser las responsables de esta característica. Para probar el efecto de las alcohol deshidrogenasas sobre el consumo de metanol enP. pastoris Aaox1Aaox2se seleccionaron dos alcohol deshidrogenasas potenciales.ADH2:PP7435_Chr2-0821 yADH900:PP7435_Chr2-0990 para su deleción. Se crearon tres cepas, (1) una cepa con deficiencia deADH2,(2) una cepa con deficiencia deADH900y (3) una cepa de doble deleciónADH2yADH900intercambiando la región codificante del gen por una de resistencia a antibióticos. Efectivamente, se crearon las cepas (1)P. pastoris Aaox1Aaox2adh2A::HphR, (2)P. pastoris Aaox1Aaox2Adh900A::KanMX y (3)P. pastoris Aaox1Aaox2adh2A::HphR adh900A::KanMX.

a)P. pastoris Aaox1Aaox2se hizo electrocompetente como se describe en el Ejemplo1a). Para generar deleciones deADH2se utilizó el método del marcador dividido descrito en el ejemplo1b). Las células electrocompetentes se transformaron con 500 nanogramos del casete 1 del marcador dividido Adh2 y 500 nanogramos del casete 2 del marcador dividido Adh2 como se describe en el Ejemplo1d). Las secuencias del casete se pueden encontrar en la Tabla 14. Los transformantes se seleccionaron en placas YPD con 200 pg/mL de Higromicina. Se seleccionó un clon basándose en la amplificación por PCR y la secuenciación del amplicón de PCR. La sustitución exitosa de la región codificante deADH2por el marcador de antibiótico se verificó mediante amplificación por PCR con los cebadores Adh2_KO ctrl fwd y Adh2_KO_ctrl_rev (Tabla 15) y secuenciación del amplicón de PCR (Microsynth AG, Suiza). La cepa generada se denomina (1)P. pastoris Aaox1Aaox2adh2A::HphR.

b) La cepa deP. pastoris Aaox1Aaox2se hizo electrocompetente como se describe en el Ejemplo 1a). Las células electrocompetentes se transformaron con 500 nanogramos del casete 1 del marcador dividido Adh900 y 500 nanogramos del casete 2 del marcador dividido Adh900 como se describe en el Ejemplo 1d). Las secuencias del casete se pueden encontrar en la Tabla 14. Los transformantes se seleccionaron en placas YPD con 500 pg/mL de Geneticina. Se seleccionó un clon basándose en la amplificación por PCR y la secuenciación del amplicón de PCR. La sustitución exitosa de la región codificante deADH900por marcador de antibiótico se verificó mediante amplificación por PCR con los cebadores Adhll_KO Ctrl fwd y Adhll_KO Ctrl_rev (Tabla 15) y secuenciación del amplicón de PCR (Microsynth AG, Suiza). La cepa generada se denomina (2)P. pastoris Aaox1Aaox2Adh900A::KanMX.

c) La cepa deP. pastoris Aaox1Aaox2adh2A::HphR se hizo electrocompetente como se describe en el Ejemplo 1a) aparte de eso, se añadieron 200 pg/mL de Higromicina al medio de cultivo principal. Las células electrocompetentes se transformaron con 500 nanogramos del casete 1 del marcador dividido Adh900 y 500 nanogramos del casete 2 del marcador dividido Adh900 como se describe en el Ejemplo 1d). Las secuencias del casete se pueden encontrar en la Tabla 14. Los transformantes se seleccionaron en placas YPD con 200 pg/mL de Higromicina y 500 pg/mL de Geneticina. Se seleccionó un clon basándose en la amplificación por PCR y la secuenciación del amplicón de PCR. La sustitución exitosa de la región codificante deADH900por el marcador antibiótico se verificó mediante amplificación por PCR con los cebadores Adhll_KO Ctrl fwd y Adhll_KO Ctrl_rev (Tabla 15) y secuenciación del amplicón de PCR (Microsynth AG, Suiza). La cepa generada se denomina (3)P. pastorisAaox1Aaox2 Adh2A::HphR Adh900A::KanMX.

d) Se aisló ADN genómico para amplificaciones por PCR con el Kit de Purificación de ADN Genómico Wizard® (Promega Corporation, EE. UU.) según las recomendaciones del fabricante. Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron con la polimerasa Q5 (New England Biolabs, Inc., EE. UU.) según las recomendaciones del fabricante.

Tabla 14: Secuencia de ADN del casete de marcador dividido utilizada para generar las cepas de deleción

de Adh2y Adh900.

Tabla 15: Cebadores de reacción en cadena de la polimerasa.

Ejemplo 13: Generación de cepas negativas para la utilización de metanol con expresión anormalmente alta de Adh2 y Adh900.

Con el fin de comprobar el efecto de la expresión anormalmente alta deADH2yADH900se creó una construcción de expresión compuesta por un promotor constitutivo P<gap>: PP7425_Chr1 (596296...596790) y la secuencia codificante deADH2o la secuencia codificante deADH900,respectivamente. La secuencia codificante deADH2yADH900(Tabla 16) se modificó para eliminar los sitios de restricción Bbsl y Bsal en la secuencia codificante sin afectar a la secuencia de aminoácidos del producto génico. Las cepas generadas fueron denominadasP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pGAP Adh2_CycTT yP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pGAP_Adh900_CycTT.

a) Para utilizar el método de ensamblaje Golden Gate, era necesario eliminar los sitios de restricción de las enzimas de restricción Bbsl y Bsal (New England Biolabs, Inc., EE. UU.) de la secuencia codificante sin afectar a la secuencia de aminoácidos del producto génico. Este procedimiento se denomina Curado. La secuencia codificante deADH2PP7435_Chr2-0821 fue modificada en c.45G>A y c.660C>G. La secuencia codificante deADH900PP7435_Chr2-0990 fue modificada en c.42C>G. La secuencia codificante curada utilizada para el ensamblaje Golden Gate se puede encontrar en la Tabla 15. Obsérvese que los primeros 12 pares de bases y los últimos 15 pares de bases no forman parte de la secuencia codificante y son necesarios para el ensamblaje Golden Gate.

b) El ensamblaje del Golden Gate como se emplea aquí ya se describió (Prielhofer et al., 2017). (1) La construcción de expresión BB3aZ_pGAP_Adh2_CycTT se ensambló de la siguiente manera. El fragmento de ADN curado Adh2_GG (Tabla 15) se clonó en la columna vertebral de BB1_23, creando BB1_23_Adh2. La construcción de expresión se generó mediante el ensamblaje Golden Gate de BB3aZ_14* (columna vertebral), BB1_23_Adh2 (secuencia codificante), BB1_12_pGAP (promotor), BB1_34_ScCYC1tt (terminador). (2) La construcción de expresión BB3aZ_pGAP_Adh900_CycTT se ensambló de la siguiente manera. El fragmento de ADN curado Adh900_GG (Tabla 15) se clonó en la columna vertebral de BB1_23, creando el BB1_23_Adh900. La construcción de expresión se generó mediante el ensamblaje Golden Gate de BB3aZ_14* (columna vertebral), BB1_23_Adh900 (secuencia codificante), BB1_12_pGAP (promotor), BB1_34_ScCYC1tt (terminador). Los plásmidos y las secuencias están disponibles en el kit Golden PiCS Núm. 1000000133 (Addgene, Inc., EE. UU.).

