JP2023543604A - 翻訳因子を過剰発現する宿主細胞 - Google Patents

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Abstract

目的の遺伝子（ＧＯＩ）を発現する組換え真核生物宿主細胞であって、遺伝子改変によって、メッセンジャーリボ核タンパク質（ｍＲＮＰ）の翻訳開始因子（ＴＩＦ遺伝子）をコードする２つ以上の遺伝子の発現を、当該１つ以上の遺伝子改変の前の宿主細胞と比較して増加させるように操作され、当該ＴＩＦ遺伝子が、少なくともｅＩＦ４Ａをコードする遺伝子と、ｅＩＦ４Ｇをコードする遺伝子と、を含み、当該ＴＩＦ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現が、当該ＧＯＩの発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの転写制御下にある、組換え真核生物宿主細胞。【選択図】なし

Description

本発明は、１つ以上の翻訳因子の発現を増加させるように操作された、組換えタンパク質産生及び宿主細胞の収率を改善することに言及する。
組換え宿主細胞培養で産生されるタンパク質は、診断剤及び治療剤としてますます重要になっている。この目的のために、細胞は、異常に高いレベルの目的の組換えタンパク質又は異種タンパク質を産生するように操作及び／又は選択される。
目的のタンパク質（ＰＯＩ）の産生の成功は、細胞培養中の真核生物宿主細胞において達成されている。真核生物宿主細胞、特に哺乳類宿主細胞、酵母若しくは糸状菌、又は細菌は、バイオ医薬タンパク質及びバルク化学物質の産生宿主として一般的に使用されている。最も顕著な例は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのようなメチル栄養酵母であり、これは、異種タンパク質の効率的な分泌でよく知られている。２００５年、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは新しい属Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａに再分類され、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ、Ｋ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓの３つの種に分けられた。バイオテクノロジー用途に一般的に使用される株は、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＫ．ｐｈａｆｆｉｉの２つの提案された種に属する。株ＧＳ１１５、Ｘ－３３、ＣＢＳ２６１２、及びＣＢＳ７４３５は、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉであるが、株ＤＳＭＺ７０３８２は、タイプ種Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓに分類され、これは、入手可能な全てのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の参照株である（Ｋｕｒｔｚｍａｎ ２００９，Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６（１１）：１４３５－８）。Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈら（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ２００９，８：２９ ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７５－２８５９－８－２９）は、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓのタイプ株ＤＳＭＺ７０３８２のゲノム配列決定を記載し、そのセクレクトーム及び糖輸送体を分析した。
リボソームは、タンパク質合成を行う複雑なリボ核タンパク質のアセンブリである。メッセンジャーリボ核タンパク質（ｍＲＮＰ）は、ｍＲＮＡ－タンパク質複合体であり、転写物は、転写物のライフサイクルを構成する共転写及び転写後事象を媒介する変化する一連のタンパク質によって結合される。転写物は、最初に５’末端キャッピング、多くの場合でスプライシング、３’切断及びポリアデニル化、核エキソソームによるｍＲＮＡ品質管理、及び輸送因子の動員を受ける。次いで、それらは細胞質に輸送され、一部は特定の細胞内局在化を受ける。転写物は、しばしば制御された様式で最終的に翻訳され、分解される。
翻訳の開始は、組換えタンパク質の産生のための重要な経路にある。ｍＲＮＡ、いくつかの真核生物開始因子（ｅＩＦ）、及びリボソームタンパク質からなる閉ループ構造の形成は、翻訳の開始を支援し、したがって、全体的な翻訳効率を向上させることが検討されている。
Ｍｅａｄら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０１５，４７２：２６１－２７３）は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生する３０の組換えＣＨＯ細胞株のパネルにわたって、閉ループの主要成分であるｅＩＦ（ｅＩＦ３ａ、ｅＩＦ３ｂ、ｅＩＦ３ｃ、ｅＩＦ３ｈ、ｅＩＦ３ｉ、及びｅＩＦ４Ｇ１）、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）１及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質１（ＰＡＩＰ１）のｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルを記載している。高産生細胞株は、閉ループｍＲＮＡの形成に関与する翻訳開始因子の量を維持し、これらのタンパク質を適切なレベルに維持して、増強された組換えタンパク質産生を提供することが見出された。
ｅＩＦ４Ｆ複合体は、キャップ結合タンパク質ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｇ、及びＲＮＡヘリカーゼｅＩＦ４Ａからなる。ｅＩＦ４Ｇは、ＰＡＢＰ（ＰＡＢ１）、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ａ、及び（哺乳動物において）ｅＩＦ３の結合ドメインを有する足場タンパク質である。酵母及びヒトｅＩＦ４Ｇもまた、ＲＮＡに結合する。ｅＩＦ４ＧにおけるｅＩＦ４Ｅ及びＰＡＢＰの結合ドメインは、そのＲＮＡ結合活性と共に、ｅＩＦ４Ｇが、キャップ、ポリ（Ａ）テール、及びｍＲＮＡ本体の配列を介してｍＲＮＡとの独立した相互作用を調整して、「閉ループ」構造と称される安定した環状メッセンジャーリボ核タンパク質（ｍＲＮＰ）のアセンブリを可能にする。
閉ループモデルは、いくつかの翻訳開始因子を含むいくつかのタンパク質によって媒介される架橋機構を介して、ｍＲＮＡの５’末端と３’末端との相互作用を提案する。閉ループのコアブリッジは、５’キャップ、ｅＩＦ４Ｆ（ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｅ、及びｅＩＦ４Ｇからなる）、ｅＩＦ３、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）相互作用タンパク質１（ＰＡＩＰ１）、ＰＡＢＰ１、及びポリ（Ａ）テール間で形成される。ｍＲＮＡのこの環化は、リボソームのリサイクルを増強することによって、及び／又はｅＩＦ４ＦがｍＲＮＡにつながれたままで、翻訳開始の各ラウンドで遊離ｅＩＦ４Ｆプールから再動員される必要がないことを確実にすることによって、翻訳速度を増強することがほぼ受け入れられている。真核生物における翻訳の伸長、終結、及びリサイクル段階は、Ｄｅｖｅｒら（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ２０１２；４：ａ０１３７０６）及びＨｉｎｎｅｂｕｓｃｈら（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ２０１２；４：ａ０１１５４４）によって概説されている。
Ｒｏｏｂｏｌら（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０２０，５９：９８－１０５）は、哺乳類細胞株ＨＥＫ及びＣＨＯ細胞株における大型ｅＩＦ３複合体のｅＩＦ３ｉ及びｅＩＦ３ｖサブユニットの一過的かつ安定した過剰発現が、それぞれ増大した増殖速度、増加したタンパク質合成能力、及び遅延したアポトーシスに対する影響を調べている。ｅＩＦ３ｉは、１２個の異なるサブユニット（そのうち５個（ａ、ｂ、ｃ、ｇ、及びｉ）は保存されており、酵母から哺乳類までインビボで必須である）の単一コピーを含む真核生物開始因子３（ｅＩＦ３）複合体の成分である。
Ａｒｃｈｅｒら（ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１５Ｍａｒ；１２（３）：２４８－２５４）は、酵母におけるキャップ構造、ポリ（Ａ）テール、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｇ、及びＰＡＢ間の相互作用によって形成されたｍＲＮＡ閉ループを調査した。
Ｃｈａｎら（ｅＬｉｆｅ ２０１８；７：ｅ３２５３６）は、翻訳開始の阻害が個々の転写物を不安定化し、酵母におけるｍＲＮＡ分解を加速させることを記載している。ｅＩＦ４Ｅの５’キャップ結合変異体の過剰発現は、増殖の微妙な阻害を引き起こした。ｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ４Ｇを同時に下方調節すると、強い合成増殖欠陥が観察された。
３９Ｓ及び５７Ｓの翻訳複合体に存在する翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｇ１、及びｅＩＦ４Ｇ２は、ＰＡＢ１と共精製される。かかる複合体は、閉ループ因子ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｇ、及びＰＡＢ１を含み、ｍＲＮＡキャップへのｅＩＦ４Ｅの結合及びポリアデニル化テールへのＰＡＢ１の結合を介して明らかにｍＲＮＡと会合する（Ｄｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１８，８：１１４６８を参照）。
ＲＬＩ１は、リボソームのリサイクルに重要であり、効率的な終止コドンの認識に必要であり、したがって、翻訳の終結を刺激することが知られている。しかしながら、ＲＬＩ１は、翻訳開始及びリボソーム生合成において二重の機能を有する。Ｙａｒｕｎｉｎら（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００５，２４：５８０－５８８）は、ＲＬＩ１が、プレ４０Ｓ粒子及び成熟４０Ｓサブユニットに関連するリボソーム形成における機能を有することを記載している。ＲＬＩ１は、ＭＦＣ成分及び４０Ｓリボソームに特異的に関連する（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ２００４，２７９（４０）：４２１５７－４２１６８）。
Ｌｉａｏら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ（２０２０）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１０５２９－０２０－０２９７７－ｚ）は、翻訳関連因子過剰発現株におけるメタノール誘導下のｅＧＦＰの発現プロファイルを開示しており、メタノール誘導下で過剰発現させた場合、ｅＧＦＰ発現を有意に増加させる因子としてリボソーム生合成因子であるＢｃｙ１を同定した。ｅＩＦ４Ａ及びｅＩＦ４Ｇ過剰発現体は、かかる発現系において有意な効果を有しなかった。Ｂｃｙ１は、サイクリックＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）の調節サブユニットであり、リボソームタンパク質遺伝子、ポストジオーキシックシフト（ｐｏｓｔｄｉａｕｘｉｃ ｓｈｉｆｔ）遺伝子、及びストレス応答エレメント遺伝子を調節し、細胞増殖及び異種タンパク質発現の改善をもたらす。
ＷＯ２０１９／１７３２０４Ａ１は、ＰＡＢ１を過剰発現し、それによって、酢酸形成を低減する、大規模なエタノール産生における使用のための酵母を開示している。ＵＳ５６４６００９は、１つのオープンリーディングフレームにｅＩＦ４ＥをコードするＤＮＡセグメント及び目的のタンパク質をコードする別のＤＮＡセグメントを含み、それによって、真核生物宿主細胞（特に、ＨＥＫ細胞）におけるタンパク質の発現を増加させるハイブリッドベクターを開示している。
ＣＮ１１０５５１７５０は、ＲＬＩ１を過剰発現することによって酵母ｍＲＮＡ発現の効率を改善することに言及している。
ＥＰ３６６３３１９は、ＰＡＢ１及びｅＩＦ４Ｇを含む融合タンパク質を発現し、酵母において目的のタンパク質を発現することを開示している。
本概要は、以下の詳細な説明で更に説明される、簡略化された形式で概念の選択を紹介するために提供される。本概要は、特許請求される主題の主要な又は本質的な特徴を特定することを意図するものでもなく、特許請求される主題の範囲を限定することを意図するものでもない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、実用性、及び利点は、添付の図面に例示され、添付の特許請求の範囲に定義されるそれらの態様を含む、以下の書面による詳細な説明から明らかになるであろう。
本発明の目的は、産生宿主細胞における組換えタンパク質の産生を改善することである。特定の目的は、翻訳効率を高めることによって組換えタンパク質の収率を増加させることである。
本目的は、特許請求の範囲の主題によって解決され、本明細書に更に記載される。
本発明は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）を発現する組換え真核生物宿主細胞を提供し、これは、１つ以上の遺伝子改変の前の宿主細胞と比較して、メッセンジャーリボ核タンパク質（ｍＲＮＰ）の翻訳開始因子（ＴＩＦ遺伝子）をコードする２つ以上の遺伝子の発現を増加させるように遺伝子改変することによって操作される。
具体的には、当該より多くのＴＩＦ遺伝子のうちの２つは、少なくともｅＩＦ４Ａをコードする遺伝子と、ｅＩＦ４Ｇをコードする遺伝子と、を含むＴＩＦ遺伝子である。
特定の態様によれば、ＴＩＦ遺伝子は、ｅＩＦ４Ｅ、ＰＡＢ１、又はＲＬＩ１をコードする遺伝子のうちのいずれか１つ以上を更に含む。
特定の実施形態によれば、当該ＴＩＦ遺伝子は、以下のＴＩＦを含むか又はそれからなるＴＩＦをコードし、特に、以下のＴＩＦの組み合わせを含むか又はそれからなる：
ａ）ｅＩＦ４Ａ及びｅＩＦ４Ｇ、
ｂ）ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、及びｅＩＦ４Ｅ、
ｃ）ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４Ｅ、及びＰＡＢ１、
ｄ）ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、及びＰＡＢ１。
具体的には、上記の実施形態ａ）～ｄ）のＴＩＦの組み合わせのうちのいずれかは、任意選択的に、ＲＬＩ１を更に含み得る。
特定の態様によれば、宿主細胞は、少なくとも以下を過剰発現するように操作される：
ａ）ｅＩＦ４Ａ及びｅＩＦ４Ｇをコードする遺伝子、
ｂ）ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、及びｅＩＦ４Ｅをコードする遺伝子、
ｃ）ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４Ｅ、及びＰＡＢ１をコードする遺伝子、
ｄ）ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、及びＰＡＢ１をコードする遺伝子。
具体的には、宿主細胞は、上記ａ）～ｄ）に列挙されている遺伝子の組み合わせのうちのいずれかを過剰発現するように操作され、任意選択的に、ＲＬＩ１を過剰発現するように操作されるように更に操作され得る。具体的には、当該ＴＩＦ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現は、当該ＧＯＩの発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの転写制御下にある。具体的には、ＧＯＩは、ＧＯＩ発現カセット（ＧＯＩＥＣ）によって発現され、それぞれのＴＩＦ遺伝子は、ＴＩＦ遺伝子発現カセット（ＴＩＦＥＣ）によって発現される。発現カセットは、発現される遺伝子に作動可能に連結された少なくともプロモーターを含むか又はそれからなる。
特定の態様によれば、ＧＯＩＥＣプロモーターは、ＴＩＦＥＣプロモーターのうちのいずれか１つ以上又は全てと異なる。
プロモーターは、ＴＩＦ遺伝子及びＧＯＩを発現するために、それぞれの別個の発現カセットに特異的に含まれる。
具体的には、ｍＲＮＰのＴＩＦは、例えば、４３Ｓ前開始複合体（ＰＩＣ）に結合する前に、ｍＲＮＰ複合体又は活性化ｍＲＮＰに存在するＴＩＦである。かかるＴＩＦの中には、特に、閉ループ構造に関連すると理解されているｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、ＰＡＢ１、及び／又はＲＬＩ１などの閉ループ因子のうちの１つ以上があり、特に、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ａ、又はｅＩＦ４ＧなどのｅＩＦ４Ｆ複合体の因子のうちの１つ以上がある。
具体的には、当該ｅＩＦ４Ｇは、好ましくは、Ｐｉｃｈｉａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの酵母のｅＩＦ４Ｇ２（ＴＩＦ４６３２、真核生物開始因子４Ｆサブユニットｐ１３０）である。
特定の実施形態によれば、宿主細胞は、当該ＴＩＦ遺伝子のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つを過剰発現するように遺伝子操作され、当該ＴＩＦ遺伝子は、少なくともｅＩＦ４Ａ及びｅＩＦ４Ｇをコードする遺伝子を含む。
具体的には、当該ＴＩＦのうちの少なくとも２つは、ｅＩＦ４Ｆ複合体のもの（特に、ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、及び任意選択的にｅＩＦ４Ｅ）である。具体的には、ｅＩＦ４Ｆ複合体のＴＩＦ遺伝子のうちの２つ、３つ、若しくはそれ以上、又は全て（特に、ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、及び任意選択的に、ｅＩＦ４Ｅ）が過剰発現される。
具体的には、当該ＴＩＦのうちの少なくとも１つは、閉ループ因子、特にｅＩＦ４Ｇ、及び任意選択的に、ｅＩＦ４Ｅ又はＰＡＢ１のいずれか１つ又は両方であり得る。具体的には、１つ、２つ、３つ、若しくはそれ以上、又は全ての閉ループ因子（特に、ｅＩＦ４Ｇ、及び任意選択的に、ｅＩＦ４Ｅ又はＰＡＢ１のいずれか１つ又は両方）が過剰発現される。
具体的には、ＴＩＦ遺伝子は、真核生物又は原核生物（特に、酵母若しくは哺乳類）由来であり、天然に存在する遺伝子、又はその人工バリアント、特に、天然に存在するＴＩＦ（天然に存在するアイソフォームを含む）をコードする遺伝子、又は高い配列同一性を有し、かつ産生宿主細胞における活性化ｍＲＮＰ及び／若しくは翻訳開始におけるＴＩＦとほぼ同じ機能若しくは増加した機能を有する機能的に活性なバリアントを含む。
具体的には、ＴＩＦ遺伝子は、真核生物由来であり、例えば、本明細書に更に記載される宿主細胞種のうちのいずれかに由来する。例えば、以下に由来する：
ａ）ピキア属、ハンセヌラ属、コマガタエラ属、サッカロミセス属、クリベロマイセス属、カンジダ属、オガタエア属、ヤロウイア属、及びゲオトリクム属からなる群から選択される属の酵母細胞（好ましくは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、若しくはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、又は
ｂ）糸状菌の細胞（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ若しくはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、又は
ｃ）非ヒト霊長類、ヒト、げっ歯類、若しくはウシ細胞（例えば、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ（ＣＯＳ１及びＣＯＳ７など）、ＱＣ１－３、ＨＥＫ－２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢＩ、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解性若しくはハイブリドーマ細胞株）、又は
ｄ）昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｍｉｍｉｃ（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（ＢＴ１－ＴＮ－５Ｂ１－４）、若しくはＢＴ１－Ｅａ８８細胞）、又は
ｅ）藻類細胞（例えば、アンフォラ属、クサリケイソウ属、ドナリエラ属、クロレラ属、クラミドモナス属、藍藻類（シアノバクテリア）、ナンノクロロプシス属、スピルリナ属、若しくはオクロモナス属）、又は
ｆ）植物細胞（例えば、単子葉植物（好ましくは、トウモロコシ、イネ、コムギ、若しくはエノコログサ）由来の細胞、若しくは双子葉植物（好ましくは、キャッサバ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、アルファルファ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ、若しくはシロイヌナズナ）由来の細胞）。
特定の態様によれば、ＴＩＦ遺伝子は、真核生物起源であり、例えば、ＰＯＩと同じ種起源に由来する。特に、ＴＩＦ遺伝子は、酵母起源（例えば、ピキア又はサッカロマイセス）、又は哺乳類起源（例えば、ヒト又は非ヒト動物起源）であり得る。特定の態様によれば、ＴＩＦのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つは、酵母又は哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ハムスター、若しくは類人猿）タンパク質（天然に存在するアイソフォームを含む）である。
特定の実施形態によれば、酵母又はヒトＴＩＦ遺伝子のうちのいずれかは、宿主細胞における過剰発現のために選択される。
具体的には、本明細書に提供される目的のために使用されるＴＩＦは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のうちの少なくともいずれか１つが、それぞれの天然に存在する（天然又は野生型とも称される）ＴＩＦの配列（特に、本明細書に提供される配列によって特定されるＴＩＦのうちのいずれか１つ）と同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
特定の態様によれば、
ａ）当該ＴＩＦ遺伝子は、ｅＩＦ４Ｅをコードし、配列番号１～１１のうちのいずれか１つと、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性のうちの少なくともいずれか１つを含むか又はそれらからなり、
ｂ）当該ＴＩＦ遺伝子は、ｅＩＦ４Ａをコードし、配列番号１２～３３のうちのいずれか１つと、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つを含むか又はそれらからなり、
ｃ）当該ＴＩＦ遺伝子は、ｅＩＦ４Ｇをコードし、配列番号３４～４４のうちのいずれか１つと、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つを含むか又はそれらからなり、
ｄ）当該ＴＩＦ遺伝子は、ＰＡＢ１をコードし、配列番号４５～５５のうちのいずれか１つと、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つを含むか又はそれらからなり、かつ
ｅ）当該ＴＩＦ遺伝子は、ＲＬＩ１をコードし、配列番号５６～６５のうちのいずれか１つと、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つを含むか又はそれらからなる。
特定の態様によれば、
ａ）ｅＩＦ４Ｅタンパク質は、配列番号１～１１のうちのいずれか１つと、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つを含むか又はそれらからなり、
ｂ）ｅＩＦ４Ａタンパク質は、配列番号１２～３３のうちのいずれか１つと、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つを含むか又はそれらからなり、
ｃ）ｅＩＦ４Ｇタンパク質は、配列番号３４～４４のうちのいずれか１つと、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つを含むか又はそれらからなり、
ｄ）当該ＰＡＢ１タンパク質は、配列番号４５～５５のうちのいずれか１つと、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つを含むか又はそれらからなり、
ｅ）ＲＬＩ１タンパク質は、配列番号５６～６５のうちのいずれか１つと、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つを含むか又はそれらからなる。
具体的には、本明細書に提供される目的のために使用されるＴＩＦ遺伝子は、それぞれのＴＩＦをコードするヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる核酸分子である。ＴＩＦ遺伝子は、天然に存在する（天然又は野生型とも称される）ヌクレオチド配列を含むか若しくはそれからなるか、又は変異され得る（例えば、宿主細胞において当該ＴＩＦ遺伝子を発現するために最適化され得る（例えば、コドン最適化配列若しくはＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ最適化配列））。
具体的には、本明細書に提供される目的のために使用されるＴＩＦ遺伝子は、それぞれの天然に存在する（天然又は野生型とも称される）ＴＩＦ遺伝子の配列と（特に、本明細書に提供される配列によって特定されるＴＩＦ遺伝子のうちのいずれか１つと）、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のうちの少なくともいずれか１つであるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。
特定の態様によれば、当該１つ以上の遺伝子改変は、（ｉ）１つ以上のポリヌクレオチド若しくはその一部、又は（ｉｉ）発現制御配列、好ましくはプロモーター、リボソーム結合部位、転写若しくは翻訳の開始及び終止配列、エンハンサー及びアクチベーター配列からなる群から選択される発現制御配列のノックイン、置換、破壊、欠失、若しくはノックアウトを含み、好ましくは、当該１つ以上の遺伝子改変は、宿主細胞ゲノムへの異種ポリヌクレオチド又は発現カセットの組み込みを含む。
特定の態様によれば、当該１つ以上の遺伝子改変は、当該ＴＩＦ遺伝子の数若しくは当該ＴＩＦ遺伝子を含む発現カセットの数の増加、及び／又は当該ＴＩＦ遺伝子の機能獲得変化を含み、その結果、当該ＴＩＦ遺伝子のレベル若しくは活性が増加する。
特定の態様によれば、当該１つ以上の遺伝子改変は、それぞれのＴＩＦ遺伝子における機能獲得変化を含み、例えば、それぞれのＴＩＦ遺伝子を過剰発現させることによって、及び／又は分解を低減することによって、又はそれぞれのＴＩＦ遺伝子若しくはＴＩＦｍＲＮＡの安定性を増加させることによって、ＴＩＦのレベル若しくは活性を増加させる。
具体的には、当該機能獲得変化は、それぞれのＴＩＦ遺伝子のノックインを含む。
具体的には、当該機能獲得変化は、当該細胞におけるそれぞれのＴＩＦ遺伝子の発現を上方制御する。
具体的には、当該機能獲得変化は、当該細胞でそれぞれのＴＩＦ遺伝子を過剰発現するための異種発現カセットの挿入を含む。
機能獲得変化は、ＴＩＦ遺伝子の発現を増加させることに特異的であり、例えば、ＴＩＦをコードするポリヌクレオチド（又はかかるポリヌクレオチドを含むＴＩＦＥＣ）を宿主細胞ゲノムに導入すること、及び任意選択的に、かかるポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーターを破壊すること、かかるプロモーターをより高いプロモーター活性を有する別のプロモーターで置き換えることが含まれる。
遺伝子発現を改変する特定の方法は、ポリヌクレオチド（遺伝子）の発現を調節する調節配列の改変（例えば、活性化、上方調節、不活性化、阻害、又は下方調節）を調節することを用い、例えば、宿主細胞を改変するＣＲＩＳＰＲベースの方法に使用されるＲＮＡガイドリボヌクレーゼによる関連する配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写開始又は終止配列、翻訳開始又は終止配列、エンハンサー又はアクチベーター配列、リプレッサー又は抑制配列、シグナル又はリーダー配列、特にタンパク質の発現及び／又は分泌を制御するものからなる群から選択される調節配列を標的とするそれぞれの転写調節因子を使用する。
具体的には、ＴＩＦ遺伝子の発現を増加させるための当該１つ以上の遺伝子改変は、１つ以上のゲノム変異を含み、かかる遺伝子改変を有しないそれぞれの宿主と比較して、遺伝子又は遺伝子の一部の発現を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは９５％、又は更にそれ以上（例えば、異種遺伝子のノックインによって、又は内因性遺伝子のコピー数を増加させることによって）増加させる、それぞれの遺伝子又はゲノム配列の挿入又は活性化を含む。
具体的には、発現を増加させる１つ以上の遺伝子改変は、ゲノム変異を含み、１つ以上の内因性ポリヌクレオチドの発現を構成的に向上させるか、又はそうでなければ増加させる。
具体的には、発現を増加させる１つ以上の遺伝子改変は、１つ以上の誘導性又は脱抑制性調節配列を導入するゲノム変異を含み、１つ以上の内因性ポリヌクレオチドの発現を条件的に改善するか、又はそうでなければ増加させる。かかる条件的に活性な改変は、特に、それらの調節エレメント及び遺伝子を標的とし、細胞培養条件に依存して活性である、かつ／又は発現される。
具体的には、目的のタンパク質（ＰＯＩ）の産生方法で宿主細胞を使用する場合、それぞれのＴＩＦをコードするポリヌクレオチドの発現が増加する。具体的には、遺伝子改変の際、ＰＯＩが産生される間、宿主細胞培養の条件下で、それぞれのＴＩＦ遺伝子の発現が増加する。
具体的には、宿主細胞は、例えば、１つ以上のそれぞれのＴＩＦ遺伝子のノックインによって、当該改変を有しない宿主細胞と比較して、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のうちの少なくとも１つによって、それぞれのＴＩＦの量（例えば、レベル、活性、又は濃度）を増加させるように遺伝子改変される。特定の実施形態によれば、宿主細胞は、宿主細胞ゲノムに組み込まれている（１つ以上の）ゲノム配列（特に、それぞれのＴＩＦをコードするゲノム配列）の１つ以上の挿入を含むように遺伝子改変される。かかる宿主細胞は、典型的には、ノックイン株として提供される。
