ES2539378T3 - Células huésped y procedimientos de uso - Google Patents

Abstract

Una cepa de Pichia modificada genéticamente, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica: (i) PEP4, PRB1 y YMP1, (ii) PEP4, PRB1 y YMP2, o (iii) PEP4, PRB1 y YMP3 es modificada genéticamente para producir deficiencia de proteasa de al menos tres de las siguientes enzimas y/o tipo de enzima: aminopeptidasa de tipo Arg / Ala, aspartil proteasa, serín proteasa, serín proteasa secretada, serín proteasa Prb 1, aminopeptidasa de tipo Leu, en comparación con la cepa de tipo salvaje.

Description

Células huésped y procedimientos de uso

Campo de la invención

La invención pertenece al campo de la ingeniería biomédica. Más particularmente, la presente invención se refiere a cepas de Pichia modificadas genéticamente y a procedimientos de producción de polipéptidos en las mismas.

Antecedentes de la invención

Los polipéptidos y proteínas terapéuticas se pueden expresar en diversas células huésped, incluyendo células bacterianas, células de E. coli, células fúngicas o de levaduras, células de un microorganismo, células de insectos y células de mamíferos. Huéspedes fúngicos, tales como la levadura metiltrófica Pichia pastoris tiene claras ventajas para la expresión de proteínas terapéuticas, por ejemplo, no secreta grandes cantidades de proteínas endógenas, que tiene un fuerte promotor inducible, se puede cultivar en medios químicos definidos y puede producir altos títulos de proteínas recombinantes (Cregg y col., Mol. Biotech. 16:23-52 (2000)). Las levaduras y hongos filamentosos se han usado con éxito para la producción de proteínas recombinantes, tanto intracelulares y secretadas (Cereghino, J.

L. y J. M. Cregg 2000 FEMS Microbiology Reviews 24(1): 45 66; Harkki, A., et al. 1989 Bio-Technology 7(6): 596; Berka, R. M., et al. 1992 Abstr. Papers Amer. Chem.Soc.203: 121-BIOT; Svetina, M., et al. 2000 J. Biotechnol. 76(23): 245-251. Pichia es una célula huésped notable para la expresión de seroalbúmina humana recombinante (HSA). Sin embargo, la expresión de otros polipéptidos terapéuticos, incluidos polipéptidos fusionados genéticamente con HSA se enfrenta a los obstáculos técnicos de la proteólisis no deseada y la glicosilación.

Las proteínas heterólogas expresadas en P. pastoris pueden contener azúcares de manosa adicionales resultantes en glicanos "ricos en manosa", así como grupos manosilfosfato que imparten una carga negativa en una proteína. Las proteínas glicosiladas, ya sea con glicanos ricos en manosa o mananos cargados tienen un alto riesgo de provocar una respuesta inmunitaria en los seres humanos (Takeuchi, Trends in Glycosci. & Glycotech., 9:S29-S35 (1997); Rosenfeld y col., J. Biol. Chem., 249:2319-2321 (1974)). Por consiguiente, sería deseable producir péptidos terapéuticos, polipéptidos y/o proteínas en sistemas de huéspedes fúngicas, de forma que patrón de glicosilación sea idéntico o al menos similar al de los seres humanos.

El documento US6051419 describe genes que influyen sobre la actividad proteolítica de Pichia. Daly et al. describen la expresión de proteínas heterólogas en Pichia (Journal of Molecular Recognition Vol. 18, No. 2, 119-138). Los documentos WO9914347 1 y US6153424 describieron cepas de Pichia deficientes en proteasa. Gleeson et al describen la generación de cepas deficientes en proteasa y su uso en la expresión de proteínas heterólogas (Methods in Molecular Biology Vol. 103, 81-94).

Por lo tanto, existe la necesidad de cepas de levadura, en particular cepas de Pichia que sean capaces de producir péptidos heterólogos, polipéptidos y/o proteínas con proteolisis reducida y/o glicosilación en comparación con las cepas de tipo salvaje. Además, existe la necesidad de identificar genes dentro de cepas de levadura, en particular cepas de Pichia, responsables de producir las proteínas implicadas en vías proteolíticas y de glicosilación.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una cepa de Pichia modificada genéticamente en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica:

(i)

PEP4, PRB1 e YMP1,

(ii)

PEP4, PRB1 e YMP2, o

(iii) PEP4, PRB1 e YMP3

es modificada genéticamente para producir deficiencia de proteasa de al menos tres de las siguientes enzimas y/o tipo de enzima: aminopeptidasa de tipo Arg / Ala, aspartil proteasa, serín proteasa, serín proteasa secretada, serín proteasa Prb 1, aminopeptidasa de tipo Leu, en comparación con la cepa de tipo salvaje.

Se describen cepas de Pichia modificadas genéticamente en las que al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto génico funcional y/o al menos un ácido nucleico necesario para la expresión de al menos un producto génico en dicha cepa de Pichia está modificada genéticamente, en el que dicho producto génico es responsable de la proteólisis y/o la glicosilación en dicha cepa de Pichia modificada genéticamente.

También se proporcionan en el presente documento procedimientos de producción de al menos un polipéptido heterólogo que comprende expresar dicho polipéptido heterólogo en una cepas de Pichia modificada genéticamente de la presente invención. Se describen péptidos expresados de forma heteróloga, polipéptidos y proteínas expresadas en las células huésped de la presente invención.

Se describe un polipéptido aislado que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % y/o 100 % de identidad de secuencia con la SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 6 y SEC ID Nº 8.

También se describe una cepa de células huésped genéticamente modificada en la que dicho padre de tipo salvaje parental de dicha célula huésped comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene al menos 60 % de identidad de secuencia con las SEC ID Nº 4, 6 y 8, en la que dicho gen se modifica genéticamente en el genoma de dicha célula huésped de tal manera que el producto del gen o su actividad se reduce o se elimina en dicha célula huésped genéticamente modificada en comparación con dicha célula huésped de tipo salvaje.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Nueva proteasa Ymp1 de Pichia identificada utilizando la purificación por afinidad y análisis CL/EM

Figura 2: Estructura predicha de YMP1 (SEC ID Nº 4) que muestra los aminoácidos 1-857 como la SEC ID Nº 15.

Figura 3: Ensayo de actividad de la proteasa de la cepa mutante ymp1

Figura 4: Ensayo zimográfico de la cepa mutante ymp1

Figura 5: Efecto de inactivación de ymp1 sobre la proteolisis de la proteína heteróloga (SEC ID Nº 1)

Figura 6: Efecto de inactivación de ysp2 sobre la proteolisis de la proteína heteróloga (SEC ID Nº 1)

Figura 7: Efecto de inactivación de ysp1 sobre la proteolisis de la proteína heteróloga (SEC ID Nº 1)

Figura 8: Efecto de inactivación de pep4 sobre la proteolisis de la proteína heteróloga (SEC ID Nº 1)

Figura 9: Estudio de estabilidad en tampón de las cepas mutantes ymp1, ymp3

Figura 10: Resultados del ensayo de zimoliasa par alas cepas de tipo salvaje (WT) y mutantes pmt1 y pmt4 de Pichia

Figura 11: Análisis de glicosilación de proteínas heterólogas (SEC ID Nº 1) de la cepa mutante pmt4

Descripción detallada de la invención

“Célula(s) huésped” como se usa en el presente documento se refiere a una célula que se ha introducido (por ejemplo, transformado, infectado o transfectado) o es capas de introducción (por ejemplo, transformación, infección

o transfección) por una secuencia de polinucleótidos aislados. Las células huésped de origen de levadura y/u hongos filamentosos pueden incluir, entre otros, las siguientes familias, géneros y especies: Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia menabranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichi salictaria, Pichia guercum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia sp., Saccharomyces castelii, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Candida sp., Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens y Neurospora crassa.

"Transformado" como se conoce en la técnica, es la modificación dirigida del genoma o apisona de un organismo a través de la introducción de ADN o ARN externo, o a cualquier otra introducción estable de ADN o ARN externo.

"Transfectada" como se conoce en la técnica, es la introducción de ADN o ARN externo en un microorganismo, incluyendo, pero no limitado a, ADN o ARN recombinante.

“Identidad”, como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, según el caso, determinado comparando las secuencias. En la técnica, “identidad” también significa el grado de relación de la secuencia entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, como puede ser el caso según se determine mediante la correspondencia entre cadenas de dichas secuencias. La “identidad” se puede calcular con facilidad mediante procedimientos conocidos, que incluyen pero sin limitación, los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Printer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Match., 48: 1073 (1988). Se diseñan procedimientos para determinar la identidad para dar la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Además, los procedimientos para determinar la identidad se codifican en programas informáticos disponibles para el público. Los procedimientos de programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, entre otros, el paquete del programa GCG (Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S.F. y col., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990). La familia de programas BLAST X está disponible públicamente en NCBI y otras fuentes BLAST Manual, Altschul, S., y col., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., y col., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). También se puede usar el algoritmo bien conocido de SmithWaterman para determinar la identidad.

Los parámetros para la comparación de secuencias de polipéptidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)

Sanción por hueco: 12

Sanción de longitud de hueco: 4

Un programa útil con estos parámetros está públicamente disponible como el programa de “huecos” de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por defecto para comparaciones de péptidos (junto con ausencia penalización para los huecos en los extremos).

Los parámetros para la comparación de polinucleótidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparación: apareamientos = + 10, apareamiento erróneo = 0

Sanción por hueco: 50

Sanción de longitud de hueco: 3

Disponible como: El programa de “huecos” de Genetics Computer Group, Madison WI.

Estos son los parámetros por defecto para las comparaciones de los ácidos nucleicos.

Un significado de “identidad” para polinucleótidos y polipéptidos, como puede ser el caso, se proporcionan en (1) y

(2) más adelante.

(1)

Las realizaciones de polinucleótidos incluyen adicionalmente un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 o 100 % de identidad con una secuencia de referencia, por ejemplo, la SEC ID Nº 3, en la que dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 3 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparada con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución de nucleótidos, incluyendo transición y transversión, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las posiciones terminales 5’ y 3’ de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en la SEC ID Nº 3 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en la SEC ID Nº 3, o

en la que nn es el número de alteraciones de nucleótidos, xn es el número total de nucleótidos en la SEC ID Nº 3, y es 0,95 para 95 %, 0,97 para 97 %, 1,00 para 100 %, etc., y • es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de xn e y se redondea hacia abajo al número entero más cercano antes de restarlo de xn. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido pueden crear mutaciones sin sentido, de sentido erróneo o mutaciones de desplazamiento del marco de lectura en esta secuencia codificante y, por lo tanto, alterar el polipéptido codificado por el polinucleótido después de dichas alteraciones.

