JP2022528536A - Ｍｕｔ－メチロトローフ酵母 - Google Patents

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Abstract

ａ）１つまたは複数の遺伝子修飾の前の宿主細胞と比較して第１および第２の内因性遺伝子の発現を減少させるための１つまたは複数の遺伝子修飾であって、ｉ．第１の内因性遺伝子が、配列番号１特定されるアミノ酸配列を含むアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）またはそのホモログとしてをコードし、ｉｉ．第２の内因性遺伝子が、配列番号３として特定されるアミノ酸配列を含むアルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）またはそのホモログをコードする、１つまたは複数の遺伝子修飾、ならびに、ｂ）１つまたは複数の遺伝子修飾の前の前記宿主細胞と比較してアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）遺伝子の発現を増加させるための、１つまたは複数の遺伝子修飾であって、ＡＤＨ２遺伝子がアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）をコードする、１つまたは複数の遺伝子修飾、によって操作された組換えメタノール利用経路欠損メチロトローフ酵母（Ｍｕｔ－）宿主細胞。

Description

本発明は、アルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）およびアルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）の欠損した組換えメチロトローフ酵母での目的のタンパク質（ＰＯＩ）の産生について言及する。
組換え宿主細胞培養において産生されるタンパク質は、診断剤および治療剤として益々重要になっている。この目的のため、目的の組換えタンパク質または異種タンパク質を非常に高レベルにおいて産生するように、細胞は、操作および／または選択される。細胞培養条件の最適化は、組換えタンパク質または異種タンパク質の良好な商業的製造にとって重要である。
目的のタンパク質（ＰＯＩ）の良好な製造は、細胞培養において原核生物および真核生物宿主細胞の両方によって達成された。真核生物宿主細胞、特に哺乳動物宿主細胞、酵母、糸状菌、または細菌は、生物薬剤学的タンパク質ならびにバルクケミカルのための産生宿主として一般的に使用される。最も際立った例は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのメチロトローフ酵母であり、それは、異種タンパク質の効率的な分泌において定評である。Ｐ．パストリスは、新規の属であるコマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）に再分類されており、さらに、３つの種、Ｋ．パストリス（Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｋ．ファフィ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ）、およびＫ．シュードパストリス（Ｋ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）に分けられる。生物工学的用途のために一般的に使用される株は、２つの提案された種、Ｋ．パストリスおよびＫ．ファフィに属する。株ＧＳ１１５、Ｘ－３３、ＣＢＳ２６１２、およびＣＢＳ７４３５は、Ｋ．ファフィであり、その一方で、株ＤＳＭＺ７０３８２は、全ての利用可能なＰ．パストリス株にとっての参考株である基準種のＫ．パストリスに分類される（Ｋｕｒｔｚｍａｎ ２００９， Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３６（１１）：１４３５～８）。Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈら（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ２００９， ８：２９ ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７５－２８５９－８－２９）は、Ｋ．パストリスの基準株ＤＳＭＺ ７０３８２のゲノム配列決定について説明しており、そのセクレトームおよび糖輸送体を分析した。
Ｐ．パストリス株は、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２の両方のＡＯＸ遺伝子が欠損したもの（Ｍｕｔ－と呼ばれる）、または、ＡＯＸ２のみが欠損したもの（ＭｕｔＳと呼ばれる）、またはＡＯＸ遺伝子のいずれも欠損していないもの（Ｍｕｔ＋と呼ばれる）、が使用されてきた。
組換え宿主細胞におけるタンパク質産生のために使用されるプロモーターは、調節される（例えば、培地へのメタノールの添加において誘導される、メタノール制御型）、または、絶えず活性である（構成型）、のいずれかである。メタノール誘導性プロモーターｐＡＯＸ１は、Ｍｕｔ－、Ｍｕｔ＋、またはＭｕｔＳ株においてタンパク質発現を制御すると説明されている。
Ｃｈｉｒｕｖｏｌｕら（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． １９９７， ２１：２７７～２８３）は、組換えタンパク質製造のために使用されるＭｕｔ－株の構成について説明している。Ｍｕｔ－株は、メタノールにおいて増殖せず、増殖、維持、およびタンパク質産生を提供するためには別の炭素源の使用を必要とするということが特定された。ＰＯＩは、ｐＡＯＸ１の制御下において発現され、それは、発酵槽へのメタノールの注入により約０．５（ｖ／ｖ）％の濃度を維持することによって誘導された。
Ｃｈａｕｈａｎら（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９， ３４：１３９～１４５）は、ｐＡＯＸ１プロモーターの下でＨＢｓＡｇを発現するための遺伝子を運ぶ、ＡＯＸ１欠失宿主（Ｍｕｔ－と命名されるが、ＭｕｔＳであると理解される）の利用について説明している。タンパク質発現は、メタノールによって誘導されたが、発酵液における高メタノール濃度は、細胞に対して毒性であることがわかり、というのも、ＭｕｔＳ細胞は、メタノール濃度に対して敏感であることが見出されためである。
Ｋａｒａｏｇｌａｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １９９５， ＤＯＩ １０．１００７／ｓ１０５２９－０１５－１９９３－ｚ）は、Ｐ．パストリスにおけるアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）遺伝子の機能分析について説明している。ＡＤＨ３（ＸＭ＿００２４９１３３７）およびＡＤＨ（ＦＮ３９２３２３）遺伝子を破壊した。ダブルノックアウト株もエタノールを産生した。それにより、ＡＤＨ遺伝子は、エタノール代謝において役割を果たしておらず、ＰｐＡＤＨ３は、Ｐ．パストリスにおけるエタノールの消費を担う唯一の遺伝子であったと結論付けられる。
ＳｉｎｇｈおよびＮａｒａｎｇ（ｂｉｏＲｘｉｖ， ＤＯＩ：１０．１１０１／５７３５１９， プレプリント）は、コマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）（ピキア・パストリス）のＭｕｔ＋、ＭｕｔＳ（ＡＯＸ１－）、およびＭｕｔ－（ＡＯＸ１－ＡＯＸ２－）株におけるβ－ガラクトシダーゼ発現について説明している。ホルマートまたは／およびホルムアルデヒドは、おそらく、真の誘導物質であると結論付けられ、というのも、両方が、ホルマートまたはホルムアルデヒドから細胞内メタノールを合成することができないＭｕｔ－においてＰＡＯＸ１発現を誘導するためであり、メタノールの有望な代替品としてホルマートを提案しており、というのも、それは、メタノールの場合のような不具合を抱えているようには見えないからである。
Ｗｅｉ Ｓｈｅｎら（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ２０１６， １５（１）：１～１１）は、無メタノールピキア・パストリスタンパク質発現系について説明している。２つのキナーゼ変異体Δｇｕｔ１およびΔｄａｋは、非メタノール炭素源の下で強いアルコールオキシダーゼ活性を示し、無メタノール発現系を構築するために使用された。
Ｉａ Ｐｌａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ， ２００６， ｐｐ ８８１～８８８）は、ＡＯＸプロモーターを使用したｓｃＦｖの発現およびメタノールによる誘導に対するＭｕｔＳおよびＭｕｔ＋Ｐ．パストリス株について説明している。
欧州特許出願公開第１９０５８３６（Ａ１）号では、組換えヒトインターフェロンαを産生するためのＰ．パストリス株が開示されており、変異したＡＯＸ１遺伝子を含むがＡＯＸ１遺伝子座は完全には欠失していないＡＯＸ１妨害クローンの使用を提唱している。
Ｃｈｉｎｇ－Ｈｓｉａｎｇ Ｃｈａｎｇら（ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１８， １８（１）：８１）は、メタノール発現調節因子１（Ｍｘｒ１）－再プログラムされた細胞を使用した、Ｐ．パストリスにおける柔軟なｐＡＯＸ１誘導システムを提唱している。
Ｒｕｓｓｍａｙｅｒ Ｈ．ら（ＢＭＣ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５， １３（１）：８０）は、Ｐ．パストリス発現システムの調節におけるＡＯＸの重要性について説明している。
Ｔｏｍａｓ－Ｇａｍｉｓａｎｓ Ｍ．ら（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１８， １１（１）：２２４～２３７）は、単一炭素源としてのメタノールまたはグリセロールに関する予測改良のための、Ｐ．パストリスゲノムスケールの代謝モデルについて説明している。
Ｍｏｓｅｒら（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ２０１７， １６（１）：４９）は、Ｐ．パストリスにおける増殖および組換えタンパク質産生を向上させる順応性実験室進化について説明している。
Ｐ．パストリスでの組換えタンパク質産生は、激しいプロセススキームを必要とし、それは、高い酸素需要および熱生成につながり、高いバイオマス濃度およびメタノール消費を要求する。下流での処理における酸素移動、冷却、およびバイオマス分離は、コストがかかる。したがって、低い酸素需要および熱生成のプロセスを開発することは望ましい。さらに、特に炭素源の効率的な使用によって、タンパク質産生の収率を増加させることは望ましい。
本発明の目的は、メチロトローフ酵母における組換えタンパク質産生を向上させることである。
この目的は、特許請求の範囲の主題によって、本明細書において詳細に説明されるように解決される。
本発明は、
ａ）１つまたは複数の遺伝子修飾の前の宿主細胞と比較して、第１および第２の内因性遺伝子の発現を減少させるための１つまたは複数の遺伝子修飾であって、
ｉ．第１の内因性遺伝子が、配列番号１として特定されるアミノ酸配列を含むアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）またはそのホモログをコードし、
ｉｉ．第２の内因性遺伝子が、配列番号３として特定されるアミノ酸配列を含むアルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）またはそのホモログをコードする、
１つまたは複数の遺伝子修飾、
ならびに
ｂ）１つまたは複数の遺伝子修飾の前の前記宿主細胞と比較してアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）遺伝子の発現を増加させるための１つまたは複数の遺伝子修飾であって、ＡＤＨ２遺伝子が、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）をコードする、１つまたは複数の遺伝子修飾、
によって操作された組換えメタノール利用経路欠損メチロトローフ酵母（Ｍｕｔ－）宿主細胞を提供する。
詳細には、ＡＤＨ２タンパク質は、ＥＣ１．１．１．１として分類されるアルコールデヒドロゲナーゼである。
本明細書において説明されるように、用語「ＡＤＨ２」は、天然アルコールデヒドロゲナーゼ、例えば、配列番号５０として特定されるアミノ酸配列を含むかまたはそのアミノ酸配列からなるＰ．パストリスアルコールデヒドロゲナーゼなど（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｆ２ＱＳＸ６＿ＫＯＭＰＣ；ＦＲ８３９６２９ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ：ＣＣＡ３８５０４．１；遺伝子：ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ２－０８２１）または配列番号５０に対してある特定の相同性（または配列同一性）を有する配列のどちらかを意味するものである。
詳細には、ＡＤＨ２は、Ｐ．パストリス株に由来し得るか、または、真正核細胞などの有機体、例えば、酵母特にメチロトローフ酵母株、種、もしくは属などの野生型細胞に由来して天然に存在するかもしくは内因性であるか、またはそのような天然に存在するＡＤＨ２の変異体である、そのホモログもしくはオーソログであり得る。
詳細には、ＡＤＨ２タンパク質は、宿主細胞の種に天然に存在するか、またはそれに対して内因性であるか、またはそれらの変異体である。
詳細には、本明細書においてＡＤＨ２遺伝子と呼ばれる、Ｐ．パストリスアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号５１として特定されるヌクレオチド配列、または、ＡＤＨ２をコードする同種のポリヌクレオチド（遺伝子）を含むかまたはそれからなり、この場合、ＡＤＨ２は、配列番号５０に対してある特定の相同性（または配列同一性）を有する。
詳細には、ＡＤＨ２遺伝子は、Ｍｕｔ－宿主細胞に対して内因性または異種である。詳細には、Ｍｕｔ－宿主細胞は、ＡＤＨ２遺伝子の１つまたは複数のコピーを含む。
詳細には、ＡＤＨ２は、
ａ）配列番号５０として特定されるアミノ酸配列を含むＰ．パストリスＡＤＨ２であるＡＤＨ２、もしくは酵母種、特にメチロトローフ酵母に対して内因性であるそのホモログ；または
ｂ）配列番号５０に対して少なくとも６０％同一である、ａ）のＡＤＨ２の変異体
のうちのどちらかである。
相同配列は、ＡＤＨ２ホモログまたはＡＤＨ２遺伝子ホモログとも呼ばれる。
例示的ホモログは、図１において説明される：
配列番号５２：コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ ２８４８５のＡＤＨ２アミノ酸配列
配列番号５３：コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ ２８４８５のＡＤＨ２遺伝子配列
配列番号５４：オガタエア・パラポリモルファＤＬ－１のＡＤＨ２アミノ酸配列
配列番号５５：オガタエア・パラポリモルファＤＬ－１のＡＤＨ２遺伝子配列
配列番号５６：オガタエア・パラポリモルファＤＬ－１のＡＤＨ２アミノ酸配列
配列番号５７：オガタエア・パラポリモルファＤＬ－１のＡＤＨ２遺伝子配列
配列番号５８：オガタエア・ポリモルファＮＣＹＣ ４９５ ｌｅｕ１．１のＡＤＨアミノ酸配列
配列番号５９：オガタエア・ポリモルファＮＣＹＣ ４９５ ｌｅｕ１．１のＡＤＨ遺伝子配列
配列番号６０：オガタエア・ポリモルファＮＣＹＣ ４９５ ｌｅｕ１．１のＡＤＨアミノ酸配列
配列番号６１：オガタエア・ポリモルファＮＣＹＣ ４９５ ｌｅｕ１．１のＡＤＨ遺伝子配列
配列番号６２：サッカロマイセス・セレビシエＹＪＭ６２７のＡＤＨ２アミノ酸配列
配列番号６３：サッカロマイセス・セレビシエＹＪＭ６２７のＡＤＨ２遺伝子配列
配列番号６４：カンジダ・マルトーサＸｕ３１６のＡＤＨ２アミノ酸配列
配列番号６５：カンジダ・マルトーサＸｕ３１６のＡＤＨ２遺伝子配列
配列番号６６：クリベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３－１０４２のＡＤＨ４アミノ酸配列
配列番号６７：クリベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３－１０４２のＡＤＨ４遺伝子配列
配列番号６８：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）７．１９８２のＡＤＨ１アミノ酸配列
配列番号６９：大腸菌７．１９８２のＡＤＨ１遺伝子配列
配列番号７０：フサリウム・グラミネアラムＰＨ－１のＡＤＨ１アミノ酸配列
配列番号７１：フサリウム・グラミネアラムＰＨ－１のＡＤＨ１遺伝子配列。
詳細には、ＡＤＨ２ホモログは、配列番号５０に対して６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性のうちの少なくともいずれかを有する。ＡＤＨ２遺伝子ホモログは、本明細書において、ＡＤＨ２ホモログをコードすると理解される。詳細には、配列同一性は、本明細書において詳細に開示されるように、例えば、全長配列と比較して特定される。
詳細には、ホモログまたはホモログ配列は、野生型の宿主細胞例えば、Ｐ．パストリス、特に、Ｋ．パストリスまたはＫ．ファフィ、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）、など、における、ＡＤＨ２タンパク質の同じ定性的な機能によって特徴付けられる。
詳細には、配列番号５０の相同配列は、Ｐ．パストリス、特にＫ．パストリスまたはＫ．ファフィ、以外の種、例えば、コマガタエラ属またはピキア属の別の酵母、の配列であり、それぞれの内因性コード配列の発現は、本明細書において説明されるように増加される（例えば、ノックインされる）。
宿主細胞が、Ｐ．パストリス、特に、Ｋ．パストリスまたはＫ．ファフィの細胞である場合、ＡＤＨ２タンパク質は、内因性配列、例えば、配列番号５０、または異なる株または種の配列番号５０のホモログ、または野生型株または有機体において天然には存在しない、特に、メチロトローフ酵母において天然には存在しない、変異体ＡＤＨ２タンパク質の人工配列、を含み得るかまたはそれらからなり得る。
具体例により、相同配列は、野生型Ｐ．パストリスにおける内因性の天然に存在するＰ．パストリスアルコールデヒドロゲナーゼの活性と比較して０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５．倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、またはそれ以上高いアルコールデヒドロゲナーゼ活性のうちの少なくともいずれかを有する。アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、好適なアッセイにおいて、例えば、無細胞抽出物を使用したアルコールデヒドロゲナーゼアッセイによって、測定することができる。無細胞抽出物は、Ｋａｒａｏｇｌａｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ． ２０１６； ３８（３）：４６３～９）によって説明されるような、ジルコニア／シリカ／ガラスビーズによる細胞培養物の機械的破壊によって、得ることができる。アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、ＮＡＤＨの形成の後に、Ｗａｌｋｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ． １９９２ ２１（１）：４２～４３）によって説明されるように３４０ｎｍの波長において吸収増加を測定することによって測定することができる。ＮＡＤ＋およびアルコールは、基質として使用することができ、等モル濃度において消費される。ＮＡＤＨ産生は、ＮＡＤ＋消費と逆相関する。あるいは、市販の比色アルコールデヒドロゲナーゼ活性アッセイキットを使用することもできる（ＭＡＫ０５３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。例示的アッセイは、本明細書の実施例のセクションにおいて説明される。
本明細書において説明されるように、用語「ＡＯＸ１」は、天然アルコールオキシダーゼ１、例えば、配列番号１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｆ２ＱＹ２７）として特定されるアミノ酸配列を含むかまたはそのアミノ酸配列からなるＰ．パストリスアルコールオキシダーゼ－１など、あるいは、配列番号１に対してある特定の相同性（または配列同一性）を有し、メチロトローフ酵母種に対して内因性であるＰ．パストリスアルコールオキシダーゼ１のホモログであり得、特に内因性アルコールオキシダーゼ１の発現を減少させるための１つまたは複数の遺伝子修飾の前では、宿主細胞として使用されるメチロトローフ酵母に対して内因性であるような配列、のどちらかを意味するものである。特に、ＡＯＸ１タンパク質は、宿主細胞種の種に対して内因性であるオーソログである。
詳細には、本明細書においてＡＯＸ１と呼ばれるＰ．パストリスアルコールオキシダーゼ１をコードする遺伝子は、配列番号２として特定されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれらからなる。
相同配列は、ＡＤＨ１ホモログまたはＡＤＨ１ホモログとも呼ばれる。詳細には、ＡＯＸ１タンパク質またはＡＯＸ１ホモログは、ＥＣ１．１．３．１３として分類されるアルコールオキシダーゼ酵素である。
詳細には、ＡＯＸ１ホモログは、配列番号１に対して６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性のうちの少なくともいずれかを有する。ＡＯＸ１ホモログは、本明細書において、ＡＯＸ１ホモログをコードすると理解される。詳細には、配列同一性は、例えば、本明細書において詳細に開示されるように、完全長配列と比較する場合に特定される。
本明細書において説明されるように、用語「ＡＯＸ２」は、天然アルコールオキシダーゼ２、例えば、配列番号３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｆ２Ｒ０３８）として識別特定されるアミノ酸配列を含むかまたはそのアミノ酸配列からなるＰ．パストリスアルコールオキシダーゼ２など、または配列番号３に対してある特定の相同性（または配列同一性）を有し、メチロトロフィックーフ酵母種に対して内因性であるＰ．パストリスアルコールオキシダーゼ２のホモログであり得、特に、当該内因性アルコールオキシダーゼ２の発現を減じる減少させるための１つまたは複数の遺伝子修飾の前では、宿主細胞として使用されるメチロトローフ酵母に対して内因性である、配列、のどちらかを意味するものである。特に、ＡＯＸ２タンパク質は、宿主細胞種の種に対して内因性であるオーソログである。
詳細には、本明細書においてＡＯＸ２遺伝子と呼ばれるＰ．パストリスアルコールオキシダーゼ２をコードする遺伝子は、配列番号４として特定されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれらからなる。
相同配列は、ＡＯＸ２ホモログまたはＡＯＸ２ホモログとも呼ばれる。詳細には、ＡＯＸ２タンパク質またはＡＯＸ２ホモログは、ＥＣ１．１．３．１３として分類されるアルコールオキシダーゼ酵素である。
詳細には、ＡＯＸ２ホモログは、配列番号３に対して６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性のうちの少なくともいずれかを有する。ＡＯＸ２ホモログは、本明細書において、ＡＯＸ２ホモログをコードすると理解される。詳細には、配列同一性は、例えば、本明細書において詳細に開示されるように、完全長配列と比較する場合に特定される。
詳細には、宿主細胞が、Ｐ．パストリス、特に、それぞれＫ．パストリスおよびＫ．ファフィである場合、ＡＯＸ１および／またはＡＯＸ２タンパク質は、Ｐ．パストリス起源のタンパク質、特にＫ．パストリスまたはＫ．ファフィ起源のタンパク質である。あるいは、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２タンパク質のそれぞれは、Ｐ．パストリス起源、特に、Ｋ．パストリスまたはＫ．ファフィ起源、のそれぞれのタンパク質のホモログ（またはオーソログ）配列を含み、この場合、ホモログ（またはオーソログ）配列は、別の起源または種の野生型宿主細胞の配列である場合、野生型宿主細胞に対して内因性である。例えば、宿主細胞がＫ．ファフィの場合、内因性ＡＯＸ１またはＡＯＸ２タンパク質は、それぞれ、配列番号１および配列番号３として特定されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
別の実施例により、宿主細胞がＫ．パストリスの場合、内因性ＡＯＸ１タンパク質は、配列番号１に対して９９．８５％同一である、配列番号９（コマガタエラ・パストリス、ＡＴＣＣ ２８４８５）として特定されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
別の実施例により、宿主細胞がＫ．パストリスの場合、内因性ＡＯＸ２タンパク質は、配列番号３に対して９９．４０％同一である、配列番号１１として特定されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
例示的ホモログは、図１において説明される：
配列番号９：コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ ２８４８５のＡＯＸ１アミノ酸配列
配列番号１０：コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ ２８４８５のＡＯＸ１ヌクレオチド配列
配列番号１１：コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ ２８４８５のＡＯＸ２アミノ酸配列
配列番号１２：コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ ２８４８５のＡＯＸ２ヌクレオチド配列
配列番号１３：オガタエア・メタノリカＪＣＭ １０２４０のＭＯＤ１アミノ酸配列
配列番号１４：オガタエア・メタノリカＪＣＭ １０２４０のＭＯＤ１ヌクレオチド配列
配列番号１５：オガタエア・メタノリカＪＣＭ １０２４０のＭＯＤ２アミノ酸配列
配列番号１６：オガタエア・メタノリカＪＣＭ １０２４０のＭＯＤ２ヌクレオチド配列
配列番号１７：オガタエア・メタノリカＪＣＭ １０２４０のｐＭＯＤ１プロモーター配列
配列番号１８：オガタエア・メタノリカＪＣＭ １０２４０のｐＭＯＤ２プロモーター配列
配列番号１９：オガタエア・ポリモルファＮＣＹＣ ４９５ ｌｅｕ １．１のＭＯＸアミノ酸配列
配列番号２０：オガタエア・ポリモルファＮＣＹＣ ４９５ ｌｅｕ １．１のＭＯＸヌクレオチド配列
配列番号２１：オガタエア・ポリモルファＮＣＹＣ ４９５ ｌｅｕ １．１のｐＭＯＸプロモーター配列。
しかし、宿主細胞が異なる種の細胞である場合（Ｋ．パストリスおよび／またはＫ．ファフィ以外）、宿主細胞に対して内因性であるＡＯＸ１またはＡＯＸ２タンパク質配列は、それぞれ、配列番号１および配列番号３に対してホモログであり、宿主細胞におけるそのようなホモログ（それぞれ、配列番号１および配列番号３のオーソログ配列）の発現は、本明細書において説明される目的のために減少される。
詳細には、相同配列のいずれかまたはそれぞれは、野生型宿主細胞、例えば、Ｐ．パストリス、特に、Ｋ．パストリスまたはＫ．ファフィ、におけるそれぞれのＡＯＸ１およびＡＯＸ２タンパク質の、例えば、アルコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１３）と同じ定性的機能によって特徴付けられる。
詳細には、配列番号１および配列番号３のそれぞれの相同配列は、Ｐ．パストリス、特に、Ｋ．パストリスまたはＫ．ファフィ、以外の種、例えば、コマガタエラ属またはピキア属の別の酵母の配列であり、それぞれの内因性コード配列の発現は、本明細書において説明されるように、減少または無効にされる（ノックアウトされる）。
詳細には、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２タンパク質の両方は、宿主細胞に対して内因性であり、それぞれＡＯＸ１およびＡＯＸ２をコードする遺伝子の発現は、減少されるかまたは欠失される。
詳細には、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２タンパク質の両方は、同じ起源のタンパク質であり、第１および第２の内因性遺伝子の発現を減少させるための操作の前の同じ宿主細胞（または宿主細胞種）に由来するかそれに対して内因性である。
詳細には、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２タンパク質の両方は、Ｐ．パストリス起源のタンパク質、特に、宿主細胞に対して内因性であるそれぞれの遺伝子によってコードされるタンパク質であり、この場合、宿主細胞は、Ｐ．パストリスである。
詳細には、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２タンパク質の両方は、コマガタエラ・ファフィ起源のタンパク質、特に、宿主細胞に対して内因性であるそれぞれの遺伝子によってコードされるタンパク質であり、その場合、宿主細胞は、コマガタエラ・ファフィである。
詳細には、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２タンパク質の両方は、コマガタエラ・パストリス起源のタンパク質、特に、宿主細胞に対して内因性であるそれぞれの遺伝子によってコードされるタンパク質であり、この場合、宿主細胞は、コマガタエラ・パストリスである。
特定の態様により、１つまたは複数の遺伝子修飾は、（ｉ）１つもしくは複数のポリヌクレオチド、もしくはその一部；または（ｉｉ）発現制御配列、の破壊、置換、欠失、ノックイン、もしくはノックアウトを含む。
特定の態様により、１つまたは複数の遺伝子修飾は、本明細書において説明される宿主細胞の１つまたは複数の内因性ポリヌクレオチド、例えば、コーディングポリヌクレオチド、例えば、それぞれＡＯＸ１、ＡＯＸ２、もしくはＡＤＨ２タンパク質、特に、宿主細胞種、タイプ、もしくは株において天然に存在する野生型（未修飾または天然）タンパク質、をコードするポリヌクレオチド（または遺伝子）、またはポリヌクレオチド（または遺伝子）の発現を制御するヌクレオチド配列、の遺伝子修飾である。
特定の態様により、１つまたは複数の遺伝子修飾は、発現制御配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列もしくは翻訳開始および停止配列、など、の遺伝子修飾、またはエンハンサー配列またはアクティベーター配列の遺伝子修飾である。
宿主細胞を操作する様々な方法を用いることより、例えば、
ａ）例えば、それぞれＡＯＸ１またはＡＯＸ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを破壊すること、そのようなポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを破壊すること、そのようなプロモーターをより低いプロモーター活性を有する別のプロモーターで置き換えることなどによって、それぞれＡＯＸ１またはＡＯＸ２タンパク質をコードする遺伝子の発現を減少させるため；または
ｂ）例えば、ＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムの中に導入すること、そのようなポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを破壊すること、そのようなプロモーターをより高いプロモーター活性を有する別のプロモーターで置き換えることなどによって、ＡＤＨ２タンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させるために、
内因性ポリヌクレオチドの発現を調節する（減少させるまたは増加させる）ことができる。
遺伝子発現を修飾する特定の方法は、例えば、宿主細胞を修飾するＣＲＩＳＰＲベースの方法において使用されるＲＮＡ誘導リボヌクレアーゼによって関連配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写開始または停止配列、翻訳開始または停止配列、エンハンサー配列またはアクティベーター配列、抑制配列または阻害配列、シグナル配列またはリーダー配列、特に、タンパク質の発現および／または分泌を制御する配列、からなる群から選択される制御配列など、を標的にするそれぞれの転写制御因子を使用することにより、ポリヌクレオチド（遺伝子）の発現を調節する制御配列を調節（例えば、活性化、上方調節、不活性化、阻害、または下方調節）するステップを用いる。
特定の態様により、１つまたは複数の遺伝子修飾は、結果としてＡＤＨ２のレベルまたは活性を増加させる、ＡＤＨ２遺伝子の機能獲得変更を含む。
詳細には、機能獲得変更は、ＡＤＨ２遺伝子のノックインを含む。
詳細には、機能獲得変更は、細胞におけるＡＤＨ２遺伝子発現を上方調節する。
詳細には、機能獲得変更は、細胞においてＡＤＨ２遺伝子を過剰発現させるための異種発現カセットの挿入を含む。
詳細には、異種発現カセットは、プロモーター配列の制御下においてＡＤＨ２遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドを含む。そのようなプロモーターは、構成的プロモーター、抑制性プロモーター、または誘導性プロモーターのうちのいずれかであり得る。
詳細には、遺伝子の発現を増加させるための１つまたは複数の遺伝子修飾は、例えば、異種遺伝子のノックイン、または内因性遺伝子のコピー数を増加させることによって、そのような遺伝子修飾を行わないそれぞれの宿主と比較して、遺伝子または遺伝子の一部の発現を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％、またはそれ以上増加させる、遺伝子またはゲノム配列の挿入または活性化を含む１つまたは複数のゲノム変異を含む。
詳細には、発現を増加させる１つまたは複数の遺伝子修飾は、１つまたは複数の内因性ポリヌクレオチドの発現を構成的に改良するかそうでなければ増加させるゲノム変異を含む。
詳細には、発現を増加させる１つまたは複数の遺伝子修飾は、１つまたは複数の内因性ポリヌクレオチドの発現を条件付きで改良するかそうでなければ増加させる１つまたは複数の誘導性または抑制性調節配列を導入するゲノム変異を含む。そのような条件付きで活性化する修飾は、特に、細胞培養条件に応じて、活性でありおよび／または発現される調節要素および遺伝子を標的にする。
詳細には、ＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現は、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を製造する方法において宿主細胞を使用する場合に増加する。詳細には、遺伝子修飾に関して、ＡＤＨ２タンパク質の発現は、ＰＯＩが産生される間の宿主細胞培養の条件下において増加する。
詳細には、宿主細胞は、例えば、１つまたは複数のそれぞれのＡＤＨ２遺伝子のノックインによって、ＡＤＨ２タンパク質の量（例えば、レベル、活性、または濃度）を、修飾を行わない宿主細胞と比較して５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、またはそれ以上のうちの少なくともいずれかにおいて増加するように、遺伝子修飾される。特定の実施形態により、宿主細胞は、（１つまたは複数の）ゲノム配列、特にそれぞれのＡＤＨ２タンパク質をコードするゲノム配列、の１つまたは複数の挿入を含むように遺伝子修飾され、ゲノム配列は、宿主細胞のゲノム中統合される。そのような宿主細胞は、典型的には、ノックイン株として提供される。
特定の実施形態により、本明細書において説明される宿主細胞が細胞培養において培養された後、宿主細胞または宿主細胞培養物中のＡＤＨ２タンパク質の総量は、そのような遺伝子修飾を行う前のまたは行わない宿主細胞によって発現または産生される基準量と比較して、またはそれぞれの宿主細胞培養物において産生される基準量と比較して、またはそのような修飾を行う前のまたは修飾を行わない宿主細胞と比較して、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％（活性％、またはｍｏｌ／ｍｏｌ）、または１００％以上のうちの少なくともいずれかにおいて増加する。
詳細には、例えば、ＡＯＸ１および／またはＡＯＸ２遺伝子などの遺伝子の発現を減少させるための１つまたは複数の遺伝子修飾は、例えば、遺伝子のノックアウトによって、そのような遺伝子修飾を行っていないそれぞれの宿主と比較して、遺伝子または遺伝子の一部の発現を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％減少させるか、または完全にその発現を無効にする、遺伝子またはゲノム配列の欠失または不活性化を含む１つまたは複数のゲノム変異を含む。
詳細には、発現を減少させる１つまたは複数の遺伝子修飾は、１つまたは複数の内因性ポリヌクレオチドの発現を構成的に弱めるかそうでなければ減少させるゲノム変異を含む。
詳細には、発現を減少させる１つまたは複数の遺伝子修飾は、１つまたは複数の内因性ポリヌクレオチドの発現を条件付きで弱めるかそうでなければ減少させる１つまたは複数の誘導性または抑制性調節配列を導入するゲノム変異を含む。そのような条件付きで活性化する修飾は、特に、細胞培養条件に応じて、活性でありおよび／または発現される調節要素および遺伝子を標的にする。
詳細には、１つまたは複数の内因性ポリヌクレオチドの発現は減少し、それにより、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を製造する方法において宿主細胞を使用する場合に、それぞれＡＯＸ１またはＡＯＸ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を減少させる。詳細には、遺伝子修飾に関して、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２タンパク質の両方の発現は、ＰＯＩが産生される間の宿主細胞培養の条件下において減少される。
詳細には、宿主細胞は、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２タンパク質の両方の量（例えば、レベル、活性、または濃度）を、修飾を行わない宿主細胞と比較して５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％（活性％、またはｍｏｌ／ｍｏｌ）のうちの少なくともいずれかにおいて減少させるため、または１００％において、例えば、検出不可能な量まで減少させるために、遺伝子修飾され、それにより、例えば、それぞれＡＯＸ１およびＡＯＸ２遺伝子のノックアウトによって、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２タンパク質の両方の産生を完全に無効にする。特定の実施形態により、宿主細胞は、（１つまたは複数の）ゲノム配列、特にそれぞれＡＯＸ１および／またはＡＯＸ２タンパク質をコードするゲノム配列、の１つまたは複数の欠失を含むように遺伝子修飾される。そのような宿主細胞は、典型的には、欠失株またはノックダウン株として提供される。
特定の態様により、第１および／または第２の内因性遺伝子は、１つまたは複数の遺伝子修飾によってノックアウトされる。詳細には、Ｍｕｔ－宿主細胞は、ΔＡＯＸ１／ΔＡＯＸ２ノックアウト株である。
特定の態様により、第１および／または第２の内因性遺伝子は、１つまたは複数の遺伝子修飾によってノックアウトされ；ＡＤＨ２遺伝子は、１つまたは複数の遺伝子修飾によってノックインされる。詳細には、Ｍｕｔ－宿主細胞は、ΔＡＯＸ１／ΔＡＯＸ２＋ＡＤＨ２－ＯＥ株である。
