CZ363796A3

CZ363796A3 - Polypeptide encoding dna structure, recombinant expression vector, yeast strain and process for preparing heterologous protein

Info

Publication number: CZ363796A3
Application number: CZ963637A
Authority: CZ
Inventors: Knud Vad; Jakob Brandt; Thomas Borglum Kjeldsen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1994-06-17
Filing date: 1995-06-16
Publication date: 1997-05-14
Also published as: WO1995035384A1; CN1131312C; EP0765395A1; NO965411L; MX9606536A; HU9603476D0; FI965030A0; SG47883A1; JP3730255B2; IL114160A; FI965030A; HUT75840A; JPH10501695A; CA2192943A1; PL317761A1; IL114160A0; BR9508053A; AU2733595A; CN1152942A; NO965411D0

Abstract

The present invention relates to polypeptides expressed and processed in yeast, a DNA construct comprising a DNA sequence encoding polypeptide having the following structure signal peptide-leader peptide -X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7- heterologous protein, X1 is Lys or Arg; X2 is Lys or Arg, X1 and X2 together defining a yeast processing site; X3 is Glu or Asp; X4 is a sequence of amino acids with the following structure (A-B)n wherein A is Glu or Asp, B is Ala, Val, Leu or Pro, and n is 0 or an integer from 1 to 5, and when n > 2 each A and B is the same or different from the other A(s) and B(s), or X4 is a sequence of amino acids with the following structure (C)m wherein C is Glu or Asp, and m is 0 or an integer from 1 to 5; X5 is a peptide bond or is one or more amino acids which may be the same or different; X6 is a peptide bond or an amino acid residue selected from the group consisting of Pro, Asp, Thr, Ser, Glu, Ala and Gly; and X7 is Lys or Arg.

Description

kvasinkový kmen, který je schopen exprimovat heterogenní protein a který je transformován rekombinantním expresním vektorem. Je popsán rovněž způsob výroby heterogenního proteinu, který zahrnuje kultivování kvasinkové buňky ve vhodném médiu, takže dojde k expresí a sekreci heterogenního proteinu, načež se protein isoluje z kultivačního média.a yeast strain that is capable of expressing a heterogeneous protein and that is transformed with a recombinant expression vector. Also described is a method for producing a heterogeneous protein, which comprises culturing the yeast cell in a suitable medium such that the heterogeneous protein is expressed and secreted, and the protein is isolated from the culture medium.

CZ 3637-96 A3 (54) Název přihlášky vynálezu:CZ 3637-96 A3 (54) Application Name:

DNA konstrukce kódující polypeptid, rekombinantní expresní vektor, kvasinkový kmen a způsob výroby heterologního proteinu (57) Anotace:DNA constructs encoding a polypeptide, a recombinant expression vector, a yeast strain, and a method for producing a heterologous protein (57)

Je popsána DNA konstrukce kódující polypeptid obecného vzorce I, v němž X¹ znamená Lys nebo Arg, X² znamená Lys nebo Arg a X¹společně s X² definují kvasinkové místo opracování, X³ znamená Glu nebo Asp, X⁴ znamená sekvenci aminokyselin (A-B)n, kde A znamená Glu nebo Asp, B znamená Ala, Val, Leu nebo Pro a n znamená číslo 0 až 5, přičemž jestliže η δ 2, potom A a B znamenají nezávisle na sobě stejnou nebo různou skupinu při srovnání s dalšími A a B, nebo X⁴ znamená sekvenci aminokyselin (C)n, kde C znamená Glu nebo Asp a m znamená číslo 0 až 5, X⁵znamená peptidovou vazbu nebo jednu či více aminokyselin, které mohou být stejné nebo různé, X⁶ znamená peptidovou vazbu nebo zbytek aminokyseliny, který je vybrán ze skupiny sestávající z Pro, Asp, Thr, Ser, Glu, Ala a Gly, a X⁷ znamená Lys nebo Arg. Je popsán také rekombinantní expresní vektor, který je schopen replikace v kvasince a který nese uvedenou DNA konstrukci. Dále je popsán signální psptid-lesdsr psptid-x¹-x‘-x^,-ť-x*-x'-x’-hstsroloqnl protein (I)A DNA construct encoding a polypeptide of Formula I is described wherein X ¹ is Lys or Arg, X ² is Lys or Arg, and X ¹ together with X ² define a yeast treatment site, X ³ is Glu or Asp, X ⁴ is an amino acid sequence ( AB) n, where A is Glu or Asp, B is Ala, Val, Leu or Pro and n is 0 to 5, where if η δ 2 then A and B are independently the same or different group when compared to other A and B, or X ⁴ is the amino acid sequence of (C) n, wherein C is Glu or Asp and m is 0 to 5, X ⁵ is a peptide bond or one or more amino acids that can be the same or different, X ⁶ is a peptide bond or an amino acid residue selected from the group consisting of Pro, Asp, Thr, Ser, Glu, Ala, and Gly, and X ⁷ is Lys or Arg. Also described is a recombinant expression vector that is capable of replicating in yeast and which carries said DNA construct. Further described is the signal psptid-lesdsr psptid-x ¹ -x'-x ^, ť-x * -x'-x'-hstsroloqnl protein (I)

XT fí < “O <— Z3 > OXT ph <“O <- Z3> O

N) NJ'N) NJ '

DNA konstrukce kódující polypept|d, r^cómb .nappní expresní v tor, kvasinkový kmen a způsob výroby heterologního -protfiin'A DNA construct encoding a polypeptide, a variant expression receptor, a yeast strain, and a method for producing a heterologous protein.

Oblast technikyTechnical field

Předložený vynález se týká DNA konstrukce kódující polypeptid, rekombinantního expresního vektoru obsahujícího tuto DNA konstrukci, kvasinkového kmenu transformovaného tímto expresním vektorem a způsobu výroby heterologního proteinu v kvasinkách.The present invention relates to a DNA construct encoding a polypeptide, a recombinant expression vector comprising the DNA construct, a yeast strain transformed with the expression vector, and a method for producing a heterologous protein in yeast.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Kvasinkové organismy produkují četné proteiny, které jsou syntetizovány intracelulárně, ale které mají fukci mimo buňku. Tyto extracelulární proteiny se označují jako sekretované proteiny. Tyto sekretované proteiny se exprimují původně uvnitř buňky jako prekursor nebo jako pre-forma obsahující presekvenci zajištující efektivní směrování exprimovaného produktu přes membránu endoplasmového retikula (ER). Presekvence, normálně nazývaná signální peptid, se během translokace obvykle odštěpí od žádaného produktu. Jakmile jednou protein vstoupí na sekreční cestu, je transportován do Golgiho aparátu. Z Golgiho aparátu může protein pokračovat různými cestami, které vedou k takovým částečkám, jako je buněčná vakuola nebo buněčná membrána, nebo může být vyveden ven z buňky, takže je sekretován do vnějšího prostředí [Pfeffer S.R. a Rothman J.E.: Ann. Rev. Biochem.Yeast organisms produce numerous proteins that are synthesized intracellularly but that function outside the cell. These extracellular proteins are referred to as secreted proteins. These secreted proteins are expressed initially within the cell as a precursor or as a pre-form containing a presequence ensuring efficient targeting of the expressed product across the endoplasmic reticulum (ER) membrane. A presequence, normally called a signal peptide, is usually cleaved from the desired product during translocation. Once the protein enters the secretory pathway, it is transported to the Golgi apparatus. From the Golgi apparatus, the protein can proceed through various pathways that lead to particles such as a cell vacuole or cell membrane, or it can be discharged from the cell so that it is secreted to the external environment [Pfeffer S.R. and Rothman, J. E., Ann. Roar. Biochem.

829 (1987).].829 (1987)].

Pro expresi a sekreci proteinů v kvasinkách heterologních pro kvasinky bylo navrženo několik přístupů. Evropská publikovaná patentovaná přihláška č. 0088632A popisuje postup, podle kterého jsou proteiny heterologní pro kvasinky exprimovány, opracovány a sekretovány transformováním kvasinkového organismu expresním vektorem nesoucím DNA kódující žádaný protein a signální peptid, připravením kultury transformovaného organismu, růstem kultury a isolovánímn proteinu z kultivačního prostředí.Several approaches have been proposed for the expression and secretion of proteins in yeast heterologous to yeast. European Published Patent Application No. 0088632A describes a process whereby yeast heterologous proteins are expressed, processed and secreted by transforming a yeast organism with an expression vector carrying DNA encoding the desired protein and signal peptide, preparing the transformed organism culture, growing the culture, and isolating the protein from the culture medium.

Signální peptid může znamenat signální peptid žádaného proteinu samotného, heterologní signální peptid nebo hybrid přírodního nebo heterologního signálního peptidu.The signal peptide may be a signal peptide of the desired protein alone, a heterologous signal peptide, or a hybrid of a natural or heterologous signal peptide.

Problémem, se kterým se setkáváme při použití signálních peptidů heterologních pro kvasinku, může být to, že heterologní signální peptid nezajišťuje účinnou translokaci a/nebo odštěpení po signálním peptidu.A problem encountered when using yeast heterologous signal peptides may be that the heterologous signal peptide does not provide efficient translocation and / or cleavage after the signal peptide.

Saccharomyces cerevisiae MFal (α-faktor) je syntetizován jako prepro-forma 165 aminokyselin obsahující signální nebo pre-peptid 19 aminokyselin následovaných '•leader nebo pre-peptidem 64 aminokyselin, zahrnujícím tři N-navázaná glykosylační místa následovaná (LysArg(Asp/Glu,Ala)₂-₃a-faktorem)« [Kur jan J. a Herskowitz I.: Cell 20, 933 (1982).]. Část signál-leader preproMFal je široce používána při syntéze a sekreci heterologních proteinů v S. cerevisiae.Saccharomyces cerevisiae MFa1 (α-factor) is synthesized as a 165 amino acid preproform containing a 19 amino acid signal or pre-peptide followed by a leader or 64 amino acid pre-peptide, including three N-linked glycosylation sites followed by (LysArg (Asp / Glu, Ala) _{_2-3} alpha-factor) «[Kur John J. and Herskowitz I .: Cell 20, 933 (1982).]. The signal-leader preproMFaI portion is widely used in the synthesis and secretion of heterologous proteins in S. cerevisiae.

Použití signálních/leader peptidů homologních pro kvasinku je známo z, mimo jiné, USA patentového spisu číslo 4 546 082, evropských publikovaných patentových přihlášek číslo 0116201A, 0123294A, 0123544A, 0163529A a 0123289A a evropského patentu Č. 0100561B.The use of yeast homologous signaling / leader peptides is known from, inter alia, U.S. Patent No. 4,546,082, European Published Patent Applications Nos. 0116201A, 0123294A, 0123544A, 0163529A and 0123289A and European Patent No. 0100561B.

V evropské patentové přihlášce 0123289A je popsáno použití S. cerevisiae α-faktorového prekursoru, zatímco evropský patent 100561 popisuje použití Saccharomyces cerevisiae PH05 signálu a PCT spis č. WO 95/02095 popisuje použití YAP3 signálního peptidu pro sekreci cizích proteinů.European patent application 0123289A describes the use of S. cerevisiae α-factor precursor, while European patent 100561 describes the use of the Saccharomyces cerevisiae PH05 signal and PCT publication No. WO 95/02095 describes the use of the YAP3 signal peptide for secretion of foreign proteins.

USA patent číslo 4 546 082 a evropské spisy č. 0016201A, 0123294A, 0123544A a 0163529A popisují postupy, při nichž se signál-leader α-faktoru ze Saccharomyces cerevisiae (MFal nebo MFa2) používá při sekreci exprimovaných heterologních proteinů v kvasince. Bylo prokázáno napojení DNA sekvence kódující S. cerevisiae MFal signální/leader sekvenci na 5' konec genu pro sekreci a opracováni žádaného proteinu.U.S. Pat. No. 4,546,082 and European Publication Nos. 0016201A, 0123294A, 0123544A and 0163529A disclose procedures in which the α-factor signal leader from Saccharomyces cerevisiae (MFa1 or MFa2) is used to secrete expressed yeast heterologous proteins. The DNA sequence coding for the S. cerevisiae MFa1 signaling / leader sequence at the 5 'end of the gene for secretion and processing of the desired protein has been demonstrated.