Tabla 16: Secuencia codificante deADH2yADH900nativas y secuencia codificante deADH2curada con mutaciones en c.45G>A y c.660C>G y secuencia codificante deADH900curada con mutaciones en c.42C>G utilizadas para el ensamblaje Golden Gate. Los primeros 12 pares de bases y los últimos 15 pares de bases no forman parte de la secuencia codificante y se utilizan para el ensamblaje Golden Gate.

c) La cepa deP. pastoris Aaox1Aaox2se hizo electrocompetente como se describe en el Ejemplo 1a). La construcción de expresión BB3aZ_pGAP_Adh2_CycTT y la construcción de expresión BB3aZ_pGAP_Adh900_CycTT se linealizaron con Ascl (New England Biolabs, Inc., EE. UU.) según el protocolo del fabricante y se purificaron con Kits de Extracción de Fragmentos de ADN en gel/PCR Hi Yield® (Süd-Laborbedarf GmbH, Alemania). 500 nanogramos del plásmido linealizado se transformaron enP. pastoris Aaox1Aaox2electrocompetentes como se describió anteriormente en el ejemplo 1a) y 1d). Se seleccionaron transformantes positivos en placas YPD con 25 pg/mL de Zeocina. La integración satisfactoria de la construcción de expresión se verificó mediante amplificación por PCR con los cebadores 109_BB3aN_ctrl_fwd y pGAP_goi_rev_v2 (Tabla 17) con ADN genómico como molde. Las cepas creadas se denominanP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pGAP_Adh2_CycTT yP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pGAP_Adh900_CycTT.

d) Se aisló ADN genómico para amplificaciones por PCR con el Kit de Purificación de ADN Genómico Wizard® (Promega Corporation, EE. UU.) según recomendaciones del fabricante. Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron con la polimerasa Q5 (New England Biolabs, Inc., EE. UU.) según las recomendaciones del fabricante.

Tabla 17: Cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa.

Ejemplo 14: Medición de la actividad alcohol deshidrogenasa en extractos libres de células de cepas con deficiencia de alcohol deshidrogenasa negativas para la utilización de metanol.

Para comprobar la eliminación satisfactoria de las alcohol deshidrogenasas a nivel de fenotipo, se midió la actividad alcohol deshidrogenasa en extractos libres de células con etanol como sustrato. Generalmente se considera que el etanol es el sustrato principal para Adh2.

a) Se realizó un cultivo nocturno en 2 mL de medio YPD en placas de 24 pocillos selladas con una membrana permeable al aire a 25°C y 280 rpm. Las cepas utilizadas fueron del Ejemplo12a)P. pastoris Aaox1Aaox2Adh2A::HphR, Ejemplo12b)P. pastoris Aaox1Aaox2Adh2A::HphR Adh900A::KanMX y Ejemplo1e)P. pastoris Aaox1Aaox2.Como control adicional se utilizaronP. pastorisX33 (Thermo Fisher Scientific Inc., EE. UU.) yP. pastorisX33AAdh2(Nocon et al., 2014).

b) Los extractos libres de células se prepararon centrifugando (16.000 g, 5 min, 4°C) el cultivo nocturno y se resuspendiéndolo en 1 mL de solución salina tamponada con fosfato. Después de una segunda etapa de centrifugación (16.000 g, 5 min, 4°C), las células se resuspendieron en 0,5 mL de tampón de lisis celular con cuentas de vidrio. Los cultivos se lisaron en un homogeneizador Ribolyser (MP Biomedicals, Inc., EE. UU.) batiendo las cuentas durante 3 x 20 segundos a 6 m/s con 1 minuto de enfriamiento en hielo entre las etapas. Después de la etapa de lisis, los cultivos se centrifugaron (16.000 g, 5 min, 4°C) y el sobrenadante se transfirió a un tubo Eppendorf nuevo y se centrifugó nuevamente (16.000 g, 30 min, 4°C) para eliminar cualquier residuo celular transportado. Después de la segunda etapa de centrifugación, el sobrenadante se almacenó a -20°C hasta su uso.

c) El tampón de lisis celular consistía en HEPES 20 mM, NaCl 420 mM, MgCl2 1,5 mM, 10% de Glicerol, 1 Comprimido de Cóctel Inhibidor de Proteasa SIGMAFAST™ (Sigma-Aldrich GmbH) por 50 mL. El tampón de ensayo consistió en MOPS 100 mM, MgSO45 mM, NAD+ 2 mM a pH 8,9.

d) La concertación de proteínas de los extractos libres de células se midió con el Ensayo de Proteínas BCA de Pierce™ (Thermo Scientific, Inc., EE. UU.) según las recomendaciones del fabricante y se ajustó uniformemente a una concentración común de 3,8 mg/mL para todas las muestras.

e) Los ensayos de actividad alcohol deshidrogenasa se realizaron en una placa de 96 pocillos. Las mediciones se realizaron en un lector de microplacas (Tecan Group Ltd., Suiza) midiendo la absorbancia de NADH a 340 nm. La temperatura se fijó en 42°C. Para iniciar el ensayo, se añadieron 20 pl de extractos libres de células al tampón de ensayo y se equilibraron durante 10 a 15 minutos antes de añadir 1 M de etanol como sustrato. El volumen final total fue de 300 pl. La actividad en mU/mg se calculó a partir del aumento de absorción lineal máximo después de la adición del sustrato etanol. Una unidad de actividad corresponde a 1 pmol de sustrato (NAD+) consumido por minuto. Esto se calculó a partir de los datos de absorción utilizando la ley de Lambert-Beer y el coeficiente £<nadh>= 6220 M-1 cm-1.

f) Los resultados muestran claramente el efecto de la deleción del gen AHD sobre la actividad alcohol deshidrogenasa de los extractos libres de células (Tabla 18). Al eliminar elADH2gen se consigue una reducción de la actividad de 94%. Esto también lo confirman las cepas de P. pastoris X33. Suprimiendo también el segundo gen de la alcohol deshidrogenasaADH900Se observa una reducción de la actividad combinada de 99%.

Tabla 18: Actividad alcohol deshidrogenasa de extractos libres de células sobre etanol como sustrato.

Ejemplo 15: Medición de las tasas de absorción de metanol de cepas negativas para la utilización de metanol y con deficiencia de alcohol deshidrogenasa.

