KR100726716B1 - 재조합 인체 혈소판 유래 성장인자（ｐｄｇｆ―ｂｂ）를고효율로 생산·분비하는 균주 및 분비촉진 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 생산이 어려운 난발현성 단백질의 하나인 인체 혈소판 유래 성장인자(PDGF)의 발현 및 생산효율을 증대시키는 방법에 관한 것이다. 즉, 당뇨병 환자의 족부궤양 등 상처 치료제로 사용되는 PDGF의 효모발현 시스템을 이용한 생산 시 단백질 접힘과 세포외 발현을 돕는 트랜스형 분비인자를 발굴하고 궁극적으로 PDGF 생산성 증가를 목적으로 하였다.

본 발명을 이용할 경우 생산 비용의 절감이 가능할 뿐만 아니라 다양한 고부가가치의 단백질 제품에 대한 고효율 분비 체계 확립이 가능하며 경쟁력 있는 바이오제네릭 제품이 될 것이다.

혈소판 유래 성장인자(PDGF), 재조합 단백질 효모발현 시스템, 단백질 접힘, 분비인자

Description

재조합 인체 혈소판 유래 성장인자（ＰＤＧＦ―ＢＢ）를 고효율로 생산·분비하는 균주 및 분비촉진 단백질{A New Strain Highly Producing PDGF-BB, and a Secretive Protein for the Strain}

도 1은 본 발명에 의한 효모 형질전환체를 제작하는 과정을 보여주는 개략 흐름도.

도 2는 인간의 각 조직 유래 cDNA library와 HELA 세포 library를 기질로 하여 PDGF-B 유전자를 PCR 기법으로 증폭한 전기영동 사진.

도 3은 증폭한 PDGF 유전자를 기질로 하여 PCR 기법을 이용해 PDGF-B 성숙 유전자만을 다시 증폭한 결과의 전기영동 사진.

도 4는 효모 발현 벡터인 YEGα-HIR525에 PDGF-B(WM) 유전자를 클로닝여 제조한 pYGMF-PB 벡터 지도.

도 5는 pYGMF-PB 형질전환 효모에 의해 생산된 PDGF-B이 효모의 체내에서 분비되지 않음을 보여주는 SDS-PAGE 결과 사진.

도 6는 pYGMF-PB 형질전환 효모의 PDGF-B 유전자 발현을 보여주는 SDS-PAGE 결과 사진.

도 7은 PDGF-BB 단량이량체의 발현 차이를 확인하기 위하여 마우스 항-인간 PDGF 항체, 염소 항-마우스 IgG-AP를 이용한 웨스턴 블러팅 결과 사진.

도 8은 형질전환체의 PDGF-BB 발현·분리량의 정성분석 결과사진.

도 9는 본 발명에 의한 이중 형질전환체 Y2805△ gal1 /pYGMF-PB/pS-17 균주의 PDGF-BB 생산시험 결과를 보여주는 그래프.

본 발명은 재조합 생산이 어려운 인체 유래 단백질인 PDGF(혈소판 유래 성장인자; Platelet-derived growth factor)-B 단종이량체를 효모 발현시스템을 이용해 생산 시 그 생산성을 증가시킬 수 있는 최적분비인자를 발굴하는 방법과 분비인자를 이용한 생산성 증가에 관한 것이다.

효모 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)는 주류나 제빵산업용 외에도 여러 유용물질인 단백질, 핵산, 효소, 지질, 비타민, 미네랄 등의 원료로 사용되는 인체에 무해한 GRAS(Generally Recognized As Safe)급의 미생물이며 (Roman 등, Food Biotechnology,1992,6:225) 유전자 조작의 용이성과 발현벡터 등 관련 외래 단백질, 특히 인간유래 단백질처럼 고등세포 유래 단백질을 생산을 위한 제반 시스템이 잘 구축되어있다. 또한 고등세포와 유사한 단백질 분비기능과 당쇄 부가 기능 및 해독 후 수식 기능을 수행할 수 있는 장점을 가지고 있어 대장 균을 통한 재조합 단백질 생산이 곤란한 고등세포 유래 단백질의 발현 및 생산에 주로 이용되는 미생물이다.