Evropský patent 206 783 popisuje systém pro sekreci pólypeptidů z S. cerevisiae použitím leader sekvence a-faktoru, která byla upravena tak, že byly odstraněny 4 α-faktorové peptidy přítomné v přírodní leader sekvenci,takže se získá leader peptid napojený na heterologní polypeptid místem opracování α-faktoru Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala. Bylo uvedeno, že tato konstrukce vede k účinnému opracování menších peptidů (menších než 50 aminokyselin). Pro sekreci a opracování větších polypeptidů se leader sekvence přírodního α-faktoru upraví tak, aby zůstal(y) jeden nebo dva α-faktorové peptidy mezi leader peptidexn a polypeptidem.European Patent 206 783 discloses a system for secreting polypeptides from S. cerevisiae using an α-factor leader sequence that has been modified to remove the 4 α-factor peptides present in the natural leader sequence so as to obtain a leader peptide linked to the heterologous polypeptide by the processing site α-Factor Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala. This construction has been reported to result in efficient processing of smaller peptides (less than 50 amino acids). For secretion and processing of larger polypeptides, the leader sequence of the natural α-factor is engineered to leave one or two α-factor peptides between the leader peptidexin and the polypeptide.

četné sekretované proteiny jsou vedeny po takové cestě, aby byly vystaveny působení proteolytického opracovávacího systému, který může štěpit peptidovou vazbu na karboxylovém konci dvou po sobě jdoucích bazických aminokyselin. Tato enzymatická aktivita je v S. cerevisiae kódována KEX 2 genem [Julius D.A. a spol.: Cell 37. 1075 (1984b).]. Opracování produktu KEX 2 proteasou je potřeba pro sekreci aktivního S. cerevisiae kopulačního faktoru al (MFal nebo a-faktor), ale KEX 2 není zahrnuta v sekreci aktivního S. cerevisiae faktoru a.Numerous secreted proteins are routed such that they are exposed to a proteolytic processing system that can cleave a peptide bond at the carboxyl terminus of two consecutive basic amino acids. This enzymatic activity is encoded by the KEX 2 gene in S. cerevisiae [Julius D.A. et al., Cell 37, 1075 (1984b).]. Protease treatment of KEX 2 is required for secretion of active S. cerevisiae coupling factor α1 (MFα1 or α-factor), but KEX 2 is not involved in secretion of active S. cerevisiae factor α.

Sekrece a správné opracování polypeptidů, o kterém se předpokládá, že bude sekretován, se dosáhne v některých případech tak, že se kultivuje kvasinkový organismus, který je transformován vektorem zkonstruovaným tak, jak je shora uvedeno v odkazech. V mnoha případech je však úroveň sekrece velmi nízká nebo vůbec nedochází k sekreci a nebo proteolytické opracování může být nepřesné nebo neúplné. Jak je popsáno v PCT spisu č. WO 90/10075, předpokládá se, že tuto skutečnost lze do jistého rozsahu přičíst nedostatečnému vystavení místa opracování přítomného mezi C-koncem leader peptidu a N-koncem heterologního proteinu, což způsobuje, že je nepřístupné, nebo alespoň méně přístupné, proteolytickému štěpení.The secretion and proper processing of the polypeptides believed to be secreted is achieved in some cases by culturing a yeast organism that is transformed with a vector constructed as referred to above in the references. In many cases, however, the secretion level is very low or no secretion at all and or proteolytic processing may be inaccurate or incomplete. As described in PCT Publication No. WO 90/10075, this is believed to be attributed to some extent to the lack of exposure of the processing site present between the C-terminus of the leader peptide and the N-terminus of the heterologous protein, making it inaccessible, or at least less accessible, proteolytic cleavage.

Spis WO 90/10075 popisuje kvasinkový expresní systém se zlepšeným opracováním heterologního polypeptidů získaný prove4 děním některých úprav blízko místa opracování na C-konci leader peptidu a/nebo N-konci heterologního peptidu napojeného na leader peptid. Tak je tedy možné získat vyšší výtěžek přesně opracovaného proteinu, než který lze získat s neupravenými konstrukcemi leader peptid - heterologní polypeptid.WO 90/10075 discloses a yeast expression system with improved treatment of heterologous polypeptides obtained by making some adjustments near the treatment site at the C-terminus of the leader peptide and / or the N-terminus of the heterologous peptide linked to the leader peptide. Thus, it is possible to obtain a higher yield of precisely processed protein than can be obtained with unmodified leader peptide-heterologous polypeptide constructs.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Předložený vynález popisuje modifikace N-konce heterologního polypeptidu navržené jako rozšíření, které lze odštěpit bud přirozeně se vyskytujícími kvasinkovými proteasami před čištěním z kultivačního media nebo in vitro proteolysou během nebo po vyčištění produktu z kultivačního media.The present invention describes modifications of the N-terminus of a heterologous polypeptide designed as an extension that can be cleaved either by naturally occurring yeast proteases before purification from the culture medium or by in vitro proteolysis during or after purification of the product from the culture medium.

Předložený vynález se týká DNA konstrukce kódující polypeptid obecného vzorce signální peptid-leader peptid-X¹-X²-X³-X*-X⁵-X*-X⁷-heterologní protein, v němž Xl znamená Lys nebo Arg,The present invention relates to a DNA construct encoding a polypeptide of the formula signal peptide-leader peptide-X ¹ -X ² -X ³ -X a -X ⁵ -X ⁷ -X * -heterologní protein wherein X is Lys or Arg,

X² znamená Lys nebo Arg a X¹ společně s X² definují kvasinkové místo opracování,X ² represents Lys or Arg and X ¹ together with X ² define the yeast treatment site,

X³ znamená Glu nebo Asp,X ³ is Glu or Asp,

X* znamená sekvenci aminokyselin obecného vzorce (A-B)^, v němž A znamená Glu nebo Asp, B znamená Ala, Val, Leu nebo Pro a n znamená od 0 do 5, při čemž jestliže n > 2, potom A a B znamenají nezávisle na sobě stejnou nebo různou skupinu při srovnání s dalšími A a B, neboX * is an amino acid sequence of formula (AB) 4 wherein A is Glu or Asp, B is Ala, Val, Leu or Pro and n is from 0 to 5, provided that if n> 2 then A and B are independently each have the same or different group as compared to other A and B, or

X* znamená sekvenci aminokyselin obecného vzorce (C)„, v němž C znamená Glu nebo Asp a m znamená čislo 0 až 5,X * is an amino acid sequence of formula (C) n wherein C is Glu or Asp and m is 0 to 5,

X^s znamená peptidovou vazbu nebo jednu či více aminokyselin, které mohou být stejné nebo různé,X represents ^a peptide bond or one or more amino acids which may be the same or different,

X⁶ znamená peptidovou vazbu nebo zbytek aminokyseliny, který je vybrán ze skupiny sestávající z Pro, Asp, Thr, Glu, Ala a Gly, aX ⁶ is a peptide bond or an amino acid residue selected from the group consisting of Pro, Asp, Thr, Glu, Ala, and Gly, and

X⁷ znamená Lys nebo Arg.X ⁷ is Lys or Arg.

V této souvislosti je pojem signální peptid chápán jako označení presekvence, která je převážně hydrofobní povahy a která je přítomna jako N-koncová sekvence prekursorové formy extracelulárního proteinu exprimovaného v kvasince. Funkcí signálního peptidu je umožnit, aby heterologní protein, který je sekretován, vstoupil do endoplasmového retikula. Signální peptid se normálně během tohoto procesu odštěpí. Signální peptid může být pro kvasinkový organismus, který produkuje tento protein, heterologní nebo homologní. Účinnějšího odštěpení signálního peptidu lze však dosáhnout tehdy, když je s příslušným kvasinkovým organismem homologní.In this context, the term "signal peptide" is understood to denote a presection that is predominantly hydrophobic in nature and which is present as the N-terminal sequence of the precursor form of the extracellular protein expressed in yeast. The function of the signal peptide is to allow the heterologous protein that is secreted to enter the endoplasmic reticulum. The signal peptide is normally cleaved during this process. The signal peptide may be heterologous or homologous to the yeast organism that produces the protein. However, more efficient cleavage of the signal peptide can be achieved when it is homologous to the yeast organism in question.

Výraz leader peptid označuje převážně hydrofilní peptid, jehož funkcí je umožnit, aby heterologoní protein, který má být sekretován, byl směrován z endoplasmového retikula do Golgiho aparátu a dále do sekrečních váčků pro sekreci do prostředí (tj. export exprimovaného polypeptidů přes buněčnou stěnu nebo alespoň buněčnou membránu do periplasmového prostoru buňky).The term leader peptide refers predominantly to a hydrophilic peptide whose function is to allow the heterologous protein to be secreted to be directed from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus and further to secretory vesicles for secretion into the environment (ie, export of expressed polypeptides via the cell wall or at least cell membrane into the periplasmic space of the cell).

Pojem heterologní protein označuje takový protein nebo polypeptid, který není produkován hostitelským kvasinkovým organismem v přírodě.The term heterologous protein refers to a protein or polypeptide that is not produced by the host yeast organism in nature.

Χ³-Χ⁴-Χ⁵-Χ^β—X⁷ společně tvoří rozšíření na N-konci heterologního polypeptidů. Toto rozšíření nejen že zvyšuje výtěžek fermentace, ale díky přítomnosti X³ chrání proti opracování dipeptidylaminopeptidasou (DPAP A), což vede k homogennímu N-koncovému polypeptidů. Rozšíření lze zkonstruovat tak, že bude odštěpeno proteasami přirozeně se vyskytujícími v kvasince jinými než DPAP, jako je například kvasinková aspartová proteasa 3 (YAP3), před vyčištěním heterologního proteinového produktu z kultivačního prostředí. Rozšíření může být zkonstruováno také tak, že je odolné vůči proteolytickému štěpení během fermentace, takže na N-konci rozšířený heterologní proteinový produkt může být z kultivačního media vyčištěn pro následující in vitro maturaci,např. trypsinem, Achromobacter lyticus proteasou I nebo enterokinasou.Χ ³ -Χ ⁴ -Χ ⁵ -Χ ^{β —} X ⁷ together form an extension at the N-terminus of the heterologous polypeptide. This extension not only increases the fermentation yield, but thanks to the presence of X ³ protects against dipeptidylaminopeptidase (DPAP A) treatment, resulting in a homogeneous N-terminal polypeptide. The extension can be constructed to be cleaved by proteases naturally occurring in yeast other than DPAP, such as yeast aspart protease 3 (YAP3), before purifying the heterologous protein product from the culture medium. The extension can also be designed to be resistant to proteolytic cleavage during fermentation, so that the N-terminal extended heterologous protein product can be purified from the culture medium for subsequent in vitro maturation, e.g. trypsin, Achromobacter lyticus protease I or enterokinase.

V ještě dalším aspektu se tento vynález týká způsobu výroby heterologního proteinu v kvasince, který se vyznačuje tím, že zahrnuje kultivaci transformovaného kvasinkového kmene ve vhodném mediu. Dojde tak k expresi a sekreci heterologního proteinu, po niž se protein isoluje z media.In yet another aspect, the invention relates to a method for producing a heterologous protein in yeast, characterized in that it comprises culturing the transformed yeast strain in a suitable medium. This results in the expression and secretion of the heterologous protein, after which the protein is isolated from the medium.

V následující části tohoto spisu bude předložený vynález popsán podrobněji.In the following, the present invention will be described in more detail.

V peptidové struktuře obecného vzorce (A-B)_n n s výhodou znamená číslo 2 až 4, výhodněji 3.In the peptide structure of formula (AB), _{n n is} preferably 2 to 4, more preferably 3.