特定の実施形態によれば、本明細書に記載の宿主細胞が細胞培養で培養される場合、宿主細胞又は宿主細胞培養物におけるそれぞれの過剰発現されたＴＩＦの総量は、かかる遺伝子改変の前若しくは改変なしで宿主細胞によって発現若しくは産生される参照量と比較して、又はそれぞれの宿主細胞培養で産生される参照量と比較して、又は当該改変の前若しくは改変なしの宿主細胞と比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは９５％、又は更に１００％以上（活性％又はｍｏｌ／ｍｏｌ）のうちの少なくともいずれか１つで、増加する。
特定の態様によれば、当該ＴＩＦ遺伝子のうちの１つ以上は、宿主細胞に対して内因性又は異種である。具体的には、当該ＴＩＦ遺伝子は、それぞれのＴＩＦ発現カセット（ＴＩＦＥＣ）に含まれる。具体的には、当該ＴＩＦ遺伝子は、１つ以上のＴＩＦＥＣで発現される。
具体的には、当該ＴＩＦ遺伝子は、１つ以上の異種発現カセットに含まれ、特に、ＴＩＦ遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の発現制御配列（例えば、プロモーター）を含む異種発現構築物を含む。具体的には、当該発現構築物は、当該宿主細胞において天然に存在しないか、又は宿主細胞のゲノム若しくは染色体内に、それぞれの内因性ＴＩＦ遺伝子若しくは発現構築物が天然に存在する部位とは異なる部位に組み込まれているか、又はエピソームプラスミド上に提供される。
具体的には、任意の１つ、２つの３つ、４つ、若しくは５つ、若しくはそれ以上、又は全てのＴＩＦＥＣは、ＴＩＦ発現カセット（ＴＩＦＥＣ）プロモーターと称されるプロモーターを含む。
具体的には、ＴＩＦＥＣプロモーターは、発現されるＴＩＦ遺伝子にＴＩＦＥＣプロモーターが作動可能に連結された構成的プロモーター、又は誘導性若しくは脱抑制性プロモーターなどの調節性プロモーター、である。
具体的には、少なくとも１つＴＩＦＥＣプロモーター（例えば、同じ宿主細胞内のＴＩＦ発現カセットで使用される任意の１つ以上又は全てのＴＩＦＥＣプロモーター）は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（特に、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ若しくはＫ．ｐｈａｆｆｉｉ）のｐＡＯＸ１ではないか、又はメタノール誘導性ではない。ｐＡＯＸ１プロモーターは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｆ２ＱＹ２７によって特定されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓアルコールオキシダーゼ１のアルコールオキシダーゼ１をコードする天然遺伝子と称される「ＡＯＸ１」遺伝子の天然プロモーターとして理解される。
特定の態様によれば、宿主細胞は、ＧＯＩと、宿主細胞培養で当該ＧＯＩを発現するために当該ＧＯＩに作動可能に連結された１つ以上の発現制御配列と、を含む、発現カセットを更に含む。
具体的には、当該ＧＯＩは、ＴＩＦ発現カセットから分離されているＧＯＩ発現カセット（ＧＯＩＥＣ）で発現される。
具体的には、ＧＯＩＥＣは、ＧＯＩ発現カセット（ＧＯＩＥＣ）プロモーターとして称されるプロモーターを含む。
具体的には、ＧＯＩＥＣプロモーターは、調節性プロモーター（例えば、誘導性若しくは脱抑制性プロモーター又は構成的プロモーター）であり、ＧＯＩＥＣプロモーターは、発現されるＧＯＩに作動可能に連結される。
好ましくは、同じ宿主細胞内のＴＩＦ発現カセットで使用される少なくとも１つ、例えば、任意の１つ以上又は全てのＴＩＦＥＣプロモーターは、ＧＯＩＥＣプロモーター以外の任意のものである。
具体的には、
ａ）任意の１つ以上又は全てのＴＩＦＥＣプロモーターが、構成的であり、ＧＯＩＥＣプロモーターが、誘導性又は（脱）抑制性プロモーターである、
ｂ）任意の１つ以上又は全てのＴＩＦＥＣプロモーターが、誘導性又は（脱）抑制性であり、ＧＯＩＥＣプロモーターが、構成的プロモーターである、
ｃ）任意の１つ以上又は全てのＴＩＦＥＣプロモーターが、構成的であり、ＧＯＩＥＣプロモーターが、かかるＴＩＦＥＣプロモーターのうちのいずれか１つ以上とは異なるタイプ又は強度の構成的プロモーターである、
ｄ）任意の１つ以上又は全てのＴＩＦＥＣプロモーターが、誘導性又は（脱）抑制性であり、ＧＯＩＥＣプロモーターが、かかるＴＩＦＥＣプロモーターのうちのいずれか１つ以上とは異なるタイプ又は強度の誘導性又は（脱）抑制性プロモーターである。
特定の態様によれば、ＧＯＩＥＣプロモーターは、ＴＩＦＥＣプロモーターのいずれかと比較して、高いプロモーター強度を有する。
好ましい実施形態では、それぞれのＴＩＦをコードするポリヌクレオチドの発現は、構成的プロモーターによって駆動され、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）の発現は、誘導性プロモーターによって駆動される。更に別の好ましい実施形態では、それぞれのＴＩＦをコードするポリヌクレオチドの発現は、誘導性プロモーターによって駆動され、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）の発現は、構成的プロモーターによって駆動される。
一例として、ＴＩＦをコードするポリヌクレオチドの発現は、構成的ＧＡＰプロモーターによって駆動され得、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドの発現は、ＡＯＸ１又はＡＯＸ２プロモーターなどのメタノール誘導性プロモーターによって駆動され得る。
別の例として、ＴＩＦをコードするポリヌクレオチドの発現は、ＭＤＨ３、ＰＯＲ１、ＰＤＣ１、ＦＢＡ１－１、又はＧＰＭ１（Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１７，ＢＭＣ Ｓｙｓ Ｂｉｏｌ．１１：１２３）などの構成的プロモーターによって駆動され得、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドの発現は、ＡＯＸ１又はＡＯＸ２プロモーターなどのメタノール誘導性プロモーターによって駆動され得る。
別の例として、ＴＩＦをコードするポリヌクレオチドの発現は、ＧＡＰプロモーターなどの構成的プロモーターによって駆動され得、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドの発現は、本明細書に更に記載されるものなどの脱抑制性プロモーターによって駆動され得る。
別の例として、ＴＩＦをコードするポリヌクレオチドの発現は、構成的プロモーターによって駆動され得、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドの発現は、本明細書に更に記載されるものなどの脱抑制性プロモーターによって駆動され得る。
別の例として、ＴＩＦをコードするポリヌクレオチドの発現は、脱抑制性プロモーターによって駆動され得、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドの発現は、本明細書に更に記載されるものなどの脱抑制性プロモーターによって駆動され得る。
具体的には、本明細書で言及される発現カセットは、少なくとも１つのプロモーター及び当該プロモーターの転写制御下で発現されるポリヌクレオチド（又は遺伝子）、並びに任意選択的に、例えば、リボソーム結合部位、転写開始又は終止配列、翻訳開始又は終止配列、エンハンサー又はアクチベーター配列、リプレッサー又は抑制配列、シグナル又はリーダー配列、特にタンパク質の発現及び／又は分泌を制御するものからなる群から選択される更なる調節配列を含む。
具体的には、宿主細胞に対して異種である発現カセットが使用される。特に、発現カセットは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、プロモーター及びポリヌクレオチドは、互いに異種であり（自然界ではかかる組み合わせで存在していないことを意味する）、例えば、プロモーター及びポリヌクレオチドの一方（又は一方のみ）が、他方及び／若しくは本明細書に記載の宿主細胞に対して人工的若しくは異種的であるか、プロモーターが、内因性プロモーターであり、かつポリヌクレオチドが、異種性ポリヌクレオチドであるか、又はプロモーターが、人工的若しくは異種プロモーターであり、かつポリヌクレオチドが、内因性ポリヌクレオチドであり、プロモーター及びポリヌクレオチドの両方が、本明細書に記載の宿主細胞と比較して、人工的、異種、又は異なる起源由来（例えば、異なる種若しくは細胞型（株）由来）であることを意味する。具体的には、プロモーターは、本明細書に記載の宿主細胞として使用される細胞において、当該ポリヌクレオチドに天然に会合しない、かつ／又はそれに作動可能に連結されない。
特定の態様によれば、異種発現カセットは、自律的に複製するベクター又はプラスミドに含まれるか、又は当該宿主細胞の染色体内に組み込まれる。
ＧＯＩ発現構築物は、必要に応じて、宿主細胞において当該発現構築物から当該ＧＯＩを発現するために、ＧＯＩに作動可能に連結された発現制御配列（例えば、プロモーター）を含むか又はそれからなり得る。ＧＯＩ発現構築物は、別個の発現カセット、又は当該ＴＩＦ遺伝子のうちの１つ以上を更に発現する発現カセットに含まれてもよい。
特定の態様によれば、宿主細胞は、少なくとも１つの異種ＧＯＩＥＣを含む組換え宿主細胞であり、ＧＯＩＥＣに含まれる少なくとも１つの成分又は成分の組み合わせが、宿主細胞に対して異種である。具体的には、人工発現カセットが使用され、特に、プロモーター及びＧＯＩは、互いに異種であり、自然界ではかかる組み合わせは存在せず、例えば、プロモーター及びＧＯＩの一方（又は一方のみ）が、他方及び／若しくは本明細書に記載の宿主細胞に対して人工的若しくは異種であるか、プロモーターが、内因性プロモーターであり、かつＧＯＩが、異種ＧＯＩであるか、又はプロモーターが、人工的若しくは異種のプロモーターであり、かつＧＯＩが、内因性ＧＯＩであり、プロモーター及びＧＯＩの両方が、本明細書に記載の宿主細胞と比較して、人工的、異種、又は異なる起源由来（例えば、異なる種若しくは細胞型（株）由来）である。具体的には、ＧＯＩＥＣプロモーターは、本明細書に記載の宿主細胞として使用される細胞において、当該ＧＯＩに天然に会合しない、かつ／又は作動可能に連結されない。
具体的には、宿主細胞は、
ａ）１つ以上の異種ＴＩＦ発現カセットにおいて当該ＴＩＦ遺伝子のうちの１つ以上を発現する発現系であって、各々が、当該ＴＩＦ遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の発現制御配列を含む、発現系と、
ｂ）ＧＯＩ及び当該ＧＯＩに作動可能に連結された１つ以上の発現制御配列を含むＧＯＩ発現カセットと、を含み、
ａ）の発現系及びｂ）の発現カセットが、細胞培養で宿主細胞を培養する場合、それぞれのＴＩＦ遺伝子及びＧＯＩを発現するように操作される。
特定の態様によれば、宿主細胞は、１つ以上の異種発現カセットにおいて当該ＴＩＦ遺伝子のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つ、又はそれ以上を発現する発現系を含み、各々が、当該ＴＩＦ遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の発現制御配列を含む。特定の実施形態では、各ＴＩＦ遺伝子は、ＴＩＦＥＣプロモーターに作動可能に連結される。
細胞当たりのＧＯＩＥＣ又はＴＩＥＦＥＣの数は、典型的には、それぞれの発現産物の量を決定する。宿主細胞は、細胞当たり少なくとも１つのＧＯＩＥＣ及び少なくとも１つのＴＩＦＥＣコピーを特異的に含む。１つの発現カセットは、典型的には、「１つのコピー」と称される。
特定の態様によれば、宿主細胞当たりの１つのタイプのＧＯＩＥＣ又はＧＯＩＥＣコピーの数は、少なくとも（又は最大）１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又は更により多数、最大２０、３０、４０、若しくは５０のうちのいずれか１つであり得る。
特定の態様によれば、宿主細胞当たりの１つのタイプのＴＩＦＥＣ又はＴＩＦＥＣコピーの数は、少なくとも（又は最大）１、２、３、４、又は５のいずれか１つである。
特定の態様によれば、宿主細胞当たりの異種ＴＩＦＥＣの数は、少なくとも（又は最大）１、２、３、４、又は５である。
ＴＩＦＥＣは、好ましくは宿主細胞に対して異種であるが、ＧＯＩＥＣは、異種又は内因性であり得る。
特定の態様によれば、宿主細胞は、１つ以上（例えば、複数）の異種発現カセットを含み、これには、例えば、ＴＩＦを発現する１つ以上の発現カセットと、ＧＯＩを発現する１つ以上（複数）のコピー（例えば、ＴＩＦＥＣ又はＧＯＩＥＣの少なくとも１、２、３、４、又は５コピー（遺伝子コピー数、ＧＣＮ））の発現カセットと、を含む。コピーの各々は、同じ又は異なる配列を含むか又はそれらからなり得、発現されるそれぞれの遺伝子に作動可能に連結された発現制御配列を含む。
具体的には、宿主細胞において過剰発現されたＴＩＦの各々について、細胞当たりのＴＩＦをコードするポリヌクレオチドの数は、他の過剰発現ＴＩＦとほぼ同じ（＋／－１）であり、ほぼ同じレベルの全ての過剰発現ＴＩＦを確実にする。
特定の態様によれば、
ａ）少なくとも１つ（すなわち、ＴＩＦ発現カセットのうちの任意の１つ以上若しくは全て）が、構成的プロモーターを含み、かつ／又は
ｂ）ＧＯＩ発現カセットは、誘導性、脱抑制性、若しくはそうでなければ調節性プロモーター、又は構成的プロモーターを含む。
具体的には、ＧＯＩは、当該ＴＩＦ遺伝子とは異なるポリヌクレオチド又は遺伝子である。具体的には、ＧＯＩは、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を発現している。具体的には、ＰＯＩは、当該ＴＩＦとは異なるポリペプチド又はタンパク質である。
特定の態様によれば、ＰＯＩは、宿主細胞種に対して異種である。
特定の態様によれば、ＰＯＩは、治療薬又は診断薬である。好ましくは、ＰＯＩは、哺乳動物において機能する治療用タンパク質である。
具体的には、ＰＯＩは、抗原結合タンパク質、治療用タンパク質、酵素、ペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物－タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン抗原、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、プロセス酵素、及び代謝酵素からなる群から選択されるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。
具体的には、ＰＯＩは、真核生物タンパク質、好ましくは哺乳動物由来又は関連タンパク質（例えば、ヒトタンパク質若しくはヒトタンパク質配列を含むタンパク質）、又は細菌タンパク質若しくは細菌由来タンパク質である。酵母宿主細胞において天然に存在しない任意のかかる哺乳類、細菌、又は人工のタンパク質は、宿主細胞に対して異種であると理解される。
特定の場合、ＰＯＩは、多量体タンパク質（具体的には、二量体又は四量体）である。
具体的には、抗原結合タンパク質は、
ａ）抗体又は抗体断片（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、Ｆｖテトラマー、ミニボディ、若しくは単一ドメイン抗体（ＶＨ、ＶＨＨ、ＩｇＮＡＲ、若しくはＶ－ＮＡＲのような）のうちのいずれか）、
ｂ）抗体模倣物（例えば、アドネクチン、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ダーピン、フィノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、若しくはナノクランプ）、又は
ｃ）１つ以上の免疫グロブリンフォールドドメイン、抗体ドメイン、若しくは抗体模倣物を含む融合タンパク質、からなる群から選択される。
特異的ＰＯＩは、抗体などの抗原結合分子、又はその断片、特に抗原結合ドメインを含む抗体断片である。具体的なＰＯＩの中には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）若しくは免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）、重鎖抗体（ＨｃＡｂ）、又はその断片（例えば、断片抗原結合（Ｆａｂ））、Ｆｄ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又はその操作されたバリアント（例えば、Ｆｖ二量体（ダイアボディ）、Ｆｖ三量体（トライアボディ）、Ｆｖ四量体、又はミニボディ及び単一ドメイン抗体（ＶＨ、ＶＨＨ、ＩｇＮＡＲ、若しくはＶ－ＮＡＲのような））、又は免疫グロブリンフォールドドメインを含む任意のタンパク質などの抗体がある。更なる抗原結合分子は、抗体模倣物、又は例えば、操作されたクニッツドメイン、アドネクチン、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、又はダーピンなどの（代替的な）足場タンパク質から選択され得る。
特定の態様によれば、ＰＯＩは、例えば、ＢＯＴＯＸ、Ｍｙｏｂｌｏｃ、Ｎｅｕｒｏｂｌｏｃ、ディスポート（又はボツリヌス神経毒の他の血清型）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、ＹＨ－１６、絨毛性ゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリックス、インターロイキン－２、アルデスロイキン、テセロイリン、デニロイキンジフチトクス、インターフェロンα－ｎ３（注射）、インターフェロンα－ｎｌ、ＤＬ－８２３４、インターフェロン、サントリー（γ－１ａ）、インターフェロンγ、チモシンα１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ＶｉｐｅｒａＴＡｂ、ＥｃｈｉＴＡｂ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、レビフ、エプトテルミンアルファ、テリパラチド（骨粗鬆症）、カルシトニン注射剤（骨疾患）、カルシトニン（鼻、骨粗鬆症）、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー２５０（ウシ）、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト上皮増殖因子（外用ゲル、創傷治癒）、ＤＷＰ４０１、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグアルファ、モノニン、エプトコグアルファ（活性化）、組換え第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、リコネイト、組換え第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（組換え体）、Ａｌｐｈｎｍａｔｅ、オクトコグアルファ、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、インディキナーゼ、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エキセナチド、プラムリンチド、イニグルセラーゼ（ｉｎｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、ガルスルファーゼ、ロイコトロピン、モルグラモスチン（ｍｏｌｇｒａｍｏｓｔｉｒｎ）、酢酸トリプトレリン、ヒストレリン（皮下インプラント、ハイドロン）、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ロイプロリド徐放デポ（ＡＴＲＩＧＥＬ）、ロイプロリドインプラント（ＤＵＲＯＳ）、ゴセレリン、ユートロピン、ＫＰ－１０２プログラム、ソマトロピン、メカセルミン（成長障害）、エンファビルチド、Ｏｒｇ－３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリシン、インスリン（吸入）、インスリンリスプロ、インスリンデターニル（ｉｎｓｕｌｉｎ ｄｅｔｅｒｎｉｒ）、インスリン（頬側、ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファバート、アナキンラ、セルモロイキン、９９ｍＴｃ－アプシタイド注射剤、ミエロピド、ベータセロン、酢酸グラチラマー、ゲポン、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来αインターフェロン、ビリブ、インスリン（組換え）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセニン（ｍｅｃａｓｅｎｉｎ）、ロフェロン－Ａ、インターフェロン－α２、アルファフェロン、インターフェロンアルファコン－１、インターフェロンα、アボネックス組換えヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、ゼマイラ、ＣＴＣ－１１１、シャンバック－Ｂ、ＨＰＶワクチン（４価）、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチルン（ａｎｃｅｓｔｉｒｎ）、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、プレザチド酢酸銅（外用ゲル）、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、アクティミューン、ペグイントロン、トリコミン、組換えチリダニアレルギー減感作注射剤、組換えヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１－８４（皮下、骨粗鬆症）、エポエチンデルタ、トランスジェニックアンチトロンビンＩＩＩ、グランジトロピン、ビトラーゼ、組換えインスリン、インターフェロンα（経口ロゼンジ）、ＧＥＭ－２１Ｓ、バプレオチド、イデュルスルファーゼ、オムナパトリラト（ｏｍｎａｐａｔｒｉｌａｔ）、組換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴル、グルカルピダーゼ、ヒト組換えＣ１エステラーゼ阻害剤（血管性浮腫）、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド（無針注射、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ２０００）、ＶＧＶ－１、インターフェロン（α）、ルシナクタント、アビプタジル（吸入、肺疾患）、イカチバント、エカランチド、オミガナン、オーログラブ、酢酸ペキシガナン、ＡＤＩ－ＰＥＧ－２０、ＬＤＩ－２００、デガレリクス、シントレデキンベスドトクス、ＦａｖＩｄ、ＭＤＸ－１３７９、ＩＳＡｔｘ－２４７、リラグルチド、テリパラチド（骨粗鬆症）、チファコギン、ＡＡ４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマクソマブ、ＤＷＰ４１３、ＡＲＴ－１２３、クリサリン、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンアルファ、ＴＨ－９５０７、テデュグルチド、ディアミド、ＤＷＰ－４１２、成長ホルモン（徐放性注射剤）、組換えＧ－ＣＳＦ、インスリン（吸入、ＡＩＲ）、インスリン（吸入、Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ）、インスリン（吸入、ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ－３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンβ（Ｃ型肝炎ウイルス感染（ＨＣＶ））、インターフェロンα－ｎ３（経口）、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、ＡＭＧ－５３１、ＭＢＰ－８２９８、キセレセプト、オペバカン、ＡＩＤＳＶＡＸ、ＧＶ－１００１、リンフォスキャン、ランピルナーゼ、リポキシサン、ルスプルチド、ＭＰ５２（リン酸三カルシウム担体、骨再生）、メラノーマワクチン、シプロイセル－Ｔ、ＣＴＰ－３７、インセジア、ビテスペン、ヒトトロンビン（凍結、外科出血）、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ、プリカーゼ、テルリプレシン（静脈内、肝腎症候群）、ＥＵＲ－１００８Ｍ、組換えＦＧＦ－Ｉ（注射、血管疾患）、ＢＤＭ－Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ－２１６、Ｐ－１１３、ＭＢＩ－５９４ＡＮ、デュラマイシン（吸入、嚢胞性線維症）、ＳＣＶ－０７、ＯＰＩ－４５、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＡＢＴ－５１０、ボウマン・バークインヒビター濃縮物、ＸＭＰ－６２９、９９ｍＴｃ－Ｈｙｎｉｃ－アネキシンＶ、カハラリドＦ、ＣＴＣＥ－９９０８、テベレリクス（持続放出）、オザレリックス、ロルニデプシン（ｒｏｒｎｉｄｅｐｓｉｎ）、ＢＡＹ－５０４７９８、インターロイキン４、ＰＲＸ－３２１、ペプスキャン、イボクタデキン、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ－０１５、ＩＬ－２１、ＡＴＮ－１６１、シレンギチド、アルブフェロン、ビファシックス（Ｂｉｐｈａｓｉｘ）、ＩＲＸ－２、オメガインターフェロン、ＰＣＫ－３１４５、ＣＡＰ－２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１－ＤＭＩ、卵巣がん免疫療法ワクチン、ＳＢ－２４９５５３、Ｏｎｃｏｖａｘ－ＣＬ、ＯｎｃｏＶａｘ－Ｐ、ＢＬＰ－２５、ＣｅｒＶａｘ－１６、マルチエピトープペプチド黒色腫ワクチン（ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、チロシナーゼ）、ネミフィチド、ｒＡＡＴ（吸入）、ｒＡＡＴ（皮膚科）、ＣＧＲＰ（吸入、喘息）、ペグスネルセプト、チモシンベータ４、プリチデプシン、ＧＴＰ－２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ－１、ＡＣ－１００、サケカルシトニン（経口、ｅｌｉｇｅｎ）、カルシトニン（経口、骨粗鬆症）、エクサモレリン、カプロモレリン、Ｃａｒｄｅｖａ、ベラフェルミン、１３１Ｉ－ＴＭ－６０１、ＫＫ－２２０、Ｔ－１０、ウラリチド、デペレスタット、ヘマチド、Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ（外用）、ｒＮＡＰｃ２、組換え因子Ｖ１１１（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組換えスタフィロキナーゼバリアント、Ｖ－１０１５３、ＳｏｎｏＬｙｓｉｓ Ｐｒｏｌｙｓｅ、ＮｅｕｒｏＶａｘ、ＣＺＥＮ－００２、膵島細胞新生療法、ｒＧＬＰ－１、ＢＩＭ－５１０７７、ＬＹ－５４８８０６、エキセナチド（放出制御、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ）、ＡＶＥ－００１０、ＧＡ－ＧＣＢ、アボレリン、ＡＣＭ－９６０４、酢酸リナクロチド、ＣＥＴｉ－１、Ｈｅｍｏｓｐａｎ、ＶＡＬ（注射剤）、速効型インスリン（注射剤、Ｖｉａｄｅｌ）、鼻腔内インスリン、インスリン（吸入）、インスリン（経口、ｅｌｉｇｅｎ）、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ皮下注射、湿疹）、ピトラキンラ（吸入乾燥粉末、喘息）、マルチカイン、ＲＧ－１０６８、ＭＭ－０９３、ＮＢＩ－６０２４、ＡＴ－００１、ＰＩ－０８２４、Ｏｒｇ－３９１４１、Ｃｐｎ１０（自己免疫疾患／炎症）、タラクトフェリン（外用）、ｒＥＶ－１３１（眼科）、ｒＥＶ－１３１（呼吸器疾患）、経口組換えヒトインスリン（糖尿病）、ＲＰＩ－７８Ｍ、ｏｐｒｅｌｖｅｋｉｎ（経口）、ＣＹＴ－９９００７、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＴＹ－００１、バラテグラスト、インターフェロンα－ｎ３（外用）、ＩＲＸ－３、ＲＤＰ－５８、Ｔａｕｆｅｒｏｎ、胆汁酸塩刺激リパーゼ、Ｍｅｒｉｓｐａｓｅ、アラリン（ａｌａｌｉｎｅ）ホスファターゼ、ＥＰ－２１０４Ｒ、メラノタン－ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ－１０４、組換えヒトマイクロプラスミン、ＡＸ－２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ－１、Ｘｅｎ－２１７４、ＣＪＣ－１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ－６６０３、ＬＡＢ ＧＨＲＨ、ＡＥＲ－００２、ＢＧＣ－７２８、マラリアワクチン（ビロソーム、ＰｅｖｉＰＲＯ）、ＡＬＴＵ－１３５、パルボウイルスＢ１９ワクチン、インフルエンザワクチン（組換えノイラミニダーゼ）、マラリア／ＨＢＶワクチン、炭疽菌ワクチン、Ｖａｃｃ－５ｑ、Ｖａｃｃ－４ｘ、ＨＩＶワクチン（経口）、ＨＰＶワクチン、Ｔａｔトキソイド、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ－１３３４０、ＰＴＨ（１－３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、Ｏｓｔａｂｏｌｉｎ－Ｃ、ＰＴＨ類似体（外用、乾癬）、ＭＢＲＩ－９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆワクチン（結核）、ＭＶＡ－Ａｇ８５Ａワクチン（結核）、ＦＡＲＡ０４、ＢＡ－２１０、組換え体ペストＦＩＶワクチン、ＡＧ－７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ－ｐ１／Ｄｅｒ－ｐ２／Ｄｅｒ－ｐ７アレルゲン標的化ワクチン（チリダニアレルギー）、ＰＲ１ペプチド抗原（白血病）、変異ｒａｓワクチン、ＨＰＶ－１６Ｅ７リポペプチドワクチン、迷路障害ワクチン（腺がん）、ＣＭＬワクチン、ＷＴ１－ペプチドワクチン（がん）、ＩＤＤ－５、ＣＤＸ－１１０、Ｐｅｎｔｒｙｓ、Ｎｏｒｅｌｉｎ、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ－９８０８、ＶＴ－１１１、イクロカプチド、テルベルミン（皮膚科、糖尿病性足部潰瘍）、ルピントリビル、レティキュロース、ｒＧＲＦ、ＨＡ、α－ガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ－０１１、ＡＬＴＵ－１４０、ＣＧＸ－１１６０、アンギオテンシン治療用ワクチン、Ｄ－４Ｆ、ＥＴＣ－６４２、ＡＰＰ－０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ－０７（経口、結核）、ＤＲＦ－７２９５、ＡＢＴ－８２８、ＥｒｂＢ２特異的免疫毒素（抗がん剤）、ＤＴ３ＳＳＩＬ－３、ＴＳＴ－１００８８、ＰＲＯ－１７６２、Ｃｏｍｂｏｔｏｘ、コレシストキニンＢ／ガストリン受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ－ｈＥＧＦ、ＡＥ－３７、トラスニズマブ（ｔｒａｓｎｉｚｕｍａｂ）－ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ－１２（組換え）、ＰＭ－０２７３４、ＩＭＰ－３２１、ｒｈＩＧＦ－ＢＰ３、ＢＬＸ－８８３、ＣＵＶ－１６４７（外用）、Ｌ－１９ベースの放射免疫療法剤（がん）、Ｒｅ－１８８－Ｐ－２０４５、ＡＭＧ－３８６、ＤＣ／１５４０／ＫＬＨワクチン（がん）、ＶＸ－００１、ＡＶＥ－９６３３、ＡＣ－９３０１、ＮＹ－ＥＳＯ－１ワクチン（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、黒色腫ワクチン（パルス抗原療法剤）、前立腺がんワクチン、ＣＢＰ－５０１、組換えヒトラクトフェリン（ドライアイ）、ＦＸ－０６、ＡＰ－２１４、ＷＡＰ－８２９４Ａ（注射剤）、ＡＣＰ－ＨＩＰ、ＳＵＮ－１１０３１、ペプチドＹＹ［３－３６］（肥満、鼻腔内）、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３－Ｆｃ、ＢＮ－００３、ＢＡ－０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１－３４（鼻、骨粗鬆症）、Ｆ－１８－ＣＣＲ１、ＡＴ－１１００（セリアック病／糖尿病）、ＪＰＤ－００３、ＰＴＨ（７－３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、デュラマイシン（眼科、ドライアイ）、ＣＡＢ－２、ＣＴＣＥ－０２１４、