特定の実施形態により、本明細書において説明される宿主細胞が、細胞培養において培養された後、宿主細胞または宿主細胞培養物中のそれぞれＡＯＸ１および／またはＡＯＸ２タンパク質の総量は、そのような遺伝子修飾を行う前のまたは行わない宿主細胞によって発現または産生される基準量と比較して、またはそれぞれの宿主細胞培養物において産生される基準量と比較して、またはそのような修飾を行う前のまたは修飾を行わない宿主細胞と比較して、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のうちの少なくともいずれか、または１００％において、例えば、検出不可能な量まで、減少される。
それぞれＡＤＨ２、ＡＯＸ１、またはＡＯＸ２タンパク質の産生を増加または減少させる遺伝子修飾の効果について本明細書において説明される宿主細胞を比較する場合、それは、典型的には、そのような遺伝子修飾の前または遺伝子修飾を行わない同等な宿主細胞と比較される。比較は、典型的には、特にＰＯＩを産生する条件下において培養された時に組換えＰＯＩまたは異種ＰＯＩを産生するように操作されるそのような遺伝子修飾を行わない（または行う前の）、同じ宿主細胞種またはタイプにおいて為される。
しかしながら、比較は、組換えＰＯＩまたは異種ＰＯＩを産生するようにさらには操作されない同じ宿主細胞種またはタイプにおいても行うことができる。特定の態様により、それぞれＡＤＨ２、ＡＯＸ１、またはＡＯＸ２タンパク質の増加または減少は、細胞内におけるそれぞれのタンパク質の量（例えば、レベル、活性、または濃度）の増加または減少によって特定される。詳細には、タンパク質の量は、例えば、ウエスタンブロット法、免疫蛍光イメージング、フローサイトメトリーまたは質量分析法などを用いる好適な方法によって特定され、特に、その場合、質量分析法は、例えば、Ｄｏｎｅａｎｕら（ＭＡｂｓ． ２０１２； ４（１）： ２４～４４）によって説明されるような、液体クロマトグラフィ－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）、または液体クロマトグラフィタンデム－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）である。特定の実施例により、アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、無細胞抽出物を使用する活性アッセイによって測定することができる。無細胞抽出物は、Ｋａｒａｏｇｌａｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ． ２０１６； ３８（３）： ４６３～９）によって説明されるように、ジルコニア／シリカ／ガラスビーズによる細胞培養物の機械的破壊によって得ることができる。アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、Ｗａｌｋｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ． １９９２ ２１（１）：４２～４３）によって説明されるように、ＮＡＤＨの形成直後に、３４０ｎｍの波長での吸収増加を測定することによって測定される。ＮＡＤ＋およびアルコールは、基質として使用され、当モル濃度において消費される。ＮＡＤＨ産生は、ＮＡＤ＋の消費に逆相関する。あるいは、市販の比色分析アルコールデヒドロゲナーゼ活性アッセイキットを使用することもできる（ＭＡＫ０５３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。アルコールオキシダーゼ活性は、Ｖｅｒｄｕｙｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． １９８４ （２）１： １５～２５）によって説明されるように、過酸化水素と反応する２，２’－アジノ－ビス－（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）を用いた熱量測定によって、あるいは、ＣｏｕｄｅｒおよびＢａｒａｔｔｉ（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｉ． Ｃｈｅｒｎ． １９８０； ４４（１０）：２２７９～２２８９）によって説明されるように、形成されたホルムアルデヒドの量を測定することによって、測定することができる。詳細なアッセイは、本明細書の実施例のセクションにおいて説明される。
特定の態様により、Ｍｕｔ－宿主細胞は、目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）に作動可能に連結した発現カセットプロモーター（ＥＣＰ）を含む異種目的遺伝子発現カセット（ＧＯＩＥＣ）を含む。
特定の態様により、Ｍｕｔ－宿主細胞は、少なくとも１つの異種ＧＯＩＥＣを含む組換え宿主細胞であり、この場合、ＧＯＩＥＣに含まれる少なくとも１つの成分または成分の組み合わせは、宿主細胞に対して異種である。詳細には、人工発現カセットが使用され、特にその場合、プロモーターおよびＧＯＩは、お互いに異種であり、そのような組み合わせは本質的に天然には生じず、例えば、その場合、プロモーターおよびＧＯＩの一方（または一方のみ）は、人工であるか、または互いに対しておよび／もしくは本明細書において説明される宿主細胞に対して異種であるか；または、プロモーターは、内因性プロモーターであり、ＧＯＩは、異種ＧＯＩであるか；または、プロモーターは、人工であるかまたは異種プロモーターであり、ＧＯＩは異種ＧＯＩであるか、のいずれかであり；その場合、プロモーターおよびＧＯＩの両方は、人工であるか、異種であるか、または異なる起源、例えば、本明細書において説明される宿主細胞と比較して異なる種またはタイプ（株）の細胞に由来する。詳細には、ＥＣＰは、本明細書において説明される宿主細胞として使用される細胞のＧＯＩに天然には付随せず、および／またはＧＯＩに作動可能に連結されない。
詳細には、ＧＯＩＥＣは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または抑制性プロモーターを含む。
構成的プロモーターの具体例としては、例えば、ｐＧＡＰおよびその機能的バリアント、国際公開第２０１４１３９６０８号において公開される、ｐＣＳ１などの構成的プロモーターのいずれかが挙げられる。
誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターの具体例としては、例えば、天然のｐＡＯＸ１またはｐＡＯＸ２およびその機能的バリアント、国際公開第２０１３０５０５５１号において公開される、ｐＧ１－ｐＧ８などの調節プロモーターおよびその断片のいずれか；国際公開第２０１７０２１５４１（Ａ１）号において公開される、ｐＧ１およびｐＧ１－ｘなどの調節プロモーターのいずれかが挙げられる。
酵母宿主細胞による使用にとって好適なプロモーター配列は、Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈら（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （２０１２） ８２４：３２９～５８）によって説明されており、その例としては、解糖酵素、例えば、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨまたはＧＡＰ）およびそのバリアント、ラクターゼ（ＬＡＣ）およびガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、Ｐ．パストリスグルコース－６－ホスフェートイソメラーゼプロモーター（ＰＰＧＩ）、３－ホスホグリセレートキナーゼプロモーター（ＰＰＧＫ）、グリセロールアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ｐＧＡＰ）、翻訳伸長因子プロモーター（ＰＴＥＦ）、およびＰ．パストリスエノラーゼ１（ＰＥＮ０１）のプロモーター、トリオースホスフェートイソメラーゼ（ＰＴＰＩ）、リボソーマルサブユニットタンパク質（ＰＲＰＳ２、ＰＲＰＳ７、ＰＲＰＳ３１、ＰＲＰＬ１）、アルコールオキシダーゼプロモーター（ＰＡＯＸ１、ＰＡＯＸ２）または変更された特性を有するそのバリアント、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼプロモーター（ＰＦＬＤ）、イソシトレートリアーゼプロモーター（ＰＩＣＬ）、α－ケトイソカプロエートデカルボキシラーゼプロモーター（ＰＴＨＩ）、ヒートショックタンパク質のファミリーメンバーのプロモーター（ＰＳＳＡ１、ＰＨＳＰ９０、ＰＫＡＲ２）、６－ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ（ＰＧＮＤ１）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＰＭ１）、トランスケトラーゼ（ＰＴＫＬ１）、ホスファチジルイノシトールシンターゼ（ＰＰＩＳ１）、フェロ－０２－オキシドレダクターゼ（ＰＦＥＴ３）、高親和性鉄透過酵素（ＰＦＴＲ１）、抑制性アルカリホスファターゼ（ＰＰＨ０８）、Ｎ－ミリストイルトランスフェラーゼ（ＰＮＭＴ１）、フェロモン反応転写因子（ＰＭＣＭ１）、ユビキチン（ＰＵＢＩ４）、一本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ＰＲＡＤ２）、ミトコンドリア内膜の主要ＡＤＰ／ＡＴＰキャリアのプロモーター（ＰＰＥＴ９）（国際公開第２００８／１２８７０１号）、ならびにギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）プロモーターが挙げられる。
好適なプロモーターのさらなる例としては、サッカロミセス・セレビシエエノラーゼ（ＥＮＯ１）、サッカロミセス・セレビシエガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセス・セレビシエトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビシエメタロチオネイン（ＣＵＰ１）、およびサッカロマイセス・セレビシエ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ならびにマルターゼ遺伝子プロモーター（ＭＡＬ）が挙げられる。
ＧＡＰプロモーター（ｐＧＡＰ）、ＡＯＸ１（ｐＡＯＸ１）、もしくはＡＯＸ２（ｐＡＯＸ２）プロモーター、またはそれらの機能的バリアントでありかつｐＧＡＰもしくはｐＡＯＸ１もしくはｐＡＯＸ２のいずれかに由来するプロモーターは、特に好ましい。ｐＡＯＸプロモーターは、メタノールによって誘導することができ、グルコースによって抑制される。詳細には、機能的バリアントは、それらが由来するプロモーターに対して８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％配列同一性の少なくともいずれかを有し、それらが由来するプロモーターと比較して、およそ同じプロモーター活性（例えば、±５０％、±４０％、±３０％、±２０％、または±１０％のいずれか；しかし、プロモーター活性は向上され得る）を有する。
特定の実施形態により、ＥＣＰは、メタノール誘導性である。特に、ＥＣＰは、メタノール制御される。詳細には、ＥＣＰは、メタノール含有細胞培養物において完全に誘導することができる。そのような場合、メタノールは、細胞培養物に供給されるエネルギー源としてだけではなく、ＥＣＰを誘導する際にＰＯＩ発現を誘導するためにも使用され得る。
特定の態様により、ＥＣＰは、ＰＯＩを産生するために炭素源として使用される、細胞培養物中に存在するメタノールの量によってメタノール誘導可能である。詳細には、異種発現カセットによるＧＯＩ発現は、メタノール誘導性ＥＣＰによって誘導可能である。
詳細には、ＥＣＰは、メタノール誘導性であり、例えば、細胞培養培地または細胞培養上清中における０．１（ｖ／ｖ）％、０．０５（ｖ／ｖ）％、または０．０１（ｖ／ｖ）％のいずれか未満である量のメタノールの不在下において抑制される（本明細書において、プロモーター抑制量（ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ）と呼ばれる）。
詳細には、ＥＣＰは、メタノール誘導性であり、例えば、プロモーター抑制量を、例えば、細胞培養培地または細胞培養上清中における０．１（ｖ／ｖ）％、０．５（ｖ／ｖ）％、１（ｖ／ｖ）％、１．５（ｖ／ｖ）％、２．０（ｖ／ｖ）％、２．５（ｖ／ｖ）％、または３（ｖ／ｖ）％のうちの少なくともいずれかにおいて超える量のメタノールの存在下において誘導される（本明細書において、プロモーター誘導量（ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ）と呼ばれる）。
詳細には、ＥＣＰは、本明細書において説明される細胞培養方法において使用されるようなメタノール量によって完全に誘導される。ＥＣＰプロモーターは、培養条件がほぼ最大の誘導を提供する場合、完全に誘導されると見なされる。
細胞培養培地または細胞培養上清中におけるそのような量は、特に、宿主細胞の供給および宿主細胞による消費の際に検出可能であり得る量として、理解される。典型的には、細胞培養物の産生段階にＰＯＩを産生する場合、細胞培養物は、ＰＯＩ産生の間に細胞によって即座に消費される量において補助炭素源を加えることによって供給を受け、その結果、細胞培養培地または細胞培養上清中に全く残留しないかまたは少ない残量のみ、例えば、最大でも１．０ｇ／Ｌまでの量しか残らない。
詳細には、ＥＣＰは、宿主細胞に対して内因性であるかまたは異種である。
詳細には、ＥＣＰは、以下：
ａ）配列番号５に対して６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性のうちの少なくともいずれかを含むかまたはそれからなるｐＡＯＸ１プロモーター；または
ｂ）配列番号６に対して６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性のうちの少なくともいずれかを含むかまたはそれからなるｐＡＯＸ２プロモーター；または
ｃ）配列番号３６～４９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるプロモーター、
のうちのいずれかである。
詳細には、表３８に一覧される任意のメタノール誘導性プロモーター、特に、配列番号３６～４９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるものが、使用され得る。
少なくとも６０％の配列同一性によって特徴付けられる機能的ｐＡＯＸ１およびｐＡＯＸ２プロモーターバリアントが、本明細書において詳細に説明される例示的メタノール誘導性プロモーターによって例示される。例えば、配列番号１７（オガタエア・メタノリカＪＣＭ １０２４０のｐＭＯＤ１プロモーター配列）は、配列番号１５と比較して５４．０％の配列同一性を有し；配列番号１８（オガタエア・メタノリカＪＣＭ １０２４０のｐＭＯＤ２プロモーター配列）は、配列番号６と比較して５３．７％の配列同一性を有する。それぞれｐＡＯＸ１およびｐＡＯＸ２プロモーターと比較したｐＭＯＤ１およびｐＭＯＤ２プロモーターの配列同一性は、ＬＡＬＩＧＮバージョン３６．３．８ｇ ２０１７年１２月を使用したアラインメントによって特定されており；結果は、同じ配列方向および最も高い重なりにおいて整列された配列を意味している（パラメータ：Ｍａｔｒｉｘ：＋５／－４；ＧＡＰ ＯＰＥＮ：－５；Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ：－４；Ｅ（）Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ １０．０；Ｏｕｔｐｕｔ ｆｏｒｍａｔ：ＭＡＲＫＸ ０；Ｇｒａｐｈｉｃｓ：Ｙｅｓ）。
さらなる例示的メタノール誘導性プロモーターは、表３８に一覧されるか、またはＧａｓｓｅｒら（Ｇａｓｓｅｒ， Ｓｔｅｉｇｅｒ， ＆ Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ， ２０１５， Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ． １４： １９６）によって説明されるような、ｐＳＨＢ１７、ｐＡＬＤ４、ｐＦＤＨ１、ｐＤＡＳ１、ｐＤＡＳ２、ｐＰＭＰ２０、ｐＦＢＡ１－２ｐＰＭＰ４７、ｐＦＬＤ、ｐＦＧＨ１、ｐＴＡＬ１－２、ｐＤＡＳ２、ｐＣＡＭ１、ｐＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ１－０３３６である。
本明細書において説明されるように、用語「ｐＡＯＸ１」は、配列番号５として特定される配列を含むプロモーター、または配列番号５に対してある特定の相同性（または配列同一性）を有する配列の両方を意味するものである。相同配列は、ｐＡＯＸ１ホモログとも呼ばれる。ｐＡＯＸ１ホモログは、天然の自然に発生する配列であり得るか、または、例えば、変異誘発の任意の好適な方法によって作製された、その変異体であり得る。
本明細書において説明されるように、用語「ｐＡＯＸ２」は、配列番号６として特定される配列を含むプロモーター、または配列番号６に対してある特定の相同性（または配列同一性）を有する配列の両方を意味するものである。相同配列は、ｐＡＯＸ２ホモログとも呼ばれる。ｐＡＯＸ２ホモログは、天然の自然に発生する配列であり得るか、または、例えば、変異誘発の任意の好適な方法によって作製された、その変異体であり得る。
本明細書において説明されるｐＡＯＸ１またはｐＡＯＸ２変異体は、詳細には、匹敵する発現系または産生宿主系において特定されるように、誘導された状態のときのそれぞれ天然のｐＡＯＸ１またはｐＡＯＸ２プロモーターと比較して、約０．５倍から、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．３倍、３．５倍、３．８倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、または少なくとも６倍のうちの少なくともいずれかまで増加されるプロモーター強度によって特徴付けられる。
詳細には、プロモーター強度は、基準プロモーターと比較した場合の、モデルタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ、例えば、強化されたＧＦＰ、すなわちｅＧＦＰなど、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ アクセッション番号Ｕ５７６０７）などのＰＯＩの発現レベル、および／または転写強度によって特定される。好ましくは、転写解析は、定量的または準定量的であり、好ましくは、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮＡ配列決定、およびトランスクリプトーム分析を用いる。
詳細には、本明細書において説明される組換え宿主細胞は、１つのみまたは複数の異種ＧＯＩＥＣ、例えば、発現カセットの複数のコピー、例えば、少なくとも２、３、４、または５コピー（遺伝子コピー数、ＧＣＮ）を含む。例えば、組換え宿主細胞は、最大で２、３、４、または５までのコピーを含む。各コピーは、同じまたは異なる配列を含み得るかまたはそれらからなり得、ただし、ＧＯＩに作動可能に連結されたＥＣＰを含む。
特定の態様により、異種発現カセットは、自己複製ベクターまたはプラスミドに含まれるか、または宿主細胞の染色体内に統合される。
発現カセットは、宿主細胞内に導入され得、例えば、統合の特異的な部位において、染色体内要素として宿主細胞ゲノム（またはその染色体のいずれか）に統合され得るか、またはランダムに統合され得、その場合、高産生宿主細胞系が選択される。あるいは、当該発現カセットは、染色体外遺伝子要素、例えば、プラスミドまたは人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）など、の内に統合され得る。特定の実施例により、当該発現カセットは、ベクター、特に発現ベクター、によって、宿主細胞に導入され、その場合、それらは、好適な形質転換技術によって宿主細胞に導入される。この目的のため、ＧＯＩは、発現ベクターにリゲートされ得る。
好ましい酵母発現ベクター（好ましくは、酵母での発現のために使用される）は、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣＺａｌｆａ、ｐＧＡＰＺａｌｆａ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＧＡＰＨｉｓ、ｐＰＵＺＺＬＥ、またはＧｏｌｄｅｎＰｉＣＳに由来するプラスミドからなる群から選択される。
ベクターまたはプラスミドを導入するために宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換する技術は、当分野において周知である。そのような技術は、電気穿孔法、スフェロプラスト、脂質小胞媒介取り込み、ヒートショック媒介取り込み、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈）、ウイルス感染、特に、改変されたウイルス、例えば、改変されたアデノウイルスを使用するウイルス感染、マイクロインジェクション、および電気穿孔法を含み得る。
本明細書において説明される形質転換体は、発現カセット、ベクター、またはプラスミドＤＮＡを宿主に導入すること、および関連タンパク質または選択マーカーを発現する形質転換体を選択することによって得ることができる。宿主細胞は、宿主細胞の形質転換のために慣習的に使用される方法、例えば、電気パルス法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、およびそれらの修正された方法などによって、異種ＤＮＡまたは外来ＤＮＡを導入するために、処理することができる。Ｐ．パストリスは、好ましくは、電気穿孔法によって形質転換される。微生物による組換えＤＮＡ断片の取り込みのための形質転換の好ましい方法は、化学形質転換、電気穿孔法、またはプロトプラステーション（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔａｔｉｏｎ）による形質転換が挙げられる。
特定の態様により、本明細書において説明される異種ＧＯＩＥＣは、ポリヌクレオチドの人工融合物、例えば、ＧＯＩに作動可能に連結されたＥＣＰ、および場合により、さらなる配列、例えば、シグナル配列、リーダー配列、またはターミネーター配列など、を含むかまたはそれからなる。
詳細には、発現カセットは、ＧＯＩに作動可能に連結されたＥＣＰを含み、場合によりさらに、分泌されたタンパク質としてＰＯＩを発現し産生するために必要な場合には、シグナル配列およびリーダー配列を含む。
特定の態様により、ＧＯＩＥＣは、ＰＯＩの分泌を可能にするシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
詳細には、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＧＯＩの５’末端に隣接して融合される。
詳細には、シグナルペプチドは、Ｓ．セレビシエα接合因子プレプロペプチド由来のシグナル配列、Ｐ．パストリス酸性ホスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ１）由来のシグナルペプチド、および細胞外タンパク質Ｘ（ＥＰＸ１）からなる群から選択される（Ｈｅｉｓｓ， Ｓ．， Ｖ． Ｐｕｘｂａｕｍ， Ｃ． Ｇｒｕｂｅｒ， Ｆ． Ａｌｔｍａｎｎ， Ｄ． Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ ＆ Ｂ． Ｇａｓｓｅｒ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５；１６１（７）：１３５６～６８）。
詳細には、国際公開第２０１４０６７９２６（Ａ１）号に記載される任意のシグナル配列および／またはリーダー配列、特に配列番号２２または配列番号２３、
を使用することができる。
詳細には、国際公開第２０１２１５２８２３（Ａ１）号に記載されるようなシグナル配列、特に、配列番号２４として特定されるＳ．セレビシエの天然α接合因子のシグナル配列またはその変異体、を使用することができる。
特定の態様により、本明細書において説明される宿主細胞は、例えば、タンパク質産生を向上させるために、１つまたは複数のさらなる遺伝子修飾を受け得る。
詳細には、宿主細胞はさらに、プロテアーゼ欠損株、特に、カルボキシペプチダーゼＹ活性の欠損した株、を生成するために使用されるタンパク質分解活性に影響を及ぼす１つまたは複数の遺伝子を修飾するために操作される。具体例は、国際公開第１９９２０１７５９５（Ａ１）号に記載される。液胞プロテアーゼ、例えば、プロティナーゼＡまたはプロティナーゼＢなど、における機能が欠損したプロテアーゼ欠損ピキア株のさらなる例が、米国特許第６１５３４２４（Ａ）号に記載される。さらなる例は、ａｄｅ２欠失、および／またはプロテアーゼ遺伝子ＰＥＰ４およびＰＲＢ１の一方または両方の欠失を有するピキア株であり、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって提供される。
詳細には、宿主細胞は、国際公開第２０１００９９１９５（Ａ１）号において開示されるように、ＰＥＰ４、ＰＲＢ１、ＹＰＳ１、ＹＰＳ２、ＹＭＰ１、ＹＭＰ２、ＹＭＰ１、ＤＡＰ２、ＧＲＨｌ、ＰＲＤ１、ＹＳＰ３、およびＰＲＢ３からなる群より選択される機能遺伝子産物、特にプロテアーゼ、をコードする少なくとも１つの核酸配列を改変するように操作される。
ヘルパー因子をコードする遺伝子の過剰発現または過小発現は、詳細には、例えば、国際公開第２０１５１５８８００（Ａ１）号に記載されるように、ＧＯＩの発現を増強するために適用される。
ＰＯＩは、真核生物の、原核生物の、または合成の、ぺプチド、ポリペプチド、タンパク質、または宿主細胞の代謝物質のうちのいずれかであり得る。
特定の態様により、ＰＯＩは、Ｍｕｔ－宿主細胞またはＥＣＰに対して異種である。
詳細には、ＰＯＩは、宿主細胞種に対して異種である。
詳細には、ＰＯＩは、分泌されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質であり、すなわち、宿主細胞から細胞培養上清中へ分泌される。
詳細には、ＰＯＩは、真核生物タンパク質であり、好ましくは、哺乳動物由来タンパク質または哺乳動物関連タンパク質、例えば、ヒトタンパク質またはヒトタンパク質配列を含むタンパク質、または細菌性タンパク質または細菌由来タンパク質など、である。
好ましくは、ＰＯＩは、哺乳動物において機能する治療用タンパク質である。
特定の場合において、ＰＯＩは、多量体タンパク質であり、詳細には、二量体または四量体である。
詳細には、ＰＯＩは、抗原結合性タンパク質、治療用タンパク質、酵素、ペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物－タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン抗原、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、プロセシング酵素からなる群から選択されるペプチドまたはタンパク質である。
詳細には、抗原結合性タンパク質は、以下： ａ）抗体または抗体断片、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、Ｆｖ四量体、ミニボディ、またはＶＨ、ＶＨＨ、ＩｇＮＡＲｓ、もしくはＶ－ＮＡＲのような単一ドメイン抗体など；
ｂ）抗体模倣物、例えば、アドネクチン、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎｓ、フィノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、またはＮａｎｏＣＬＡＭＰＳなど；または
ｃ）１つまたは複数の免疫グロブリンフォールドドメイン、抗体ドメイン、または抗体模倣物を含む融合タンパク質
からなる群より選択される。
特定のＰＯＩは、抗原結合性分子、例えば、抗体、またはその断片、特に、抗原結合性ドメインを含む抗体断片など、である。中でも特に、特定のＰＯＩは、抗体、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）または免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）、重鎖抗体（ＨｃＡｂ’ｓ）、またはその断片、例えば、抗原結合性断片（Ｆａｂ）、Ｆｄ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または操作されたそのバリアント、例えば、Ｆｖ二量体（ダイアボディ）、Ｆｖ三量体（トリアボディ）、Ｆｖ四量体、またはミニボディ、ならびにＶＨ、ＶＨＨ、ＩｇＮＡＲｓ、またはＶ－ＮＡＲのような単一ドメイン抗体、または免疫グロブリンフォールドドメインを含む任意のタンパク質である。さらなる抗原結合性分子は、抗体模倣物、または（代替）足場タンパク質、例えば、操作されたクニッツドメイン、アドネクチン、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、またはＤＡＲＰｉｎｓから選択され得る。
特定の態様により、ＰＯＩは、例えば、ＢＯＴＯＸ、マイオブロック（Ｍｙｏｂｌｏｃ）、ナーブロック（ＮｅｕｒｏＢｌｏｃ）、ディスポート（Ｄｙｓｐｏｒｔ）（または、ボツリヌス神経毒素の他のセロタイプ）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、ＹＨ－１６、コリオゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン－２、アルデスロイキン、テセロイキン（ｔｅｃｅｌｅｕｌｉｎ）、デニロイキンジフチトクス、インターフェロンアルファ－ｎ３（注射剤）、インターフェロンアルファ－ｎｌ、ＤＬ－８２３４、インターフェロン、サントリー（ガンマ－１ａ）、インターフェロンガンマ、チモシンアルファ１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ＶｉｐｅｒａＴＡｂ、ＥｃｈｉＴＡｂ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、レビフ、エプトテルミンアルファ、テリパラチド（骨粗鬆症）、カルシトニン注射剤（骨疾患）、カルシトニン（経鼻、骨粗鬆症）、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー２５０（ウシ）、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト上皮成長因子（局所ゲル、創傷の治癒）、ＤＷＰ４０１、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグアルファ、モノニン、エプタコグアルファ（活性型）、組換え第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、リコンビナート（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ）、組換え第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（リコンビナート）、アルフマート（Ａｌｐｈｎｍａｔｅ）、オクトコグアルファ、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、インジキナーゼ、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エキセナチド、プラムリンチド、イミグルセラーゼ（ｉｎｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、ガルスルファーゼ、ロイコトロピン、モルグラモスチム（ｍｏｌｇｒａｍｏｓｔｉｒｎ）、トリプトレリン酢酸塩、ヒストレリン（皮下インプラント、ヒドロン）、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ロイプロリド徐放性デポー剤（ＡＴＲＩＧＥＬ）、ロイプロリドインプラント（ＤＵＲＯＳ）、ゴセレリン、ユートロピン、ＫＰ－１０２プログラム、成長ホルモン、メカセルミン（成長不全）、エンフビルチド（ｅｎｌｆａｖｉｒｔｉｄｅ）、Ｏｒｇ－３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリン（吸入）、インスリンリスプロ、インスリンデテミル（ｉｎｓｕｌｉｎ ｄｅｔｅｒｎｉｒ）、インスリン（頬、ラピッドミスト）、メカセルミンリンファバート、アナキンラ、セルモロイキン、９９ ｍＴｃ－アプシタイド注射、ミエロピド、ベタセロン、グラチラマー酢酸塩、ゲポン、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロン、ビリブ、インスリン（組換え体）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセルミン（ｍｅｃａｓｅｎｉｎ）、ロフェロン－Ａ、インターフェロン－アルファ２、アルファフェロン、インターフェロンアルファコン－１、インターフェロンアルファ、「アボネックス」組換えヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、ゼマイラ、ＣＴＣ－１１１、シャンバック－Ｂ、ＨＰＶワクチン（四価）、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム（ａｎｃｅｓｔｉｒｎ）、アガルシダーゼ ベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅（局所ゲル）、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、アクティミューン、ＰＥＧ－イントロン、トリコミン、組換え家塵ダニアレルギー減感作注射、組換えヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１－８４（皮下、骨粗鬆症）、エポエチンデルタ、トランスジェニックアンチトロンビンＩＩＩ、グランジトロピン、ビトラーゼ、組換えインスリン、インターフェロン－アルファ（経口トローチ）、ＧＥＭ－２１Ｓ、バプレオチド、イデュルスルファーゼ、オマパトリラト（ｏｍｎａｐａｔｒｉｌａｔ）、組換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴル、グルカルピダーゼ、ヒト組換えＣ１エステラーゼ阻害剤（血管性水腫）、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド（無針注射Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ２０００）、ＶＧＶ－１、インターフェロン（アルファ）、ルシナクタント、アビプタジル（吸入、肺疾患）、イカチバント、エカランチド、オミガナン、オーログラブ、ペキシガナン酢酸塩、アディＰＥＧ２０、ＬＤＩ－２００、デガレリクス、シントレデキンベスドトクス（ｃｉｎｔｒｅｄｅｌｉｎｂｅｓｕｄｏｔｏｘ）、Ｆａｖｌｄ、ＭＤＸ－１３７９、ＩＳＡｔｘ－２４７、リラグルチド、テリパラチド（骨粗鬆症）、チファコギン、ＡＡ４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマキソマブ、ＤＷＰ４１３、ＡＲＴ－１２３、クリサリン、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンアルファ、Ｔｈ－９５０７、テデュグルチド、ダイアミド、ＤＷＰ－４１２、成長ホルモン（徐放性注射）、組換えＧ－ＣＳＦ、インスリン（吸入、ＡＩＲ）、インスリン（吸入、テクノスフィア）、インスリン（吸入、ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ－３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンベータ（Ｃ型肝炎ウイルス感染症（ＨＣＶ））、インターフェロンアルファ－ｎ３（経口）、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、ＡＭＧ－５３１、ＭＢＰ－８２９８、キセレセプト、オペバカン、ＡＩＤＳＶＡＸ、ＧＶ－１００１、リンホスキャン、ランピルナーゼ、リポキシサン、ルスプルチド、ＭＰ５２（ベータ－リン酸三カルシウムキャリア、骨再生）、黒色腫ワクチン、シプロイセル－Ｔ、ＣＴＰ－３７、インセジア、ビテスペン、ヒトトロンビン（凍結、外科出血）、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ、プリカーゼ、テルリプレシン（静脈内、肝腎症候群）、ＥＵＲ－１００８Ｍ、組換えＦＧＦ－Ｉ（注射剤、血管性疾患）、ＢＤＭ－Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ－２１６、Ｐ－１１３、ＭＢＩ－５９４ＡＮ、ズラマイシン（吸入、嚢胞性繊維症）、ＳＣＶ－０７、ＯＰＩ－４５、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＡＢＴ－５１０、ボウマンバーク阻害剤濃縮物、ＸＭＰ－６２９、９９ ｍＴｃ－Ｈｙｎｉｃ－アネキシンＶ、カハラリドＦ、ＣＴＣＥ－９９０８、テベレリクス（徐放性）、オザレリクス、ロミデプシン（ｒｏｒｎｉｄｅｐｓｉｎ）、ＢＡＹ－５０４７９８、インターロイキン４、ＰＲＸ－３２１、ペップスキャン、イボクタデキン、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ－０１５、ＩＬ－２１、ＡＴＮ－１６１、シレンギチド、アルブフェロン、ビファシクス、ＩＲＸ－２、オメガインターフェロン、ＰＣＫ－３１４５、ＣＡＰ－２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１－ＤＭＩ、卵巣癌免疫治療ワクチン、ＳＢ－２４９５５３、オンコバックス－ＣＬ、オンコバックス－Ｐ、ＢＬＰ－２５、セルバックス－１６、マルチエピトープペプチド黒色腫ワクチン（ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、チロシナーゼ）、ネミフィチド、ｒＡＡＴ（吸入）、ｒＡＡＴは（皮膚科学用）、ＣＧＲＰ（吸入、喘息）、ペグスネルセプト、サイモシンベータ４、プリチデプシン、ＧＴＰ－２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ－１、ＡＣ－１００、サケカルシトニン（経口、エリゲン）、カルシトニン（経口、骨粗鬆症）、エキサモレリン、カプロモレリン、カルデバ、ベラフェルミン、１３１Ｉ－ＴＭ－６０１、ＫＫ－２２０、Ｔ－１０、ウラリチド、デペレスタット、ヘマタイド、クリサリン（局所）、ｒＮＡＰｃ２、組換え第ＶＩＩＩ因子（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組換えスタフィロキナーゼバリアント、Ｖ－１０１５３、ソノリシスプロリーゼ、ニューロバックス、ＣＺＥＮ－００２、膵島細胞ネオゲネシス療法、ｒＧＬＰ－１、ＢＩＭ－５１０７７、ＬＹ－５４８８０６、エキセナチド（徐放性、メディソルブ）、ＡＶＥ－００１０、ＧＡ－ＧＣＢ、アボレリン、ＡＣＭ－９６０４、リナクロチド酢酸塩（ｌｉｎａｃｌｏｔｉｄ ｅａｃｅｔａｔｅ）、ＣＥＴｉ－１、ヘモスパン、ＶＡＬ（注射剤）、速効性インスリン（注射剤、ヴィアデル）、鼻腔内インスリン、インスリン（吸入）、インスリン（経口、エリゲン）、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ（皮下注射、湿疹）、ピトラキンラ（吸入粉末剤、アストマ）、マルチカイン、ＲＧ－１０６８、ＭＭ－０９３、ＮＢＩ－６０２４、ＡＴ－００１、ＰＩ－０８２４、Ｏｒｇ－３９１４１、Ｃｐｎ１０（自己免疫疾患／炎症）、タラクトフェリン（局所）、ｒＥＶ－１３１（点眼剤）、ｒＥＶ－１３１（呼吸器疾患）、経口組換えヒトインスリン（糖尿病）、ＲＰＩ－７８Ｍ、オプレルベキン（経口）、ＣＹＴ－９９００７ ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＴＹ－００１、バラテグラスト、インターフェロンアルファ－ｎ３（局所）、ＩＲＸ－３、ＲＤＰ－５８、タウフェロン、胆汁酸塩刺激リパーゼ、メリスパーゼ、アラリン（ａｌａｌｉｎｅ）ホスファターゼ、ＥＰ－２１０４Ｒ、メラノタン－ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ－１０４、組換えヒトマイクロプラスミン、ＡＸ－２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ－１、Ｘｅｎ－２１７４、ＣＪＣ－１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ－６６０３、ＬＡＢ ＧＨＲＨ、ＡＥＲ－００２、ＢＧＣ－７２８、マラリアワクチン（ビロゾーム、ＰｅｖｉＰＲＯ）、ＡＬＴＵ－１３５、パルボウイルスＢ１９ワクチン、インフルエンザワクチン（組換えノイラミニダーゼ）、マラリア／ＨＢＶワクチン、脾脱疽ワクチン、Ｖａｃｃ－５ｑ、Ｖａｃｃ－４ｘ、ＨＩＶワクチン（経口）、ＨＰＶワクチン、Ｔａｔトキソイド（Ｔａｔ Ｔｏｘｏｉｄ）、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ－１３３４０、ＰＴＨ（１－３４）、リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、オスタボリン－Ｃ（Ｏｓｔａｂｏｌｉｎ－Ｃ）、ＰＴＨ類似体（局所、乾癬）、ＭＢＲＩ－９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆワクチン（結核）、ＭＶＡ－Ａｇ８５Ａワクチン（結核）、ＦＡＲＡ０４、ＢＡ－２１０、組換えペストＦＩＶワクチン、ＡＧ－７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ－ｐ１／Ｄｅｒ－ｐ２／Ｄｅｒ－ｐ７アレルゲン標的ワクチン（塵性ダニアレルギー）、ＰＲ１ペプチド抗原（白血病）、変異体ｒａｓワクチン、ＨＰＶ－１６Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンチンワクチン（腺癌）、ＣＭＬワクチン、ＷＴ１－ペプチドワクチン（癌）、ＩＤＤ－５、ＣＤＸ－１１０、ペントリス（Ｐｅｎｔｒｙｓ）、ノレリン（Ｎｏｒｅｌｉｎ）、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ－９８０８、ＶＴ－１１１、イクロカプチド、テルベルミン（皮膚科学用、糖尿病の足部潰瘍）、ルピントリビル、レティキュロース、ｒＧＲＦ、ＨＡ、αガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ－０１１、ＡＬＴＵ－１４０、ＣＧＸ－１１６０、アンジオテンシン治療ワクチン、Ｄ－４Ｆ、ＥＴＣ－６４２、ＡＰＰ－０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ－０７（経口、結核）、ＤＲＦ－７２９５、ＡＢＴ－８２８、ＥｒｂＢ２特異的免疫毒素複合体（抗癌）、ＤＴ３ＳＳＩＬ－３、ＴＳＴ－１００８８、ＰＲＯ－１７６２、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）、コレシストキニン－Ｂ／ガストリン受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ－ｈＥＧＦ、ＡＥ－３７、トラスツズマブ（ｔｒａｓｎｉｚｕｍａｂ）－ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ－１２（組換え体）、ＰＭ－０２７３４、ＩＭＰ－３２１、ｒｈＩＧＦ－ＢＰ３、ＢＬＸ－８８３、ＣＵＶ－１６４７（局所）、Ｌ－１９に基づく放射免疫療法（癌）、Ｒｅ－１８８－Ｐ－２０４５、ＡＭＧ－３８６、ＤＣ／１５４０／ＫＬＨワクチン（癌）、ＶＸ－００１、ＡＶＥ－９６３３、ＡＣ－９３０１、ＮＹ－ＥＳＯ－１ワクチン（ぺプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、黒色腫ワクチン（パルス式抗原治療）、前立腺癌ワクチン、ＣＢＰ－５０１、組換えヒトラクトフェリン（ドライアイ）、ＦＸ－０６、ＡＰ－２１４、ＷＡＰ－８２９４Ａ（注射剤）、ＡＣＰ－ＨＩＰ、ＳＵＮ－１１０３１、ペプチドＹＹ［３－