Ve výhodných polypeptidech podle vynálezu X³ znamená Glu, A znamená Glu, B znamená Ala, X* znamená peptidovou vazbu, Glu nebo Glu Pro Lys Ala nebo X⁶ znamená Pro nebo peptidovou vazbu.In preferred polypeptides of the invention, X ³ is Glu, A is Glu, B is Ala, X * is a peptide bond, Glu or Glu Pro Lys Ala or X ⁶ is Pro or peptide bond.

Příklady možných rozšíření X³-X⁴-X⁵-X^e-X⁷ na N-konci jsou:Examples of possible extensions X ³ -X ⁴ -X ⁵ -X ^e -X ⁷ at the N-terminus are:

Glu Glu Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Glu Glu (Pro/Ala) (Glu/Lys) (Ala/Glu/Lys/Thr) (Pro / Ala) (Glu / Lys) Arg Arg Ala Ala Pro For Arg, Arg, t t Glu Glu Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Glu Glu Pro For Lys Ala (Thr/Pro) Arg, Lys Ala (Thr / Pro) Arg Glu Glu Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Glu Pro Arg, Glu Pro Arg Glu Glu Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Glu Pro Lys, Glu Pro Lys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Glu Arg, Glu Arg, Glu Glu Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala (Asp/Ala/Gly/Glu) Lys, (Asp / Ala / Gly / Glu) Lys, Glu Glu Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala (Pro/Leu/Ile/Thr) Lys, (Pro / Leu / Ile / Thr) Glu Glu Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg, Arg, Glu Glu Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Glu Glu (Glu/Asp/Gly/Ala) Lys, (Glu / Asp / Gly / Ala) Lys, Glu Glu Glu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Pro For Lys Lys t t Glu Glu Glu Glu Ala Ala Pro For Lys Lys 1 1 Asp Asp Asp Asp Ala Ala Asp Asp Ala Ala Asp Asp Ala Ala Asp Pro Arg, Asp Pro Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Pro For Lys Lys » »» Glu Glu Glu Glu Glu Glu Pro For Lys Lys / / Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Lys Lys a and Glu Glu Glu Glu Pro For Lys Lys • •

Signální peptidová sekvence polypeptidu podle vynálezu může znamenat jakýkoliv signální peptid, který zajištuje efektiv7 ní směrování exprimovaného polypeptidu do sekreční cesty buňky. Signální peptid může znamenat přirozeně se vyskytující signální peptid nebo jeho funkční část nebo může znamenat syntetický peptid. Bylo zjištěno, že vhodnými signálními peptidy jsou a-faktorový signální peptid, signální peptid myšší slinné amylasy, modifikovaný karboxypeptidasový signální peptid, kvasinkový BARI signální peptid a signální peptid kvasinkové aspartové proteasy 3 (YAP3). Signální sekvence myšší slinné amylasy je popsána O. Hagenbůchlem a spol.: Nátuře 289. 643 (1981). Karboxypeptidasová signální sekvence je popsána L.A. Vallsem a spol.: Cell 887 (1987). BARI signální peptid je popsán v PCT spisu WO 87/02670. Signální peptid kvasinkové aspartové proteasy 3 je popsán v PCT spisu č. 95/02059.The signal peptide sequence of a polypeptide of the invention may be any signal peptide that provides efficient targeting of the expressed polypeptide to the secretory pathway of the cell. The signal peptide may be a naturally occurring signal peptide or a functional portion thereof, or may be a synthetic peptide. Suitable signal peptides have been found to be α-factor signal peptide, mouse salivary amylase signal peptide, modified carboxypeptidase signal peptide, yeast BAR1 signal peptide, and yeast aspart protease 3 (YAP3) signal peptide. The signal sequence of mouse salivary amylase is described by O. Hagenbuchel et al., Nature 289. 643 (1981). The carboxypeptidase signal sequence is described by L.A. Valls et al., Cell 887 (1987). The BAR1 signal peptide is described in PCT publication WO 87/02670. Yeast aspart protease 3 signal peptide is disclosed in PCT Publication No. 95/02059.

Leader peptidová sekvence polypeptidu podle vynálezu může znamenat jakýkoliv leader peptid, který je funkční pro směrování exprimovaného polypeptidu endoplasmovým retikulem a dále podél sekreční cesty. Možnými leader sekvencemi, které jsou vhodné pro tento účel, jsou přírodní leader peptidy odvozené od kvasinky nebo jiných organismů, jako je α-faktorový leader nebo jeho funkční analog. Leader peptid může znamenat také syntetický leader peptid, např. jeden z těch syntetických leader peptidů, které jsou popsány v PCT spisu č. WO 89/02463 nebo WO 92/11378.The leader peptide sequence of a polypeptide of the invention may be any leader peptide that is functional to direct the expressed polypeptide through the endoplasmic reticulum and further along the secretory pathway. Possible leader sequences suitable for this purpose are natural leader peptides derived from yeast or other organisms, such as α-factor leader or a functional analogue thereof. The leader peptide may also be a synthetic leader peptide, e.g., one of those synthetic leader peptides described in PCT Publication No. WO 89/02463 or WO 92/11378.

Heterologní protein rozšířený na N-konci vyrobený způsobem podle tohoto vynálezu může znamenat jakýkoliv protein, který může být s výhodou vyráběn v kvasince. Mezi příklady těchto proteinů patří aprotinin, inhibitor cesty tkáňového faktoru nebo jiné proteasové inhibitory, inzulín nebo prekursory inzulínu, analogy inzulínu, inzulínu podobný růstový faktor I nebo II, lidský nebo hovězí růstový hormon, interleukin, aktivátor tkáňového plasminogenu, glukagon, glukagonu podobný peptid 1 (GLP-1), faktor VII, faktor VIII, faktor XIII, růstový faktor odvozený od destiček, enzymy nebo funkční analog kteréhokoliv z těchto proteinů. V této souvislosti pojem “funkční analog 2namená polypeptid s podobnou funkcí jakou má přírodní protein (to je myšleno tak, že jde spíše o povahu než úroveň biologické aktivity přírodního proteinu). Tento polypeptid může být strukturně podobný přírodnímu proteinu a může být od přírodního proteinu odvozen přidáním jedné nebo více aminokyselin na kterýkoliv nebo na oba C- a N-konec přírodního proteinu, substitucí jedné nebo více aminokyselin na jednom nebo více různých místech přírodní aminokyselinové sekvence, delecí jedné nebo více aminokyselin na kterémkoliv nebo na obou koncích přírodního proteinu nebo na jednom nebo několika místech aminokyselinové sekvence nebo vložením jedné nebo více aminokyselin do jednoho nebo do více míst přírodní aminokyselinové sekvence. Tyto modifikace jsou dobře známy pro některé shora uvedené proteiny.The N-terminal heterologous protein produced by the method of the invention may be any protein that can preferably be produced in yeast. Examples of such proteins include aprotinin, tissue factor pathway inhibitor or other protease inhibitors, insulin or insulin precursors, insulin analogs, insulin-like growth factor I or II, human or bovine growth hormone, interleukin, tissue plasminogen activator, glucagon, glucagon-like peptide 1 (GLP-1), factor VII, factor VIII, factor XIII, platelet-derived growth factor, enzymes, or a functional analog of any of these proteins. In this context, the term "functional analogue" does not mean a polypeptide with a similar function to the natural protein (that is to say, it is of a nature rather than a level of biological activity of the natural protein). The polypeptide may be structurally similar to the natural protein and may be derived from the natural protein by adding one or more amino acids to either or both the C- and N-terminus of the natural protein, substituting one or more amino acids at one or more different sites of the natural amino acid sequence, one or more amino acids at either or both ends of the natural protein or at one or more sites of the amino acid sequence, or by inserting one or more amino acids into one or more sites of the natural amino acid sequence. These modifications are well known for some of the above proteins.

Příklady vhodných inzulínových prekursorů a inzulínových analogů jsou B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) (jak je popsáno např. v evropském patentu 163 529), B(l-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A(l-21) (jak je popsáno např. v PCT spisu číslo 95/00550), B(1-29)-Ala-Ala-Arg-A(1-21) (jak je popsáno např. v PCT spisu č. 95/07931) a B(l-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21).Examples of suitable insulin precursors and insulin analogs are B (1-29) -Ala-Ala-Lys-A (1-21) (as described, eg, in European Patent 163,529), B (1-27) -Asp-Lys -Ala-Ala-Lys-A (1-21) (as described, eg, in PCT Publication No. 95/00550), B (1-29) -Ala-Ala-Arg-A (1-21) (as as described, for example, in PCT Publication No. 95/07931) and B (1-29) -Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A (1-21).

DNA konstrukce podle vynálezu kódující polypeptid podle vynálezu se může připravovat synteticky standardními způsoby, např. fosfoamiditovým způsobem podle S.L. Beaucageho a Μ. H. Carutherse: Tetrahedron Letters 22. 1859 (1981) nebo způsobem popsaným Matthesem a spol.: EMBO Journal 2, 801 (1984). Podle fosfoamiditového způsobu se oligonukleotidy syntetizují např. v automatickém DNA syntetizátoru, vyčistí se, zdvojí a ligují. Vytvoří se tak syntetická DNA konstrukce. Běžně výhodným způsobem přípravy DNA konstrukce je polymerasová řetězová reakce (PCR), např. jak popisují Sambrook a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY 1989.A DNA construct of the invention encoding a polypeptide of the invention can be prepared synthetically by standard methods, e.g., the phosphoamidite method of S.L. Beaucage and Μ. H. Caruthers: Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981), or as described by Matthes et al., EMBO Journal 2, 801 (1984). According to the phosphoamidite method, oligonucleotides are synthesized, e.g., in an automated DNA synthesizer, purified, doubled, and ligated. This creates a synthetic DNA construct. A commonly preferred method of preparing a DNA construct is by polymerase chain reaction (PCR), e.g. as described by Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY 1989.

DNA konstrukce podle vynálezu mohou být také genomového nebo cDNA původu, mohou se získávat např. připravením genomové nebo cDNA knihovny a vyhledáváním DNA sekvencí kódujících celý nebo část polypeptidu podle vynálezu hybridizací použitím stan9 dardních oligonukleotidových sond podle standardních způsobů (viz např. Sambrook a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989). V tomto případě může být genomová nebo cDNA sekvence kódující signální a leader peptid napojena na genomovou nebo cDNA sekvenci kódující heterologní protein, načež se DNA sekvence může upravit v místě odpovídajícím aminokyselinové sekvenci X¹-X^a-X³-X‘-X⁵-X⁶-X⁷ polypeptidu, např. vložením syntetických oligonukleotidů kódujících žádanou aminokyselinovou sekvenci pro homologní rekombinaci podle dobře známých postupů.The DNA constructs of the invention may also be of genomic or cDNA origin, may be obtained, for example, by preparing a genomic or cDNA library and screening for DNA sequences encoding all or part of the polypeptide of the invention by hybridization using standard oligonucleotide probes according to standard methods (see, e.g., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989). In this case, the genomic or cDNA sequence encoding the signal and leader peptide may be linked to a genomic or cDNA sequence encoding a heterologous protein, whereupon the DNA sequence may be modified at a location corresponding to the amino acid sequence X ¹ -X ^and -X ³ -X'-X ⁵ - X ⁶ -X ⁷ polypeptide, eg, by insertion of synthetic oligonucleotides encoding the desired amino acid sequence for homologous recombination according to well known procedures.

A konečně, DNA konstrukce může být smíšeného syntetického a genomového, smíšeného syntetického a cDNA nebo smíšeného genomového a cDNA původu, která se připraví anelováním fragmentů syntetického, genomového nebo cDNA původu (podle okolností), fragmentů odpovídajících různým částem úplné DNA konstrukce, podle standardních způsobů. Lze si tedy představit, že DNA sekvence kódující heterologní protein může být genomového nebo cDNA původu, zatímco sekvence kódující signální a leader peptid stejně jako sekvence kódující N-koncové rozšíření X¹-X^a-X³-X*-X⁵-X^e-X⁷ se mohou připravit synteticky.Finally, the DNA construct may be of mixed synthetic and genomic, mixed synthetic and cDNA or mixed genomic and cDNA origin, prepared by annealing fragments of synthetic, genomic or cDNA origin (as appropriate), fragments corresponding to different portions of the complete DNA construct, according to standard methods . Thus, it is conceivable that the DNA sequence encoding the heterologous protein may be of genomic or cDNA origin, while the sequence encoding the signal and leader peptide as well as the sequence encoding the N-terminal extension of X ¹ -X ^and -X ³ -X * -X ⁵ -X ^e X ⁷ can be prepared synthetically.