グリコＰＥＧ化エリスロポエチン、ＥＰＯ－Ｆｃ、ＣＮＴＯ－５２８、ＡＭＧ－１１４、ＪＲ－０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノカンジン、ＰＮ－９５１、７１６１５５、ＳＵＮ－Ｅ７００１、ＴＨ－０３１８、ＢＡＹ－７３－７９７７、テベレリクス（即時放出）、ＥＰ－５１２１６、ｈＧＨ（制御放出、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ）、ＯＧＰ－Ｉ、シフビルチド、ＴＶ４７１０、ＡＬＧ－８８９、Ｏｒｇ－４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ－９９１、チモペンチン（肺疾患）、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝臓選択的インスリン、スバリン、Ｌ１９－ＩＬ－２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ－１５０、ＡＬＴＵ－１３９、ＥＮ－１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体作動薬（血小板減少性疾患）、ＡＬ－１０８、ＡＬ－２０８、神経成長因子拮抗薬（疼痛）、ＳＬＶ－３１７、ＣＧＸ－１００７、ＩＮＮＯ－１０５、経口テリパラチド（ｅｌｉｇｅｎ）、ＧＥＭ－ＯＳ１、ＡＣ－１６２３５２、ＰＲＸ－３０２、ＬＦｎ－ｐ２４融合ワクチン（Ｔｈｅｒａｐｏｒｅ）、ＥＰ－１０４３、肺炎球菌小児ワクチン、マラリアワクチン、髄膜炎菌グループＢワクチン、新生児グループＢレンサ球菌ワクチン、炭疽ワクチン、ＨＣＶワクチン（ｇｐＥ１＋ｇｐＥ２＋ＭＦ－５９）、中耳炎療法、ＨＣＶワクチン（コア抗原＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ｈＰＴＨ（１－３４）（経皮、ＶｉａＤｅｒｍ）、７６８９７４、ＳＹＮ－１０１、ＰＧＮ－００５２、アビスクミン、ＢＩＭ－２３１９０、結核ワクチン、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、がんワクチン、エンカスチム、ＡＰＣ－８０２４、ＧＩ－５００５、ＡＣＣ－００１、ＴＴＳ－ＣＤ３、血管標的化ＴＮＦ（固形腫瘍）、デスモプレシン（頬側制御放出）、オネルセプト若しくはＴＰ－９２０１、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）／ＭＡＢ ＴＨＥＲＡ（商標））、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））、ペグリルグラスチム（ｐｅｇｒｉｌｇｒａｓｔｉｍ）（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標））、又はバイオシミラー及びバイオベターを含む任意の他の好適なＰＯＩである。
具体的には、ＰＯＩは、宿主細胞種に対して異種である。
具体的には、ＰＯＩは、分泌ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質であり、すなわち、宿主細胞から細胞培養上清中に分泌される。
具体的には、ＧＯＩは、分泌シグナル配列により発現され、好ましくは、分泌シグナルペプチド（又は分泌シグナルペプチドを含むリーダー）が、ＰＯＩのＮ末端に融合される。
本発明は、本明細書に記載の宿主細胞を産生するための方法を更に提供する。具体的には、かかる方法は、１つ以上の異種発現カセット内に、当該ＴＩＦ遺伝子のうちの１つ以上及び目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含むように、宿主細胞を遺伝子操作することを含む。
更なる具体的な態様によれば、本発明は、宿主細胞を遺伝子操作して、１つ以上の発現カセット内に、２つ以上の異種核酸分子、及び異種核酸分子の各々に作動可能に連結された発現制御配列を導入することによって、宿主細胞培養で目的のタンパク質（ＰＯＩ）を産生することができる本明細書に記載の宿主細胞を産生するための方法を提供し、核酸分子のうちの１つは、ＰＯＩをコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含み、更なる１つ以上の核酸分子は、本明細書に更に記載されるように、ＴＩＦ遺伝子などのＴＩＦをコードする。
具体的には、宿主細胞は、野生型宿主細胞の遺伝子操作によって提供される。
具体的な例によれば、宿主細胞は、最初に当該ＴＩＦ遺伝子を発現する１つ以上の発現カセットを導入するように改変することによって産生され得る。次いで、かかる改変宿主細胞は、ＰＯＩ産生のための発現カセットを含むように更に操作され得る。
別の具体的な例によれば、宿主細胞は、ＰＯＩ産生のための発現カセットを含むように、第１の操作によって産生され得る。かかる操作された宿主細胞は、ＴＩＦ遺伝子を発現する１つ以上の発現カセットを導入するように更に改変され得る。
本発明は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）によってコードされる目的のタンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法であって、この産生が、当該ＰＯＩを産生するための条件下で、本明細書に記載の宿主細胞を培養することによって行われる、方法を更に提供する。
本発明は、宿主細胞における目的のタンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法を更に提供し、
（ｉ）本明細書に記載される１つ以上の異種発現カセット内に当該ＴＩＦ遺伝子と、当該ＰＯＩをコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）と、を含むように、宿主細胞を遺伝子操作するステップと、
（ｉｉ）当該宿主細胞を、当該ＴＩＦ遺伝子及び当該ＧＯＩを共発現する条件下で、培養培地で培養し、それによって、ＰＯＩを得るステップと、
（ｉｉｉ）宿主細胞又は培養培地からＰＯＩを回収するステップと、を含む。
具体的には、本明細書に記載の方法のステップｉ）は、ステップ（ｉｉ）の前に実施される。
特定の例によれば、野生型宿主細胞は、本明細書に記載の方法のステップｉ）に従って遺伝子改変される。
具体的には、異種発現カセットを発現するための野生型宿主細胞株に当該遺伝子改変を導入する際に、宿主細胞が提供される。しかし、特定の実施形態によれば、宿主細胞は、例えば、ステップｉ）に従って遺伝子改変する前に、タンパク質を発現及び／又は分泌する細胞の能力を改善するために、又は望ましくない副産物（例えば、宿主細胞タンパク質）を低減するために、野生型宿主細胞の１つ以上の更なる遺伝子改変を受けてもよい。
具体的には、本明細書に更に記載される組換え宿主細胞を産生するために、好適な方法ステップが用いられる。
具体的には、ＰＯＩは、宿主細胞を適切な培地で培養し、発現されたＰＯＩを細胞培養物から（特に、細胞を分離する際に、細胞培養上清又は培地から）単離し、発現された産物に適した方法によって精製する（特に、ＰＯＩを細胞から分離する際に、好適な手段によって精製する）ことによって産生され得る。これによって、精製されたＰＯＩ調製物が産生され得る。
具体的には、本明細書に記載の方法は、本明細書に更に記載される特徴によって（特に、本明細書に更に記載される組換え宿主細胞及び／又は発現システムによって）特徴付けられる。
特定の態様によれば、本発明は、ＰＯＩの産生のための本明細書に記載の宿主細胞の使用を更に提供する。
具体的には、ＰＯＩは、宿主細胞を、当該ＴＩＦ遺伝子のうちの１つ以上を共発現又は過剰発現する条件下で培養しながら、当該ＧＯＩを発現させることによって産生される。具体的には、かかる方法によって、当該ＧＯＩの発現及び当該ＰＯＩの産生収率が増加する。
具体的には、宿主細胞が、ＴＩＦ遺伝子のうちの１つ以上を共発現させ、かつＰＯＩを宿主細胞培養物に分泌させるための条件下で、培養培地で培養され、ＰＯＩが、宿主細胞培養物から回収される。
具体的には、宿主細胞は、細胞培養で培養された細胞株（特に、産生宿主細胞株）である。
特定の実施形態によれば、細胞株は、好適なバッチ、フェッドバッチ、又は連続培養条件下で培養される。培養は、マイクロタイタープレート、振盪フラスコ、又はバイオリアクターで実施してもよく、任意選択的に、第１のステップとしてのバッチ相から始めて、その後、第２のステップとしてのフェッドバッチ相又は連続培養相が続いてもよい。
具体的には、当該細胞培養物は、バッチ相で細胞を増殖させること、及びフェッドバッチ相又は連続培養相で当該ＰＯＩを産生するように細胞を培養することを採用し、任意選択的に、第１のステップとしてのバッチ相から始めて、その後、第２のステップとしてのフェッドバッチ又は連続培養相が続く。
特定の態様によれば、本明細書に記載の方法は、増殖相及び産生相を含む。
具体的には、本方法は、
ａ）宿主細胞を、増殖条件（増殖相（ｇｒｏｗｉｎｇ ｐｈａｓｅ）又は「増殖相（ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）」）下で培養するステップと、更に
ｂ）宿主細胞を、ＧＯＩが当該ＰＯＩを産生するように発現される増殖制限条件下（産生相）で培養するステップと、を含む。
具体的には、第２のステップｂ）は、第１のステップａ）に続く。
具体的には、宿主細胞は、当該ＰＯＩに対する宿主細胞の比生産性（μｇ／ｇ酵母乾燥質量（ＹＤＭ）／時間及び／又は当該ＰＯＩに対する体積生産性（μｇ／Ｌ／時間）を増加させるレベルで、当該ＴＩＦ遺伝子のうちの１つ以上を共発現するように改変される。
具体的には、かかる共発現によって、当該ＴＩＦを共発現するように操作されていない、当該ＧＯＩを発現する同等の宿主細胞と比較して、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１０．５倍、１１倍、１１．５倍、又は１２倍のうちの少なくともいずれか１つで生産性又は収率が増加する。
当該ＴＩＦを産生する遺伝子改変の影響について本明細書に記載の宿主細胞を比較する場合、典型的には、かかる遺伝子改変の前又は改変なしの同等の宿主細胞と比較される。典型的には、特に、当該ＰＯＩが産生される条件下で培養する場合、ＰＯＩを産生するように操作される、かかる遺伝子改変なしの同じ宿主細胞種又は型と比較が行われる。しかしながら、ＰＯＩを産生するように更に操作されていない同じ宿主細胞種又は型と比較を行うこともできる。それぞれのコード配列の発現時の当該ＴＩＦの産生は、宿主細胞によって産生される当該ＴＩＦの量（例えば、レベル又は濃度）によって決定され得る。具体的には、その量は、ウエスタンブロット、免疫蛍光イメージング、フローサイトメトリー、又は質量分析（特に、質量分析は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）又は液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）である）を用いるなどの好適な方法によって決定することができる。
特定の態様によれば、本明細書に記載の宿主細胞は、例えば、タンパク質産生を改善するために、１つ以上の更なる遺伝子改変を受け得る。
具体的には、宿主細胞は、プロテアーゼ欠損株（特に、カルボキシペプチダーゼＹ活性が欠損した株を生成するために使用されるタンパク質分解活性に影響を与える１つ以上の遺伝子を改変するように更に操作され得る。具体的な例は、ＷＯ１９９２／０１７５９５Ａ１に記載されている。プロテアーゼＡ又はプロテアーゼＢなどの液胞プロテアーゼの機能欠損を有するプロテアーゼ欠損ピキア株の更なる例は、ＵＳ６１５３４２４Ａに記載されている。更なる例は、ａｄｅ２の欠失、及び／又はプロテアーゼ遺伝子ＰＥＰ４及びＰＲＢ１の一方又は両方の欠失を有するＰｉｃｈｉａ株であり、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって提供されている。
具体的には、宿主細胞は、ＷＯ２０１０／０９９１９５Ａ１に開示されているように、ＰＥＰ４、ＰＲＢ１、ＹＰＳ１、ＹＰＳ２、ＹＭＰ１、ＹＭＰ２、ＹＭＰ１、ＤＡＰ２、ＧＲＨＩ、ＰＲＤ１、ＹＳＰ３、及びＰＲＢ３からなる群から選択される、機能性遺伝子産物（特にプロテアーゼ）をコードする少なくとも１つの核酸配列を改変するように操作することができる。
ヘルパー因子をコードする遺伝子の過剰発現又は過少発現を適用して、例えば、ＷＯ２０１５／１５８８００Ａ１に記載されているように、ＧＯＩの発現を増強することができる。
特定の態様によれば、宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。
具体的には、宿主細胞は、
ａ）ピキア属、ハンセヌラ属、コマガタエラ属、サッカロミセス属、クリベロマイセス属、カンジダ属、オガタエア属、ヤロウイア属、及びゲオトリクム属からなる群から選択される属の酵母細胞（好ましくは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、若しくはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、又は
ｂ）糸状菌の細胞（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ若しくはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、又は
ｃ）非ヒト霊長類、ヒト、げっ歯類、若しくはウシ細胞（例えば、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ（ＣＯＳ１及びＣＯＳ７など）、ＱＣ１－３、ＨＥＫ－２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢＩ、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解性若しくはハイブリドーマ細胞株）、又は
ｄ）昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｍｉｍｉｃ（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（ＢＴ１－ＴＮ－５Ｂ１－４）、若しくはＢＴ１－Ｅａ８８細胞）、又は
ｅ）藻類細胞（例えば、アンフォラ属、クサリケイソウ属、ドナリエラ属、クロレラ属、クラミドモナス属、藍藻類（シアノバクテリア）、ナンノクロロプシス属、スピルリナ属、若しくはオクロモナス属）、又は
ｆ）植物細胞（例えば、単子葉植物（好ましくは、トウモロコシ、イネ、コムギ、若しくはエノコログサ）由来の細胞、若しくは双子葉植物（好ましくは、キャッサバ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、アルファルファ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ、若しくはシロイヌナズナ）由来の細胞）である。
特定の態様によれば、宿主細胞は、任意の酵母細胞であり得る。具体的には、宿主細胞は、ピキア属、ハンセヌラ属、コマガタエラ属、サッカロマイセス属、クリベロマイセス属、カンジダ属、オガタエア属、ヤロウイア属、及びゲオトリクム属からなる群から選択される属の細胞、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ｏｒ Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ若しくはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのような糸状菌類の細胞である。好ましくは、宿主細胞は、メチル栄養酵母、好ましくはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。本明細書では、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、及びＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓと全て同義的に使用される。
具体的な例は、ピキア属（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、及びＰｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、コマガタエラ属（例えば、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、又はＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）、サッカロマイセス属（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、クリベロマイセス属（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、カンジダ属（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｃａｏｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、ゲオトリクム属（例えば、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅの酵母細胞を指す。
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ種が好ましい。具体的には、宿主細胞は、ＣＢＳ７０４、ＣＢＳ２６１２、ＣＢＳ７４３５、ＣＢＳ９１７３－９１８９、ＤＳＭＺ ７０８７７、Ｘ－３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ、及びＳＭＤ１１６８からなる群から選択されるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株である。
出典：ＣＢＳ７０４（＝ＮＲＲＬ Ｙ－１６０３＝ＤＳＭＺ７０３８２）、ＣＢＳ２６１２（＝ＮＲＲＬ Ｙ－７５５６）、ＣＢＳ７４３５（＝ＮＲＲＬ Ｙ－１１４３０）、ＣＢＳ９１７３－９１８９（ＣＢＳ株：ＣＢＳ－ＫＮＡＷ Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｎ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、及びＤＳＭＺ ７０８７７（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）；Ｘ－３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ、及びＳＭＤ１１６８などのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒからの株。
好ましいＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の例としては、Ｗ３０３、ＣＥＮ．ＰＫ、及びＢＹシリーズ（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦコレクション）が挙げられる。上記の株の全ては、形質転換体を産生し、異種遺伝子を発現するために首尾よく使用されている。
本発明は、目的のタンパク質（ＰＯＩ）の収率を増加させる方法であって、当該ＰＯＩをコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）を発現する宿主細胞によって産生される場合、細胞培養でメッセンジャーリボ核タンパク質（ｍＲＮＰ）の１つ以上のＴＩＦ遺伝子を発現する１つ以上の異種発現カセットを共発現することによって増加させる、方法を更に提供する。
本発明は、本明細書に更に記載されるＴＩＦ遺伝子などのメッセンジャーリボ核タンパク質（ｍＲＮＰ）の１つ以上のＴＩＦ遺伝子を発現する１つ以上の異種発現カセットを含むポリペプチド発現システムを更に提供する。かかる発現カセットは、本明細書では、ＴＩＦ発現構築物又はＴＩＦ（ＴＩＦ遺伝子）発現カセット（ＴＩＦＥＣ）とも称される。具体的には、異種発現カセットは、当該ＴＩＦ遺伝子を発現するために当該ＴＩＦ遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の発現制御配列を含み、特に、例えば、プロモーター、シグナルペプチド、又はリーダーなどの当該発現制御配列のうちの少なくとも１つは、当該ＴＩＦ遺伝子に天然に作動可能に連結されていない。具体的には、ＴＩＦ発現カセットは、本明細書に更に記載されるように特徴付けられる。
具体的には、発現システムは、目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードするＧＯＩと、当該ＧＯＩに作動可能に連結された１つ以上の発現制御配列と、を含む、発現カセットを更に含む。かかる発現カセットは、本明細書では、ＧＯＩ発現構築物（ＧＯＩＥＣ）又はＧＯＩ発現カセットとも称される。具体的には、ＧＯＩ発現カセットは、本明細書に更に記載されるように特徴付けられる。具体的には、ＧＯＩを含む発現カセットは、ＴＩＦ遺伝子を発現する他の発現カセットとは別個である。
具体的には、本明細書に記載の発現系は、本明細書に更に記載される発現カセット及び組換え発現構築物の特徴によって特徴付けられる。
具体的には、当該遺伝子操作によって過剰発現されるＴＩＦ遺伝子は、各々、別個の発現カセットに含まれる。しかし、少なくとも２つ又は３つのＴＩＦ遺伝子を含み、任意選択的にＧＯＩを更に含む、発現カセットを使用してもよい。
本発明は、本明細書に記載の発現系（特に、ＴＩＦ遺伝子を発現する発現カセット及びＧＯＩを発現する発現カセットを含む発現系）を含む、宿主細胞（特に、本明細書に記載される宿主細胞）を更に提供する。
特定の態様によれば、宿主細胞は、ＧＯＩに作動可能に連結された発現カセットプロモーターを含む、少なくとも１つの異種ＧＯＩＥＣを含む組換え宿主細胞であり、ＧＯＩＥＣに含まれる少なくとも１つの成分又は成分の組み合わせは、宿主細胞に対して異種である。
具体的には、人工発現カセットが使用され、特に、プロモーター及び当該プロモーターの制御下で発現される遺伝子は、互いに異種であり（かかる組み合わせが天然に存在しない）、例えば、プロモーター及び遺伝子の一方（又は一方のみ）が、他方及び／若しくは本明細書に記載の宿主細胞に対して人工的若しくは異種であるか、プロモーターが、内因性プロモーターであり、かつ発現される遺伝子が、異種遺伝子であるか、又はプロモーターが、人工的若しくは異種のプロモーターであり、かつ遺伝子が、内因性遺伝子であり、プロモーター及び遺伝子の両方が、本明細書に記載の宿主細胞と比較して、人工的、異種、又は異なる起源由来（例えば、異なる種若しくは細胞型（株）由来）である。
特定の態様によれば、異種発現カセットのうちの任意の１つ以上（又は全て）は、１つ以上の自律的に複製するベクター若しくはプラスミドに含まれるか、又は当該宿主細胞の染色体内に組み込まれる。
発現カセットは、宿主細胞に導入され、染色体内エレメントとして宿主細胞ゲノム（若しくはその染色体のいずれか）に、例えば、組み込みの特定の部位で又はランダムに組み込まれてもよく、その後、高産生宿主細胞株が選択される。代替的に、発現カセットは、プラスミド若しくは人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などの染色体外遺伝子エレメント内に組み込まれてもよい。特定の例によれば、発現カセットは、好適な形質転換技術又はトランスフェクション技術によって宿主細胞に導入されるベクター（特に、発現ベクター）によって宿主細胞に導入される。この目的のために、発現される異種ポリヌクレオチド（特にＧＯＩ）は、発現ベクターにライゲーションされ得る。
好ましい酵母発現ベクターは、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣＺａｌｆａ、ｐＧＡＰＺａｌｆａ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＧＡＰＨｉｓ、ｐＰＵＺＺＬＥ、又はＧｏｌｄｅｎＰｉＣＳに由来するプラスミドからなる群から選択される。
ベクター又はプラスミドを導入するための宿主細胞をトランスフェクション又は形質転換するための技術は、当該技術分野で周知である。これらには、エレクトロポレーション、スフェロプラスト、脂質小胞媒介性取り込み、熱ショック媒介性取り込み、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈殿）、ウイルス感染及び特に改変ウイルス（例えば、改変アデノウイルス）を使用すること、マイクロインジェクション、並びにエレクトロポレーションが含まれ得る。
本明細書で使用される場合、酵母細胞を「形質転換する」という用語は、それを「トランスフェクションする」ことを包含すると理解される。
本明細書に記載の形質転換体は、発現カセット、ベクター、又はプラスミドＤＮＡを宿主に導入し、関連するタンパク質又は選択マーカーを発現する形質転換体を選択することによって得ることができる。宿主細胞は、電気パルス法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、及びそれらの改変方法などの、宿主細胞の形質転換に従来使用されている方法によって、異種又は外来ＤＮＡを導入するように処理され得る。微生物による組換えＤＮＡ断片の取り込みのための好ましい形質転換方法は、化学的形質転換、エレクトロポレーション、又はプロトプラスト化による形質転換を含む。
特定の態様によれば、ポリヌクレオチドの人工的融合物を含むか又はそれからなる発現カセットが使用され、人工的融合物が、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、及び任意選択的にシグナル配列、リーダー配列、又はターミネーター配列などの更なる配列を含む。
具体的には、ＴＩＦＥＣは、当該ＴＩＦを細胞内タンパク質として発現する。
具体的には、ＧＯＩＥＣは、分泌タンパク質としてＰＯＩを発現及び産生するために必要なシグナル配列及びリーダー配列を含む。
特定の態様によれば、ＧＯＩは、分泌シグナル配列、好ましくは異種分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配列の５’末端で融合される。
特定の態様によれば、ＧＯＩＥＣは、ＰＯＩの分泌を可能にするシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。具体的には、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＧＯＩの５’末端に隣接して融合される。
シグナル配列は、天然のシグナル配列であってもよく、本明細書では、発現時にかかるタンパク質を分泌するために、天然に存在するタンパク質と共発現されるか、融合されるか、又はそうでなければ会合されるシグナル配列として理解される。例えば、天然の分泌シグナル配列は、典型的には、分泌されるそれぞれのタンパク質と共発現されるか、融合されるか、又はそうでなければ会合されるシグナル配列である。具体的には、当該ＰＯＩとは異なる分泌タンパク質に由来するシグナル配列などの、当該ＰＯＩに対して異種である（又は天然に会合していない）天然の分泌シグナル配列が使用される。
代替的に、人工の分泌シグナル配列、特に、天然に存在するものと８５％、９０％、又は９５％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つのものであるシグナル配列を使用することができる。
具体的には、シグナル配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα接合因子プレプロペプチド由来のシグナル配列、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの酸性ホスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ１）由来のシグナル配列、及び細胞外タンパク質Ｘ（ＥＰＸ１）からなる群から選択される（Ｈｅｉｓｓ，Ｓ．，Ｖ．Ｐｕｘｂａｕｍ，Ｃ．Ｇｒｕｂｅｒ，Ｆ．Ａｌｔｍａｎｎ，Ｄ．Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ ＆ Ｂ．Ｇａｓｓｅｒ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５；１６１（７）：１３５６－６８）。
具体的には、ＷＯ２０１４／０６７９２６Ａ１又はＷＯ２０１２／１５２８２３ Ａ１に記載されているシグナル配列及び／又はリーダー配列のうちのいずれかを使用することができる。
本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列 本明細書で言及される配列
別段の指示又は定義がない限り、本明細書で使用される全ての用語は、当該技術分野における通常の意味を有し、当業者には明らかであろう。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｌｅｗｉｎ，”Ｇｅｎｅｓ ＩＶ”，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９０）、及びＪａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，”Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ”（５ｔｈ Ｅｄ．，ｏｒ ｍｏｒｅ ｒｅｃｅｎｔ ｅｄｉｔｉｏｎｓ），Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１などの標準的なハンドブックが参照される。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語は、同義的に使用することができ、更なるメンバー又は部分又は要素を許容するオープンな定義として理解されるものとする。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」とは、構成する定義特徴の更なる要素を含まない最も狭い定義とみなされる。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」はより広義であり、定義「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を含む。