(2)

Las realizaciones de polipéptidos además incluyen un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 o 100 % de identidad a la secuencia de polipéptidos de referencia tal como la SEC ID Nº 4, en la que dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos comparada con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por la menos una deleción, sustitución de aminoácidos, incluyendo sustitución, conservadora o y no conservadora, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las posiciones terminales amino-o carboxi de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, intercaladas o bien individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de aminoácidos, o:

en la que na es el número de alteraciones de aminoácidos, xa es el número total de aminoácidos en la secuencia, y es 0,95 para 95 %, 0,97 para 97 %, 1,00 para 100 %, y • es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de xa e y se redondea hacia abajo al número entero más cercano antes de restarlo de xa.

“Aislado” significa alterado “por la mano del hombre” a partir de su estado natural, es decir, si se produce en la naturaleza, se ha cambiado o eliminado de su ambiente natural, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido de origen natural en un organismo vivo no está “aislado”, pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está “aislado”, incluyendo, entre otros, cuando dicho polinucleótido o polipéptido se introduce de nuevo en una célula.

Un ácido nucleico o polinucleótido “aislado” o “sustancialmente puro” (por ejemplo, un ARN, ADN o un polímero mixto) es uno que está sustancialmente separado de otros componentes celulares que acompaña de forma natural al polinucleótido nativo en su célula huésped natural, por ejemplo ribosomas, polimerasas y secuencias genómicas con las que está asociado de forma natural. El término abarca un ácido nucleico o polinucleótido que (1) se ha retirado de su entorno de origen natural, (2) no está asociado con todo o una porción de un polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (3) está unido operativamente a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (4) no se produce en la naturaleza. El término "aislado" o "sustancialmente puro" se puede utilizar también en referencia a aislados de ADN recombinante o clonado, análogos de polinucleótidos sintetizados químicamente, o análogos de polinucleótidos que son sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos.

Sin embargo, "aislado" no requiere necesariamente que el ácido nucleico o polinucleótido descrito de este modo ha sido eliminado en sí físicamente de su entorno nativo. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico endógeno en el genoma de un organismo se considera "aislado" en el presente documento si una secuencia heteróloga se coloca adyacente a la secuencia de ácido nucleico endógeno, de manera que la expresión de esta secuencia de ácido nucleico endógeno se altera, por ejemplo, se ha aumentado, disminuido o eliminado. En este contexto, una secuencia heteróloga es una secuencia que no está de forma natural adyacente a la secuencia de ácido nucleico endógeno, ya sea o no la secuencia heteróloga es en sí misma endógena (procedente de la misma célula huésped o progenie de la misma) o exógena (procedente de una célula huésped diferente o progenie de la misma). A modo de ejemplo, una secuencia promotora puede sustituirse (por ejemplo, mediante recombinación homóloga) por el promotor nativo de un gen en el genoma de una célula huésped, de tal manera que este gen tiene un patrón de expresión alterado. Este gen se convertiría ahora en "aislado" porque está separado de al menos algunas de las secuencias que lo flanquean de forma natural.

Un ácido nucleico también se considera "aislado" si contiene cualquier modificación que no se produce de forma natural en al ácido nucleico correspondiente en un genoma. Por ejemplo, una secuencia codificante endógena se considera "aislada" si contiene una inserción, deleción o una mutación puntual introducida artificialmente, por ejemplo, por intervención humana. Un "ácido nucleico aislado" también incluye un ácido nucleico integrado en un cromosoma de la célula huésped en un sitio heterólogo y una construcción de ácido nucleico presente como un episoma. Además, un "ácido nucleico aislado" puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o sustancialmente libre de medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Tal como se usa en el presente documento, "secuencia de ácido nucleico que codifica un producto génico funcional" se refiere a cualquier porción de una parte codificante de un gen. La secuencia de ácido nucleico que codifica un producto génico funcional puede ser una porción de una enzima que es capaz de hacer al menos una actividad la enzima completa o de la totalidad de la enzima.

Tal como se usa en el presente documento, "ácido nucleico necesario para la expresión de al menos un producto génico" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica cualquier porción de un gen y/o está unido operativamente a un ácido nucleico que codifica un producto génico, pero no comprende necesariamente secuencia de codificación. A modo de ejemplo, una secuencia de ácido nucleico necesaria para la expresión de al menos un producto génico incluye, pero no se limita a, potenciadores, promotores, secuencias reguladoras, codones de iniciación, codones de terminación, secuencias de poliadenilación, y/o secuencias de codificación.

Tal como se usa en el presente documento, "proteolisis" o "producto génico responsable de la proteolisis en una célula" se refiere a cualquier péptido, polipéptido, proteína y/o enzima o porción del mismo capaz de provocar la escisión de al menos un péptido, polipéptido y/o proteína. El producto génico responsable de la proteolisis puede ser directamente responsable de la escisión (es decir, una peptidasa) o puede ser indirectamente responsable como parte de una vía de síntesis de peptidasa. Ejemplos de productos génicos que son responsables de la proteolisis en una célula incluyen, pero no se limitan a, aspartil proteasas, serín proteasas, aspartil proteasas secretadas, serín proteasas secretadas, proteasas metiltróficas de levadura, endopeptidasas de tipo DPP IV, metaloendopeptidasas, serín proteasas de tipo Prb1, serín proteasas Prb1 y carboxipeptidasas de tipo CPY. Asimismo se incluyen en esta definición la proteasa que puede ser secretada por una célula, pero todavía mantener parte o toda la actividad de proteolisis, tal como una serín proteasa secretada. Una proteasa secretada puede ser responsable de la proteólisis dentro de la célula y/o fuera de la célula.

Tal como se usa en el presente documento, "glicosilación" o "producto génico responsable de la glicosilación en una célula" se refiere a cualquier péptido, polipéptido, proteína y/o enzima o porción de los mismos que participan en la adición de al menos un resto de sacárido a un polipéptido o alargamiento de al menos una cadena de sacárido en la célula. El producto génico responsable de la glicosilación en una célula puede ser directamente responsable de la adición de un sacárido a un polipéptido en una célula, por ejemplo, entre otros, manosiltranferasas. Las manosiltransferasas pueden transferir un residuo de Dol-P-Man a un residuo de serina y/o treonina en un péptido, polipéptido y/o proteína o pueden actuar para transferir un residuo de manosa de GPD-Man a un sacárido, alargando de este modo la cadena de sacárido. Como alternativa, el producto génico responsable de la glicosilación puede ser parte de una ruta de glicosilación y puede ser indirectamente responsable de la adición de polisacárido a un polipéptido en una célula. Ejemplos de productos génicos que son responsables de la glicosilación en una célula incluyen, pero no se limitan a, manosiltranferasas.

Tal como se usa en el presente documento, "actividad de proteasa 1 metiltrófica de levadura (Ymp1)" se refiere a cualquier actividad que la proteína identificada en el presente documento como SEC ID Nº 4 pueda realizar. Por ejemplo, la actividad de proteasa 1 metiltrófica de levadura o actividad Ympl incluye, pero no se limita a, la capacidad de una enzima para escindir proteolíticamente un péptido, polipéptido, o proteína. En particular, la actividad Ympl puede referirse a la capacidad de una enzima para escindir un polipéptido que comprende un fragmento y/o variante de un agonista de GLP-1, tal como, pero no limitado a, GLP-1 humano y/o albúmina humana. Al menos una actividad Ymp1 incluye, pero no se limita a, al menos una actividad de serín proteasa.

"Polinucleótido (s)" se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. "Polinucleótido (s)" incluyen, sin limitación, ADN mono y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias o regiones mono, bi y tricatenarias, simple, ARN, y ARN mono y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, regiones bicatenarias o tricatenarias,

o una mezcla de regiones mono y bicatenarias. Además, "polinucleótido" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a regiones de triple hebra que comprenden ARN o ADN o ambos ARN y ADN. Las hebras en tales regiones pueden ser de la misma molécula o de diferentes moléculas. Las regiones pueden incluir todas de una o más de las moléculas, pero más típicamente implican solamente una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice a menudo es un oligonucleótido. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polinucleótido (s)" incluye también ADN o ARN como se ha descrito anteriormente que comprenden una o más bases modificadas. Por lo tanto, los ADN o ARN con esqueletos modificados para la estabilidad o por otras razones son "polinucleótido (s)" tal como se pretende con ese término en el presente documento. Además, los ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiladas, por citar sólo dos ejemplos, son polinucleótidos como se usa el término en el presente documento. Se apreciará que se ha realizado una gran variedad de modificaciones se en el ADN y el ARN que sirven para muchos propósitos útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término "polinucleótido (s)", como se emplea en el presente documento abarca dichas de polinucleótidos formas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente modificadas, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo, por ejemplo, células simples y complejas. "Polinucleótido (s)" también abarca polinucleótidos cortos a menudo denominados oligonucleótido (s).

“Polipéptido(s)” se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados. “Polipéptido(s)” se refiere tanto a cadenas cortas, normalmente denominadas péptidos, oligopéptidos y oligómeros, y a cadenas más largas, en general denominadas proteínas. Los polipéptidos pueden comprender aminoácidos distintos a los 20 aminoácidos codificados en los genes. Los polipéptido (s)" incluyen los modificados ya sea mediante procesos naturales, tales como procesamiento y otras modificaciones postraduccionales, pero también mediante técnicas de modificación química. Tales modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa bibliografía de investigación, y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grado variable en varios sitios en un polipéptido dado. Asimismo, un polipéptido dado puede comprender muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones se pueden producir en cualquier punto en un polipéptido, incluida la estructura peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado nucleotídico, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, glicosilación, unión lipídica, sulfatación, carboxilación gamma de restos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas, tales como arginilación y ubiquitinación. Véase, por ejemplo, PROTEINS -STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ª Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 y Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pág. 1-12 en POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter y col., Meth. Enzymol. 18: 626-646 (1990) y Rattan y col., Protein Synthesis: Posttranslational

Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992). Los polipéptidos pueden ser ramificados o cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden ser el resultado de procesos naturales postraduccionales o pueden fabricarse también mediante procedimientos completamente sintéticos,

"Sistema(s) de expresión recombinante" se refiere a sistemas de expresión o porciones de los mismos o polinucleótidos de la invención introducidos, transfectados o transformados en una célula huésped o lisado de célula huésped para la producción de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención.