PDGF-A 유전자는 7번 염색체에 한정되어 위치하며 PDGF-B 유전자와 아미노산 서열의 동일성은 56%이다. PDGF에는 PDGF-A와 PDGF-B 체인에 의해서 세 가지 이량체 형태인 PDGF-AA, PDGF-AB 그리고 PDGF-BB로 존재하며(Hammacher 등, J.Biol.Chem, 1988, 263) PDGF가 합성되고 유리되는 근원은 혈소판으로 알려져 있으나 현재 다양한 세포에서 유리 되고 있다(Canalis등, Academic Press Inc. U.S.A. 1996). 최근 PDGF-C 체인과 D 체인에 대한 보고가 있으며 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Heldin 등, Arch. Biochem. Biophys, 2002, 398:2). PDGF는 등전점이 9.8이며 분자량 30kDa의 조절성 단백질로서 생물학적 기능은 민무늬근육세포 및 섬유모세포의 분열과 분화를 유도하고, 생리학적으로 조직손상의 복구, 염증, 종양형성 등에 관여하는 것으로 알려지고 있다 (Heldin과 Westermark, ,Cell. regul., 1, 1990 ;Bowen-Pope 등, Trends Genetics, 7,1991).임상학적으로는 화상으로 창상치유, 당뇨성 족부 궤양 치료에 효과가 탁월한 것으로 알려져 있으며 상처 치유에 관여하는 여러 성장인자들 중 PDGF만이 in vivo에서 상처 치유를 증대하는 것으로 확인되었다. 서로 다른 PDGF 이성질체중 가장 강력한 이성질체는 PDGF-BB 단종이량체로 알려져 있으며 PDGF-BB(82-190 아미노산)가 세포 표면에서 공통적으로 발현 되었으므로 만성 상처치료에 집중적으로 이용되었다(J. Trauma, 1996, 41, Science, 1988, 240). 현재 PDGF gel은 becaplermin(상품명 Regranex) 제품이 전량 수입되어 판매되고 있으며 37만원/15g(PDGF 함량 0.01%)에 판매되는 고가의 제품이다. 국내에서는 대웅제약의 EGF(Epidermal growth factor) 스프레이가 유일하나 족부 궤양 치료에 있어서는 PDGF가 전세계적으로 효과가 검증되어 있다. 이러한 산업적 중요성 때문에 PDGF의 생산성 향상에 많은 관심이 모아지고 있으나 그 생산량은 극히 미미한 실정이다. 사카로마이세스 세레비시에에서 PDGF-BB를 발현 분비형으로 제조하였으나 배양 후에도 대부분 세포내에 존재하였고 Arg³²에 부분적인 단백질 분해가 일어났다(US 4,769,328,1999). 이러한 분해를 막기 위해 R28S와 R32P로 치환한 결과 야생형에 비해 발현양도 증가하고 생물학적 활성도 약간 증가하였으나 여전히 분비가 잘 되지 않았다. 현재까지 사카로마이세스 세레비시에에서 재조합 단백질의 분비능을 증진시키기 위해 다양한 분비인자 연구가 진행되고 있는데 크게 소포체에서 새로 합성된 단백질 접힘을 돕는 트랜스형 샤페론 연구와 과 발현된 단백질이 소포체에서 서로 응집되는 것을 막기 위한 시스형 단백질 융합인자 연구로 나눌 수 있다. 효모에서 분비 단백질의 분비 및 성숙과정을 돕는 단백질로 폴데이즈(Foldase)와 샤페론이 있는데 정상적인 세포의 배양에서는 이러한 매개 단백질이 부족하지 않으나 재조합 균주의 경우 외래 단백질을 대량 발현하기 때문에 매개단백질이 일종의 병목(bottle-neck)이 될 가능성이 있으므로 재조합 단백질의 분비를 향상시키는 숙주공학으로 단백질 접힘을 매개하는 폴데이즈와 샤페론의 과 발현 방법이 표 1에서와 같이 알려져 있다.

샤페론은 단백질이 제대로 3차구조를 갖도록 접히는데 문제가 있을 경우 미성숙 단백질에 결합할 뿐만 아니라 추가적인 샤페론과 폴데이즈의 발현을 유도하는 세포내의 정상적 과정으로서 외래단백질을 발현 할 때도 적용된다. 외래단백질 생산시 단백질이 제대로 접히지 않을 경우 단백질의 생산성을 낮추며 경우에 따라서 이러한 문제가 샤페론과 같은 세포내의 helper 단백질을 과 발현함으로서 해결된 예가 많이 보고되고 있다. 그러나 목표 단백질의 종류에 따라서 효과가 없거나 오히려 역효과가 나타난 예도 표 2와 같이 다수 보고되었다.

그러므로 위 서술한 바와 같이 단백질의 분비촉진을 위해 개발된 샤페론의 효과가 단백질의 종류에 따라서 상이한 결과를 나타냄을 알 수 있다. 이러한 문제는 현재까지 전통생리학을 근거로 개발된 기존 단백질 분비 생산시스템이 모든 단백질에 대해 범용으로 적용하지 못하기 때문이며 기존 시스템만으로는 전혀 재조합 생산이 불가능한 단백질이 다수 있기 때문에 이를 효율적으로 해결하기 위해서는 기존의 일률적 효모 재조합 단백질 분비시스템을 획기적으로 개선할 수 있도록 목표 단백질의 구조 및 특성에 따른 맞춤형(tailer-made) 샤페론등의 분비인자 개발이 절대적으로 필요하다. 아직까지 PDGF-BB 단종이량체를 효과적으로 생산하는데 도움을 주는 분비인자에 대한 실험 확인, 분석 보고한 예는 없다.

이에 본 발명자들 PDGF-BB 단종이량체 생산에 도움을 주는 샤페론등의 맞춤형 분비인자를 인간 유전체로부터 검출하여 그 효과를 증명하였다.