本明細書で使用される「約」という用語は、同じ値又は所与の値と＋／－１０％又は＋／－５％異なる値を指す。
本明細書全体を通して使用される特定の用語は、以下の意味を有する。
本明細書で使用される「宿主細胞」に関して、「細胞」という用語は、宿主細胞の単一細胞、単一細胞クローン、又は細胞株を指す。
本明細書で使用される「細胞株」という用語は、長期間にわたって増殖する能力を獲得した特定の細胞型の確立されたクローンを指す。細胞株は、典型的には、ポリペプチド若しくはかかるポリペプチドによって媒介される細胞代謝産物を産生するための、内因性若しくは組換えの核酸分子又は遺伝子あるいは代謝経路の産物を発現させるために使用される。「産生宿主細胞株」又は「産生細胞株」は、一般に、ＰＯＩなどの産生プロセスの産物を得るためのバイオリアクターでの細胞培養のために調整済の細胞株であると理解される。
本明細書に記載の具体的な実施形態は、少なくとも２つの異なるポリヌクレオチド（核酸分子又は遺伝子）と、本明細書に記載されるＴＩＦをコードする少なくとも１つのＴＩＦ遺伝子と、ＰＯＩをコードする少なくとも１つの目的の遺伝子（ＧＯＩ）と、を共発現するように操作された産生宿主細胞株を指し、特に、ＰＯＩは、それぞれのポリヌクレオチドを共発現することによって高収率で産生される。
本明細書に記載されるＰＯＩを産生する宿主細胞は、「産生宿主細胞」とも称され、それぞれの細胞株は、「産生細胞株」と称される。本明細書に記載の具体的な実施形態は、当該ＴＩＦを共発現するように操作され、高いＰＯＩ産生率を特徴とするかかるＰＯＩ産生宿主細胞株に言及する。
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、特に、ＰＯＩ又は宿主細胞代謝産物を産生するための組換え目的で好適に使用される任意の細胞に適用される。「宿主細胞」という用語は、ヒトを含まないことがよく理解される。具体的には、本明細書に記載される組換え宿主細胞は、人工生物及び天然（野生型）宿主細胞の誘導体である。本明細書に記載の宿主細胞、方法、及び使用、例えば、１つ以上の遺伝子改変、異種発現カセット、又は人工発現構築物を含むものを具体的に指し、当該トランスフェクト又は形質転換された宿主細胞、及び組換えタンパク質は、天然に存在せず、「人工」又は合成であり、したがって、「自然法則」の結果として考慮されないことがよく理解される。本明細書に記載の遺伝子改変は、当該技術分野で既知のツール、方法、及び技術を使用することができ、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）に記載されている。
宿主細胞に関して本明細書で使用される場合、「細胞培養」又は「培養すること」又は「培養」という用語は、細胞の活性状態又は静止状態で、具体的には、業界で既知の方法による制御されたバイオリアクター内で、細胞の増殖、分化、又は継続的な生存に有利な条件下で、人工的な（例えば、インビトロの）環境での細胞の維持を指す。
適切な培養培地を使用して細胞培養物を培養する場合、細胞は、細胞培養で細胞の培養をサポートするのに好適な条件下で、培養容器中の培地又は基質と接触させられる。標準的な細胞培養培地及び技術は、当該技術分野で周知である。
本明細書に記載の細胞培養物は、本明細書では「細胞培養上清」と称される細胞バイオマスから分離可能な細胞培養培地中でＰＯＩを得るためなど、分泌ＰＯＩの産生を提供する技術を特に用い、精製して、より高い純度でＰＯＩを得ることができる。タンパク質（例えば、ＰＯＩ）が細胞培養の宿主細胞によって産生及び分泌される場合、かかるタンパク質が、細胞培養上清に分泌され、細胞培養上清を宿主細胞バイオマスから分離し、任意選択的に、タンパク質を更に精製して、精製されたタンパク質調製物を産生することによって得ることができることが理解される。
細胞培養培地は、制御された人工のインビトロ環境で細胞を維持し、増殖させるために必要な栄養素を提供する。細胞培養培地の特徴及び組成は、特定の細胞要件に応じて異なる。重要なパラメータには、浸透圧、ｐＨ、及び栄養素組成が含まれる。栄養素の供給は、当該技術分野で既知の方法に従って、連続的又は不連続的なモードで行うことができる。
バッチプロセスは、細胞の培養に必要な全ての栄養素が、発酵中に更なる栄養素を追加供給することなく、バッチ相の後、フェドバッチ又は連続プロセスで、最初の培養培地に含まれる細胞培養モードであり、供給相は、供給によって１つ以上の栄養素が培養物に供給される。ほとんどのプロセスでは、供給モードは重大かつ重要であるが、細胞培養の特定のモードに関して、本明細書に記載の宿主細胞及び方法は限定されない。
組換えＰＯＩは、宿主細胞及び本明細書に記載のそれぞれの細胞株を使用して、適切な培地中で培養すること、発現された産物又は代謝産物を培養物から単離すること、及び任意選択的に、好適な方法によってそれを精製することによって産生することができる。
本明細書に記載されるＰＯＩを産生するために、いくつかの異なるアプローチが好ましい。ＰＯＩは、宿主細胞を、関連するタンパク質をコードする組換えＤＮＡを保有する発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトすること、形質転換又はトランスフェクトされた細胞の培養物を調製すること、培養物を増殖させること、転写及びＰＯＩ産生を誘導すること、並びにＰＯＩを回収することによって、発現、処理、及び任意選択的に分泌され得る。
特定の実施形態では、細胞培養プロセスは、フェッドバッチプロセスである。具体的には、所望の組換えＰＯＩをコードする核酸構築物でトランスフェクトされた宿主細胞を、増殖相で培養し、所望の組換えＰＯＩを産生するために産生相に移行させる。
別の実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞は、連続モードで（例えば、ケモスタットを用いて）培養される。連続発酵プロセスは、バイオリアクターへの新鮮な培養培地の定義された一定かつ連続的な供給速度によって特徴付けられ、それによって、培養ブロスも同時に、同じ定義された一定かつ連続的な除去速度でバイオリアクターから除去される。培地、供給速度、及び除去速度を同じ一定レベルに維持することにより、バイオリアクター内の細胞培養パラメータ及び条件は一定のままである。
別の実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞は、灌流モードで培養され、例えば、新鮮な培地を供給し、上清を除去しながら、デバイス内で細胞を培養する。
本明細書に記載される安定な細胞培養物は、遺伝的特性を維持し、具体的には、高いＰＯＩ産生レベル、例えば、少なくともμｇレベルで、約２０世代の培養後でも、好ましくは少なくとも３０世代、より好ましくは少なくとも４０世代、最も好ましくは少なくとも５０世代の培養後でも維持している、細胞培養物を指すと特に理解される。具体的には、安定した組換え宿主細胞株が提供され、これは、工業規模の産生に使用される場合、大きな利点と考えられる。
本明細書に記載の細胞培養物は、栄養素の供給、特にフェッドバッチ若しくはバッチプロセス、又は連続若しくは半連続プロセス（例えば、ケモスタット）に基づく培養モードと組み合わせて、例えば、体積及び技術システムの両方に関して、工業的製造スケールの方法に特に有利である。
本明細書に記載の宿主細胞は、典型的には、ＰＯＩ産生のためのＧＯＩを発現するその能力について試験され、以下の試験：ＥＬＩＳＡ、活性アッセイ、キャピラリー電気泳動、ＨＰＬＣ、又は他の好適な試験（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット技術、若しくは質量分析）のうちのいずれかによってＰＯＩ収率について試験される。
１つ以上のＴＩＦを共発現する効果（例えば、ＰＯＩ産生に対する影響）を決定するために、宿主細胞株は、それぞれの細胞で共発現するためのかかる遺伝子改変を有しない株と比較して、フェッドバッチ又はケモスタット発酵を使用して、マイクロタイタープレート、振盪フラスコ、又はバイオリアクターで培養され得る。
本明細書に記載の産生方法は、パイロット規模又は工業規模での発酵を特に可能にする。工業プロセス規模は、好ましくは、少なくとも１０Ｌ、具体的には少なくとも５０Ｌ、好ましくは少なくとも１ｍ３、好ましくは少なくとも１０ｍ３、最も好ましくは少なくとも１００ｍ３の体積を用いる。
工業規模での産生条件が好ましく、これは、例えば、数日間の典型的なプロセス時間を用いる、１００Ｌ～１０ｍ３以上のリアクター体積でのフェッドバッチ培養を指すか、又は希釈速度が約０．００１～０．１５時間－１である、約５０～１０００Ｌ以上の発酵器体積での連続プロセスを指す。
本明細書に記載の目的のために使用されるデバイス、設備、及び方法は、任意の所望の細胞株の培養で、及びそれと共に使用するのに特に好適である。更に、デバイス、設備、及び方法は、任意の酵母宿主細胞型の培養に好適であり、ポリペプチド産物（ＰＯＩ）、核酸産物（例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）、又は細胞及び／若しくはウイルス（例えば、細胞療法及び／若しくはウイルス療法で使用されるもの）などの医薬品及びバイオ医薬品の産生のために構成された産生操作に特に好適である。
特定の実施形態では、細胞は、組換え治療薬又は診断薬などの産物を発現又は産生する。本明細書でより詳細に記載されるように、細胞によって産生される産物の例としては、抗体分子（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体）、抗体模倣物（例えば、ＤＡＲＰｉｎ、アフィビボディ、アドネクチン、又はＩｇＮＡＲなどの抗原に特異的に結合するが、構造的には関連しないポリペプチド分子）、融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、他の組換えタンパク質（例えば、グリコシル化タンパク質、酵素、ホルモン）、又はウイルス治療薬（例えば、抗がん腫瘍溶解性ウイルス、遺伝子療法及びウイルス免疫療法用のベクター、及びウイルス療法用のウイルスベクター）、細胞治療薬（例えば、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、及び成体幹細胞）、又はワクチン若しくは脂質被包粒子（例えば、エキソソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）若しくはＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ）、抗生物質若しくはアミノ酸が挙げられる。実施形態では、デバイス、設備、及び方法は、バイオシミラーを産生するために使用することができる。
述べたように、特定の実施形態では、デバイス、設備、及び方法は、真核細胞（例えば、酵母細胞）及び／又は大規模な様式で当該細胞によって合成される当該細胞の産物（例えば、タンパク質、ペプチド、若しくは抗生物質、アミノ酸、核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡなど）を含むＰＯＩ）の産生を可能にする。本明細書に別段の記載がない限り、デバイス、設備、及び方法は、ベンチスケール、パイロットスケール、及び完全生産スケール容量を含むが、これらに限定されない任意の所望の容量又は生産容量を含むことができる。
更に、本明細書に別段の定めがない限り、デバイス、設備、及び方法は、撹拌タンク、エアリフト、繊維、マイクロファイバー、中空繊維、セラミックマトリックス、流動床、固定床、及び／又は噴流床バイオリアクターを含むがこれらに限定されない、任意の好適なリアクターを含むことができる。本明細書で使用する場合、「リアクター」は、発酵器若しくは発酵ユニット、又は任意の他の反応容器を含むことができ、「リアクター」という用語は、「発酵器」と同義に使用される。例えば、いくつかの態様では、例示的なバイオリアクターユニットは、以下：栄養素及び／又は炭素源の供給、好適な気体（例えば、酸素）の注入、発酵又は細胞培養培地の流入量及び流出量、気体相及び液体相の分離、温度の維持、酸素及びＣＯ２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、撹拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）（例えば、撹拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ））、並びに／又は洗浄／滅菌のうちの１つ以上又は全てを実施することができる。発酵ユニットなどの例示的なリアクターユニットは、ユニット内に複数のリアクターを含んでもよく、例えば、ユニットは、各ユニットかつ／又は施設内に１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００個、又はそれ以上のバイオリアクターを有することができ、かつ／又は施設内に単一又は複数のリアクターを有する複数のユニットを含んでもよい。様々な実施形態では、バイオリアクターは、バッチ、セミフェッドバッチ、フェッドバッチ、灌流、及び／又は連続発酵プロセスに好適であり得る。任意の好適なリアクター直径を使用することができる。実施形態では、バイオリアクターは、約１００ｍＬ～約５０，０００Ｌの体積を有し得る。非限定的な例としては、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル、及び／又は５０，０００リットルの体積が挙げられる。加えて、好適なリアクターは、マルチユース、シングルユース、ディスポーザブル、又は非ディスポーザブルであってもよく、ステンレス鋼（例えば、３１６Ｌ又は任意の他の好適なステンレス鋼）並びにインコネル、プラスチック、及び／又はガラスなどの金属合金を含む任意の好適な材料から形成され得る。
実施形態では、及び本明細書に特に明記しない限り、本明細書に記載のデバイス、設備、及び方法はまた、特に言及されていない任意の好適な単位操作及び／又は機器、例えば、かかる産物の分離、精製、及び分離のための操作及び／又は機器を含むことができる。任意の好適な設備及び環境、例えば、従来の現場組み立て（ｓｔｉｃｋ－ｂｕｉｌｔ）設備、モジュラー設備、移動設備及び仮設設備、又は任意の他の好適な建設、設備、及び／又はレイアウトを使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、モジュラークリーンルームを使用することができる。加えて、特に明記しない限り、本明細書に記載されるデバイス、システム、及び方法は、単一の場所又は施設に収容及び／又は実行され得るか、代替的に、別個若しくは複数の場所及び／又は施設に収容及び／又は実行され得る。
好適な技術は、バッチ相で始まり、高い比増殖速度での短い指数関数的フェッドバッチ相が続き、低い比増殖速度でのフェッドバッチ相が更に続くバイオリアクターで培養することを包含し得る。別の好適な培養技術は、バッチ相、続いて任意の好適な比増殖速度でのフェッドバッチ相、又はＰＯＩ産生時間にわたって高増殖速度から低増殖速度へ、又はＰＯＩ産生時間にわたって低増殖速度から高増殖速度へ進むような比増殖速度の組み合わせを包含し得る。別の好適な培養技術は、バッチ相、続いて、低希釈速度での連続培養相を包含し得る。
好ましい実施形態は、バイオマスを提供するためのバッチ培養、続いて、高収率ＰＯＩ産生のためのフェッドバッチ培養を含む。
本明細書に記載の宿主細胞を、増殖条件下、バイオリアクターで培養して、少なくとも１ｇ／Ｌの細胞乾燥重量、より好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌの細胞乾燥重量、好ましくは少なくとも２０ｇ／Ｌの細胞乾燥重量、好ましくは少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、又は８０ｇ／Ｌの細胞乾燥重量の細胞密度を得ることが好ましい。パイロット規模又は工業規模で、かかる収率のバイオマス産生を提供することは有利である。
バイオマスの蓄積を可能にする増殖培地（特に、基本増殖培地）は、典型的には、炭素源、窒素源、硫黄源、及びリン酸源を含む。典型的には、かかる培地は、更に微量元素及びビタミンを含み、アミノ酸、ペプトン、又は酵母抽出物を更に含み得る。
好ましい窒素源としては、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、又はＮＨ３、又は（ＮＨ４）２ＳＯ４が挙げられる。
好ましい硫黄源としては、ＭｇＳＯ４、又は（ＮＨ４）２ＳＯ４、又はＫ２ＳＯ４が挙げられる。
好ましいリン酸塩源としては、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、又はＨ３ＰＯ４、又はＮａＨ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、又はＫ２ＨＰＯ４が挙げられる
更なる典型的な培地成分としては、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、及び以下の微量元素が挙げられる：Ｆｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｍｎ、Ｉ、Ｂ。
好ましくは、培地は、増殖に不可欠なビタミン、例えば、Ｂ７などのビタミンＢが補充される。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの典型的な増殖培地は、グリセロール、ソルビトール又はグルコース、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ビオチン、及び微量元素を含む。
産生相では、産生培地は、特に、ほんの限られた量の補充炭素源が使用される。
好ましくは、宿主細胞株は、好適な炭素源を含むミネラル培地で培養され、それによって、単離プロセスが更に大幅に簡素化される。好ましいミネラル培地の例は、利用可能な炭素源（例えば、グルコース、グリセロール、ソルビトール、メタノール、エタノール、又はそれらの組み合わせ）、多量元素（カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、塩化物、硫酸塩、リン酸塩）及び微量元素（銅、ヨウ化物、マンガン、モリブデン、コバルト、亜鉛、及び鉄塩、並びにホウ酸）、並びに、任意選択的に、ビタミン又はアミノ酸（例えば、栄養要求性を補完するもの）を含有する培地である。
具体的には、細胞は、所望のＰＯＩの発現をもたらすのに好適な条件下で培養され、ＰＯＩは、発現系及び発現タンパク質の性質（例えば、タンパク質がシグナルペプチドに融合されているかどうか、及びタンパク質が可溶性又は膜結合性であるかどうか）に応じて、細胞又は培養培地から精製することができる。当業者によって理解されるように、培養条件は、用いられる宿主の細胞型及び特定の発現ベクターを含む要因に応じて異なる。
典型的な産生培地は、補充炭素源を含み、更にＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ビオチン、及び微量元素を含む。
例えば、発酵に添加された補充炭素源の供給は、最大５０重量％の利用可能な糖類、又は最大１００％の利用可能なアルコールを含む炭素源を含み得る。
発酵は、好ましくは、３～８の範囲のｐＨで実施される。
典型的な発酵時間は、２０℃～３５℃、好ましくは２２～３０℃の範囲の温度で、約２４～１２０時間である。
ＰＯＩは、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｇ／Ｌの収率を生じさせるための条件を用いて発現される。
「発現」又は「発現カセット」という用語は、所望のコード配列（本明細書では遺伝子と称される）を含有し、作動可能な連結において配列を制御する（その結果、これらの分子で形質転換又はトランスフェクトされた宿主が、それぞれの配列を組み込み、コードされたタンパク質又は宿主細胞代謝産物を産生することができる）核酸分子（本明細書ではポリヌクレオチドとも称される）を指すと理解される。本明細書で使用される「発現」という用語は、ポリヌクレオチド若しくは遺伝子の発現、又はそれぞれのポリペプチド若しくはタンパク質の発現を指す。
１つ以上の発現カセットは、本明細書では、「発現系」としても理解される。発現系は、ベクターなどの発現構築物に含まれ得るが、関連するＤＮＡが、宿主細胞の染色体に組み込まれる可能性がある。発現は、ポリペプチド又は代謝産物を含む、分泌型又は非分泌型発現産物を指し得る。
発現カセットは、例えば、「ベクター」又は「プラスミド」の形態の発現構築物として好都合に提供され、それらは、典型的には、好適な宿主生物において、クローニングされた組換えヌクレオチド配列（すなわち、組換え遺伝子）の転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列である。発現ベクター又はプラスミドは、通常、宿主細胞内での自律複製のための起点、又はゲノム組み込みのための遺伝子座、選択可能なマーカー（例えば、アミノ酸合成遺伝子、又はゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８、若しくはハイグロマイシン、ノーセオスリシンなどの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子）、いくつかの制限酵素切断部位、好適なプロモーター配列、及び転写ターミネーターを含み、これらの構成要素は、一緒に作動可能に連結されている。本明細書で使用される場合、「プラスミド」及び「ベクター」という用語は、自律的に複製するヌクレオチド配列、並びに人工染色体（例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などのヌクレオチド配列を組み込むゲノムを含む。
発現ベクターには、クローニングベクター、改変クローニングベクター、及び特に設計されたプラスミドが含まれ得るが、これらに限定されない。本明細書に記載の好ましい発現ベクターは、真核生物宿主細胞における組換え遺伝子の発現に好適な発現ベクターであり、宿主生物に応じて選択される。適切な発現ベクターは、典型的には、真核生物宿主細胞においてＰＯＩをコードするＤＮＡを発現するのに好適な調節配列を含む。調節配列の例としては、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、並びに転写及び翻訳の開始及び終了を制御する配列が挙げられる。調節配列は、典型的には、発現されるＤＮＡ配列に作動可能に連結される。
宿主細胞における組換えヌクレオチド配列の発現を可能にするために、プロモーター配列は、典型的には、それと作動可能に連結される下流ヌクレオチド配列の転写を調節及び開始する。発現カセット又はベクターは、典型的には、コード配列の５’末端に隣接する、例えば、（例えば、ヘルパー因子をコードする）コード配列若しくは目的の遺伝子（ＧＯＩ）の上流にあり隣接するプロモーターヌクレオチド配列、又は、シグナル配列若しくはリーダー配列が使用される場合、コード配列の翻訳開始及び発現を容易にして発現産物（例えば、ＴＩＦ若しくはＰＯＩ）が得られるように、それぞれ、当該シグナル配列及びリーダー配列の上流にあり隣接するプロモーターヌクレオチド配列を含む。
本明細書に記載の特定の発現構築物は、当該プロモーターの転写制御下でＴＩＦ又はＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。具体的には、プロモーターは、当該コード配列に天然に関連付けられていないものを使用することができる。
本明細書に記載の特異的発現構築物は、分泌経路へのＰＯＩの輸送及び／又は宿主細胞からのＰＯＩの分泌を引き起こす、リーダー配列（例えば、分泌シグナルペプチド配列（プレ配列）、又はプロ配列）に連結されたＰＯＩをコードするポリヌクレオチドを含む。発現ベクターにおけるかかる分泌リーダー配列の存在は、典型的には、組換え発現のために意図されたＰＯＩが、天然に分泌されないタンパク質であり、したがって、天然の分泌リーダー配列を欠く場合に必要とされるか、又はそのヌクレオチド配列が、その天然の分泌リーダー配列なしでクローニングされている場合に必要とされる。一般に、宿主細胞からのＰＯＩの分泌を引き起こすのに有効な任意の分泌リーダー配列を使用することができる。分泌リーダー配列は、酵母源、例えば、酵母α因子（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＦα）又は酵母ホスファターゼ由来、哺乳類若しくは植物源由来、又は他に由来し得る。
特定の実施形態では、マルチクローニングベクターを使用することができ、これは、マルチクローニング部位を有するベクターである。具体的には、所望の異種ポリヌクレオチドは、発現ベクターを調製するために、マルチクローニング部位に組み込まれるか又は取り込まれ得る。マルチクローニングベクターの場合、プロモーターは、典型的には、マルチクローニング部位の上流に配置される。
本明細書で使用される場合、「遺伝子発現」又は「ポリヌクレオチドを発現する」又は「核酸分子を発現する」という用語は、ｍＲＮＡへのＤＮＡの転写、ｍＲＮＡの翻訳及びプロセシング、ｍＲＮＡの成熟、ｍＲＮＡの輸送、タンパク質のフォールディング及び／又はタンパク質の輸送からなる群から選択される少なくとも１つのステップを包含することを意味する。
「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、又は「核酸配列」という用語は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのポリマー非分岐形態の、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれか、又は両方の組み合わせのヌクレオチドを指す。好ましくは、ポリヌクレオチドは、任意の長さのポリマー非分岐形態のデオキシリボヌクレオチドを指す。ここで、ヌクレオチドは、五炭糖（デオキシリボース）、窒素含有塩基（アデニン、グアニン、シトシン、又はチミン）、及びリン酸基からなる。
本明細書で使用される「共発現する」又は「共発現」という用語は、宿主細胞、細胞株、又は細胞培養物中の少なくとも２つ又は複数のポリヌクレオチド（遺伝子などの核酸分子）の、例えば、ほぼ同じ又は異なる量若しくは比率の、随伴する又は連続した（まだ、同じ細胞培養物若しくは封じ込めで細胞を培養している間に）又は同時の発現を意味する。
本明細書に記載されるように、ポリヌクレオチド（ＴＩＦ遺伝子のような）は、ポリヌクレオチド（ＧＯＩのような）のうちの少なくとも１つが過剰発現されるように、共発現され得る。
本明細書に記載されるようなＴＩＦ遺伝子を共発現する宿主細胞は、宿主細胞培養物における当該ＴＩＦ遺伝子の発現を増加させるように特異的に遺伝子操作及び改変される。これは、本明細書では「過剰発現」又は「共過剰発現」とも称される。
本明細書で使用される「過剰発現する」又は「過剰発現」という用語は、宿主細胞の遺伝子改変前の同じ発現産物の発現よりも高いレベルでの、又は定義された条件で遺伝子改変されていない同等の宿主における、発現産物（例えば、ポリペプチド又はタンパク質）の発現を指すものとする。宿主細胞に対して異種であるＴＩＦは、かかる宿主細胞がかかるＴＩＦを発現している場合、常に過剰発現されると理解される。例えば、本明細書に記載される宿主細胞が当該ＴＩＦのいずれも天然に発現しない場合、かかるＴＩＦタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドは、発現のために宿主細胞に新たに導入され、かかる場合、かかるＴＩＦの検出可能な発現は、「過剰発現」という用語によって包含される。
タンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＴＩＦ遺伝子）の過剰発現は、タンパク質（例えば、ＴＩＦ）の過剰発現とも称される。過剰発現は、当業者に既知の任意の方式で達成することができる。一般に、それは、遺伝子の転写／翻訳を増加させること、例えば、遺伝子のコピー数を増加させること、又は遺伝子の発現に関連する調節配列若しくは部位を変更又は改変することによって達成され得る。例えば、遺伝子は、高い発現レベルに達するように、強力なプロモーターに作動可能に連結され得る。かかるプロモーターは、内因性プロモーター、又は異種プロモーター（特に、組換えプロモーター）であり得る。プロモーターは、遺伝子の発現を増加させる異種プロモーターで置換され得る。誘導性プロモーターを使用すると、更に、培養過程で発現を増加させることが可能になる。更に、過剰発現は、例えば、特定の遺伝子の染色体位置を改変すること、特定の遺伝子に隣接する核酸配列（例えば、リボソーム結合部位若しくは転写ターミネーター）を変更すること、オープンリーディングフレームにフレームシフトを導入すること、遺伝子の転写及び／若しくは遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなど）を改変すること、又は当該技術分野における特定の遺伝子ルーチンの発現を脱調節する任意の他の従来の手段（例えば、抑制タンパク質の発現を遮断するか、又は過剰発現されることが望まれる遺伝子の発現を通常抑制する転写因子の遺伝子を欠失若しくは変異させる、アンチセンス核酸分子の使用が含まれるが、これに限定されない）によっても達成され得る。ｍＲＮＡの寿命を延ばすことで、発現レベルを改善することもできる。例えば、特定のターミネーター領域は、ｍＲＮＡの半減期を延長するために使用され得る。遺伝子が複数コピー含まれる場合、遺伝子は、異なるコピー数のプラスミドに配置されるか、又は染色体に組み込まれ増幅され得る。１つ以上の遺伝子又はゲノム配列を、発現のための宿主細胞に導入することが可能である。
特定の実施形態によれば、それぞれのＴＩＦをコードするポリヌクレオチドは、細胞当たり単一コピー又は複数コピーで提示され得る。コピーは、隣接していてもよく、又は互いに離れていてもよい。別の具体的な実施形態によれば、それぞれのＴＩＦの過剰発現は、ＴＩＦをコードする組換えヌクレオチド配列を用い、ＴＩＦは、宿主細胞のゲノムへの組み込み（すなわち、ノックイン）に好適な１つ以上のプラスミド上で、細胞当たり単一コピー又は複数コピーで提供される。コピーは、隣接していてもよく、又は互いに離れていてもよい。過剰発現は、複数コピーのポリヌクレオチド、例えば、宿主細胞当たり、２、３、４、５、６以上のコピーの当該ポリヌクレオチドを発現させることによって達成することができる。
ＧＯＩ及びそれぞれのＴＩＦをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）を含む組換えヌクレオチド配列は、１つ以上の自律的に複製するプラスミド上に提供されてもよく、細胞当たり単一コピー又は複数コピーで導入されてもよい。
代替的に、ＧＯＩ及びＴＩＦをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）を含む組換えヌクレオチド配列は、同じプラスミドに存在してもよく、細胞当たり単一コピー又は複数コピーで導入されてもよい。
それぞれのＴＩＦをコードする異種のポリヌクレオチド（遺伝子）、又はＴＩＦをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）を含む異種組換え発現構築物は、好ましくは宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