３６］（肥満、経鼻）、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３－Ｆｃ、ＢＮ－００３、ＢＡ－０５８、ヒト上皮小体ホルモン１－３４（鼻腔、骨粗鬆症）、Ｆ－１８－ＣＣＲ１、ＡＴ－１１００（小児脂肪便症／糖尿病）、ＪＰＤ－００３、ＰＴＨ（７－３４）、リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、ズラマイシン（眼科、ドライアイ）、ＣＡＢ－２、ＣＴＣＥ－０２１４、グリコＰＥＧ化エリスロポエチン、ＥＰＯ－Ｆｃ、ＣＮＴＯ－５２８、ＡＭＧ－１１４、ＪＲ－０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノカンジン、ＰＮ－９５１、７１６１５５、ＳＵＮ－Ｅ７００１、ＴＨ－０３１８、ＢＡＹ－７３－７９７７、テベレリクス（即時放出）、ＥＰ－５１２１６、ｈＧＨ（制御放出、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ）、ＯＧＰ－Ｉ、シフビルチド、ＴＶ４７１０、ＡＬＧ－８８９、Ｏｒｇ－４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ－９９１、チモペンチン（肺疾患）、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝臓選択性インスリン、スバリン、Ｌ１９－ＩＬ－２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ－１５０、ＡＬＴＵ－１３９、ＥＮ－１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポイエチン受容体アゴニスト（血小板減少性疾患）、ＡＬ－１０８、ＡＬ－２０８、神経成長因子アンタゴニスト（疼痛）、ＳＬＶ－３１７、ＣＧＸ－１００７、ＩＮＮＯ－１０５、経口テリパラチド（エリゲン）、ＧＥＭ－ＯＳ１、ＡＣ－１６２３５２、ＰＲＸ－３０２、ＬＦｎ－ｐ２４融合ワクチン（Ｔｈｅｒａｐｏｒｅ）、ＥＰ－１０４３、Ｓ肺炎小児用ワクチン、マラリアワクチン、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｂ群ワクチン、新生児用Ｂ群連鎖球菌ワクチン、脾脱疽ワクチン、ＨＣＶワクチン（ｇｐＥ１＋ｇｐＥ２＋ＭＦ－５９）、中耳炎療法、ＨＣＶワクチン（コア抗原＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ｈＰＴＨ（１－３４）（経皮、ＶｉａＤｅｒｍ）、７６８９７４、ＳＹＮ－１０１、ＰＧＮ－００５２、アビスクムミン、ＢＩＭ－２３１９０、結核ワクチン、マルチエピトープ・チロシナーゼペプチド、癌ワクチン、エンカスチム、ＡＰＣ－８０２４、ＧＩ－５００５、ＡＣＣ－００１、ＴＴＳ－ＣＤ３、血管標的ＴＮＦ（固形腫瘍）、デスモプレシン（バッカル制御放出）、オネルセプト、またはＴＰ－９２０１、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）／ＭＡＢ ＴＨＥＲＡ（商標））、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））、ペグフィルグラスチム（ｐｅｇｒｉｌｇｒａｓｔｉｍ）（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標））、または後発生物製剤およびバイオベターを含む任意の他の好適なポリペプチドである。
特定の態様により、発酵産物が、細胞培養物から単離され、この場合、発酵産物は、Ｍｕｔ－宿主細胞から得られたＰＯＩまたは宿主細胞代謝物質を含む。
特定の態様により、Ｍｕｔ－宿主細胞は、ピキア属、コマガタエラ属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、またはカンジダ属の酵母細胞である。
詳細には、Ｍｕｔ－宿主細胞は、ピキア属種、例えば、ピキア・パストリスピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ，）、およびピキア・アンガスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）など；コマガタエラ属種、例えば、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス、またはコマガタエラ・ファフィなど、ハンゼヌラ属種、例えば、ハンゼヌラ・ポリモアファなど、オガタエア属種、例えば、オガタエア・ポリモルファまたはオガタエア・パラポリモルファなど、ならびにカンジダ属種、例えば、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｃａｏｉ）、およびカンジダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）など、からなる群から選択される酵母の菌株に由来する。
好ましいのは、ピキア・パストリス種である。詳細には、宿主細胞は、ＣＢＳ７０４、ＣＢＳ２６１２、ＣＢＳ７４３５、ＣＢＳ９１７３－９１８９、ＤＳＭＺ７０８７７、Ｘ－３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１ＨおよびＳＭＤ１１６８からなる群から選択されるピキア・パストリス株である。
供給源：ＣＢＳ７０４（＝ＮＲＲＬ Ｙ－１６０３＝ＤＳＭＺ ７０３８２）、ＣＢＳ２６１２（＝ＮＲＲＬ Ｙ－７５５６）、ＣＢＳ７４３５（＝ＮＲＲＬ Ｙ－１１４３０）、ＣＢＳ ９１７３－９１８９（ＣＢＳ株：ＣＢＳ－ＫＮＡＷ菌類生物多様性センター、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｎ、ユトレヒト、オランダ）、およびＤＳＭＺ ７０８７７（ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ））；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの菌株、例えば、Ｘ－３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１ＨおよびＳＭＤ１１６８など。
特定の態様により、本発明は、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法であって、ＰＯＩを産生するための炭素源としてメタノールを、特に、ＥＣＰのメタノール誘導のため（だけ）ではなくエネルギー源としての使用のためのそのようなメタノール量を、使用して、本明細書において説明されるＭｕｔ－宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。
特定の態様により、方法は、ＰＯＩを産生するための炭素源としてメタノールを使用してＭｕｔ－宿主細胞を培養するステップを含み、この場合、Ｍｕｔ－宿主細胞は、
目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）に作動可能に連結した発現カセットプロモーター（ＥＣＰ）を含む異種目的遺伝子発現カセット（ＧＯＩＥＣ）を含み、この場合、
Ｍｕｔ－宿主細胞は、１つまたは複数の遺伝子修飾の前の宿主細胞と比較して、第１および第２の内因性遺伝子の発現を減少させるために、１つまたは複数の遺伝子修飾によって操作され、その場合、
ａ）第１の内因性遺伝子は、配列番号１として特定されるアミノ酸配列を含むアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）またはそのホモログをコードし、ならびに
ｂ）第２の内因性遺伝子は、配列番号３として特定されるアミノ酸配列を含むアルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）またはそのホモログをコードする。
詳細には、Ｍｕｔ－宿主細胞は、単一の炭素源として、または他の炭素源（例えば、炭水化物）との組み合わせにおいて、特に、例えば、増殖および／またはＰＯＩ産生（合成）などのためのエネルギー源として、メタノールを使用して培養される。
詳細には、そのような他の炭素源（本明細書において「非メタノール炭素源」とも呼ばれる）は、炭水化物である。
詳細には、非メタノール炭素源は、糖、ポリオール、アルコール、または先述のうちの任意の１つまたは複数の混合物から選択される。
詳細には、糖は、単糖、例えば、ヘキソースなど、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、もしくはマンノース、または二糖、例えば、ショ糖など；またはアルコールもしくはポリオール、例えば、エタノール、もしくは任意のジオールもしくはトリオール、例えば、グリセロール、または先述のうちの任意のいずれかの混合物、のうちの任意の１つもしくは複数であり得る。本明細書において説明される炭素源として使用されるメタノール量に加えて、任意のそのような非メタノール炭素源を、追加的に、ＰＯＩを産生する量において細胞培養で使用してもよい。
特定の実施形態により、Ｍｕｔ－宿主細胞の細胞系が培養される。
詳細には、細胞系は、バッチ培養、流加バッチ培養、または連続培養条件下において培養される。培養は、マイクロタイタープレート、振盪フラスコ、またはバイオリアクターにおいて実施され得、場合により、第一ステップとしてバッチ段階（ｂａｔｃｈ ｐｈａｓｅ）によって開始され、その後に、第二ステップとして流加バッチ段階（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｐｈａｓｅ）または連続培養段階（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｈａｓｅ）が続く。
特定の態様により、本明細書において説明される方法は、増殖段階（ｇｒｏｗｉｎｇ ｐｈａｓｅ）および産生段階（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）を含む。
詳細には、方法は、以下のステップ：
ａ）増殖条件下において宿主細胞を培養するステップ（増殖段階または「成長段階（ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）」）；および、さらなるステップ
ｂ）ＰＯＩを産生するためにＧＯＩが発現される、炭素源としてのメタノールの存在下での増殖制限条件下において宿主細胞を培養するステップ（産生段階）
を含む。
詳細には、第二ステップｂ）は、第一ステップａ）の後に続く。
詳細には、
ａ）Ｍｕｔ－宿主細胞が、エネルギー源として基礎炭素源を使用して培養される、増殖段階；の後に、
ｂ）Ｍｕｔ－宿主細胞が、メタノール供給を使用して培養され、その結果、ＰＯＩを産生する、産生段階、
が続く。
詳細には、宿主細胞は、例えば、場合により炭素源の量が消費されるまでの、細胞培養における宿主細胞の増殖を可能にするのに十分な量において、第１の炭素源を含む細胞培養培地において、増殖条件下の第一ステップにおいて培養され、さらなる培養ステップは、増殖制限条件下であり得る。
詳細には、第２の炭素源は、メタノールおよび場合により１つまたは複数のさらなる炭素源（メタノール以外）であり、第二炭素源は、補助炭素源（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ）と呼ばれる。
詳細には、基礎炭素源および／または補助炭素源（メタノールに加えて）は、糖、ポリオール、アルコール、または先述のうちの任意の１つまたは複数の混合物から選択することができる。
特定の実施形態により、基礎炭素源は、補助炭素源とは異なっており、例えば、量的および／または質的に異なる。量的な違いは、典型的には、ＥＣＰプロモーター活性を抑制または誘導するための異なる条件を提供する。
さらなる特定の実施形態により、基礎炭素源および補助炭素源は、同じタイプの分子または炭水化物を、好ましくは異なる濃度において含む。さらなる特定の実施形態により、炭素源は、２つ以上の異なる炭素源の混合物である。
任意のタイプの有機炭素源、特に、宿主細胞培養、特に真核生物宿主細胞培養のために典型的に使用されるものが使用され得る。特定の実施形態により、炭素源は、ヘキソース、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、もしくはマンノースなど、二糖、例えば、ショ糖など、アルコール、例えば、グリセロールもしくはエタノールなど、またはそれらの混合物である。
特定の好ましい実施形態により、基礎炭素源は、グルコース、グリセロール、エタノール、またはそれらの混合物からなる群から選択される。好ましい実施形態により、基礎炭素源は、グリセロールである。
さらなる特定の実施形態により、補助炭素源は、（メタノールに加えて）、ヘキソース、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、およびマンノースなど、二糖、例えば、ショ糖など、アルコール、例えば、グリセロールもしくはエタノールなど、またはそれらの混合物を含む。好ましい実施形態により、補助炭素源は、メタノールに加えてグルコースを含む。
両方の培養ステップは、詳細には、炭素源の存在下において細胞系を培養するステップを含む。
詳細には、成長段階（ステップａ））の培養は、バッチ段階において実施され；ならびに産生段階（ステップｂ））の培養は、流加バッチ段階または連続培養段階において実施される。
詳細には、宿主細胞は、特に、産生段階において細胞培養を維持するときに完全に消費される量のみの炭素源を含む、規定された最小限の培地を供給することによって炭素源を制限しつつ、高い増殖速度の段階の間は、基礎炭素源を含む炭素源リッチな培地において増殖され（増殖条件下において）、ステップａ）（例えば、最大増殖速度の少なくとも５０％、または少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最高で最大増殖速度までにおいて）、ならびに低い増殖速度の段階の間、ＰＯＩを産生する（増殖抑制条件下）、ステップｂ）（例えば、最大増殖速度の９０％未満、好ましくは８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、または４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、または０．２％未満））。
詳細には、特に、産生段階の間、宿主細胞培養において、詳細には、細胞培養培地または細胞培養上清において、０．５（ｖ／ｖ）％、０．５５（ｖ／ｖ）％、０．６（ｖ／ｖ）％、０．６５（ｖ／ｖ）％、０．７（ｖ／ｖ）％、０．７５（ｖ／ｖ）％、０．８（ｖ／ｖ）％、０．８５（ｖ／ｖ）％、０．９（ｖ／ｖ）％、０．９５（ｖ／ｖ）％、または１．０（ｖ／ｖ）％のうちの少なくともいずれか、例えば、最高でも３（ｖ／ｖ）％、２．５（ｖ／ｖ）％、２（ｖ／ｖ）％、１．５（ｖ／ｖ）％、または１（ｖ／ｖ）％のいずれか、の平均メタノール濃度が使用される。
詳細には、平均メタノール濃度は、少なくとも２４時間にわたる産生段階の間、好ましくは、０．１（ｖ／ｖ）％、０．５（ｖ／ｖ）％、１（ｖ／ｖ）％、１．５（ｖ／ｖ）％、２（ｖ／ｖ）％、２．５（ｖ／ｖ）％、または３（ｖ／ｖ）％のうちの少なくといずれかに維持される。
特定の実施形態により、平均メタノール濃度は、少なくとも２４時間にわたる産生段階の間、０．５～２（ｖ／ｖ）％である。
平均量または平均濃度は、細胞培養物において、特に、細胞培養培地または細胞培養上清において、観察期間の少なくとも開始時および終了時、観察期間の間、例えば、少なくとも２４時間毎に、または連続測定毎に、測定したときのメタノール濃度の合計を測定回数で割ることによって、計算することができる。
細胞培養物中のメタノール濃度は、ＨＰＬＣのような好適な標準的アッセイを使用して測定することができ、例えば、細胞培養による消費における培養培地中の残留濃度として特定することができる。
詳細には、メタノール供給は、産生段階の間、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、または１５ｍｇメタノール／（ｇ乾燥バイオマス＊時）、またはそれ以上のうちの少なくともいずれか、例えば、２～２０または２～１５ｍｇメタノール／（ｇ乾燥バイオマス＊時）、の平均供給速度である。
メタノールは、１回でまたは複数回に分割して、例えば、１回または複数回の注射によって、細胞培養物に加えられ得るか、または、ＰＯＩを産生するある特定の期間に連続的に加えられ得る。平均量は、観察期間における全てのメタノール添加の合計を、平均総乾燥バイオマスおよび観察期間の所要時間で割ることによって、計算することができる。平均総乾燥バイオマスは、観察期間の少なくとも開始時および終了時、場合により観察期間の間に、乾燥バイオマス濃度を測定することによって計算される。次いで、乾燥バイオマス濃度は、観察期間の開始時と終了時との間において補間される。補間された乾燥バイオマス濃度は、各間隔において反応器の容積を掛けられ、全ての間隔に対する計算値が合計され、間隔の数で割られる。間隔の所要時間は、１時間以下である。
詳細には、平均供給速度は、少なくとも２４時間の産生段階の間、好ましくは、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、または１５ｍｇメタノール／（ｇ乾燥バイオマス＊時）、またはそれ以上のうちの少なくともいずれか、例えば、２～２０または２～１５ｍｇメタノール／（ｇ乾燥バイオマス＊時）、に維持される。
観察期間は、本明細書において、細胞培養がＰＯＩを産生しているある特定の期間として理解され、特に、産生段階、特に、流加バッチ法または連続細胞培養法の産生段階として理解される。実際のＰＯＩ産生プロセスまたは産生段階は、観察期間よりも長い場合があるが、平均量は、定義された観察期間の間において計算される。
詳細には、ＰＯＩ産生プロセスの所要時間は、１０時間から５００時間である。
詳細には、バッチ段階は、およそ１０時間から３６時間において実施される。
用語「およそ（ａｒｏｕｎｄ）」は、培養時間に関連する場合、＋／－５％または＋／－１０％を意味するものである。
例えば、およそ１０時間から３６時間の特定のバッチ実行時間は、１８時間から３９．６時間、詳細には、１９時間から３７．８時間であり得る。
特定の実施形態により、バッチ段階は、バッチ培地における基礎炭素源として１０ｇ／Ｌから５０ｇ／Ｌのグリセロール、詳細には、２０ｇ／Ｌから４０ｇ／Ｌグリセロールを使用して実施され、培養は、２５℃でおよそ２７時間から３０時間、もしくは３０℃でおよそ２３時間から３６時間、または２５℃から３０℃の間の任意の温度で２３時間から３６時間の培養時間において実施される。バッチ培地中のグリセロール濃度を下げると、バッチ段階の長さが減少し、バッチ培地中のグリセロールを増加させると、バッチ段階はさらに長引くであろう。グリセロールの代替として、グルコースを、例えば、およそ同じ量において使用することができる。
バッチ段階の後に流加バッチ段階が続く、細胞培養およびＰＯＩ発現の典型的な系において、流加バッチ段階の培養は、およそ１５時間から１００時間、およそ１５時間から８０時間、およそ１５時間から７０時間、およそ１５時間から６０時間、およそ１５時間から５０時間、およそ１５時間から４５時間、およそ１５時間から４０時間、およそ１５時間から３５時間、およそ１５時間から３０時間、およそ１５時間から３５時間、およそ１５時間から２５時間、またはおよそ１５時間から２０時間のうちのいずれかにおいて；好ましくはおよそ２０時間から４０時間において、実施される。詳細には、流加バッチ段階の培養は、およそ１００時間、およそ８０時間、およそ７０時間、およそ６０時間、およそ５５時間、およそ５０時間、およそ４５時間、およそ４０時間、およそ３５時間、およそ３３時間、およそ３０時間、およそ２５時間、およそ２０時間、またはおよそ１５時間のうちのいずれかにおいて、実施される。
詳細には、容積特異的産物形成速度（ｒＰ）は、単位容積（Ｌ）および単位時間（ｈ）あたりに形成される産物の量（ｍｇ）（ｍｇ（Ｌｈ）－１）である。容積特異的産物形成速度は、空時収量（ｓｐａｃｅ ｔｉｍｅ ｙｉｅｌｄ：ＳＴＹ）または容積生産性（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）とも呼ばれる。
詳細には、本明細書において説明される方法の流加バッチ培養は、約３０ｍｇ（Ｌｈ）－１（３０ｍｇ（Ｌｈ）－１＋／－５％または＋／－１０％）の空時収量となるように実施される。詳細には、約３０ｍｇ（Ｌｈ）－１の空時収量は、約３０時間以内の流加バッチにおいて、詳細には、３３時間、３２時間、３１時間、３０時間、２９時間、２８時間、２７時間、２６時間、または２５時間未満のうちの少なくともいずれかの流加バッチ時間以内において、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３ｍｇ（Ｌｈ）－１のうちの少なくともいずれかを達成することができる。
詳細には、ＰＯＩは、例えば、最大増殖速度未満の増殖速度、典型的には、細胞の最大増殖速度の９０％未満、好ましくは８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、または０．２％未満において細胞系を培養することによってなど、増殖制限条件下での産生段階に発現される。典型的には、最大増殖速度は、宿主細胞の各タイプに対して個別に特定される。
特定の態様により、Ｍｕｔ－宿主細胞は、宿主細胞の増殖を１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満（ｗ／ｗバイオマス）のいずれかに制限する条件下において、産生段階の間に培養される。
詳細には、産生段階は、０．０００１ｈ－１から０．２時－１、好ましくは０．００５ｈ－１から０．１５ｈ－１の範囲内の特定の増殖速度を維持するような増殖制限量において補助炭素源を提供する供給培地を用いる。
特定の態様により、本発明は、発酵産物を製造する方法における、組換えメタノール利用経路欠損メチロトローフ酵母（Ｍｕｔ－）宿主細胞の使用であって、方法が、Ｍｕｔ－宿主細胞がアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）のための基質としてメタノールを使用すること、および発酵産物を製造することができる条件下において、（Ｍｕｔ－）宿主細胞を培養するステップを含む、使用を提供する。
詳細には、Ｍｕｔ－宿主細胞は、アルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）およびアルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）を欠損している。
詳細には、Ｍｕｔ－宿主細胞において、アルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）およびアルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）をコードする遺伝子は、ノックアウトされるかまたは欠失される。
特定の態様により、本発明は、発酵産物を製造する方法における、組換えメタノール利用経路欠損メチロトローフ酵母（Ｍｕｔ－）宿主細胞の使用であって、方法が、Ｍｕｔ－宿主細胞が炭素源としてメタノールを使用して発酵産物を産生することができる条件下において、（Ｍｕｔ－）宿主細胞を培養するステップを含み、Ｍｕｔ－宿主細胞が、
ａ）１つまたは複数の遺伝子修飾の前の宿主細胞と比較して、第１および第２の内因性遺伝子の発現を減少させるための１つまたは複数の遺伝子修飾であって、
ｉ．第１の内因性遺伝子が、配列番号１として特定されるアミノ酸配列を含むアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）またはそのホモログをコードし、ならびに
ｉｉ．第２の内因性遺伝子が、配列番号３として特定されるアミノ酸配列を含むアルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）またはそのホモログをコードする、
１つまたは複数の遺伝子修飾、ならびに、
ｂ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）遺伝子の発現を増加させるための１つまたは複数の遺伝子修飾であって、ＡＤＨ２遺伝子が、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）をコードする、１つまたは複数の遺伝子修飾
によって操作される、使用を提供する。
特定の態様により、本発明は、宿主細胞において目的のタンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法であって、以下のステップ：
ａ）それぞれＡＯＸ１およびＡＯＸ２をコードする第１および第２の遺伝子の発現を減少させる（過小発現）ように宿主細胞を遺伝子操作するステップ；
ｂ）ＡＤＨ２をコードする遺伝子の発現を増加させる（過剰発現）ように宿主細胞を遺伝子操作するステップ；
ｃ）発現カセットプロモーター（ＥＣＰ）の制御下においてＰＯＩをコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含む異種発現カセットを宿主細胞に導入するステップ；
ｄ）炭素源としてメタノールを使用してＰＯＩを産生する条件下において宿主細胞を培養し、それにより、特に、増殖および／またはＰＯＩ産生のためのエネルギーを供給するステップ；
ｅ）場合により、ＰＯＩを細胞培養物から単離するステップ；および
ｆ）場合により、ＰＯＩを精製するステップ
を含む方法を提供する。
詳細には、本明細書において説明される方法のステップａ）は、ステップｂ）の前、後、または同時に実施される。
詳細には、本明細書において説明される方法のステップａ）およびｂ）は、ステップｃ）の前、後、または同時に実施される。
特定の態様により、宿主細胞は、最初、ＰＯＩを産生するために操作される前に、それぞれＡＯＸ１およびＡＯＸ２をコードする第１および第２遺伝子の発現を減少させるように、およびＡＤＨ２をコードする遺伝子の発現を増加させるように、遺伝子操作される。特定の実施例により、野生型宿主細胞は、本明細書において説明される方法のステップａ）およびｂ）に従って遺伝子修飾される。詳細には、宿主細胞は、それぞれＡＯＸ１およびＡＯＸ２をコードする第１および第２遺伝子の低減のため、およびＡＤＨ２をコードする遺伝子の発現を増加させるために、１つまたは複数の遺伝子修飾を野生型宿主細胞株に導入する際に提供される。
さらなる態様により、宿主細胞は、最初に、それぞれＡＯＸ１およびＡＯＸ２をコードする第１および第２の遺伝子を減少させるため、およびＡＤＨ２をコードする遺伝子の発現を増加させるためにさらに遺伝子修飾される前に、異種または組換えＰＯＩを産生するように操作される。特定の実施例により、野生型宿主細胞は、最初に、ＰＯＩ産生のための発現カセットを含むように操作され得る。そのような操作された宿主細胞は、次いで、それぞれＡＯＸ１およびＡＯＸ２をコードする第１および第２の遺伝子を減少させるため、およびＡＤＨ２をコードする遺伝子の発現を増加させるために、さらに改変され得る。
さらなる態様により、宿主細胞は、操作ステップ、例えば、ＰＯＩ産生のために操作するステップ、ならびに、それぞれＡＯＸ１およびＡＯＸ２をコードする第１および第２遺伝子の低減のため、および、同時にＡＤＨ２をコードする遺伝子の発現を増加させるために遺伝子修飾するステップ、すなわち、１つの方法ステップにおいて、例えば、１つまたは複数の反応混合物においてそれぞれ発現カセット、試薬、およびツールを用いるステップ、を受ける。
詳細には、方法は、本明細書において詳細に説明されるような組換えＭｕｔ－宿主細胞を生成するための方法ステップを用いる。
詳細には、異種発現カセットは、本明細書において詳細に説明されるようなＥＣＰを含む。
詳細には、ＰＯＩは、適切な培地においてＭｕｔ－宿主細胞を培養すること、培養ステップの間にメタノールを含む細胞培養産生培地を使用してＰＯＩを産生すること、および、細胞を分離する際に、発現したＰＯＩを細胞培養物、特に、細胞培養上清または培地から単離すること、ならびに、場合によりＰＯＩを、発現した産物にとって適切な方法で精製すること、によって産生することができる。
それにより、精製されたＰＯＩ調製物を作製することができる。
驚くべきことに、Ｍｕｔ－宿主細胞は、メタノールに鈍感で、効率的に取り込むことができ、ＰＯＩ産生のためのエネルギーを提供するのに必要なかなりの量のメタノールを使用することができることが判明した。これは、驚くべきことであり、と言うのも、先行技術において、メタノールは、ＭｕｔＳ株に対して毒性であることがわかっているためである。
本明細書において説明される細胞培養の具体例により、有利なことに、Ｍｕｔ－宿主細胞の増殖は、産生段階の間、制限され、それは、酸素供給および冷却の必要性を減少させる。
さらに驚くべきことに、ＰＯＩ産生の収率が、アルコールデヒドロゲナーゼのこれまで過小評価されたメカニズムと、メチロトローフ酵母におけるＡＤＨ２の活性とによって増加され、それにより、メタノール利用経路欠損メチロトローフ酵母のＡＯＸ１およびＡＯＸ２遺伝子をノックアウトするにもかかわらず、結果として、メタノール取り込みおよび効果的なメタノール消費を生じた。
特定の実施例により、メタノール誘導性ＥＣＰは、ＧＯＩＥＣにおいて有利に使用された。細胞培養において炭素源として使用されるメタノール量は、ＧＯＩの発現を誘導するのに十分であった。
本明細書において参照される配列 本明細書において参照される配列 本明細書において参照される配列 本明細書において参照される配列 本明細書において参照される配列 本明細書において参照される配列 本明細書において参照される配列 本明細書において参照される配列 本明細書において参照される配列 本明細書において参照される配列 本明細書において参照される配列 本明細書において参照される配列 本明細書において参照される配列 本明細書において参照される配列
明細書全体を通して使用される特定の用語は、以下の意味を有する。
用語「炭素源」は、本明細書において使用される場合、発酵性炭素基質、典型的には、微生物のためのエネルギー源として好適な炭水化物源、例えば、宿主生物または産生細胞系によって代謝されることができるもの、特に、精製された形態において、最小限の培地中において、または複雑な栄養物質などの原材料において提供される、単糖、オリゴ糖、多糖、グリセロールを含むアルコール、からなる群から選択される源、を意味するものである。炭素源は、単一の炭素源として、または異なる炭素源の混合物として、本明細書において説明されるように使用され得る。
本明細書において説明されるように、メタノールは、炭素源として、例えば、産生段階の間の単独の炭素源として、または非メタノール炭素源との混合物において、使用される。詳細には、メタノールは、任意の非メタノール炭素源と共に、細胞培養物に同時供給（ｃｏ－ｆｅｄ）される。
非メタノール炭素源は、メタノール以外の炭素源、特に、無メタノール炭素源である炭素源として本明細書において理解される。
本明細書において説明されるような「基礎炭素源」は、典型的には、細胞増殖にとって好適な炭素源、例えば、宿主細胞のための、特に真核細胞のための栄養物など、である。基礎炭素源は、培地、例えば、基礎培地または複合培地など、においてだけではなく、精製された炭素源を含む既知組成培地においても提供され得る。基礎炭素源は、典型的には、例えば、継代培養ステップの間に９０％超、好ましくは９５％超の生存率を示す、例えば、少なくとも５ｇ／Ｌ細胞乾燥質量、好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌ細胞乾燥質量、または少なくとも１５ｇ／Ｌ細胞乾燥質量の細胞密度を得るために、特に培養プロセスにおける増殖段階の間に、細胞増殖を提供する量において提供される。
基礎炭素源は、典型的には、過剰量または余剰量において使用され、それは、例えば、高い特定の増殖速度を有する細胞系の培養の間、例えば、バッチ培養プロセスまたは流加バッチ培養プロセスにおける細胞系の増殖段階の間などに、バイオマスを増加させるためのエネルギーを提供する過剰として理解される。この余剰量は、特に、測定可能で、典型的には、補助炭素源の制限された量を供給する間より、少なくとも１０倍高い、好ましくは少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍高い、発酵液中の残留濃度を達成するような、補助炭素源の制限された量（増殖制限条件下において使用されるような）を超過する量である。
本明細書において説明される「補助炭素源」は、典型的には、特に培養プロセスの産生段階において産生細胞系による発酵産物の産生を促進する補助基質である。産生段階は、詳細には、例えば、バッチプロセス、流加バッチプロセス、および連続培養プロセスなどにおける増殖段階の後に続く。補助炭素源は、詳細には、流加バッチプロセスの供給に含まれ得る。補助炭素源は、典型的には、炭素基質制限条件下の細胞培養において、すなわち、制限された量の炭素源を使用する条件下において用いられる。
詳細には、本明細書において説明される方法において、メタノールは、補助炭素源として使用される。
炭素源の「制限された量」または「制限された炭素源」は、本明細書において、詳細には、特に、最大増殖速度未満に制御された増殖速度の培養プロセスにおいて、産生細胞系による発酵産物の産生を促進する炭素基質のタイプおよび量を意味するとして理解される。産生段階は、詳細には、例えば、バッチプロセス、流加バッチプロセス、および連続培養プロセスなどにおける増殖段階の後に続く。細胞培養プロセスは、バッチ培養、連続培養、流加バッチ培養を用い得る。バッチ培養は、少量の種培養液が培地に加えられ、培養中に、追加の培地を加えることなくまたは培養液を排出することなく、細胞が培養される培養プロセスである。
連続培養は、培養中に培地が連続的に加えられ、および放出される、培養プロセスである。連続培養は、潅流培養も包含する。バッチ培養と連続培養との中間であり、半バッチ培養とも呼ばれる流加バッチ培養は、培養中に培地が連続的にまたは逐次的に加えられるが、連続培養とは異なり、培養液は連続的には排出されない、培養プロセスである。
特に好ましいのは、培養への増殖制限栄養基質の供給に基づく流加バッチプロセスである。単一流加バッチ発酵または反復流加バッチ発酵を含む流加バッチ戦略は、典型的には、バイオリアクターでの高細胞密度を達成するためにバイオ産業プロセスにおいて使用される。炭素基質の制限された追加は、培養の増殖速度に直接的に影響を及ぼし、オーバーフロー代謝または望ましくない代謝副産物の形成を回避するのに貢献する。炭素源制限条件下において、炭素源は、詳細には、流加バッチプロセスの供給に含まれ得る。それにより、炭素基質は、制限された量において提供される。
本明細書において説明されるケモスタットまたは連続培養においても、増殖速度は、しっかりと制御することができる。
炭素源の制限された量は、本明細書において、特に、例えば、産生段階または産生モードにおいて、増殖制限条件下で産生細胞系を維持するのに必要な炭素源の量として理解される。そのような制限された量は、流加バッチプロセスにおいて用いられ得、その場合、炭素源は、供給培地に含まれ、例えば、バイオマスを特定の低増殖速度に維持しつつＰＯＩを産生するために、持続的エネルギー送達のために低供給速度において培養物に供給される。供給培地は、典型的には、細胞培養物の産生段階の間に、発酵液に加えられる。
炭素源の制限された量は、例えば、細胞培養液中の炭素源の残留量によって決定され得、それは、所定の閾値未満であるか、さらには、標準的（炭水化物）アッセイにおいて測定される場合の検出限界未満である。残留量は、典型的には、発酵産物を収穫する際の発酵液において特定されるであろう。
また、炭素源の制限された量は、例えば、時間あたりの計算された平均量を特定するために、例えば、培養時間あたりの、全培養プロセス、例えば、流加バッチ段階、に加えられた量によって特定される場合に、発酵槽への炭素源の平均供給速度を定義することによって特定され得る。この平均供給速度は、細胞培養による補助炭素源の完全な使用を確保するために、低く、例えば、０．６ｇＬ－１ｈ－１（Ｌ初期発酵量およびｈ時間あたりのｇ炭素源）から２５Ｌ－１ｈ－１の間、好ましくは１．６ｇＬ－１ｈ－１から２０ｇＬ－１ｈ－１の間、に維持される。
炭素源の制限された量は、特定の増殖速度を測定することによっても特定され得、この場合、特定の増殖速度は、産生段階の間、例えば、所定の範囲内、例えば、０．００１ｈ－１から０．２０ｈ－１、または０．００５ｈ－１から０．２０ｈ－１の範囲、好ましくは０．０１ｈ－１から０．１５ｈ－１の間、において、低く、例えば、特定の最大増殖速度未満、に維持される。
詳細には、供給培地は、メタノールを含む既知組成において使用される。
細胞培養培地、例えば、流加バッチプロセスにおける最少培地または供給培地など、に関する用語「既知組成」は、産生細胞系のインビトロ細胞培養にとって好適な培養培地を意味するものであり、この場合、化学成分および（ポリ）ペプチドの全てが既知である。典型的には、既知組成培地は、動物由来成分を完全に含まず、純粋で一貫した細胞培養環境を表す。