본 발명은 효모를 이용하여 인체 단백질의 일종인 PDGF 분비인자를 이용하여 과 발현 분비시스템을 개발하는 것을 목적으로 한다. 또 한 가지 재조합 단백질의 과량 생산을 위한 효모 분비 시스템을 확립하여 목적 단백질을 구조와 특성에 맞게 발현시키고 비용 절감을 통해 산업화에 응용할 수 있도록 하는 기술력 확보를 목적으로 한다. 목표단백질에 적합한 분비 시스템을 개발하는 경우 생산 비용 절감이 크며 본 연구에서 대상으로 하는 고부가가치의 인체 혈소판 성장 인자의 대량 분비 시스템 개발 뿐 아니라 다양한 고부가 가치의 단백질 제품이 고효율 분비 체계 확립이 가능하며 국내 자체 기술로 인해 인체 의약용 재조합 단백질의 고 분비시스템 개발과 각 분비융합 인자에 대한 지적 재산권 획득이 가능하게 된다. 또한 효모를 이용한 대량 생산 발현 및 분비시스템을 이용하여 다양한 생명체의 게놈프로젝트에서 확보된 유전체 염기서열 및 단백질 소재의 구조나 기능 분석뿐만 아니라 향후의 의약적, 산업적으로 중요한 제품의 대량 생산을 위해 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

본 발명은 PDGF-B를 고효율로 생산할 수 있는 균주 개발을 위해 단백질 분비과정에 관여하는 다양한 분비인자를 유전자 단위에서 초고속 검색을 통해 발굴하고 최적화함으로써 혁신적인 분비시스템을 개발하고자 하였다.

먼저 기존에 알려져 있던 인간의 PDGF 염기서열을 바탕으로 하여 프라이머(Primer)를 제작하고 PDGF가 많이 발현되는 조직을 찾고자 여러 조직의 cDNA library를 이용하여 PCR 을 수행하였다. 그 결과 신장의 cDNA library에서 PDGF 유전자를 얻을 수 있었다. 이렇게 분리한 PDGF 유전자를 주형으로 PDGF-B 성숙 유전자인 PDGF-B(WM) 유전자를 다시 증폭하여 효모 발현벡터인 YEGα-HIR525(Galactose-induced secretion vector, Choi 등, Appl,. Microbiol. Biotechnol., 1994, 42)에 클로닝(cloning) 하였고 클로닝 유무는 플라스미드 DNA을 추출한 후 염기서열 결정으로 확인하였다. 이렇게 제조된 재조합체는 pYGMF-PB로 명명하였고 이를 효모 숙주세포인 Y2805△gal1 균주에 형질전환 시키고 형질전환의 유무 역시 플라스미드 DNA 추출과 염기서열 결정을 통해 확인하였다. 비록 벡터 내 교배인자 알파 분비시그널(MFα leader)을 함유하고 있었지만 예상처럼 PDGF-BB는 세포 외(extra-cellular) 분비가 잘 되지 않았다. 효모 발현 시스템의 경우 인체 유전자를 효과적으로 발현시킬 수 있는 장점이 있으나 단백질의 종류나 특성에 따라서 엄청난 분비 생산성의 차이를 나타내므로 목표 단백질의 특성에 따른 맞춤형 발현 및 분비 시스템의 도입이 절대적으로 필요하였다. 그래서 인체 PDGF-BB 발현을 증가시킬 수 있는 트랜스 샤페론(Trans-chaperone)과 같은 분비인자를 도입하였다. PDGF-BB의 발현을 증가시킬 수 있는 샤페론 등 분비인자 탐색 및 검출은 인체 신장 cDNA library를 이용하였다. 효모 Y2805△gal1 /pYGMF-PB 균주에 클론텍사에서 구매한 cDNA library를 같이 형질전환 시킨 후 나온 형질전환체(transformant)는 배양하여 dot blot과 효소면역법(enzyme-linked immunosorbent assay)을 통하여 형질전환 여부를 확인하고, 이는 다시 실험의 재연성을 확인한 후 PDGF와 같이 발현시키는 경우 기존의 PDGF-BB를 단독 발현시키는 것보다 발현 양을 증가시킬 수 있었다. 본 발명의 전체적 흐름을 도 1에 나타내었다.

한편 단백질 PDGF-B를 생산한다는 것은 그의 단종이량체인 PDGF-BB를 생산한다는 것과 같은 의미이므로 이하에서는 편의에 따라 PDGF-B와 PDGF-BB를 혼용하여 표현한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 예시적으로 열거한 것일 뿐 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 범위나 내용이 변경되거나 축소되는 것은 아니다.