「ゲノム」という用語は、一般に、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）にコードされている生物の全遺伝情報を指す。それは、染色体に、プラスミド若しくはベクター上に、又はそれらの両方に存在し得る。好ましくは、それぞれのＴＩＦをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）は、当該細胞の染色体に組み込まれる。
それぞれのＴＩＦをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）は、その天然の遺伝子座に組み込まれ得る。「天然の遺伝子座」とは、ＴＩＦをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）が天然に存在する野生型細胞内に位置する、特定の染色体上の位置を意味する。しかしながら、別の実施形態では、ＴＩＦをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）は、天然の遺伝子座ではなく、異所的に組み込まれた宿主細胞のゲノムに存在する。「異所的組み込み」という用語は、その通常の染色体遺伝子座以外の部位で、核酸を微生物のゲノムに挿入すること（すなわち、所定の又はランダムな組み込み）を意味する。別の実施形態では、ＴＩＦをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）は、天然の遺伝子座に、及び異所的に組み込まれる。異種組換えは、ランダムな組み込み又は非標的化組み込みを達成するために使用することができる。異種組換えは、顕著に異なる配列を有するＤＮＡ分子間の組換えを指す。
特定の実施形態では、それぞれのＴＩＦ及び／又はＧＯＩをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）は、プラスミド又はベクターに組み込むことができる。好ましくは、プラスミドは、真核生物発現ベクター、好ましくは酵母発現ベクターである。好適なプラスミド又はベクターは、本明細書に更に記載される。
組換え宿主細胞における内因性又は異種ポリヌクレオチドの過剰発現は、発現制御配列を改変することによって達成することができる。発現制御配列は、当該技術分野で既知であり、例えば、宿主細胞内でのポリヌクレオチド配列の発現を提供するプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などを含む。発現制御配列は、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する。例示的な発現制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。
好ましい実施形態では、過剰発現は、エンハンサーを使用してポリヌクレオチドを発現することによって達成される。転写エンハンサーは、イントロン内並びにコード配列自体内で、転写ユニットの５’及び３’に見出されており、配向及び位置に比較的依存しない。エンハンサーは、コード配列の５’又は３’位で発現ベクターにスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターから５’位に位置する。ほとんどの酵母遺伝子は、一般的に、ＣＡＰ部位の数百塩基対以内に存在する１つのＵＡＳのみを含有し、ほとんどの酵母エンハンサー（ＵＡＳ）は、プロモーターの３’に位置する場合は機能しないが、高等真核生物のエンハンサーは、プロモーターの５’及び３’の両方で機能し得る。
哺乳類遺伝子（グロビン、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＥＭＣ、エラスターゼ、アルブミン、ａ－フェトプロテイン、及びインスリン）からのエンハンサー配列が多数知られている。また、ＳＶ４０後期エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーなどの真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用してもよい。
具体的には、本明細書に記載されるＧＯＩ及び／又はＴＩＦをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）は、宿主細胞における発現を提供する転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結される。本明細書で使用される「翻訳調節配列」という用語は、遺伝子核酸配列に関連し、遺伝子の翻訳を調節するヌクレオチド配列を指す。転写及び／又は翻訳調節配列は、プラスミド又はベクターに配置されるか、又は宿主細胞の染色体に組み込まれるかのいずれかであり得る。転写及び／又は翻訳調節配列は、それが調節する遺伝子の同じ核酸分子に配置される。
具体的には、それぞれのＴＩＦの過剰発現は、Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００８（Ｍａｒｘ，Ｈ．，Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，Ｄ．ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，Ｍ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ７（２００８）：２３）によって記載されているように、当該技術分野で既知の方法によって（例えば、内因性調節領域を遺伝子改変することによって）達成することができ、かかる方法は、例えば、遺伝子の発現を増加させる組換えプロモーターの組み込みを含む。
例えば、組換え宿主細胞における内因性又は異種ポリヌクレオチドの過剰発現は、かかる発現を制御するプロモーターを改変することによって、例えば、高い発現レベルに到達するために、当該ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（例えば、野生型生物で当該ポリヌクレオチドに天然に連結された内因性プロモーター又はプロモーター）を、別のより強いプロモーターに置き換えることによって達成され得る。かかるプロモーターは、誘導的又は構成的であり得る。プロモーターの改変は、当該技術分野で既知の変異誘発方法によっても行われ得る。
具体的な実施形態は、ＧＯＩを発現することと共に、ＴＩＦ（又はＴＩＦ遺伝子）の共発現に言及する。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ベクター又は核酸配列は、少なくとも１つのＴＩＦ分子及びＧＯＩを共発現するための１つ以上の発現カセットを含み得る。ベクター又は核酸配列は、２つ以上のプラスミドの共トランスフェクション、複数のプロモーター若しくは双方向性プロモーターの使用、又はバイシストロンベクター若しくはマルチシストロンベクターの作製を含む多くの技術を使用して、２つ以上のポリヌクレオチドの共発現を可能にするように構築され得る。
具体的な実施形態は、例えば、宿主細胞のゲノム又は染色体内で安定した組み込みのためのそれぞれの発現カセットを導入する際に、少なくとも１、２、３、４、又は５つのＴＩＦを安定して共発現するための遺伝子改変に言及する。
本明細書で使用される「機能的バリアント」という用語は、「機能的に活性なバリアント」とも称され、例えば、ＴＩＦ、ヌクレオチド配列若しくはＴＩＦのアミノ酸配列に由来するか、又はそれに関連する、天然配列（「天然（ｎａｔｉｖｅ）」は、野生型細胞内に天然に存在する配列として理解される）以外のあらゆるものを意味する。本明細書では、親配列と特定の配列同一性を有する（親）ＴＩＦ又はそれぞれのＴＩＦ遺伝子のいずれかの特定の機能的バリアント（例えば、配列番号１～６５のいずれか１つ、特に、配列番号１、１２、２３、３４、４５、又は５６のいずれかを含むか又はそれからなる）を記載する。
特定の実施形態によれば、機能的バリアントは、天然配列に由来し、宿主細胞において実証された機能を有する所定の配列を含むか又はそれからなり、それが由来する天然配列と比較して、ほぼ同じ及び／又は改善されている。
特定の実施形態によれば、機能的バリアントは、天然に存在する親分子のアイソフォーム又はオーソログであり、オーソログは、天然に存在する親分子を含む種（例えば、哺乳動物種又は真菌種）以外の種において天然に存在する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸分子の機能的バリアントは、例えば、核酸安定性の改善、宿主細胞における翻訳効率の上昇、発現された切断型タンパク質の数の減少、発現されたタンパク質のフォールディングの改善若しくはミスフォールディングの防止、発現された産物の毒性の減少、発現された産物によって引き起こされた細胞死の減少、又はタンパク質凝集の増加及び／若しくは減少のために、配列が最適化されたヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態によれば、親ヌクレオチド配列の機能的バリアントは、宿主細胞の細胞環境で改善された発現のために親ヌクレオチド配列の１つ以上の遺伝子改変によって取得可能である、宿主細胞において発現される当該親ヌクレオチド配列のコドン最適化されたバリアントである。
本明細書に記載されるＴＩＦの機能的バリアントは、天然配列と実質的に同じ又は改善された活性を有する場合（特に、宿主細胞において共発現させたときにＰＯＩの産生を改善するために）、機能的に活性であるとみなされる。
ＴＩＦの機能的に活性なバリアントは、それぞれの天然（野生型）ＴＩＦ遺伝子の変異誘発によってそのバリアントを産生し、宿主細胞においてバリアントを異種ＰＯＩをコードする遺伝子と随伴して又は同時に発現させ、バリアントの活性を評価して宿主細胞の生産性を向上させてＰＯＩを産生させることによって調製することができる。
ＴＩＦの活性は、例えば、インビトロ及びインビボのアプローチを使用して、周知の方法によって記載されているように決定され得る。
翻訳活性を分析するための好適な方法は、Ｄｅｒｍｉｔ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ．２０１７ Ｎｏｖ ２１；１３（１２）：２４７７－２４８８２０１７）に要約されている。
いくつかの更なる好適な方法は、Ｍａｒｔｉｎ Ｒ（１９９８；Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ７７，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）によって記載されているように、活発に翻訳されるタンパク質の放射性標識（放射性標識アミノ酸の組み込み）を用いる。
翻訳活性を測定する特定の試験は、以下の実施例セクションに記載されている。
親タンパク質の機能的バリアントとしては、例えば、１つ以上のアミノ酸残基が、Ｎ末端又はＣ末端で、並びに１つ以上の内部ドメイン内で、付加又は欠失されるタンパク質が挙げられる。特定の機能的に活性なバリアントは、親配列を、例えば、１００アミノ酸未満、具体的には７５アミノ酸未満、より具体的には５０アミノ酸未満、より具体的には２５アミノ酸未満、又はそれ以外では１０アミノ酸未満延長するために、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のアミノ酸を含む。更なる特定の機能的に活性なバリアントは、融合タンパク質であってもよく、本発明の配列は、別のポリペプチド又はタンパク質の追加のアミノ酸残基によって延長される。
特定の機能的バリアントは、親タンパク質又は核酸分子の断片である。
ポリヌクレオチド又は核酸分子の断片である機能的バリアントは、少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドから本明細書に記載されるＴＩＦをコードする完全長ヌクレオチド配列までの範囲であり得る。ポリヌクレオチド又は核酸分子の機能的に活性な断片は、それぞれのヌクレオチド配列の少なくとも５０％、好ましくは６０、７０、８０、８５、９０％、又は９５％のうちの少なくともいずれかで含み得る。
ポリペプチド又はタンパク質の断片である機能的バリアントは、少なくとも１０個のアミノ酸、具体的には少なくとも２５個のアミノ酸、より具体的には少なくとも５０個のアミノ酸、より具体的には少なくとも７５個のアミノ酸、又は少なくとも１００個の連続したアミノ酸、又は完全長タンパク質に存在するアミノ酸の総数までを含むか又はそれからなり得る。
本明細書で使用される「内因性」という用語は、それぞれの内因性遺伝子の発現を減少させる、かつ／又は内因性タンパク質の産生を減少させるための改変の前に、野生型（天然）宿主細胞に存在するそれらの分子及び配列（特に、内因性遺伝子又はタンパク質）を含むことを意味する。特に、特定の宿主細胞に存在する（及びそれから得ることができる）内因性核酸分子（例えば、遺伝子）又はタンパク質は、それが天然に見出されるため、「宿主細胞内因性」又は「宿主細胞に内因性」であると理解される。更に、核酸又はタンパク質を「内因的に発現する」細胞は、それが自然界に見出されるものと同じ特定のタイプの宿主のように、その核酸又はタンパク質を発現する。更に、宿主細胞は、核酸、タンパク質、又は他の化合物を「内因的に産生している」か、又は「内因的に産生する」宿主細胞は、自然界に見出されるものと同じ特定のタイプの宿主細胞のように、その核酸、タンパク質、又は化合物を産生する。
したがって、タンパク質をコードする遺伝子が不活性化又は欠失される宿主細胞のノックアウト変異体などの宿主細胞によって内因性タンパク質がもはや産生されない場合でも、タンパク質は、本明細書では依然として「内因性」と称される。
ヌクレオチド配列、構築物（例えば、発現カセット）、アミノ酸配列、又はタンパク質に関して本明細書で使用される「異種の」という用語は、所与の宿主細胞に対して外来（すなわち、当該宿主細胞において天然には見出されないような「外因性」）であるか、あるいは所与の宿主細胞において天然に見出される（例えば、「内因性」である）が、異種構築物の文脈において、又はかかる異種構築物に組み込まれる（例えば、内因性核酸と融合された若しくは内因性核酸と併せて異種核酸を用いる）ことで、構築物を異種にするかのいずれかである化合物を指す。内因的に見出される異種ヌクレオチド配列はまた、細胞において不自然な（例えば、予想よりも多い、又は天然に見出されるものよりも多い）量で産生され得る。異種ヌクレオチド配列、又は異種ヌクレオチド配列を含む核酸は、おそらく内因性ヌクレオチド配列とは配列が異なるが、内因的に見出されるものと同じタンパク質をコードする。具体的には、異種ヌクレオチド配列は、自然界の宿主細胞と同じ関係で見出されないものである。任意の組換えヌクレオチド配列又は人工ヌクレオチド配列は、異種であると理解される。異種ポリヌクレオチドの例は、本明細書に記載されているように、プロモーターと天然に会合していないヌクレオチド配列（例えば、ハイブリッドプロモーターを得るために）、又はコード配列に作動可能に連結されていないヌクレオチド配列である。その結果、ハイブリッドポリヌクレオチド又はキメラポリヌクレオチドを得ることができる。異種化合物の更なる例は、内因性の天然に存在するＰＯＩをコードする配列が通常作動可能に連結されていない、転写制御エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結されたＰＯＩをコードするポリヌクレオチドである。
本明細書で使用される「ＴＩＦ」と略される「翻訳開始因子」という用語は、翻訳開始因子タンパク質又は翻訳開始因子をコードするポリヌクレオチド（核酸分子）を指す。
具体的には、本明細書に記載のＴＩＦのいずれも、目的のタンパク質（ＰＯＩ）ではない。本明細書に記載の組換え宿主細胞は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）と称される、ＴＩＦを発現し、（ポリヌクレオチドをコードする当該ＴＩＦとは異なる）別のポリヌクレオチドを更に発現する発現系を含むことが特に理解される。
本明細書で使用される「翻訳開始因子」という用語は、特に、ｍＲＮＰに含まれる因子のいずれかを指す。
特異的なＴＩＦをコードするヌクレオチド配列は、天然に存在する配列又はその機能的に活性なバリアント（例えば、組換え宿主細胞におけるその発現を改善するために、ヌクレオチド配列最適化アルゴリズムによって又はコドン最適化技術によって配列を最適化する１つ以上、例えば、最大５０、４０、３０、２０、又は１０個のうちのいずれかの点変異で親（天然に存在する）とは異なるバリアントヌクレオチド配列）である。
具体的な最適化技術は、例えば、ヌクレオチド配列最適化アルゴリズムによって又はコドン最適化技術によって、宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を改善することである。
Ｇｏｌｄｅｎ ＧａｔｅクローニングやＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリの最適化など、特定の最適化技術がクローニングを改善している。
特定の最適化ヌクレオチド配列は、例えば、使用される任意の制限酵素（例えば、ＢｓａＩ及びＢｐｉＩ）の認識部位の存在を回避するための「サイレント」変異を含む。
本明細書に記載の最適化されたヌクレオチド配列は、典型的には、コードされたアミノ酸配列における１つ以上、例えば、いくつかの点変異、例えば、最大１０、９、８、７、６、５、４、又は３個の点変異を可能にする。
真核生物翻訳開始因子４Ｅとしても知られる「ｅＩＦ４Ｅ」は、閉ループｍＲＮＡの形成に関与するＴＩＦであり、これは、閉ループ因子であり、ｅＩＦ４Ｆキャップ結合複合体の一部であり、ｍＲＮＰの一部である。それは、配列番号１～１１のいずれか１つ、又は他の真核生物種におけるオーソログによって特徴付けられる。ｅＩＦ４Ｅは、天然に存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子であり得るｅＩＦ４Ｅをコードするヌクレオチド配列、又は天然に存在するｅＩＦ４Ｅと特定の配列同一性を有するｅＩＦ４Ｅをコードするそのそれぞれの機能的バリアントによってコードされる。例示的なｅＩＦ４Ｅをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１をコードするＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉの配列番号６６によって特定されるか、又はその機能的に活性なバリアントである。配列番号６７は、Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ最適化によって産生されている最適化コードヌクレオチド配列の一例を特定し、配列番号６６とは３つのヌクレオチド置換：Ａ２７６Ｇ、Ｔ３５４Ｃ、Ｇ４９２Ａによって異なる。
真核生物翻訳開始因子４Ａとしても知られるｅＩＦ４Ａは、閉ループｍＲＮＡの形成に関与するＴＩＦであり、これは、閉ループ因子であり、ｅＩＦ４Ｆキャップ結合複合体の一部であり、ｍＲＮＰの一部である。それは、配列番号１２～３３のうちのいずれか１つ、又は他の真核生物種におけるオーソログによって特徴付けられる。「ｅＩＦ４Ａ」という用語は、ＴＩＦ２ａ及びＴｉＦ２ｂを含み、ＴＩＦ２ｂは、５’末端上のＴＩＦ２ａの２４９ヌクレオチド（８３個のアミノ酸に対応する）のより長いバリアントである。両方の配列は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムから直接増幅され、代替の開始位置を有するｅＩＦ４Ａの２つのバリアントを提示した。
ｅＩＦ４Ａは、天然に存在するｅＩＦ４Ａ遺伝子であり得るｅＩＦ４Ａをコードするヌクレオチド配列、又は天然に存在するｅＩＦ４Ａと特定の配列同一性を有するｅＩＦ４Ａをコードするそのそれぞれの機能的バリアントによってコードされる。例示的なｅＩＦ４Ａをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号１２及び配列番号２３をコードするＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉの配列番号６８又は配列番号７０によって特定されるか、又はその機能的に活性なバリアントである。配列番号６９は、Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ最適化によって産生されている最適化されたコードヌクレオチド配列の一例を特定し、配列番号６８とは１つのヌクレオチド置換：Ｃ４５Ａによって異なる。配列番号７１は、Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ最適化によって産生されている最適化されたコードヌクレオチド配列の一例を特定し、配列番号７０とは１つのヌクレオチド置換：Ｃ２９４Ａによって異なる。
真核生物翻訳開始因子４Ｇとしても知られるｅＩＦ４Ｇは、閉ループ因子であり、ｅＩＦ４Ｆキャップ結合複合体の一部であり、ｍＲＮＰの一部である、閉ループｍＲＮＡの形成に関与するＴＩＦである。それは、配列番号３４～４４のいずれか１つ、又は他の真核生物種におけるオーソログによって特徴付けられる。ｅＩＦ４Ｇは、天然に存在するｅＩＦ４Ｇ遺伝子であり得るｅＩＦ４Ｇをコードするヌクレオチド配列、又は天然に存在するｅＩＦ４Ｇと特定の配列同一性を有するｅＩＦ４Ｇをコードするそのそれぞれの機能的バリアントによってコードされる。例示的なｅＩＦ４Ｇをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４をコードするＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉの配列番号７２によって特定されるか、又はその機能的に活性なバリアントである。配列番号７３は、Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ最適化によって産生されている最適化されたコードヌクレオチド配列の一例を特定し、配列番号７２とは４つのヌクレオチド置換：Ａ５６４Ｇ、Ａ１９２３Ｇ、Ｇ２０３７Ｃ、Ｔ２１００Ｃによって異なる。
ポリアデニル酸結合タンパク質１としても知られるＰＡＢ１は、閉ループｍＲＮＡ及びｍＲＮＰの一部の形成に関与するＴＩＦである。それは、配列番号４５～５５のうちのいずれか１つ、又は他の真核生物種におけるオーソログによって特徴付けられる。ＰＡＢ１は、天然に存在するＰＡＢ１遺伝子であり得るＰＡＢ１をコードするヌクレオチド配列、又は天然に存在するＰＡＢ１と特定の配列同一性を有するＰＡＢ１をコードするそのそれぞれの機能的バリアントによってコードされる。例示的なＰＡＢ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４５をコードするＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉの配列番号７４によって特定されるか、又はその機能的に活性なバリアントである。配列番号７５は、Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ最適化によって産生されている最適化コードヌクレオチド配列の一例を特定し、配列番号７４とは３つのヌクレオチド置換：Ｃ１５０Ａ、Ｔ３８４Ｃ、Ｃ７０７Ｔによって異なる。
ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＥメンバー１（ＡＢＣＥ１）としても知られ、ＲＮａｓｅＬ阻害剤（ＲＬＩ）としても知られるＲＬＩ１は、ヒトでＡＢＣＥ１遺伝子によってコードされるＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質である。これは、翻訳開始及びリボソーム生合成、並びに翻訳終結及びｍＲＮＰの一部において二重の役割を有するＴＩＦである。それは、配列番号５６～６５のうちのいずれか１つ、又は他の真核生物種におけるオーソログによって特徴付けられる。ＲＬＩ１は、天然に存在するＲＬＩ１遺伝子であり得るＲＬＩ１をコードするヌクレオチド配列、又は天然に存在するＲＬＩ１と特定の配列同一性を有するＲＬＩ１をコードするそのそれぞれの機能的バリアントによってコードされる。例示的なＲＬＩ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５６をコードするＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉの配列番号７６によって特定されるか、又はその機能的に活性なバリアントである。
本明細書に提供され、実施例セクションで使用される（それぞれの（最適化された）ヌクレオチド配列を含む）配列番号１、１２、２３、３４、４５、及び５６によって特定されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＴＩＦは、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ起源である。本明細書に提供される配列番号２、１３、２４、３５、４６、及び５７によって特定されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＴＩＦは、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ起源である。図１に提供されているものなどの、他の酵母宿主細胞（特に、メチル栄養性酵母）に本明細書に記載されるように使用することができる相同配列が存在することはよく理解されている。例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの酵母は、それぞれの相同配列を含む。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、コマガタエラ属に再分類され、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ、及びＫ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓの３つの種に分けられている。
例えば、本明細書に記載の特定の配列同一性を有するそれぞれのＴＩＦの任意の相同配列、特に、それぞれのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（例えば、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、又はＫ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）のＴＩＦのオーソログである任意のかかるタンパク質を使用することができる。
本明細書で使用される「ｍＲＮＰ」という用語は、結合タンパク質を有するｍＲＮＡからなる粒子又は複合体として理解されるメッセンジャーＲＮＰ（メッセンジャーリボ核タンパク質）を指す。ｍＲＮＡは、細胞質で合成、スプライシング、輸送、及び翻訳される間、様々なタンパク質によって結合される。
本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、１つ以上のヌクレオチド配列の機能が、当該核酸分子に存在する少なくとも１つの他のヌクレオチド配列によって影響を受けるような方法で、単一の核酸分子（例えば、ベクター又は発現カセット）でのヌクレオチド配列の会合を指す。核酸配列は、作動可能に連結することによって、同じ核酸分子上の別の核酸配列との機能的関係に置かれる。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、組換え遺伝子のコード配列と作動可能に連結される。更なる例として、シグナルペプチドをコードする核酸は、成熟タンパク質又は成熟タンパク質のプレ形態などの分泌型のタンパク質を発現することができる場合、ＰＯＩをコードする核酸配列に作動可能に連結される。具体的には、互いに作動可能に連結されたかかる核酸は、すなわち、シグナルペプチドをコードする核酸とＰＯＩをコードする核酸配列との間の更なるエレメント又は核酸配列なしで、直に連結され得る。代替的に、例えば、プロモーターとＧＯＩとの間に配置されたクローニング部位などの好適な連結配列を使用してもよい。
「プロモーター」配列は、典型的には、プロモーターがコード配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結されると理解される。プロモーター配列がコード配列に天然には会合していない場合、その転写は、天然（野生型）の細胞においてプロモーターによって制御されていないか、又は配列が異なる連続した配列と組み換えられているかのいずれかである。
プロモーターは、ＰＯＩをコードするＤＮＡなどのポリヌクレオチド（ＤＮＡ）をコードするタンパク質の発現を開始、調節、又はそうでなければ媒介若しくは制御するように本明細書に記載される。プロモーターＤＮＡ及びコードＤＮＡは、同じ遺伝子由来又は異なる遺伝子由来であってもよく、同じ又は異なる生物由来であってもよい。
プロモーターの強度は、高頻度又は低頻度でそのプロモーターで生じる転写の開始の効率によって表される、その転写強度を具体的に指す。転写強度が高いほど、そのプロモーターでの転写がより頻繁に起こるであろう。プロモーターの強度は、プロモーターの典型的な特徴である。なぜなら、プロモーターは、所与のｍＲＮＡ配列が転写される頻度を決定し、他の遺伝子よりもいくつかの遺伝子の転写に対して効果的に高い優先順位を与え、より高い濃度の転写物をもたらすからである。例えば、大量に必要とされるタンパク質をコードする遺伝子は、典型的には、比較的強いプロモーターを必要とする。ＲＮＡポリメラーゼは一度に１つの転写タスクしか実行することができないため、作業を効率化するために優先順位を付ける必要がある。この優先順位付けを可能にするために、プロモーターの強度の差が選択される。
プロモーターの強度はまた、例えば、好適なアッセイ（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ又はノーザンブロッティング）における転写物の量によって決定される、転写速度として一般的に理解されている転写の頻度も指し得る。例えば、本明細書に記載のプロモーターの転写強度は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓである宿主細胞において決定され、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの天然のｐＧＡＰプロモーターと比較される。
目的の遺伝子を発現するためのプロモーターの強度は、一般に、発現強度又は高い発現レベル／速度をサポートする能力として理解される。例えば、本発明のプロモーターの発現及び／又は転写の強度は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓである宿主細胞において決定され、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの天然のｐＧＡＰプロモーターと比較され、例えば、完全に誘導又は脱抑制されたときに測定される。
特定の態様によれば、ＧＯＩＥＣプロモーターは、ＴＩＦＥＣプロモーターよりも強い。好ましくは、ＰＯＩを産生するための組換え目的で宿主細胞として選択された宿主細胞（例えば、真核生物）において決定されるように、天然のｐＧＡＰプロモーターと比較して、転写速度又は強度が、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％、又は更にそれ以上のうちの少なくともいずれか１つであり、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、若しくは２００％、又は更にそれ以上のうちの少なくともいずれか１つである、プロモーターが使用される。発現速度は、例えば、ｅＧＦＰなどのレポーター遺伝子の発現量によって決定され得る。