用語「細胞」または「宿主細胞」は、本明細書において使用される場合、単一の細胞、単一の細胞クローン、または宿主細胞の細胞系を意味するものである。用語「宿主細胞」は、メチロトローフ酵母の細胞に対して特に当てはまり、それらは、ＰＯＩまたは宿主細胞代謝物質を産生するための組換え目的のために好適に使用される。用語「宿主細胞」が人間を包含しないことは、十分に理解される。詳細には、本明細書において説明される宿主細胞は、人工有機体であり、天然（野生型）の宿主細胞の誘導体である。本明細書において説明される宿主細胞、方法、および使用（例えば、詳細には、１つまたは複数の遺伝子修飾を含むものを意味する）、異種発現カセットまたは発現構築物、トランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞および組換えタンパク質、は、天然には存在しない「人工物」または合成物であり、したがって、「自然の法則」の結果とは見なされないことは、十分に理解される。
用語「細胞系」は、本明細書において使用される場合、長期間にわたって増殖する能力を取得した特定の細胞タイプにおける確立されたクローンを意味する。細胞系は、典型的には、内因性または組換え遺伝子を発現するため、またはポリペプチドを産生するための代謝経路の産物のため、またはそのようなポリペプチドによって媒介される細胞代謝物質のために使用される。
本明細書において説明されるＰＯＩを産生する宿主細胞は、「産生宿主細胞」とも呼ばれ、それぞれの細胞系は、「産生細胞系」と呼ばれる。「産生細胞系」は、一般的に、産生プロセスの産物、例えば、ＰＯＩなど、を得るために、バイオリアクターでの細胞培養にすぐに使える細胞系であると理解される。
本明細書において説明される特定の実施形態は、メタノールを酵素的に処理してそれにより細胞にエネルギーを提供するためにＡＤＨ２を効率的に使用することができるＭｕｔ－産生宿主細胞を意味する。
本明細書において説明される特定の実施形態は、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２タンパク質をコードする内因性遺伝子を過小発現するように、およびＡＤＨ２をコードする遺伝子を過剰発現するように操作された産生細胞系を意味し、メタノールを炭素源として使用して本明細書において説明されるＥＣＰの制御下でのＰＯＩ産生の高い収率によって特徴付けられる。
用語「細胞培養」または「培養すること」または「培養」は、宿主細胞に関して本明細書において使用される場合、活性状態または静穏状態での、詳細には、産業において既知の方法による制御されたバイオリアクターでの、細胞の増殖、分化、または持続的増殖力を支持する条件下での、人工環境、例えば、インビトロ環境における細胞の維持を意味する。
適切な培養培地を使用して細胞培養物を培養する場合、細胞は、細胞培養物での細胞の培養を支持するのに好適な条件下において、培養容器の培地または基質に接触する。本明細書において説明されるように、宿主細胞、例えば、メチロトローフ酵母、の増殖のために使用することができる培養培地が提供される。標準的細胞培養技術は、当分野において周知である。
本明細書において説明される細胞培養は、特に、例えば、細胞培養培地において、ＰＯＩを得るために、分泌されたＰＯＩの産生を提供する技術を用い、この場合、ＰＯＩは、本明細書において「細胞培養上清」とも呼ばれる細胞バイオマスから分離可能であり、より高い純度のＰＯＩを得るために精製され得る。タンパク質（例えば、ＰＯＩ）が、細胞培養において、宿主細胞によって産生および分泌される場合、そのようなタンパク質は、細胞培養上清中に分泌され、細胞培養上清を宿主細胞バイオマスから分離し、場合により、精製されたタンパク質調製物を作製するためにタンパク質をさらに精製することによって得ることができるということは、本明細書において理解される。
細胞培養培地は、制御された人工のインビトロ環境での細胞の維持および細胞の増殖に必要な栄養素を提供する。細胞培養培地の特徴および組成は、特定の細胞要件に応じて変わる。重要なパラメータとしては、オスモル濃度、ｐＨ、および栄養素配合が挙げられる。栄養素の供給は、当技術分野において既知の方法に従って、連続モードまたは不連続モードにおいて為され得る。
バッチプロセスは、細胞培養モードであり、当該モードでは、細胞の培養に必要な栄養素の全てが初期培養培地に含まれ、バッチ段階の後、流加バッチプロセスにおいて、発酵中にさらなる栄養素の追加供給がされないが、それに対して、供給段階は、１つまたは複数の栄養素が供給によって培養物に供給される状態において行われる。ほとんどのプロセスにおいて、供給のモードは、決定的で重要であるが、本明細書において説明される宿主細胞および方法は、細胞培養のある特定のモードに関して制限されない。
組換えＰＯＩは、本明細書において説明される宿主細胞およびそれぞれの細胞系を使用することにより、適切な培地において培養し、発現された産物または代謝物質を培養物から単離し、場合により、それを適切な方法によって精製することによって、産生することができる。
本明細書において説明されるＰＯＩの産生のためのいくつかの異なるアプローチが好ましい。ＰＯＩは、発現され得、処理され得、場合により、関連タンパク質をコードする組換えＤＮＡを含む発現ベクターによって宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換すること、トランスフェクトまたは形質転換された細胞の培養物を調製すること、培養物を増殖させること、転写およびＰＯＩ産生を誘導すること、およびＰＯＩを回収すること、によって分泌され得る。
ある特定の実施形態において、細胞培養プロセスは、流加バッチプロセスである。詳細には、所望の組換えＰＯＩをコードする核酸コンストラクトによって形質転換された宿主細胞は、増殖段階において培養され、所望の組換えＰＯＩを産生するために産生段階に以降される。
別の実施形態において、本明細書において説明される宿主細胞は、例えば、ケモスタットを使用して、連続モードにおいて培養される。連続発酵プロセスは、バイオリアクターへの、規定された一定で連続した速度の新鮮な培養培地の供給によって特徴付けられ、当該供給により、同時に、培養液が、同じ規定された一定で連続した除去速度においてバイオリアクターから除去される。培養培地、供給速度、および除去速度を同じ一定のレベルに維持することにより、バイオリアクターにおける細胞培養パラメータおよび条件は、一定に維持される。
本明細書において説明される安定した細胞培養は、詳細には、培養の約２０継代の後でさえ、好ましくは、少なくとも３０継代、より好ましくは少なくとも４０継代、最も好ましくは少なくとも５０継代の後でさえ、遺伝的特性を維持する細胞培養、詳細には、ＰＯＩ産生レベルを高く、例えば、少なくともμｇレベルに維持する細胞培養を意味するとして理解される。詳細には、安定した組換え宿主細胞系が提供され、これは、工業規模での生産のために使用される場合にかなりの利点であると考えられる。
本明細書において説明される細胞培養は、栄養素の供給に基づく培養モード、特に、流加バッチプロセスもしくはバッチプロセス、または連続もしくは半連続プロセス（例えば、ケモスタット）との組み合わせにおいて、量および技術システムの両方に関して、工業製造規模での方法にとって特に有利である。
本明細書において説明される宿主細胞は、典型的には、ＰＯＩ産生のためにＧＯＩを発現するその能力について試験され、以下の試験：ＥＬＩＳＡ、活性アッセイ、ＨＰＬＣ、または他の好適な試験、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット技術、または質量分析法など、のいずれかによってＰＯＩ収率について試験される。
それぞれの細胞培養におけるＡＯＸ１および／またはＡＯＸ２タンパク質をコードする遺伝子の過小発現または発現の減少に対する１つまたは複数の遺伝子修飾の効果、例えば、ＰＯＩ産生に対するそれらの効果を特定するために、それぞれの細胞においてそのような遺伝子修飾を行っていない株と比較して、流加バッチまたはケモスタット発酵を使用して、マイクロタイタープレート、振盪フラスコ、またはバイオリアクターにおいて、宿主細胞系が培養され得る。
本明細書において説明される製造方法は、詳細には、パイロット規模または工業規模での発酵を可能にする。工業プロセス規模は、好ましくは、少なくとも１０Ｌ、詳細には少なくとも５０Ｌ、好ましくは少なくとも１ｍ３、好ましくは少なくとも１０ｍ３、最も好ましくは少なくとも１００ｍ３の容積を用いるであろう。
例えば、１００Ｌから１０ｍ３またはそれ以上の反応器容量での流加バッチ培養を意味し、およそ０．０２～０．１５ｈ－１の希釈速度によって、およそ５０～１０００Ｌまたはそれ以上の発酵槽容積での、数日の典型的なプロセス時間、または連続プロセスを用いる、工業規模での製造条件は好ましい。
本明細書において説明される目的のために使用される装置、施設、および方法は、原核生物細胞系および／または真核生物細胞系を含む任意の所望の細胞系の培養における、および培養による使用にとって特に好適である。さらに、ある実施形態において、装置、施設、および方法は、懸濁細胞または足場依存性（付着性）細胞を含む任意の細胞タイプの培養にとって好適であり、医薬製品およびバイオ医薬製品、例えば、ポリペプチド産物（ＰＯＩ）、核酸産物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、または細胞および／またはウイルス、例えば、細胞療法および／またはウイルス療法において使用されるものなど、の産生のために構成された産生作業にとって好適である。
ある特定の実施形態において、細胞は、組換え治療用産物または診断用産物などの産物を発現または産生する。本明細書においてより詳細に説明されるように、細胞によって産生される産物の例としては、これらに限定されるわけではないが、ＰＯＩ、例えば、抗体分子（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体）を含む本明細書において例示されるものなど、抗体模倣物（抗原に特異的に結合するが抗体に構造的に関連はしないポリペプチド分子、例えば、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アドネクチン、またはＩｇＮＡＲなど）、融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、他の組換えタンパク質（例えば、グリコシル化タンパク質、酵素、ホルモン）、またはウイルス治療（例えば、抗癌腫瘍溶解性ウイルス、遺伝子治療のためのウイルスベクター、およびウイルス免疫療法）、細胞治療（例えば、多分化能性幹細胞、間充織幹細胞、および成人幹細胞）、ワクチンまたは脂質で覆われた粒子（例えば、エキソソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡなど）またはＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡなど）、抗生物質、またはアミノ酸が挙げられる。ある実施形態において、装置、施設、および方法は、バイオシミラーを製造するために使用することができる。
言及したように、ある特定の実施形態において、装置、施設、および方法は、真核細胞、例えば、酵母細胞、例えば、タンパク質、ぺプチド、または抗生物質、アミノ酸、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）などの、大規模な方式において細胞によって合成されたＰＯＩの産生を可能にする。本明細書において特に記載のない限り、装置、施設、および方法は、任意の所望の容積または生産能力、例えば、これらに限定されるわけではないが、ベンチ規模、試験規模、およびフル生産規模の能力を含むことができる。
その上、本明細書において特に明記されない限り、装置、施設、および方法は、任意の好適な反応器、例えば、これらに限定されるわけではないが、撹拌タンク、エアリフト、繊維、ミクロ繊維、中空繊維、セラミックマトリックス、流動床、固定床、および／または噴流床バイオリアクターなど、を含むことができる。本明細書において使用される場合、「反応器」は、発酵槽もしくは発酵ユニット、または任意の他の反応器を含むことができ、用語「反応器」は、「発酵槽」と相互互換的に使用される。例えば、いくつかの態様において、実例のバイオリアクターユニットは、以下：栄養素および／または炭素源の供給、好適なガス（例えば、酸素）の注入、発酵培地または細胞培養培地の入口流および出口流、気相および液相の分離、温度の維持、酸素およびＣＯ２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、アジテーション（例えば、撹拌）、および／またはクリーニング／滅菌、のうちの１つまたは複数、または全てを実施することができる。実例の反応器ユニット、例えば、発酵ユニットなど、は、ユニット内に複数の反応器を含んでもよく、例えば、ユニットは、各ユニットに１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、またはそれ以上のバイオリアクターを有することができ、および／または施設は、施設内に単一のまたは複数の反応器を有する複数のユニットを収容し得る。様々な実施形態において、バイオリアクターは、バッチ、半流加バッチ、流加バッチ、潅流、および／または連続発酵プロセスにとって好適であり得る。任意の好適な反応器直径を使用することができる。ある実施形態において、バイオリアクターは、約１００ｍＬから約５０，０００Ｌの間の容積を有することができる。非限定的な例としては、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル、および／または５０，０００リットルの容積が挙げられる。さらに、好適な反応器は、マルチユース、シングルユース、使い捨て、または非使い捨てであり得、任意の好適な材料、例えば、ステンレス（例えば、３１６Ｌまたは任意の他の好適なステンレス）およびインコネルなどの合金、プラスチック、および／またはガラスなど、で形成することができる。
ある実施形態において、および本明細書において特に明記されない限り、本明細書において説明される装置、施設、および方法は、特に言及されない任意の好適な単位操作および／または設備、例えば、そのような産物の分離、精製、および単離のための操作および／または設備など、も含むことができる。任意の好適な施設および環境、例えば、従来の現場組立施設、モジュール式、可動式、および一次的な施設、または任意の他の好適な構成、施設、および／もしくはレイアウトなど、を使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、モジュール式クリーンルームを使用することができる。さらに、特に明記しない限り、本明細書において説明される装置、システム、および方法は、単一の場所または施設に収容および／もしくは実施することができ、または別々のまたは複数の場所および／もしくは施設において収容および／または実施することができる。
好適な技術は、バイオリアクターでの培養を包含し得、それは、バッチ段階によって開始され、その後に高い特定の増殖速度での短い急激な流加バッチ段階が続き、さらにその後に、低い特定の増殖速度での流加バッチ段階が続く。別の好適な培養技術は、バッチ段階と、その後に続く任意の好適な特定の増殖速度での、またはＰＯＩ産生時間にわたって高い増殖速度から低い増殖速度へと、もしくはＰＯＩ産生時間にわたって低い増殖速度から高い増殖速度へと移行するような特定の増殖速度の組み合わせでの、流加バッチ段階を包含し得る。別の好適な培養技術は、バッチ段階と、その後に続く、低希釈速度での連続培養段階を包含し得る。
好ましい実施形態は、バイオマスを提供するためのバッチ培養と、その後に続く、高収率ＰＯＩ産生のための流加バッチ培養を含む。
少なくとも１ｇ／Ｌ細胞乾燥重量、より好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌ細胞乾燥重量、好ましくは少なくとも２０ｇ／Ｌ細胞乾燥重量、好ましくは３０、４０、５０、６０、７０、または８０ｇ／Ｌ細胞乾燥重量のうちの少なくともいずれかの細胞密度を得るための増殖条件下においてバイオリアクターにて本明細書において説明される宿主細胞を培養することは好ましい。パイロット規模または工業規模においてバイオマス生産においてそのような収率を提供することは有利である。
バイオマスの蓄積を可能にする増殖培地、詳細には基礎増殖培地は、典型的には、炭素源、窒素源、硫黄源、およびリン酸源を含む。典型的には、そのような培地は、さらに、微量元素およびビタミンを含み、さらに、アミノ酸、ペプチド、または酵母エキスを含み得る。
好ましい窒素源としては、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＮＨ３、または（ＮＨ４）２ＳＯ４が挙げられる。
好ましい硫黄源としては、ＭｇＳＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、またはＫ２ＳＯ４が挙げられる。
好ましいリン酸源としては、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、またはＨ３ＰＯ４、またはＮａＨ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、またはＫ２ＨＰＯ４が挙げられる。
さらなる典型的な培地成分としては、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、および微量元素、例えば、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｍｎ、Ｉ、Ｂなどが挙げられる。
好ましくは、培地は、ビタミンＢ７が補われる。
Ｐ．パストリスのための典型的な増殖培地は、グリセロール、ソルビトール、またはグルコース、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ビオチン、および微量元素を含む。
産生段階において、産生培地は、詳細には、制限された量のみの補助炭素源と共に使用される。
好ましくは、宿主細胞系は、好適な炭素源を伴う無機培地において培養され、それにより、さらに、単離プロセスを著しく簡素化する。好ましい無機培地の例は、利用可能な炭素源（特に、本明細書で説明されたメタノール、場合により、例えば、グルコース、グリセロール、またはソルビトールと組み合わせて）、多量元素を含む塩（カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、塩化物、硫酸塩、リン酸塩）、および微量元素（銅、ヨウ素、マンガン、モリブデン酸塩、コバルト、亜鉛、鉄塩、およびホウ酸）、場合により、例えば、栄養要求性を補足するための、ビタミンまたはアミノ酸、を含有するものである。
詳細には、細胞は、望ましいＰＯＩの発現をもたらすのに好適な条件下において培養され、その場合、ＰＯＩは、発現系および発現されるタンパク質の性質、例えば、タンパク質がシグナルペプチドに融合するか否か、およびタンパク質が可溶性であるかまたは膜結合性であるか、などに応じて、細胞または培養培地から精製することができる。当業者によって理解されるであろうように、培養条件は、用いられる宿主細胞および特定の発現ベクターのタイプなどの要因に従って変わるであろう。
典型的な産生培地は、補助炭素源、さらにＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ビオチン、および微量元素を含む。
例えば、発酵に加えられる補助炭素源の供給は、最大で５０重量％までの利用可能な糖を伴う炭素源を含み得る。
発酵は、好ましくは、ｐＨ３から８の範囲において実施される。
典型的な発酵時間は、２０℃から３５℃、好ましくは２２～３０℃の範囲の温度において約２４時間から１２０時間である。
ＰＯＩは、好ましくは、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｇ／Ｌの力価を生じる条件を用いて発現される。
用語「発現」または「発現カセット」は、本明細書において使用される場合、これらの配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主が、コードされたタンパク質または宿主細胞代謝物質を産生することができるように、作動可能に連結された所望のコード配列および制御配列を含有する核酸分子を意味する。形質転換を生じさせるために、発現系は、ベクターに含ませられ得るが、ただし、関連ＤＮＡも、宿主細胞染色体に統合され得る。発現は、ポリペプチドまたは代謝物質を含む、分泌発現産物または非分泌発現産物を意味し得る。
発現カセットは、例えば、「ベクター」または「プラスミド」の形態において、発現構築物として簡便に提供され、それらは、典型的には、好適な宿主生物におけるクローンされた組換えヌクレオチド配列、すなわち組換え遺伝子、の転写、ならびにそれらのｍＲＮＡの翻訳のために必要なＤＮＡ配列である。発現ベクターまたは発現プラスミドは、通常、自立複製のためのオリジナルまたは宿主細胞におけるゲノム統合のための遺伝子座、選択マーカー（例えば、アミノ酸合成遺伝子、またはゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）、カナマイシン、Ｇ４１８、もしくはハイグロマイシン、ヌールセオトリシンなどの抗生物質に対する抵抗性を付与する遺伝子）、いくつかの制限酵素切断部位、好適なプロモーター配列、および転写ターミネーターを含み、その場合、成分は、一緒に作動可能に連結される。用語「プラスミド」および「ベクター」は、本明細書で使用される場合、自己複製性ヌクレオチド配列、ならびにゲノム統合ヌクレオチド配列、例えば、人工染色体など、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）など、を含む。
発現ベクターは、クローニングベクター、改変されたクローニングベクター、および特異的に設計されたプラスミドを含み得るが、それらに限定されるわけではない。本明細書において説明される好ましい発現ベクターは、真核生物宿主細胞において組換え遺伝子を発現するために好適な発現ベクターであり、宿主生物に応じて選択される。適切な発現ベクターは、典型的には、真核生物宿主細胞においてＰＯＩをコードするＤＮＡを発現するために好適な調節配列を含む。調節配列の例としては、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、および転写および翻訳の開始および停止を制御する配列が挙げられる。調節配列は、典型的には、発現されるＤＮＡ配列に作動可能に連結される。
本明細書において説明される特定の発現構築物は、プロモーターの転写制御下においてＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターを含む。詳細には、プロモーターは、ＰＯＩのコード配列に天然には付随しない。
宿主細胞における組換えヌクレオチド配列の発現を可能にするために、ＧＯＩＥＣとして本明細書において説明される発現カセットまたはベクターは、ＥＣＰ、典型的には、プロモーターヌクレオチド配列を含み、それらは、コード配列の５’末端に隣接し、例えば、目的の遺伝子（ＧＯＩ）から上流において遺伝子に隣接するか、または、シグナル配列またはリーダー配列が使用される場合には、ＰＯＩの発現および分泌を促進するために、それぞれシグナル配列およびリーダー配列から上流において配列に隣接する。プロモーター配列は、典型的には、特にＧＯＩなど、作動可能に連結した下流のヌクレオチド配列の転写を調節するかまたは開始する。
本明細書において説明される特定の発現構築物は、宿主細胞からのＰＯＩの分泌を生じさせるリーダー配列と連結されたＰＯＩをコードするポリヌクレオチドを含む。発現ベクターにおけるそのような分泌リーダー配列の存在は、典型的には、組換え発現および分泌のために意図されるＰＯＩが天然には分泌されないタンパク質であり、そのため、天然の分泌リーダー配列を欠く場合、あるいは、そのヌクレオチド配列が、その天然分泌リーダー配列を伴わずにクローンされている場合、に必要である。概して、宿主細胞からのＰＯＩの分泌を生じさせるために有効な任意の分泌リーダー配列が使用され得る。分泌リーダー配列は、酵母源、例えば、サッカロミセス・セレビシエのＭＦａなどの酵母α因子、または酵母ホスファターゼ、哺乳動物源または植物源または他の源に由来し得る。
特定の実施形態において、マルチクローニングベクターが使用され得、それらは、マルチクローニング部位を有するベクターである。詳細には、所望の異種遺伝子は、発現ベクターを調製するために、マルチクローニング部位において統合または導入され得る。マルチクローニングベクターの場合、プロモーターは、典型的には、マルチクローニング部位の上流に位置される。
用語「遺伝子発現」または「ポリヌクレオチドを発現する」は、本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡへのＤＮＡ転写、ｍＲＮＡプロセシング、ｍＲＮＡ成熟化、ｍＲＮＡエクスポート、翻訳、タンパク質フォールディングおよび／またはタンパク質移動からなる群から選択される少なくとも１つのステップを含むことが意図される。
用語「発現を増加する」は、本明細書において「過剰発現」とも呼ばれ、これは、ある特定のポリヌクレオチドの発現を増加させる遺伝子変化前の宿主細胞であり得るか、またはそうでなければ、ポリヌクレオチドの発現を増加させるように操作されていない同じタイプまたは種の宿主細胞によって発現される、参照標準によって示される発現レベルを超える任意の量を意味する。
宿主細胞が所定の遺伝子産物を含まない場合、発現のために遺伝子産物を宿主細胞に導入することは可能であり；この場合、任意の検出可能な発現は、用語「過剰発現」に包含される。
タンパク質（例えば、ＡＤＨ２）をコードする遺伝子の過剰発現は、タンパク質（例えば、ＡＤＨ２）の過剰発現とも見なされる。過剰発現は、当業者に既知の任意の方法によって達成することができる。概して、それは、遺伝子の転写／翻訳を増加させることによって、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることによって、または調節配列もしくは遺伝子の発現に関連する部位を変更もしくは修飾することによって達成することができる。例えば、遺伝子は、高い発現レベルを達成するために、強いプロモーターに作動可能に連結させることができる。そのようなプロモーターは、内因性プロモーターまたは異種プロモーター、特に組換えプロモーターであり得る。あるプロモーターを、遺伝子の発現を増加させる異種プロモーターで置き換えることができる。さらに、誘導性プロモーターの使用は、培養の過程において発現を増加させることを可能にする。その上、過剰発現は、例えば、特定の遺伝子の染色体位置を改変すること、リボソーム結合部位または転写ターミネーターなどの特定の遺伝子に隣接する核酸配列を変更すること、オープンリーディングフレームにフレームシフトを導入すること、遺伝子の転写および／もしくは遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、抑圧遺伝子、エンハンサー、転写活性因子など）を修飾すること、または当技術分において特定の遺伝子ルーチンの発現を調節解除する任意の他の従来の手段（例えば、これらに限定されるわけではないが、例えば、リプレッサータンパク質の発現を妨げるための、アンチセンス核酸分子の使用、または過剰発現することが望ましい遺伝子の発現を通常は抑制する転写因子のための遺伝子を欠失または変異させること）によっても達成することができる。ｍＲＮＡの寿命を延ばすことは、発現のレベルも向上させ得る。例えば、ある特定のターミネーター領域は、ｍＲＮＡの半減期を延ばすために使用され得る。遺伝子の複数のコピーが含まれる場合、遺伝子は、可変コピー数のプラスミドに位置され得るか、または染色体に統合され増幅され得る。１つまたは複数の遺伝子またはゲノム配列を発現のための宿主細胞に導入することは可能である。
特定の実施形態により、ＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１細胞あたり１つのコピーまたは複数のコピーに存在することができる。コピーは、お互いに隣接している場合もあれば、離れている場合もある。別の特定の実施形態により、ＡＤＨ２タンパク質の過剰発現は、１細胞あたり１つのコピーまたは複数のコピーにおいて、宿主細胞のゲノムへの統合（すなわち、ノックイン）にとって好適な１つまたは複数のプラスミド上において提供されるＡＤＨ２タンパク質をコードする組換えヌクレオチド配列を用いる。コピーは、お互いに隣接している場合もあれば、離れている場合もある。過剰発現は、ポリヌクレオチドの複数のコピー、例えば、１宿主細胞あたりポリヌクレオチドの２、３、４、５、６、またはそれ以上のコピーを発現させることによって達成することができる。
ＧＯＩとＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）とを含む組換えヌクレオチド配列は、１つまたは複数の自己複製プラスミド上において提供され得、１細胞あたり１つのコピーまたは複数のコピーに導入され得る。
あるいは、ＧＯＩとＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）とを含む組換えヌクレオチド配列は、同じプラスミド上に存在し得、１細胞あたり１つのコピーまたは複数のコピーに導入され得る。
ＡＤＨ２タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチド（遺伝子）または、ＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）を含む異種組換え発現構築物は、好ましくは、宿主細胞のゲノムに統合される。
用語「ゲノム」は、一般的に、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）においてコードされる有機体の遺伝子情報全体を意味する。それは、染色体上、プラスミドまたはベクター上、またはその両方に存在し得る。好ましくは、ＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）は、細胞の染色体に統合される。
ＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）は、その天然の遺伝子座に統合され得る。「天然の遺伝子座」は、特定の染色体上の位置を意味し、その場合、ＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）は、天然に存在する野生型細胞に位置される。しかしながら、別の実施形態において、ＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）は、それらの天然の遺伝子座においてではなく宿主細胞のゲノムに存在するが、異所的に統合される。用語「異所的統合（ｅｃｔｏｐｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」は、その通常の染色体座以外の部位における微生物のゲノムへの核酸の挿入、すなわち、所定のまたはランダムな統合を意味する。別の実施形態において、ＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）は、天然の遺伝子座に異所的に統合される。異種組換えは、ランダムなまたは非標的化統合を達成するために使用することができる。異種組換えは、著しく異なる配列を有するＤＮＡ分子の間の組換えを意味する。
酵母細胞の場合、ＡＤＨ２タンパク質および／またはＧＯＩをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）は、所望の遺伝子座、例えば、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＥＮＯ１、ＴＥＦ、ＨＩＳ４（Ｚａｍｉｒら， Ｐｒｏｃ． ＮａｔＬ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８１） ７８（６）：３４９６～３５００）、ＨＯ（Ｖｏｔｈら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００１ Ｊｕｎｅ １５； ２９（１２）： ｅ５９）、ＴＹＲ１（Ｍｉｒｉｓｏｌａら， Ｙｅａｓｔ ２００７； ２４： ７６１－７６６）、Ｈｉｓ３、Ｌｅｕ２、Ｕｒａ３（Ｔａｘｉｓら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （２００６） ４０：７３～７８）、Ｌｙｓ２、ＡＤＥ２、ＴＲＰ１、ＧＡＬ１、ＡＤＨ１など、に挿入され得るか、または５ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の統合において挿入され得る。
他の実施形態において、ＡＤＨ２タンパク質および／またはＧＯＩをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）は、プラスミドまたはベクターに統合することができる。好ましくは、プラスミドは、真核生物発現ベクター、好ましくは、酵母発現ベクターである。好適なプラスミドまたはベクターは、本明細書において詳細に説明される。
組換え宿主細胞における内因性または異種ポリヌクレオチドの過剰発現は、発現制御配列を改変することによって達成することができる。発現制御配列は、当技術分野において既知であり、その例としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ならびに宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現を提供する同様のものが挙げられる。発現制御配列は、特に、転写に関与する細胞タンパク質と相互作用する。例示的発現制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０）に記載される。
好ましい実施形態において、過剰発現は、ポリヌクレオチドを発現させるためにエンハンサーを使用することによって達成される。転写エンハンサーは、方向および位置に比較的左右されず、イントロン内ならびにコード配列自体内において、転写単位に対して５’および３’側に見出される。エンハンサーは、コード配列に対して位置５’または３’において発現ベクターに挿入され得るが、好ましくは、プロモーターからの部位５’に位置される。ほとんどの酵母遺伝子は、１つのみのＵＡＳを含み、それは、概して、キャップ部位の数百の塩基対内にあり、ほとんどの酵母エンハンサー（ＵＡＳ）は、プロモーターの３’に位置された場合に機能することができないが、高等真核生物におけるエンハンサーは、プロモーターの５’および３’の両方において機能することができる。
多くのエンハンサー配列が、哺乳類遺伝子によって知られている（グロビン、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＥＭＣ、エラスターゼ、アルブミン、ａ－フェトプロテイン、およびインスリン）。真核細胞ウイルス由来のエンハンサー、例えば、ＳＶ４０後期エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーなど、も使用してもよい。
詳細には、本明細書において説明されるようなポリヌクレオチド（遺伝子）をコードするＧＯＩおよび／またはＡＤＨ２は、宿主細胞における発現を提供する転写調節配列および翻訳調節配列に作動可能に連結される。用語「転写調節配列」は、本明細書に使用される場合、遺伝子核酸配列に付随し、遺伝子の翻訳を調節する、ヌクレオチド配列を意味する。転写および／または翻訳調節配列は、プラスミドまたはベクターに位置され得るか、または宿主細胞の染色体に統合され得る。転写および／または翻訳調節配列は、それが調節する遺伝子の同じ核酸分子に位置される。
詳細には、ＡＤＨ２タンパク質の過剰発現は、当技術分野において既知の方法、例えば、Ｍａｒｘら， ２００８ （Ｍａｒｘ， Ｈ．， Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ， Ｄ． ａｎｄ Ｓａｕｅｒ， Ｍ． Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ７ （２００８）： ２３）によって説明されるように、それらの内因性調節領域を遺伝子修飾することによって達成することができ、そのような方法は、例えば、遺伝子の発現を増加させる組換えプロモーターの統合を含む。
例えば、組換え宿主細胞における内因性または異種ポリヌクレオチドの過剰発現は、そのような発現を制御するプロモーターを改変すること例えば、高い発現レベルを達成するために別のより強力なプロモーターによってポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーター（例えば、内因性プロモーターまたは、野生型有機体のポリヌクレオチドに天然で連結されているプロモーター）を置き換えることによって達成することができる。そのようなプロモーターは、誘導性または構成的であり得る。プロモーターの改変は、当技術分野において既知の変異誘導方法によっても実施され得る。
好ましい実施形態において、ＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＰＯＩをコードするポリヌクレオチドの両方の発現は、誘導性プロモーターによって駆動される。別の好ましい実施形態において、ＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＰＯＩをコードするポリヌクレオチドの両方の発現は、構成的プロモーターによって駆動される。さらなる別の好ましい実施形態において、ＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現は、構成的プロモーターによって駆動され、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドの発現は、誘導性プロモーターによって駆動される。さらなる別の好ましい実施形態において、ＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現は、誘導性プロモーターによって駆動され、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドの発現は、構成的プロモーターによって駆動される。
詳細には、メタノール誘導性プロモーターは、本明細書において詳細に説明されるように、ＡＤＨ２をコードする遺伝子を過剰発現するため、および／またはＧＯＩを発現するために使用される発現構築物において用いられ得る。
一例として、ＡＤＨ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現は、構成的ＧＡＰプロモーターによって駆動され得、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドの発現は、メタノール誘導性ＡＯＸ１またはＡＯＸ２プロモーターによって駆動され得る。
一実施形態において、ＡＤＨ２タンパク質およびＰＯＩをコードするポリヌクレオチドの発現は、プロモーター活性（例えば、プロモーターの強さ）および／または発現挙動（例えば、誘導性であるかまたは構成的であるか）に関して同じプロモーターまたは同じタイプのプロモーターによって駆動される。
本明細書において「過小発現」とも呼ばれる「発現を減少させる」なる用語は、ある特定のポリヌクレオチドの発現を減少させる遺伝子変化の前の宿主細胞であり得るか、そうでなければ、ポリヌクレオチドの発現を下げるように操作されていない同じタイプまたは種の宿主細胞である、参照標準によって示される発現量または発現レベル（例えば、活性または濃度）未満の任意の量またはレベル（例えば、活性または濃度）を意味する。本明細書において説明される発現の減少は、詳細には、定義されたＡＯＸ１タンパク質またはＡＯＸ２タンパク質をコードするポリペプチドまたは遺伝子、特に、操作前の宿主細胞に対して内因性である遺伝子、を意味する。特に、それぞれの遺伝子産物は、本明細書において説明されるような、定義されたＡＯＸ１タンパク質またはＡＯＸ２タンパク質である。遺伝子の発現を減少させるために遺伝子修飾によって宿主細胞を操作する場合、遺伝子産物またはポリペプチドの発現は、宿主細胞の遺伝子修飾の前の同じ遺伝子産物またはポリペプチドの発現未満のレベル、または遺伝子修飾されていない匹敵する宿主における発現未満のレベルにおいてである。「未満」は、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０、９０％、またはそれ以上を含む。遺伝子産物またはポリペプチドの発現がない場合も、用語「発現の減少」または「過小発現」によって包含される。