실시예 1 : 인체 cDNA library로부터 PDGF-B(WM) 유전자의 분리 및 발현벡터의 제조

(1) PDGF-B(WM) 유전자의 분리

PDGF가 많이 발현되는 조직을 알아보기 위해 인간의 뇌, 간, 신장조직 cDNA library와 세포주의 일종인 HELA 세포 library로를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR에 사용한 primer는 FPDGF(5'-ATGAATCGCTGCTGGGCGCTCTTC-3'; 서열번호 1)와 RPDGF(5'-CTAGGCTCCAAGGGTCTCCTTCAG-3'; 서열번호 2)를 이용하여 95℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃에서 30초로 30 cycle 반복하였다. PCR 산물을 통상의 방법으 로 전기영동 하여 밴드를 확인하였다(도 2). 도에서 레인 M은 크기 표시자(size marker; 이하 동일함), 레인 1은 인간의 뇌 유래 cDNA library, 레인 2는 인간의 간 유래 cDNA library, 레인 3은 인간의 신장 유래 cDNA library, 레인 4는 HELA 세포 유래 cDNA library이다. 도에서 볼 수 있듯이, 인간의 신장 유래 cDNA library에서 PDGF-B 유전자가 발현됨을 확인하였다.

아가로스겔 추출 키트(Solgent Co. Ltd)을 이용하여 전기영동 결과 아가로스 겔에서 인간의 신장 유래 cDNA library의 PDGF-B 유전자를 추출하였다. 획득한 DNA를 pGEM T-easy 클로닝 벡터에 16℃, 4시간 동안 ligation한 후 대장균 DH5α균주에 형질전환하여 획득한 대장균 군락 중 5개 콜로니를 무작위로 선별하여 서열번호 1 및 2로 된 프라이머 세트를 이용하여 PCR기법으로 증폭한 후 전기영동하여 클로닝 여부를 확인하였다. PDGF-B 유전자가 도입된 상기 재조합체를 pPDGF-WF라 명명하였다. pPDGF-WF를 주형으로 프라이머 FPDMF(5'-AAT TCT AGA ATG AAT CGC TGC TGG GCG CTC TTC-3'; 서열번호 3)와 RPDMF(5'-AAT GTC GAC CTA GGC TCC AAG GGT CTC CTT CAG-3'; 서열번호 4)를 이용해 PCR 기법으로 증폭한 성숙 PDGF-B 유전자 산물(도 3 참조)은 PDGF-B(WM)라 명명하고, 염기서열을 분석하였다(서열번호 5). 도 3은 증폭한 PDGF 유전자를 기질로 하여 PCR 기술을 이용해 PDGF-B 성숙유전자만을 다시 증폭한 결과로 증폭된 유전자 산물은 PDGF-B(WM:Wild mature)이라 명명하였다. 도에서 레인 1은 인체유래 PDGF-B 유전자로 형질전환된 대장균 DH5α균주 유래의 DNA를 의미한다.

(2) PDGF-B(WM) 유전자 발현벡터의 제조

PDGF-B(WM) 클로닝을 위해 먼저 효모 발현벡터인 YEGα-HIR525 벡터를 30㎕, 10X BSA 6㎕, buffer 6㎕, BamHⅠ3㎕, SalⅠ3㎕을 넣고 최종 부피를 60㎕로 맞춘 후 37℃에서 5시간 동안 반응시키고 전기영동 하였다. 전기영동을 하여 얻은 약 5.6kb fragment와 GAL10 프로모터와 교배인자 알파 분비시그널를 함유한 약 980bp fragment을 각각 겔에서 추출 정제하여 DNA을 확보하였다. 이 중 980bp fragment DNA을 20㎕, Buffer 6㎕, XbaⅠ 6㎕, 10X BSA 6㎕ 넣고 최종 부피를 60㎕로 맞춘 후 37℃에서 5시간 반응하고 전기영동 하였다. 여기에서 약 760bp fragment을 겔에서 추출, 정제하여 DNA을 확보하였다. PCR 증폭한 PDGF-B(WM) DNA을 30㎕, buffer 6㎕, SalⅠ 3㎕, XbaⅠ 3㎕, 10X BSA 6㎕을 넣고 최종 부피를 60㎕로 맞춘 후 37℃에서 5시간 반응하고 전기영동 하였다. 그 후 약 300bp 위치에 있는 fragment을 겔에서 추출, 정제하여 DNA을 확보하였다.

이렇게 준비한 5.6kb, 760bp, 300bp의 DNA fragment을 three-pieces ligation 하였다. 각각의 DNA와 ligation buffer 3㎕, T4 DNA ligase 3㎕을 넣고 최종 volume을 30㎕으로 맞춘 후 16℃에서 16시간 동안 반응하였다.

반응이 완료된 Ligation mixture를 대장균 DH5α competent cell과 섞어준 후 electroporation하고 LB(1% NaCl, 1% tryptone, 0.5% yeast extract)와 섞어서 37℃에서 1시간 배양 후 암피실린이 첨가된 LB plate에 스프레딩 하여 콜로니를 확보하였다. 이렇게 확보한 콜로니를 무작위로 선별하여 플라스미드 DNA 분리 후 염기서열 결정하여 PDGF-B(WM) 유전자 클로닝을 확인하였고 이를 pYGMF-PB로 명명하 였다. 발현벡터 pYGMF-PB의 주요부 맵을 도 4에 나타내었다.