Podle dalšího aspektu se tento vynález týká rekombinantního expresního vektoru, který je schopen replikovat v kvasince a který nese DNA konstrukci kódující shora uvedený polypeptid. Rekombinantní expresní vektor může znamenat jakýkoliv vektor, který je schopen replikace v kvasinkovém organismu. Ve vektoru by měla být DNA sekvence kódující polypeptid podle vynálezu odštěpítělně napojena na vhodnou promotorovou sekvenci. Promotorem může být jakákoliv DNA sekvence, která vykazuje transkripční aktivitu v kvasince, a může být odvozen od genů kódujících proteiny buá homologní nebo heterologní s kvasinkou. Promotor je s výhodou odvozen od genu kódujícího protein homologní s kvasinkou. Mezi příklady vhodných promotorů patří Saccharomyces cerevisiae Μαΐ, TPI, ADH nebo PGK promotory.In another aspect, the invention relates to a recombinant expression vector capable of replicating in yeast and which carries a DNA construct encoding the above polypeptide. A recombinant expression vector may be any vector that is capable of replicating in a yeast organism. In the vector, the DNA sequence encoding the polypeptide of the invention should be operably linked to a suitable promoter sequence. The promoter can be any DNA sequence that exhibits transcriptional activity in yeast and can be derived from genes encoding proteins either homologous or heterologous to the yeast. The promoter is preferably derived from a gene encoding a yeast homologous protein. Examples of suitable promoters include Saccharomyces cerevisiae Μαΐ, TPI, ADH or PGK promoters.

DNA sekvence kódující polypeptid podle vynálezu může být také odštěpitelně napojena na vhodný terminátor, např. TPI terminátor (viz např. T. Alber a G. Kawasaki: J. Mol. Appl. Genet. 1, 419 (1982)).The DNA sequence encoding the polypeptide of the invention may also be operably linked to a suitable terminator, e.g., a TPI terminator (see, e.g., T. Alber and G. Kawasaki: J. Mol. Appl. Genet. 1, 419 (1982)).

Rekombinantní expresní vektor podle vynálezu dále obsahuje DNA sekvenci umožňující vektoru replikaci v kvasince. Příklady takových sekvencí jsou kvasinkové plasmidové 2μ replikační geny REP 1 až 3 a počátek replikace. Vektor může obsahovat také selektovatelný markér, např. Schizosaccharomyces pombe TPI gen, jak popsal P.R. Russell: Gene 40. 125 (1980).The recombinant expression vector of the invention further comprises a DNA sequence allowing the vector to replicate in yeast. Examples of such sequences are the yeast plasmid 2μ replication genes REP 1-3 and the origin of replication. The vector may also contain a selectable marker, eg, Schizosaccharomyces pombe TPI gene, as described by P.R. Russell: Gene 40. 125 (1980).

Postupy použité pro ligaci DNA sekvencí kódujících polypeptid podle vynálezu, promotor a terminátor a pro jejich vložení do vhodných kvasinkových vektorů obsahujících informace nutné pro kvasinkovou replikaci, jsou dobře známy odborníkům z oblasti techniky (viz například Sambrook a spol.: shora uvedená citace). Tomu je třeba rozumět tak, že vektor může být zkonstruován buá tak, Že se nejdříve připraví DNA konstrukce obsahující celou DNA sekvenci kódující polypeptid podle vynálezu a potom se tento fragment vloží do vhodného expresního vektoru nebo se postupně vkládají DNA fragmenty obsahující genetickou informaci pro jednotlivé prvky (jako je signální, leader nebo heterologní protein) a následuje ligace.The procedures used to ligate the DNA sequences encoding the polypeptide of the invention, the promoter and the terminator and to insert them into suitable yeast vectors containing the information necessary for yeast replication are well known to those skilled in the art (see, for example, Sambrook et al., Supra). It is to be understood that the vector may be constructed either by first constructing a DNA construct comprising the entire DNA sequence encoding the polypeptide of the invention and then inserting the fragment into a suitable expression vector or sequentially inserting DNA fragments containing the genetic information for each element (such as a signal, leader, or heterologous protein) followed by ligation.

Kvasinkovým organismem použitým ve způsobu podle vynálezu může být jakýkoliv vhodný kvasinkový organismus, který při kultivaci poskytuje velká množství žádaného heterologního proteinu nebo polypeptidu. Příklady vhodných kvasinkových organismů mohou být kmeny kvasinek druhu Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe nebo Saccharomyces uvarum. Transformace kvasinkových buněk se může například provést vytvořením protoplastu a následující transformací známým způsobem. Mediem použitým pro kultivaci buněk může být jakékoliv konvenční medium vhodné pro růst kvasinkových organismů. Sekretovaný heterologní protein, jehož významný podíl bude přítomen v mediu ve správně opracované formě, se může z media isolovat konvenčními postupy, mezi něž patří oddělení buněk kva11 sinky od media odstřelováním nebo odfiltrováním, vysrážení proteinových složek supernatantu nebo filtrátu soli, například síranem amonným, a následující vyčištění různými chromatografickými postupy, např. chromatografii na ionexu, afinitní chromatograf i í nebo podobně.The yeast organism used in the method of the invention may be any suitable yeast organism that yields large amounts of the heterologous protein or polypeptide of interest during cultivation. Examples of suitable yeast organisms may be yeast strains of the species Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe or Saccharomyces uvarum. For example, transformation of yeast cells can be accomplished by protoplast formation followed by transformation in a known manner. The medium used for cell culture may be any conventional medium suitable for the growth of yeast organisms. The secreted heterologous protein, a significant proportion of which will be present in the medium in the properly processed form, can be recovered from the medium by conventional techniques, such as separating the quartz cells from the medium by blasting or filtering, precipitating the protein components of the supernatant or salt filtrate such as ammonium sulfate; subsequent purification by various chromatographic techniques, e.g. ion exchange chromatography, affinity chromatography or the like.

Po sekreci do kultivačního media se protein může podrobit různým postupům, kterými se odstraní sekvence obecného vzorce Χ’-Χ'-Χ’-Χ^Χ⁷.After secretion into the culture medium, the protein can be subjected to various procedures to remove the sequences of the general formula Χ'-Χ'-Χ'-Χ ^ Χ ⁷ .

Jestliže X* znamená Pro, Thr, Ser, Gly nebo Asp, bylo zjištěno, že tato rozšíření jsou stabilně připojena k heterolognímu proteinu během fermentace a chrání tak N-konec heterologního proteinu proti proteolytické aktivitě kvasinkových proteas, jako je DPAP. Přítomnost N-koncového rozšíření na heterologním proteinu může sloužit také jako ochrana N-koncové aminoskupiny heterologního proteinu během chemického opracování proteinu, tj. může sloužit jako náhrada za BOC nebo podobnou chránící skupinu. V těchto případech se aminokyselinová sekvence X³-X*-X^s-X^e-X⁷ může z isolovaného heterologního proteinu odstranit proteolytickým enzymem, který je specifický pro bazickou aminokyselinu (např. Lys nebo Arg), takže koncové rozšíření se odštěpí na X⁷. Příklady těchto proteolytických enzymů jsou trypsin, Achromobacter lyticus proteasa I, enterokinasa, Fusarium oxysporun trypsinu podobná proteasa a kvasinková aspartová proteasa 3 (YAP3) ze Saccharomyces cerevisiae.When X * is Pro, Thr, Ser, Gly or Asp, these extensions have been found to be stably attached to the heterologous protein during fermentation and thus protect the N-terminus of the heterologous protein against the proteolytic activity of yeast proteases such as DPAP. The presence of the N-terminal extension on the heterologous protein may also serve to protect the N-terminal amino group of the heterologous protein during chemical processing of the protein, i.e., it may serve as a substitute for BOC or a similar protecting group. In these cases, the amino acid sequence X ³ -X * -X ^with -X ^e -X ⁷ can be removed from the isolated heterologous protein by a proteolytic enzyme that is specific for a basic amino acid (eg, Lys or Arg), so that the terminal extension is cleaved to X ⁷ . Examples of these proteolytic enzymes are trypsin, Achromobacter lyticus protease I, enterokinase, Fusarium oxysporun trypsin-like protease, and yeast aspart protease 3 (YAP3) from Saccharomyces cerevisiae.

YAP3 byly charakterizovány aplikováním různých prohormonů a expresí heterologního proteinu v Saccharomyces cerevisiae [Niamh X.C. a spol.: FEBS Letters 332. 273 (1993), Bourbonnais Y. a spol.: EMBO Journal 12/ 285 (1993) a Egel-Mitani M. a spol.: Yeast £, 127 (1990).].YAP3s were characterized by the application of various prohormones and expression of a heterologous protein in Saccharomyces cerevisiae [Niamh X.C. et al .: FEBS Letters 332. 273 (1993), Bourbonnais Y. et al .: EMBO Journal 12/285 (1993) and Egel-Mitani M. et al .: Yeast £ 127 (1990).].

YAP3 se objevuje při fermentacích Saccharomyces cerevisiae ve velkém měřítku. Je aktivní při pH 3 až asi 6. YAP3 se získává nejvíce tehdy, jestliže se používají media minimálních typů. V takovém mediu buňky hladovějí, pokud jde o glukosu a/nebo du12 sík, ale lze použít i jiné podmínky, které omezují růst. YAP3 proteasa vyžaduje definovaný motif obklopující místo štěpení. Takový motif je přítomen na N-koncovém rozšíření, jestliže aminokyselina, která bezporostředně předchází X⁷, znamená Ala nebo Glu (ale ne tehdy, jestliže X⁶ znamená Pro, Thr, Ser, Gly nebo Asp).YAP3 occurs in large-scale fermentations of Saccharomyces cerevisiae. It is active at pH 3 to about 6. YAP3 is obtained most when using minimal media types. In such medium, the cells starve for glucose and / or du12 sulfur, but other growth-limiting conditions may also be used. The YAP3 protease requires a defined motif surrounding the cleavage site. Such a motif is present at the N-terminal extension if the amino acid immediately preceding X ⁷ is Ala or Glu (but not if X ⁶ is Pro, Thr, Ser, Gly or Asp).

Jestliže X^e tedy znamená peptidovou vazbu (a aminokyselina předcházející X⁷ znamená Ala nebo Glu), Ala nebo Glu, rozšíření mohou být odštěpena z heterologního proteinu během fermentace, nej pravděpodobně ji po jeho sekreci z kvasinkových buněk - způsobem, který závisí na YAP3 působící na jeho substrát (peptidová vazba po lysinu nebo argininu) v kvasinkových buňkách nebo v růstovém mediu. YAP3 uvnitř, napojená na nebo uniklá z kvasinkových buněk, může selektivně odštěpit rozšíření tak, že se z růstového media může isolovat nerozšířený produkt.Thus, if X ^e is a peptide bond (and the amino acid preceding X ⁷ is Ala or Glu), Ala or Glu, the extensions may be cleaved from the heterologous protein during fermentation, most likely after its secretion from yeast cells - in a YAP3-dependent manner to its substrate (peptide bond after lysine or arginine) in yeast cells or in growth medium. YAP3 internally, attached to or leaked from yeast cells, can selectively cleave the spread so that the non-expanded product can be isolated from the growth medium.

Aminokyselinová sekvence X³-X⁷, jestliže X⁶ znamená Ala, Glu nebo peptidovou vazbu (a aminokyselina předcházející X⁷znamená Ala nebo Glu), může být z heterologního proteinu v mediu odstraněna takovým postupem, který zahrnuje podrobení těchto kvasinkových buněk stresu, což způsobí, že buňky uvolňují YAP3 do media, při čemž se aminokyselinová sekvence X³-X⁷odštěpí.The amino acid sequence X ³ -X ⁷ , if X ⁶ is Ala, Glu, or a peptide bond (and the amino acid preceding X ⁷ is Ala or Glu), can be removed from the heterologous protein in the medium by a procedure involving subjecting these yeast cells to stress, causes the cells to release YAP3 into the medium, whereby the amino acid sequence X ³ -X ⁷ is cleaved.