本明細書において説明される特定の実施形態により、宿主細胞は、ＡＯＸ１タンパク質またはＡＯＸ２タンパク質をコードする内因性宿主細胞遺伝子（本明細書において定義され、例えば、野生型Ｐ．パストリスにおいて天然に存在する配列のホモログまたはオーソログを含む）、または宿主細胞にＡＯＸ１タンパク質もしくはＡＯＸ２タンパク質を発現または産生する能力を与える他の（コードまたは非コード）ヌクレオチド配列を（遺伝子またはその一部の不活性化または欠失のため）ノックダウンまたはノックアウトするように操作される。
詳細には、欠失株が提供され、その場合、ヌクレオチド配列が破壊される。
用語「破壊する（ｄｉｓｒｕｐｔ）」は、本明細書に使用される場合、例えば、ノックダウンまたはノックアウトによる、宿主細胞における１つまたは複数の内因性タンパク質の発現または活性における著しい減少から完全な除去までを意味する。これは、例えば、質量分析法などによって、宿主細胞の細胞培養物または培養培地におけるこの１つまたは複数の内因性タンパク質の存在として測定され得、その場合、内因性タンパク質の全含有量は、閾値未満であり得るか、または検出不可能であり得る。あるいは、それは、内因性タンパク質の酵素活性として測定され得る。
用語「破壊する（ｄｉｓｒｕｐｔ）」は、詳細には、遺伝子サイレンシング、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウト、ドミナントネガティブコンストラクトの送達、条件付き遺伝子ノックアウト、および／または特定の遺伝子に関する遺伝子変化からなる群から選択される少なくとも１つのステップによる遺伝子操作の結果を意味する。
遺伝子発現との関連における用語「ノックダウン」、「減少」、または「欠失」は、本明細書に使用される場合、対照細胞における発現と比較した場合の所定の遺伝子の発現の減少を生じる実験的アプローチを意味する。遺伝子のノックダウンは、様々な実験的アプローチ、例えば、細胞内に核酸分子を導入して遺伝子のｍＲＮＡの一部とハイブリダイズすることによりその劣化を引き起こすことによって（例えば、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ）、または転写の減少、ｍＲＮＡ安定性の低下、ｍＲＮＡ翻訳の減少、またはコードされたタンパク質の活性の低下を生じるような方法において遺伝子の配列を変えることによって、達成することができる。
所定の遺伝子の発現の完全な阻害は、「ノックアウト」と呼ばれる。遺伝子のノックアウトは、遺伝子から機能的転写物は合成されず、それにより、この遺伝子によって通常は提供される機能の欠如が生じる。遺伝子ノックアウトは、ＤＮＡ配列を変更し、それにより、遺伝子またはその調節配列あるいはそのような遺伝子または調節配列の一部の破壊または欠失を生じさせることによって達成される。ノックアウト技術は、重要な部分または遺伝子配列全体を置換する、割り込ませる、または欠失させるための、相同組換え技術の使用、あるいは、Ｇａｊら（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１３；３１（７）：３９７～４０５）によって説明されるような、標的遺伝子のＤＮＡへの二本鎖切断を導入するためのＤＮＡ修飾酵素、例えば、亜鉛フィンガーまたはメガヌクレアーゼなど、の使用を含む。
特定の実施形態は、宿主細胞へと形質転換またはトランスフェクトされる１つまたは複数のノックアウトプラスミドまたはカセットを用いる。相同的組換えにより、宿主細胞における標的遺伝子を破壊することができる。この手順は、典型的には、標的遺伝子の全ての対立遺伝子が安定して除去されるまで繰り返される。
本明細書において説明される特定の遺伝子をノックアウトするための特定の１つの方法は、例えば、Ｗｅｎｉｎｇｅｒら（Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１６， ２３５：１３９～４９）において説明されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法である。別の方法としては、例えば、Ｈｅｉｓｓら ２０１３ （Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９７（３）：１２４１～９．）によって説明されるスプリットマーカー法が挙げられる。
別の実施形態は、宿主細胞をトランスフェクトするために低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用し、宿主細胞によって内因的に発現される標的タンパク質をコードするｍＲＮＡを標的化することによる、標的ｍＲＮＡの劣化を意味する。
遺伝子の発現は、遺伝子発現に直接干渉する方法、例えば、これらに限定されるわけではないが、例えば、特定のプロモーター関連リプレッサーの使用、所定のプロモーターの部位特異的変異誘発、プロモーター交換、または翻訳の阻害または減少、例えば、ＲＮＡｉまたは非コードＲＮＡ誘導の転写後遺伝子サイレンシング、によるＤＮＡ転写の阻害または減少など、によって阻害または減少され得る。活性の低下した機能不全または不活性な遺伝子産物の発現は、例えば、コード遺伝子内の部位特異的またはランダムな変異誘発、挿入、または欠失によって達成することができる。
遺伝子産物の活性の阻害または低下は、例えば、タンパク質発現の前または同時におけるそれぞれの酵素への阻害剤の投与またはそれを用いたインキュベーションによって達成することができる。そのような阻害剤の例としては、これらに限定されるわけではないが、阻害性ペプチド、抗体、アプタマー、酵素に対する融合タンパク質もしくは抗体模倣物、またはそのリガンドもしくは受容体、または阻害性ペプチドもしくは核酸または同様の結合活性を有する小分子が挙げられる。
遺伝子サイレンシング、遺伝子ノックダウン、および遺伝子ノックアウトは、遺伝子修飾、またはｍＲＮＡ転写または遺伝子のどちらかに対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた処理のどちらかによって、遺伝子の発現を減少させる技術を意味する。ＤＮＡの遺伝子修飾が為される場合、結果は、ノックダウンまたはノックアウトされた有機体である。ｍＲＮＡに結合した、または遺伝子に一時的に結合したオリゴヌクレオチドによって、遺伝子発現における変化が引き起こされる場合、これは、結果として、染色体ＤＮＡの修飾なしに遺伝子発現における一時的な変化を生じ、それは、一時的ノックダウンと呼ばれる。
上記の用語に包含される一時的ノックダウンにおいて、活性遺伝子またはその転写物に対するこのオリゴヌクレオチドの結合は、転写のブロッキングによる発現の減少（遺伝子結合の場合）、ｍＲＮＡ転写物の劣化（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡによる）、またはｍＲＮＡ翻訳のブロッキングを生じる。
遺伝子サイレンシング、ノックダウン、またはノックアウトを実施するための別のアプローチは、それぞれの文献により当業者に既知であり、本発明との関連におけるそれらの適用は、日常的作業と見なされる。遺伝子ノックアウトは、遺伝子の発現を完全に遮断する技術を意味し、すなわち、それぞれの遺伝子は、作動不能であるか、または除去される。この目標を達成する方法論的アプローチは、多種多様であり、当業者に既知である。その例は、所定の遺伝子に対して支配的にネガティブである変異体の生成である。そのような変異体は、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（例えば、欠失、部分欠失、挿入、または核酸の置換）によって、好適なトランスポゾンの使用によって、またはそれぞれの文献から当業者に既知の他のアプローチによって、生成することができ、本発明との関連におけるその適用は、結果として、日常的作業と見なされる。一例は、標的化されたＺｎフィンガーヌクレアーゼの使用によるノックアウトである。それぞれのキットが、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって「ＣｏｍｐｏＺＲ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＺＦＮ」として提供される。別のアプローチは、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＴＡＬＥＮ）の使用を含む。
ドミナントネガティブコンストラクトの送達は、例えば、トランスフェクションによる、機能不全遺伝子発現産物をコードする配列の導入を伴う。コード配列は、機能不全酵素の遺伝子発現が遺伝子発現産物の天然の発現を無効にするような方法において、強力なプロモーターに機能的に結合され、それは、次に、遺伝子発現産物のそれぞれの活性の有効な生理的欠陥を生じる。
条件付き遺伝子ノックアウトは、組織特異的または時間特異的な方法において遺伝子の発現を阻害することを可能にする。これは、例えば、目的の遺伝子の周りにｌｏｘＰ部位と呼ばれる短い配列を導入することによって為される。再び、他のアプローチは、それぞれの文献から当業者に知られており、本発明との関連におけるそれらの適用は、日常的作業と見なされる。
他の１つのアプローチは、機能不全の遺伝子産物または活性の低下した遺伝子産物を生じ得る遺伝子変化である。このアプローチは、フレームシフト変異、ナンセンス変異（すなわち、未成熟終止コドンの導入）、または遺伝子産物全体を機能不全にするかまたは活性低下を引き起こすアミノ酸置換を生じる変異の導入を伴う。そのような遺伝子変化は、例えば、変異誘発（例えば、欠失、部分欠失、挿入、または核酸の置換）、非特異的（ランダムな）変異誘発または部位特異的変異誘発のどちらか、によって生じさせることができる。遺伝子サイレンシング、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウト、ドミナントネガティブコンストラクトの送達、条件付き遺伝子ノックアウト、および／または遺伝子変化の実際の適用について説明するプロトコールは、一般的に、当業者に利用可能であり、彼らの日常的作業の範疇である。本明細書において提供される技術教示は、結果として、遺伝子産物の遺伝子発現の阻害または減少、または機能不全または不活性な、または活性の低下した遺伝子産物の発現を生じる全ての想到される方法に関して完全に有効である。
本明細書において説明される遺伝子修飾は、例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１）によって説明されるような、当技術分野において既知のツール、方法、および技術を用いてもよい。
用語「内因性」は、本明細書において使用される場合、それぞれの内因性遺伝子の発現を減少させるための、および／または、内因性タンパク質の産生を減少させるためのその修飾の前に、野生型（天然）宿主細胞に存在する、それらの分子および配列、特に内因性遺伝子またはタンパク質を包含することが意図される。特に、本来それらが見出されるような特定の宿主細胞において生じる（および、それらから得ることができる）内因性核酸分子（例えば、遺伝子）またはタンパク質は、「宿主細胞内因性」または「宿主細胞に対して内因性」であると理解される。その上、核酸またはタンパク質「を内因的に発現する」細胞は、本来それらが見出されるような同じ特定のタイプの宿主が発現するのと同様に、その核酸またはタンパク質を発現する。その上、核酸、タンパク質、または他の化合物を「内因的に産生する（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）」または「内因的に産生する（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｓ）」宿主細胞は、本来それらが見出されるような同じ特定のタイプの宿主細胞が産生するのと同様に、その核酸、タンパク質、または化合物を産生する。
したがって、内因性タンパク質が、宿主細胞によってそれ以上産生されなくても、例えば、タンパク質をコードする遺伝子が不活性化または欠失されている宿主細胞のノックアウト変異体においてタンパク質は、本明細書において依然として、「内因性」と呼ばれる。
用語「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」は、ヌクレオチド配列、コンストラクト、例えば、発現カセットなど、アミノ酸配列、またはタンパク質に関して本明細書において使用される場合、所定の宿主細胞に対して外来性であるような、すなわち、本来宿主細胞において見出されないような「外因性」化合物、または所定の宿主細胞において天然に見出されるような、例えば、「内因性」であるが、ただし、異種コンストラクトに関連して、であるような、または、例えば、内因性核酸に融合されるかもしくはそれと併用される異種核酸を用い、それによりコンストラクトを異種にすることにより、そのような異種コンストラクトに組み込まれるような、化合物を意味する。内因的に見出される異種ヌクレオチド配列は、細胞において、非天然の量、例えば、予想を超える量、または天然に見出される量を超える量、においても産生され得る。異種ヌクレオチド配列、または異種ヌクレオチド配列を含む核酸は、おそらく、内因性ヌクレオチド配列とは配列が異なっているが、内因的に見出されるのと同じタンパク質をコードする。詳細には、異種ヌクレオチド配列は、本来、宿主細胞に対して同じ関係においては見出されないものである。任意の組換えまたは人工ヌクレオチド配列が、異種であると理解される。異種ポリヌクレオチドの例は、例えば、ハイブリッドプロモーターを得るためのプロモーターに天然には付随しないヌクレオチド配列であるか、または本明細書において説明されるように、コード配列に作動可能に連結したヌクレオチド配列である。結果として、ハイブリッドポリヌクレオチドまたはキメラポリヌクレオチドが得られ得る。異種化合物のさらなる例は、転写制御因子、例えば、内因性の天然に存在するＰＯＩコード配列が通常は作動可能に連結しないプロモーター、に作動可能に連結したポリヌクレオチドをコードするＰＯＩである。
用語「作動可能に連結された」は、本明細書に使用される場合、１つまたは複数のヌクレオチド配列の機能が、核酸分子上に存在する少なくとも１つの他のヌクレオチド配列によって影響されるような方法での、単一の核酸分子、例えば、ベクター、または発現カセット、上でのヌクレオチド配列の結合を意味する。作動可能に連結することにより、核酸配列は、同じ核酸分子上の別の核酸配列との機能的関係内に置かれる。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に作用することができる場合、組換え遺伝子のコード配列に作動可能に連結される。さらなる例として、シグナルペプチドをコードする核酸は、分泌形態、例えば、成熟タンパク質のプレフォームまたは成熟タンパク質、においてタンパク質を発現することができる場合、ＰＯＩをコードする核酸配列に作動可能に連結される。詳細には、お互いに作動可能に連結されるそのような核酸は、直ちに、すなわち、シグナルペプチドをコードする核酸とＰＯＩをコードする核酸配列との間にさらなる要素または核酸配列なしに、連結され得る。
用語「メチロトローフ酵母」は、本明細書に使用される場合、それらの増殖のために単一の炭素源としてメタノールの使用を可能にする共通の代謝経路を共有する酵母の属および種を意味する。メタノール誘導に対する転写調節された反応において、いくつかの酵素は、高いレベルにおいて急速に合成される。これらの遺伝子の発現を制御するプロモーターは、中でも最も強力で最も厳密に酵母プロモーターを調節するため、メチロトローフ酵母は、組換えタンパク質の大規模生産のための宿主として魅力的である。
本明細書において説明されるメチロトローフ酵母は、それをメタノール利用経路において不十分にさせる１つまたは複数の遺伝子修飾によって、特に、内因性ＡＯＸ１タンパク質またはＡＯＸ２タンパク質をそれぞれコードする遺伝子の一方または両方を過小発現させることによって、変異される。ＡＯＸ１タンパク質をコードする遺伝子およびＡＯＸ２タンパク質をコードする遺伝子の両方を過小発現するか、そうでなければ、その発現を欠損するメチロトローフ酵母は、本明細書において、「Ｍｕｔ－」として理解される。本明細書において説明される目的のために、そのようなＭｕｔ－酵母は、依然として、「メチロトローフ酵母」と呼ばれるが、それは、そのような遺伝子修飾の前に、機能的メタノール利用経路を含むためである。
「プロモーター」配列は、典型的には、プロモーターがコード配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結されると理解される。プロモーター配列が、天然においてコード配列に付随しない場合、その転写は、天然（野生型）細胞においてプロモーター制御されないか、または、配列は、異なる連続した配列によって組み換えられる。
本明細書において説明される目的のために使用されるプロモーターは、本明細書において「ＥＣＰ」と呼ばれる。ＥＣＰは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または抑制性プロモーターであり得る。特定の実施形態において、ＥＣＰは、それぞれ、メタノールおよびメタノール炭素源によって誘導可能なプロモーターである。
本明細書において説明されるＥＣＰは、特に、ＤＮＡをコードするＰＯＩの発現を開始するか、調節するか、そうでなければ、媒介するかまたは制御する。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子または異なる遺伝子由来であってもよく、同じ有機体または異なる有機体由来であってもよい。
本明細書において説明される誘導性ＥＣＰは、詳細には、抑制された状態および誘導された状態において異なるプロモーター強度を有する、調節可能なプロモーターであるとして理解される。用語「調節可能な（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ）」は、誘導性または抑制性調節要素、例えば、本明細書において説明されるプロモーターなど、に関して、例えば、バッチ培養の増殖段階などにおいて、過剰量の物質（例えば、細胞培養培地における栄養素など）の存在下の宿主細胞において抑制され、流加バッチ戦略に従って、例えば、産生段階（例えば、補助基質の供給またはメタノール誘導のためのメタノールの追加の際など）において、強力な活性を誘導するように抑制解除される、要素を意味するものである。さらに、調節要素は、調節可能に設計することができ、それにより、要素は、細胞培養添加剤の添加なしに不活性であり、そのような添加剤の存在下で活性である。したがって、そのような調節要素の制御下でのＰＯＩの発現は、そのような添加剤の添加において誘導することができる。
ＥＣＰの強度は、詳細には、その転写強度を意味し、高いまたは低い頻度でそのプロモーターにおいて生じる転写の開始の効率によって表される。転写強度が高いほど、より多い頻度において、そのプロモーターにおいて転写が生じるであろう。プロモーター強度は、プロモーターの典型的な特徴であり、というのも、それは、所定のｍＲＮＡ配列がどの程度の頻度で転写されるかを決定し、実質的に、転写に関していくつかの遺伝子に他の遺伝子よりも高い優先度を与え、それは、転写のより高い濃度につながるからである。例えば、大量に必要とされるタンパク質をコードする遺伝子は、典型的には、比較的強力なプロモーターを有する。ＲＮＡポリメラーゼは、一度に１回しか転写タスクを実行できず、そのため、効率的であるために、その仕事を優先させなければならない。プロモーター強度の差は、この優先順位付けを考慮に入れて選択される。
強力なＥＣＰ、特に、完全に誘導された状態、典型的には、ほぼ最大活性の状態として理解される状態、において比較的強いＥＣＰ、は、本明細書において好ましい。相対強度は、一般的に、匹敵するプロモーターに対して特定され、プロモーターは、本明細書において基準プロモーターと呼ばれ、標準プロモーター、例えば、宿主細胞として使用される細胞のそれぞれのｐＧＡＰプロモーターなど、であり得る。
転写の頻度は、一般的に、転写率として理解され、それは、例えば、好適なアッセイ、例えば、ＲＴ－ＰＣＲまたはノーザンブロット法など、での転写の量によって特定される。例えば、本発明によるプロモーターの転写強度は、Ｐ．パストリスである宿主細胞において、Ｐ．パストリスの天然ｐＧＡＰプロモーターと比較することにより特定される。
目的の遺伝子を発現するプロモーターの強度は、一般的に、発現強度または高い発現レベル／率を支持する能力として理解される。例えば、本発明のプロモーターの発現強度および／または転写強度は、Ｐ．パストリスである宿主細胞において、Ｐ．パストリスの天然ｐＧＡＰプロモーターと比較することにより特定される。
基準プロモーターと比較する比較転写強度は、標準的な方法によって、例えば、転写の量を、例えば、マイクロアレイを用いて測定することによって、または細胞培養において、例えば、組換え細胞におけるそれぞれの遺伝子発現産物の量を測定することによって、特定され得る。特に、転写率は、マイクロアレイにおける転写強度、ノーザンブロット法、または定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、またはデータが、高増殖率の状態と、低増殖率の状態、または異なる培地組成を用いた状態との間の発現レベルの差と、基準プロモーターと比較した場合の高いシグナル強度とを示す、ＲＮＡ配列決定法（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を用いて、によって特定され得る。
発現率は、例えば、リポーター遺伝子、例えば、ｅＧＦＰの発現の量によって特定され得る。
本明細書において説明されるＥＣＰは、例えば、「相同ｐＧＡＰプロモーター（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐＧＡＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」とも呼ばれる、宿主細胞における天然ｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１５％の転写率または転写強度によって反映される、比較的高い転写強度を発揮する。好ましくは、転写率または転写強度は、天然ｐＧＡＰプロモーターと比較した場合に、例えば、ＰＯＩを産生する組換え目的のために宿主細胞として選択された（真核生物）宿主細胞において特定した場合に、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、またはそれ以上のうちの少なくともいずれか、例えば、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、または２００％、またはそれ以上のうちの少なくともいずれかである。
天然ｐＧＡＰプロモーターは、典型的には、ほとんどの生物中に存在する構成的プロモーターであるグリセロアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードするＧＡＰ遺伝子の発現を開始させる。解糖および糖新生の鍵酵素であるＧＡＰＤＨ（ＥＣ１．２．１．１２）は、異化作用および同化作用の糖質代謝において決定的な役割を果たす。
天然ｐＧＡＰプロモーターは、詳細には、未修飾（非組換え）または組換え真核細胞を含む、同じ種または株の天然真核細胞と同様に、組換え真核細胞において活性である。そのような天然ｐＧＡＰプロモーターは、一般的に、内因性プロモーターであると理解され、したがって、宿主細胞に対して相同であり、比較目的のための標準または基準プロモーターとして機能し得る。本明細書において説明されるプロモーターの相対発現強度または転写強度は、通常、ＰＯＩを産生するための宿主として使用される同じ種または株の天然ｐＧＡＰプロモーターと比較される。
用語「変異誘発」は、本明細書において使用される場合、非コード領域またはコード領域に少なくとも１つの変化を有するそのバリアントを得るために、例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換によって、ヌクレオチド配列の変異体を提供する方法を意味するものである。変異誘発は、ランダムな、セミランダムな、または部位特異的な変異によって為され得る。バリアントは、基準として親配列を使用する好適な変異誘発方法によって作製することができる。ある特定の変異誘発方法は、核酸を操作する方法、または、テンプレートとしてそれぞれの親配列情報を使用してヌクレオチド配列をデノボ合成する方法を含む。特定の変異誘発方法は、変異体の合理的な操作を適用する。
本明細書に使用される用語「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかを意味する。「核酸配列」または「ポリヌクレオチド配列」または単に「ポリヌクレオチド」は、５’から３’末端へと読まれるデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。それは、発現カセット、自己複製プラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマー、および非機能的ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
用語「目的のタンパク質（ＰＯＩ）」は、本明細書に使用される場合、宿主細胞において組換え技術によって作製されたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。より詳細には、タンパク質は、宿主細胞において天然には存在しないポリペプチド、すなわち、異種タンパク質、であり得るか、または宿主細胞に対して天然であり得、すなわち、宿主細胞に対して相同なタンパク質であり得るが、しかし、例えば、ＰＯＩをコードする核酸配列を含む自己複製ベクターによる形質転換によって、または統合の際に、宿主細胞のゲノム中へＰＯＩをコードする核酸配列の１つまたは複数のコピーの組換え技術によって、または例えば、プロモーター配列の、ＰＯＩをコードする遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列の組換え改変によって、産生される。場合によって、用語ＰＯＩは、本明細書において使用される場合、組換え的に発現されたタンパク質によって媒介されるような宿主細胞による任意の代謝産物も意味する。
親ヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較したときのバリアント、ホモログ、またはオーソログの「配列同一性」なる用語は、２つ以上の配列の同一性の程度を示す。２つ以上のアミノ酸配列は、対応する位置において同じアミノ酸残基または保存されたアミノ酸残基を、ある程度、最高で１００％まで有し得る。２つ以上のヌクレオチド配列は、対応する位置において同じ塩基対または保存された塩基対を、ある程度、最高で１００％まで有し得る。
配列類似性検索は、過剰な（例えば、少なくとも５０％の）配列同一性を有するホモログを特定するために、有効で信頼できる戦略である。頻繁に使用される配列類似性検索ツールは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＨＭＭＥＲである。
配列類似性検索は、過剰な類似性、および共通の祖先を反映する統計的に有意な類似性を検出することによって、そのような相同タンパク質または遺伝子を特定することができる。ホモログは、オーソログを包含し得、それらは、本明細書において、異なる有機体における同じタンパク質、例えば、異なる有機体または種におけるそのようなタンパク質のバリアント、として理解される。
異なる有機体または種における同じタンパク質のオーソロガス配列は、典型的には、タンパク質配列に対して、詳細には、同じ属由来のオーソログの配列に対して、相同である。典型的には、オーソログは、約２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性、最高で１００％の配列同一性のうちの少なくともいずれかを有する。
詳細には、タンパク質のオーソログは、ノックアウト宿主細胞におけるオーソロガス配列によって、タンパク質またはタンパク質をコードする遺伝子の置換において特定することができ、この場合、宿主細胞は、そのような置換の前に、それぞれの遺伝子またはタンパク質をノックアウトするために改変されている。
例えば、想定されるＡＤＨ２、ＡＯＸ１、またはＡＯＸ２タンパク質が、Ｐ．パストリス宿主細胞において機能的であり、そのような内因性タンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされているＰ．パストリス宿主細胞のそれぞれの内因性タンパク質に取って代わる場合、そのような想定されるＡＤＨ２、ＡＯＸ１、またはＡＯＸ２タンパク質は、本明細書において説明される目的に対して、それぞれホモログと見なすことができる。
配列番号１として特定されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるＡＯＸ１タンパク質は、Ｋ．ファフィ起源である。他のメチロトローフ酵母宿主細胞に存在する相同配列が存在することは、よく理解される。例えば、ピキア・パストリスの酵母は、それぞれの相同配列を含む。ピキア・パストリスは、新属であるコマガタエラに分類し直されており、３つの種Ｋ．パストリス、Ｋ．ファフィ、およびＫ．シュードパストリスに分けられる。
配列番号１の特定の相同配列は、例えば、Ｋ．パストリス（例えば、配列番号９、例えば、配列番号１０を含むかまたはそれからなるヌクレオチド配列によってコードされる）、オガタエア・ポリモルファ（例えば、配列番号１９、例えば、配列番号２０を含むかまたはそれからなるヌクレオチド配列によってコードされる）、またはオガタエア・メタノリカ（例えば、配列番号１３、例えば、配列番号１４を含むかまたはそれからなるヌクレオチド配列によってコードされる）に見出される。
配列番号３として特定されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＯＸ２タンパク質は、Ｋ．ファフィ起源である。他のメチロトローフ酵母宿主細胞に存在する相同配列が存在することは、よく理解される。例えば、ピキア・パストリスの酵母は、それぞれの相同配列を含む。ピキア・パストリスは、新属であるコマガタエラに分類し直されており、３つの種Ｋ．パストリス、Ｋ．ファフィ、およびＫ．シュードパストリスに分けられる。
配列番号３の特定の相同配列は、例えば、Ｋ．パストリス（例えば、配列番号１１、例えば、配列番号１２を含むかまたはそれからなるヌクレオチド配列によってコードされる）、オガタエア・ポリモルファ（例えば、配列番号１９、例えば、配列番号２０を含むかまたはそれからなるヌクレオチド配列によってコードされる）、またはオガタエア・メタノリカ（例えば、配列番号１５，例えば、配列番号１６を含むかまたはそれからなるヌクレオチド配列によってコードされる）、に見出される。
オガタエア・ポリモルファは、本明細書において配列番号１９によって例示された、１つのアルコールオキシダーゼしか有していない。したがって、本明細書において説明されるようなオガタエア・ポリモルファにおけるＡＯＸ１およびＡＯＸ２の発現の減少は、オガタエア・ポリモルファの内因性アルコールオキシダーゼの発現を減少させることによって、効果的に実施される。
本明細書において説明されるある特定の配列同一性を有するＡＯＸ１またはＡＯＸ２タンパク質、特に、Ｐ．パストリスＡＯＸ１またはＡＯＸ２タンパク質のオーソログである任意のそのようなタンパク質、の任意の相同配列は、本明細書において説明されるように、それぞれＡＯＸ１タンパク質またはＡＯＸ２タンパク質の定義に含まれる。
配列番号５０として特定されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＤＨ２タンパク質は、Ｋ．ファフィ起源である。他のメチロトローフ酵母宿主細胞に存在する相同配列が存在することは、よく理解される。例えば、ピキア・パストリスの酵母は、それぞれの相同配列を含む。ピキア・パストリスは、新属であるコマガタエラに分類し直されており、３つの種Ｋ．パストリス、Ｋ．ファフィ、およびＫ．シュードパストリスに分けられる。
配列番号５０の特定の相同配列は、例えば、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のいずれかである。
本明細書において説明されるある特定の配列同一性を有するＡＤＨ２タンパク質の任意の相同配列、特に、本明細書において説明されるような、Ｐ．パストリスＡＤＨ２タンパク質のオーソログである任意のそのようなタンパク質。
本明細書において説明されるアミノ酸配列、ホモログ、およびオーソログに関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部と見なさず、最大パーセント配列同一性を達成するために配列を整列させ、必要であればギャップを導入した後の、特定のポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
本明細書において説明される目的のために、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性が、以下の例示的パラメータ：Ｐｒｏｇｒａｍ：ｂｌａｓｔｐ、Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：６、Ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ：１０、Ｈｉｔｌｉｓｔ ｓｉｚｅ：１００、Ｇａｐｃｏｓｔｓ：１１．１、Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｆｉｌｔｅｒ ｓｔｒｉｎｇ：Ｆ、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ、による、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラム バージョンＢＬＡＳＴＰ ２．８．１を使用して決定される。
例えば、プロモーターまたは遺伝子のヌクレオチド配列に関する「パーセント（％）同一性」は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部と見なさない、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列を整列させ、必要であればギャップを導入した後の、ＤＮＡ配列におけるヌクレオチドと同一である、候補ＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの割合として定義される。パーセントヌクレオチド配列同一性を特定する目的のためのアラインメントは、当技術分野における技能の範囲内の様々な方法において、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
本明細書において説明される目的のために（特に明記されない限り）、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性は、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラム バージョンＢＬＡＳＴＮ ２．８．１を使用して、以下の例示的パラメータ：Ｐｒｏｇｒａｍ：ｂｌａｓｔｎ、Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：１１、Ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０、Ｈｉｔｌｉｓｔ ｓｉｚｅ：１００、Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ：５．２、Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｓｃｏｒｅｓ：２，－３、Ｆｉｌｔｅｒ ｓｔｒｉｎｇ：Ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｒｅｇｉｏｎｓ、Ｍａｒｋ ｆｏｒ ｌｏｏｋｕｐ ｔａｂｌｅ ｏｎｌｙ、を使用して決定される。
用語「単離された」または「単離」は、ＰＯＩに関して本明細書において使用される場合、「精製された」または「十分に純粋な」形態において存在するように、天然において関連する環境から十分に分離されているそのような化合物、特に細胞培養上清、を意味するものである。しかし、「単離された」は、他の化合物または材料との人工混合物または合成混合物、または基本的な活性を妨げず、例えば、不完全な精製により存在し得る不純物の存在の排除、を必ずしも意味するわけではない。単離された化合物は、その調合薬を製造するためにさらに製剤化することができ、さらに、実用目的のために、単離することもでき、例えば、ＰＯＩは、診断または治療において使用される場合、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合することができる。
用語「精製された」は、本明細書において使用される場合、少なくとも５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の化合物（例えば、ＰＯＩ）を含む調製物を意味するものである。純度は、化合物にとって適切な方法によって測定される（例えば、クロマトグラフ法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ分析など）。本明細書において説明される、単離され精製されたＰＯＩは、不純物を減少させるために細胞培養上清を精製することによって得られ得る。
組換えポリペプチドまたはタンパク質産物を得るための単離方法および精製方法として、溶解度の違いを利用する方法、例えば、塩析および溶媒沈殿など、分子量の違いを利用する方法、例えば、限外ろ過およびゲル電気泳動法など、電荷の違いを利用する方法、例えば、イオン交換クロマトグラフィなど、特異的親和性を利用する方法、例えば、親和クロマトグラフィなど、疎水性の違いを利用する方法、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィなど、ならびに等電点の違いを利用する方法、例えば、等電焦点法など、が使用され得る。
以下の標準的方法が好ましい：精密ろ過、接線流フィルタ（ＴＦＦ）、または遠心分離法、沈殿または熱処理によるＰＯＩ精製、酵素消化物によるＰＯＩ活性化、クロマトグラフィによるＰＯＩ精製、例えば、イオン交換（ＩＥＸ）など、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、親和クロマトグラフィ、サイズ排除（ＳＥＣ）またはＨＰＬＣクロマトグラフィ、濃縮物のＰＯＩ沈殿、および限外ろ過ステップによる洗浄、による、細胞（デブリ）分離および洗浄。
非常に精製された産物は、本質的に混在タンパク質を含まず、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％、最高で１００％までの純度を有する。精製された産物は、細胞培養上清または細胞残屑の精製によって得られ得る。
単離および精製されたＰＯＩは、従来の方法、例えば、ウエスタンブロット、ＨＰＬＣ活性アッセイ、またはＥＬＩＳＡなど、によって特定することができる。
用語「組換え」は、本明細書において使用される場合、遺伝子操作によって調製されること、またはその結果を意味するものである。組換え宿主は、１つまたは複数のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を欠失および／または不活性化するように操作され得、詳細には、組換え核酸配列を含む発現ベクターまたはクローニングベクターを含み得、特に、宿主に対して外来性のヌクレオチド配列を用いる。組換えタンパク質は、宿主においてそれぞれの組換え核酸を発現させることによって産生される。ＰＯＩに関する用語「組換え」は、本明細書において使用される場合、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されるＰＯＩ、例えば、ＰＯＩを発現するように形質転換された宿主細胞から単離されたＰＯＩなど、を含む。本発明に従って、当技術分野の技能内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を用いてもよい。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，（１９８２）を参照されたい。