실시예 2 : 효모 Y2805 △gal1 를 숙주로 이용한 PDGF-BB 단백질의 발현 실험

(1) 형질전환 효모의 제작

Y2805△gal1 competent cell만을 만들기 위해 Y2805△gal1 단일 콜로니를 YPD(2% pepton, 1% yeast extract) 3ml에 접종한 후 30℃에서 밤새 배양하였다. 밤새 배양한 종 배양액을 YPD 50㎖에 1% 접종한 후 OD₆₀₀값이 0.4~0.6정도 되도록 30℃에서 배양하고 3000 rpm, 5분간 원심분리 하였다. 여기에 1X TE/LiAc 25ml을 넣고 현탁한 후 3000 rpm, 5분간 원심분리 한 후 pellet을 다시 1X TE/LiAc 500㎕에 현탁하고 100㎕씩 분주하여 4℃에 보관하였다.

pYGMF-PB 플라스미드 DNA 10㎕, Competent cell 100㎕, Salmon sperm DNA 10㎕, PEG/LiAc 600㎕을 섞어준 후 30℃에서 30분간 반응하고 DMSO 70㎕을 넣고 42℃에서 15분간 heat-shock하였다. 3000 rpm, 5분간 원심분리 후 증류수 200㎕에 현탁하여 Ura- plate에 도말하고 30℃에서 2~3일간 배양하여 형질전환체를 확보하였다.

(2) PDGF-BB 단백질의 발현 분석

형질전환된 콜로니를 무작위 선별한 후 YPDG(2% pepton, 1% yeast extract, 1% galactose)배지에 접종하여 48시간 동안 배양한 후 세포파쇄 추출물과 배양상등액으로 나누어 실험하였다. 세포파쇄 추출물 준비는 배양한 cell을 OD값 측정을 하 여 세포 양을 맞춘 후 원심분리하고 Tris/PMSF 100㎕을 넣고 교반하였다. 12000 rpm, 5분간 원심분리 한 후 상등액을 제거하고 여기에 Tris/PMSF 30㎕을 넣고 동량의 glass beads을 넣어 교반하였다. 여기에 다시 Tris/PMSF 200㎕을 넣고 12000 rpm, 5분간 원심분리 한 후 상등액을 5X sample buffer와 섞어 변성시켜 SDS-PAGE을 수행하였다(도 5). 도 5에서 레인 1~4는 각각 효모 Y2805△gal1 배양 상등액, 효모 Y2805△gal1 /YEGα-HIR525 배양 상등액, 효모 Y2805△gal1 /pYGMF-PB 배양 상등액 및 효모 Y2805△gal1 /pYGMF-PB 세포파쇄 추출액을 나타낸다.

도 5에서 확인된 밴드가 PDGF-B(WM) 단백질에 의한 것인지를 면역반응법을 통해 다시 한번 확인하였다. 이를 위해 마우스 항-인간 PDGF 항체, 염소 항-마우스 IgG-AP를 이용하여 웨스턴 블러팅 기술을 이용해 PDGF-BB 단량이량체의 발현 차이를 분석하였다.

배양 상등액은 브레드포드 방법을 이용해 단백질 정량 하고 동량의 100% Cold Acetone을 넣고 ice에 30분간 방치하였다. 그런 후 4℃, 13000 rpm에서 15분간 원심분리하고 pellet을 70% EtOH로 세척하고 1X PBS에 현탁하여 농축하였다. 세포파쇄 추출물과 마찬가지로 5X sample buffer와 섞어 변성시켜 SDS-PAGE을 수행하였다. SDS-PAGE 겔에 전개 후 coomassie blue로 염색하여 band을 확인하고 NC(Nitrocellulose) membrane에 transfer Membrane에 Blocking solution(5% skim milk in 1X TBS)을 넣은 후 상온에서 2시간 동안 blocking 시켰다. Blocking solution을 제거한 후 Blocking solution에 녹인 primary antibody (Mouse Anti-PDGF, monoclonal)을 1:2000의 배율로 넣고 4℃에서 밤새 shaking incubation 하였 다. 밤새 shaking incubation한 membrane을 TTBS(0.05% Tween 20 in 1X TBS)로 10분씩 3번 washing후 Secondary antibody (Anti-mouse IgG)을 1:4000의 배율로 넣고 상온에서 2시간 동안 shaking incubation 하였다. Membrane을 TTBS로 washing한 후 Detection buffer에 NBT, BCIP을 넣고 암소에서 발색하였다. Anti-human PDGF antibody을 이용하여 Western blotting을 함으로써 PDGF-BB 발현양의 차이를 확인하였다(도 6). 도에서 각 레인은 도 5와 동일하다.