天然のｐＧＡＰプロモーターは、典型的には、ほとんどの生物に存在する構成的プロモーターであるグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードするＧＡＰ遺伝子の発現を開始する。ＧＡＰＤＨ（ＥＣ１．２．１．１２）は、糖酵素分解及び糖新生の重要な酵素であり、異化及び同化炭水化物代謝において重要な役割を果たす。
参照プロモーターと比較した相対的な転写強度は、例えば、マイクロアレイを用いて転写物の量を測定するなどの標準的な方法によって、又は組換え細胞中のそれぞれの遺伝子発現産物の量を測定することなどによって細胞培養で決定することができる。特に、転写速度は、マイクロアレイ、ノーザンブロット、若しくは定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、又はＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）における転写強度によって決定され得る。
本明細書に記載されるように、異種プロモーターは、それぞれのＴＩＦＥＣにおいて、ＴＩＦのうちの任意の１つ以上又は全てを発現するために、及び／又はＧＯＩＥＣにおいて、ＧＯＩを発現するために使用することができる。異種プロモーターは、発現されるポリヌクレオチド及び／若しくは人工プロモーター、又は野生型宿主細胞に由来するが、異種発現カセット内の宿主細胞ゲノムに配置されるか若しくは野生型宿主細胞において天然に存在しない位置に配置されるプロモーターに対して異種であり得る。
本明細書に記載されるように、特定の実施形態によれば、ＴＩＦ発現カセット又はＧＯＩＥＣのいずれかは、例えば、本明細書に更に記載されるプロモーターのうちのいずれかの構成的プロモーターを含み、用いられ得る。
構成プロモーターの具体例としては、例えば、ｐＧＡＰ（例えば、配列番号１００、配列番号１０１）及びその機能的バリアント、ｐＣＳ１（例えば、配列番号１０２、若しくはＷＯ２０１４／１３９６０８に公開されているようなその機能的バリアント）、ｐＭＤＨ３（例えば、配列番号１０３）、ｐＰＯＲ１（例えば、配列番号１０４）、ｐＲＰＰ１Ｂ、ｐＰＤＣ１、ｐＧＰＭ１、ｐＦＢＡ１－１などの構成プロモーターのいずれか、又は前述のいずれかの機能的バリアントが挙げられる。
誘導性又は抑制性プロモーターの具体例としては、例えば、天然ｐＡＯＸ１又はｐＡＯＸ２及びその機能的バリアント、ＷＯ２０１３／０５０５５１に公開されているｐＧ１－ｐＧ８又はその断片などの調節性プロモーターのいずれか、並びにＷＯ２０１７／０２１５４１Ａ１に公開されているｐＧ１及びｐＧ１－ｘなどの調節プロモーターのいずれかが挙げられる。
特に、脱抑制性若しくは抑制性（本明細書では（脱）抑制性と称される）又は誘導性プロモーターなどの調節性プロモーター、例えば、天然のメタノール誘導性プロモーターｐＡＯＸ１（配列番号８１）若しくはｐＡＯＸ２（配列番号８２）、又はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの天然のメタノール誘導性プロモーターのいずれか（例えば、配列番号８３～９６、Ｇａｓｓｅｒ，Ｓｔｅｉｇｅｒ，＆ Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２０１５，１４：１９６によって公開されている）、又は任意の他の炭素源調節性プロモーター（例えば、ｐＧ１－ｐＧ８（ｐＧ１：配列番号９７、ｐＧ３：配列番号１０５、ｐＧ４：配列番号１０６、ｐＧ５：配列番号１０７、ｐＧ７：配列番号１０８、ｐＧ８：配列番号１０９などの脱抑制性プロモーター）及び前述のいずれかの機能的バリアント（例えば、断片）（例えば、ｐＧ１ａ～ｐＧ１ｆと称されるｐＧ１の断片：配列番号１１０～１１５）、並びにＷＯ２０１３／０５０５５１及びＷＯ２０１７／０２１５４１に公開されているｐＧ１－ｘと称される機能的バリアント、特に、ｐＧ１－３（例えば、配列番号９８、ｐＧ１－Ｄ１２４０と称される）若しくはｐＧ１－４（例えば、配列番号９９、ｐＧ１－Ｄ１４２７と称される）、又は少なくとも３００、４００、若しくは５００ｂｐ（特に、３’末端を含む）の長さを有する前述のいずれかの機能的バリアント、あるいは前述のいずれかの機能的バリアントが使用され得る。
具体的には、本明細書に記載のプロモーターの機能的バリアントは、それが由来するプロモーターと、プロモーター配列の全長若しくは３’末端の部分にわたって（部分が少なくとも３００、４００、又は５００ｂｐの長さを有する）、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つを含み、発現されるポリヌクレオチドの発現を、特に、ほぼ同じプロモーター活性（例えば、＋／－５０％、４０％、３０％、２０％、若しくは１０％のうちのいずれか１つ）で作動可能に制御するように機能するが、プロモーター活性は、それが由来するプロモーターと比較して改善され得る。図１に示されるように、ｐＧ１－３又はｐＧ１－４の具体的な機能的プロモーターバリアントは、少なくとも２つの主要調節領域、及び／又は少なくとも２つのコア調節領域、及び／又は少なくとも２つのＴモチーフを含むものである。
好適なプロモーター配列の更なる例は、Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒら（ＢＭＣ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２０１７．１１（１）：１２３）及びＭａｔｔａｎｏｖｉｃｈら（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２）８２４：３２９－５８）に記載されており、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ又はＧＡＰ）及びそのバリアント、ラクターゼ（ＬＡＣ）及びガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓグルコース－６－リン酸イソメラーゼプロモーター（ＰＰＧＩ）、３－ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ｐＰＧＫ）、グリセロールアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ｐＧＡＰ）、翻訳伸長因子プロモーター（ＰＴＥＦ）、及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓエノラーゼ１（ｐＥＮ０１）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｐＴＰＩ）、リボソームサブユニットタンパク質（ｐＲＰＳ２、ｐＲＰＳ７、ｐＲＰＳ３１、ｐＲＰＬ１）、アルコールオキシダーゼプロモーター（ｐＡＯＸ１、ｐＡＯＸ２）又は特性が改変されたそのバリアント、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼプロモーター（ｐＦＬＤ）、イソクエン酸リアーゼプロモーター（ｐＩＣＬ）、α－ケトイソカプロン酸デカルボキシラーゼプロモーター（ｐＴＨＩ）、熱ショックタンパク質ファミリーメンバーのプロモーター（ｐＳＳＡ１、ｐＨＳＰ９０、ｐＫＡＲ２）、６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ｐＧＮＤ１）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｐＧＰＭ１）、トランスケトラーゼ（ｐＴＫＬ１）、ホスファチジルイノシトールシンターゼ（ｐＰＩＳ１）、フェロ－０２－オキシドレダクターゼ（ｐＦＥＴ３）、高親和性鉄パーミアーゼ（ｐＦＴＲ１）、抑制性アルカリホスファターゼ（ｐＰＨ０８）、Ｎ－ミリストイルトランスフェラーゼ（ｐＮＭＴ１）、フェロモン応答転写因子（ｐＭＣＭ１）、ユビキチン（ｐＵＢＩ４）、一本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ｐＲＡＤ２）、ミトコンドリア内膜の主要ＡＤＰ／ＡＴＰ担体のプロモーター（ｐＰＥＴ９）（ＷＯ２００８／１２８７０１）、及びギ酸脱水素酵素（ＦＭＤ）プロモーターが挙げられる。
好適なプロモーターの更なる例としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ１）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＧＡＰ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅメタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、並びにマルターゼ遺伝子プロモーター（ＭＡＬ）が挙げられる。
本明細書で使用される「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかを指す。「核酸配列」又は「ポリヌクレオチド配列」又は単に「ポリヌクレオチド」は、５’末端から３’末端へ読まれるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖のポリマーを指す。これには、発現カセット、自己複製プラスミド、ＤＮＡ又はＲＮＡの感染性ポリマー、並びに非機能的ＤＮＡ又はＲＮＡが含まれる。
本明細書で使用される「目的のタンパク質（ＰＯＩ）」という用語は、宿主細胞において組換え技術によって産生されるポリペプチド又はタンパク質を指す。より具体的には、タンパク質は、宿主細胞において天然に存在しないポリペプチド（すなわち、異種タンパク質）であってもよく、又はその他宿主細胞に天然であってもよいが（すなわち、宿主細胞と相同タンパク質）、例えば、ＰＯＩをコードする核酸配列を含む自己複製ベクターによる形質転換若しくはトランスフェクションによって、又は宿主細胞のゲノムに１コピー以上のＰＯＩをコードする核酸配列を組換え技術による組み込みによって、又はＰＯＩをコードする遺伝子（例えば、プロモーター配列）の発現を制御する１つ以上の調節配列の組換え改変によって産生される。場合によっては、本明細書で使用される用語ＰＯＩは、組換え発現されたタンパク質によって媒介される宿主細胞による任意の代謝産物も指す。
親ヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較して、バリアント、ホモログ、又はオーソログの「配列同一性」という用語は、２つ以上の配列の同一性の程度を示す。２つ以上のアミノ酸配列は、ある程度まで、最大１００％まで、対応する位置に同じ又は保存されたアミノ酸残基を有してもよい。２つ以上のヌクレオチド配列は、対応する位置に、ある程度まで、最大１００％まで、同一の又は保存された塩基対を有してもよい。
配列類似性検索は、過剰な（例えば、少なくとも５０％）配列同一性を有するホモログを同定するための効果的かつ信頼性の高い戦略である。頻繁に使用される配列類似性検索ツールは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＨＭＭＥＲである。
配列類似性検索は、過剰な類似性、及び共通の祖先を反映する統計的に有意な類似性を検出することによって、かかる相同タンパク質又は遺伝子を特定することができる。ホモログは、オーソログを包含し得、オーソログは、異なる生物における同じタンパク質（例えば、異なる生物又は種におけるかかるタンパク質のバリアント）として本明細書で理解される。
本明細書に記載のアミノ酸配列、ホモログ、及びオーソログに関して、「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、（配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに）最大のパーセント配列同一性を達成した後、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。
本明細書に記載の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、以下の例示的なパラメータを用いてＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムバージョンＢＬＡＳＴＰ２．８．１を使用して決定される：プログラム：ｂｌａｓｔｐ、ワードサイズ：６、期待値：１０、ヒットリストのサイズ：１００、ギャップコスト：１１．１、マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２、フィルターストリング：Ｆ、組成調節：条件付き組成スコアマトリックス調整。
ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅウェブサーバ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）は、その全長に沿った２つのアミノ酸配列のペアワイズタンパク質配列整列の場合、デフォルト設定（マトリックス：ＥＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン：１０、ギャップエクステンド：０．５、エンドギャップペナルティ：ｆａｌｓｅ、エンドギャップオープン：１０、エンドギャップエクステンド：０．５）で使用した。ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ整列アルゴリズムを使用して、２つの入力配列の最適な整列（ギャップを含む）を見つけ、最適な大域的配列整列をファイルに書き込む。
例えば、プロモーター又は遺伝子のヌクレオチド配列に関する「パーセント（％）同一性」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、（配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに）最大のパーセント配列同一性を達成した後、ＤＮＡ配列中のヌクレオチドと同一である候補ＤＮＡ配列中のヌクレオチドの割合として定義される。パーセントヌクレオチド配列同一性を決定する目的のための整列は、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野内にある様々な方式で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。
本明細書に記載の目的のために（特に示されない限り）、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、以下の例示的なパラメータを用いてＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムバージョンＢＬＡＳＴＮ２．８．１を使用して決定される：プログラム：ｂｌａｓｔｎ、ワードサイズ：１１、期待閾値：１０、ヒットリストのサイズ：１００、ギャップコスト：５．２、マッチ／ミスマッチスコア：２、－３、フィルターストリング：低複雑度領域、ルックアップテーブルのみをマーク。
ＰＯＩに関して本明細書で使用される場合、「単離された」又は「単離」という用語は、「精製された」又は「実質的に純粋な」形態で存在するように、それが天然に会合するであろう環境（特に、細胞培養上清）から十分に分離されているかかる化合物を指す。しかし、「単離された」は、必ずしも、他の化合物若しくは材料との人工的若しくは合成的な混合物、又は例えば、不完全な精製のために存在し得るが基本的な活性を妨げない不純物の存在を除外することを意味しない。単離された化合物は、その調製物を産生するために更に製剤化されてもよく、実用的な目的のために更に単離されてもよい。例えば、ＰＯＩは、診断又は療法で使用される場合、薬学的に許容される担体又は賦形剤と混合され得る。
本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、少なくとも５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％の化合物（例えば、ＰＯＩ）を含む調製物を指す。純度は、化合物に適した方法（例えば、クロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。本明細書に記載の単離された精製されたＰＯＩは、細胞培養上清を精製して、不純物を減らすことによって得ることができる。
組換えポリペプチド又はタンパク質産物を得るための単離及び精製方法としては、溶解度の差を利用する方法（例えば、塩析及び溶媒沈殿）、分子量の差を利用する方法（例えば、限外濾過及びゲル電気泳動）、電荷の差を利用する方法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）、特異的親和性を利用する方法（例えば、親和性クロマトグラフィー）、疎水性の差を利用する方法（例えば、逆相高性液体クロマトグラフィー）、及び等電点の差を利用する方法（例えば、等電点電気泳動）が使用され得る。
以下の標準的な方法が好ましい：細胞（デブリ）分離及び精密濾過又は接線流濾過（ＴＦＦ）又は遠心分離による洗浄、沈殿又は熱処理によるＰＯＩ精製、酵素消化によるＰＯＩ活性化、イオン交換（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除（ＳＥＣ）又はＨＰＬＣクロマトグラフィー、ＰＯＩ沈殿、濃縮及び洗浄（例えば、限外濾過ステップ）。
高度に精製された産物は、本質的に夾雑タンパク質を含まず、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は更に少なくとも９８％、最大１００％の純度を有する。精製された産物は、細胞培養上清の精製によって、又はその他細胞デブリから得ることができる。
単離され精製されたＰＯＩは、ウエスタンブロット、ＨＰＬＣ、活性アッセイ、又はＥＬＩＳＡなどの従来の方法によって同定することができる。
本明細書で使用される「組換え」という用語は、遺伝子操作によって調製されているか、又は遺伝子操作の結果であることを意味するものとする。「組換え細胞」又は「組換え宿主細胞」は、本明細書では、当該細胞にとって天然ではない核酸配列を含むように遺伝子操作又は改変されている細胞又は宿主細胞として理解される。組換え宿主は、１つ以上のヌクレオチド又はヌクレオチド配列を欠失及び／又は不活性化するように操作されてもよく、特に、宿主にとって外来のヌクレオチド配列を用いて、組換え核酸配列を含有する発現ベクター又はクローニングベクターを具体的に含んでもよい。組換えタンパク質は、宿主においてそれぞれの組換え核酸を発現させることによって産生される。本明細書で使用されるＰＯＩに関して「組換え」という用語は、ＰＯＩを発現するように形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞から単離されたＰＯＩなどの組換え手段によって調製、発現、作製、又は単離されるＰＯＩを含む。本発明によれば、当該技術分野内の従来の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術を用いることができる。かかる技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，（１９８２）を参照されたい。
特定の組換え宿主細胞は、「操作された」宿主細胞であり、遺伝子操作を使用して、すなわち、ヒト介入によって操作された宿主細胞として理解される。宿主細胞が所与の遺伝子又はそれぞれのタンパク質を発現、共発現、又は過剰発現するように操作されている場合、宿主細胞は、操作前の同じ条件下での宿主細胞と比較して、又は当該遺伝子又はタンパク質が発現、共発現、又は過剰発現されるように操作されていない宿主細胞と比較して、それぞれ、かかる遺伝子及びタンパク質を発現する能力を有するように操作される。本明細書に記載されるように、目的のタンパク質（ＰＯＩ）の収率は、ＴＩＦをコードするポリヌクレオチドが共発現若しくは過剰発現されることなく、又はＴＩＦをコードするポリヌクレオチドを共発現若しくは過剰発現するように操作されることなく、同じ培養条件下で同じＰＯＩを発現する同じ細胞と比較した場合、本明細書に記載のＴＩＦを共発現若しくは過剰発現することによって増加させることができる。
驚くべきことに、ｅＩＦ３のサブユニットではなく、ｍＲＮＰの一部であるＴＩＦの過剰発現が、いくつかの組換えＰＯＩの産生及び分泌の増加につながっていたことが判明した。
本明細書に記載される特定の例によれば、ＴＩＦの過剰発現は、操作された細胞の翻訳能力を増強し、また、より高いレベルのＰＯＩ転写物及び内因性転写物と相関した。
更に驚くべきことに、異なる培養モード（スクリーニング、フェッドバッチ、及び連続培養）における、ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４Ｅ、ＰＡＢ１、及びＲＬＩ１などの単一のＴＩＦ、並びにそれらの組み合わせの過剰発現によって、ＰＯＩ産生の収率が増加した。
前述の説明は、以下の実施例を参照することにより完全に理解されるであろう。しかしながら、かかる実施例は、本発明の１つ以上の実施形態を実施する方法の単なる代表であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：翻訳因子（ＴＩＦ）過剰発現株の構築
ａ）宿主株及び発現ベクター：
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株であるＣＢＳ７４３５又はＣＢＳ２６１２（ＣＢＳ－ＫＮＡＷ Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をバックグラウンド株として使用した。翻訳因子の過剰発現の影響を評価するために、異なる分泌モデルタンパク質をレポーターとして使用した。この目的のために、ＣＢＳ２６１２＿ＰＧ１－３＿ｖＨＨ＃４（ＷＯ２０２０／１４４３１３Ａ１に記載）を発現に使用した。更なる宿主株を生成するために、ＷＯ２０２０／１４４３１３Ａ１に記載されているように、ＰＧ１－３＿ＨＳＡの発現カセットをＣＢＳ２６１２に形質転換し、ＰＧ１－３＿ｖＨＨ発現カセットをＣＢＳ７４３５に形質転換した。ＭｕｔＳ ＰＡＯＸ１－ｖＨＨ（Ｚａｖｅｃ ｅｔ ａｌ．２０２０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１７（５）：１３９４－１４０５）を使用して、メタノール条件における効果を評価した。
ｂ）ＴＩＦ過剰発現ベクターの生成
標的を、それぞれの発現カセットの宿主株への相同組換えによって過剰発現させた。このためのプラスミドは、２つの異なるクローニング戦略を使用することによって生成された。表２及び７に、選択された標的翻訳因子を示す。
ｐＰｕｚｚｌｅベースの発現によるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ翻訳因子の過剰発現株の構築と選択
ＷＯ２００８／１２８７０１Ａ２に記載されているｐＰｕｚｚｌｅ＿ＺｅｏＲベクター骨格の誘導体であるｐＰＭ２ａＫ２１プラスミドを使用した。これは、（天然のＡＯＸ１ターミネーター遺伝子座への組み込みのための）ＡＯＸターミネーター配列、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点（ｐＵＣ１９）、大腸菌及び酵母における選択のための抗生物質耐性カセットＭＣＳ（カナマイシン及びＧ４１８に対する耐性を付与するｋａｎＭＸ）、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の発現カセット（ＧＡＰプロモーター、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＹＣ１転写ターミネーターからなる）からなる。選択した過剰発現遺伝子を、表８に示されるプライマーを使用して、ＰＣＲ（Ｑ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって、開始コドンから終止コドンまで増幅した。配列を、２つの制限酵素ＳｂｆＩ及びＳｆｉＩを用いて、ｐＰＭ２ａ発現ベクターのＭＣＳにクローニングした。遺伝子配列を、サンガー配列決定によって検証した。
ＧｏｌｄｅｎＰｉＣＳシステムによるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ翻訳因子過剰発現株の構築と選択
過剰発現のために選択された遺伝子を、ＰＣＲ（Ｑ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって開始コドンから終止コドンまで増幅するか、又は２つからいくつかの断片に分割した。ＧｏｌｄｅｎＰｉＣＳシステム（Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１７．ＢＭＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌ．１１，１２３，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２９１８－０１７－０４９２－３）は、いくつかのコード配列にサイレント変異を導入する必要がある。これは、表３及び９のプライマーを使用することによって、１つのコード配列からいくつかの断片を増幅することによって行われた。代替的に、ｇＢｌｏｃｋｓを得た（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩＤＴ）。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＣＢＳ２６１２由来のゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ鋳型として使用した。得られた断片は、表３及び９のプライマーで増幅した後、制限酵素ＢｓａＩを使用することによって、ＧｏｌｄｅｎＰｉＣＳシステムのＢＢ１に導入した。ＧｏｌｄｅｎＰｉＣＳシステムは、骨格ＢＢ１、ＢＢ２、及びＢＢ３で構成されている。それぞれのコード配列を担持する組み立てられたＢＢ１を、ＢＢ２中のプロモーター及びターミネーター領域と組み合わせ、次いで、更に処理して、Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒら（２０１７）に記載されているように、必要なＢＢ３組み込みプラスミドを作製した。ＢＢ２又はＢＢ３骨格中の発現カセットを組み立てるために使用した全てのプロモーター及びターミネーターは、Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒら（２０１７）に記載されている。使用したＢＢ３ｒＮは、５’－ＲＧＩ１ゲノム組み込み領域と、ノーセオスリシンに対する選択のためのＮａｔＭＸ選択マーカーカセットと、を含む。全てのプラスミドは、大腸菌の複製起点（ｐＵＣ１９）を含む。
ｃ）ＴＩＦ過剰発現形質転換体の生成
プラスミドを、ＡｓｃＩ制限酵素を使用して線状化した後、Ｇａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３（Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８（２）：１９１－２０８）に記載されている標準的な形質転換プロトコルを使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにエレクトロポレーションした。５００μｇ／ｍＬ－１のＧ４１８又は１００μｇ／ｍＬ－１のノーセオスリシンを含有するＹＰＤプレート（１リットル当たり：１０ｇの酵母抽出物、２０ｇのペプトン、２０ｇのグルコース、２０ｇの寒天）上で、陽性形質転換体の選択を行った。コロニーＰＣＲを使用して、形質転換されたプラスミドが正しい遺伝子座に存在することを確認した。これには、ゲノムＤＮＡは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓコロニーを０．０４ＭのＮａＯＨ中で調理することによって得られ、これを適切なプライマーを用いてＰＣＲに直接適用した。
ｄ）過剰発現標的の遺伝子コピー数（ＧＣＮ）の決定
発現強度は、しばしば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムに組み込まれた発現カセットの数と相関する。したがって、過剰発現標的の各々の遺伝子コピー数を決定した。ゲノムＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１１２０）を使用して単離した。次いで、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して、遺伝子コピー数を決定した。これには、Ｂｌｕｅ Ｓ’Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲキット（Ｂｉｏｚｙｍ）を使用した。Ｂｌｕｅ Ｓ’Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲマスターミックスを、プライマー及び試料と混合し、リアルタイムＰＣＲサイクラー（Ｒｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ，Ｑｉａｇｅｎ）でリアルタイム分析に適用した。表１に、使用したプライマーのリストを示す。全ての試料を三重に分析した。データ分析には、Ｒｏｔｏｒ Ｇｅｎｅソフトウェアを使用した。標準物質（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）として、ＡＣＴ１遺伝子を使用した。ＧＣＮは、単一の過剰発現構築物にはＰＧＡＰプライマー（実施例４を参照）、及び組み合わせた過剰発現構築物にはＴＩＦ２プライマーを使用することによって決定した（実施例５を参照）。表１０及び表１２に、それぞれ結果を示す。選択された過剰発現標的がＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの内因性遺伝子であるため、２のＧＣＮは、１つの追加の遺伝子コピーの組み込みに成功したことを示し、遺伝子の１つが元の遺伝子であり、２つ目が過剰発現カセットである。
Figure 2023543604000001
実施例２：組換えタンパク質産生に対するＴＩＦ過剰発現の影響の分析
組換えタンパク質の分泌に対する翻訳因子の過剰発現の影響を判定するために、操作された過剰発現株を、ＧＯＩについてｐＧプロモーターを使用する場合のグルコース制限条件（Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ １２，５）又はメタノール利用経路に由来するプロモーターの場合のメタノール誘導（Ｇａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ １４：１９６）などの好適なスクリーニング条件で培養した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主株の操作は、実施例１に記載されるように、ｐＰｕｚｚｌｅベース又はＧｏｌｄｅｎＰｉＣＳ ＢＢ３ｒＮベースのいずれかのＴＩＦ発現ベクターをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムに組み込むことによって行った。次いで、操作されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を小規模で培養し（スクリーニング手順）、それによって、フェッドバッチ培養をシミュレートした。上清に分泌された組換えタンパク質を定量化し、異なる操作された株の力価及び収率を、親宿主株と比較した。