ある特定の組換え宿主細胞は、「操作された」宿主細胞であり、それは、遺伝子工学を使用して、すなわち、人間の介入によって、取り扱われた宿主細胞として理解される。宿主細胞が、所定の遺伝子またはそれぞれのタンパク質の発現を減少させるように、または過小発現するように操作される場合、宿主細胞は、取り扱う前の宿主細胞と同じ条件下において比較して、または遺伝子またはタンパク質が過小発現されるように操作されていない宿主細胞と比較して、宿主細胞がもはや、それぞれ、そのような遺伝子およびタンパク質を発現する能力を有しないように取り扱われる。
前述の説明は、後述の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。ただし、そのような実施例は、本発明の１つまたは複数の実施形態を実践する方法の単なる例示であり、本発明の範囲の限定として読まれるべきではない。
実施例１：ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のメタノール利用陰性株の生成
メタノール利用陰性株（Ｍｕｔ－）を生成するため、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２と名付けられたメタノール利用を担う２つの遺伝子をピキア・パストリス（コマガタエラ酵母（ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）と同義）のゲノムから欠失させた。
ａ）このため、Ｐ．パストリス株（ＣＢＳ２６１２、ＣＢＳ－ＫＮＡＷ Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をエレクトロコンピテントにした。株を１００ｍＬのＹＰＤ培地（本培養）中に１６～２０時間（２５℃；１８０ｒｐｍ）接種し、光学濃度（ＯＤ６００）１．８～３で、遠心分離（５分；１５００ｇ；４℃）によって２つの５０ｍＬファルコンチューブに回収した。細胞ペレットを、１０ｍＬのＹＰＤ＋２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋２５ｍＭ ＤＴＴに再懸濁し、インキュベートした（３０分；２５℃；１８０ｒｐｍ）。インキュベーション期間後、ファルコンチューブを４０ｍＬの氷冷した滅菌蒸留水で満たし、遠心分離した（５分；１５００ｒｐｍ；４℃）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。細胞ペレットを、氷冷した滅菌１ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ｐＨ８に再懸濁し、遠心分離した（５分；１５００ｇ；４℃）。細胞ペレットを４５ｍＬの氷冷した１Ｍソルビトールに再懸濁し、遠心分離した（５分；１５００ｇ；４℃）。ペレットを、５００μＬの氷冷した１Ｍソルビトールに再懸濁し、８０μＬを氷冷した１．５ｍＬエッペンドルフチューブにアリコートした。アリコートしたエレクトロコンピテントな細胞を使用まで－８０℃で保存した。
ｂ）酵母株の培養は、選択が必要な場合には５００μｇ／ｍＬのジェネテシンまたは２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有するＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのペプトン、２０ｇ／Ｌのグルコース）またはＹＰＤアガープレート（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのペプトン、２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのアガー－アガー）で行った。
ｃ）ＡＯＸ１およびＡＯＸ２の欠失株を生成するため、スプリットマーカーカセットアプローチを使用した（Ｇａｓｓｅｒら，２０１３）。遺伝子欠失を生成するためのＤＮＡ断片は、表１に見出される。スプリットマーカーカセットは、ＬｏｘＰ部位に隣接したジェネテシンの抗生物質耐性カセットを持つ。
ｄ）欠失は、０．５μｇのＡＯＸ１スプリットマーカーカセット１および０．５μｇのＡＯＸ１スプリットマーカーカセット２を添加することによって行い、エレクトロコンピテントな細胞をアリコートし、氷上で５分間インキュベートした。電気穿孔を２ｋＶで４ミリ秒行った（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，ＵＳＡ）。形質転換後、電気穿孔した細胞を１ｍＬのＹＰＤ培地に再懸濁し、サーモシェーカー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で、７００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で１．５時間～３時間再生させた。その後、２０μＬと１５０μＬの細胞懸濁液を、選択のために５００μｇ／ｍＬのジェネテシンを含有するＹＰＤプレート上に蒔き、４８時間２８℃でインキュベートした。出現したコロニーを、５００μｇ／ｍＬのジェネテシンを含有する新しいＹＰＤプレート上に再ストリークした。ＡＯＸ１遺伝子座の正確な破壊は、欠失カセットの外側に結合するプライマーであるＡＯＸ１＿ｃｔｒｌ＿ＦｗｄおよびＡＯＸ１＿ｃｔｒｌ＿Ｒｅｖ（表２）を使用してゲノムＤＮＡのＰＣＲによって確かめた。１つのクローンを、Ｐ．パストリス ａｏｘ１Δ：：ＫａｎＭＸ株を作製する所望の遺伝子の正確な欠失を確認するＰＣＲ増幅およびＰＣＲアンプリコンのシークエンシングに基づいて選択した。単一の陽性コロニーから液体培養をインキュベートし、本培養を作成するための液体培地中への５００μｇ／ｍＬのジェネテシンの添加以外は、実施例１ａ）で説明したようにエレクトロコンピテントにした。選択のためのＬｏｘＰ領域の間のジェネテシン抗生物質耐性カセットおよびハイグロマイシン耐性カセットの欠失に必要なＣｒｅリコンビナーゼを持つ５００μｇのｐＴＡＣ＿Ｃｒｅ＿Ｈｐｈ＿Ｍｘ４プラスミドを用いて株を電気穿孔した（Ｍａｒｘ，Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，＆Ｓａｕｅｒ，２００８）。記載したように電気穿孔を行い、形質転換体を、５００μｇ／ｍＬのジェネテシンおよび２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含むＹＰＤと２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンのみを含むＹＰＤプレートに並行して再ストリークすることにより、ジェネテシン耐性の欠損を選択した。５００μｇ／ｍＬのジェネテシンおよび２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含むＹＰＤプレートでは増殖することができないが、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンのみを含むＹＰＤプレートでは増殖することができたクローンを選択した。ＡＯＸ１コード領域および抗生物質マーカーの欠失の成功は、プライマーＡＯＸ１＿ｃｔｒｌ＿ＦｗｄおよびＡＯＸ１＿ｃｔｒｌ＿Ｒｅｖ（表２）によるＰＣＲ増幅およびＰＣＲアンプリコンのシークエンシングによって確かめた（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ，Ｓｗｉｓｓ）。生成した株は、Ｐ．パストリスＣＢＳ２６１２ Δａｏｘ１と呼び、ＭｕｔＳ表現型を示す。これを、さらなる遺伝子操作のために選択した。
ｅ）Ｐ．パストリスＣＢＳ２６１２ Δａｏｘ１を使用して、ａ）に記載のプロトコールによりエレクトロコンピテントな細胞を生成し、ｄ）に記載した手順により０．５μｇのＡＯＸ２スプリットマーカーカセット１および０．５μｇのＡＯＸ２スプリットマーカーカセット２（表１）を用いて電気穿孔した。抗生物質マーカーは、ｄ）に記載したのと同じ手順によって除去した。ＡＯＸ２コード領域および抗生物質マーカーの欠失の成功は、プライマーＡＯＸ２＿ｃｔｒｌ＿ｆｗｄ＆ＡＯＸ２＿ｃｔｒｌ＿ｒｅｖ（表２）によるＰＣＲ増幅およびＰＣＲアンプリコンのシークエンシングによって確かめた（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ，Ｓｗｉｓｓ）。生成した株は、Ｐ．パストリスＣＢＳ２６１２ Δａｏｘ１Δａｏｘ２と呼び、メタノール利用陰性（Ｍｕｔ－）表現型を示す。
ｆ）ＰＣＲ増幅のためのゲノムＤＮＡは、製造業者の推奨により、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いて単離した。ＰＣＲ増幅反応は、製造業者の推奨により、Ｑ５ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて行った。
Figure 2022528536000001
Figure 2022528536000002
Figure 2022528536000003
Figure 2022528536000004
実施例２：メタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーター下のＰ．パストリスΔａｏｘ１およびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２による細胞内ｅＧＦＰの産生
タンパク質産生能力およびプロモーター活性を試験するため、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２株およびＰ．パストリスΔａｏｘ１株を、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の発現構築物（表４）により形質転換した。ｅＧＦＰコード配列は、ＰＡＯＸ１：ＰＰ７４３５＿ｃｈｒ４（２３７９４１・・・２３８８９８）の発現制御下にあった。
ａ）発現構築物ＢＢ３ａＮ＿ｐＡＯＸ１＿ＧＦＰ＿ＳｃＣＹＣｔｔを、プラスミドＢＢ１＿１２＿ｐＡＯＸ１，ＢＢ１＿２３＿ｅＧＦＰ，ＢＢ１＿３４＿ＳｃＣＹＣ１ｔｔおよびＢＢ３ａＮ＿１４＊から、記載されたようにＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリー手順（Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒら，２０１７）を使用してアセンブルした。プラスミドおよび配列は、Ｇｏｌｄｅｎ ＰｉＣＳキット＃１００００００１３３（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で入手可能である。電気穿孔の前に、製造業者のプロトコールにより制限酵素ＡｓｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてプラスミドを線状化し、Ｈｉ Ｙｉｅｌｄ（登録商標）Ｇｅｌ／ＰＣＲ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（Ｓｕｄ－Ｌａｂｏｒｂｅｄａｒｆ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。５００ｎｇの線状化したプラスミドは、実施例１ａ）および１ｄ）に先に記載したように、エレクトロコンピテントなＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２およびＰ．パストリスΔａｏｘ１に形質転換した。陽性の形質転換体を、１００μｇ／Ｌのノーセオスリシンを含むＹＰＤで選択し、後のスクリーニング実験に使用した。
ｂ）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２およびＰ．パストリスΔａｏｘ１における細胞内ｅＧＦＰ発現のスモールスケールスクリーニング実験。実施例２ａ）からの１０個の形質転換体をピックし、ウェルあたり２ｍＬのＹＰＤおよび１００μｇ／Ｌのノーセオスリシンを含有する２４深ウェルプレート中の終夜培養へと接種した。全ての形質転換体を２重に試験した。２４ウェルプレートを通気性膜で密封し、２５℃および２８０ｒｐｍでインキュベートした。ｅＧＦＰの細胞内発現レベルのスクリーニングのため、終夜培養物をグルコース徐放性のための２５ｇ／Ｌの多糖および０．３％のアミラーゼ（ｍ２ｐ－ｌａｂｓ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む２．５ｍＬの最小ＡＳＭｖ６培地を含む２４深ウェルプレートに移し、２時間インキュベートし、続いてｅＧＦＰ産生の誘導のため、０．２％（ｖ／ｖ）または１％（ｖ／ｖ）メタノールのいずれかを添加した。ｅＧＦＰ測定は、Ｇａｌｌｉｏｓ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を使用して、誘導の４および２０時間後に行った。このため、細胞を、０．２４ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．８ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４ ＊２Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、８ｇ／Ｌ ＮａＣｌを含有するリン酸緩衝生理食塩水中で０．５のＯＤ６００に希釈した。２０，０００イベントを測定した。ＦＸ値は、等式
Figure 2022528536000005
を使用する、ソフトウェアＦＡＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ３（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＵＳＡ）を用いて算出した。方法は、既に記載された（Ａｔａ，Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒ，Ｇａｓｓｅｒ，Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，＆Ｃａｌｉｋ，２０１７；Ｈｏｈｅｎｂｌｕｍ，Ｂｏｒｔｈ，＆Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，２００３；Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒら，２０１３）。
ｃ）最小培地ＡＳＭｖ６：６．３ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．８ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．４９ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ、２．６４ｇ／Ｌ ＫＣｌ、０．０５４ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２ ＊２Ｈ２Ｏ、２２ｇ／Ｌ クエン酸一水和物、１．４７ｍＬ／Ｌ ＰＴＭ０微量金属、０．８ｍｇ／Ｌ ビオチン ２０ｍＬ／Ｌ ＮＨ４ＯＨ（２５％）；ＫＯＨでｐＨを６．５に設定。
ｄ）結果は、表３に示す。蛍光は、細胞内ｅＧＦＰレベルを決定する代用であり、細胞内ｅＧＦＰレベルは、ＰＡＯＸ１の活性を決定するための代用であった。結果は、１％メタノール誘導下での２０時間で、プロモーターがＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２株において活性であり、ｅＧＦＰが産生されることを示す。Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＮ＿ｐＡＯＸ１＿ＧＦＰ＿ＳｃＣＹＣｔｔ株の誘導は、２０時間後、０．２％メタノールよりも１％でよく、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１株ではメタノール濃度間の違いは観察されない。
Figure 2022528536000006
Figure 2022528536000007
Figure 2022528536000008
実施例３：メタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーター下で分泌ＨＳＡおよびＶＨＨを産生するＰ．パストリスΔａｏｘ１およびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２株の生成
Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２株において分泌組換えタンパク質を産生する能力を試験し、それをＰ．パストリスΔａｏｘ１株と比較するため、株を２つの分泌モデルタンパク質の発現構築物を用いて形質転換した：（１）その天然の分泌リーダーを伴うヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または（２）出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α接合因子分泌リーダーを伴うラクダ類抗体の可変領域（ＶＨＨ）。目的のこれらの遺伝子のコード配列（外部プロバイダーによってコドン最適化および合成された）は表４に見出すことができる。
ａ）ＨＳＡおよびＶＨＨ産生に使用するｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴおよびｐＰＭ２ｐＺ３０＿ｐＡＯＸ１＿αＭＦ－ｖＨＨ＿ＣｙｃＴＴ発現構築物は、ＷＯ２００８１２８７０１Ａ２に記載のｐＰｕｚｚｌｅ ＺｅｏＲベクターの誘導体であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＵＣ１９ｏｒｉおよびゼオシン抗生物質耐性カセットからなる。ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴの場合では、ゼオシン耐性は、制限酵素処理およびライゲーションを介してノーセオスリシン耐性に交換される。さらに、ベクターは、効率的なインテグレーションのためのＰＧＩ遺伝子座ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ３（１３６６３２９・・・１３６７１９３）に相同なインテグレーション配列を持つ。発現ベクターは、他により詳細に記載される（Ｇａｓｓｅｒら，２０１３；Ｓｔａｄｌｍａｙｒら，２０１０）。目的の遺伝子（ＧＯＩ）の発現は、ＰＡＯＸ１ ＰＰ７４３５＿ｃｈｒ４（２３７９４１・・・２３８８９８）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ１転写終結因子によって媒介された。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿０００４６８）を、Ｐ．パストリスにコドン最適化し、合成した。これは、天然の分泌リーダーを有し、したがって、上澄み液へと分泌される。ＶＨＨの遺伝子は、Ｐ．パストリスにコドン最適化して合成し（表４）、上澄み液への分泌のためのＮ末端Ｓ．セレビシエα接合型リーダーを有する。発現構築物の形質転換のため、環状ベクターを、ＸｍｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてＰＧＩ１相同配列内の制限酵素処理により線状化し、Ｈｉ Ｙｉｅｌｄ（登録商標）Ｇｅｌ／ＰＣＲ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｕｄ－Ｌａｂｏｒｂｅｄａｒｆ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。
ｂ）エレクトロコンピテントなＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２およびＰ．パストリスΔａｏｘ１を、５００ｎｇの線状化ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴおよびｐＰＭ２ｐＺ３０＿ｐＡＯＸ１＿αＭＦ－ｖＨＨ＿ＣｙｃＴＴプラスミドを用いて電気穿孔し、選択は実施例１ａ）および実施例１ｄ）に先に記載したように行った。選択は、それぞれ１００μｇ／ｍＬのノーセオスリシンまたは２５μｇ／ｍＬのゼオシンを含むＹＰＤプレートで行った。
実施例４：ＨＳＡおよびＶＨＨ産生Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２およびＰ．パストリスΔａｏｘ１のスモールスケールスクリーニング
ａ）前培養のため、選択のために使用する抗生物質耐性に基づき１００μｇ／ｍＬのノーセオスリシンまたは２５μｇ／ｍＬのゼオシンを含む２ｍＬのＹＰＤに形質転換体を接種した。各発現構築物につき、スクリーニングのため１２個の形質転換体をピックした。前培養およびスクリーニング培養は、通気性膜で密封した２４ウェルプレートで培養し、２８０ｒｐｍ、２５℃でインキュベートした。スクリーニング培養物を、開始光学濃度（ＯＤ６００）８で、６ｍｍフィードビーズ（Ｋｕｈｎｅｒ Ｓｈａｋｅｒ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に基づくグルコース徐放システムを有する２ｍＬの最小培地（ＡＳＭｖ６）に接種し、培養をグルコース限界に維持した。株は、受け取る全メタノールおよび持続期間が異なる、異なるメタノール供給手順で比較した（表５）。
ｂ）インキュベーション期間後、１ｍＬの各培養物を除去し、前計量したエッペンドルフチューブ内で遠心分離した。上澄み液を除去し、製造業者の使用説明書によりＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてタンパク質濃度を測定した。ウェット細胞重量は、細胞ペレットを含むエッペンドルフチューブを計量することにより決定し、以下のように算出した：重量（全）－重量（空）＝ウェット細胞重量（ＷＣＷ）（ｇ／Ｌ）。このデータから、収率を算出した：収率（μｇ／ｇ）＝タンパク質濃度／ウェット細胞重量。濃度が２倍である、または上澄み液中に検出可能なタンパク質がない形質転換体のデータは、外れ値として解析から除外した。外れ値は、２コピーの発現構築物を持つまたは全くコピーがない、のいずれかの形質転換体と考えられる（Ａｗ＆Ｐｏｌｉｚｚｉ，２０１３；Ｓｃｈｗａｒｚｈａｎｓら，２０１６）。
Figure 2022528536000009
ｃ）結果は、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２が、ＰＡＯＸ１の誘導下で分泌タンパク質を産生でき、収率は業界標準として使用されるＰ．パストリスΔａｏｘ１に匹敵することを示す（表６）。「ツーショット－延長」戦略では、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２はよい収率を示し、少ないメタノールでの長い培養時間下で、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２が有利な収率を示すことを示している。さらに、これは、ＰＡＯＸ１およびメタノール誘導によって制御される分泌タンパク質を産生するＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２株をスクリーニングするために制限グルコース条件を使用することが可能であることを示す。
Figure 2022528536000010
実施例５：バイオリアクター培養
組換えタンパク質産生設定の流加バッチモードにおけるＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２の挙動およびプロセスパラメータを決定するため、バイオリアクター培養を実施した。培養は、以下のように実施した。
ａ）０．７Ｌのワーキング容積でＤＡＳＧＩＰバイオリアクターを使用した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。１つのバイオリアクターシステムは、温度を制御するため、１つのバイオブロックに配置された４つのリアクターからなる。各リアクターは、ソフトウェア制御された４つの蠕動ポンプに接続される。さらに、各リアクターは、重量測定法でポンプスピードを調整するため、ＤＡＳＧＩＰ制御ソフトウェア（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続された２つの利用可能なバランスを有した。各リアクターは、制御可能なガス供給（加圧空気、Ｎ２、Ｏ２は任意の所望の量で混合することができる）およびリアクターオフガスにおけるＯ２およびＣＯ２濃度測定のためのガスアナライザーと接続された。リアクターは、ＤＡＳＧＩＰ制御ソフトウェアに接続されたｐＨプローブおよび溶存酸素（ＤＯ）プローブを有した。ＤＡＳＧＩＰ制御ソフトウェアは、１分間隔で全てのパラメータを記録した。
ｂ）バイオリアクター培養培地は、ＢＳＭ培地（Ｍｅｌｌｉｔｚｅｒら，２０１４）：１１．４８ｇ／Ｌ Ｈ３ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２ ＊２Ｈ２Ｏ、７．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ、９ｇ／Ｌ Ｋ２ＳＯ４、２ｇ／Ｌ ＫＯＨ、４０ｇ／Ｌグリセロール、０．２５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、４．３５ｍＬ／Ｌ ＰＴＭ０、０．８７ｍｇ／Ｌ ビオチン、０．１ｍＬ／Ｌ Ｇｌａｎａｐｏｎ２０００、２５％ ＮＨ３で５．５に設定されたｐＨ、からなる。
ｃ）ＰＴＭ０：６．０ｇ ＣｕＳＯ４ ＊５Ｈ２Ｏ、０．０８ｇ ＮａＩ、３．３６ｇ ＭｎＳＯ４ ＊Ｈ２Ｏ、０．２ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４ ＊２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ Ｈ３ＢＯ３、０．８２ｇ ＣｏＣｌ２、２０．０ｇ ＺｎＣｌ２、６５．０ｇ ＦｅＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ、５ｍＬ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４（９５％～９８％）からなる。
ｄ）グルコース供給培地：５０％（ｗ／ｗ）グルコース、２．０８ｍｇ／ｋｇ ビオチン、１０．４ｍＬ／ｋｇ ＰＴＭ０からなる。メタノール供給培地：５０％（ｖ／ｖ）または１００％（ｖ／ｖ）メタノールである。グリセロール供給培地：６０％（ｗ／ｗ）グリセロール、２．０８ｍｇ／ｋｇ ビオチン、１０．４ｍＬ／ｋｇ ＰＴＭ０からなる。
ｅ）溶存酸素（ＤＯ）の設定ポイントは２０％であった。ある特定の場合では、ＤＯ対照は不活性化され、撹拌および通気は手動で一定な７５０ｒｐｍおよび９．５ｓＬ／ｈに設定した。ｐＨは、ＤＡＳＧＩＰ制御ソフトウェアによって制御された１２．５％または２５％のいずれかのＮＨ３を用いて５．０または５．５に設定した。酸対照は、必要な場合に手動の添加により、１０％ Ｈ３ＰＯ４を用いて達成された。温度は２５℃に設定した。開始ＯＤ６００は２であり、開始体積は３００ｍＬ＋１５ｍＬの接種培養であった。
ｆ）サンプリングは、毎日行った（およそ２４時間毎）。最初の３ｍＬの吸引液をリアクターから採取し、サンプリングポートのデッドボリュームを除去した。次いで、９ｍＬの試料を採取した。３×２ｍＬを再軽量した２ｍＬエッペンドルフチューブへピペットし、１×１．５ｍＬを１つの１．５ｍＬエッペンドルフチューブへとピペットした。試料を遠心分離（１６，０００ｇ、１０分、４℃）した。上澄み液を、タンパク質およびＨＰＬＣ解析のために回収し、－２０℃で保存した。ペレットを１ｍＬの０．１Ｍ ＨＣｌ中での再懸濁により洗浄し、微量の塩を除去し、再び遠心分離（１６，０００ｇ、１０分、４℃）した。次いでペレットを、１０５℃で２４時間乾燥させ、乾燥細胞重量を決定した。乾燥細胞重量は以下：（重量（全）－重量（空））／２＝乾燥細胞重量（ｇ／Ｌ）のように算出し、３回の反復の平均として算出した。ＨＰＬＣ試料のみが必要な場合、２ｍＬのみの試料が採取された
ｇ）細胞生存率は、ヨウ化プロピジウムを用いて細胞懸濁液を染色することによって測定した。このため、リアクター試料からの細胞懸濁液は、リン酸緩衝生理食塩水を用いて０．５のＯＤ６００に希釈し、５９０～６５０ｎｍのフィルタを用いるＧａｌｌｉｏｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）での測定の前に、１０μＭの最終濃度にヨウ化プロピジウムのストック溶液と混合した。試料当たり５０，０００イベントを測定した。
実施例６：細胞を含まないバイオリアクターからのメタノールの蒸発率を決定する。
通気および撹拌によるリアクターからのメタノールの蒸発率を評価するため、リアクターを滅菌培地で満たし、メタノールをパルスし、メタノール濃度を決定するために試料を採取した。
ａ）この例のため、２つのリアクターを、グリセロールを含まない３１０ｍＬのＢＳＭ培地で満たし、２つのリアクターを、グリセロールを含まない５００ｍＬのＢＳＭ培地で満たし、増殖培養によりグリセロールが消費されるバッチ段階の終了時の培地をシミュレートした。
ｂ）リアクター撹拌スピードを７６０ｒｐｍに設定し、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２の培養の場合のように９．５ｓＬ／ｈでガス注入した。パラメータは表７に見出すことができる。
ｃ）５０％（ｖ／ｖ）メタノールパルスを手動で添加し、メタノール濃度を１％（ｖ／ｖ）に増加させ、試料を実際に達成された濃度を決定するために採取した。試料ポートから３ｍＬのデッドボリュームの最初の除去、および吸引液の廃棄により、３．４、６．５、２２．４、３１．０、４７．９時間で試料を採取した。その直後に４ｍＬの試料を採取した。
ｄ）メタノール濃度のＨＰＬＣ測定を、先に記載されたように行った（Ｂｌｕｍｈｏｆｆ，Ｓｔｅｉｇｅｒ，Ｍａｒｘ，Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，＆Ｓａｕｅｒ，２０１３）。特定および定量のため、純度標準を使用した。カラムは、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，ＵＳＡ）であり、０．６ｍＬ／分で４ｍＭ Ｈ２ＳＯ４移動相を用いて６０℃で実行した。検出器は、屈折率検出器ＲＩＤ－１０Ａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｃｏｒｐ．，Ｊａｐａｎ）であり、算出はＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ ｖ５．８５ソフトウェア（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｃｏｒｐ．，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。
ｅ）蒸発率は、最大時間および濃度差のある最初および最終試料からのみ算出した。隣接する試料間の濃度の変化はわずかであり、測定誤差は算出に影響が大きかった。データは表８に見出すことができる。Ｒ１およびＲ２は、５００ｍＬの培地で満たし、平均値０．０６３ｇ＊Ｌ－１＊ｈ－１を有した。
Figure 2022528536000011
Figure 2022528536000012
実施例７：Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２のメタノール取り込み率の決定
メタノール取り込み率を決定するため、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴ株をバイオリアクターで培養した。培養は、ある特定のバイオマス濃度まで増殖させた。次いで、メタノールパルスを適用し、試料をパルス直後およびおよそ２０時間後に採取した。目的はＭｕｔ－株のメタノール取り込み率を決定し、それを実施例６で測定されたメタノール蒸発率と比較することである。
ａ）前培養：リアクター接種の２４時間前に、１００μｇ／Ｌのノーセオスリシンを含有する５０ｍＬのＹＰＤに、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴを接種した。リアクターの接種の３時間前に、前培養は、別の１００μｇ／Ｌのノーセオスリシンを含有するさらなる５０ｍＬのＹＰＤによって希釈した。接種前、適切な量の培養物を遠心分離（１５００ｇ、５分、２０℃）し、ＯＤ６００が４２の１５ｍＬのＢＳＭ培地中に再懸濁した。
ｂ）３００ｍＬのＢＳＭ培地で満たしたリアクターに、１５ｍＬのＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴ培養物を接種した。リアクター内の標的接種ＯＤ６００は２であった。残存酸素スパイクによって示されるバッチ段階の終了時に、５０％（ｗ／ｗ）グルコース供給を２．４ｍＬ／ｈで開始し、２４時間バイオマスを増加させた。グルコース供給開始の２時間後、９．５ｍＬの５０％（ｖ／ｖ）メタノールショットを与え、メタノール濃度を１．５％に増加させた（測定した濃度は、Ｒ１＝１．４７％およびＲ２＝１．４８％であった）。これは、メタノール消費を誘導するために行われた。グルコース供給段階の終了時に、細胞乾燥重量およびＨＰＬＣのための試料を採取した。
ｃ）グルコース段階の後、撹拌およびガス注入は、一定な７５０ｒｐｍおよび９．５ｓＬ／ｈに設定した。追加の５０％メタノールパルスを添加し、濃度を１．５％に増加させ、すぐに試料を採取した（測定された濃度は、Ｒ１＝１．３６％およびＲ２＝１．３６％であった）。濃度を１９．５時間後に再び測定し、特異的なメタノール取り込み率（ｑメタノール）を決定するために使用した。
ｄ）この実験のメタノール濃度減少（ｄｃ／ｄｔ）は、０．０２２～０．０６３ｇＬ－１ｈ－１の範囲である実施例６ｅ）、表８での蒸発率で得られた値と比較して、平均０．３７ｇＬ－１ｈ－１で実質的に高かった。
特異的メタノール取り込み率は、以下のように表９に表すデータに基づいて算出した。
Figure 2022528536000013
体積は、測定期間にわたり一定であった。引かれる蒸発を含まない平均の特異的メタノール取り込み率（ｑメタノール）は、５．０７ｍｇ ｇ－１ｈ－１であった。引かれる蒸発を含む特異的メタノール取り込み率の算出のため、２２ｍｇ Ｌ－１ｈ－１の蒸発率を、実施例６ｅ）、表８の結果に基づき推定した。この結果は、完全に新しく、予想外であった。これまで、Ｍｕｔ－はメタノールを代謝することができず、メタノールの減少が蒸発減であることが、出版された論文で報告および認められた（Ｌｏｏｓｅｒら，２０１５）。
Figure 2022528536000014
実施例８：培養戦略１－Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２への一定のグルコース／メタノール同時供給の適用
Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴ株を、組換えタンパク質産生シナリオで培養した。株に、一定の制限グルコース供給を供給し、タンパク質産生のためにメタノールで誘導した。
ａ）接種は、実施例７ａ）ｂ）に記載のように行った。培養は、２つの段階に分けた。（１）段階１：バッチは、ＢＳＭ培地中２のＯＤ６００で開始した。バッチ段階の終了は、リアクターＲ１で２２．２７ｈ、リアクターＲ２で２１．５２ｈでの残存酸素スパイクによって示された。
ｂ）（２）段階２：５０％（ｗ／ｗ）グルコース供給を含む流加バッチ段階は、９７時間、２．４ｍＬ／ｈの供給速度で段階１の後に開始した。同時に、メタノール濃度を１．５％（ｖ／ｖ）に増加させるために、５０％（ｖ／ｖ）メタノールパルスを添加した。ＨＰＬＣ試料は、実施例６ｄ）に記載のように採取し、正確な濃度を測定し、必要であれば追加のパルスを添加した。予測されるバイオマス濃度に基づいて算出されたメタノール供給および実施例７ｄ）で測定されたように５ｍｇ／ｇ－１ｈ－１の特異的メタノール取り込み率を適用した。メタノール濃度は、ＨＰＬＣによるアットラインで毎日測定した。
ｃ）メタノール供給は、以下のように時間間隔で算出した：
Figure 2022528536000015
ｄ）実施例７ｄ）に基づき予測される特異的メタノール取り込み率のため、アットラインで１日当たり１回だけのメタノール濃度測定および供給調整を伴い、１．１９％から１．５％（ｖ／ｖ）のメタノールへとバイオリアクター培養の間メタノール濃度を過剰に保つことが可能であった。
ｅ）プロセスおよび生産性データは、表１０に見出すことができる。特異的生産性の全体平均は、２９．４μｇ ｇ－１ｈ－１であった。培養の終了時のメタノール濃度は、リアクターＲ１およびＲ２で１０．４および１０．０ｇ／Ｌ（１％（ｖ／ｖ）メタノールは、７．９２ｇ／Ｌに相当する）であった。リアクターＲ１およびＲ２による段階２で消費されたメタノールの総量は、２５．０３ｇおよび２４．０７ｇであった。これは、以下の等式によって算出した：
Figure 2022528536000016
Figure 2022528536000017
実施例９：培養戦略２－別々のグルコース供給段階およびメタノールのみの供給段階による供給戦略
Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴ株を、まず、制限グルコース供給を適用してバイオマスを増加させ、メタノールパルスによる別の段階、およびタンパク質産生を誘導するための供給へと続く組換えタンパク質産生シナリオで試験した。
ａ）バイオリアクター培養を３つの段階に分けた。（１）段階１は、開始ＯＤ６００が２のＢＳＭ培地でのバッチ段階からなる。接種は、実施例７ａ）ｂ）に記載のように行った。バッチ段階は、リアクターＲ３およびＲ４で、それぞれ１９．６８および１９．５時間続いた。（２）段階２は、２５時間、４．８ｍＬ／ｈでの５０％（ｗ／ｗ）グルコース供給であり、バイオマス濃度を増加させた。（３）段階３は、１．５％（ｖ／ｖ）の標的濃度に達するように５０％（ｖ／ｖ）メタノールパルスで開始し、メタノール供給プロファイルは、７２．７時間、実施例８ｃ）に記載のように予測される細胞乾燥重量および特異的メタノール取り込み率に基づき算出された。メタノール濃度を実施例６ｄ）に記載のように毎日ＨＰＬＣによってアットラインで測定し、正確な濃度を測定し、必要であれば追加の補正パルスを添加した。この段階では、リアクター撹拌スピードは一定な７６０ｒｐｍに設定し、ガス注入は９．５ｓＬ／ｈであった。
ｂ）プロセスおよび生産性データは、表１１に見出すことができる。培養を通して最大および最小メタノール濃度は、４．３ｇ／Ｌから１２．５５ｇ／Ｌの範囲であった。特異的生産性の全体平均は、３２．９μｇ ｇ－１ｈ－１であった。培養の終了時のメタノール濃度は、リアクターＲ３およびＲ４で７．１０および７．４７ｇ／Ｌであった。リアクターＲ３およびＲ４により段階３で消費されたメタノールの量は、１２．０ｇおよび１２．６ｇであった。これは、実施例８ｅ）のように算出した。段階３でのバイオマスが一定であったため、段階３のメタノール取り込み率（ｑメタノール）は、以下の等式によって算出した：
Figure 2022528536000018
段階３では、リアクターＲ３のｑメタノールは３．７９ｍｇ ｇ－１ｈ－１であり、リアクターＲ４では、ｑメタノールは３．９２ｍｇ ｇ－１ｈ－１である。
ｃ）表１１の総バイオマスは、１２ｍＬの試料抽出について補正し、バイオマスが増加しなかったことを示す。全体的に、段階３の総バイオマスは、リアクターＲ３およびＲ４で４．５％および３．４％減少した。驚いたことに、それにもかかわらず、培養は分泌組換えタンパク質を産生した。これは、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴ株は、メタノールのみを供給し、明らかな増殖がない場合でさえも、組換え分泌タンパク質を効果的に産生することができる。唯一の炭素源としてメタノールを用いて段階３で産生されたタンパク質の総量の平均は１０５ｍｇである。
Figure 2022528536000019
Figure 2022528536000020
実施例１０：培養戦略３－グルコース／メタノール同時供給段階による供給戦略および別のメタノールのみの供給段階
Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴ株を、バッチ段階の後に制限グルコース供給ならびに追加のメタノールパルスおよび供給を適用してバイオマスの増加および組換えタンパク質産生を同時に達成する組換えタンパク質産生シナリオで試験した。所望のバイオマスが達成された後、グルコース供給は停止したが、メタノール供給は培養の残りの間継続した。