“Variante(s)”, como el término se usa en el presente documento, se refiere a un polinucleótido o polipéptido que se diferencia de un polinucleótido o polipéptido, respectivamente, de referencia, pero conserva las propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en una secuencia de nucleótidos de otro, polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o no alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, proteínas de fusión y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se describe más adelante. Una variante típica de un polipéptido difiere en una secuencia de aminoácidos de otro, polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante sean estrechamente similares en conjunto y, en muchas regiones, idénticas. Una variante del polipéptido de referencia se puede diferenciar en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación Un residuo de aminoácidos sustituido o insertado puede o no puede estar codificado por el código genético. También se describen variantes de cada uno de los polipéptidos, esto es, polipéptidos que varían de los referentes en sustituciones de aminoácidos conservativas, en las que un residuo es sustituido por otro con características similares. De estas sustituciones las típicas se dan entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los residuos básicos Lys y Arg; o los residuos aromáticos Phe y Tyr. Particularmente hay variantes en las que varios, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 i 1 aminoácidos se sustituyen, eliminan, o añaden en cualquier combinación. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser de origen natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conoce que sea de origen natural. Variantes no naturales de polinucleótidos y polipéptidos pueden hacerse mediante técnicas de mutagénesis, mediante síntesis directa y mediante otros procedimientos recombinantes conocidos por los expertos en la técnica.

"Microorganismo(s) "significa un (i) procariota, incluyendo, pero no limitado a, un miembro del género Streptococcus, Staphylococcus, Bordetella, Corynebacterium, Mycobacterium, Neisseria, Haemophilus, Actinomycetes, Streptomycetes, Nocardia, Enterobacter, Yersinia, Fancisella, Pasturella, Moraxella, Acinetobacter, Erysipelothrix, Branhamella, Actinobacillus, Streptobacillus, Listeria, Calymmatobacterium, Brucella, Bacillus, Clostridium, Treponema, Escherichia, Salmonella, Kleibsiella, Vibrio, Proteus, Erwinia, Borrelia, Leptospira, Spirillum, Campylobacter, Shigella, Legionella, Pseudomonas, Aeromonas, Rickettsia, Chlamydia, Borrelia y Mycoplasma, e incluyendo además, entre otros, un miembro de la especie o grupo Estreptococo del grupo A, Estreptococo del grupo B, Estreptococo del grupo C, Estreptococo del grupo D, Estreptococo del grupo G, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus durans, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium diptheriae, Gardnerella vaginalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium leprae, Actinomyctes israelii, Listeria monocytogenes, Bordetella pertusis, Bordatella parapertusis, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Haemophilus influenzae, Haemophilus aegyptius, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus ducreyi, Bordetella, Salmonella typhi, Citrobacter freundii. Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Yersinia pestis, Kleibsiella pneumoniae, Serratia marcessens, Serratia liquefaciens, Vibrio cholera. Shigella dysenterii. Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa, Franscisella tularensis, Brucella abortis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Treponema pallidum, Rickettsia rickettsii Y Chlamydia trachomitis, (ii) una arqueobacteria, incluyendo, entre otros, Archaebacter, y (iii) un eucariota unicelular o filamentoso, incluyendo, entre otros, un protozoo, un hongo, un miembro del género Saccharomyces, Kluveromyces, o Candida, y un miembro de la especie Saccharomyces ceriviseae, Kluveromyces lactis, o Candida albicans.

“Bacteria (I) significa un (i) procariota, incluyendo, pero no limitado a, un miembro del género Streptococcus, Staphylococcus, Bordetella, Corynebacterium, Mycobacterium, Neisseria, Haemophilus, Actinomycetes, Streptomycetes, Nocardia, Enterobacter, Yersinia, Fancisella, Pasturella, Moraxella, Acinetobacter, Erysipelothrix, Branhamella, Actinobacillus, Streptobacillus, Listeria, Calymmatobacterium, Brucella, Bacillus, Clostridium, Treponema, Escherichia, Salmonella, Kleibsiella, Vibrio, Proteus, Erwinia, Borrelia, Leptospira, Spirillum, Campylobacter, Shigella, Legionella, Pseudomonas, Aeromonas, Rickettsia, Chlamydia, Borrelia y Mycoplasma, e incluyendo además, entre otros, un miembro de la especie o grupo Estreptococo del grupo A, Estreptococo del grupo B, Estreptococo del grupo C, Estreptococo del grupo D, Estreptococo del grupo G, Streptococcus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptoeoccus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus durans, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium diptheriae, Gardnerella vaginalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium leprae, Actinomyctes israelii, Listeria monocytogenes, Bordetella pertusis, Bordatella parapertusis, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Haemophilus influenzae, Haemophilus aegyptius, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus ducreyi,

Bordetella, Salmonella typhi, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Yersinia pestis, Kleibsiella pneumoniae, Serratia marcessens, Serratia liquefaciens, Vibrio cholera, Shigella dysenterii, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa, Franscisella tularensis, Brucella abortis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Treponema pallidum, Rickettsia rickettsii y Chlamydia trachomitis, y (ii) una arqueobacteria incluyendo, entre otras, Archaebacter.

Como se usa en el presente documento, "polipéptido(s) heterólogo (s)" se refiere a un polipéptido no sintetizado de forma natural por una célula huésped transformada o microorganismo de interés e introducido en la célula huésped o microorganismo por ADN recombinante. Por ejemplo, Pichia puede actuar como una célula huésped para la expresión de seroalbúmina humana, que no se produce en Pichia no transformada o no transfectada. Los polipéptidos heterólogos pueden incluir polipéptidos que han sido modificados para facilitar el aislamiento.

Tal como se usa en el presente documento "marcador de afinidad" se refiere a cualquier resto asociado con una molécula que puede dar a dicha molécula una afinidad selectiva por otra sustancia o molécula. Por ejemplo, un marcador de afinidad puede usarse para facilitar la purificación de una molécula proporcionando a la molécula una afinidad selectiva por el material de empaquetado de la columna. Un ejemplo no limitante de un marcador afinidad es un marcador de His.

Una secuencia de ácido nucleico está “unida operativamente” cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está unido operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está colocado de manera que facilita la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se logra mediante uniones en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los ligadores o adaptadores de oligonucleótidos sintéticos se usan de acuerdo con la práctica convencional

Como se usa en el presente documento, "cosechado" de células se refiere a la recolección de células del cultivo celular. Las células pueden concentrarse durante el cosechado para separarlos del caldo de cultivo, por ejemplo por centrifugación o filtración. El cosechado de las células pueden comprender además la etapa de lisis de las células para obtener material intracelular, tal como, pero no limitado a, polipéptidos y polinucleótidos. El experto en la técnica debe entender que cierto material celular, incluyendo, pero no limitado a, polipéptido expresado de forma heteróloga, puede liberarse de las células durante el cultivo. Por lo tanto, un producto (por ejemplo, un polipéptido expresado de forma heteróloga) de interés puede permanecer en caldo de cultivo después de cosechar las células.

Además se proporcionan procedimientos en los que la construcción de ADN recombinante codifica un marcador seleccionable. Tal marcador seleccionable proporciona una selección positiva o negativa. También se proporcionan procedimientos que comprenden expresar dicho marcador seleccionable y comparar la cantidad de marcador seleccionable producido por al menos una primera célula transformada de la etapa de selección con la cantidad de marcador seleccionable producido por al menos una segunda célula transformada de la etapa de selección en el que la primero y segunda célula transformada produce el mismo marcador seleccionable. Como se entiende en la técnica, los marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, dihidrofolato reductasa (dhfr), β-galactosidasa, proteína fluorescente, forma secretada de la fosfatasa alcalina placentaria humana, beta-glucuronidasa, los marcadores seleccionables de levadura Leu 2 y URA3, genes resistentes a la apoptosis y oligonucleótidos antisentido, así como genes de resistencia a antibióticos que confieren la capacidad de crecer en presencia de antibióticos, incluyendo, neomicina (neo), kanamicina, geneticina, higromicina B, puromicina, zeocina, blasticidina, nourseotricina, bialafos, fleomicina y ampicilina. Como también se entiende en la técnica, las células pueden ordenarse por diversos medios, incluyendo pero no limitados a, inspección visual o un clasificador de células tal como un BD FACS Aria, que puede detectar la expresión de un marcador seleccionable.

El término "tipo salvaje" como se entiende en la técnica se refiere a una célula huésped o una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que se produce en una población nativa sin modificación genética. Por ejemplo, un "padre de tipo salvaje de una célula huésped" se refiere a una cepa no modificada de una célula huésped antes de realizar o que se produzca cualquier modificación genética en el genoma de la célula huésped.

Como se usa en el presente documento, "rendimiento del título" se refiere a la concentración de un producto (por ejemplo, polipéptido, expresado de forma heteróloga) en solución (por ejemplo, caldo de cultivo o mezcla de lisis – células o tampón) y se expresa generalmente como mg/l o g/l. Un aumento en el rendimiento título puede referirse a un aumento absoluto o relativo de la concentración de un producto producido con dos conjunto definidos de condiciones.

Hormona incretina" como se usa en el presente documento significa cualquier hormona que potencia la secreción de insulina o, de otra manera, aumenta el nivel o insulina. Un ejemplo de una hormona incretina es GLP-1. GLP-1 es una incretina secretada por las células L intestinales en respuesta a la ingestión de alimentos. En un individuo sano, GLP-1 desempeña un papel importante en la regulación de los niveles posprandiales de glucosa en sangre mediante la estimulación de la secreción de insulina dependiente de la glucosa por el páncreas lo que da como resultado una

mayor absorción de la glucosa en la periferia. GLP-1 también suprime la secreción de glucagón, que conduce a la reducción de la producción hepática de glucosa. Además, GLP-1 retrasa el tiempo de vaciado gástrico y reduce la motilidad del intestino delgado, de modo que retrasa la absorción de los alimentos. GLP-1 estimula la competencia continuada de las células beta mediante la estimulación de la transcripción de genes implicados en la secreción de insulina dependiente de glucosa y mediante la estimulación de la neogénesis de células beta (Meier, et al. Biodrugs 2003; 17 (2): 93-102).

"Actividad de GLP-1" como se usa en el presente documento significa una o más de las actividades del GLP-1 humano de origen natural, incluyendo, pero no limitado a, reducción de la glucosa en sangre y/o en plasma, estimulación de la secreción de insulina dependiente de la glucosa o, de otro modo, elevación del nivel o la insulina, supresión de la secreción de glucagón, reducción de la fructosamina, aumento de la liberación de glucosa y el metabolismo en el cerebro, retraso del vaciado gástrico y estimulación de la competencia de las células beta, y/o neogénesis. Cualquiera de estas actividades y otras actividades asociadas con la actividad de GLP-1 pueden deberse directa o indirectamente a una composición que tiene actividad de GLP-1 o un agonista de GLP-1. A modo de ejemplo, una composición que tiene actividad de GLP-1 puede estimular directa o indirectamente dependiente de la glucosa, mientras que la estimulación de la producción de insulina puede reducir indirectamente los niveles de glucosa en plasma en un mamífero.