Stres, kterému jsou kvasinkové buňky vystaveny, může zahrnovat snížení pH kultiuvačního media pod 6,0, s výhodou pod 5, nebo hladovění kvasinkových buněk, pokud jde o glukosu a/nebo dusík.The stress to which the yeast cells are exposed may include lowering the pH of the culture medium below 6.0, preferably below 5, or starving the yeast cells for glucose and / or nitrogen.

V postupu podle vynálezu výroby heterologního proteinu se kvasinkové buňky mohou dále transformovat jedním nebo více geny kódujícími proteasu, která je specifická pro zbytky bazických aminokyselin, takže se při kultivaci buňky exprimuje gen nebo geny a tato produkce proteasy zajišťuje úplnější odštěpeni X³-X⁷od heterologního polypeptidu.In the process according to the invention for producing a heterologous protein, the yeast cell may further be transformed with one or more genes encoding a protease which is specific for basic amino acid residues such that culturing the cells expressing the gene or genes, and the production of protease ensuring a more complete cleavage of X ³ -X ⁷ from heterologous polypeptide.

Ve výhodném provedení se pro transformaci kvasinkové buňky může použít jeden nebo více dalších genů kódujících YAP3, takže při kultivaci buňky dochází k nadexpresi genu nebo genů a tato nadprodukce YAP3 zajistuje úplnější odštěpení X³-X⁷ od heterologního polypeptidu.In a preferred embodiment, one or more additional genes encoding YAP3 may be used to transform the yeast cell, such that the cell culture overexpresses the gene or genes, and this overproduction of YAP3 ensures more complete cleavage of X ³ -X ⁷ from the heterologous polypeptide.

V této souvislosti kvasinková aspartová proteasa 3 (YAP3) zahrnuje přírodní YAP3 enzym stejně jako enzymy odvozené od přírodního enzymu, při čemž C-konec je modifikován, aby se zajistilo účinné uvolnění YAP3 proteinu z buňky, nebo při tom může dojít k jakékoliv modifikaci, která zachovává proteolytickou aktivitu.In this context, the yeast aspart protease 3 (YAP3) comprises a natural YAP3 enzyme as well as enzymes derived from a natural enzyme, wherein the C-terminus is modified to ensure effective release of YAP3 protein from the cell, or any modification that may occur preserves proteolytic activity.

Proteasou může být také A. lyticus proteasa I, enterokinasa nebo trypsin.The protease may also be A. lyticus protease I, enterokinase or trypsin.

Předložený vynález je dále popsán podrobně na následujících příkladech, které v žádném případě nejsou zamýšleny jako omezení rozsahu vynálezu tak, jak uveden v nárocích.The present invention is further described in detail by the following examples, which in no way are intended to limit the scope of the invention as set forth in the claims.

Při popisu vynálezu je odkazováno na následující obrázky.In describing the invention, reference is made to the following figures.

Obrázek 1 ukazuje obecné schéma konstrukce plasmidů obsahujících geny, které exprimují polypeptidy rozšířené na N-konci. V obrázku 1 jsou použity následující symboly: 1: promotorové sekvence TPI gen ze S. cerevisiae. 2: oblast kódující signál/leader peptid (např. z genu α-faktoru S. cerevisiae). 3: oblast kódující heterologní polypeptid. 3*: oblast kódující rozšíření heterologního polypeptidu na N-konci. 4: terminátorovou sekvenci TPI genu ze S. cerevisiae. Pl: syntetický oligonukleotidový PCR primer určující strukturu rozšíření na N-konci. P2: universální PCR primer pro amplifikace oblasti 3. POT: TPI gen ze S. pombe. 2μ počátek replikace: sekvence ze S. cerevisiae 2 μ plasmidu zahrnující její počátek replikace DNA v S. cerevisiae. Ap“: sekvence z pBR322/pUC13 zahrnující gen resistence na ampicilin a počátek replikace DNA v E. coli.Figure 1 shows a general scheme for construction of plasmids containing genes that express polypeptides spread at the N-terminus. In Figure 1, the following symbols are used: 1: TP1 gene promoter sequences from S. cerevisiae. 2: signal / leader peptide coding region (eg from the α-factor S. cerevisiae gene). 3: heterologous polypeptide coding region. 3 *: region encoding the extension of the heterologous polypeptide at the N-terminus. 4: the terminator sequence of the TPI gene from S. cerevisiae. P1: synthetic oligonucleotide PCR primer determining the N-terminal extension structure. P2: universal PCR primer for amplification of region 3. POT: TPI gene from S. pombe. 2μ origin of replication: sequence from S. cerevisiae 2 μ plasmid including its origin of DNA replication in S. cerevisiae. Aβ ': sequence from pBR322 / pUC13 comprising the ampicillin resistance gene and the origin of DNA replication in E. coli.

Obrázek 2 ukazuje DNA sekvenci v pJB59 kódující inzulínový prekursor B_e._t. (1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_r._t. (1-21) napojený na N-konci na 85 zbytků, které tvoří α-faktorový signálni/leader peptid, v němž Leu v poloze 82 a Asp v poloze 83 jsou substituovány Met a Ala.Figure 2 shows the DNA sequence in pJB59 encoding the insulin precursor B _e . _t . (1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A _r . _t . (1-21) linked at the N-terminus to 85 residues that form the α-factor signal / leader peptide, wherein Leu at position 82 and Asp at position 83 are substituted with Met and Ala.

Obrázek 3 je DNA sekvence pAK623 kódující GLP-l₇__36Alanapojený na N-konci na syntetickou signálni/leader sekvencí YAP3/S1_pavx .Figure 3 is the DNA sequence of pAK623 encoding GLP-l ₇ _ _36Ala connected to the N-terminus to a synthetic signal / leader sequence YAP3 / S1 _pavx.

Obrázek 4 ukazuje DNA sekvenci pKV142 kódující ^.^.(1-29)-Ala-Arg-A_ř._t.(l-21) napojený na N-konci na 85 zbytků, které tvoří α-faktorový signálni/leader peptid, v němž Leu v poloze 82 a Asp v poloze 83 jsou substituovány Met a Ala.Figure 4 shows the DNA sequence of pKV142 encoding ^. ^. (1-29) _-Ala-Arg-N. _t. (l-21) coupled to the N-terminal 85 residues which make α-factor signal / leader peptide in which Leu in position 82 and Asp in position 83 have been substituted by Met and Ala.

Obrázek 5 ukazuje DNA sekvenci pAK679 kódující Β*_β1.(1-29)-Ala-Arg-Lys-A*_at. (1-21) napojený na N-konci na syntetickou signální/leader sekvenci YPA3/LA19”.Figure 5 shows the DNA sequence of pAK679 encoding Β * _β1 . (1-29) -Ala-Arg-Lys-A * _at . (1-21) linked at the N-terminus to the synthetic signal / leader sequence YPA3 / LA19 ”.

Obrázek 6 ukazuje HPLC chromatogramy kultivačních supernatantů obsahujících inzulínový prekursor B_řat. (l-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A^et. (1-21) s nebo bez rozšířeních na N-konci a s nebo in vivo nebo in vitro opracováním rozšířeních na N-konci.Figure 6 shows HPLC chromatograms of culture supernatants containing the insulin precursor B _RAT. (1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-^et. (1-21) with or without N-terminal extensions and with or in vivo or in vitro treatment of N-terminal extensions.

Obrázek 7 ukazuje produkty podle obrázku 4 rozdělené podle velikosti na 10% (hmotn.) tricin-SDS-PAGE-gelu.Figure 7 shows the products of Figure 4 sized by 10% (w / w) tricine-SDS-PAGE-gel.

Obrázek 8 ukazuje vliv přítomnosti YAP3 koexprese na výtěžek, odvozený od HPLC dat, v pJB176 při srovnání s pJB64.Figure 8 shows the effect of the presence of YAP3 coexpression on the HPLC-derived yield in pJB176 as compared to pJB64.

Příklady provedeni vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Plasmidy a DNA materiálPlasmids and DNA material

Všechny expresní plasmidy jsou typu C-POT (viz obrázek i) , Tyto plasmidy, podobné těm, které jsou popsány ve spisu WO SP 171 142, jsou charakterizovány tím, že obsahují gen Schizcj= charomyces pombe triosofosfátisomerasy (POT) pro selekci a stabilizaci plasmidu v S. cerevisiae. Plasmidy dále obsahují promotor (oblast 1 na obrázku 1) a terminátor (oblast 4 na obrázku 1) S. cerevisiae triosofosfátisomerasy. Tyto sekvence jsou identické s odpovídajícími sekvencemi v plasmidu pKFN1003 (popsaném ve spisu WO 90/100075) stejně jako všechny sekvence vyjma sekvence EcoRI-Xbal fragmentu kódující signál/leader/produkt (oblast 2 a 3 na obrázku 1). Aby se exprimovaly různé heterologní proteiny, EcoRI-Xbal fragment plasmidu pKFN1003 se jednoduše nahradí EcoRI-Xbal fragmentem kódujícím signál/leader /produkt, o který se jedná. Takové EcoRI-Xbal fragmenty mohou být syntetizovány pomocí syntetických oligonukleotidů a PCR podle standardních způsobů (viz shora Sambrook a spol., 1989).All expression plasmids are of the C-POT type (see Figure i). These plasmids, similar to those described in WO SP 171 142, are characterized in that they contain the Schizci = charomyces pombe triosophosphate isomerase (POT) gene for the selection and stabilization of the plasmid. in S. cerevisiae. The plasmids further comprise a S. cerevisiae triosophosphate isomerase promoter (region 1 in Figure 1) and a terminator (region 4 in Figure 1). These sequences are identical to the corresponding sequences in plasmid pKFN1003 (described in WO 90/100075) as well as all sequences except the EcoRI-XbaI fragment of the signal / leader / product coding sequence (regions 2 and 3 in Figure 1). In order to express the various heterologous proteins, the EcoRI-XbaI fragment of plasmid pKFN1003 is simply replaced by the EcoRI-XbaI fragment encoding the signal / leader / product of interest. Such EcoRI-XbaI fragments can be synthesized using synthetic oligonucleotides and PCR according to standard methods (see Sambrook et al., 1989 above).

Obrázek 1 ukazuje obecné schéma použité pro konstrukci plasmidů obsahující geny exprimující polypeptidy rozšířené na N-konci. Toto schéma zahrnuje následující stupně.Figure 1 shows the general scheme used to construct plasmids containing genes expressing N-terminally extended polypeptides. This scheme includes the following steps.

- Vzorek C-POT plasmidového vektoru se rozštěpí restrikčními nukleasami EcoRV a Xbal a standardními molekulárními způsoby (Sambrook J., Fritsch E.L. a Maniatis T.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.) se isoluje největší DNA fragment.- The C-POT sample of the plasmid vector was digested with EcoRV and XbaI restriction nucleases and the largest DNA was isolated by standard molecular methods (Sambrook J., Fritsch EL and Maniatis T .: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). fragment.

- Další vzorek C-POT plasmidu (který může být stejný nebo jiný než shora uvedený plasmid) se rozštěpí restrikčními nukleasami EcoRV a Ncol a isoluje se fragment obsahující oblast 1 a 2.Another sample of the C-POT plasmid (which may be the same or different from the above plasmid) is digested with the restriction nucleases EcoRV and NcoI and the fragment containing regions 1 and 2 is isolated.