실시예 3 : PDGF-BB 발현·분비를 증가시키는 새로운 분비인자 탐색

(1) 분비인자 탐색을 위한 이중 형질전환체의 제작

PDGF의 발현을 증가시킬 수 있는 분비인자 선별을 하기 위해서 먼저 인간 PDGF을 분리한 조직이며 Mesodermal 유래 조직인 인간 신장 cDNA library(Cat. HL4043AH)을 클론텍사에서 구입하여 실험하였다. 상기 cDNA library는 pACT2 vector에 EcoRⅠ/XhoⅠ site에 클로닝 되어있으며 insert size는 0.5-4.0kb이다. 이하에서는 설명의 편의를 위해, 인간 신장 cDNA library가 도입되어 있지 않은 빈 벡터를 pACT2-로, 인간 신장 cDNA library가 도입되어 있는 벡터를 pACT2로 표시한다.

cDNA library를 대장균 DH5α에 형질전환하여 암피실린이 첨가된 LB plate에 serial dilution하여 도말한 후 적절한 희석 배수를 결정하고 이에 근거하여 다시 도말하여 형질전환체를 대량 확보 후 이로부터 플라스미드 DNA을 회수 하였다.

ura 유전자가 존재하는 YEGα-HIR525 벡터에 클로닝 되어있는 PDGF-B(WM) 즉pYGMF-PB와 leu2 유전자가 존재하는 pACT2 vector에 클로닝 되어 있는 human kidney cDNA library 두 종류를 한번에 선별할 수 있는 Y2805△gal1 (Ura, Leu auxotroph)을 숙주세포로 이용하여 형질전환을 수행하였다. 효모 Y2805△gal1 /pYGMF-PB 균주의 competent cell은 위에서 언급한 방법으로 동일하게 준비하였다.

인간 신장 cDNA library 10㎕, 효모 Y2805△gal1 /pYGMF-PB 균주의 competent cell 100㎕, Salmon sperm DNA 10㎕, PEG/LiAc 600㎕을 섞어준 후 30℃에서 30분간 방치하고 DMSO 70㎕을 넣고 42℃에서 15분간 heat-shock하였다. 3000 rpm, 5분간 원심분리 후 증류수 200㎕에 현탁하여 YG(YNB & Glucose, UL-) plate에 도말하고 30℃에서 2~3일간 배양하여 이중으로 형질전환된 콜로니를 확보하였다.

(2) 이중 형질전환체의 PDGF-BB 발현·분비 정성분석

상기 콜로니를 동일한 조건에서 다량을 배양하기 위해 96 well을 사용하였으며 일반 96 well plate의 경우 효모가 잘 자라지 않으므로 96 deep well plate에 배양하였다. Glass beads을 넣어 멸균시킨 96 deep well plate에 YPDG(1% yeast extract, 2% Peptone, 1% Dextrose, 1% Galactose)배지를 600㎕씩 넣고 형질전환체 각각 한 개씩 접종하였다. 이 때 형질전환체 각각은 다른 YG(YNB & Glucose, UL-) plate에도 같이 picking하여 master cell도 같이 확보하였다. 접종한 형질전환체를 96 deep well plate 배양기(Bioneer Co. Ltd)에 넣고 산소를 공급해주면서 30℃, 400 rpm으로 48시간 배양하였다.

이렇게 배양한 cell을 원심 분리하여 pellet을 제거한 후 NC(Nitrocellulose) membrane을 놓은 Dot blot kit에 50㎕씩 loading 하고 1X TBS 50㎕씩 2번 washing하였다. Membrane을 sealing bag에 넣고 Blocking solution(5% skim milk in 1X TBS)을 넣은 후 상온에서 2시간 동안 blocking 시켰다. Blocking solution을 제거한 후 Blocking solution에 녹인 primary antibody (Mouse Anti-PDGF, monoclonal)을 1:2000의 배율로 넣고 4℃에서 밤새 shaking incubation 하였다. 밤새 shaking incubation한 membrane을 TTBS(0.05% Tween 20 in 1X TBS)로 10분씩 3번 washing후 Secondary antibody (Anti-mouse IgG)을 1:4000의 배율로 넣고 상온에서 2시간 동안 교반하며 배양하였다. Membrane을 TTBS로 위와 같은 방법으로 washing한 후 Detection buffer에 NBT, BCIP을 넣고 암소에서 발색하여 단백질 발현·분비량을 정성분석하였다(도 7).

도 7은 Dot blot 기술을 이용해 효모 Y2805△gal1 /pYGMF-PB에서 성숙 PDGF-B(WM)유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 분비인자 1차 검출을 위해 인간의 신장 유래 cDNA library를 효모 Y2805△gal1 /pYGMF-PB에 형질전환하여 PDGF-BB 발현량의 변화를 정성적으로 관찰한 결과이다. 도에서 1번, 2번, 3번은 대조구로써 1번은 효모 Y2805△gal1/pYGMF-PB/pACT2- 이중 형질전환체(인체 신장유래 cDNA가 삽입되지 않은 빈 pACT2로 이중 형질전환된 것)의 배양 상등액, 2번은 효모 Y2805△gal1 /pYGMF-PB 배양 상등액, 3번은 효모 Y2805△gal1 배양 상등액을 나타냈다. 번호를 표기하지 않은 blot들은 효모 Y2805△gal1 /pYGMF-PB에 인체 신장 유래 cDNA가 도입된 pACT2로 이중 형질전환된 형질전환체(Y2805△gal1/pYGMF-PB/pACT2)의 배양 상등액으로 숫자 표시를 생략하였다. 3개의 대조구와 비교하여 강도가 높은 샘플을 1차적으로 선별하였다.