Un "mimético de incretina" como se usa en el presente documento es un compuesto capaz de potenciar la secreción de insulina o, de otra manera, aumentar el nivel o insulina. Un mimético de incretina puede ser capaz de estimular la secreción de insulina, aumentar la neogénesis de las células beta, inhibir la apoptosis de las células beta, inhibir la secreción de glucagón, retrasar el vaciado gástrico e inducir de saciedad en un mamífero. Un mimético de incretina puede incluir, pero no se limita a, cualquier polipéptido que tiene actividad de GLP-1, incluyendo, pero no limitado a, exendina 3 y exendina 4, incluyendo cualquier fragmento y/o variante y/o conjugado de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, "fragmento", cuando se utiliza en referencia a un polipéptido, es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es la misma como parte, pero no toda, la secuencia de aminoácidos de todo el polipéptido de origen natural. Los fragmentos pueden estar "libres" o comprendidos dentro de un polipéptido más grande del cual forman una parte o región como una única región continua en un solo polipéptido más grande. A modo de ejemplo, un fragmento de GLP-1 de origen natural sería incluir los aminoácidos 7 a 36 de los aminoácidos de origen natural 1 a 36. Además, los fragmentos de un polipéptido también pueden ser variantes de la secuencia parcial de origen natural. Por ejemplo, un fragmento de GLP-1 que comprende los aminoácidos 7-30 de GLP-1 de origen natural también puede ser una variante que tiene sustituciones de aminoácidos dentro de su secuencia parcial.

Tal como se usa en el presente documento, "conjugado" o "conjugados" se refiere a dos moléculas que están unidas entre sí. Por ejemplo, un primer polipéptido puede estar unido covalente o no covalentemente a un segundo polipéptido. El primer polipéptido puede estar unido covalentemente mediante un enlazador químico o puede fusionarse genéticamente al segundo polipéptido, en el que el primero y el segundo polipéptido comparten un esqueleto polipeptídico común. Conjugado puede comprender al menos un polipéptido terapéutico conjugado a la seroalbúmina humana. Otros conjugados también incluyen, pero no se limitan a, al menos un polipéptido terapéutico conjugado a la transferrina, un dominio variable de cadena única, y/o al menos una región Fc de un anticuerpo. Los conjugados pueden comprender o no un enlazador.

Tal como se usa en el presente documento "orientado en tándem" se refiere a dos o más polipéptidos que están adyacentes uno a otro como parte de la misma molécula. Pueden estar unidos forma covalente o no covalente. Dos

o más polipéptidos orientados en tándem pueden formar parte del mismo esqueleto del polipéptido. Los polipéptidos orientados en tándem pueden tener orientación directa o invertida y/o pueden estar separados por otras secuencias de aminoácidos.

Un “anticuerpo de dominio” o “dAb" se puede considerar lo mismo que un “dominio variable único" que es capaz de unirse a un antígeno. Un dominio variable único puede ser un dominio variable de anticuerpo humano, pero también incluye dominios variables únicos de anticuerpo de otras especies, como dAb VHH de roedores (por ejemplo, tal como se divulga en el documento WO 00/29004), de tiburón nodriza y de Camelid. El VHH de camélidos son polipéptidos en el dominio variable único de inmunoglobulina que derivan de especies, entre las que se incluyen camellos, llamas, alpacas, dromedarios y guanacos, que producen anticuerpos de cadena pesada desprovistos de forma natural de las cadenas ligeras. Dichos dominios VHH pueden humanizarse de acuerdo con técnicas estándar disponibles en la técnica y dichos dominios se consideran “anticuerpos de dominio” de acuerdo con la invención. Como se usa en el presente documento VH incluye dominios VHH de camélidos.

La frase “dominio variable único” se refiere a un dominio variable de la proteína de unión al antígeno (por ejemplo, VH, VHH, VL) que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de una región o dominio diferente.

La expresión “proteína de unión al antígeno”, como se usa en el presente documento se refiere a anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y otras construcciones proteicas, tales como dominios, pero no se limitan a dominios variables y anticuerpos de dominios, que pueden unirse a un antígeno.

Como se usa en el presente documento, "cantidad reducida" de una enzima o fragmento de la misma o actividad enzimática en comparación con una célula huésped genéticamente modificado se refiere a una célula huésped modificada genéticamente que produce menos de al menos una enzima o muestra menos de al menos un tipo de actividad enzimática cuando se compara con una célula huésped no modificadas genéticamente. Típicamente, la comparación de la actividad enzimática producida por una célula huésped modificada genéticamente es con la cepa de tipo salvaje de la misma especie antes de la modificación genética. Sin embargo, la comparación también puede ser entre el huésped modificado genéticamente y un huésped de tipo salvaje del género pero diferentes especie o cepa o con otra cepa modificada genéticamente. Una reducción en al menos una enzima o actividad enzimática también incluye una anulación completa de al menos una enzima o actividad enzimática en la que ninguno de al menos una enzima se produce en una célula huésped modificada genéticamente y/o ninguno de al menos una enzima es funcional o muestra actividad. También se incluye dentro de esta definición una cantidad reducida de al menos una actividad enzimática. Es decir, las enzimas que tienen más de una actividad pueden mantener la cantidad de una primera actividad, mientras que se reduce una segunda actividad de la misma enzima.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "condiciones rigurosas" y "condiciones de hibridación rigurosas" quieren decir que la hibridación se producirá solo si hay al menos una identidad del 70 % y al menos del 80 %, pero de al menos un 95 %, entre las secuencias. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la incubación durante toda la noche a 42 ºC en una solución que comprende: 50 % de formamida, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, 10 % de sulfato de dextrano y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 0,1 x SSC a aproximadamente 65 ºC. Las condiciones de hibridación y de lavado son muy conocidas y se encuentran ejemplos en Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularmente en su capítulo 11.

Tal como se usa en el presente documento "modificación genética" o "genéticamente modificado" se refiere a cualquier supresión, sustitución, deleción y/o inserción de una o más bases o de un fragmento de una secuencia (s) de ADN celular. Tal modificación genética puede obtenerse in vitro (directamente en ADN aislado) o in situ, por ejemplo mediante técnicas de ingeniería genética o exponiendo las células a un agente mutagénico. Agentes mutagénicos incluyen, por ejemplo, agentes físicos tales como rayos energéticos (rayos X, rayos γ, UV, etc.) o agentes químicos capaces de reaccionar con diferentes grupos funcionales de ADN, tales como agentes alquilantes (EMS, NQO, etc.) agentes bialquilantes, agentes intercalantes, etc. Las modificaciones genéticas también pueden obtenerse mediante alteración genética, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento divulgado por Rothstein et al. (Meth. Enzymol. 194:281-301(1991)). De acuerdo con este procedimiento, parte o la totalidad de un gen se sustituye a través de recombinación homóloga por una versión modificada in vitro. Las modificaciones genéticas pueden obtenerse también por cualquier mutación de tipo inserción en las secuencias de ADN, tales como transposones, fagos, etc. Además, como se usa en el presente documento "genéticamente modificado" se puede referir a un gen que codifica un polipéptido o un polipéptido que tiene al menos una deleción, sustitución o supresión de un ácido nucleico o aminoácido, respectivamente. Por ejemplo, un polipéptido en el que al menos un aminoácido está sustituido por la forma de tipo salvaje sería considerado modificado genéticamente.

La modificación genética puede invertirse o atenuarse mediante un mecanismo celular. Como alternativa, las mutaciones pueden no ser reversibles y sin fugas. Las mutaciones “con fugas” incluyen mutaciones que tienen como resultado una inactivación parcial en lugar de completa de la función de tipo salvaje.

Las modificaciones genéticas realizadas por las células huésped de la invención pueden estar localizadas en una región de codificación de la secuencia de ADN de la célula y/o en una región que afecta a la expresión de un gen. Por tanto, las modificaciones generalmente afectarán al producto génico o a la regulación o estimulación del producto génico de proteínas y/o enzimas implicadas en la proteolisis y/o glicosilación. La capacidad reducida de las células para escindir proteolíticamente y/o glicosilar un polipéptido expresado de forma heteróloga puede deberse a cambios estructurales y/o conformacionales, con respecto a la producción de una o más enzimas con propiedades biológicas alteradas, con respecto a la ausencia de producción de dichas una o más enzimas o con respecto a la producción de una o más enzimas en niveles bajos.

Se describen cepas de Pichia modificadas genéticamente en las que al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto génico funcional y/o al menos un ácido nucleico necesario para la expresión de al menos un producto génico en dicha cepa de Pichia está modificada genéticamente, en el que dicho producto génico es responsable de la proteólisis y/o la glicosilación en dicha cepa de Pichia modificada genéticamente. Las cepas de Pichia modificadas genéticamente de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Pichia en la que al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica al menos uno de los siguientes un producto génico funcional o expresión de dicho producto génico está modificado genéticamente: PEP4, PRB1, YPS1, YPS2, YMP1, DAP2, GRH1, PRD1, YSP3, PRB3, YMP y/o YMP3. También se describen cepas de Pichia modificadas genéticamente que producen una cantidad reducida, ninguna y/o al menos una reducción de la actividad de al menos una de las siguientes enzimas y/o tipo de enzima: aspartil proteasas, serín proteasas, aspartil proteasas secretadas, serín proteasas secretadas, proteasas metiltróficas de levadura, endopeptidasas de DPP IV, metaloendopeptidasas, serín proteasas de tipo Prb1, serín proteasas Prb1, carboxipeptidasas de tipo CPY y/o manosiltranferasas en comparación con la cepa de tipo salvaje. Adicionalmente, las cepas modificadas genéticamente pueden producir una enzima seleccionada de: aspartil proteasas, serín proteasas, aspartil proteasas secretadas, serín proteasas secretadas,

proteasas metiltróficas de levadura, endopeptidasas de DPP IV, metaloendopeptidasas, serín proteasas de tipo Prb1, serín proteasas Prb1, carboxipeptidasas de tipo CPY y/o manosiltranferasas, en las que dicha enzima demuestra al menos una actividad reducida de dicha enzima en comparación con una cepa de tipo salvaje y/o enzima.