- Provede se polymerasová řetězová reakce (PCR) s použitím sestavy Gene Amp PCR reagent kit (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, Kt. 06859, USA) podle pokynů výrobce a syntetických oligonukleotidových primerů PÍ a P2 na matrici (která může být stejná nebo jiné než shora uvedené plasmidy) kódující heterologní polypeptid, o který se jedná. PÍ je označen tak, že zahrnuje místo pro rozpoznáni restrikční nukleasy Ncol (5'CCATGG3') následované sekvencemi, které kódují KEX2 místo opracování, N-koncové rozšíření a 10 až 15 nukleotidů identických se sekvencí kódu16 jící původní N-konec heterologního proteinu, o který se jedná. P2 (např. 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3·) je navržen tak, že amplifikuje oblast 3 a obklopující místo pro rozpoznání restrikční nukleasou Xbal (5⁷-TCTAGA-3⁷) v PCR s PÍ standardními způsoby popsanými Sambrookem a spol., viz shora.- Polymerase Chain Reaction (PCR) is performed using a Gene Amp PCR reagent kit (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, Kt. 06859, USA) according to the manufacturer's instructions and synthetic P1 and P2 oligonucleotide primers on the matrix (which may be the same or different) than the above-mentioned plasmids) encoding the heterologous polypeptide of interest. P1 is designated to include a NcoI restriction nuclease recognition site (5'CCATGG3 ') followed by sequences that encode a KEX2 processing site, an N-terminal extension, and 10 to 15 nucleotides identical to the sequence encoding the original N-terminus of the heterologous protein 16, o that is. P2 (e.g. 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG ·-3) is designed so that it amplifies region 3 and the surrounding recognition site for restriction nuclease XbaI (TCTAGA 5 ⁷ 3 ⁷⁾ in the PCR PI standard methods described in Sambrook et al., Supra above.

- PCR produkt se rozštěpí restrikčními nukleasami Ncol a Xbal a rozštěpený fragment se isoluje.The PCR product is digested with the restriction nucleases NcoI and XbaI, and the digested fragment is isolated.

- Isolované fragmenty se spolu ligují pomocí T4 DNA ligasy za standardních podmínek (popsáno Sambrookem a spol., viz shora).The isolated fragments are ligated together with T4 DNA ligase under standard conditions (described by Sambrook et al., Supra).

- Ligační směs se použije pro transformaci příslušných E. coli buněk ap^r a provede se selekce resistencí na ampicilin podle Sambrooka a spol., viz shora.- The ligation mixture was used to transform competent E. coli cells ap ^r and selection was carried out to ampicillin resistance according to Sambrook et al., Supra.

- Standardními molekulárními způsoby (popsanými Sambrookem a spol., viz shora) se z výsledných E. coli klonů isolují plasmidy.Standard plasmids are isolated from the resulting E. coli clones by standard molecular methods (described by Sambrook et al., Supra).

- Použitím enzymatických řetězových zakončení (Sequenase, United States Biochemicals) se podle pokynů výrobce provede DNA sekvenování, aby se ověřily (nebo určily) DNA sekvence kódující polypeptid rozšířený na N-konci a aby bylo jisté, že jde o oblast s DNA sekvencí kódující signál/leader peptid oblasti 2.- Using enzymatic chain termini (Sequenase, United States Biochemicals), DNA sequencing is performed according to the manufacturer's instructions to verify (or determine) the DNA sequences encoding the N-terminal extended polypeptide and to ensure that it is a region with a DNA sequence encoding the signal / leader peptide of region 2.

- Tento plasmid se použije pro transformaci kvasinkového kmene MT663 a pro vybrání růstu na glukosu, jak je podrobně popsáno níže.This plasmid is used to transform the yeast strain MT663 and to select for growth into glucose, as described in detail below.

Transformace kvasinek: S. cerevisiae kmen MT663 (E2-7B XE11-36 a/α, Atpi/Atpi, pep 4-3/pep 4-3) (kvasinkový kmen MT663 byl uložen v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur v souvislosti s podáním spisu WO 92/11378 pod číslem ukožení DSM 6278) byl nechán růst na YPGaL (1 % (hmotn.) kvasinkového extraktu Bacto, 2 % (hmotn.) Bacto peptonu, 2 % (hmotn.) galaktosy, 1 % (hmotn.) laktátu) na optickou hustotu (OD) 0,6 přiYeast transformation: S. cerevisiae strain MT663 (E2-7B XE11-36 a / α, Atpi / Atpi, pep 4-3 / pep 4-3) (yeast strain MT663 was deposited in the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures in connection with administration No. WO 92/11378 under accession number DSM 6278) was grown to YPGaL (1% Bacto yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% galactose, 1% w / w). lactate) to an optical density (OD) of 0.6 at

600 nm.600 nm.

Odstřelováním se získá 100 ml kultury, která se promyje 10 ml vody, odstřeáuje a resuspenduje v 10 ml roztoku, který obsahuje 1,2M sorbitol, 25mM Na_aEDTA, pH 8,0, a 6,7 mg/ml dithiothreitolu. Suspenze se inkubuje 15 minut při 30 ^eC, odstřeáuje a buňky se resuspenduji v 10 ml roztoku, který obsahuje 1,2M sorbitol, lOmM Na2EDTA, 0,lM citrát sodný, pH 5,8, a 2 mg Novozymu^<B>234. Tato suspenze se inkubuje 30 minut při 30 °C, buňky se isolují odstřeáováním, promyjí se 10 ml 1,2M sorbitolu a 10 ml CAS (1,2M sorbitol, lOmM CaCl2, lOmM Tris HCl (Tris znamená tris(hydroxymethyl)aminomethan), pH 7,5) a resuspenduji se ve 2 ml CAS. Pro transformaci se 1 ml buněk suspendovaných v CAS smíchá s přibližně 0,1 pg plasmidové DNA a nechá se stát 15 minut za teploty místnosti. Přidá se 1 ml směsi (20% (hmotn.) polyethylenglykol 4000, lOmM CaCl₂, lOmM Tris HCl, pH 7,5) a směs se ponechá dalších 30 minut za teploty místnosti. Tato směs se odstřeluje, peleta se resuspenduje v 0,1 ml SOS (1,2M sorbitol, 33% (obj.) YPD, 6,7mM CaCl₂) a inkubuje se 2 h při 30 °C. Suspenze se pak odstřeáuje a peleta se resupenduje v 0,5 ml 1,2M sorbitolu. Potom se při 52 °C přidá 6 ml vrchního agaru (SC medium podle Shermana a spol.: Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1992)) obsahující 1,2M sorbitol a 2,5% (hmotn.) agar) a suspenze se nalije na povrch desek obsahujících stejný ztuhlý agar a medium obsahující sorbitol .By centrifugation, 100 ml of culture is obtained, which is washed with 10 ml of water, centrifuged and resuspended in 10 ml of a solution containing 1.2 M sorbitol, 25 mM Na _and EDTA, pH 8.0, and 6.7 mg / ml dithiothreitol. The suspension is incubated for 15 minutes at 30 ^e C, centrifuged and the cells resuspended in 10 ml of a solution containing 1.2M sorbitol, lOmM Na 2 EDTA, 0 M sodium citrate, pH 5.8, and 2 mg Novozym ^<B> 234th This suspension is incubated for 30 minutes at 30 ° C, cells are harvested by centrifugation, washed with 10 ml 1.2M sorbitol and 10 ml CAS (1.2M sorbitol, 10mM CaCl 2, 10mM Tris HCl (Tris means tris (hydroxymethyl) aminomethane), pH 7.5) and resuspended in 2 ml CAS. For transformation, 1 ml of cells suspended in CAS are mixed with approximately 0.1 µg of plasmid DNA and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. 1 ml of the mixture (20% (w / w) polyethylene glycol 4000, 10 mM CaCl ₂ , 10 mM Tris HCl, pH 7.5) was added and the mixture was left at room temperature for a further 30 minutes. This mixture is centrifuged, the pellet is resuspended in 0.1 ml SOS (1.2 M sorbitol, 33% (v / v) YPD, 6.7 mM CaCl ₂ ) and incubated for 2 h at 30 ° C. The suspension is then centrifuged and the pellet resuspended in 0.5 ml of 1.2 M sorbitol. Then 6 ml of top agar (SC medium according to Sherman et al .: Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1992) containing 1.2 M sorbitol and 2.5% agar) was added at 52 ° C and the suspension is poured onto the surface of plates containing the same solidified agar and sorbitol-containing medium.

Příklad 1Example 1

Konstrukce pJB108 a pJB109Construction of pJB108 and pJB109

Plasmid pJB59 je derivátem pKFN1003, v němž EcoRI-Xbal fragment kóduje inzulínový prekursor B_ř._t. (l-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_r.t. (1-21) napojený na N-konci na signál/leader sekvenci odpovídající 85 zbytkům preprosignálního peptidů a-faktoru, v němž Leu v poloze 82 a Asp v poloze 83 jsou substituovány Met a Ala (obrázek 2). EcoRI-Xbal fragment je syntetizován v biosystému DNA syntetizátoru (Perkin Elmer DNA Thermal Cycler) podle pokynů výrobce.Plasmid pJB59 is a derivative of pKFN1003 in which the EcoRI XbaI fragment encodes the insulin precursor B _r. _t . (l-27) _{-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-N} .t. (1-21) linked at the N-terminus to a signal / leader sequence corresponding to 85 residues of the α-factor preprosignal peptide in which Leu at position 82 and Asp at position 83 are substituted with Met and Ala (Figure 2). The EcoRI-XbaI fragment is synthesized in a DNA synthesizer (Perkin Elmer DNA Thermal Cycler) biosystem according to the manufacturer's instructions.

Plasmidové konstrukce navržené pro expresi inzulínového prekursorů B_řat. (1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A*._t. (1-21) rozšířeného na N-konci byly získány pomocí Pl-primeru s následující sekvencíPlasmid constructs designed for the expression of insulin precursors of B- _rays . (I-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A *. _t . (1-21) extended at the N-terminus were obtained using a P1-primer with the following sequence

Ncol ' -GGGGTATCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCT ( AC ) CAAAGTTCGTT GlyLeuSerMetAlaLysArgGluGluAlaGluAlaGluAla Xaa LysPheValNcol '-GGGGTATCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCT (AC) CAAAGTTCGTT GlyLeuSerMetAlaLysArgGluGluAlaGluAlaGluAla Xaa LysPheVal

AACCAACAC-3' AsnGlnHis,AACCAACAC-3 'AsnGlnHis,

P2 primeru: 5^Z-AATTTATTTTACATAACACTAG-3^Z a plasmidu pJB59 podle shora popsaného obecného schématu. PCR a klonování vedly ke konstrukci, v níž DNA sekvence kódující inzulínový prekursor B_ret (1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-At.1. (1-21) předchází DNA sekvenci kódující rozšíření Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Xaa-Lys na N-konci, při čemž Xaa znamená buS Pro (pJB108, Pro kodován CCA) nebo Thr (pJB109, Thr kódován ACA).P2 primer: 5 ^Z -AATTTATTTTACATAACACTAG-3 ^Z and plasmid pJB59 according to the general scheme described above. PCR and cloning resulted in a construction in which the DNA sequence encoding the insulin precursor B _ret (1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-At.1. (1-21) precedes the DNA sequence encoding the extension of Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Xaa-Lys at the N-terminus, wherein Xaa is either SS Pro (pJB108, CCA encoded) or Thr (pJB109, Thr encoded by ACA).