Para determinar la tasa de absorción de metanol se cultivaron cepas Mut- y con deficiencia de alcohol deshidrogenasa en un biorreactor. Las cepas probadas fueronP. pastoris Aaox1Aaox2Adh2A::HphR,P. pastoris Aaox1Aaox2Adh900A::KanMX yP. pastoris Aaox1Aaox2Adh2A::HphR Adh900A::KanMX. Los cultivos se desarrollaron hasta una cierta concentración de biomasa. Después se aplicó un pulso de metanol y se midió la concentración de metanol inmediatamente después del pulso y aproximadamente 20 horas después. La configuración experimental ya se describe en detalle en el Ejemplo 7. El objetivo era determinar la tasa de absorción de metanol específica de las cepas con deficiencia de alcohol deshidrogenasa y compararla con la tasa de absorción de metanol medida en el Ejemplo 7.

a) A los reactores cargados con 300 mL de medio BSM se les inocularon 15 mL deP. pastoris Aaox1Aaox2 adh2A::HphR(reactores aR2 y aR4) yP. pastoris Aaox1Aaox2 adh900A::KanMX(reactores aR1 y aR3). La OD600 inicial objetivo fue 2. Al final de la fase discontinua, como lo indica un pico de oxígeno disuelto, se inició una alimentación de glucosa al 50% (p/p) a 2,8 mL/h durante 24 horas para aumentar la biomasa. Dos horas después del inicio de la alimentación con glucosa, se administró una inyección de metanol al 50% (v/v) para aumentar la concentración de metanol a 1,5% (la concentración medida fue aR1 = 1,64%, aR2 = 1,66%, aR3 = 1,59% y aR4 = 1,67%). Esto se hizo para inducir el consumo de metanol. Al final de la fase de alimentación de glucosa, se tomaron muestras para determinar el peso seco celular y para la HPLC.

b) Después de la fase de alimentación de glucosa, la agitación y la gasificación se fijaron a 750 rpm constantes y 9.5 sL/h. Se añadió un pulso adicional de metanol al 50% para aumentar la concentración a 1,5% e inmediatamente se tomó una muestra de HPLC (la concentración medida fue aR1 = 1,36%, aR2 = 1,44%, aR3 = 1,34% y aR4 = 1,45%). La concentración se midió nuevamente después de 18,4 horas y se usó para determinar la tasa de absorción específica de metanol (qmetanol).

c) Se inició un cultivo en biorreactor separado para medir la tasa de absorción de la cepa de doble deleción deADH P. pastoris Aaox1Aaox2adh2A::HphR adh900A::KanMX. El cultivo se llevó a cabo como se explica en este ejemplo y en el Ejemplo7. Se inoculóP. pastoris Aaox1Aaox2Adh2A::HphRAdh900A::KanMX en los reactores cR3 y cR4. La DO600 inicial objetivo fue 2. Al final de la fase discontinua, como lo indica un pico de oxígeno disuelto, se inició una alimentación de glucosa al 50% (p/p) a 2,4 mL/h durante 24 horas para aumentar la biomasa. Dos horas después del inicio de la alimentación con glucosa, se administró una inyección de metanol al 50% (v/v) para aumentar la concentración de metanol a 1,5% (la concentración medida fue cR3 = 1,50% y cR4 = 1,47%). Esto se hizo para inducir el consumo de metanol. Al final de la fase de alimentación de glucosa, se tomaron muestras para determinar el peso seco celular y para la HPLC.

d) Después de la fase de alimentación de glucosa, la agitación y la gasificación se fijaron a 750 rpm constantes y 9.5 sL/h. Se añadió un pulso adicional de metanol al 50% para aumentar la concentración a 1,5% e inmediatamente se tomó una muestra de HPLC (la concentración medida fue cR3 = 1,37% y cR4 = 1,49%). La concentración se midió nuevamente después de 19,5 horas y se utilizó para determinar la tasa de absorción específica de metanol (qmetanol).

e) La tasa de absorción específica de metanol se calculó como en el Ejemplo7d). Al eliminar elADH2,se logró una reducción sorprendente y sustancial en la tasa de absorción de metanol (Tabla 19). La dc/dt del metanol está entre 0,07 y 0,06 g L-1 h-1 para aR2 y aR4 que es sólo ligeramente superior a la evaporación observada en el Ejemplo6. En contraste, la tasa de absorción de metanol de la cepa de deleción deADH900no se reduce y, de hecho, fue ligeramente mayor que la tasa de absorción medida deP. pastoris Aaox1Aaox2en el Ejemplo7. Esta diferencia se puede atribuir a condiciones ligeramente diferentes entre el Ejemplo7y este ejemplo, siendo la diferencia un volumen del reactor y una concentración de metanol ligeramente mayores después del pulso de metanol. La cepa de doble deleción deADHno muestra una reducción observable de la tasa de absorción de metanol en comparación con la ya baja tasa de absorción de la cepa de deleción deADH2.Estos resultados confirmaron inesperadamente que el genADH2y su producto, la enzima Adh2, son en gran medida responsables de las características observadas enP. pastoris Aaox1Aaox2y que las observaciones del Ejemplo7no son consecuencia de la oxidación espontánea del metanol ni de la actividad promiscua de ninguna otra enzima.

Por lo tanto, se concluyó que el principal gen y enzima responsables de la absorción de metanol enP. pastoris Aaox1Aaox2es el genADH2y su producto, la enzima Adh2.

Tabla 19: Resumen de tasas específicas de absorción de metanol (qmetanol) y pérdida aparente de metanol (dc/dt) para las cepas con deleción deADH.* La concentración de metanol se mide a las 19,5 h.

Ejemplo 16: Medición de las tasas de absorción de metanol de las cepas negativas para la utilización de metanol y con expresión anormalmente alta de alcohol deshidrogenasa.

Para confirmar que Adh2 es la enzima responsable del consumo de metanol enP. pastoris Aaox1Aaox2e investigar si es posible aumentar la tasa de absorción de metanol con la expresión anormalmente alta de los genesADH2oADH900,se midió la tasa específica de absorción de metanol de las cepasP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pGAP_Adh2_CycTT yP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pGAP_Adh900_CycTT en un cultivo en biorreactor. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo7y15.

a) A los reactores cargados con 300 mL de medio BSM se les inocularon 15 mL deP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pGAP_Adh2_CycTT (reactores R1 y R3) yP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pGAP_Adh900_CycTT (R2 y R4). La DO600 inicial objetivo fue 2. Al final de la fase discontinua, como lo indica un pico de oxígeno disuelto, se inició una alimentación de glucosa al 50% (p/p) a 2,8 mL/h durante 24 horas para aumentar la biomasa. Dos horas después del inicio de la alimentación con glucosa, se administró una inyección de metanol al 50% (v/v) para aumentar la concentración de metanol a 1,5% (la concentración medida fue R1 = 1,56%, R2 = 1,53%, R3 = 1,52% y R4 = 1,54%). Esto se hizo para inducir el consumo de metanol. Al final de la fase de alimentación de glucosa, se tomaron muestras para determinar el peso seco celular y para la HPLC.

b) Después de la fase de alimentación de glucosa, la agitación y la gasificación se fijaron a 750 rpm constantes y 9,5 sL/h. Se añadió un pulso adicional de metanol al 50% para aumentar la concentración a 1,5% e inmediatamente se tomó una muestra de HPLC (la concentración medida fue R1 = 1,30%, R2 = 1,30%, R3 = 1,35% y R4 = 1,30%). La concentración se midió nuevamente después de 4,1, 20,1 horas y se utilizó para determinar la tasa de absorción específica de metanol (qmetanol).