실시예 4 : 이중 형질전환체의 PDGF-BB 발현·분비 정량분석 및 선별

Dot blot을 이용한 1차 탐색에서 PDGF-BB 시그널이 높게 나온 82개 콜로니에 대하여 ELISA 1차 분석을 수행(결과 도시 생략)하였고 master cell을 확인하고 ELISA로 2차 분석하였다. ELISA는 Human PDGF-BB DuoSet ELISA Development system(Cat. DY220, R&D system)에서 구입한 kit을 이용하였다.

이중 형질전환체를 YPDG(yeast extract 1%, Peptone 2%, Dextrose 1%, Galactose 1%) 5ml에 접종 후 30℃, 180 rpm으로 48시간 동안 배양하였다.

ELISA 하기 위해 우선 Coating plate에 Capture reagent(Recombinant human PDGF Rβ)을 희석하여 100㎕씩 넣고 상온에서 밤새 반응하였다. Well에 들어있는 용액을 제거한 후 PBST(0.05% Tween20 in PBS)로 10분간 3번 washing후 blocking solution(1% BSA in PBS)을 넣고 상온에서 한 시간 동안 반응하였다. 그런 후 다시 PBST로 washing하고 여기에 kit 안에 들어있는 PDGF standard와 일정 배수로 희석한 배양 상등액을 동일량 가하고 상온에서 2시간 동안 반응하였다. Well을 PBST로 세척한 후 detection antibody (Goat anti-human PDGF-BB)을 넣고 상온에서 2시간 동안 정체 반응 시킨 후 PBST로 세척하고 여기에 Streptavidin-HRP을 넣은 후 상온, 암소에서 20분간 반응시켰다. PBST로 세척 후 Substrate solution (TMB, SIGMA)을 넣고 상온, 암소에서 20분간 반응시킨 후 stop solution (2N H2SO4)을 넣고 450nm와 540nm에서 파장에서의 흡광도를 측정하였다. 측정오차를 줄이기 위해 450nm에서 측정한 값에서 540nm 측정한 흡광도 값을 뺀 교정 값을 이용하였다. 이러한 방식으로 PDGF-BB 표준품과 함께 ELISA 2차 분석을 3회 실시하여 그 평균값을 구하고 대조구에 비해 PDGF-BB 발현률이 증가한 17개 형질전환체에 S-번호를 부여하였다. 17개 이중 형질전환체 배양 상등액 중의 PDGF-BB 농도를 도 8에 그래프로 나타내었다. 도에서 1번은 효모 Y2805△gal1 배양 상등액, 2번은 효모 Y2805△gal1 /YEGα-HIR525 배양 상등액, 3번은 효모 Y2805△gal1 /pYGMF-PB/pACT2- 배양 상등액이다.

실시예 5 : PDGF-BB 분비인자의 서열분석

(1) 선별된 균주의 분비인자 DNA 증폭

2차 ELISA 결과 PDGF-BB 발현이 가장 좋은 3개 균주(pS-12, 17, 26)를 선택한 후 DNA을 회수하기 위해 YPD(1% yeast extract, 2% Peptone, 2% Dextrose) 3ml에 접종 한 후 밤새 배양하였다. 배양한 cell을 13000 rpm, 10분간 원심 분리하여 상등액을 제거한 다음 STES(0.5M NaCl, 0.2M Tris-HCl (pH7.6), 0.01M EDTA, 1% SDS) buffer 50㎕에 현탁 후 원심분리 하였다. 그런 후 다시 동량의 STES buffer을 넣고 여기에 glass beads을 넣어 5분간 교반하였다. 1X TE와 RNase A(20mg/ml)을 넣고 30℃에서 1시간 동안 반응한 후 여기에 Phenol:Chroloform:Isoamyl alcohol = 25:24:1을 넣고 5분간 교반하였다. 13000 rpm, 10분간 원심 분리한 후 상등액을 새 tube로 옮기고 3M Sodium acetate와 100% EtOH을 이용하여 precipitation을 수행하였다. 그런 후 70% EtOH로 세척하고 건조 후 증류수에 녹이고 전기영동으로 DNA을 확인하였다.

DNA 1㎕, 프라이머 FSCR:5'-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAAC-3'(서열번호 6) 및 RSCR: 5'-TGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGA-3'(서열번호 7), FSCR(10pmol) 2㎕, RSCR(10pmol) 2㎕, 5X PCR premix 4㎕을 넣고 최종 volume을 20㎕로 맞춘 후 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 68℃에서 3분간 총 30 cycle PCR한 다음 전기영동 하여 insert size을 확인하였다. 이 중 3㎕는 형질전환에 사용하였다.