ａ）バイオリアクター培養を３つの段階に分けた。（１）段階１は、バッチ段階であった。このため、リアクターは、開始ＯＤ６００が２の産生株Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴを接種した。接種は、実施例７ａ）ｂ）に記載のように行った。バッチ段階は、リアクターＲ１およびＲ２で、それぞれ１９．３５および１９．３７時間続いた。バッチ段階の終了は、残存酸素ピークによって示された。（２）この時点で、段階２を開始した。段階２は、２５時間、４．８ｍＬ／ｈでの５０％（ｗ／ｗ）グルコース供給からなる。段階２の開始時には、５０％（ｖ／ｖ）メタノールパルスを適用し、メタノール濃度を標的の１．５％（ｖ／ｖ）に増加させ、続くメタノール供給を開始して、メタノール消費、蒸発およびグルコース供給による希釈に対抗した。（３）段階３は、７２．９時間のメタノールのみの供給からなる。この段階では、リアクター撹拌速度は一定な７６０ｒｐｍに設定し、ガス注入は９．５ｓＬ／ｈであった。メタノール濃度を実施例６ｄ）に記載のように毎日ＨＰＬＣによってアットラインで測定した。必要であれば追加の補正パルスを添加した。
ｂ）メタノール供給は、実施例９ｂ）のように時間間隔で算出した：
ｃ）プロセスおよび生産性データは、表１２に見出すことができる。２回の繰り返しの培養を通して最大および最小メタノール濃度は、６．９ｇ／Ｌから１１．４ｇ／Ｌの範囲であった。特異的生産性の全体平均は、４５．８μｇ ｇ－１ｈ－１であり、段階３の平均特異的生産性は、３４．０μｇ ｇ－１ｈ－１であった。培養の終了時のメタノール濃度は、リアクターＲ１およびＲ２で８．０ｇ／Ｌであった。リアクターＲ１およびＲ２により段階３で消費されたメタノールの量は、１４．４ｇおよび１４．１ｇであった。これは、実施例９ｂ）に示すように等式によって算出した。段階３でのバイオマスが一定であったため、段階３のメタノール取り込み率（ｑメタノール）は、実施例９ｂ）に示すように算出した。段階３では、リアクターＲ１のｑメタノールは４．６１ｍｇ ｇ－１ｈ－１であり、リアクターＲ２のｑメタノールは４．５４ｍｇ ｇ－１ｈ－１であった。全体的に、段階３では、バイオマスは、リアクターＲ１およびＲ２で５．７％および５．５％減少した。また、これは、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２株による明らかな増殖がない産生が可能であることを示す。唯一の炭素源としてメタノールを用いて段階３で産生された組換えタンパク質の総量の平均は１０６ｍｇであり、実施例９、段階３で産生された１０５ｍｇの組換えタンパク質と類似する。これは、実施例９の３２．９μｇ ｇ－１ｈ－１とこの実施例の３４．０μｇ ｇ－１ｈ－１から、段階３での類似の特異的生産性によっても示される。結論として、段階３（メタノールのみを供給する段階）での生産性は、培養が段階２（グルコース供給段階）で誘導されたか、またはそうでないかに依存しなかった。組換えタンパク質産生が増殖と無関係であるため、メタノールのみを供給する戦略は、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２株で使用する場合、いくつかの利点を有する。実施例８のようにメタノールのみを供給する段階を含まないバイオリアクター培養では、プロセスは、最大リアクター体積および酵母乾燥質量濃度によって制約される。ある特定の時間後、この制約は、最大体積または最大の所望のバイオマス濃度のいずれかに達することによって培養プロセスを停止させる。実施例９のように、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２と組み合わせてメタノール供給段階を使用することにより、バイオマスが増加せず、体積の増加が無視できるため、培養時間は、バイオマス濃度または体積によってもはや制限されない。結果として、高いバイオマス濃度での培養は、これらの制約に達することなくより長い期間バイオリアクターで維持することができ、目的のタンパク質の濃度を増加するより長い産生段階を可能にする。以下の実施例１２に示すようにメタノール利用が低いＰ．パストリスΔａｏｘ１株を使用する場合、メタノールのみの供給段階も適用されるが、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１がメタノールのみの供給で継続して増殖し、したがって議論したのと同じ制約を示すためこれらの利点は存在しない。Ｐ．パストリスΔａｏｘ１をＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２と同じメタノール供給速度に制限することは、生産性の喪失をもたらす。さらなるプロセスに関連するＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２株の改善は、実施例１２で議論する。
Figure 2022528536000021
実施例１１：培養戦略３－ＶＨＨを分泌するＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２に適用するグルコース／メタノール同時供給段階および別々のメタノールのみの供給段階による供給戦略
別の分泌タンパク質により分泌された組換えタンパク質産生を確認するため、実施例１０ａ）に記載のバイオリアクター培養を、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＺ３０＿ｐＡＯＸ１＿αＭＦ－ｖＨＨ＿ＣｙｃＴＴを用いて繰り返した。
ａ）実施例１０ａ）のように、このバイオリアクター培養を３つ段階に分けた。（１）段階１は、バッチ段階であった。このため、実施例７ａ）ｂ）に記載のように、リアクターは、開始ＯＤ６００が２の産生株Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＺ３０＿ｐＡＯＸ１＿αＭＦ－ｖＨＨ＿ＣｙｃＴＴを接種した。バッチ段階は、リアクターＲ１およびＲ２で、それぞれ１８．７９および１９．３３時間続いた。バッチ段階の終了は、残存酸素ピークによって示された。（２）この時点で、段階２を開始した。段階２は、３３．９時間、４．８ｍＬ／ｈでの５０％（ｗ／ｗ）グルコース供給からなり、実施例１０においてよりもさらに高くバイオマスを増加させた。段階２の開始時には、５０％（ｖ／ｖ）メタノールパルスを添加し、メタノール濃度を標的値の１．５％（ｖ／ｖ）に増加させ、続くメタノール供給を開始して、メタノール消費、蒸発およびグルコース供給による希釈に対抗した。（３）段階３は、６３．９時間のメタノールのみの供給からなる。撹拌速度は一定な７６０ｒｐｍに設定し、ガス注入は９．５ｓＬ／ｈに設定した。メタノール濃度を実施例６ｄ）に記載のように毎日ＨＰＬＣによってアットラインで測定した。必要であれば追加の補正パルスを添加した。
ｂ）メタノール供給は、実施例９ｂ）に記載のように算出した。
プロセスおよび生産性データは、表１３に見出すことができる。２回の繰り返しの培養を通して最大および最小メタノール濃度は、８．７ｇ／Ｌ（Ｒ１）から１１．３ｇ／Ｌ（Ｒ１）の範囲であった。特異的生産性の全体平均は、１１８．０μｇ ｇ－１ｈ－１であり、段階３では、８８．２μｇ ｇ－１ｈ－１であった。培養の終了時のメタノール濃度は、リアクターＲ１およびＲ２で１０．５ｇ／Ｌおよび１０．８ｇ／Ｌであった。リアクターＲ１およびＲ２により消費されたメタノールの量は、２６．６ｇおよび２６．０ｇであった。これは、実施例８ｅ）に示すように以下の等式によって算出した。この量は、より高いバイオマス濃度により実施例１０より高いが、依然としてＭｕｔｓ株（実施例１２に記載）より著しく低い（５分の１）。段階３でのバイオマスが一定であったため、段階３のメタノール取り込み率（ｑメタノール）は、実施例９ｂ）に示すように算出した。段階３では、リアクターＲ１のｑメタノールは４．７５ｍｇ ｇ－１ｈ－１であり、リアクターＲ２のｑメタノールは４．６８ｍｇ ｇ－１ｈ－１であった。
ｃ）全体的に、段階３では、バイオマスは、リアクターＲ１およびＲ２で４．４％および４．９％減少した。表１３のデータは、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２株が、リットル当たりグラム量でも分泌組換えタンパク質を産生できることを明確に示す。メタノールのみを供給する段階では、ｖＨＨ濃度は８１５．５ｍｇ／Ｌ増加し、平均総量３２３．１ｍｇの抗体断片が唯一の炭素源としてメタノールを使用して産生されたことを意味する。
Figure 2022528536000022
実施例１１．１：確立されたバイオリアクター培養プロトコールを用いて培養したメタノール利用が低いＰ．パストリスΔａｏｘ１（Ｍｕｔｓ）と比較してＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２（Ｍｕｔ－）株で得られたプロセスパラメータ。
比較のため、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴを、Ｍｕｔｓ表現型の確立された培養プロトコールを用いて培養した（Ｐｏｔｖｉｎ，Ａｈｍａｄ，＆Ｚｈａｎｇ，２０１２）。
ａ）このバイオリアクター培養を４つの段階
に分けた。（１）段階１は、バッチ段階であった。このため、実施例７ａ）ｂ）に記載のように、リアクターは、開始ＯＤ６００が２の産生株Ｐ．パストリスΔａｏｘ１ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴを接種した。バッチ段階は、リアクターＲ１およびＲ２で、それぞれ２０．１７および２０．３０時間続いた。バッチ段階の終了は、残存酸素ピークによって示された。（２）段階２は、８時間、線状に増加する（ｙ＝０．２２５ｘ＋１．９５）６０％グリセロール供給である。（３）段階３は、１８時間、線状に減少する（ｙ＝３．７５－０．１１１ｘ）６０％グリセロール供給と線状に増加する（ｙ＝０．０２８ｘ＋０．６）１００％メタノール供給による同時供給段階であった。（４）段階４は、７２時間、線状に増加する１００％メタノール供給（ｙ＝０．０２８ｘ＋１．１０）によるメタノールのみの供給段階である。総実行時間は、１１９．２５時間であった。
ｂ）グリセロールとメタノール供給は、ＤＡＳＧＩＰ制御ソフトウェア（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、ａ）の等式に基づいて重量測定で制御された。
ｃ）プロセスおよび生産性データは、表１３．１に見出すことができる。段階３から段階４（産生段階）の特異的生産性の全体平均は、６１．７μｇ ｇ－１ｈ－１であった。消費したメタノールの平均総量は、培養期間全体にわたり１６５．８ｇであり、段階４（メタノールのみの供給段階）では１５０．６ｇであった。培養ブロスの残存メタノール濃度は、これがメタノール限定培養であったため、ゼロであると考えられた。この実施例の段階４は、実施例９、１０および１１の段階３に相当する。段階４の平均バイオマスに基づき、実施例９ｂ）に示すようにメタノール取り込み率（ｑメタノール）を算出した。段階４のｑメタノールは、リアクターＲ１では３７．１ｍｇ ｇ－１ｈ－１であり、リアクターＲ２では３７．６ｍｇ ｇ－１ｈ－１であった。段階４のｑメタノールは、望まないバイオマス増加を促進する。培養終了時の総バイオマスの５３．２％（Ｒ１）および５２．４％（Ｒ２）が、段階４のメタノールによる増殖中に生成される。
ｄ）株に関連するプロセスパラメータの比較は表１３．２に示され、提示した実施例からの特異的メタノール取り込み率および供給速度の概要は１３．３に見出すことができる。組換えタンパク質産生のためにＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２Ｍｕｔ－を使用することにより、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１によるプロセスと比較して、いくつかの重要なプロセスパラメータが著しく改善した。反応の熱は、実質的に８０％より大きく低下し、冷却の必要性の低下をもたらす。特異的酸素取り込み率および酸素移行率は、８０％より大きく低下し、混合および通気の必要性の低下をもたらし、通気の流速ならびに純粋な酸素をバイオリアクターベッセルに供給する必要性を低下させる。低い特異的メタノール取り込み率は、培養に必要とされるメタノールの量を低下させる。メタノールは毒性および可燃性である。
Ｍｕｔ－株の使用は、それが生産設備で操作および保存するために必要なメタノールの量を低下させるため、技術および安全性の改善を提示する。別の利点は、高メタノール濃度へのＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２の低い感受性である。これは、実施例１０の株Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２およびこの実施例のＰ．パストリスΔａｏｘ１の細胞生存率データによって確認される。実施例１０において、プロセスの終了時におけるリアクターＲ１およびＲ２のＭｕｔ－細胞の生存率は、９９．８％および９９．７％であった。これに対し、この実施例におけるリアクターＲ１およびＲ２のＭｕｔｓ細胞の細胞生存率は、９５．９％および９６．５％であった。Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２株の低い感受性と高い生存率は、組換え産生された分泌タンパク質の純度に効果を有する。溶解した細胞は、目的のタンパク質を分解するプロテアーゼを放出し、上澄み液中に望まない可溶性タンパク質を加え、両作用が上澄み液中の目的のタンパク質の低純度および欠如をもたらす。実施例１０のＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２の純度が両リアクターＲ１およびＲ２で８５％であったのと比較して、この実施例のＰ．パストリスΔａｏｘ１の純度は、リアクターＲ１およびＲ２で７２％および７７％であった。
Figure 2022528536000023
Figure 2022528536000024
Figure 2022528536000025
実施例１２：メタノール利用陰性およびアルコールデヒドロゲナーゼ欠損株の生成
実施例７で観察されたＰ．パストリスＭｕｔ－株のメタノール消費は、予想外であり、新しかった。この知識に基づき、アルコールデヒドロゲナーゼがこの特徴の要因であるという仮説を立てた。Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２におけるメタノール消費へのアルコールデヒドロゲナーゼの効果を試験するため、２つの可能性のあるアルコールデヒドロゲナーゼを欠失のために選択した。ＡＤＨ２：ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ２－０８２１およびＡＤＨ９００：ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ２－０９９０。遺伝子のコード領域を抗生物質耐性と交換することにより、３つの株、（１）ＡＤＨ２欠損株、（２）ＡＤＨ９００欠損株、および（３）二重欠失ＡＤＨ２＆ＡＤＨ９００株を作製した。効果的に、株（１）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ａｄｈ２Δ：：ＨｐｈＲ、（２）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ Ａｄｈ９００Δ：：ＫａｎＭＸおよび（３）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ａｄｈ２Δ：：ＨｐｈＲ ａｄｈ９００Δ：：ＫａｎＭＸを作成した。
ａ）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２を、実施例１ａ）に記載のようにエレクトロコンピテントにした。ＡＤＨ２欠失を生成するため、実施例１ｂ）に記載のようにスプリットマーカー手法を使用した。エレクトロコンピテントな細胞を、実施例１ｄ）に記載のように、５００ｎｇのＡｄｈ２スプリットマーカーカセット１および５００ｎｇのＡｄｈ２スプリットマーカーカセット２により形質転換した。カセット配列は、表１４に見出すことができる。形質転換体は、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含むＹＰＤプレートで選択した。１つのクローンをＰＣＲ増幅およびＰＣＲアンプリコンのシークエンシングに基づいて選択した。抗生物質マーカーによるＡＤＨ２コード領域の置換の成功は、プライマーＡｄｈ２＿ＫＯ＿ｃｔｒｌ＿ｆｗｄ ＆ Ａｄｈ２＿ＫＯ＿ｃｔｒｌ＿ｒｅｖ（表１５）を用いるＰＣＲ増幅およびＰＣＲアンプリコンのシークエンシングによって確かめた（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ，Ｓｗｉｓｓ）。生成した株は、（１）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ Ａｄｈ２Δ：：ＨｐｈＲと呼ばれる。
ｂ）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２株を、実施例１ａ）に記載のようにエレクトロコンピテントにした。エレクトロコンピテントな細胞を、実施例１ｄ）に記載のように、５００ｎｇのＡｄｈ９００スプリットマーカーカセット１および５００ｎｇのＡｄｈ９００スプリットマーカーカセット２により形質転換した。カセット配列は、表１４に見出すことができる。形質転換体は、５００μｇ／ｍｌのジェネテシンを含むＹＰＤプレートで選択した。１つのクローンをＰＣＲ増幅およびＰＣＲアンプリコンのシークエンシングに基づいて選択した。抗生物質マーカーによるＡＤＨ９００コード領域の置換の成功は、プライマーＡｄｈＩＩ＿ＫＯ＿Ｃｔｒｌ＿ｆｗｄ ＆ ＡｄｈＩＩ＿ＫＯ＿Ｃｔｒｌ＿ｒｅｖ（表１５）を用いるＰＣＲ増幅およびＰＣＲアンプリコンのシークエンシングによって確かめた（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ，Ｓｗｉｓｓ）。生成した株は、（２）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ Ａｄｈ９００Δ：：ＫａｎＭＸと呼ばれる。
ｃ）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ａｄｈ２Δ：：ＨｐｈＲ株を、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを主培養培地に添加した以外は実施例１ａ）に記載のようにエレクトロコンピテントにした。エレクトロコンピテントな細胞は、実施例１ｄ）に記載のように、５００ｎｇのＡｄｈ９００スプリットマーカーカセット１および５００ｎｇのＡｄｈ９００スプリットマーカーカセット２により形質転換した。カセット配列は、表１４に見出すことができる。形質転換体は、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンおよび５００μｇ／ｍＬのジェネテシンを含むＹＰＤプレートで選択した。１つのクローンをＰＣＲ増幅およびＰＣＲアンプリコンのシークエンシングに基づいて選択した。抗生物質マーカーによるＡＤＨ９００コード領域の置換の成功は、プライマーＡｄｈＩＩ＿ＫＯ＿Ｃｔｒｌ＿ｆｗｄ ＆ ＡｄｈＩＩ＿ＫＯ＿Ｃｔｒｌ＿ｒｅｖ（表１５）を用いるＰＣＲ増幅およびＰＣＲアンプリコンのシークエンシングによって確かめた（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ，Ｓｗｉｓｓ）。生成した株は、（３）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ Ａｄｈ２Δ：：ＨｐｈＲ Ａｄｈ９００Δ：：ＫａｎＭＸと呼ばれる。
ｄ）ＰＣＲ増幅のためのゲノムＤＮＡは、製造業者の推奨により、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いて単離した。ＰＣＲ増幅反応は、製造業者の推奨により、Ｑ５ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて行った。
Figure 2022528536000026
Figure 2022528536000027
Figure 2022528536000028
Figure 2022528536000029
実施例１３：Ａｄｈ２およびＡｄｈ９００過剰発現メタノール利用陰性株の生成
ＡＤＨ２およびＡＤＨ９００過剰発現の効果を調べるため、構成的プロモーターＰＧＡＰ：ＰＰ７４２５＿Ｃｈｒ１（５９６２９６・・・５９６７９０）およびそれぞれＡＤＨ２コード配列またはＡＤＨ９００コード配列から構成されるように発現構築物を作成した。ＡＤＨ２およびＡＤＨ９００コード配列（表１６）を改変し、遺伝子産物のアミノ酸配列に影響することなくコード配列のＢｂｓＩおよびＢｓａＩ制限部位を除去した。生成した株は、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＧＡＰ＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴおよびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＧＡＰ＿Ａｄｈ９００＿ＣｙｃＴＴと名付けた。
ａ）Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリー法を使用するため、制限酵素ＢｂｓＩおよびＢｓａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）の制限部位は、遺伝子産物のアミノ酸配列に影響することなくコード配列から除去される必要があった。このプロセスは、キュアリングと呼ばれる。ＡＤＨ２ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ２－０８２１のコード配列は、ｃ．４５Ｇ＞Ａおよびｃ．６６０Ｃ＞Ｇで改変された。ＡＤＨ９００ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ２－０９９０のコード配列は、ｃ．４２Ｃ＞Ｇで改変された。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーのために使用したキュアしたコード配列は、表１５に見出すことができる。最初の１２塩基対および最後の１５塩基対は、コード配列の部分ではなく、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーに必要とされることに注意されたい。
ｂ）本明細書で使用したＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーは、既に記載された（Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒら，２０１７）。（１）発現構築物ＢＢ３ａＺ＿ｐＧＡＰ＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴは以下のようにアセンブルした。Ａｄｈ２＿ＧＧ＿ｃｕｒｅｄ ＤＮＡ断片（表１５）を、ＢＢ１＿２３骨格へとクローニングし、ＢＢ１＿２３＿Ａｄｈ２を作成した。発現構築物は、ＢＢ３ａＺ＿１４＊（骨格）、ＢＢ１＿２３＿Ａｄｈ２（コード配列）ＢＢ１＿１２＿ｐＧＡＰ（プロモーター）、ＢＢ１＿３４＿ＳｃＣＹＣ１ｔｔ（ターミネーター）のＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーによって生成した。（２）発現構築物ＢＢ３ａＺ＿ｐＧＡＰ＿Ａｄｈ９００＿ＣｙｃＴＴは以下のようにアセンブルした。Ａｄｈ９００＿ＧＧ＿ｃｕｒｅｄ ＤＮＡ断片（表１５）を、ＢＢ１＿２３骨格へとクローニングし、ＢＢ１＿２３＿Ａｄｈ９００を作成した。発現構築物は、ＢＢ３ａＺ＿１４＊（骨格）、ＢＢ１＿２３＿Ａｄｈ９００（コード配列）ＢＢ１＿１２＿ｐＧＡＰ（プロモーター）、ＢＢ１＿３４＿ＳｃＣＹＣ１ｔｔ（ターミネーター）のＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーによって生成した。プラスミドおよび配列は、Ｇｏｌｄｅｎ ＰｉＣＳ ｋｉｔ＃１００００００１３３（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で入手可能である。
Figure 2022528536000030
Figure 2022528536000031
Figure 2022528536000032
ｃ）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２株を、実施例１ａ）に記載のようにエレクトロコンピテントにした。ＢＢ３ａＺ＿ｐＧＡＰ＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴ発現構築物およびＢＢ３ａＺ＿ｐＧＡＰ＿Ａｄｈ９００＿ＣｙｃＴＴ発現構築物を、製造業者のプロトコールによりＡｓｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて線状化し、Ｈｉ Ｙｉｅｌｄ（登録商標）Ｇｅｌ／ＰＣＲ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｕｄ－Ｌａｂｏｒｂｅｄａｒｆ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。５００ｎｇの線状化したプラスミドは、実施例１ａ）および１ｄ）に先に記載したように、エレクトロコンピテントなＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２に形質転換した。陽性の形質転換体を、２５μｇ／ｍＬのゼオシンを含むＹＰＤで選択した。発現構築物のインテグレーションの成功は、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いる、プライマー１０９＿ＢＢ３ａＮ＿ｃｔｒｌ＿ｆｗｄおよびｐＧＡＰ＿ｇｏｉ＿ｒｅｖ＿ｖ２（表１７）でのＰＣＲ増幅により確かめた。作成された株は、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＧＡＰ＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴおよびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＧＡＰ＿Ａｄｈ９００＿ＣｙｃＴＴと呼ばれる。
ｄ）ＰＣＲ増幅のためのゲノムＤＮＡは、製造業者の推奨により、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いて単離した。ＰＣＲ増幅反応は、製造業者の推奨により、Ｑ５ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて行った。
Figure 2022528536000033
実施例１４：メタノール利用陰性アルコールデヒドロゲナーゼ欠損株の無細胞抽出物におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性の測定。
表現型レベルでのアルコールデヒドロゲナーゼの欠失の成功を調べるため、基質としてエタノールを用いて無細胞抽出物におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性を測定した。エタノールは、一般にＡｄｈ２の主な基剤と考えられる。
ａ）通気性膜によって密封した２４ウェルプレートにおいて、２ｍＬのＹＰＤ培地中、２５℃および２８０ｒｐｍで終夜培養を行った。使用した株は、実施例１２ａ）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ Ａｄｈ２Δ：：ＨｐｈＲ、実施例１２ｂ）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ Ａｄｈ２Δ：：ＨｐｈＲ Ａｄｈ９００Δ：：ＫａｎＭＸおよび実施例１ｅ）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２であった。さらなる対照として、Ｐ．パストリスＸ３３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）およびＰ．パストリスＸ３３ ΔＡｄｈ２（Ｎｏｃｏｎら、２０１４）を使用した。
ｂ）無細胞抽出物は、終夜培養を遠心分離（１６，０００ｇ、５分、４℃）し、それを１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁することによって調製した。２回目の遠心分離ステップ（１６，０００ｒｐｍ、５分、４℃）の後、細胞は、ガラスビーズ（ｇｌａｓｓ ｂｅａｔｓ）を含む０．５ｍＬの細胞溶解緩衝液に再懸濁した。培養を、ステップの間氷上で１分間冷却しながら、６ｍ／ｓで３×２０秒間ビーズ破砕により、ｒｉｂｏｌｙｓｅｒ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で溶解した。溶解ステップの後、培養物を遠心分離（１６．０００ｇ、５分、４℃）し、上澄み液を新しいエッペンドルフチューブに移し、再び遠心分離（１６．０００ｇ、３０分、４℃）し、持ち越した細胞デブリを除去した。２回目の遠心分離ステップの後、上澄み液を使用まで－２０℃で保存した。
ｃ）細胞溶解緩衝液は、５０ｍＬあたり２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４２０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、１ ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＧｍｂＨ）からなる。アッセイ緩衝液は、ｐＨ８．９の、１００ｍＭ ＭＯＰＳ、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、２ｍＭ ＮＡＤ＋からなる。
ｄ）無細胞抽出物のタンパク質濃度は、製造業者の推奨により、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）によって測定し、全ての試料を３．８ｍｇ／ｍＬの共通濃度に均一に調整した。
ｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性アッセイは、９６ウェルプレートで行った。測定は、３４０ｎｍでのＮＡＤＨの吸光度を測定することにより、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．，Ｓｗｉｓｓ）で行った。温度は４２℃に設定した。アッセイを開始するため、２０μＬの無細胞抽出物をアッセイ緩衝液に添加し、基質として１Ｍのエタノールを添加する前に１０から１５分間平衡化した。全終了体積は、３００μＬであった。ｍＵ／ｍｇでの活性は、基質エタノールの添加後の吸収の最大線形増加から算出した。１活性単位は、１分当たりに消費される１μｍｏｌの基剤（ＮＡＤ＋）に相当する。これは、ランベルト－ベールの法則および係数εＮＡＤＨ＝６２２０ Ｍ－１ｃｍ－１を使用して、吸収データから算出した。
ｆ）結果は、無細胞抽出物のアルコールデヒドロゲナーゼ活性へのＡＨＤ遺伝子欠失の効果を明確に示す（表１８）。ＡＤＨ２遺伝子を欠失することにより、９４％の活性減少が達成される。これは、Ｐ．パストリスＸ３３株によってさらに確認される。第２のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ＡＤＨ９００も欠失することにより、９９％の合わせた活性減少が観察される。
Figure 2022528536000034
実施例１５：メタノール利用陰性およびアルコールデヒドロゲナーゼ欠損株のメタノール取り込み率の測定。
メタノール取り込み率を決定するため、Ｍｕｔ－およびアルコールデヒドロゲナーゼ欠損株を、バイオリアクター内で培養した。試験した株は、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ Ａｄｈ２Δ：：ＨｐｈＲ、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ Ａｄｈ９００Δ：：ＫａｎＭＸおよびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ Ａｄｈ２Δ：：ＨｐｈＲ Ａｄｈ９００Δ：：ＫａｎＭＸであった。培養は、特定のバイオマス濃度まで増殖させた。次いで、メタノールパルスを適用し、パルスの直後およびおよそ２０時間後にメタノール濃度を測定した。実験設定は、実施例７に既に詳細に記載した。目的は、アルコールデヒドロゲナーゼ欠損株の特異的メタノール取り込み率を決定し、それを実施例７で測定したメタノール取り込み率と比較することであった。
ａ）３００ｍＬのＢＳＭ培地で満たしたリアクターに、１５ｍＬのＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ａｄｈ２Δ：：ＨｐｈＲ（リアクターａＲ２およびａＲ４）およびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ａｄｈ９００Δ：：ＫａｎＭＸ（リアクターａＲ１およびａＲ３）を接種した。標的開始ＯＤ６００は２であった。残存酸素スパイクによって示されるバッチ段階の終了時に、５０％（ｗ／ｗ）グルコース供給を２．８ｍＬ／ｈで開始し、２４時間バイオマスを増加させた。グルコース供給開始の２時間後、５０％（ｖ／ｖ）メタノールショットを与え、メタノール濃度を１．５％に増加させた（測定した濃度は、ａＲ１＝１．６４％、ａＲ２＝１．６６％、ａＲ３＝１．５９％、およびａＲ４＝１．６７％であった）。これは、メタノール消費を誘導するために行われた。グルコース供給段階の終了時に、細胞乾燥重量およびＨＰＬＣのための試料を採取した。
ｂ）グルコース供給段階の後、撹拌およびガス注入は、一定な７５０ｒｐｍおよび９．５ｓＬ／ｈに設定した。追加の５０％メタノールパルスを添加し、濃度を１．５％に増加させ、すぐにＨＰＬＣ試料を採取した（測定された濃度は、ａＲ１＝１．３６％、ａＲ２＝１．４４％、ａＲ３＝１．３４％およびａＲ４＝１．４５％であった）。濃度を１８．４時間後に再び測定し、特異的なメタノール取り込み率（ｑメタノール）を決定するために使用した。
ｃ）別々のバイオリアクター培養を開始し、二重ＡＤＨ欠失株Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ａｄｈ２Δ：：ＨｐｈＲ ａｄｈ９００Δ：：ＫａｎＭＸの取り込み率を測定した。培養は、この実施例および実施例７で説明したように行った。Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ Ａｄｈ２Δ：：ＨｐｈＲ Ａｄｈ９００Δ：：ＫａｎＭＸをリアクターｃＲ３およびｃＲ４に接種した。標的開始ＯＤ６００は２であった。残存酸素スパイクによって示されるバッチ段階の終了時に、５０％（ｗ／ｗ）グルコース供給を２．４ｍＬ／ｈで開始し、２４時間バイオマスを増加させた。グルコース供給開始の２時間後、５０％（ｖ／ｖ）メタノールショットを与え、メタノール濃度を１．５％に増加させた（測定した濃度は、ｃＲ３＝１．５０％およびｃＲ４＝１．４７％であった）。これは、メタノール消費を誘導するために行われた。グルコース供給段階の終了時に、細胞乾燥重量およびＨＰＬＣのための試料を採取した。
ｄ）グルコース供給段階の後、撹拌およびガス注入は、一定な７５０ｒｐｍおよび９．５ｓＬ／ｈに設定した。追加の５０％メタノールパルスを添加し、濃度を１．５％に増加させ、すぐにＨＰＬＣ試料を採取した（測定された濃度は、ｃＲ３＝１．３７％およびｃＲ４＝１．４９％であった）。濃度を１９．５時間後に再び測定し、特異的なメタノール取り込み率（ｑメタノール）を決定するために使用した。
ｅ）特異的メタノール取り込み率は、実施例７ｄ）のように算出した。ＡＤＨ２を欠失させることにより、メタノール取り込み率の驚くべき、および実質的な減少が達成された（表１９）。メタノールのｄｃ／ｄｔは、ａＲ２およびａＲ４で０．０７～０．０６ｇ Ｌ－１ｈ－１であり、実施例６で観察された蒸発よりわずかだけ高かった。反対に、ＡＤＨ９００欠失株のメタノール取り込み率は減少せず、実際、実施例７のＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２の測定された取り込み率よりわずかに高かった。この差は、実施例７とこの実施例の間でわずかに異なる条件に起因し、その差は、わずかに高いリアクター体積およびメタノールパルス後のメタノール濃度であり得る。二重ＡＤＨ欠失株は、ＡＤＨ２欠失株の既に低い取り込み率と比較して、メタノール取り込み率の観察可能な減少を示さない。これらの結果は、ＡＤＨ２遺伝子およびその産物、酵素Ａｄｈ２がＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２で観察される特徴を最も広範囲に担い、実施例７における観察は、自然なメタノール酸化または任意の他の酵素の乱雑な活性の結果ではないことを予期せず確認した。
したがって、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２におけるメタノール取り込みの主な原因遺伝子および酵素は、ＡＤＨ２遺伝子およびその産物である酵素Ａｄｈ２であると結論付けられた。
Figure 2022528536000035
実施例１６：メタノール利用陰性およびアルコールデヒドロゲナーゼ過剰発現株のメタノール取り込み率の測定。
Ａｄｈ２がＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２におけるメタノールの消費の原因酵素であることを確認するため、およびＡＤＨ２またはＡＤＨ９００遺伝子の過剰発現によりメタノール取り込み率を増加することが可能であるか調べるため、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＧＡＰ＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴおよびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＧＡＰ＿Ａｄｈ９００＿ＣｙｃＴＴ株の特異的メタノール取り込み率を、バイオリアクター培養で測定した。実験は、実施例７および１５に記載のように行った。
ａ）３００ｍＬのＢＳＭ培地で満たしたリアクターに、１５ｍＬのＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＧＡＰ＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴ（リアクターＲ１およびＲ３）およびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＧＡＰ＿Ａｄｈ９００＿ＣｙｃＴＴ（Ｒ２およびＲ４）を接種した。標的開始ＯＤ６００は２であった。残存酸素スパイクによって示されるバッチ段階の終了時に、５０％（ｗ／ｗ）グルコース供給を２．８ｍＬ／ｈで開始し、２４時間バイオマスを増加させた。グルコース供給開始の２時間後、５０％（ｖ／ｖ）メタノールショットを与え、メタノール濃度を１．５％に増加させた（測定した濃度は、Ｒ１＝１．５６％、Ｒ２＝１．５３％、Ｒ３＝１．５２％、およびＲ４＝１．５４％であった）。これは、メタノール消費を誘導するために行われた。グルコース供給段階の終了時に、細胞乾燥重量およびＨＰＬＣのための試料を採取した。
ｂ）グルコース供給段階の後、撹拌およびガス注入は、一定な７５０ｒｐｍおよび９．５ｓＬ／ｈに設定した。追加の５０％メタノールパルスを添加し、濃度を１．５％に増加させ、すぐにＨＰＬＣ試料を採取した（測定された濃度は、Ｒ１＝１．３０％、Ｒ２＝１．３０％、Ｒ３＝１．３５％およびＲ４＝１．３０％であった）。濃度を４．１、２０．１時間後に再び測定し、特異的なメタノール取り込み率（ｑメタノール）を決定するために使用した。
ｃ）より高いメタノール取り込み率が期待されたため、４．１時間でのさらなるサンプリング時間が選択された。４．１時間での平均メタノール取り込み率は、ＡＤＨ２過剰発現株Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＧＡＰ＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴで７．７２ｍｇ ｇ－１ｈ－１であり、ＡＤＨ９００過剰発現株Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＧＡＰ＿Ａｄｈ９００＿ＣｙｃＴＴで５．６１ｍｇ ｇ－１ｈ－１であった。２０．１時間後、平均取り込み率は、ＡＤＨ２過剰発現株で６．３５ｍｇ ｇ－１ｈ－１に、ＡＤＨ９００過剰発現株で５．１６ｍｇ ｇ－１ｈ－１に減少した（表２０）。実施例１５ｅ）で先に議論したように、ＡＤＨ９００遺伝子を欠失する場合、親Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２への顕著な差は観察されず、同じことがＡＤＨ９００遺伝子を過剰発現する場合にも当てはまる。一方で、ＡＤＨ２過剰発現株は、ＡＤＨ９００過剰発現株と比較して４．１時間と２１．７時間で３７％と２３％高い取り込み率を示した。Ａｄｈ２がメタノールの消費の原因酵素であり、ＡＤＨ２遺伝子の過剰発現によりメタノール消費を増加させることができるという予期せぬ発見をさらに強調する。