c) Se eligió un punto de tiempo de muestreo adicional a las 4,1 horas ya que se esperaba una mayor tasa de absorción de metanol. La tasa media de absorción de metanol a las 4,1 horas fue de 7,72 mg g-1 h-1 para la cepa deP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pGAP_Adh2_CycTT que expresa de manera anormalmente altaADH2y 5,61 mg g-1 h-1 para la cepa deP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pGAP_Adh900_CycTT que expresa de manera anormalmente altaADH900.Después de 20,1 horas, la tasa media de absorción disminuye a 6,35 mg g-1 h-1 para la cepa que expresa de manera anormalmente altaADH2y a 5,16 mg g-1 h-1 para la cepa que expresa de manera anormalmente altaADH900(Tabla 20). Como se discutió anteriormente en el Ejemplo15e)no se puede observar diferencia significativa para laP. pastoris Aaox1Aaox2parental cuando se suprime el genADH900y lo mismo ocurre cuando se expresa de manera anormalmente alta el geneADH900.Por otra parte, la cepa que expresa de manera anormalmente altaADH2tuvo una tasa de absorción 37% y 23% mayor a las 4,1 y 21,7 horas en comparación con la cepa que expresa de manera anormalmente altaADH900. Subrayando aún más el hallazgo inesperado de que Adh2 es la enzima responsable del consumo de metanol y que es posible aumentar el consumo de metanol con la expresión anormalmente alta del genADH2.

Tabla 20: Resumen de tasas específicas de absorción de metanol (qmetanol) y pérdida aparente de metanol (dc/dt) para las cepas que expresan de manera anormalmente alta ADH.

Ejemplo 17: Generación de cepas con promotores inducibles por metanol para la expresión anormalmente alta de ADH2.

Con el fin de investigar el efecto de la expresión anormalmente alta deADH2inducible por metanol, se crearon dos construcciones de expresión anormalmente alta compuestas por promotores inducibles por metanolPaoxiPP7435_chr4 (237941...238898) yPfldiPP7435_Chr3 (262922...263518) controlando la expresión de la secuencia codificante deADH2.La secuencia codificante deADH2se modificó para eliminar los sitios de restricción Bbsl y Bsal en la secuencia codificante sin afectar la secuencia de aminoácidos del producto génico (Tabla 16). Las cepas generadas fueron denominadasP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pAOX1_Adh2_CycTT yP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pFLD1_Adh2_CycTT.

a) Las construcciones de expresión se crearon utilizando el ensamblaje Golden Gate como ya se describió (Prielhofer et al., 2017). (1) La construcción de expresión BB3aZ_pAOX1_Adh2_CycTT se ensambló de la siguiente manera. El fragmento de ADN curado Adh2_GG_(Tabla 16) se clonó en la estructura principal BB1_23, creando BB1_23_Adh2. La construcción de expresión se generó mediante el ensamblaje Golden Gate de BB3aZ_14* (estructura principal), BB1_23_Adh2 (secuencia codificante), BB1_12_pAOX1 (promotor), BB1_34_ScCYC1tt (terminador). (2) La construcción de expresión BB3aZ_pFLD1_Adh2_CycTT se generó mediante el ensamblaje Golden Gate de BB3aZ_14* (estructura principal), BB1_23_Adh2 (secuencia codificante), BB1_12_pFLD1 (promotor), BB1_34_ScCYC1tt (terminador). Los plásmidos y las secuencias están disponibles en el kit Golden PiCS Núm. 1000000133 (Addgene, Inc., EE. UU.).

b) La cepa deP. pastoris Aaox1Aaox2se hizo electrocompetente como se describe en el Ejemplo1a).La construcción de expresión BB3aZ_pAOX1_Adh2_CycTT y la construcción de expresión BB3aZ_pFLD1_Adh2_CycTT se linealizaron con Ascl (New England Biolabs, Inc., EE. UU.) según el protocolo del fabricante y se purificaron con Kits de Extracción de Fragmentos de ADN en Gel/PCR Hi Yield® (Süd-Laborbedarf GmbH, Alemania). 500 nanogramos del plásmido linealizado se transformaron enP. pastoris Aaox1Aaox2electrocompetentes como se describió anteriormente en el Ejemplo1a)y1d).Se seleccionaron transformantes positivos en placas YPD con 25 pg/mL de Zeocina. La integración satisfactoria de la construcción de expresión se verificó mediante amplificación por PCR con los cebadores 109_BB3aN_ctrl_fwd y pGAP_goi_rev_v2 (Tabla 17) con ADN genómico como molde. Las cepas creadas se denominanP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pAOX1_Adh2_CycTT yP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pFLD1_Adh2_CycTT.

c) Se aisló ADN genómico para amplificaciones por PCR con el Kit de Purificación de ADN Genómico Wizard® (Promega Corporation, EE. UU.) según recomendaciones del fabricante. Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron con la polimerasa Q5 (New England Biolabs, Inc., EE. UU.) según las recomendaciones del fabricante.

Ejemplo 18: Medición de tasas específicas de absorción de metanol de cepas negativas para la utilización de metanol con promotores inducibles por metanol para la expresión anormalmente alta de AHD2.

Para investigar el efecto de la expresión anormalmente alta deADH2con promotores inducibles por metanol sobre la tasa de absorción específica de metanol, se estableció un cultivo en biorreactor como se describe en el Ejemplo7y el Ejemplo16.Para ello, se utilizaron las cepasP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pAOX1_Adh2_CycTT yP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pFLD1_Adh2_CycTT generadas en el Ejemplo17.

a) A los reactores cargados con 300 mL de medio BSM se les inocularon 15 mL deP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pAOX1_Adh2_CycTT (reactores R1 y R2) yP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pFLD1_Adh2_CycTT (R3 y R4). La DO600 objetivo inicial fue 2. Al final de la fase discontinua, como lo indica un pico de oxígeno disuelto, se inició una alimentación de glucosa al 50% (p/p) a 2,8 mL/h durante 24 horas para aumentar la biomasa. Dos horas después del inicio de la alimentación con glucosa, se administró una inyección de metanol al 50% (v/v) para aumentar la concentración de metanol a 1,5% (la concentración medida fue R1 = 1,57%, R2 = 1,57%, R3 = 1,57% y R4 = 1,70%). Esto se hizo para inducir el consumo de metanol y los promotores inducibles por metanol. Al final de la fase de alimentación de glucosa, se tomaron muestras para determinar el peso seco celular y para la HPLC.

b) Después de la fase de alimentación de glucosa, la agitación y la gasificación se fijaron a 750 rpm constantes y 9,5 sL/h. Se añadió un pulso adicional de metanol al 50% para aumentar la concentración a 1,5% e inmediatamente se tomó una muestra de HPLC (la concentración medida fue R1 = 1,42%, R2 = 1,39%, R3 = 1,39% y R4 = 1,42%). La concentración se midió nuevamente después de 4,2 horas y se usó para determinar la tasa de absorción específica de metanol (qmetanol). Después de que el pulso inicial casi se consumió, se aplicó un segundo pulso de metanol e inmediatamente se tomó una muestra de HPLC (la concentración medida fue R1 = 1,61%, R2 = 1,65%, R3 = 1,50% y R4 = 1,47%). La concentración se midió nuevamente después de 6,2 horas y se usó para determinar la tasa de absorción específica de metanol (qmetanol) por segunda vez.