대장균 DH5α competent cell에 앞서 수득한 플라스미드 DNA을 섞어준 후 electroporation 하고 LB에 배양 후 암피실린이 첨가된 LB plate에 도말하여 형질전환체를 확보하였다.

(2) PDGF-B 분비인자의 서열분석

상기에서 확보된 형질전환체를 무작위 선별하여 암피실린이 첨가된 LB에 접종한 후 플라스미드 DNA을 회수 하고 염기서열을 결정하였다.

YY2805△gal1 /pYGMF-PB 균주에 back-transformation하여 얻은 후보들 중 일관성 있게 positive로 나온 3개의 클론에 대하여 플라스미드 DNA을 분리 정제한 후 염기서열 분석을 통해 3종류의 서로 다른 서열을 갖는 유전자가 삽입되어 단백질 분비인자 역할을 하는 것을 알 수 있었다(표 3).

pS-12에 함유된 Glutathione S-transferase(GST)의 경우 단백질 정제 시 정제의 용이함을 위하여 정제 목적의 대상 단백질과 융합하여 사용하는 융합단백질로 잘 알려져 있다. 그러나 pS-17, pS-26과 함께 PDGF를 비롯한 단백질 분비 및 생산에 도움을 주는 보고나 메카니즘은 보고된 바 없다.

실시예 6 : 5L 발효조를 이용한 PDGF-BB 생산성 확인

선별된 균주 중 Y2805△gal1 /pYGMF-PB/pS-17을 5L 발효조를 이용하여 고농도 배양을 실시하여 PDGF-BB의 산업적 생산 가능성을 분석하였다.

종 배양의 배지 조성은 glucose 2%, Yeast Extract 1%, Bactopeptone 2%로 20~24hr 배양하였다. 본 배양의 배지 조성은 glucose 2%, Yeast Extract 4%, Bactopeptone 1.5%로 총 72hr 배양하였다. 본 배양은 유가식 배양법으로 500rpm 에서 900rpm까지의 교반속도와 1.0vvm(v/v)에서 2.0 vvm(v/v)의 통기량 으로 조절하였다. 13시간 이후 배지내 포도당이 거의 소진된 시점부터 새 배지(60% glucose, 5% yeast extract)를 첨가하였으며, galactose induction(총 volume의 1.5% galactose)은 OD₆₀₀ 측정 시 100이상인 40시간 후에 실시하였다. 그 결과 배양 54시간 경과시 최대 115ng/ml 농도로 PDGF-BB를 생산 할 수 있었다(도 9).

상기 한 바와 같이, 본 발명에 의하여 PDGF 과량생산을 위해 최적 분비 인자를 이용하게 됨으로써 PDGF-BB의 대량 발현이 가능하게 된다. 따라서 본 발명은 생산 비용의 절감이 가능할 뿐만 아니라 다양한 고부가가치의 단백질 제품의 고효율 분비 체계 확립에 매우 유용하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

1. 혈소판유래 성장인자 B(PDGF-B) 유전자와 분비인자로서 서열번호 9에 의해 암호화되는 단백질 유전자에 의해 동시 형질전환(co-transformation)된 것을 특징으로 하는 PDGF-B를 고효율로 생산/분비하는 효모.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 PDGF-B 유전자와 분비인자 유전자가 서로 다른 벡터에 존재하는 것을 특징으로 하는 PDGF-B를 고효율로 생산/분비하는 효모.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   상기 PDGF-B 유전자가 존재하는 벡터는 도 4에 도시된 특성을 가지는 pYGMF-PB이며, 상기 서열번호 9인 서열이 존재하는 벡터는 pACT2인 것을 특징으로 하는 PDGF-B를 고효율로 생산/분비하는 효모.
4. 제 4 항에 있어서,

   상기 효모는 Y2805△gal1 /pYGMF-PB/pACT2인 것을 특징으로 하는 PDGF-B를 고효율로 생산/분비하는 효모.
5. 서열번호 9에 의해 암호화되는 단백질.
6. 제 5 항에 의한 단백질을 암호화하는 염기서열.
7. (A) 혈소판유래 성장인자 B(PDGF-B) 유전자를 분리하고 클로닝하여 발현벡터에 도입하는 단계;

   (B) 상기 발현벡터로 효모를 형질전환한 후 배양하여 PDGF-B가 발현되는 1차형질전환 효모를 분리하는 단계;

   (C) 상기 1차 형질전환 효모를 서열번호 9에 의해 암호화되는 단백질 유전자로 재차 형질전환하고 PDGF-BB가 세포외로 분비되는 2차형질전환 효모를 분리하는 단계;

   를 포함하는 것을 특징으로 하는 PDGF-B를 고효율로 생산/분비하는 효모의 제작방법.

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