Las cepas de Pichia genéticamente modificadas también incluyen cepas de Pichia en las que al menos una de las siguientes secuencias de ácidos nucleicos que codifican un producto génico funcional o la expresión de dicho producto génico está modificada genéticamente: OCH1, PMT1, PMT2, y/o PMT4. La Pichia modificada genéticamente producen una cantidad reducida, ninguna actividad o actividad reducida de al menos una manosiltransferasa en comparación con la cepa de tipo salvaje. Adicionalmente, las cepas modificadas genéticamente pueden producir una enzima asociada con la glicosilación tal como al menos una manosiltransferasa que tiene una actividad reducida en comparación con la enzima de tipo salvaje.

Las cepas genéticamente modificadas de Pichia incluyen, pero no se limitan a, una forma modificada genéticamente de las cepas salvajes de Pichia X-33 o SMD1163. Las cepas de Pichia modificadas genéticamente incluyen, pero no se limitan a, una forma modificada genéticamente de tipo salvaje de Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichi salictaria, Pichia guercum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia sp. de tipo salvaje.

Se describen cepas de Pichia modificadas en las que la siguiente secuencia de ácido nucleico que codifica un producto génico funcional o la expresión de dicho producto génico está modificada genéticamente: PEP4, PRB1, YPS1, YPS2, YMP1, YMP2, YMP3 y PMT4. La Pichia modificada produce una cantidad reducida, ninguna actividad

o actividad reducida de al menos uno de los siguientes productos génicos en comparación con una cepa de tipo salvaje: aspartil proteasa, serín proteasa, serín proteasa secretada y manosiltransferasa. Las cepas de Pichia modificadas también tienen una actividad reducida de al menos uno de los siguientes productos génicos en comparación con la cepa de tipo salvaje: al menos una aspartil proteasa, al menos una serín proteasa, al menos una serín proteasa secretada y/o al menos una manosiltransferasa.

Las cepas de Pichia modificadas genéticamente pueden comprender además un polinucleótido capaz de expresar al menos un polipéptido heterólogo. El polinucleótido capaz de expresar al menos un polipéptido heterólogo incluyen, pero no se limitan a, vectores, ADN transformado en el genoma de la célula huésped, virus o parte de un virus, y/o plásmidos. El polinucleótido capaz de expresar un polipéptido heterólogo puede transformarse en el genoma de Pichia y/o puede ser parte de un vector de expresión y/o sistema de expresión episomal.

Como se entiende en la técnica, el ADN puede transformarse en una célula huésped mediante varios procedimientos diferentes. En levaduras, puede usarse cualquier procedimiento conveniente de transferencia de ADN, tal como electroporación, el procedimiento del cloruro de litio o el procedimiento de esferoplasto. Para producir una cepa estable adecuada para la fermentación de alta densidad, es deseable integrar el ADN en el cromosoma huésped. La integración se produce a través de recombinación homóloga, usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, el ADN capaz de expresar al menos una proteína heteróloga se puede proporcionar con secuencias flanqueantes homólogas a las secuencias del organismo huésped. De esta manera, la integración se produce en un sitio definido en el genoma del huésped, sin alteración de genes deseables o esenciales. Como alternativa, el ADN capaz de expresar al menos una proteína heteróloga se integra en el sitio de un gen no deseado en un cromosoma huésped, efectuando la interrupción o deleción del gen o la expresión de ese producto génico. Por ejemplo, la integración en los sitios de los genes YMP1, YMP2, YMPi, PEP4, prbl, YPSL, YPS2, DAP2, GRHL, prdl, YSP3, PRB3, SEC ID Nº 10, SEC ID Nº 12 y/o SEC ID Nº 14 permite la expresión de la proteína heteróloga al tiempo que evita la expresión de enzimas implicadas en la proteolisis en levaduras. En otras realizaciones, el ADN puede introducirse en el huésped a través de un cromosoma, plásmido, vector retroviral, o integración aleatoria en el genoma huésped.

En otro aspecto de la presente invención, al menos un polipéptido heterólogo expresado en las células huésped de la presente invención comprende al menos un agonista de GLP-1. En algunos aspectos, el agonista de GLP-1 se selecciona del grupo de: hormona incretina y/o fragmento, variante y/o conjugado del mismo y mimético de incretina y/o fragmento, variante y/o conjugado del mismo. En algunos aspectos, al menos un polipéptido heterólogo tiene al menos una actividad de GLP-1.

Los polipéptidos que tienen actividad de GLP-1 pueden comprender al menos un fragmento y/o variante de GLP-1 humano. Los dos fragmentos de origen natural de GLP-1 humano se representan en la SEC ID Nº 2

en la que: Xaa en la posición 37 es Gly (en lo sucesivo designado como "GLP-1 (7-37)"), o -NH 2 (en lo sucesivo designado como "GLP-1 (7-36)"). Los fragmentos de GLP-1 pueden incluir, pero no se limitan a, moléculas de GLP-1 que comprenden, o como alternativa que consisten en, los aminoácidos 7 a 36 del GLP-1 humano (GLP-1 (7-36)). Las variantes de GLP-1 o fragmentos de los mismos pueden incluir, pero no se limitan a, uno, dos, tres, cuatro, cinco

o más sustituciones de aminoácidos de GLP-1 tipo salvaje en o en los fragmentos de origen natural de GLP-1 se muestra en la SEC ID Nº 2. Las variantes de GLP-1 o fragmentos de GLP-1 pueden incluir, pero no se limitan a, sustituciones de un residuo de alanina análogo a la alanina 8 del GLP-1 de tipo salvaje, estando dicha alanina mutada a una glicina (en lo sucesivo designado "A8G") (véase, por ejemplo, los mutantes divulgados en la patente de EE.UU. Nº 5.545.618).

En otro aspecto, el al menos un polipéptido que tiene actividad de GLP-1 comprende al menos un fragmento y/o variante de GLP-1 humano fusionado con seroalbúmina humana. En otro aspecto, al menos un fragmento y la variante de GLP-1 comprenden GLP-1(7-36(A8G)). El al menos un fragmento y la variante de GLP-1 está fusionado genéticamente a seroalbúmina humana.. En otro aspecto, el polipéptido heterólogo de la presente invención comprende al menos dos GLP-1 (7-36 (A8G)) en tándem y genéticamente fusionados a la seroalbúmina humana. Los dos GLP-1 (7-36 (A8G)) se fusionan genéticamente en el extremo N de la seroalbúmina humana. En algunos casos, el polipéptido heterólogo comprende la SEC ID Nº 1.

En todavía otra realización, al menos un polipéptido heterólogo expresado en las células huésped de la invención comprende uno o más de los siguientes: al menos una proteína de unión a antígeno, al menos un dominio variable sencillo, y/o al menos un anticuerpo de dominio. Los polipéptidos que comprenden al menos un dominio de unión a antígeno pueden comprender también al menos un polipéptido y/o agonista y/o antagonista del receptor del péptido. En algunos casos, el agonista del polipéptido puede ser un agonista del receptor de GLP-1. Como se entiende en la técnica, más de un polipéptido heterólogo puede expresarse en la misma célula. A modo de ejemplo, un polipéptido heterólogo que tiene actividad de GLP-1 se puede expresar en la misma célula como una proteína de unión a antígeno. El polipéptido que tiene actividad de GLP-1 puede expresarse a partir el mismo polinucleótido que la proteína de unión a antígeno, unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico necesaria para la expresión. Como alternativa, y a modo de ejemplo, un polipéptido que tiene actividad de GLP-1 puede expresarse independientemente de un segundo polipéptido heterólogo tal como una proteína de unión a antígeno, ya sea desde el mismo ADN episomal o genoma pero unido operativamente a diferentes secuencias de polinucleótidos necesarias para la expresión o a partir de secuencias de ADN localizadas en vectores separados.

También, en el presente documento se proporcionan cepas de Pichia modificadas genéticamente, en las que dicha cepa muestra una proteolisis reducida de dicho al menos un polipéptido heterólogo en dicha cepa en comparación con Pichia de tipo salvaje. Además, Pichia modificada genéticamente puede mostrar una glicosilación reducida o ausencia de glicosilación de dicho al menos un polipéptido heterólogo en dicha cepa en comparación con Pichia de tipo salvaje.

En otro aspecto se proporcionan procedimientos para producir un polipéptido heterólogo que comprenden expresar dicho polipéptido heterólogo en una Pichia modificada genéticamente de la invención. También se describen polipéptidos heterólogos producidos en una cualquiera de las Pichia modificadas genéticamente de la presente invención.

Se describen polinucleótidos aislados que tienen una identidad de secuencia de al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, y/o 100 % con las SEC ID Nº 3, 5, y 7. Se describen polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia de al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90

%, 95 %, 99 %, y/o 100 % con las SEC ID Nº 4, 6, y 8. Se describen células huésped modificadas genéticamente en las que el padre de tipo silvestre de dicha célula huésped modificada genéticamente comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, y/o 100 % con las SEC ID Nº 4, 6, 8, en las que dicho gen está modificado genéticamente en el genoma de dicha célula huésped de tal manera que el producto génico se reduce o elimina en dicha célula huésped modificada genéticamente en comparación con dicha célula huésped de tipo salvaje. También se describen células huésped genéticamente modificadas en las que dicho tipo silvestre parental de dicha célula huésped modificada genéticamente comprende un gen que tiene una identidad de secuencia de al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, y/o 100 % con las SEC ID Nº 3, 5, y 7, en las que dicho gen está modificado genéticamente en el genoma de dicha célula huésped genéticamente modificada. La célula huésped modificada genéticamente de la presente invención puede tener una actividad proteasa reducida o eliminada en comparación con dicha célula huésped parental de tipo salvaje. La célula huésped modificada genéticamente de la presente invención tiene actividad proteasa metiltrófica de levadura reducida o eliminada (Ympl). En algunos casos, la célula huésped es Pichia.

Se describen polinucleótidos aislados que tienen una identidad de secuencia de al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, y/o 100 % con las SEC ID Nº 9, 11, y 13. Se describen polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia de al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, y/o 100 % con las SEC ID Nº 10, 12, y 14.

Como se entiende en la técnica, la actividad enzimática de una o más enzimas producidas por células huésped en cultivo puede verse afectada por las condiciones de crecimiento del cultivo. Por ejemplo, la actividad proteolítica de una proteasa producida por una célula huésped en cultivo podría disminuirse mediante la alteración de una o más de las siguientes condiciones: pH, oxígeno disuelto, temperatura, osmolaridad, uno o más componentes de los medios, inhibidores específicos de la proteasa, tiempo y/o velocidad de crecimiento, concentración celular, duración del cultivo y/o la tasa de alimentación de glucosa (por ejemplo, alimentación discontinua). La adición de los hidrolizados de proteínas complejas al cultivo puede ser especialmente eficaz en la inhibición de la proteolisis. Además, las condiciones pueden alterarse en uno o más puntos específicos durante el cultivo de una manera tal que se maximice el efecto. Del mismo modo, la glicosilación de las proteínas producidas en cultivo puede verse afectada por factores similares. Por lo tanto, las condiciones de crecimiento para reducir la actividad enzimática de una célula huésped, tal como la actividad proteolítica o de glicosilación, en cultivo pueden optimizarse mediante el ajuste de uno o más de los factores no limitantes mencionados anteriormente.