c) La tasa específica de absorción de metanol (qmetanol) se determinó utilizando dos pulsos de metanol. El tiempo entre el primer pulso y el momento del muestreo fue de 4,2 horas. El tiempo entre el segundo pulso de metanol y el punto de muestreo fue de 6,2 horas. La tasa promedio de absorción de metanol después de 4,2 horas después del primer pulso fue de 8,3 mg g-1 h-1 para la cepa deP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pFLD1_Adh2_CycTT que expresa de manera anormalmente altaPfld1ADH2y 11,6 mg g-1 h-1 para la cepa deP. pastoris Aaox1úaox2BB3aZ_pAOX1_Adh2_CycTT que expresa de manera anormalmente alta Paox1ADH2 (Tabla 21). 6,2 horas después del segundo pulso de metanol, la tasa de absorción promedio aumentó a 10,1 mg g-1 h-1 para la cepa que expresa de manera anormalmente alta pfld1ADH2y a 13,8 mg g-1 h-1 para la cepa que expresa de manera anormalmente alta<paox>1ADH2 (Tabla 22). Estos datos muestran que tiempos de inducción de metanol más prolongados conducen a una mayor expresión de Adh2 y a una tasa de absorción específica de metanol cuando se utilizan promotores inducibles por metanol. Por lo tanto, las cepas pueden mantener e incluso aumentar la tasa específica de absorción de metanol a lo largo del tiempo en un medio con metanol como única fuente de energía y carbono. En comparación con la cepa deP. pastoris Aaox1Aaox2pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT descrita en el Ejemplo 7, la tasa específica de absorción de metanol aumentó como promedio 1,6 veces paraP. pastoris kaoxlkaox2BB3aZ_pFLD1_Adh2_CycTT y 2,3 veces paraP. pastoris Aaox1Aaox2BB3aZ_pAOX1_Adh2_CycTT.

Tabla 21: Resumen de las tasas específicas de absorción de metanol (qmetanol) con expresión anormalmente alta deADH2inducible por metanol después del primer pulso de metanol.

Tabla 22: Resumen de las tasas específicas de absorción de metanol (qmetanol) con expresión anormalmente alta deADH2inducible por metanol después del segundo pulso de metanol.

Ejemplo 19: Generación de cepas que expresan de manera anormalmente altaADH2produciendo una proteína recombinante secretada.

Para investigar si la expresión anormalmente alta deADH2y el consiguiente aumento en la tasa de absorción específica de metanol tienen un impacto en la producción de proteínas recombinantes, se transformaronP. pastoris Aaox1Aaox2que producen HSA y vHH del Ejemplo 3 con las construcciones de expresión anormalmente alta dePaoxiADH2yPfldiADH2y se escrutaron a pequeña escala con un protocolo adaptado descrito en el Ejemplo 4.

a) Las construcciones de expresión anormalmente alta se realizaron utilizando el ensamblaje Golden Gate como ya se describió (Prielhofer et al., 2017). (1) La construcción de expresión BB3aK_pAOX1_Adh2_CycTT se generó mediante el ensamblaje Golden Gate de BB3aK_14* (estructura principal), BB1_23_Adh2 (secuencia codificante) del Ejemplo 17, BB1_12_pAOX1 (promotor), BB1_34_ScCYC1tt (terminador). (2) La construcción de expresión BB3aK_pFLD1_Adh2_CycTT se generó mediante el ensamblaje Golden Gate de BB3aK_14* (estructura principal), BB1_23_Adh2 (secuencia codificante) del Ejemplo 17, BB1_12_pFLD1 (promotor), BB1_34_ScCYC1tt (terminador). Los plásmidos y las secuencias están disponibles en el kit Golden PiCS Núm. 1000000133 (Addgene, Inc., EE. UU.).

b) La cepa deP. pastoris Aaox1úaox2pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT yP. pastoris Aaox1úaox2pPM2pZ30_pAOX1_aMF-vHH_CycTT se hizo electrocompetente como se describe en el Ejemplo 1a). La construcción de expresión BB3aK_pAOX1_Adh2_CycTT y la construcción de expresión BB3aK_pFLD1_Adh2_CycTT se linealizaron con Ascl (New England Biolabs, Inc., EE. UU.) según el protocolo del fabricante y se purificaron con Kits de Extracción de Fragmentos de ADN en el/PCR Hi Yield® (Süd-Laborbedarf GmbH, Alemania). 500 nanogramos del plásmido linealizado se transformaron en.P. pastoris Úaox1úaox2pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT yP. pastoris Aaox1Aaox2pPM2pZ30_pAOX1_aMF-vHH_CycTT electrocompetentes como se describió anteriormente en el Ejemplo 1a) y 1d). Los transformantes positivos se seleccionaron en placas YPD con 500 pg/mL de Geneticina y 25 pg/mL de Zeocina paraP. pastoris haox1haox2pPM2pZ30_pAOX1_aMF-vHH_CycTT_BB3aK_pAOX1_Adh2_CycTT yP. pastoris haox1haox2Transformantes pPM2pZ30_pAOX1_aMF-vHH_CycTT_BB3aK_pFLD1_Adh2_CycTT. Los transformantes deP. pastoris Aaox1Aaox2pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT_BB3aK_pAOX1_Adh2_CycTT yP. pastoris Aaox1Aaox2pPM2pN21_pA0X1_HSAopt_CycTT_BB3aK_pFLD1_Adh2_CycTT se seleccionaron en placas YPD con 500 pg/mL de Geneticina y 100 pg/L de Nourseotricina. Se seleccionaron múltiples clones por transformación para su posterior escrutinio (Ejemplo 20). Las cepas creadas se denominan:P. pastoris Aaox1Aaox2PaoxíHSAPaox1ADH2, P. pastoris Aaox1Aaox2PaoxíHs APfld1ADH2, P. pastoris Aaox1Aaox2PaoxívHH Paox1ADH2 yP. pastoris Aaox1Aaox2PaoxívHHPfld1ADH2.

Ejemplo 20: Detección a pequeña escala de cepas que expresan de manera anormalmente altaADH2produciendo una proteína recombinante secretada.