Figure 2022528536000036
実施例１７：ＡＤＨ２過剰発現のためのメタノール誘導性プロモーターを有する株の生成
メタノール誘導性ＡＤＨ２過剰発現の効果を調べる目的のため、ＡＤＨ２コード配列の発現を制御するメタノール誘導性プロモーターＰＡＯＸ１ ＰＰ７４３５＿ｃｈｒ４（２３７９４１・・・２３８８９８）およびＰＦＬＤ１ ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ３（２６２９２２・・・２６３５１８）から構成される、２つの過剰発現構築物を作成した。ＡＤＨ２コード配列を改変し、遺伝子産物のアミノ酸配列に影響することなくコード配列のＢｂｓＩおよびＢｓａＩ制限部位を除去した（表１６）。生成した株は、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＡＯＸ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴおよびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＦＬＤ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴと名付けた。
ａ）既に記載された（Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒら，２０１７）Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーを使用して、発現構築物を作成した。（１）発現構築物ＢＢ３ａＺ＿ｐＡＯＸ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴは以下のようにアセンブルした。Ａｄｈ２＿ＧＧ＿ｃｕｒｅｄ ＤＮＡ断片（表１６）を、ＢＢ１＿２３骨格へとクローニングし、ＢＢ１＿２３＿Ａｄｈ２を作成した。発現構築物は、ＢＢ３ａＺ＿１４＊（骨格）、ＢＢ１＿２３＿Ａｄｈ２（コード配列）ＢＢ１＿１２＿ｐＡＯＸ１（プロモーター）、ＢＢ１＿３４＿ＳｃＣＹＣ１ｔｔ（ターミネーター）のＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーによって生成した。（２）発現構築物ＢＢ３ａＺ＿ｐＦＬＤ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴは、ＢＢ３ａＺ＿１４＊（骨格）、ＢＢ１＿２３＿Ａｄｈ２（コード配列）ＢＢ１＿１２＿ｐＦＬＤ１（プロモーター）、ＢＢ１＿３４＿ＳｃＣＹＣ１ｔｔ（ターミネーター）のＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーによって生成した。プラスミドおよび配列は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｉｃｓ ｋｉｔ＃１００００００１３３（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で入手可能である。
ｂ）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２株を、実施例１ａ）に記載のようにエレクトロコンピテントにした。ＢＢ３ａＺ＿ｐＡＯＸ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴ発現構築物およびＢＢ３ａＺ＿ｐＦＬＤ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴ発現構築物を、製造業者のプロトコールによりＡｓｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて線状化し、Ｈｉ Ｙｉｅｌｄ（登録商標）Ｇｅｌ／ＰＣＲ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｕｄ－Ｌａｂｏｒｂｅｄａｒｆ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。５００ｎｇの線状化したプラスミドは、実施例１ａ）および１ｄ）に先に記載したように、エレクトロコンピテントなＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２に形質転換した。陽性の形質転換体を、２５μｇ／ｍＬのゼオシンを含むＹＰＤプレートで選択した。発現構築物のインテグレーションの成功は、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いる、プライマー１０９＿ＢＢ３ａＮ＿ｃｔｒｌ＿ｆｗｄおよびｐＧＡＰ＿ｇｏｉ＿ｒｅｖ＿ｖ２（表１７）でのＰＣＲ増幅により確かめた。作成された株は、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＡＯＸ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴおよびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＦＬＤ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴと呼ばれる。
ｃ）ＰＣＲ増幅のためのゲノムＤＮＡは、製造業者の推奨により、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いて単離した。ＰＣＲ増幅反応は、製造業者の推奨により、Ｑ５ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて行った。
実施例１８：ＡＤＨ２過剰発現のためのメタノール誘導性プロモーターを有するメタノール利用陰性株の特異的メタノール取り込み率の測定
特異的メタノール取り込み率へのメタノール誘導性プロモーターによるＡＤＨ２過剰発現の効果を調べるため、バイオリアクター培養を実施例７および実施例１６に記載のように設定した。この目的のため、実施例１７で生成した株Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＡＯＸ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴおよびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＦＬＤ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴを使用した。
ａ）３００ｍＬのＢＳＭ培地で満たしたリアクターに、１５ｍＬのＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＡＯＸ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴ（リアクターＲ１およびＲ２）およびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＦＬＤ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴ（Ｒ３およびＲ４）を接種した。標的開始ＯＤ６００は２であった。残存酸素スパイクによって示されるバッチ段階の終了時に、５０％（ｗ／ｗ）グルコース供給を２．８ｍＬ／ｈで開始し、２４時間バイオマスを増加させた。グルコース供給開始の２時間後、５０％（ｖ／ｖ）メタノールショットを与え、メタノール濃度を１．５％に増加させた（測定した濃度は、Ｒ１＝１．５７％、Ｒ２＝１．５７％、Ｒ３＝１．５７％、およびＲ４＝１．７０％であった）。これは、メタノール消費およびメタノール誘導性プロモーターを誘導するために行われた。グルコース供給段階の終了時に、細胞乾燥重量およびＨＰＬＣのための試料を採取した。
ｂ）グルコース供給段階の後、撹拌およびガス注入は、一定な７５０ｒｐｍおよび９．５ｓＬ／ｈに設定した。追加の５０％メタノールパルスを添加し、濃度を１．５％に増加させ、すぐにＨＰＬＣ試料を採取した（測定された濃度は、Ｒ１＝１．４２％、Ｒ２＝１．３９％、Ｒ３＝１．３９％およびＲ４＝１．４２％であった）。濃度を４．２時間後に再び測定し、特異的なメタノール取り込み率（ｑメタノール）を決定するために使用した。最初のパルスがほぼ消費された後、２度目のメタノールパルスを適用し、すぐにＨＰＬＣ試料を採取した（測定された濃度は、Ｒ１＝１．６１％、Ｒ２＝１．６５％、Ｒ３＝１．５０％およびＲ４＝１．４７％であった）。濃度を６．２時間後に再び測定し、２度目の特異的なメタノール取り込み率（ｑメタノール）を決定するために使用した。
ｃ）２回のメタノールパルスを使用して、特異的メタノール取り込み率（ｑメタノール）を決定した。第１のパルスとサンプリング時間の間の時間は４．２時間であった。第２のメタノールパルスとサンプリング点の間の時間は、６．２時間であった。第１のパルス後、４．２時間後の平均メタノール取り込み率は、ＰＦＬＤ１ＡＤＨ２過剰発現株Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＦＬＤ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴで８．３ｍｇ ｇ－１ｈ－１であり、ＰＡＯＸ１ＡＤＨ２過剰発現株Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＡＯＸ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴで１１．６ｍｇ ｇ－１ｈ－１であった（表２１）。第２のメタノールパルスの６．２時間後、平均取り込み率は、ＰＦＬＤ１ＡＤＨ２過剰発現株で１０．１ｍｇ ｇ－１ｈ－１に、ＰＡＯＸ１ＡＤＨ２過剰発現株で１３．８ｍｇ ｇ－１ｈ－１に増加した（表２２）。このデータは、メタノール誘導性プロモーターを使用する場合、長いメタノール誘導時間が、Ａｄｈ２の発現および特異的メタノール取り込み率の増加をもたらすことを示す。したがって、株は、唯一のエネルギーおよび炭素源としてメタノールを含む培地中で、経時的に特異的メタノール取り込み率を維持および増加させることもできる。実施例７に記載のＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴ株と比較して、特異的メタノール取り込み率は、平均してＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＦＬＤ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴで１．６倍、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＢＢ３ａＺ＿ｐＡＯＸ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴで２．３倍増加した。
Figure 2022528536000037
Figure 2022528536000038
実施例１９：分泌組換えタンパク質を産生するＡＤＨ２過剰発現株の生成
ＡＤＨ２過剰発現および続く特異的メタノール取り込み率の増加が組換えタンパク質産生に影響を与えるかどうか調べるため、実施例３のＨＳＡおよびｖＨＨ産生Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２を、ＰＡＯＸ１ＡＤＨ２およびＰＦＬＤ１ＡＤＨ２過剰発現構築物を用いて形質転換し、実施例４に記載の適合プロトコールを用いてスモールスケールでスクリーニングした。
ａ）既に記載された（Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒら，２０１７）Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーを使用して、過剰発現構築物を作成した。（１）発現構築物ＢＢ３ａＫ＿ｐＡＯＸ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴは、実施例１７のＢＢ３ａＫ＿１４＊（骨格）、ＢＢ１＿２３＿Ａｄｈ２（コード配列）、ＢＢ１＿１２＿ｐＡＯＸ１（プロモーター）、ＢＢ１＿３４＿ＳｃＣＹＣ１ｔｔ（ターミネーター）のＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーによって生成した。（２）発現構築物ＢＢ３ａＫ＿ｐＦＬＤ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴは、実施例１７のＢＢ３ａＫ＿１４＊（骨格）、ＢＢ１＿２３＿Ａｄｈ２（コード配列）、ＢＢ１＿１２＿ｐＦＬＤ１（プロモーター）、ＢＢ１＿３４＿ＳｃＣＹＣ１ｔｔ（ターミネーター）のＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーによって生成した。プラスミドおよび配列は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｉｃｓ ｋｉｔ＃１００００００１３３（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で入手可能である。
ｂ）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴおよびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＺ３０＿ｐＡＯＸ１＿αＭＦ－ｖＨＨ＿ＣｙｃＴＴ株を、実施例１ａ）に記載のようにエレクトロコンピテントにした。ＢＢ３ａＫ＿ｐＡＯＸ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴ発現構築物およびＢＢ３ａＫ＿ｐＦＬＤ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴ発現構築物を、製造業者のプロトコールによりＡｓｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて線状化し、Ｈｉ Ｙｉｅｌｄ（登録商標）Ｇｅｌ／ＰＣＲ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｕｄ－Ｌａｂｏｒｂｅｄａｒｆ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。５００ｎｇの線状化したプラスミドは、実施例１ａ）および１ｄ）に先に記載したように、エレクトロコンピテントなＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴおよびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＺ３０＿ｐＡＯＸ１＿αＭＦ－ｖＨＨ＿ＣｙｃＴＴに形質転換した。Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＺ３０＿ｐＡＯＸ１＿αＭＦ－ｖＨＨ＿ＣｙｃＴＴ＿ＢＢ３ａＫ＿ｐＡＯＸ１＿Ａｄｈ２＿ＣＹｃＴＴおよびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＺ３０＿ｐＡＯＸ１＿αＭＦ－ｖＨＨ＿ＣｙｃＴＴ＿ＢＢ３ａＫ＿ｐＦＬＤ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴ形質転換体について、陽性の形質転換体を、５００μｇ／ｍＬのジェネテシンおよび２５μｇ／ｍＬのゼオシンを含むＹＰＤプレートで選択した。Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴ＿ＢＢ３ａＫ＿ｐＡＯＸ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴおよびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴ＿ＢＢ３ａＫ＿ｐＦＬＤ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴ形質転換体は、５００μｇ／ｍＬのジェネテシンおよび１００μｇ／ｍＬのノーセオスリシンを含むＹＰＤプレートで選択した。さらなるスクリーニングのため、形質転換当たり複数のクローンを選択した（実施例２０）。作成された株は、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＰＡＯＸ１ＨＳＡ ＰＡＯＸ１ＡＤＨ２、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＰＡＯＸ１ＨＳＡ ＰＦＬＤ１ＡＤＨ２、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＰＡＯＸ１ｖＨＨ ＰＡＯＸ１ＡＤＨ２、およびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＰＡＯＸ１ｖＨＨ ＰＦＬＤ１ＡＤＨ２と名付けられた。
実施例２０：分泌組換えタンパク質を産生するＡＤＨ２過剰発現株のスモールスケールスクリーニング
実施例１９に記載の形質転換体から複数のクローンをスモールスケールスクリーニングで試験し、ＡＤＨ２過剰発現の組換えタンパク質産生への影響を調べた。スクリーニング手順は、ツーショット－延長プロトコールおよび実施例４に記載の標準プロトコールから適合させた。
ａ）Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＰＡＯＸ１ＨＳＡ ＰＡＯＸ１ＡＤＨ２およびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＰＡＯＸ１ＨＳＡ ＰＦＬＤ１ＡＤＨ２の前培養のため、５００μｇ／ｍＬのジェネテシンおよび１００μｇ／ｍＬのノーセオスリシンを含む２ｍＬのＹＰＤにクローンを接種し、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＰＡＯＸ１ｖＨＨ ＰＡＯＸ１ＡＤＨ２およびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ＰＡＯＸ１ｖＨＨ ＰＦＬＤ１ＡＤＨ２クローンは、５００μｇ／ｍＬのジェネテシンおよび２５μｇ／ｍＬのゼオシンに接種した。親株は、選択のために使用する抗生物質耐性に基づき１００μｇ／ｍＬのノーセオスリシンまたは２５μｇ／ｍＬのゼオシンを含むＹＰＤに２つ反復して接種した。各発現構築物につき、スクリーニングのため１１個のクローンをピックした。前培養およびスクリーニング培養は、通気性膜で密封した２４ウェルプレートで培養し、２８０ｒｐｍ、２５℃でインキュベートした。スクリーニング培養物を、開始光学濃度（ＯＤ６００）８で、多糖溶液および酵素に基づくグルコース徐放システムＥｎＰｕｍｐ２００（Ｅｎｐｒｅｓｓｏ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を有する２ｍＬの最小培地（ＡＳＭｖ６）に接種し、培養をグルコース限界に維持した。株は、受け取る全メタノールおよびインキュベーション時間が異なる、２つの異なるメタノール供給手順で比較した（表２３）。
ｂ）インキュベーション期間後、１ｍＬの各培養物を除去し、前計量したエッペンドルフチューブ内で遠心分離した。上澄み液を除去し、製造業者の使用説明書によりＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてタンパク質濃度を測定した。ウェット細胞重量は、細胞ペレットを含むエッペンドルフチューブを計量することにより決定し、以下のように算出した：重量（全）－重量（空）＝ウェット細胞重量（ＷＣＷ）（ｇ／Ｌ）。このデータから、収率を算出した：収率（μｇ／ｇ）＝タンパク質濃度／ウェット細胞重量。
Figure 2022528536000039
ｃ）結果は、表２４に要約する。驚くべきことに、親Ｍｕｔ－株と比較した場合、過剰発現は、ｖＨＨで１．７倍、ＨＳＡで２．３倍までタンパク質収率（μｇ／ｇ）を増加させた。実際に、ＡＤＨ２の過剰発現がＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２の組換えタンパク質産生を改善することを証明する。
ｄ）平均実行株を、バイオリアクター培養のために選択した。発現構築物のインテグレーションの成功は、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いる、プライマー１０９＿ＢＢ３ａＮ＿ｃｔｒｌ＿ｆｗｄおよびｐＧＡＰ＿ｇｏｉ＿ｒｅｖ＿ｖ２（表１７）でのＰＣＲ増幅により確かめた。ＰＣＲ増幅のためのゲノムＤＮＡは、製造業者の推奨により、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）で単離した。ＰＣＲ増幅反応は、製造業者の推奨により、Ｑ５ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて行った。
Figure 2022528536000040
実施例２１：モデルタンパク質としてＨＳＡを産生するＡＤＨ２過剰発現のメタノール資化陰性株。戦略３による培養－グルコース／メタノール同時供給段階および別々のメタノールのみの供給段階による供給戦略。
バイオリアクター培養は、実施例１９で生成され、実施例２０で選択されたメタノール利用陰性ＡＤＨ２過剰発現株の組換えタンパク質産生能力を評価するために実施した。この目的のため、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴ ＢＢ３ａＫ＿ｐＡＯＸ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴ（Δａｏｘ１Δａｏｘ２ ＰＡＯＸ１ＨＳＡ ＰＡＯＸ１ＡＤＨ２）およびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＮ２１＿ｐＡＯＸ１＿ＨＳＡｏｐｔ＿ＣｙｃＴＴ ＢＢ３ａＫ＿ｐＦＬＤ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴ（Δａｏｘ１Δａｏｘ２ ＰＡＯＸ１ＨＳＡ ＰＦＬＤ１ＡＤＨ２）株を、実施例１０および実施例１１に記載のように戦略３で培養した。
ａ）このバイオリアクター培養を３つの段階に分けた。（１）段階１は、バッチ段階であった。リアクターは、開始ＯＤ６００が２の産生株を接種した。接種は、実施例７ａ）ｂ）に記載のように行った。バッチ段階の終了は、残存酸素スパイクによって示された。（２）この時点で、段階２を開始した。段階２は、２５時間、４．８ｍＬ／ｈでの５０％（ｗ／ｗ）グルコース供給からなる。段階２の開始時には、５０％（ｖ／ｖ）メタノールパルスを適用し、メタノール濃度を標的の１．５％（ｖ／ｖ）に増加させ、続くメタノール供給を開始して、メタノール消費、蒸発およびグルコース供給による希釈に対抗した。（３）段階３は、１９．６（Ｒ１、Ｒ２）および２１．６（Ｒ５、Ｒ６）時間のメタノールのみの供給からなる。メタノール濃度を実施例６ｄ）に記載のようにＨＰＬＣによってアットラインで測定した。必要であれば追加の補正パルスを添加した。メタノール供給は、実施例８および９ｂ）のように時間間隔で算出した。各リアクターＲ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６で使用する株は、表２５で特定される。
ｂ）プロセスおよび生産性データは、表２６および表２７に見出すことができる。リアクターＲ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６の培養を通して最大および最小メタノール濃度は、８．０ｇ／Ｌから１３．６ｇ／Ｌの範囲であった。リアクターＲ１、Ｒ２およびＲ５、Ｒ６は、モデルタンパク質としてＨＳＡを産生していた。段階３の６８．７時間での特異的生産性（ｑＰ）は、実施例１０と比較してＰＡＯＸ１またはＰＦＬＤ１のいずれかによるＡＤＨ２過剰発現の正の影響を示す（表２８、表２９）。ｑＰの加重平均は、簡単な比較のため、実施例１０の時点４５．０２～６９．５８時間について算出した。実施例１０の時点４５．０２～６９．５８時間でのｑｐは、平均４０．９μｇ ｇ－１ｈ－１である。本実施例の時点４９．１～６８．７時間のＰＡＯＸ１ＡＤＨ２過剰発現（Ｒ１、Ｒ２）のリアクターでのｑｐは、平均８４．３μｇ ｇ－１ｈ－１である。これは、実施例１０と比較して２倍の増加である（表２８）。同様の時間枠（４７．１～６８．７時間）でのＰＦＬＤ１ＡＤＨ２過剰発現（Ｒ５、Ｒ６）は、７１μｇ ｇ－１ｈ－１の平均ｑＰを示す。これはｑＰの１．７倍増加を示す（表２９）。時点６８．７時間での体積生産性は、ＰＡＯＸ１ＡＤＨ２過剰発現で１．２１倍（表３０）、ＰＦＬＤ１ＡＤＨ２過剰発現で１．１３倍（表３１）増加した。この実施例における増加したｑｐおよび体積生産性は、組換えタンパク質産生のためのＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２株におけるＡＤＨ２過剰発現の利点を実証する。
Figure 2022528536000041
Figure 2022528536000042
Figure 2022528536000043
Figure 2022528536000044
Figure 2022528536000045
Figure 2022528536000046
Figure 2022528536000047
実施例２２：モデルタンパク質としてｖＨＨを産生するＡＤＨ２過剰発現のメタノール利用陰性株。戦略３による培養－グルコース／メタノール同時供給段階および別々のメタノールのみの供給段階による供給戦略。
バイオリアクター培養は、実施例１９で生成され、実施例２０で選択されたメタノール利用陰性ＡＤＨ２過剰発現株の組換えタンパク質産生能力を評価するために実施した。この目的のため、Ｐ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＺ３０＿ｐＡＯＸ１＿ｖＨＨ＿ＣｙｃＴＴ ＢＢ３ａＫ＿ｐＡＯＸ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴ（Δａｏｘ１Δａｏｘ２ ＰＡＯＸ１ｖＨＨ ＰＡＯＸ１ＡＤＨ２）およびＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２ ｐＰＭ２ｐＺ３０＿ｐＡＯＸ１＿ｖＨＨ＿ＣｙｃＴＴ ＢＢ３ａＫ＿ｐＦＬＤ１＿Ａｄｈ２＿ＣｙｃＴＴ（Δａｏｘ１Δａｏｘ２ ＰＡＯＸ１ｖＨＨ ＰＦＬＤ１ＡＤＨ２）株を、実施例１０および実施例１１に記載のように戦略３で培養した。
ａ）バイオリアクター培養を３つの段階に分けた。（１）段階１は、バッチ段階であった。リアクターは、開始ＯＤ６００が２の産生株を接種した。接種は、実施例７ａ）ｂ）に記載のように行った。バッチ段階の終了は、残存酸素スパイクによって示された。（２）この時点で、段階２を開始した。段階２は、２５時間、４．８ｍＬ／ｈでの５０％（ｗ／ｗ）グルコース供給からなる。段階２の開始時には、５０％（ｖ／ｖ）メタノールパルスを適用し、メタノール濃度を標的の１．５％（ｖ／ｖ）に増加させ、続くメタノール供給を開始して、メタノール消費、蒸発およびグルコース供給による希釈に対抗した。（３）段階３は、４３．６（Ｒ３、Ｒ４）および４４．６（Ｒ７、Ｒ８）時間のメタノールのみの供給からなる。メタノール濃度を実施例６ｄ）に記載のようにＨＰＬＣによってアットラインで測定した。必要であれば追加の補正パルスを添加した。メタノール供給は、実施例８および９ｂ）のように時間間隔で算出した。各リアクターＲ３、Ｒ４、Ｒ７およびＲ８で使用する株は、表２５に見出すことができる。
ｂ）プロセスおよび生産性データは、表３２および表３３に見出すことができる。リアクターＲ３、Ｒ４、Ｒ７およびＲ８の培養を通して最大および最小メタノール濃度は、８．６ｇ／Ｌから１４．４ｇ／Ｌの範囲であった。リアクターＲ３、Ｒ４およびＲ７、Ｒ８は、モデルタンパク質としてｖＨＨを産生していた。ＡＤＨ２過剰発現は、実施例１１と比較して特異的生産性（ｑＰ）に正の影響を示した。簡単な比較のため、ｑＰの加重平均は、実施例１１の段階２（時点２０．０～５３．６時間）について算出した。比較は、段階２でのｑＰの、ＰＡＯＸ１ＡＤＨ２過剰発現（Ｒ３、Ｒ４）が１．７１倍、ＰＦＬＤ１ＡＤＨ２過剰発現（Ｒ７、Ｒ８）が１．７８倍の増加を示すことを示す（表３４、表３５）。段階３でのより遅い時点では、改善がさらに大きい。時点９２．７および９１．７では、ｑＰは、３．７６倍（ＰＡＯＸ１ＡＤＨ２過剰発現）および３．８６倍（ＰＦＬＤ１ＡＤＨ２過剰発現）増加する（表３４、表３５）。さらに、体積生産性は、両ケースにおいて、実施例１１の親株と比較して少なくとも１．９倍改善した（表３５、表３６）。この実施例における増加したｑＰおよび体積生産性は、組換えタンパク質産生のためのＰ．パストリスΔａｏｘ１Δａｏｘ２株におけるＡＤＨ２過剰発現の利点を実証する。
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引用文献
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Claims (27)

  1. ａ）１つまたは複数の遺伝子改変の前の宿主細胞と比較して、第１および第２の内因性遺伝子の発現を減少させるための前記１つまたは複数の遺伝子改変であって、
    ｉ．前記第１の内因性遺伝子が、配列番号１として特定されるアミノ酸配列を含むアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）またはそのホモログをコードし、
    ｉｉ．前記第２の内因性遺伝子が、配列番号３として特定されるアミノ酸配列を含むアルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）またはそのホモログをコードする、
    遺伝子改変、ならびに
    ｂ）１つまたは複数の遺伝子改変の前の宿主細胞と比較して、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）遺伝子の発現を増加させるための前記１つまたは複数の遺伝子改変であって、前記ＡＤＨ２遺伝子がアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）をコードする、遺伝子改変
    によって操作されている、組換えメタノール利用経路欠損メチロトローフ酵母（Ｍｕｔ－）宿主細胞。
  2. 前記１つまたは複数の遺伝子改変が、（ｉ）１つもしくは複数のポリヌクレオチド、もしくはその一部；または（ｉｉ）発現制御配列、の破壊、置換、欠失、ノックインもしくはノックアウトを含む、請求項１に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  3. 前記発現制御配列が、プロモーター、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列または翻訳開始および停止配列、エンハンサー配列およびアクティベーター配列からなる群から選択される、請求項２に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  4. 前記第１および／または第２の内因性遺伝子が、前記１つまたは複数の遺伝子改変によってノックアウトされている、請求項１～３のいずれか一項に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  5. 前記ＡＤＨ２遺伝子が、前記Ｍｕｔ－宿主細胞に対して内因性または異種である、請求項１～４のいずれか一項に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  6. 前記ＡＤＨ２が、
    ａ）配列番号５０として特定されるアミノ酸配列を含むＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＨ２であるＡＤＨ２、または酵母種に対して内因性であるそのホモログ；
    ｂ）配列番号５０に対して少なくとも６０％同一である、ａ）のＡＤＨ２の変異体
    のうちのいずれかである、請求項１～５のいずれか一項に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  7. 前記１つまたは複数の遺伝子改変が、ＡＤＨ２のレベルまたは活性の増加をもたらす、前記ＡＤＨ２遺伝子の機能獲得変更を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  8. 前記機能獲得変更が、前記ＡＤＨ２遺伝子のノックインを含む、請求項７に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  9. 前記機能獲得変更が、前記細胞における前記ＡＤＨ２遺伝子発現を上方調節する、請求項７または８に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  10. 前記機能獲得変更が、前記細胞において前記ＡＤＨ２遺伝子を過剰発現させるための異種発現カセットの挿入を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  11. 前記異種発現カセットが、プロモーター配列の制御下におけるＡＤＨ２遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドを含む、請求項１０に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  12. 目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）に作動可能に連結した発現カセットプロモーター（ＥＣＰ）を含む異種目的遺伝子発現カセット（ＧＯＩＥＣ）を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  13. 前記ＥＣＰが、メタノール誘導性プロモーターである、請求項１２に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  14. 前記ＥＣＰが、
    ａ）配列番号５に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するｐＡＯＸ１プロモーター；
    ｂ）配列番号６に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するｐＡＯＸ２プロモーター；または
    ｃ）配列番号３６～４９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーター
    のうちのいずれかである、請求項１３に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  15. 前記ＧＯＩＥＣが、前記ＰＯＩの分泌を可能にするシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  16. 前記シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ＧＯＩの５’末端に隣接して融合している、請求項１５に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  17. 前記ＰＯＩが、前記Ｍｕｔ－宿主細胞または前記ＥＣＰに対して異種である、請求項１２～１６のいずれか一項に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  18. 前記ＰＯＩが、抗原結合性タンパク質、治療用タンパク質、酵素、ペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物－タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン抗原、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、プロセシング酵素からなる群から選択されるペプチドまたはタンパク質である、請求項１２～１７のいずれか一項に記載のＭｕｔ－宿主細胞。
  19. 前記Ｍｕｔ－宿主細胞が、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、またはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の酵母細胞である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 目的のタンパク質（ＰＯＩ）を製造する方法であって、炭素源としてメタノールを使用して請求項１～１８のいずれか一項のＭｕｔ－宿主細胞を培養して前記ＰＯＩを製造するステップを含む方法。
  21. 細胞培養物から発酵産物が単離され、発酵産物が、前記Ｍｕｔ－宿主細胞から得られた前記ＰＯＩまたは宿主細胞代謝物質を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. ａ）前記Ｍｕｔ－宿主細胞が、エネルギー源として基礎炭素源を使用して培養される、増殖段階
    の後に、
    ｂ）前記Ｍｕｔ－宿主細胞が、メタノール供給を使用して培養され、それにより前記ＰＯＩを産生する、産生段階
    が続く、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 少なくとも２４時間の前記産生段階の間に、宿主細胞培養において０．５～２．０％（ｖ／ｖ）の平均メタノール濃度が使用される、請求項２２に記載の方法。
  24. 少なくとも２４時間の前記産生段階の間に、前記メタノール供給が、少なくとも２ｍｇメタノール／（ｇ乾燥バイオマス＊ｈ）の平均供給速度である、請求項２２または２３に記載の方法。
  25. 前記Ｍｕｔ－宿主細胞が、前記産生段階の間、前記宿主細胞の増殖を１０％（ｗ／ｗバイオマス）未満に制限する条件下において培養される、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 組換えメタノール利用経路欠損メチロトローフ酵母（Ｍｕｔ－）宿主細胞が、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）の基質としてメタノールを使用すること、および発酵産物を製造することを可能にする条件下で前記Ｍｕｔ－宿主細胞を培養するステップを含む、前記発酵産物を製造する方法におけるＭｕｔ－宿主細胞の使用。
  27. 組換えメタノール利用経路欠損メチロトローフ酵母（Ｍｕｔ－）宿主細胞が、炭素源としてメタノールを使用して発酵産物を産生することを可能にする条件下で前記Ｍｕｔ－宿主細胞を培養するステップを含む、前記発酵産物を製造する方法におけるＭｕｔ－宿主細胞の使用であって、Ｍｕｔ－宿主細胞が、
    ａ）１つまたは複数の遺伝子改変の前の前記宿主細胞と比較して、第１および第２の内因性遺伝子の発現を減少させるための１つまたは複数の遺伝子改変であって、
    ｉ．前記第１の内因性遺伝子が、配列番号１として特定されるアミノ酸配列を含むアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）またはそのホモログをコードし、
    ｉｉ．前記第２の内因性遺伝子が、配列番号３として特定されるアミノ酸配列を含むアルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）またはそのホモログをコードする、
    遺伝子改変、ならびに
    ｂ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）遺伝子の発現を増加させるための１つまたは複数の遺伝子改変であって、前記ＡＤＨ２遺伝子がアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）をコードする、遺伝子改変
    によって操作されている、使用。
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