Příklad 2Example 2

Konstrukce pJB44, pJB107 a pJB126Construction of pJB44, pJB107 and pJB126

Plasmidové konstrukce navržené pro expresi dalších versi na N-konci rozšířeného inzulínového prekursorů Β*.ϊ.(1-27)-Α3ρ-Lys-Ala-Ala-Lys-A_ret. (1-21) byly získány pomocí Pl-primeru s následující sekvencíPlasmid constructs designed to express additional versi at the N-terminus of the extended insulin precursor Β * .ϊ. (1-27) -α3ρ-Lys-Ala-Ala-Lys-A _ret . (1-21) were obtained using a P1-primer with the following sequence

NcolNcol

5' -GGGGTATCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCTG (CAG ) ( AC ) AAAGTTC GlyLeuSerMetAlaLysArgGluGluAlaGluAlaGluAla Xaa LysPhe5 '-GGGGTATCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCTG (AC) AAAGTTC GlyLeuSerMetAlaLysArgGluGluAlaGluAlaGluAla Xaa LysPhe

GTTAACCAACAC-3’GTTAACCAACAC-3 ’

ValAsnGlnHis,ValAsnGlnHis,

P2 primerů: 5^/-AATTTATTTTACATAACACTAG-3^z a plasmidu pJB59, jak popsáno v příkladu 1. Z výsledných plasmidů byly isolovány pJB44, pJB107 a PJB126. Tyto plasmidy kódují inzulínový prekursor B_řet. (1-27 )-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_ert.( 1-21), který předchází rozšíření Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Xaa-Lys na N-konci, při čemž Xaa znamená buá Glu (pJB44, Glu kodován GAA), Asp (pJB126, Asp kódován GAC) nebo Gly (pJB107, Gly kódován GGC).P2 primers: 5 ^/ -AATTTATTTTACATAACACTAG-3 ^from a plasmid pJB59 as described in example 1. Among the resulting plasmids were isolated pJB44, PJB126, and pJB107. These plasmids encode the insulin precursor B _chain . (1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys- _Aert (1-21), which precedes the extension of Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Xaa-Lys at the N-terminus, wherein Xaa is either Glu (pJB44, Glu encoded by GAA), Asp (pJB126, Asp encoded by GAC) or Gly (pJB107, Gly encoded by GGC).

Příklad 3Example 3

Konstrukce pJB64 a pJBUOConstruction of pJB64 and pJBUO

Plasmidové konstrukce navržené pro expresi inzulínového prekursoru B_řet. (1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A*.^ (1-21) rozšířeného na N-konci byly získány pomocí Pl-primeru s následující sekvencíPlasmid constructs designed to express the insulin precursor B _chain . (1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A *. (1-21) extended at the N-terminus were obtained using a Pl-primer with the following sequence

NcolNcol

5'-GGGGTATCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGG(AC)AAAGTTC GlyLeuSerMetAlaLysArgGluGluAlaGluAlaGlu Xaa LysPhe5'-GGGGTATCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGG (AC) AAAGTTC GlyLeuSerMetAlaLysArgGluGluAlaGluAlaGlu Xaa LysPhe

GTTAACCAACAC-3' ValAsnGlnHis,GTTAACCAACAC-3 'ValAsnGlnHis,

P2 primerů: 5^,-AATTTATTTTACATAACACTAG-3' a plasmidu pJB59, jak popsáno v příkladu 1. Z výsledných plasmidů byly isolovány pJB64 a pJBUO. Tyto plasmidy kódují rozšíření na N-konci část B_ř._t. (1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A^.t. (1-21), která předchází DNA sekvence kódující Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Xaa-Lys rozšíření na N-konci, při čemž Xaa znamená buá Glu (pJBUO, Glu kodován GAA) nebo Ala (pJB64, Ala kódován GCA).P2 primers: ⁵ -AATTTATTTTACATAACACTAG-3 'and the plasmid pJB59 as described in example 1. Among the resulting plasmids were isolated and pJB64 pJBUO. These plasmids encode the extension at the N-terminal portion _of B. _t . (I-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-Al. (1-21), which precedes the DNA sequence encoding the Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Xaa-Lys extension at the N-terminus, wherein Xaa is either Glu (pJBUO, Glu encoded by GAA) or Ala (pJB64, Ala encoded by GCA).

Příklad 4Example 4

Konstrukce pAK663Construction of pAK663

Plasmid pAK623 je derivátem pKNF 1003, v němž EcoRI-Xbal fragment kóduje GLP-l₇__36Xla na N-konci napojený na syntetickou signální leader sekvenci YAP3/Sl_pxvx (obr. 3).Plasmid pAK623 is a derivative pKFN 1003 in which the EcoRI XbaI fragment encodes GLP-l ₇ _ _36XL N-terminally fused to a synthetic signal leader sequence YAP3 / Sl _pxvx (Fig. 3).

EcoRI-Xbal fragment byl syntetizován v DNA syntetizátoru Applied Biosystems podle pokynů výrobce.The EcoRI-XbaI fragment was synthesized in an Applied Biosystems DNA synthesizer according to the manufacturer's instructions.

Plasmidové konstrukce navržené pro expresi GLP-l₇._3eAla s rozšířením na N-konci Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Arg byly získány pomoci Pl-primeru s následující sekvencíPlasmid constructs designed for GLP- ₁₇ expression. _3eAla with the N-terminus extension of Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Arg were obtained using the Pl-primer with the following sequence

Ncol ' -AACGTTGCCATGGCTCCAGCTCCAGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAA AsnVa1AlaMetAlaProAlaValAlaLysArgGluGluAlaGluAlaGluNcol '-AACGTTGCCATGGCTCCAGCTCCAGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAA AsnVa1AlaMetAlaProAlaValAlaLysArgGluGluAlaGluAlaGlu

GCTGAAAGACATGCTGAAGGT-3'GCTGAAAGACATGCTGAAGGT-3 '

AlaGluArgHisAlaGluGly,AlaGluArgHisAlaGluGly,

P2 primerů: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3· a plasmidu pAK623 podle shora popsaného způsobu. Získá se tak plasmid pAK663.P2 primers: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3 · and plasmid pAK623 according to the method described above. This gave plasmid pAK663.

Příklad 5Example 5

Exprese produktu rozšířeného na N-konci a odstranění rozšířeníExpress the N-terminal extended product and remove the extension

Kvasinkový kmen MT663 transformovaný shora popsanými C-POT plasmidy (pJB59, pJB108, pJB109, pJB44, pJB126, pJB107, pJB64 a pJBUO) byl nechán růst na YPD (1 % (hmotn.) kvasinkového extraktu, 2 % (hmotn.) peptonu a 2 % (hmotn.) glukosy) agarových deskách. Jednotlivé kolonie byly použity pro kultivaci 5 ml kapalné kultury v YPB živném prostředí, pH 6,0, které bylo třepáno 72 h při 30 °C. Výtěžky produktů byly stanoveny přímo v supernatanetech kultury podle způsobu popsaného Snelem, Damgaar21 dem a Mollerupem: Chromatographia 24. 329 (1987).Yeast strain MT663 transformed with the above described C-POT plasmids (pJB59, pJB108, pJB109, pJB44, pJB126, pJB107, pJB64 and pJBUO) was grown to YPD (1% (w / w) yeast extract, 2% (w / w) peptone). 2% (w / w) glucose) agar plates. Individual colonies were used to cultivate 5 ml of liquid culture in YPB broth, pH 6.0, which was shaken for 72 h at 30 ° C. Product yields were determined directly in culture supernatants according to the method described by Snel, Damgaar21 dem and Mollerup: Chromatographia 24, 329 (1987).

Výsledky s kvasinkovými kmeny exprimujícími na N-konci rozšířený B_ret. (1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_eet. (1-21) při srovnání s nerozšířenou formou (pJB59) jsou uvedeny níže:Results with yeast strains expressing N-terminal extended B _ret . (1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A _eet . (1-21) as compared to the non-expanded form (pJB59) are shown below:

plasmid plasmid rozšíření na N-konci extension at the N-terminus výtěžek yield pJB59 pJB59 100 % 100% pJB108 pJB108 Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Pro-Lys Glu-Glu-Ala-Glu-Gla-Glu-Gla-Ala-Pro-Lys 275 % 275% pJB109 pJB109 Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Thr-Lys Glu-Glu-Ala-Glu-Gla-Glu-Gla-Ala-Thr-Lys 300 % 300% pJB44 pJB44 Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Lys Glu-Glu-Ala-Glu-Gla-Glu-Gla-Glu-Lys 325 %' 325% ' pJB126 pJB126 Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Asp-Lys Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Asp-Lys 300 % 300% pJB107 pJB107 Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gly-Lys Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gly-Lys 275 % 275% pJB64 pJB64 Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys 250 % 250% pJBUO pJBUO Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Glu-Lys Glu-Glu-Glu-Ala-Glu-Glu-Glu-Lys 225 % 225%

Výtěžky označené hvězdičkou (*) označují, že produkt je směs na N-konci rozšířeného B_r._t.(l-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-At_et. (1-21) a na N-konci nerozšířeného B_řet.(l-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-Aret. (1-21). Druhý z nich je výsledkem in vivo štěpení rozšíření popsaného níže a ilustrovaného na obr. 4 a 5.Yields marked with an asterisk (*) indicates that the product is a mixture of N-terminally extended B _r. _t. (l-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-At _et. (1-21) and the N-terminus unextended B _Ret. (L-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-Aret. (1-21). The second is the result of the in vivo cleavage of the extension described below and illustrated in Figures 4 and 5.

V případě pAK663, který exprimuje GLP-1₇._36A1« rozšířený na N-konci o Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Arg, byl výtěžek dvacetinásobný než u pAK623, který exprimuje nerozšířený GLP-l₇__36Jtla.In the case of pAK663, which expresses GLP- ₁₇ . _36A1 «extended at the N-terminus of Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Arg the yield was twenty times than pAK623 expressing non-enlarged GLP-l ₇ _ _36Jtla.

Příklad 6Example 6

Odstranění rozšíření na N-konci in vivoRemoval of N-terminal extension in vivo

Supernatanty získané z kultur kvasinkových kmenů transformovaných plasmidy pJB59, pJB64, pJB44 a pJB108 (viz shora) byly vyhodnoceny HPLC chromatografií (obrázek 4a) a současně byly vzorky podrobeny elektorofořeze na 10% (hmotn.) tricin-SDS-PAGE gelu (obrázek 5, pásy 1, 2, 3 a 4). Z HPLC chromatogramů se ukazuje, že supernatanty z kvasinek s plasmidem pJB44 (chromatogram 3) a pJB64 (chromatogram 2) obsahují jak na konci rozšířený tak nerozšířený B_řet.( 1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A( 1-21), zatímco supernatanty z kvasinek s pJB108 (chromatogram 4) obsahuji pouze formu rozšířenou na N-konci. V případě pJB64 bylo asi 50 % prekursoru nalezeno v nerozšířené formě (viz také 5, pás 2), zatímco tato forma představuje pouze menší část u pJB44.Supernatants obtained from cultures of yeast strains transformed with plasmids pJB59, pJB64, pJB44 and pJB108 (see above) were evaluated by HPLC chromatography (Figure 4a) and at the same time electrophoresed on a 10% (w / w) Tricine-SDS-PAGE gel (Figure 5, lanes 1, 2, 3 and 4). HPLC chromatograms show that yeast supernatants with plasmid pJB44 (chromatogram 3) and pJB64 (chromatogram 2) contain both the extended and non-expanded B _chain (1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A (1-21), whereas yeast supernatants with pJB108 (chromatogram 4) contain only the N-terminally extended form. In the case of pJB64, about 50% of the precursor was found in the non-expanded form (see also 5, lane 2), while this form represents only a minor portion of pJB44.

Tyto výsledky ilustrují schopnost kvasinek odštěpit N-koncová rozšíření selektivně in vivo, jestliže tímto rozšířením je bud Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys (pJB64) nebo Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Lys (pJB44) a neschopnost kvasinek odštěpit N-koncové rozšíření ve formě Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Pro-Lys (pJB108). Proteolytická aktivita zodpovědná za odštěpení rozšíření může souviset s enzymy na sekreční cestě, jako je na membránu navázaný YAP3 v trans-Golgi systému kvasinkových buněk.These results illustrate the ability of yeast to cleave N-terminal extensions selectively in vivo when the extension is either Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys (pJB64) or Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu- Ala-Glu-Lys (pJB44) and the inability of yeast to cleave the N-terminal extension in the form of Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Pro-Lys (pJB108). The proteolytic activity responsible for cleavage of extension may be related to enzymes on the secretory pathway, such as membrane-bound YAP3 in the yeast cell trans-Golgi system.