培地：合成スクリーニング培地ＡＳＭｖ６（１リットル当たり）：６．３０ｇ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．８ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．４９ ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２．６４ｇ ＫＣｌ、０．０５３５ｇ ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、２２．０ｇ クエン酸一水和物、１４７０μＬ ＰＴＭ０微量塩ストック溶液、２０ｍＬ ＮＨ４ＯＨ（２５％）、４ｍＬ ビオチン（０．１ｇ／Ｌ－１）。固体のＫＯＨを添加して、ｐＨを６．４～６．６に設定した。
ＰＴＭ０微量塩ストック溶液（１リットル当たり）：５．０ｍｌ Ｈ２ＳＯ４（９５～９８％）、６５．０ｇ ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２０ｇ ＺｎＣｌ２、６．００ｇ ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、３．３６ｇ ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、０．８２ｇ ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、０．２０ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、０．０８ｇ ＮａＩ、０．０２ｇ Ｈ３ＢＯ３
ａ）ｐＧプロモーターの制御下でのＧＯＩ発現を有する操作されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株のスクリーニング
モデルタンパク質分泌のスクリーニングのために、ＰＣＲで検証された遺伝子を正しい遺伝子座に組み込んだ単一コロニーを、２ｍＬの液体ＹＰＧ培地（１リットル当たり）：２０ｇ ペプトン、１０ｇ 酵母抽出物、１２．６ｇ １００％グリセリン、ｐＨ７．４～７．６）（５０μｇ／ｍＬ－１ ゼオシン及び５００μｇ／ｍＬ－１ Ｇ４１８又は１００μｇ／ｍＬ－１ ノーセオスリシン（該当する場合）を含有）に接種した。加えて、比較のために、宿主株を、各プレートで四重に培養した。この前培養物を、２８０ｒｐｍ、２４ＤＷＰで、２５℃で約２４時間増殖させた。次いで、前培養物を使用して、２ｍＬの合成スクリーニング培地ＡＳＭｖ６を、８の開始ＯＤ６００で接種した。培地は、炭素源として５０ｇ／Ｌ－１の多糖類（ＥｎＰｕｍｐ２００多糖類、Ｅｎｐｒｅｓｓｏ）及び０．４％のグルコース遊離酵素（試薬Ａ、Ｅｎｐｒｅｓｓｏ）を含有した。培養条件は、前培養条件と同様であった。４８時間後、１ｍＬの細胞懸濁液を、予め秤量した１．５ｍＬの遠心分離チューブに移し、１６，０００ｇで、室温で５分間遠心分離した。上清を、新しいバイアルに慎重に移し、更に使用するまで－２０℃で保存した。ペレットを含有する遠心分離チューブを再度秤量して、湿細胞重量（ＷＣＷ）を決定した。上清中の組換え分泌タンパク質の定量化は、以下に記載されるように、マイクロ流体キャピラリー電気泳動によって行った。
ｂ）メタノール誘導性プロモーターの制御下でＧＯＩを発現する操作されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株のスクリーニング
２ｍＬのＹＰＤ培地（１リットル当たり）：２０ｇ ペプトン、１０ｇ 酵母抽出物、２２ｇ Ｄ（＋）－グルコース一水和物、ｐＨ７．４～７．６）（５０μｇ／ｍＬ－１ Ｚｅｏｃｉｎ及び５００μｇ／ｍＬ－１Ｇ４１８又は１００μｇ／ｍＬ－１ノーセオスリシン（該当する場合）を含有）に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓクローンの単一コロニーを接種し、２８０ｒｐｍ、２４ＤＷＰで、２５℃で一晩増殖させた。次いで、前培養物を使用して、２ｍＬの合成スクリーニング培地ＡＳＭｖ６を、８の開始ＯＤ６００で接種した。培地は、炭素源として２５ｇ／Ｌ－１多糖類（ＥｎＰｕｍｐ２００多糖類，Ｅｎｐｒｅｓｓｏ）及び０．３５％のグルコース遊離酵素（試薬Ａ、Ｅｎｐｒｅｓｓｏ）を含有した。これらの培養物を、２８０ｒｐｍ、２４ＤＷＰで、２５℃で４８時間インキュベートした。最初の３時間後、細胞に、１０μＬ（０．５％）の純メタノールを供給した。次いで、１９時間、２７時間、及び４３時間の培養時間後、細胞に、２０μＬ（１％）の純メタノールを再度供給した。４８時間後、１ｍＬの細胞懸濁液を、予め秤量した１．５ｍＬの遠心分離チューブに移し、１６，０００ｇで、室温で５分間遠心分離した。上清を、新しいバイアルに慎重に移し、更に使用するまで－２０℃で保存した。ペレットを含有する遠心分離チューブを再度秤量して、湿細胞重量（ＷＣＷ）を決定した。上清中の組換え分泌タンパク質の定量化は、以下に記載されるように、マイクロ流体キャピラリー電気泳動によって行った。
ｃ）マイクロ流体キャピラリー電気泳動（ｍＣＥ）による分泌された組換えタンパク質の定量化
「ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ／ＧＸＩＩシステム」（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を、培養上清中の分泌タンパク質の力価の定量分析に使用した。消耗品「タンパク質発現Ｌａｂ Ｃｈｉｐ」（７６０４９９、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）及び「タンパク質発現試薬キット」（ＣＬＳ９６０００８、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用した。チップ及び試料の調製は、製造元の推奨に従って行った。手順の簡単な説明を以下に示す。
チップの調製：試薬が室温に達した後、５２０μＬ及び２８０μＬのタンパク質発現ゲルマトリックスをスピンフィルターに移した。２０μＬのタンパク質発現色素溶液を、５２０μＬのゲルマトリックスを含有するスピンフィルターに添加した。色素を含有するスピンフィルターを逆さで短時間ボルテックスした後、両方のスピンフィルターを、９３００ｇで１０分間遠心分離した。チップを洗浄するために、１２０μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を全ての活性チップウェルに添加し、チップを器具洗浄プログラムに供した。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水で更に２回すすぐステップの後、残りの流体を完全に吸引し、適量の濾過したゲルマトリックス溶液並びにタンパク質発現低分子量マーカー溶液を適切なチップウェルに添加した。
試料及びラダーの調製：試料調製のために、６μＬの試料を、９６マイクロタイタープレート中の２１μＬの試料緩衝液と混合した。試料を、１００℃で５分間変性させ、１，２００ｇで２分間遠心分離した。その後、１０５μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を添加した。試料溶液を、ピペッティングによって短時間混合し、測定前に、１，２００ｇで２分間再度遠心分離した。ラダーを調製するために、１２μＬのタンパク質発現ラダーを、ＰＣＲチューブで、１００℃で５分間変性させた。その後、１２０μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を添加し、ラダー溶液を短時間ボルテックスした後、小型微量遠心機でチューブを１５秒間回転させ、測定を開始した。
定量化は、製造元によって提供されたＬａｂＣｈｉｐソフトウェアを用いて、ＢＳＡ標準と比較することによって行った。
実施例３：Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける組換えタンパク質の分泌に対する翻訳開始因子３（ｅＩＦ３）サブユニットの過剰発現の影響。
まず、翻訳開始因子３（ｅＩＦ３）のサブユニットを過剰発現させた。この因子は、酵母では６つのサブユニットからなり、それらを、それ自体で、及び異なる組み合わせで過剰発現された。過剰発現の場合、実施例１に記載されるように、ｅＩＦ３サブユニットをＧｏｌｄｅｎＰｉＣＳベクターにクローニングし、宿主株ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ＃４に形質転換した。次いで、実施例２に記載されるように、操作された株をスクリーニングし、収率を宿主株と比較した。
ａ）ｅＩＦ３の単一サブユニットの過剰発現。
表２に示されるｅＩＦ３のサブユニットを、表３に示されるプライマーを使用して増幅し、実施例１に記載されるように、宿主株ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ＃４にクローニングした。ｅＩＦ３ａについては、過剰発現ベクターが得られなかった。
Figure 2023543604000002
Figure 2023543604000003
Figure 2023543604000004
表４は、ｅＩＦ３サブユニットの単一過剰発現の結果を示す。各標的遺伝子を、異なるプロモーターで過剰発現させ、約１０倍の過剰発現を達成した。これらのおおよその過剰発現強度は、ＯＥ欄に示され、実施例４ａに記載されるように計算した。スクリーニングの結果は、宿主株と比較したｖＨＨ収率の倍率変化として示される。表４の結果は、単一のｅＩＦ３サブユニットの過剰発現が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける組換えタンパク質の分泌に影響を及ぼさないことを明確に示す（操作された株と対照との間のｖＨＨ収率の倍率変化は全て、約１であり、つまり、操作された株と親対照株との間のタンパク質産生に差がないことを意味する）。Ｒｏｏｂｏｌら（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０２０，５９：９８－１０５）は、哺乳類ＨＥＫ細胞及びＣＨＯ細胞株におけるｅＩＦ３ｉ及びｅＩＦ３ｖサブユニットの一過的かつ安定した過剰発現の際の増加した増殖速度及び増加したタンパク質合成能力を報告していたため、これは予想外であった。
Figure 2023543604000005
ａ）ｅＩＦ３サブユニットの過剰発現の組み合わせ。
次に、表５に記載される、過剰発現のためにｅＩＦ３サブユニットの異なる組み合わせを選択した。クローニング及び形質転換は、実施例１に記載されるように行われ、得られた株は、実施例２に記載されるようにスクリーニングされた。実施例４ａに記載されるように、プロモーターを選択して、細胞内の転写物濃度比を天然株と同じに保った。ＯＥ欄は、計算された過剰発現強度を示す。
Figure 2023543604000006
Figure 2023543604000007
表６は、宿主株と比較したｖＨＨ収率の倍率変化を示す。スクリーニングでは、ｅＩＦ３のいくつかのサブユニットを過剰発現する組み合わせでさえ、ｖＨＨ産生を増加させなかった。実施例３ａのように、倍率変化は全て約１であり、ｅＩＦ３サブユニットが単独で又は組み合わせで過剰発現された場合、組換えタンパク質の分泌に有意な増加はないことを意味する。
実施例４：組換えタンパク質の産生に対するｍＲＮＰの単一ＴＩＦの過剰発現の影響
翻訳開始に作用し、ｍＲＮＰ及び閉ループ複合体の一部である翻訳因子：ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｇ、ＰＡＢ１、及びＲＬＩ１（表７）を、過剰発現の目的のために選択し、過剰発現ベクターを、表８及び９に示されるプライマーを使用して、実施例１ｂのように構築した。ＣＢＳ２６１２＿ＰＧ１－３＿ｖＨＨ＃４（ＷＯ２０２０／１４４３１３Ａ１に記載）を、親宿主株として使用し、実施例１に記載の単一のＴＩＦ過剰発現ベクターで形質転換した。
Figure 2023543604000008
ａ）単一ＯＥベクターの生成及びＯＥ強度の決定
Figure 2023543604000009
Figure 2023543604000010
Figure 2023543604000011
Figure 2023543604000012
記載されている全ての単一ＴＩＦ過剰発現について、強力で構成的なｐＧＡＰプロモーターを使用し、ＴＩＦ発現カセットを、５’－ＲＧＩ１遺伝子座又はＡＯＸ１転写ターミネーターのいずれかに組み込んだ。Ｒｅｂｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｊ．９（４）：５１１－２５に記載されている遺伝子発現データに基づいて、選択されたプロモーターによる予想される過剰発現の程度を計算した。表１０の「ＯＥ」欄に、親株と比較した推定された発現強度の増加を示す。
表１０はまた、選択されたクローンの測定されたＧＣＮ及びスクリーニング手順の結果を示す。表１０に示される全てのクローンは、それぞれのＴＩＦ遺伝子は、追加の１コピーを含んでいた（ＧＣＮ＝２と示されている）。
ｂ）レポーターとしてのｐＧ１－３の制御下のｖＨＨを使用した、組換えタンパク質の産生に対する単一ＴＩＦ過剰発現の影響
実施例２ａに記載されるように株を培養し、培養の４８時間後、ｍＣＥによって、分泌されたｖＨＨの力価を決定した（実施例２ｃ）。各クローンについて、力価（ｍｇ ｖＨＨ／Ｌ－１）、ＷＣＷ（ｇ／Ｌ－１）、及びバイオマス特異的産物の収率（ｍｇ ｖＨＨ／ｇ－１ＷＣＷ）を計算し、次いで、１つの因子を過剰発現する全てのクローン、並びに親株の複製について平均した。力価の倍率変化（ＦＣ）及び収率を、同じ２４－ＤＷＰで培養した親宿主株の平均と比較して決定した。
Figure 2023543604000013
予想外に、ｍＲＮＰの選択されたＴＩＦの単一の過剰発現でさえ、明らかに組換えタンパク質の産生及び分泌を増加させた（表１０）。最も高い改善は、ＴＩＦ４６３２（ｅＩＦ４Ｇ）及びＰＡＢ１過剰発現で見られ、両方とも、組換えタンパク質の分泌を約２．０倍増加させた。
実施例５：組換えタンパク質の分泌に対するｍＲＮＰのＴＩＦの組み合わせの過剰発現の影響。
複合体におけるいくつかの翻訳開始因子の過剰発現の影響があるかどうかを分析するために、実施例４で試験した翻訳因子の異なる組み合わせを選択し、組換えタンパク質の産生へのそれらの影響について比較した。この組み合わせ操作は、実施例１ｂに記載されるように、ＧｏｌｄｅｎＰｉＣＳツールボックスを使用して行った。得られたプラスミドを、宿主株ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ＃４に形質転換した。次いで、操作されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、実施例２に記載されるように小規模で培養した。上清に分泌されたタンパク質を、実施例２ｃのように測定し、異なる操作された株の力価及び収率を、親宿主と比較した。
ａ）翻訳開始因子の過剰発現のために生成された組み合わせ。
表１１に記載される異なる組み合わせの過剰発現を試験した。記載のプロモーターを選択して、各遺伝子を約１０倍過剰発現させた。これは、細胞における異なる標的遺伝子の転写物の濃度比のバランスをとるために行われた。しかしながら、表１０に見られるように、依然として組換えタンパク質の産生の増加につながる、より強い又はより弱い過剰発現も選択することができる。
Figure 2023543604000014
ａ）組換えタンパク質の分泌に対する組み合わせた過剰発現の影響。
実施例２に記載されるように、操作された株をスクリーニングし、データを分析した。
Figure 2023543604000015
表１２は、組換えタンパク質の産生に対する異なるＴＩＦの組み合わせの過剰発現の影響を示す。表１２に示される全てのクローンは、過剰発現カセットが一度だけ挿入されていることを検証した。つまり、それらが２のＧＣＮを示すことを意味する。ｖＨＨ収率の倍率変化が、宿主株ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ＃４と比較して示されている。全ての組み合わせは、親と比較して、組換えｖＨＨの分泌の増加を示したが、Ｃ３とＣ１３の組み合わせが、最大の効果を明らかに示す。Ｃ３ａ及びＣ３ｂは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノム配列における異なる注釈に応じて長さが異なる、異なるバージョンのＴＩＦ２を含有する。ＴＩＦ２バージョンとは独立して、両方の組み合わせは、ｖＨＨ収率を２倍超増加させた。Ｃ３ｂは、ｖＨＨ収率を２．５倍増加させた。
ｂ）異なるバックグラウンド株における組換えタンパク質の分泌に対するＣ３ｂ過剰発現の比較。
異なるバックグラウンド株の影響を比較するために、実施例１ａに記載されるように、ＰＧ１－３＿ｖＨＨ発現カセットをＣＢＳ７４３５に形質転換した。次いで、構築物Ｃ３ｂを、実施例１ｃに記載されるように、得られたＣＢＳ７４３５ ＰＧ１－３ｖＨＨ産生宿主株のゲノムに組み込んだ。次いで、実施例２ａに記載されるように、Ｃ３ｂ過剰発現の影響をスクリーニングし、分泌されたｖＨＨ力価を、実施例２ｃに記載されるように決定した。比較のために、ＣＢＳ７４３５ ＰＧ１－３ｖＨＨ Ｃ３ｂの９つの異なるクローンをスクリーニングし、宿主株ＣＢＳ７４３５ ＰＧ１－３ｖＨＨの生物学的四重複製物と比較した。
Figure 2023543604000016
表１３は、宿主株ＣＢＳ７４３５ ＰＧ１－３ｖＨＨにおけるＣ３ｂ過剰発現のｖＨＨ収率の倍率変化を示す。これらの結果は、バックグラウンド株の選択とは無関係に、組換えｖＨＨの分泌に対する強い有益な効果が、Ｃ３ｂ過剰発現を有する全ての株で見られることを示す。
ｃ）メタノール誘導性組換えタンパク質の分泌に対するＴＩＦ過剰発現の影響。
メタノール誘導性組換えタンパク質の分泌に対するＣ３ｂ過剰発現の影響を決定するために、ｐＡＯＸ１－ｖＨＨ発現カセット（Ｚａｖｅｃ ｅｔ ａｌ．２０２０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１７（５）：１３９４－１４０５）を含むＣＢＳ７４３５ ＭｕｔＳを、Ｃ３ｂ過剰発現の宿主株として使用した。ＰＡＯＸ１誘導のためのメタノールショットを使用して、実施例２ｂに記載されるように、株をスクリーニングし、実施例２ｃに記載されるように、タンパク質の力価を決定した。
１０種類のＣ３ｂ過剰発現クローンを用いたスクリーニングは、親株と比較して、平均１．３９±０．０５倍のｖＨＨ収率の増加を示した。これは、適用された炭素源又はプロモーター系に関係なく、組換えタンパク質の分泌の増加がＴＩＦ過剰発現で達成され得ることを確認する。
実施例６：細胞プロセスに対する翻訳開始因子の過剰発現の影響の特性評価。
どの細胞プロセスが、組換えタンパク質分泌において観察された差異に加えて、翻訳開始因子の過剰発現に影響を受けたかを評価するために、２つの異なるアプローチに従った：一方では、遺伝子転写レベルを測定して、転写物の存在量に対する潜在的な影響を決定した（実施例６ａ）。他方では、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてピューロマイシンベースの方法を設定した後、細胞翻訳活性を直接測定した（実施例６ｂ）。
ａ）転写レベルの比較測定のためのスパイクイン法。
まず、実施例２に記載されるように、２４－ＤＷＰスクリーニング手順で３０時間、株を培養した。これは、採取時点で約０．０２５／時－１の増殖速度に相当する。１ｍＬの培養物を採取し、４℃で、１６，０００ｇで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを更に使用するまで－８０℃で保存した。
一般的なハウスキーピング遺伝子の転写物濃度の潜在的な変化も測定することができるように、ペレットをＰＢＳに溶解し、ＷＣＷに従って再びペレット化して、各試料中に同じ量の酵母質量を有するようにする。次いで、各ペレットを、１ｍＬのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ懸濁液（単一の振盪フラスコ培養物由来のアリコート）でスパイクした。得られた混合Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ－Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅペレットをＲＮＡ単離に使用した。
ＲＮＡ単離のために、１ｍＬのＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５００μＬの酸性洗浄ガラスビーズを細胞に添加し、次いで、ＦａｓｔＰｒｅｐ－２４（ｍｐｂｉｏ）中で、速度５．５ｍ／秒で４０秒間破壊した。その後、２００μＬのクロロホルムを添加した。その後、試料を激しく振盪し、次いで、室温で５～１０分間静置した。相分離を促進するために、１６，０００ｇで、４℃で１０分間遠心分離した後、ＲＮＡを含む上部の無色水相を新しいチューブに移し、５００μＬのイソプロパノールを添加してＲＮＡを沈殿させた。１０分間のインキュベーション後、試料を、１６，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。ＲＮＡペレットを、７０％エタノールで１回洗浄し、風乾し、ＲＮＡｓｅ不含水に再懸濁した。
残留ＤＮＡを除去するために、ＲＮＡ試料を、製造元のマニュアルに従って、ＤＮＡ－ｆｒｅｅ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した。その後、ＲＮＡの品質、純度、及び濃度を、ゲル電気泳動及びＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した分光光度分析によって分析した。
ｃＤＮＡの合成は、製造元のマニュアルに従って、Ｂｉｏｚｙｍ ｃＤＮＡ合成キットを用いて行った。簡潔には、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、ＲＮａｓｅ阻害剤、及び合成緩衝液を含むマスターミックスに、１μｇの全ＲＮＡを添加した。プライミングとして、オリゴｄ（Ｔ）２３ＶＮ（ＮＥＢ）を使用した。反応混合物のインキュベーションを、５５℃で４５分間行った。その後、反応混合物を９９℃で５分間インキュベートすることによって、酵素の不活性化を達成した。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＣＴ１の定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）については、ＴＤＨ３及びｖＨＨに特異的なプライマーを使用した（表１４を参照）。正規化は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＣＴ１の発現レベルと比較することによって行った（表１４を参照）。操作された株の転写レベルを、宿主株の転写レベルと比較した。両方のセットのＡＣＴ１プライマーを試験し、所望の生物のｃＤＮＡにのみ結合することを検証した。ｑＰＣＲの場合、１μＬのｃＤＮＡ、水、及びプライマーを、Ｂｌｕｅ Ｓ’Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲマスターミックス（Ｂｉｏｚｙｍ）と混合し、リアルタイムＰＣＲサイクラー（Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ，Ｑｉａｇｅｎ）で分析した。全ての試料を、技術的に三重で測定した。比較定量化（ＱＣ）法を用いて、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅソフトウェアでデータ解析を行った。
Figure 2023543604000017
ｂ）転写物の存在量に対するＴＩＦ過剰発現の影響
表１５に示されるＴＩＦ過剰発現株及び宿主株ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ＃４を、実施例２ａに記載されるように、２４－ＤＷＰスクリーニング手順で３０時間培養した。２つの内因性遺伝子及び組換えＧＯＩの転写物の存在量を、実施例６ａに記載されるように決定した。
表１５は、転写レベル測定の得られた結果を示す。測定値は、ｖＨＨの転写レベルがＴＩＦ過剰発現によって強く影響されることを示す。実施例４及び５では、既により高い組換えタンパク質の分泌を示した過剰発現の組み合わせについて、特に高い値が見られる。最も高い転写レベルは、Ｃ３ｂを過剰発現する株で見出された。この過剰発現は、ｖＨＨの転写レベルを５．５倍増加させた。驚くべきことに、ＴＤＨ３の発現は、全ての過剰発現株においても増加するようであるが、ＡＣＴ１の発現は、特に組み合わせた過剰発現株において増加するようである。ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴ１及びＴＤＨ３の両方の転写レベルの増加は、細胞内の全ての転写物の増加を示す。これらの結果は、ＴＩＦの過剰発現が、細胞のｍＲＮＡレベルに正の効果及び／又は安定化効果を有し、これが、生産性の増加につながる１つの要因であり得ることを示す。
Figure 2023543604000018
ｃ）全体的な翻訳活性の測定。
Ｏ－プロパルギル標識されたピューロマイシンによる全体的な翻訳活性の測定は、酵母細胞における使用のための手順を最適化した後、Ｎａｇｅｌｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ １３，ｅ１７００４９２と同様に行った。簡潔には、実施例６ａと同じ培養からの細胞を、９０μＬの「インキュベーション溶液」中、０．４の最終ＯＤ６００で、９６ウェルマイクロタイタープレートにピペットで移した。「インキュベーション溶液」は、１０％のＤＭＳＯ及びＰＢＳ（２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、２．７ｍＭ ｇ ＫＣｌ、８ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解された０．６ｍＭのＯ－プロパルギルピューロマイシン（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＵ－９３１－０５）及び１．５ｇ／Ｌ－１のイミプラミンを含むＡＳＭｖ６培地（実施例２を参照）で構成された。懸濁液を、シェーカーで、２５℃で２時間インキュベートし、氷冷エッペンドルフチューブ中に移し、４℃で５分間、１６，０００ｇで遠心分離した。ペレット化した細胞を１２０μＬのＰＢＳで洗浄した後、再びペレット化した細胞を、１ｍＬの氷冷７０％エタノールで固定した。これらの固定試料を、１日～２週間、４℃で保存した。
クリック化学反応には、固定試料を、１６，０００ｇ、４℃で５分間遠心分離することによって採取した。ペレットを、９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、１００μＬの「クリックケミストリー緩衝液」（１１５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ＝８．５、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）で洗浄した。次いで、試料を「クリックケミストリーミックス」（１０１ｍＭ クリックイットクリックケミストリー緩衝液、１．９ｍＭ ＣｕＳＯ４、１．９ｍｇ／ｍＬ アスコルビン酸、２０μＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８アジド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中で、室温で３０分間インキュベートした。その後、細胞を、前と同様に回収し、１５０μＬのＰＢＳ中で洗浄し、１５０μＬの新鮮なＰＢＳに溶解した。得られた蛍光強度を測定するために、細胞を、４８８ｎｍの励起波長及び５２５ｎｍの発光波長で、フローサイトメトリーによって分析した。各試料について、４０，０００事象を測定した。データ分析には、各試料の幾何平均を使用し、ブランク（Ｏ－プロパルギルピューロマイシン添加なしで処理した細胞）を各々差し引いた。
ｄ）ＴＩＦの過剰発現が全体的な細胞翻訳に及ぼす影響
表１６は、得られた蛍光値の倍率変化、したがって、宿主株ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ＃４と比較した、全体の翻訳活性の平均倍率変化を示す。翻訳活性の測定には、表１５に示されるのと同じクローンを使用した。翻訳活性を、実施例６ｃに記載されるように決定した。
Figure 2023543604000019
表１６は、単一の翻訳開始因子の過剰発現が、各細胞における翻訳活性の向上をもたらしたことを明確に示す。選択されたＴＩＦの組み合わせの過剰発現は、翻訳活性の更に強い増加を示す。これはまた、これらの株において観察された組換えタンパク質の分泌の増加によっても反映される（実施例４及び５）。宿主株よりも２．３倍高い最高の翻訳活性は、Ｃ３ｂを過剰発現させることによって達成され得る。これらの結果は、選択された翻訳開始因子又はそれらの組み合わせの過剰発現が、組換えタンパク質などの特定のタンパク質の翻訳だけでなく、全体的な細胞の翻訳活性を増加させることを示す。驚くべきことに、ｖＨＨ収率の改善（表１０及び１２）と相対翻訳活性との間に明確な相関があり（相関係数Ｒ２＝０．８４）、これは、翻訳開始中のｍＲＮＰの形成が、組換えタンパク質の産生の律速段階であることを示す。
実施例７：フェッドバッチ培養における翻訳因子の過剰発現の影響。
スクリーニングでなされた観察を更に検証するために、選択された過剰発現の標的を用いて、標準的な産生プロセスと同様のフェッドバッチ培養を行った。
ａ）フェッドバッチ培養におけるｖＨＨ産生に対するＴＩＦ過剰発現の影響：
この実施例では、Ｃ３ｂ又はＲＬＩ１のいずれかを過剰発現するＣＢＳ２６１２＿ＰＧ１－３＿ｖＨＨ＃４を培養のために選択した。これらの株は、スクリーニングにおいて組換えタンパク質の分泌に強力で有益な効果を示した（実施例４、５、及び９）。フェッドバッチ培養の場合、同じ培地を使用しながら、異なる供給プロファイルを適用し、それぞれのサンプリングポイントで以下の計算された増殖速度が得られた（表１７）。培地組成は、以下に見出すことができる。
Figure 2023543604000020
培地：
ＰＴＭ０微量塩ストック溶液（１リットル当たり）：
５．０ｍＬ Ｈ２ＳＯ４（９５～９８％）、６５．０ｇ ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２０ｇ ＺｎＣｌ２、６．００ｇ ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、３．０ｇ ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、０．５ｇ ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、０．２０ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、０．０８ｇ ＮａＩ、０．０２ｇ Ｈ３ＢＯ３
グリセロールバッチ培地（１リットル当たりの含有量）：
２ｇ クエン酸一水和物（Ｃ６Ｈ８Ｏ７＊Ｈ２Ｏ）、４５ｇ グリセロール、１２．６ｇ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．５ｇ ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．９ｇ ＫＣｌ、０．０２２ｇ ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、１３．２ｍＬ ビオチンストック溶液（０．１ｇ／Ｌ－１）、及び４．６ｍＬ ＰＴＭ０微量塩ストック溶液。（濃）ＨＣｌを添加し、ｐＨを５に設定した。