Se probaron múltiples clones de los transformantes descritos en el Ejemplo 19 en pruebas de detección a pequeña escala para investigar el impacto de la expresión anormalmente alta deADH2en la producción de proteínas recombinantes. El procedimiento de escrutinio se adaptó del protocolo prolongado de dos inyecciones y del protocolo estándar descrito en el Ejemplo 4.

a) Para el precultivo deP. pastoris k.aox1k.aox2PaoxíHSAPaox1ADH2yP. pastoris k.aox1k.aox2PaoxíHSAPfld1ADH2,los clones se inocularon en 2 mL de YPD con 500 pg/mL de geneticina y 100 pg/mL de nourseotricina, a los clonesP. pastoris Aaox1Aaox2P<aoxív>HHPaox1ADH2yP. pastoris Aaox1Aaox2P<aoxív>HH P<fld>1ADH2 se les inocularon 500 pg/mL de Geneticina y 25 pg/mL de Zeocina. Las cepas parentales se inocularon en dos réplicas en YPD con 100 pg/mL de Nourseotricina o 25 pg/mL de Zeocina según la resistencia a antibióticos utilizada para la selección. Para cada construcción de expresión se seleccionaron once clones para su selección. Los cultivos previos y de escrutinio se cultivaron en placas de 24 pocillos selladas con una membrana permeable al aire y se incubaron a 25°C a 280 rpm. El cultivo de escrutinio se inoculó a una densidad óptica inicial (DO600) de 8 en 2 mL de medio mínimo (ASMv6) con un sistema de liberación lenta de glucosa EnPump200 (Enpresso GmbH, Alemania) basado en una solución de polisacárido y una enzima para mantener los cultivos en el límite de glucosa. Las cepas se compararon con dos procedimientos diferentes de alimentación de metanol que diferían en el metanol total recibido y el tiempo de incubación (Tabla 23).

b) Después del período de incubación, se extrajo 1 mL de cada cultivo y se centrifugó en un tubo Eppendorf pesado previamente. Se eliminó el sobrenadante y se midió la concentración de proteína con el Caliper LabChip GXII Touch (PerkinElmer, inc., EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. El peso húmedo celular se determinó pesando los tubos Eppendorf con el sedimento celular y se calculó de la siguiente manera: Peso (lleno) - peso (vacío) = peso húmedo celular (WCW) (g/l). A partir de estos datos se calculó el rendimiento: Rendimiento (pg/g) = concentración de proteína/peso húmedo celular.

Tabla 23: Resumen de las estrategias de escrutinio utilizadas para probar el rendimiento de producción de proteína secretada de las cepas transformadas en el Ejemplo 20. *La primera inyección fue metanol al 0,5 % (v/v).

c) Los resultados se resumen en Tabla 24. Sorprendentemente, la expresión anormalmente alta aumentó el rendimiento de proteína (pg/g) hasta 1,7 veces para vHH y 2,3 veces para HSA en comparación con las cepas Mut- parentales. Demostrando de hecho que la expresión anormalmente alta deADH2mejora la producción de proteínas recombinantes deP. pastoris Aaox1Aaox2.

d) Se seleccionaron cepas de rendimiento medio para el cultivo en biorreactor. La integración satisfactoria de la construcción de expresión se verificó mediante amplificación por PCR con los cebadores 109_BB3aN_ctrl_fwd y pGAP_goi_rev_v2 (Tabla 17) con ADN genómico como molde. Se aisló ADN genómico para amplificaciones por PCR con el Kit de Purificación de ADN Genómico Wizard® (Promega Corporation, EE. UU.) según recomendaciones del fabricante. Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron con la polimerasa Q5 (New England Biolabs, Inc., EE. UU.) según las recomendaciones del fabricante.

Tabla 24: Rendimiento promedio del producto secretado en gg de producto/g WCW con desviación estándar en diferentes condiciones de escrutinio. *Diferencia estadísticamente significativa de la prueba t (p<0,05) con respecto a la cepa parental.

Ejemplo 21: La cepa negativa para la utilización de metanol con expresión anormalmente altaADH2que produce HSA como proteína modelo. Cultivada con estrategia 3 - Una estrategia con una fase de alimentación conjunta de glucosa/metanol y una fase de alimentación separada solo de metanol.

Se realizó un cultivo en biorreactor para evaluar la capacidad de producción de proteínas recombinantes de la cepa que expresa de manera anormalmente altaADH2negativa para la utilización de metanol generada en el Ejemplo 19 y seleccionada en el Ejemplo 20. Para este propósito, las cepasP. pastoris Aaox1Aaox2pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT BB3aK_pAOX1_Adh2_CycTT (Aaox1Aaox2 PaoxíHSAPaoxiADH2)yP. pastoris Aaox1Aaox2pPM2pN21_pAOX1_HSAopt_CycTT BB3aK_pFLD1_Adh2_CycTT (Aaox1Aaox2 P<aoxi>HSAPfldiADH2)se cultivaron con la estrategia 3 como se describe en el Ejemplo 10 y el Ejemplo 11.

a) Este cultivo en biorreactor se separó en tres fases. (1) La Fase uno fue la fase discontinua. A los reactores se les inocularon las cepas de producción con una DO600 inicial de 2. La inoculación se realizó como se describe en el Ejemplo 7a) b). El final de la fase discontinua se indicó mediante un pico de oxígeno disuelto. (2) En este punto se inició la Fase dos. La Fase dos consistió en una alimentación de glucosa al 50% (p/p) a 4,8 mL/h durante 25 horas. Al inicio de la Fase dos, se aplicó un pulso de metanol al 50% (v/v) para aumentar la concentración de metanol hasta el objetivo de 1,5% (v/v) y se inició una alimentación de metanol posterior para contrarrestar el consumo, la evaporación y la dilución de metanol por parte de la alimentación de glucosa. (3) La Fase tres consistió en una alimentación de metanol únicamente durante 19,6 (R1, R2) y 21,6 (R5, R6) horas. La concentración de metanol se midió en línea con HPLC como se describe en el Ejemplo 6d). Si fue necesario, se añadió un pulso de compensación adicional. La alimentación de metanol se calculó a intervalos de una hora como en los Ejemplos 8 y 9b). Las cepas utilizadas en cada uno de los reactores R1, R2, R5 y R6 se identifican en la Tabla 25.

b) Los datos de procedimiento y productividad se pueden encontrar en la Tabla 26 y la Tabla 27. La concentración máxima y mínima de metanol durante todo el cultivo de los reactores R1, R2, R5 y R6 osciló entre 8,0 g/L y 13,6 g/l. Los reactores R1, R2 y R5, R6 producían HSA como proteína modelo. La productividad específica (qP) a las 68,7 horas en la fase 3 muestra un impacto positivo de la expresión anormalmente alta deADH2conPaox1oPfld1en comparación con el Ejemplo 10 (Tabla 28, Tabla 29). Un promedio ponderado de qP se calculó para el Ejemplo 10, puntos de tiempo de 45,02 a 69,58 horas para facilitar la comparación. La qP para el Ejemplo 10 desde el punto de tiempo 45,02 a 69,58 h es como promedio 40,9 pg g-1 h-1. La qP en el presente ejemplo para la expresión anormalmente alta de Paox1ADH2 en reactor (R1, R2) desde el punto de tiempo 49,1 a 68,7 horas es como promedio 84,3 pg g-1 h-1. Esto representa un incremento de 2 veces en comparación con el ejemplo 10 (Tabla 28). La expresión anormalmente alta depfld1ADH2(R5, R6) en un período de tiempo similar (47,1 a 68,7 horas) muestra una qP promedio de 71 p g g -1 h-1. Esto representa un incremento de 1.7 veces en qP (Tabla 29). La productividad volumétrica en el punto de tiempo de 68,7 horas se incrementa en 1.21 veces para la expresión anormalmente alta de paox1ADH2(Tabla 30) y 1.13 para la expresión anormalmente dePfldADH2(Tabla 31). El aumento de qP y la productividad volumétrica en este ejemplo está demostrando los beneficios de la expresión anormalmente alta deADH2en la cepa deP. pastoris Aaox1Aaox2para la producción de proteínas recombinantes.