También, como se entiende en la técnica de producción de la proteína heteróloga en una célula huésped puede aumentarse mediante el control de muchos de los mismos factores indicados anteriormente. Además, la adición de los factores que aumentan el número de copias del vector, incluyendo, pero no limitado a, la adición de rapamicina a los medios de cultivo, también puede aumentar la producción. Otros factores que pueden aumentar la producción incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión de una o más proteínas chaperonas, tal como la proteína disulfuro isomerasa (PDI). Además, la hemoglobina (Hb) se puede coexpresar con al menos un polipéptido heterólogo en una célula huésped para potenciar la disponibilidad de oxígeno para el metabolismo oxidativo, aumentando por lo tanto, la producción de polipéptido.

Las proteínas heterólogas que se secretan a partir de una célula huésped durante la producción pueden comprender una secuencia líder que facilita la secreción. Las secuencias líder pueden modificarse para mejorar la secreción y, por tanto, la producción y recuperación global de la proteína expresada de forma heteróloga; por ejemplo diferentes secuencias líder de varias proteínas secretadas pueden estar unidas operativamente a la proteína heteróloga y evaluarse para determinar la expresión potenciada. Como alternativa, una secuencia líder dada puede modificarse por mutagénesis dirigida al sitio, o por medio de un enfoque de biblioteca combinatoria para identificar una variante mejorada de la secuencia líder. Se pueden encontrar secuencias líder quiméricas, que comprenden regiones de dos

o más péptidos líder, se pueden para mejorar el nivel de expresión de la proteína heteróloga.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes ilustran diversos aspectos no limitantes de la presente invención.

Ejemplo 1 – Nuevas proteasas Ympl

Mediante purificación por afinidad y análisis CL/EM se identificó una nueva proteasa en el sobrenadante del cultivo de Pichia. La figura 1 muestra una nueva proteasa metiltrófica de levadura (Ympl) de Pichia identificada en el gel. El sobrenadante filtrado clarificado de B378 (cepa nula de Pichia) se incubó durante la noche con aprotinina biotinilada. El sobrenadante se cargó en una columna de 2 ml de avidina (Pierce) y se lavó con PBS. La columna se eluyó secuencialmente con Tris 0,1 M, cloruro sódico 2 M, pH 7,5, después con acetato sódico 0,1 M, cloruro de sodio 2 M, pH 4,5 y, por último, con tampón de elución de biotina (Pierce). Los eluidos se concentraron y pasaron por SDS-PAGE. Las bandas más prominentes, las bandas 1 y 2, se escindieron del gel, se redujeron, alquilaron y digirieron con tripsina in situ. Los péptidos trípticos de cada banda se analizaron mediante espectrometría de masas en tándem -cromatografía líquida. Se realizó una búsqueda de los datos de la secuencia no interpretados frente a la base de datos de contig-péptido de Pichia (Integrated Genetics) utilizando software de identificación de proteínas Mascot.

Los péptidos generados a partir de las dos bandas 1 y 2 coincidieron con un marco de lectura abierto (ORF) en una base de datos del genoma de Pichia. El gen se aisló y secuenció, y contenía un marco de lectura abierto de 5115 pb de ácidos nucleótidos (SEC ID Nº 3) que codifica una nueva proteína de 1.704 aminoácidos (SEC ID Nº 4). El peso molecular predicho de la proteína entera es 185,8 kDa. La secuencia de polinucleótidos de este gen de Pichia (que 5 se muestra en SEC ID Nº 3) no comparte una homología significativa con ninguna secuencia en GenBank. La secuencia de aminoácidos de codificación contiene dos dominios de estructura: el dominio en N-terminal (AA 1-865) comparte identidades del 30,2 % con la serín endopeptidasa de Hypocrea lixii, y el dominio en C-terminal (AA 13051449) comparte identidades del 48 % con el motivo LPXTG de la proteína del dominio de anclaje a la pared celular de Lactobacillus reuteri. Sin embargo, la comparación de la longitud completa de la SEC ID Nº 4 y la serina 10 endopeptidasa de Hypocrea lixii muestra solo una identidad del 14,8 % usando el programa LALIGN de William Pearson que calcula un alineamiento global de dos secuencias, versión 2.2u (Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:1117). La estructura predicha para esta proteasa se muestra en la Figura 2. Su estructura y la secuencia en C-terminal son únicas entre todas las serín proteasas de todas las especies. El gen se denominó proteasa metiltrófica de levadura (YMP1) ya que está presente en el cultivo de Pichia metiltrófica. Es una nueva clase de proteasa basada

15 en su estructura única. Ymp1 es uno de las proteínas secretadas más abundantes en medio de cultivo metilotrófico de Pichia sobre la base de un análisis global del sobrenadante de cultivo de Pichia usando CL / EM (datos no mostrados).

La secuencia polipeptídica codificada por la secuencia génica de la SEC ID Nº 3 se presenta a continuación como SEC ID Nº 4.

Ejemplo 2 – Nuevas proteasas

Se identificaron dos nuevas proteasas adicionales metiltróficas de levadura (Ymp2 y Ymp3) utilizando purificación por afinidad similar y el análisis CL / EM como se describe en el Ejemplo 1 a partir del sobrenadante de la cepa 5 defectiva ymp1 de Pichia (véase el Ejemplo 3). El sobrenadante filtrado clarificado de B580 (cepa de Pichia ymp1 con deleción) se incubó durante la noche con AEBSF biotinilado (4-(2-aminoetil) bencenosulfonilfluoruro clorhidrato). El sobrenadante se cargó en una columna de 10 ml de avidina (Pierce) y se lavó con PBS. La columna se eluyó secuencialmente con Tris 0,1 M, cloruro sódico 2 M, pH 7,5, después con acetato sódico 0,1 M, cloruro de sodio 2 M, pH 4,5 y, por último, con tampón de elución de biotina (Pierce). Los eluidos se desnaturalizaron mediante 10 la adición de urea 8 M y los residuos de Cys se redujeron mediante reacción con ditiotreitol (DTT) 20 mM y después se alquilaron mediante reacción con yodoacetamida 20 mM. Después de diluir la muestra a urea 2 M con bicarbonato amónico 100 mM (pH 8,5), las proteínas se digirieron con tripsina (tripsina modificada de calidad para secuenciación, Promega, Madison, WI). La mezcla de péptidos resultante de la digestión se desaló con una columna de centrifugación PepClean (Pierce, Rockford, IL), y se analizó mediante un sistema de CL-EM/EM, en el que en una

15 cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con una columna C18 de fase inversa con un diámetro interior de 75 micrómetros se acopló en línea con un espectrómetro de masas de trampa de iones (Thermo, Palo Alto, CA). Los datos de espectrometría de masas adquiridos a partir del análisis CL-EM / EM se utilizaron para buscar contra la base de datos de proteínas redundantes de GenBank, así como en la base de datos de Pichia (Integrated Genetics) usando el software de identificación de proteínas Mascot.

20 A través de las coincidencias de péptidos se identificaron dos genes, llamados YMP2 y YMP3 que compartían homologías con proteasas conocidas. YMP2 contiene un marco de lectura abierto de 618 pb de ácidos nucleótidos (SEC ID Nº 5) que codifica una nueva proteína de 205 aminoácidos (SEC ID Nº 6). El peso molecular predicho de la proteína entera es 22,9 kDa. La secuencia de polinucleótidos de este gen de Pichia (que se muestra en SEC ID Nº 5) no comparte una homología significativa con ninguna secuencia en GenBank. No obstante, la secuencia de

25 aminoácidos de codificación comparte identidades del 29 % con la Arginina / alanina aminopeptidasa de Pichia pastoris.

La secuencia polipeptídica codificada por la secuencia génica de la SEC ID Nº 5 se presenta a continuación como SEC ID Nº 6.

YMP3 contiene un marco de lectura abierto de 1233 pb de ácidos nucleótidos (SEC ID Nº 7) que codifica una nueva proteína de 410 aminoácidos (SEC ID Nº 8). El peso molecular predicho de la proteína entera es 46,0 kDa. Su secuencia de aminoácidos comparte identidades del 47 % con la leucina aminopeptidasa de Pichia stipitis.

La secuencia polipeptídica codificada por la secuencia génica de la SEC ID Nº 7 se presenta a continuación como 10 SEC ID Nº 8.

Adicionalmente, otras tres proteasas potenciales se identificaron utilizando todas las proteasas de levadura conocidas contra la base de datos de Pichia. Las secuencias de polinucleótidos identificadas que codifican estas proteasas identificadas y sus respectivas secuencias de polipéptidos se presentan en las SEC ID Nº 9-14 siguientes.

Ejemplo 3 Proteasas defectivas

Se generaron varias cepas inactivadas de Pichia mediante los procedimientos siguientes. El extremo 5 'del gen que se va a inactivar (200-500 pb) se amplificó a partir de ADN genómico de Pichia mediante PCR usando un cebador 5' específico del gen y un cebador 3’ específico del gen con una secuencia de 20 pb complementaria al extremo 5’ del casete de expresión del marcador de selección, por ejemplo KanMX. El extremo 3’ del gen que se va a inactivar (200-500 pb) también se amplificó a partir del ADN genómico de Pichia mediante PCR usando un cebador 5' específico del gen con una secuencia de 20 pb complementario al extremo 3 'del casete de expresión KanMX y un cebador 3’ específico del gen. En una reacción de PCR separada, una cantidad adecuada del producto 5’, porducto 3’, el, ADN que contiene el casete de expresión KanMX, y los cebadores específicos del gen 5’ y 3’ utilizados antes se añadieron para hacer un casete de inactivación que tiene el casete de expresión KanMX flanqueando regiones homólogas en 5’ y 3’ del gen inactivado. El fragmento de ADN se purificó y se transformó en Pichia usando un procedimiento de electroporación estándar. Las células recombinantes se seleccionaron en las placas YPD que contienen un antibiótico, por ejemplo KAN, y se efectuó detección selectiva con PCR utilizando cebadores específicos. Las cepas defectivas resultantes se confirmaron mediante secuenciación genómica y análisis de transferencia de tipo Southern.