ブドウ糖供給培地（１リットル当たりの含有量）：
４９５ｇ グルコース一水和物、４．６ｇ ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、８．４ｇ ＫＣｌ、０．２８ｇ ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、２３．６ｍＬ ビオチンストック溶液（０．１ｇ／Ｌ－１）、及び１０．１ｍＬ ＰＴＭ０微量塩ストック溶液。
ｂ）０．０４／時－１に達する最小増殖速度で線形供給によるフェッドバッチ培養。
フェッドバッチ培養は、宿主株ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ＃４及び対応する過剰発現株ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ Ｃ３ｂ＃１３、ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ Ｃ３ｂ＃１６、及びＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ ＰＧＡＰＲＬＩ１＃４を用いて、１Ｌのベンチトップバイオリアクター（ＳＲ０７００ＯＤＬＳ；Ｇｅｒｍａｎｙ；リアクター実行＃Ａ～Ｂ）又は１．８Ｌのベンチトップバイオリアクター（ＳＲ１５０００ＯＤＬＳ；Ｄａｓｇｉｐ，Ｇｅｒｍａｎｙ；リアクター実行＃Ｃ）で行った。前培養には、１Ｌ振盪フラスコ中に５０μｇ／ｍＬ－１のゼオシン及び１００μｇ／ｍＬ－１のノーセオスリシン（該当する場合）を含有する１００ｍＬのＹＰＧ培地に、１．０ｍＬのクライオストックを接種し、１８０ｒｐｍ、２５℃で約２４時間インキュベートした。バッチ培養物を、０．５Ｌの作業体積で操作し、１．５の開始ＯＤ６００で接種した。グリセロールバッチの培地組成は、上に示されている。プロセス全体を通して、温度を３０℃で制御し、スターラー速度（４００～１２００ｒｐｍ）及び空気流量（９．５～３０ｓＬ／時－１）の自動調整によって、ＤＯを３０％に維持し、１２．５％ ＮＨ４ＯＨの自動添加によって、ｐＨが５．０になるように調節した。バッチ終了（ＢＥ）を示す、ＤＯの突然のスパイク後、急速な初期増殖速度（μ）、続いて、漸減するμの拡大相をもたらす直線的に増加するグルコース供給（上で詳述した培地組成）を適用した。供給の直線的な増加を、次の式に従うように設定した：Ｆ［ｍＬ／時－１］＝０．１４３１＊ｔ＋２．０４９９。得られた結果を確認するために、同じフェッドバッチ培養を２回行った。
酵母乾燥質量（ＹＤＭ）及び分泌された組換えタンパク質を、プロセス全体を通して様々な時点で分析した（表１８に示される）。ＹＤＭ分析の場合、１ｍＬの培養ブロスを、予め乾燥させ（１０５℃で少なくとも２４時間）かつ予め秤量した２ｍＬ遠心分離チューブに移した。１６，０００ｇ、４℃で５分間遠心分離した後、上清を、新しいバイアルに慎重に移し、更に使用するまで－２０℃で保存した。細胞ペレットを、０．１ＭのＨＣｌで２回洗浄し、１０５℃で少なくとも２４時間乾燥させた後、重量を再度測定した。
上清を、実施例２ｃに記載されるように、マイクロ流体キャピラリー電気泳動（ＧＸＩＩ，Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）によって分析した。
Figure 2023543604000021
表１８には、ＴＩＦの過剰発現は、フェッドバッチ培養におけるバイオマス濃度に影響を及ぼさなかったことが見られる。対照的に、産物の力価及び収率は、フェッドバッチの全過程で、親対照と比較して増加した。特に、後の時点（Ｆ２０及びＦ４６）では、産物の力価及び収率に対するＲＬＩ１の過剰発現の明確な正の効果が見られ、発酵の終了時に親宿主株を２．２倍上回った。Ｃ３ｂの過剰発現により、産物の収量及び力価が、平均で２．７倍増加した。
ｃ）０．０２／時－１の最小増殖速度による一定供給での培養。
別のフェッドバッチ培養を、実施例７ａ及び７ｂに記載されるように、宿主株ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ＃４、並びに対応する過剰発現株ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ Ｃ３＃１６及びＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ ＰＧＡＰＲＬＩ１＃４を用いて行った。しかしながら、この培養では、異なるフィードプロファイルが選択され、実施例７ｂに記載の線形増分のグルコース供給の代わりに、一定のグルコース供給が適用された。一定の供給は、全フェッドバッチ培養中、４ｍＬ／時－１で保持された。これにより、当初の増殖速度が急速に低下し、増殖が遅くなり、培養期間がより長くなった。サンプリングは、上記のように行った。ＹＤＭ及び上清に加えて、転写レベルの決定のために、１ｍＬの細胞懸濁液を回収し、ペレット化し、－８０℃で凍結した。
Figure 2023543604000022
表１９はまた、この供給戦略では、ＲＬＩ１及びＣ３ｂの過剰発現の両方が、同じ量のＹＤＭを産生しながら、宿主株と比較して、産物の力価及び収率の増加をもたらしたことを示す。実施例７ｂのように、Ｃ３ｂの過剰発現は、組換えタンパク質の産生に非常に有益であり、平均で４倍高い産物の収率及び力価に達することを証明する。
まとめると、これは、単一のＴＩＦ又はそれらの組み合わせの過剰発現が、適用された供給戦略とは無関係に、組換えタンパク質の産生に対して強力な正の効果を有することを示す。
ｄ）フェッドバッチにおける転写レベルに対する翻訳因子の過剰発現の影響。
実施例６ｂに見られる転写物存在量に対するＴＩＦの過剰発現の影響が、フェッドバッチで細胞を培養する場合も持続するかどうかを評価するために、ＰｐＡＣＴ１、ｖＨＨ、及びＴＤＨ３の転写レベルを、フェッドバッチ実行Ｃ０４１－Ｃ０４４（実施例７ｂ）からの試料において分析した。手順は、実施例６ａに記載されるように行った。上記のように、転写レベルを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＣＴ１に対して正規化した。加えて、次いで、それらを、対応するサンプリングポイントで、宿主株、リアクターＣ０４１に対して正規化した。表２０は、ＰｐＡＣＴ１、ｖＨＨ、及びＴＤＨ３の相対転写レベルの倍率変化を示す。
Figure 2023543604000023
ＲＬＩ１の過剰発現は、分析した３つの遺伝子の転写レベルのわずかな増加をもたらしたが（後の時点Ｆ３１及びＦ５４での２つの天然Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子の平均が１．２）、Ｃ３ｂの過剰発現は、ＰｐＡＣＴ１で最大１．５、ｖＨＨで最大２．９倍、ＴＤＨ３で最大２．２倍の増加をもたらした（表２０）。Ｃ３ｂにおけるｖＨＨ転写レベルの増加は、同じフェッドバッチ培養で見られる力価の増加と相関するようである（表１９）。ハウスキーピング遺伝子ＡＣＴ１及びＴＤＨ３の両方の転写レベルの上昇は、培養様式に関係なく、細胞における全ての転写物の上昇を示す。
ｅ）メタノール誘導性組換えタンパク質の分泌を用いたフェッドバッチ培養。
Ｚａｖｅｃら（２０２０）に記載されているように、ＭｕｔＳ株についての標準的なプロセス及び培地に従って、メタノール誘導を必要とするクローンのフェッドバッチ培養を行った。前培養には、１Ｌの振盪フラスコ中に５０μｇ／ｍＬ－１のゼオシン及び１００μｇ／ｍＬ－１のノーセオスリシン（該当する場合）を含有する１００ｍＬのＹＰＧ培地に、１．０ｍＬのクライオストックを接種し、１８０ｒｐｍ、２５℃で約２４時間インキュベートした。
バッチ培養物を、０．４ＬのＢＳＭ培地（Ｍｅｌｌｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）の作業体積で操作し、２．５の開始ＯＤ６００で接種した。温度を制御し、２５℃に維持し、スターラー速度（２００～１２５０ｒｐｍ）、空気流量（９．５～５０ｓＬ／時－１）、及び酸素補給の自動調整によって、ＤＯを２０％に維持した。ｐＨは、２５％のＮＨ４ＯＨの自動添加によって、５．０になるように調節した。バッチ終了（ＢＥ）を示すＤＯの突然のスパイク後、グリセロール供給、続いて、グリセロール／メタノール共供給を開始した。直線的に増加する（ｙ＝０．２２５ｘ＋１．９５）グリセロール供給によるグリセロール供給（６０％（ｗ／ｗ）＋１２ｍＬ／Ｌ ＰＴＭ１）は、８時間持続した。これに続いて、６０％のグリセロール及び１００％のメタノールの１８時間の共供給を行った。共供給では、６０％のグリセロール供給は直線的に減少し（ｙ＝３．７５－０．１１１ｘ）、メタノール供給は直線的に増加していた（ｙ＝０．０２８ｘ＋０．６）。最後に、メタノールのみの供給相で、直線的に増加するメタノール供給（ｙ＝０．０２８ｘ＋１．１０）を７２時間適用した。実施例７ｂに記載されるように、サンプリング、ＹＤＭ決定、及びタンパク質定量化を行った。
Figure 2023543604000024
表２１はまた、メタノールベースの組換えタンパク質の産生戦略を使用する場合、Ｃ３ｂの過剰発現が、宿主株と比較して、産物の力価及び収率の増加をもたらし、したがって、明確な有益な効果を示すことを示す。増加は約１．７倍であり、純メタノール供給の開始直後に始まり、培養の終了まで続く。
実施例８：ケモスタット培養におけるＴＩＦ過剰発現の影響。
連続培養は、バイオ医薬品生産の分野でより多くの注目を集めているため、組換えタンパク質の分泌に対するＣ３ｂの過剰発現の影響も、ケモスタット培養において固定した増殖速度で分析された。この方法は、産生プロセス中の継続的な培養の可能性を提供し、増殖速度の厳密な制御を可能にする。
ａ）ケモスタットにおける固定増殖速度での組換えタンパク質分泌に対するＣ３ｂの過剰発現の影響。
培地：
ケモスタットの微量元素溶液（１リットル当たり）：
１５ｇ ＥＤＴＡ、４．５ｇ ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１．０３ｇ ＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ、０．３ ＣｏＣｌｏ２＊６Ｈ２Ｏ、０．３ｇ ＣｕＳＯ４、０．４ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、４．５ｇ ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、３ｇ ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇ Ｈ３ＢＯ３、０．１ ＫＩ。
ＥＤＴＡ及びＺｎＳＯ４＊７Ｈ２ＯをＨ２Ｏに溶解し、ｐＨを、固体ＮａＯＨで６に設定し、次いで、他の塩を１つずつ溶解した。次いで、ｐＨを、固体ＮａＯＨ及び濃ＨＣｌで４に設定した。
（１０ｇ／Ｌ－１のＹＤＭを達成するための）ケモスタット用グルコース培地（１リットル当たり）：
２２ｇ グルコース一水和物、１０ｇ （ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｇ ＫＨ２ＰＯ４、１ ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ＰＥ６１００、３ｍＬ ケモスタット用微量元素溶液、１．６ｍＬ ビオチンストック溶液（０．１ｇ／Ｌ－１）。
ｐＨは、固体ＫＯＨを添加することによって５に設定した。
ケモスタットについては、株ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ＃４及び対応するＣ３ｂ過剰発現株ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ Ｃ３ｂ＃１３を、１．８Ｌベンチトップバイオリアクター（ＳＲ１５００ＯＤＬＳ；Ｄａｓｇｉｐ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で二重に培養した。前培養には、１Ｌ振盪フラスコ中に５０μｇ／ｍＬ－１のゼオシン及び１００μｇ／ｍＬ－１のノーセオスリシン（該当する場合）を含有する１００ｍＬのＹＰＧ培地に、１．０ｍＬのクライオストックを接種し、１８０ｒｐｍ、２５℃で約２４時間インキュベートした。バッチ培養物を、０．６Ｌの作業体積で操作し、０．４の開始ＯＤ６００で接種した。上記の培地を、バッチ培養及び連続培養に使用した。バッチ培養では、撹拌速度（４００～１２００ｒｐｍ）及び空気流量（９．５～３０ｓＬ／時－１）の自動調整によって、ＤＯを３０％に維持した。連続培養では、スターラー速度を７００ｒｐｍに設定し、空気流量を３０ｓＬ／時－１に設定した。プロセス全体を通して、温度を３０℃に、１２．５％ＮＨ４ＯＨを自動添加することによってｐＨを５に維持した。ＹＤＭがバッチ培養及び連続培養で約１０ｇ／Ｌの濃度に達するように、培地を設計した。バッチ終了を示すＤＯの突然のスパイク後、連続培養を開始した。μ＝Ｄ＝０．０１５／時－１の場合、選択された供給速度は９ｍＬ／時－１であり、培養体積は０．６Ｌで一定に維持された。これは、レベルセンサーを使用し、体積が０．６Ｌを超えるときはいつでも、リアクターから追加の培養物を自動的にポンピングすることによって行われた。試料は、３３３時間後に採取され、リアクター体積の５体積分の変化に対応し、定常状態の条件として受け入れられた。
酵母乾燥質量（ＹＤＭ）及び分泌された組換えタンパク質を、実施例７ｂに記載されるように、選択されたサンプリングポイントで分析した。また、実施例６ａに記載されるように、転写レベルの分析のための試料を採取した。加えて、細胞ペレットを回収した。これは、１ｍＬの培養物を１６，０００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを－２０℃で保管することによって作製された。これらを、実施例８ｃに記載の総タンパク質の測定に使用した。
表２２は、上記のケモスタットの結果を示す。この固定した緩やかな増殖速度で、かつ定常状態の条件であっても、力価は、ＴＩＦの過剰発現時に１．７５倍高く、一方、バイオマス濃度（ＹＤＭ）は、対照宿主株と同様であった。Ｃ３ｂの過剰発現株で、宿主株と比較して、比生産性が１．５～１．８倍増加した。これにより、連続培養においても、フェッドバッチ培養物（実施例７）で見られる組換えタンパク質の産生に対するＴＩＦの過剰発現の正の効果が達成され得ることが検証される。
Figure 2023543604000025
ｂ）連続培養における転写レベルに対する翻訳因子の過剰発現の影響。
Ｃ３ｂ過剰発現の影響を更に解明するために、実施例６ａに記載される手順を用いて、転写レベルを測定した。上記のように、転写レベルを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＣＴ１に対して正規化した。加えて、それらを宿主株（リアクターＣ０５０）に対して正規化して、ＰｐＡＣＴ１及びｖＨＨの相対転写レベルの倍率変化を得た。
Ｃ３ｂの過剰発現により、ｖＨＨの相対転写レベルが１．４０±０．０４倍高くなった。ＰｐＡＣＴ１は、１．４６±０．０４の同様の倍率変化を示した。これは、スクリーニング及びフェッドバッチ培養で得られた結果を確認し、転写レベルが、適用された培養モードとは無関係に、選択された翻訳開始因子を過剰発現する細胞において一般的に増加することを示す。
ｃ）総タンパク質濃度の決定。
この増加した転写レベルの効果が細胞の総タンパク質の濃度に対して影響を及ぼすかどうかを判定するために、ビウレット法を使用した。
簡潔には、実施例８ａに記載の回収された細胞ペレットを、水で３回洗浄した。次いで、それらを水で希釈して、各チューブに８ｍｇ／ｍＬ－１のＹＤＭを添加した。試料当たり２４０μＬの細胞懸濁液を、１２５μＬの３Ｍ ＮａＯＨと混合し、９９℃で５分間沸騰させた。冷却後、１２５μＬの２．５％ ＣｕＳＯ４を添加し、試料を、１６，０００ｇで５分間遠心分離した。得られた上清のうち、チューブ当たり２００μＬを、５５５ｎｍの波長で、Ｔｅｃａｎ Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）で測定するために使用した。検量線については、ウシ血清アルブミン（アルブミン画分Ｖ、分子生物学用≧９８％）（１３、１２、１０、８、６、４、２、１、及び０ｇ／Ｌ－１）の希釈液を、試料と同じように処理した。
宿主株を有する２つのリアクターＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ＃４は、乾燥質量１ｍｇ当たり０．２４±０．００ｍｇのタンパク質を産生し、一方、過剰発現株を有する２つのリアクターＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ｖＨＨ Ｃ３ｂ＃１３は、乾燥質量１ｍｇ当たり０．２９±０．００ｍｇのタンパク質を産生した。過剰発現株で観察された総タンパク質の１．２倍の増加は、転写レベルの増加が細胞内の総タンパク質の増加をもたらすことを示す。しかしながら、組換えＰＯＩに対する影響は、全体的な細胞タンパク質（１．２倍）よりも有意に強い（１．８倍）ことから、組換えタンパク質の産生中、ｍＲＮＰのＴＩＦが制限され、それらの過剰発現がより高い生産性をもたらすという我々の驚くべき発見が再び強調される。
実施例９：他のモデルタンパク質の分泌に対するＴＩＦの過剰発現の影響。
ＴＩＦの過剰発現の影響を確認するために、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を別のモデルタンパク質として選択した。
ａ）ＨＳＡ産生株の生成
実施例１ａに記載されるように、ＰＧ１－３＿ＨＳＡの発現カセットをＣＢＳ２６１２に形質転換して、ＨＳＡ産生株を生成した。得られた株を、実施例２ａに記載されるようにスクリーニングし、実施例２ｃに記載されるように、マイクロ流体キャピラリー電気泳動（ｍＣＥ）によって測定した。ＴＩＦ過剰発現の宿主として、異なる生産性を有する２つのＨＳＡ産生クローンを選択した。ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ＨＳＡ＃１５を平均的な産生宿主株として選択し、一方、ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ＨＳＡ＃１０を高産生宿主株として選択した。これら２つの株を４重で再スクリーニングした。その結果を表２３に見ることができる。加えて、生産性の違いを説明するために、これらの株のＧＣＮを決定した。ＧＣＮの決定は、実施例１ｄに従って行った。
Figure 2023543604000026
表２３に見られる力価は、４重複製物の平均を示す。高生産者は、平均的な生産者の５倍以上を生産し、これはより高いＧＣＮとうまく相関する。両方の株を、選択された翻訳開始因子構築物の過剰発現のために使用した。
ｂ）ＴＩＦ過剰発現株の生成及びＨＳＡ分泌に対するそれらの影響
組み合わせた過剰発現Ｃ３ｂを選択し、実施例９ａに記載の２つのＨＳＡ産生株で試験した。クローニングは、実施例１に記載されるように行い、続いて、実施例２ａ及び２ｃに記載されるように、スクリーニング及び力価決定を行った。
Figure 2023543604000027
表２４は、スクリーニング結果を示す。２つの産生宿主株間の絶対ＨＳＡ力価の差にもかかわらず、ＴＩＦ Ｃ３ｂの過剰発現の影響はほぼ同じであり、１．４倍の増加を有する。これは、ＴＩＦの過剰発現が、高産生株及び平均的な産生株において組換えタンパク質の分泌を増加させる効果を有することを示す。加えて、表２４の結果は、上記の実施例で検証されたように、Ｃ３ｂの過剰発現が、ｖＨＨだけでなく、ＨＳＡについても、組換えタンパク質の分泌を増加させることを示し、したがって、組換えタンパク質の産生に対するＴＩＦ過剰発現の一般的な正の影響の概念を強化する。
ｃ）ＴＩＦを過剰発現するＨＳＡ産生株のフェッドバッチ培養
次に、ＨＳＡ宿主株及び対応するＣ３ｂ過剰発現株を、フェッドバッチ培養に使用した。フェドバッチ培養は、実施例７に記載されるように行った。この場合、直線的に増加するグルコース供給のために、以下の方程式を使用した：Ｆ［ｍＬ／時－１］＝０．０１＊ｔ＋２。これにより、サンプリングポイントＦ９で０．０２９／時－１のおおよその増殖速度が得られた。
Figure 2023543604000028
他のモデルタンパク質及び株に関しては、表２５に見ることができるように、Ｃ３ｂ過剰発現は、両方の産生宿主株における組換えＨＳＡの分泌の収率を増加させた。特に、分泌されたタンパク質の増加は、高産生株ＣＢＳ２６１２ ＰＧ１－３ＨＳＡ＃１０ではるかに顕著であり、１．９倍の増加を有する。これにより、ｍＲＮＰのＴＩＦは、組換えタンパク質の発現により高い能力を有する細胞（例えば、より高いＧＣＮ及び／又は高い発現強度を有するプロモーターによるより高い転写）に対してより強いボトルネックをもたらし、かかる細胞が、ＴＩＦの過剰発現によって更に利益を得るという結論に至る。

Claims (21)

  1. 目的の遺伝子（ＧＯＩ）を発現する組換え真核生物宿主細胞であって、遺伝子改変によって、メッセンジャーリボ核タンパク質（ｍＲＮＰ）の翻訳開始因子（ＴＩＦ遺伝子）をコードする２つ以上の遺伝子の発現を、１つ以上の前記遺伝子改変の前の前記宿主細胞と比較して増加させるように操作され、前記ＴＩＦ遺伝子が、少なくともｅＩＦ４Ａをコードする遺伝子と、ｅＩＦ４Ｇをコードする遺伝子と、を含み、前記ＴＩＦ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現が、前記ＧＯＩの発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの転写制御下にある、組換え真核生物宿主細胞。
  2. ａ）前記ｅＩＦ４Ａが、配列番号１２～３３のうちのいずれか１つに対する、少なくとも６０％の配列同一性を含み、
    ｂ）前記ｅＩＦ４Ｇが、配列番号３４～４４のうちのいずれか１つに対する、少なくとも６０％の配列同一性を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
  3. 前記ＴＩＦ遺伝子が、
    ａ）ｅＩＦ４Ｅをコードする遺伝子、
    ｂ）ＰＡＢ１をコードする遺伝子、又は
    ｃ）ＲＬＩ１をコードする遺伝子のうちのいずれか１つ以上を更に含む、請求項１又は２に記載の宿主細胞。
  4. ａ）前記ｅＩＦ４Ｅが、配列番号１～１１のうちのいずれか１つに対する、少なくとも６０％の配列同一性を含み、
    ｂ）前記ＰＡＢ１が、配列番号４５～５５のうちのいずれか１つに対する、少なくとも６０％の配列同一性を含み、
    ｃ）前記ＲＬＩ１が、配列番号５６～６５のうちのいずれか１つに対する、少なくとも６０％の配列同一性を含む、請求項３に記載の宿主細胞。
  5. 前記ＴＩＦ遺伝子のうちの１つ以上が、前記宿主細胞において前記ＴＩＦ遺伝子を発現するように最適化される、請求項１～４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  6. 少なくとも
    ａ）ｅＩＦ４Ａ及びｅＩＦ４Ｇをコードする遺伝子、
    ｂ）ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、及びｅＩＦ４Ｅをコードする遺伝子、
    ｃ）ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４Ｅ、及びＰＡＢ１をコードする遺伝子、
    ｄ）ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、及びＰＡＢ１をコードする遺伝子を過剰発現する、請求項１～５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  7. 前記宿主細胞が、ＲＬＩ１をコードする遺伝子を過剰発現するように更に操作される、請求項６に記載の宿主細胞。
  8. 前記遺伝子改変が、（ｉ）１つ以上のポリヌクレオチド若しくはその一部、又は（ｉｉ）発現制御配列、好ましくはプロモーター、リボソーム結合部位、転写若しくは翻訳の開始及び終止配列、エンハンサー及びアクチベーター配列からなる群から選択される発現制御配列のノックイン、置換、破壊、欠失、若しくはノックアウトを含み、好ましくは、１つ以上の前記遺伝子改変が、前記宿主細胞ゲノムへの異種ポリヌクレオチド又は発現カセットの組み込みを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  9. 前記遺伝子改変が、前記ＴＩＦ遺伝子の数若しくは前記ＴＩＦ遺伝子を含む発現カセットの数の増加、及び／又は前記ＴＩＦ遺伝子の機能獲得変化を含み、その結果、前記ＴＩＦ遺伝子のレベル若しくは活性が増加する、請求項１～８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  10. 前記ＴＩＦ遺伝子が、前記宿主細胞に対して内因性又は異種である、請求項１～９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  11. ａ）１つ以上の異種ＴＩＦ発現カセットにおいて前記ＴＩＦ遺伝子のうちの１つ以上を発現する発現系であって、各々が、前記ＴＩＦ遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の発現制御配列を含む、発現系と、
    ｂ）ＧＯＩ及び前記ＧＯＩに作動可能に連結された１つ以上の発現制御配列を含むＧＯＩ発現カセットと、を含み、
    ａ）の前記発現系及びｂ）の前記発現カセットが、細胞培養で前記宿主細胞を培養する場合、それぞれの前記ＴＩＦ遺伝子及びＧＯＩを発現するように操作される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  12. ａ）前記ＴＩＦ発現カセットのうちの少なくとも１つが、構成的プロモーターを含み、かつ／又は
    ｂ）前記ＧＯＩ発現カセットが、誘導性、脱抑制性、若しくはそうでなければ調節性プロモーター、又は構成的プロモーターを含む、請求項１１に記載の宿主細胞。
  13. ａ）ピキア属、ハンセヌラ属、コマガタエラ属、サッカロミセス属、クリベロマイセス属、カンジダ属、オガタエア属、ヤロウイア属、及びゲオトリクム属からなる群から選択される属の酵母細胞（好ましくは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、若しくはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、
    ｂ）糸状菌の細胞（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ若しくはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、
    ｃ）非ヒト霊長類、ヒト、げっ歯類、若しくはウシ細胞（例えば、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫＪｕｒｋａｔ、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ（ＣＯＳ１及びＣＯＳ７など）、ＱＣ１－３、ＨＥＫ－２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢＩ、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解性若しくはハイブリドーマ細胞株）、
    ｄ）昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｍｉｍｉｃ（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（ＢＴ１－ＴＮ－５Ｂ１－４）、若しくはＢＴ１－Ｅａ８８細胞）、
    ｅ）藻類細胞（例えば、アンフォラ属、クサリケイソウ属、ドナリエラ属、クロレラ属、クラミドモナス属、藍藻類（シアノバクテリア）、ナンノクロロプシス属、スピルリナ属、若しくはオクロモナス属）、又は
    ｆ）植物細胞（例えば、単子葉植物（好ましくは、トウモロコシ、イネ、コムギ、若しくはエノコログサ）由来の細胞、又は双子葉植物（好ましくは、キャッサバ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、アルファルファ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ、若しくはシロイヌナズナ）由来の細胞）、である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  14. １つ以上の異種発現カセット内に、前記ＴＩＦ遺伝子のうちの１つ以上及び目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含むように、宿主細胞を遺伝子操作することを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の宿主細胞を産生するための方法。
  15. 目的の遺伝子（ＧＯＩ）によってコードされる目的のタンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法であって、前記産生が、前記ＰＯＩを産生するための条件下で、請求項１４に記載の宿主細胞を培養することによって行われる、方法。
  16. 前記宿主細胞が、前記ＴＩＦ遺伝子のうちの１つ以上を共発現させ、かつ前記ＰＯＩを前記宿主細胞培養物に分泌させるための条件下で、培養培地で培養され、前記ＰＯＩが、前記宿主細胞培養物から回収される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記宿主細胞が、前記ＰＯＩに対する前記宿主細胞の比生産性（μｇ／ｇ酵母乾燥質量（ＹＤＭ）／時間及び／又は前記ＰＯＩに対する体積生産性（μｇ／Ｌ／時間）を増加させるレベルで、前記ＴＩＦ遺伝子のうちの１つ以上を共発現するように改変される、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 前記ＰＯＩが、治療薬又は診断薬、好ましくは、抗原結合タンパク質、治療用タンパク質、酵素、ペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物－タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン抗原、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、プロセス酵素、及び代謝酵素からなる群から選択されるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 目的のタンパク質（ＰＯＩ）の収率を増加させる方法であって、前記ＰＯＩをコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）を発現する宿主細胞によって産生される場合、細胞培養でメッセンジャーリボ核タンパク質（ｍＲＮＰ）の１つ以上のＴＩＦ遺伝子を発現する１つ以上の異種発現カセットを共発現することによって増加させる、方法。
  20. メッセンジャーリボ核タンパク質（ｍＲＮＰ）の１つ以上のＴＩＦ遺伝子を発現する１つ以上の異種発現カセットを含む、ポリペプチド発現系。
  21. 目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）と、前記ＧＯＩに作動可能に連結された１つ以上の発現制御配列と、を含む、発現カセットを含む、請求項２０に記載の発現システム。
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