Tabla 25: Resumen de las cepas utilizadas en el Ejemplo 21 y el Ejemplo 22.

Tabla 26: Datos del procedimiento de cultivo en biorreactor y productividad específica (qp) para HSA con expresión anormalmente alta dePaoxiADH2del Ejemplo 21. *Representa una muestra de control después del pulso de metanol.

Tabla 27: Datos del procedimiento de cultivo en biorreactor y productividad específica (qP) para HSA con expresión anormalmente alta de Pfld1ADH2 del Ejemplo 21. *Representa una muestra de control después del pulso de metanol.

Tabla 28: Comparación de la productividad específica (qp) de la cepa negativa para la utilización de metanol que produce HSA del Ejemplo 10 con la cepa que expresa de manera anormalmente altaP<a o x 1>ADH2del Ejemplo 21 en la fase 3.

Tabla 29: Comparación de productividad específica (qP) de la cepa negativa para utilización de metanol que produce HSA del Ejemplo 10 con la cepa que expresa de manera anormalmente altaPfldiADH2del Ejemplo 21 en la fase 3.

Tabla 30: Comparación de la productividad volumétrica de la cepa negativa para la utilización de metanol que produce HSA del Ejemplo 10 con la cepa que expresa de manera anormalmente alta P<a o x i>ADH2del Ejemplo 21.

* Concentración recombinante corregida (Ccp) para el volumen de biomasa, Ccp=Cp*(1-Cx*Fc), Fc=0.0033.

Tabla 31: Comparación de la productividad volumétrica de la cepa negativa para la utilización de metanol que produce HSA del Ejemplo 10 con la cepa que expresa de manera anormalmente altaP fld iA D H 2del Ejemplo 21.

* Concentración recombinante corregida (Ccp) para el volumen de biomasa, CcP=Cp*(1-Cx*Fc), Fc=0,0033.

Ejemplo 22: La cepa negativa para la utilización de metanol con expresión anormalmente alta deADH2que produce vHH como proteína modelo. Cultivada con estrategia 3 - Una estrategia de alimentación con una fase de alimentación conjunta de glucosa/metanol y una fase de alimentación separada solo de metanol.

Se realizó un cultivo en biorreactor para evaluar la capacidad de producción de proteínas recombinantes de la cepa que expresa de manera anormalmente alta negativa para la utilización metanolADH2generada en el Ejemplo 19 y seleccionada en el Ejemplo 20. Para este propósito, las cepasP. pastoris Aaox1Aaox2pPM2pZ30_pAOX1_vHH_CycTT BB3aK_pAOX1_Adh2_CycTT (Aaox1Aaox2PaoxivHHPaoxiADH2)yP. pastoris AaoxlAaox2pPM2pZ30_pAOX1_vHH_CycTT BB3aK_pFLD1_Adh2_CycTT (Aaox1Aaox2PaoxivHHPfldiADH2)se cultivaron con la estrategia 3 como se describe en el Ejemplo 10 y el Ejemplo 11.

a) Este cultivo en biorreactor se separó en tres fases. (1) La Fase uno fue la fase discontinua. A los reactores se les inocularon las cepas de producción con una DO600 inicial de 2. La inoculación se realizó como se describe en el Ejemplo 7a) b). El final de la fase discontinua se indicó mediante un pico de oxígeno disuelto. (2) En este punto se inició la Fase dos. La Fase dos consistió en una alimentación de glucosa al 50% (p/p) a 4,8 mL/h durante 25 horas. Al inicio de la Fase dos, se aplicó un pulso de metanol al 50% (v/v) para aumentar la concentración de metanol hasta el objetivo de 1,5% (v/v) y se inició una alimentación de metanol posterior para contrarrestar el consumo, la evaporación y la dilución de metanol por parte de la alimentación de glucosa. (3) La Fase tres consistió en una alimentación de metanol únicamente durante 43,6 (R3, R4) y 44,6 (R7, R8) horas. La concentración de metanol se midió en línea con HPLC como se describe en el Ejemplo 6d). Si fue necesario, se añadió un pulso de compensación adicional. La alimentación de metanol se calculó a intervalos de una hora como en los Ejemplos 8 y 9b). Las cepas utilizadas en cada reactor R3, R4, R7 y R8 se pueden encontrar en Tabla 25.

b) Los datos de procedimiento y productividad se pueden encontrar en la Tabla 32 y la Tabla 33. La concentración máxima y mínima de metanol durante todo el cultivo de los reactores R3, R4, R7 y R8 osciló entre 8,6 g/L y 14,4 g/L. Los reactores R3, R4 y R7, R8 producían vHH como proteína modelo. La expresión anormalmente alta deADH2tuvo un impacto positivo en la productividad específica (qP) en comparación con el Ejemplo 11. Para facilitar la comparación, se calculó un promedio ponderado de qP para la fase dos (puntos de tiempo de 20,0 a 53,6 horas) del Ejemplo 11. La comparación muestra que la expresión anormalmente alta de Paox1ADH2 (R3, R4) tiene un incremento de 1,71 veces y la expresión anormalmente alta dePfld1ADH2(R7, R8) de 1,78 veces en qP en la fase dos (Tabla 34, Tabla 35). En momentos posteriores de la fase tres, las mejoras son aún mayores. En los puntos de tiempo 92,7 y 91,7 la qP tiene un incremento de 3.76 veces (expresión anormalmente alta dePaox1ADH2)y 3,86 veces (expresión anormalmente alta dePfld1ADH2)(Tabla 34, Tabla 35). Además, la productividad volumétrica mejoró al menos 1,9 veces en comparación con la cepa parental en el Ejemplo 11 en ambos casos (Tabla 35, Tabla 36). El aumento de qP y de la productividad volumétrica en este ejemplo está demostrando los beneficios de la expresión anormalmente alta deADH2en la cepa deP. pastoris Úaox1úaox2para la producción de proteínas recombinantes.

Tabla 32: Datos del procedimiento de cultivo en biorreactor y productividad específica (qp) para vHH con expresión anormalmente alta dePaoxiADH2del Ejemplo 22. *Representa una muestra de control después del pulso de metanol.

Tabla 33: Datos del procedimiento de cultivo en biorreactor y productividad específica (qp) para vHH con expresión anormalmente alta deP<f l d 1>ADH2del Ejemplo 22. *Representa una muestra de control después del pulso de metanol.

Tabla 34: Comparación de la productividad específica (qp) de la cepa negativa para la utilización de metanol que produce vHH del Ejemplo 11 con la cepa que expresa de manera anormalmente altaP<a o x i>ADH2del Ejemplo 22.