Las cepas defectivas individuales y múltiples se transformaron después con ADN capaz de expresar un polipéptido heterólogo. Cada cepa defectiva se transformó con al menos un vector que codifica la proteína terapéutica descrita mediante la SEC ID Nº 1. Los cultivos de cepas defectivas transformadas se cultivaron y se recogieron los sobrenadantes. Los productos secretados se pasaron por geles NuPAGE MOPS para la detección degradación del producto por proteolisis. Las múltiples bandas de la proteína heteróloga semipurificada se interpretó que indicaban actividad proteasa, mientras que una única banda de proteína heteróloga en el peso molecular apropiado se interpretó como ausencia de actividad proteasa. Véase la figura 5-8.

La actividad proteasa en las muestras de sobrenadante de la fermentación se midió utilizando un péptido sintético con un marcador fluorescente e inactivador con longitudes de onda de excitación y emisión de 340 y 405 nm, respectivamente. El sustrato peptídico se incubó con muestras de sobrenadante del cultivo y la tasa de degradación del sustrato se controló usando HPLC fluorescente. Los resultados se expresan como aumento en el área del pico /

h. En la Figura 3, la actividad proteasa en el sobrenadante de la fermentación fue de aproximadamente 68 a 285 en la cepa mutante ymp1, mientras que la actividad proteasa en la cepa de control fue de aproximadamente 1541 a 1909. En consecuencia, la cepa mutante demostró una reducción espectacular de la actividad proteasa sobre el péptido.

El gel del zimograma es otro procedimiento para medir la actividad proteasa utilizando caseína o gelatina como sustratos. En este experimento, las muestras de fermentación se separaron en geles de acrilamida, ya sea con caseína o con gelatina incorporada en la matriz en condiciones reductoras no desnaturalizantes. Después de la separación, las bandas de proteínas se renaturalizaron y se aplicó un tampón de desarrollo para proporcionar los cofactores necesarios para la actividad proteasa. El gel se incubó a 37 ºC durante un período prolongado y después se tiñó con azul de Coomassie. Las áreas de actividad proteolítica se identificaron como áreas claras sobre el gel sobre un fondo azul. Las proteasas activas degradaron el sustrato, no permitiendo que el área sobre el gel se uniera

al azul de Coomassie. Las áreas en el gel que carecen de proteasa activa permiten que la mancha se una al sustrato, de modo que se genera el fondo azul. Figura 4 mostró las áreas activas de la proteasa utilizando sobrenadantes de fermentación de las cepas mutantes ymp1 y dos cepas de control. Las cepas de control tenían proteasas activas que migraron en las zonas de peso molecular tanto alto como bajo. Sin embargo, las señales en la

5 zona de peso molecular alto estaban muy disminuidas o desaparecidas en las cepas mutantes ymp1. Estos datos muestran que las actividades en las zonas de alto peso molecular podrían deberse a la acción de ymp1. El resumen de los resultados para las cepas defectivas se presentan en la Tabla 5.

Otros estudios utilizando un ensayo de estabilidad en tampón demostraron la eficacia de la escisión y el sitio cambia cuando YMP1 y YPS1 se eliminaron de las cepas huésped Pichia. En este ensayo, el patrón proteína descrito por la

10 SEC ID Nº 1 se incubó con los sobrenadantes del cultivo y los productos proteicos escindidos se analizaron mediante espectrofotometría de masas para indicar los sitios de escisión y el porcentaje de productos de degradación (Tabla 1-4).

Usando el sobrenadante del caldo de fermentación B804 (cepa parental SMD 1163 con deleción pmt4, véase el Ejemplo 4), se detectaron 5 sitios de escisión principales: Lys28/Gly29, Phe36/Thr37, Ser38/Asp39, Tyr43/Leu44 y

15 Lys50/Glu51 (Tabla 1).

Tabla 1: Caldo de fermentación BS04 de SMD1163_pmt4 (01:40)

Secuencia

0 h 24 h 48 h 5 días

His1-Leu645

100 73,4 33,9 4,6

(Trp)Leu26 -Leu645

0 1,4 1,8 0

(Leu)Val27 – Leu645

0 0 0 0

(Lys)Gly29 – Leu645

0 5,9 6,3 1,9

(Phe)Thr37 – Leu645

0 8,7 28,4 31,7

(Thr)Se r38 – Leu645

0 1 0 0

(Ser)Asp39 – Leu645

0 4,6 12,9 18

(Val)Ser41 – Leu645

0 0 0 0

(Ser)Ser42 – Leu645

0 0 2,3 2,2

(Tyr)Leu44 – Leu645

0 1,9 5,8 5,3

(Lys)Glu51 – Leu645

0 4,1 8,8 28

(Ala)Trp55 – Leu645

0 0 0 3,4

(Trp)Leu56 – Leu645

0 0 0 4,9

La deleción de YMP1 de SMD1163_pmp4 (B688) disminuyó los sitios de escisión de Phe36 / Thr37, Ser38 / Asp39 y Tyr43 / Leu44, pero mantuvo o aumentó la escisión en Lys50 / Glu51 y Lys28 / Gly29 (Tabla 2).

Tabla 2: Caldo de fermentación B688 de la cepa defectiva en ymp1 de SMD1163_pmt4 (01:40)

Secuencia

0 h 24 h 48 h

His1-Leu645

93,1 75,1 64,9

(Trp)Leu26 -Leu645

0 0 0

(Leu)Val27 – Leu645

0 0 0

(Lys)Gly29 – Leu645

1,4 18,5 26

(Phe)Thr37 – Leu645

0 0,8 1

(Thr)Se r38 – Leu645

0 0 0

(Ser)Asp39 – Leu645

0 0 0

(Val)Ser41 – Leu645

0 0 0

(Ser)Ser42 – Leu645

0 0 0

(Tyr)Leu44 – Leu645

0 0 0

(Lys)Glu51 – Leu645

5,5 4,6 7

(Ala)Trp55 – Leu645

0 0 0

(Trp)Leu56 – Leu645

0 0 0

La deleción de la proteasa yps1 de SMD1163_pmt4 (B805) no eliminó ningún sitio de escisión pero disminuyó la cantidad escindida en el sitio Lys50 / Glu51 (Tabla 3)

Tabla 3: Caldo de fermentación B805 de la cepa defectiva en yps1 de SMD1163_pmt4 (01:40)

Secuencia

0 h 24 h 48 h 5 días

His1-Leu645

100 73,6 37,3 6

(Trp)Leu26 -Leu645

0 1,6 1,9 2,3

(Leu)Val27 – Leu645

0 0 0 0

(Lys)Gly29 – Leu645

0 4,9 5,6 2,7

(Phe)Thr37 – Leu645

0 10 27,1 41

(Thr)Se r38 – Leu645

0 0 0 0

(Ser)Asp39 – Leu645

0 5,5 16 28

(Val)Ser41 – Leu645

0 0 0 0

(Ser)Ser42 – Leu645

0 1 2,3 4,2

(Tyr)Leu44 – Leu645

0 2,3 5,6 9

(Lys)Glu51 – Leu645

0 1,1 2 3,1

(Ala)Trp55 – Leu645

0 0 1,9 3,8

(Trp)Leu56 – Leu645

0 0 0 0

Cuando se delecionaron las proteasas Ymp1 y Yps1 de SMD1163_pmt4 (B803), la escisión se redujo significativamente y solo se produjo en Lys28/Gly29 (Tabla 4).

Tabla 4: Caldo de fermentación B803 de la cepa defectiva en ymp1/yps1 de SMD1163_pmt4 (01:40)

Secuencia

0 h 24 h 48 h 5 días

His1-Leu645

100 94,5 89,4 73,1

(Trp)Leu26 -Leu645

0 0 0 0

(Leu)Val27 – Leu645

0 0 0 0

(Lys)Gly29 – Leu645

0 5,5 10,6 26,9

(Phe)Thr37 – Leu645

0 0 0 0

(Thr)Se – Leu645r38

0 0 0 0

(Ser)Asp39 – Leu645

0 0 0 0

(Val)Ser41 – Leu645

0 0 0 0

(Ser)Ser42 – Leu645

0 0 0 0

(Tyr)Leu44 – Leu645

0 0 0 0 0

(Lys)Glu51 – Leu645

0 0 0

(Ala)Trp55 – Leu645

0 0 0 0

(Trp)Leu56 – Leu645

0 0 0 0

10 La inactivación individual de ymp2, ymp3 se realizó en SMD1163. Se realizaron inducciones en matraz de agitación con estas cepas defectivas y se obtuvieron muestras de los sobrenadantes control SMD1163 y del cultivo a las 24 horas de la inducción. El patrón de proteína descrito por la SEC ID Nº 1 se incubó con estas muestras a 30 ºC durante 24 horas y se analizó mediante gel de SDS PAGE.

A partir del análisis PAGE, la deleción de ymp3 disminuyó significativamente la escisión del patrón de proteína, pero 15 la deleción de ymp2 tiene menos efecto sobre la proteolisis (Véase la Figura 9).

Tabla 5

Gen

Descripción Huésped Proteasa def. Evaluación

Gen

Descripción Huésped Proteasa def. Evaluación

PEP4

Aspartil proteasa X-33 pep4 Proteolisis heteróloga reducida

PRB1

Serín proteasa X-33 pep4 pep4.prbl Proteolisis heteróloga reducida

YPS1

Aspartil proteasa X-33 pep4 pep4, ysp1 Proteolisis heteróloga reducida

YPS2

Aspartil proteasa secretada SMD1163 pep4, prb1, yps2 Proteolisis heteróloga reducida

YMP1 (SEC ID Nº 4)

Serín proteasa secretada SMD1163 pep4, prb1, ymp1 Proteolisis heteróloga reducida

DAP2

Endoproteasa de tipo DPP IV SMD1163 pep4, prb1, dap2 Sin cambios en la proteolisis

GRH1

Serín proteasa SMD1163 clon6 pep4, prb1, grh1 Sin cambios en la proteolisis

PRD1

metaloendopeptasa SMD1163 c16 [PDI] pep4, prb1, prd1 Sin cambios en la proteolisis

YSP3

Serín proteasa secretada SMD1163 c16 [PDI] pep4, prb1, vsp3 Sin cambios en la proteolisis

PRB2

Serín proteasa de tipo Prb1 SMID1163 c16 [PDI] pep4, prb1, prb2 =

PRB3

Serín proteasa de tipo Prb1 SMD1163 clon6 pep4, prb1, prb3 Sin cambios en la proteolisis

YMP2 (SEC ID Nº 6)

De tipo Arg/Ala aminopeptidasa SMD1163 pep4, prb1, ymp2 Reducción moderada de la proteolisis heteróloga

YMP3 (SEC ID Nº 8)

De tipo Leu aminopeptidasa SMD1163 pep4, prb1, ymp3 Proteolisis heteróloga reducida

PPC1 (SEC ID Nº 10)

Carboxipeptidasa de tipo CPY SMD1163 cl6 pep4, prb1, ppc1 =

PPC2 (SEC ID Nº 12)

Carboxipeptidasa de tipo CPY SMD1163 c16 pep4, prb1, ppc2 =

PPB1 (SEC ID Nº 14)

De tipo proteasa B vacuolar SMD1163 cl6 pep4, prb1, ppb1 =

Aquí se identifican seis polipéptidos, Pep4, Prb1, Yps1, Yps2 y los recién descubiertos Ymp1, Ymp3, en Pichia que son responsables de la degradación del polipéptido heterólogo (SEC ID Nº 1). La inactivación genética de estos genes puede mejorar significativamente la productividad de la expresión de la proteína heteróloga.