Tabla 35: Comparación de la productividad específica (q<p>) de la cepa negativa para la utilización de metanol que produce vHH del Ejemplo 11 con la cepa que expresa de manera anormalmente altaP fld iA D H 2del Ejemplo 22.

Tabla 36: Comparación de la productividad volumétrica de la cepa negativa para la utilización de metanol que produce vHH del Ejemplo 11 con la cepa que expresa de manera anormalmente alta P<a o x i>ADH2 del Ejemplo 22.

Tabla 37: Comparación de la productividad volumétrica de la cepa negativa para la utilización de metanol que produce vHH del Ejemplo 11 con la cepa que expresa de manera anormalmente altaP fld iA D H 2del Ejemplo 22. * Concentración recombinante corregida (Ccp) para el volumen de biomasa, CcP=Cp*(1-Cx*Fc), Fc=0,0033.

Tabla 38: Promotores inducibles por metanol y sus respectivas posiciones cromosómicas en la cepa deP. pastorisCBS7435 (Gasser, Steiger y Mattanovich, 2015)

Referencias:

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula anfitriona de levadura metilotrófica (Mut-) con deficiencia en la vía de utilización de metanol recombinante que está diseñada genéticamente:

2. La célula anfitriona Mut- de la reivindicación 1, en donde dichas una o más modificaciones genéticas comprenden una alteración, sustitución, deleción, inserción génica dirigida o bloqueo génico dirigido de (i) uno o más polinucleótidos, o una parte de los mismos; o (ii) una secuencia de control de la expresión.

3. La célula anfitriona Mut- de la reivindicación 2, en donde dicha secuencia de control de la expresión se selecciona del grupo que consiste en un promotor, un sitio de unión al ribosoma, secuencias de inicio y parada de la transcripción o la traducción, un potenciador y una secuencia activadora.

4. La célula anfitriona Mut- de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichos primer y/o segundo genes endógenos son bloqueados por dichas una o más modificaciones genéticas.

5. La célula anfitriona Mut- de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el genADH2es endógeno o heterólogo con respecto a la célula anfitriona Mut-.

6. La célula anfitriona Mut- de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde ADH2 es una cualquiera de: a) una ADH2, que es ADH2 deP. pastorisque comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:50, o un homólogo de la misma que es endógeno para una especie de levadura;

b) un mutante de la ADH2 de a), que es al menos 60% idéntico a SEQ ID NO:50.

7. La célula anfitriona Mut- de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dichas una o más modificaciones genéticas incluyen una alteración de ganancia de función en el genADH2que da como resultado un aumento del nivel o la actividad de ADH2.

8. La célula anfitriona Mut- de la reivindicación 7, en donde dicha alteración de ganancia de función incluye una inserción dirigida del genADH2.

9. La célula anfitriona Mut- de la reivindicación 7 u 8, en donde dicha alteración de ganancia de función regula por incremento la expresión del genADH2en dicha célula.

10. La célula anfitriona Mut- de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde dicha alteración de ganancia de función incluye una inserción de un casete de expresión heterólogo para expresar de manera anormalmente alta el genADH2en dicha célula.

11. La célula anfitriona Mut- de la reivindicación 10, en donde dicho casete de expresión heterólogo comprende un polinucleótido heterólogo que comprende un genADH2bajo el control de una secuencia promotora.

12. La célula anfitriona Mut- de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende un casete de expresión de gen de interés heterólogo (GOIEC) que comprende un promotor del casete de expresión (ECP) conectado operablemente a un gen de interés (GOI) que codifica una proteína de interés (POI).

13. La célula anfitriona Mut- de la reivindicación 12, en donde el ECP es un promotor inducible por metanol.

14. La célula anfitriona Mut- de la reivindicación 13, en donde el ECP es uno cualquiera de los siguientes:

a) un promotor pAOX1 que comprende al menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:5;

b) un promotor pAOX2 que comprende al menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:6; o c) un promotor que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:36-49.

15. La célula anfitriona Mut- de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde GOIEC comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que permite la secreción de la POI.

16. La célula anfitriona Mut- de la reivindicación 15, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal está fusionada adyacente al extremo 5' del GOI.

17. La célula anfitriona Mut- de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en donde la POI es heteróloga con respecto a la célula anfitriona Mut- o el ECP.

18. La célula anfitriona Mut- de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, en donde la POI es un péptido o proteína seleccionados del grupo que consiste en una proteína de unión a antígeno, una proteína terapéutica, una enzima, un péptido, un antibiótica proteico, una proteína de fusión a toxina, un producto conjugado carbohidratoproteína, una proteína estructural, una proteína reguladora, un antígeno de vacuna, un factor de crecimiento, una hormona, una citocina, una enzima de procedimiento.

19. La célula anfitriona Mut- de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde la célula anfitriona Mut- es una célula de levadura del género Pichia, Komagataella, Hansenula, Ogataea o Candida.

20. Un método para producir una proteína de interés (POI) que comprende cultivar una célula anfitriona Mut- de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 utilizando metanol como fuente de carbono para producir la POI.

21. El método de la reivindicación 20, en donde aísla un producto de fermentación del cultivo celular, cuyo producto de fermentación comprende la POI o un metabolito de la célula anfitriona obtenido de la célula anfitriona Mut-.

22. El método de la reivindicación 20 o 21, en donde

a) una fase de crecimiento, durante la cual la célula anfitriona Mut- se cultiva utilizando una fuente de carbono basal como fuente de energía; está seguida de

23. El método de la reivindicación 22, en donde se utiliza una concentración promedio de metanol de 0,5-2,0% (v/v) en el cultivo de células anfitrionas durante la fase de producción de al menos 24 horas.

24. El método de la reivindicación 22 o 23, en donde la alimentación de metanol se realiza a una velocidad de alimentación promedio de al menos 2 mg de metanol/(g de biomasa seca*h) durante la fase de producción de al menos 24 horas.

25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en donde la célula anfitriona Mut- se cultiva durante la fase de producción en condiciones que limitan el crecimiento de la célula anfitriona a menos de 10% (p/p de biomasa).

26. El uso de una célula anfitriona de levadura metilotrófica (Mut-) con deficiencia en la vía de utilización de metanol recombinante en un método para producir un producto de fermentación, cuyo método comprende cultivar dicha célula anfitriona Mut- en condiciones que permitan a la célula anfitriona Mut- utilizar metanol como sustrato para la alcohol deshidrogenasa (ADH2), y producir el producto de fermentación, en donde el método es el de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25.

27. El uso de una célula anfitriona de levadura metilotrófica (Mut-) con deficiencia en la vía de utilización de metanol recombinante en un método para producir un producto de fermentación, cuyo método comprende cultivar dicha célula anfitriona Mut- en condiciones que permitan a la célula anfitriona Mut- producir el producto de fermentación utilizando metanol como una fuente de carbono, cuya célula anfitriona Mut- está diseñada mediante ingeniería genética mediante una o más modificaciones genéticas

b) para aumentar la expresión de un gen de alcohol deshidrogenasa(ADH2),en donde el genADH2codifica una alcohol deshidrogenasa (ADH2).