Ejemplo 4 Manosiltransferasas defectivas

Cuando el polipéptido heterólogo (SEC ID Nº 1) producido a partir de la cepa de Pichia de tipo salvaje GS 115 se analizó mediante CL / EM se observaron múltiples isoformas de masa incrementada de 162 Da. Un análisis adicional usando digestión con varias enzimas y CL / EM demostró que la glicosilación se producía en el resto HSA, y los

resultados se confirmaron usando secuenciación de Edman y análisis de la composición de hidratos de carbono (datos no mostrados). El análisis de la composición de hidratos de carbono confirmó que estas modificaciones se debían a la glicosilación con O-manosa, que es una modificación postraduccional frecuente de las proteínas producidas en Pichia pastoris.

5 Las cepas defectivas en manosiltransferasa de Pichia se realizaron utilizando los mismos procedimientos descritos en el Ejemplo 2 para las proteasas defectivas. Es decir, se insertó un casete de expresión KanMX en uno de estos genes responsables de la glicosilación en levadura: OCH1, PMT1, PMT2, y PMT4. Las cepas defectivas se transformaron con un vector capaz de expresar la SEC ID Nº 1. Los cambios fenotípicos de estas cepas defectivas se demostraron usando el ensayo de sensibilidad zimoliasa (Figura 10). En este experimento, el cultivo de levadura

10 en crecimiento exponencial se diluyó hasta DO600 = 0,3 en YPD suplementado con 5U / ml de zimoliasa. Los cultivos se incubaron a temperatura ambiente con agitación suave. Se recogieron muestras cada 15 minutos durante 2 horas y la medición de la DO600 se realizó como un indicador de la muerte celular.

Los genes de la manosiltransferasa son esenciales para la integridad de la pared celular completa. Las cepas defectivas en pmt1 y pmt4 pueden tener paredes celulares parciales o incompletas, que pueden resultar en una

15 mayor sensibilidad al tratamiento con zimoliasa. Los datos mostraron que las mutantes pmt1 y pmt4 murieron rápidamente con el tratamiento con zimoliasa.

La proteína heteróloga se evaluó para determinar la glicosilación comparando la producción heteróloga en cepas modificadas genéticamente con cepas de tipo salvaje. El resumen de los resultados para las cepas defectivas se presentan en la Tabla 6 a continuación. Asimismo, véase la Figura 11. Los resultados mostraron que Pmt4 es el

20 único responsable de la glicosilación de HSA en Pichia. Una cepa defectiva solo en pmt4 puede producir HSA humana sin glicosilar.

Tabla 6

Gen

Descripción Huésped Proteasa def. Evaluación

OCH1

manosiltransferasa SMD1163 pep4, prb1, och1 sin cambios en la glicosilación

PMT1

manosiltransferasa SMD1163 pep4, prb1, pmt1 sin cambios en la glicosilación

PMT2

manosiltransferasa SMD1163 pep4, prb1, pmt2 ausencia de inactivación limpia

PMT4

manosiltransferasa SMD1163 pep4, prb1, pmt4 sin glicosilación

Ejemplo 5 – Coexpresión con proteínas chaperonas

25 Varias proteínas chaperonas pudieron coexpresarse con la proteína heteróloga en una célula huésped para aumentar la producción de proteínas heterólogas. Ejemplos de proteínas chaperonas que pueden coexpresarse con la proteína heteróloga en levaduras para aumentar la producción heteróloga se presentan en la Tabla 7 a continuación.

Tabla 7

GEN

Nombre de la proteína Especie de origen

HAC1

Factor de transcripción bZip S. cerevisiae

KAR2

Proteína de unión BiP S. cerevisiae

EUG

Homólogo de PDI S. cerevisiae

JEM1

Proteína de tipo DnaJ de la membrana del RE 1 Pichia y S. cerevisiae

CUP5

Subunidad proteolipídica de la V-ATPasa Pichia y S. cerevisiae

KIN2

serina/treonina proteína quinasa Pichia y S. cerevisiae

SSA4

Proteína del shock térmico Pichia y S. cerevisiae

SSE1

Proteína del shock térmico Pichia y S. cerevisiae

Listado de secuencias

<110> JIN, Yong Hwan JOWETT, James D.

5 TAYLOR, Alexander H. ZHU, Yuan

<120> Células huésped y procedimientos de uso

10 <130> PU63510

<140> tbd

<141> 2010-02-24

15 <150> 61.155.706

<151> 2009-02-26

<160> 15

20 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 645 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Homo Sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 31 5 <212> PRT

<213> Homo Sapiens

<220>

<221> VARIANTE 10 <222> 31

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 2

<210> 3

<211> 5115

<212> ADN 20 <213> Pichia Pastoris

<400> 3

<210> 4

<211> 1703

<212> PRT

<213> Pichia Pastoris

<400> 4

<210> 5

<211> 618

<212> ADN

<213> Pichia Pastoris

<400> 5

<210> 6

<211> 205 15 <212> PRT

<213> Pichia Pastoris

<400> 6

<210> 7 5 <211> 1233

<212> ADN

<213> Pichia Pastoris

<400> 7 10

<210> 8 5 <211> 410

<212> PRT

<213> Pichia Pastoris

<400> 8 10

<210> 9

<211> 1605

<212> ADN

<213> Pichia Pastoris

<400> 9

<210> 10

<211> 534

<212> PRT

<213> Pichia Pastoris

<400> 10

<210> 11

<211> 1356

<212> ADN

<213> Pichia Pastoris

<400> 11

<210> 12 10 <211> 451

<212> PRT

<213> Pichia Pastoris

<400> 12 15

<210> 13

<211> 1680

<212> ADN

<213> Pichia Pastoris

<400> 13

5 <210> 14

<211> 559

<212> PRT

<213> Pichia Pastoris

10 <400> 14

<210> 15

<211> 865

<212> PRT

<213> Pichia Pastoris

<400> 15

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una cepa de Pichia modificada genéticamente, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica:

   (i)

   PEP4, PRB1 y YMP1,

   (ii)

   PEP4, PRB1 y YMP2, o

   (iii) PEP4, PRB1 y YMP3

   es modificada genéticamente para producir deficiencia de proteasa de al menos tres de las siguientes enzimas y/o tipo de enzima: aminopeptidasa de tipo Arg / Ala, aspartil proteasa, serín proteasa, serín proteasa secretada, serín proteasa Prb 1, aminopeptidasa de tipo Leu, en comparación con la cepa de tipo salvaje.

2. 2.

   La cepa de Pichia modificada genéticamente de la reivindicación 1, en la que dicha cepa de Pichia modificada genéticamente es una forma modificada genéticamente de X-33 o SMD1163 de tipo salvaje.

3. 3.

   La cepa de Pichia modificada genéticamente de la reivindicación 1 o 2, en la que dicha cepa de Pichia modificada genéticamente es una forma modificada genéticamente de Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta (Ogataea minute, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia sp. de tipo salvaje.

4. 4.

   La cepa de Pichia modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el genoma de una cepa de tipo salvaje de dicha Pichia comprende un gen que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con un gen seleccionado de las SEC ID Nº 3, 5, 7 y en la que cuando dicho gen que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con las SEC ID Nº 3, 5 y 7 se deleciona, muta o rompe, dicha cepa de Pichia modificada genéticamente produce menos producto génico de dicho gen alterado que dicha cepa de tipo salvaje.

5. 5.

   La cepa modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifican al menos uno del producto génico funcional siguiente o expresión de dicho producto génico está modificado genéticamente: SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 6, y/o SEC ID Nº 8.

6. 6.

   La cepa de Pichia modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además al menos un polinucleótido capaz de expresar al menos un polipéptido heterólogo.

7. 7.

   La cepa de Pichia modificada genéticamente de la reivindicación 6, en la que dicho polinucleótido capaz de expresar al menos un polipéptido heterólogo es un vector y/o expresión episomal de un plásmido.

8. 8.

   La Pichia modificada genéticamente de la reivindicación 7, en la que dicho polinucleótido capaz de expresar al menos un polipéptido heterólogo es transformada en el genoma de la Pichia.

9. 9.

   La Pichia modificada genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 en la que dicho al menos un polipéptido heterólogo comprende al menos un agonista de GLP-1; o uno o más de los siguientes: al menos una proteína de unión a antígeno, al menos un dominio variable sencillo, y/o al menos un anticuerpo de dominio.

10. 10.

    La Pichia modificada genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que el al menos un polipéptido heterólogo tiene al menos una actividad de GLP-1.

11. 11.

    La Pichia modificada genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que el al menos un polipéptido heterólogo comprende al menos un fragmento y/o variante de GLP-1 humano fusionado con seroalbúmina humana.

12. 12.

    La cepa de Pichia modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la que dicha cepa muestra una proteolisis reducida de dicho al menos un polipéptido heterólogo en dicha cepa en comparación con Pichia de tipo salvaje.

13. 13.

    La cepa de Pichia modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en la que dicha cepa muestra una glicosilación reducida o ausencia de glicosilación de dicho al menos un polipéptido heterólogo en dicha cepa en comparación con Pichia de tipo salvaje.

14. 14.

    Un procedimiento de producción de un polipéptido heterólogo que comprende expresar dicho polipéptido heterólogo en una Pichia modificada genéticamente como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

    Las bandas 1 y 2 se escindieron del gel, se redujeron, alquilaron y digirieron con tripsina in situ. Los péptidos trípticos de cada banda se analizaron mediante espectrometría de masas en tándem -cromatografía líquida. Se realizó una búsqueda de los datos de la secuencia no interpretados frente a la base de datos de contig-péptido de Pichia (Integrated Genetics) utilizando software de identificación de proteínas Mascot.