Příklad 7Example 7

Odstranění N-koncových rozšíření in vitroRemoval of N-terminal extensions in vitro

Shora popsané supernatanty byly použity jako substráty pro proteolytické štěpení s buá primárně vyčištěným YAP3 enzymem isolovaným z kvasinkového kmene ME783 nadexprimujícím YAP3 (Egel-Mitani a spol., 1990.) nebo Achromobacter lyticus proteasou I.The supernatants described above were used as substrates for proteolytic digestion with either a purified YAP3 enzyme isolated from the yeast strain ME783 overexpressing YAP3 (Egel-Mitani et al., 1990.) or Achromobacter lyticus protease I.

Při YAP3 testu bylo použito: 4 μΐ YAP3 enzymu a 800 μΐ růstového media bez buněk. Vzorky byly inkubovány 15 h při 37 °C v pufru O,1M citrátu sodného, pH 4,0.In the YAP3 assay, 4 μΐ of YAP3 enzyme and 800 μΐ of cell-free growth medium were used. Samples were incubated for 15 h at 37 ° C in 0.1 M sodium citrate buffer, pH 4.0.

Při testu s Achromobacter lyticus proteasou I bylo použito: 10 μg A. lyticus proteasy I a 1 ml růstového media bez buněk. Vzorky byly inkubovány 1 h při 37 °C v pufru 0,lM Tris, pH 8,75.In the test with Achromobacter lyticus protease I, 10 µg of A. lyticus protease I and 1 ml cell-free growth medium were used. Samples were incubated for 1 h at 37 ° C in 0.1M Tris buffer, pH 8.75.

Obrázky 4b a 4c ukazují výsledky vyhodnocené HPLC chromatograf ií získané ze štěpení YAP3 a A. lyticus proteasou I. Současně byly tyto vzorky analyzovány na 10% (hmotn.) tricin-SDS-PAGE (obr. 5, pásy 5 a2 12).Figures 4b and 4c show results evaluated by HPLC chromatography obtained from YAP3 and A. lyticus protease I cleavage. At the same time, these samples were analyzed for 10% (w / w) tricine-SDS-PAGE (Figure 5, lanes 5 and 21).

Z chromatogramů na obr. 4b je vidět, že YAP3 enzym je schopen odštěpit N-koncová rozšíření selektivně, jestliže tato rozšíření jsou ve formě Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys (pJB64) nebo Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Lys (pJB44), ale nikoliv u Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Pro-Lys (pJB108) (viz také obr. 5, pásy 6, 7 a 8). Tyto výsledky jasně ukazují, že YAP3 nebo YAP3-podobné enzymy jsou zodpovědné za částečné štěpení rozšířeních na N-konci in vivo (viz příklad 6).It can be seen from the chromatograms in Fig. 4b that the YAP3 enzyme is able to cleave the N-terminal extensions selectively when these extensions are in the form of Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys (pJB64) or Glu-Glu- Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Lys (pJB44), but not Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Pro-Lys (pJB108) (see also Figure 5, lanes 6, 7 and 8). These results clearly show that YAP3 or YAP3-like enzymes are responsible for partial cleavage of N-terminal extensions in vivo (see Example 6).

Z chromatogramů na obr. 4c je vidět, že štěpení A. lyticus proteasou I vede ve všech případech ke stejnému produktu, konkrétně k B_řel.(1-27)-Asp-Lys-(spojeno disulfidovými vazbami)-Acet.(l-21), který je konečným výsledkem proteolytického štěpení po všech Lys-zbytcích nacházejících se v inzulínovém prekursoru B_eet. (l-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_eet. (121), včetně těch, které se nacházejí mezi B a A řetězcem prekursoru.From the chromatograms in Figure 4c, it can be seen that the cleavage of A. lyticus by protease I results in all cases in the same product, namely B [ _beta] (1-27) -Asp-Lys- (linked by disulfide bonds) -Acet. 21), which is the end result of proteolytic cleavage after all the Lys residues found in the insulin precursor B _eet . (1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-e _eet . (121), including those located between the B and A precursor chains.

V případě štěpení supernatantu z kultury kvasinky transformované pJB59 (exprimující nerozšířený B_rat.(l-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A^Jl-žl)) je vidět produkt, který se neobjevuje v jiných štěpeních. Tento produkt Arg-Be.1.(1-27)-Asp-Lys-(napojení disulf idovými vazbami )-Α*_βϊ. (1-21) pochází ze štěpení sekretovaného leader-prekursoru působením A. lyticus proteasy I v růstovém mediu. A. lyticus proteasa I štěpí mezi Lys a Arg zbytky v dibazickém KEX2 místě produktu, který unikl štěpení působením KEX2 na sekreční cestě kvasinkových buněk.In the case of the cleavage of the supernatant from a culture of yeast transformed with pJB59 (expressing non-expanded B _rat . (1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-^H1-1)), a product is seen which does not appear in other cleavages. This product Arg-Be.1 (1-27) -Asp-Lys- (disulfide bonding) -α * _βϊ . (1-21) is derived from cleavage of the secreted leader precursor by A. lyticus protease I in growth medium. A. lyticus protease I cleaves between the Lys and Arg residues in the dibasic KEX2 site of the product that escapes KEX2 cleavage on the yeast cell secretory pathway.

Příklad 8Example 8

Odstranění N-koncových rozšíření nadexpresí YAP3Removal of N-terminal extensions by overexpressing YAP3

YAP3 gen klonovaný Egel-Mitanim a spol. (Yeast 127 (1990).) byl vložen do C-POT plasmidu pJB64 kódujícího Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys-B_řet. (1-27) -Pro-Lys-Ala-Ala- Lys-Ae_-t. (1-21) (viz příklad 3) následujícím způsobem.YAP3 gene cloned by Egel-Mitani et al. (Yeast 127 (1990).) Was inserted into the C-POT plasmid pJB64 encoding Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys-B _chain . (1-27) -Pro-Lys-Ala-Ala-Lys-Ae _-t . (1-21) (see Example 3) as follows.

Sall/SacI fragment o 2500 párech nukleotidů obsahující YAP3 gen byl isolován z plasmidu pME768 (Egel-Mitani a spol: Yeast 6, 127 (1990).) a vložen do Sáli a Sací místa plasmidu pIC19R (March a spol.: Gene 32. 481 (1984).). Z výsledného plasmidu, který byl označen pME834, byl isolován Sall/Xhol fragment o 2500 párech nukleotidů obsahující YAP3 gen a tento fragment byl vložen do jedinečného Sáli místa mezi POT a Ap* sekvence plasmidu pJB64. Jeden výsledný plasmid byl označen pJB176·The 2500 bp SalI / SacI fragment containing the YAP3 gene was isolated from plasmid pME768 (Egel-Mitani et al., Yeast 6, 127 (1990)) and inserted into the SalI and SacI site of plasmid pIC19R (March et al., Gene 32). 481 (1984). From the resulting plasmid, which was designated pME834, a 2500 bp SalI / XhoI fragment containing the YAP3 gene was isolated and inserted into a unique SalI site between the POT and Aβ * sequences of plasmid pJB64. One resulting plasmid was designated pJB176 ·

Kvasinkový kmen MT663 byl transformován plasmidem pJB176 a analyzován jak popsáno v příkladu 5.Yeast strain MT663 was transformed with plasmid pJB176 and analyzed as described in Example 5.

Jak lze vidět z HPLC dat ukazujících výtěžek na obrázku 8, přítomnost YAP3 genu v pJB176 má zřetelné účinky ve vyšších procentech nerozšířeného Bm. (1-27)-Pro-Lys-Ala-Ala-Lys-A*_et.(l-21) v supernatantu kultury odpovídajících kvasinkových transformantů při srovnání s kvasinkovým transformantem pJB64.As can be seen from the HPLC data showing the yield in Figure 8, the presence of the YAP3 gene in pJB176 has distinct effects in higher percentages of unexpanded Bm. (1-27) -Pro-Lys-Ala-Ala-Lys-A * _et (1-21) in the culture supernatant of the corresponding yeast transformant as compared to the yeast transformant pJB64.

Tento výsledek ilustruje schopnost vyrobit kvasinkové kmeny se zvýšenou kapacitou odštěpovat N-koncová rozšíření selektivně in vivo tím, že se upraví hladina proteolysy způsobená YPA34.This result illustrates the ability to produce yeast strains with increased capacity to cleave N-terminal extensions selectively in vivo by adjusting the level of proteolysis caused by YPA34.

Příklad 9Example 9

Konstrukce pKV143Construction pKV143

Plasmid pKV142 je derivátem pKFN1003, v němž EcoRI-Xbal fragment kóduje inzulínový prekursor Bj._t. (l-29)-Ala-Ala-Arg(1-21) napojený na N-konci na signální/leader sekvenci odpovídající 85 zbytkům preprosignálního peptidu α-faktoru, v němž Leu v poloze 82 a Asp v poloze 83 jsou substituovány Met a Ala (obrázek 4).Plasmid pKV142 is a derivative of pKFN1003 in which the EcoRI-XbaI fragment encodes the insulin precursor Bj. _t . (1-29) -Ala-Ala-Arg (1-21) linked at the N-terminus to a signal / leader sequence corresponding to 85 residues of the α-factor preprosignal peptide in which Leu at position 82 and Asp at position 83 are substituted with Met and Ala (Figure 4).

Plasmidové konstrukce navržené pro expresi B_r._t.(l-29)-Ala-Ala-Arg-A_eet.(l-21) rozšířeného na N-konci o Asp-Asp-Ala-Asp-Ala-Asp-Ala-Asp-Pro-Arg byly získány pomocí Pl-primeru s následujíc! sekvencíPlasmid constructs designed for B _r expression. _t. (l-29) -Ala-Ala-Arg-A _EET. (l-21) extended at the N-terminus of Asp-Asp-Ala-Asp-Ala-Asp-Ala-Asp-Pro-Arg was obtained by using Pl-primer with the following! sequences

Ncol ' -GGGGTATCCATGGCTAAGAGAGACGACGCTGACGCTGACGCTGACCCAAGATTCGTT GlyLeuSerMetAlaLysArgAspAspAlaAspAlaAspAlaAspProArgPheValNcol '-GGGGTATCCATGGCTAAGAGAGACGACGCTGACGCTGACGCTGACCCAAGATTCGTT GlyLeuSerMetAlaLysArgAspAspAlaAspAlaAspAlaAspProArgPheVal

AACCAACACTTGTGCGG-3'AACCAACACTTGTGCGG-3 '

AsnGlnHisLeuCys ,AsnGlnHisLeuCys,

P2 primerů: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3· a plasmidu pKV142 podle shora popsaného obecného schématu.P2 primers: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3 · and plasmid pKV142 according to the general scheme described above.

Příklad 10Example 10

Konstrukce pKV102Construction pKV102

Plasmidové konstrukce navržené pro expresi B*_et. (1-29)-Ala-Ala-Arg-Aeet. (1-21) rozšířeného na N-konci o Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg byly získány pomocí Pl-primeru s následující sekvencíPlasmid constructs designed for expression of B * _et . (1-29) -Ala-Ala-Arg-Aeet. (1-21) extended at the N-terminus with Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg were obtained using a Pl-primer with the following sequence

Ncol · -GGGGTATCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCTGAACCAAAGGCTACA GlyLeuSerMetAlaLysArgGluGluAlaGluAlaGluAlaGluProLysAlaThrNcol · -GGGGTATCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCTGAACCAAAGGCTACA GlyLeuSerMetAlaLysArgGluGluAlaGluAlaGluAlaGluProLysAlaThr

AGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGG-3'AGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGG-3 '

ArgPheValAsnGlnHisLeuCys ,ArgPheValAsnGlnHisLeuCys,

P2 primerů: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3' a plasmidu pKV142 po dle shora popsaného obecného schématu.P2 primers: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3 'and plasmid pKV142 po according to the general scheme described above.

Příklad 11Example 11

Exprese B_eet. (1-29) -Ala-Ala-Arg-A^. (1-21) rozšířeného na N-konciExpression of B _eet . (I-29) -Ala-Ala-Arg-A1. (1-21) extended at the N-terminus

Kvasinkový kmen MT663 se transformuje C-POT plasmidy pKV142, pKV143 a pKV102 a analyzuje se jak popsáno v příkladuThe yeast strain MT663 was transformed with the C-POT plasmids pKV142, pKV143 and pKV102 and analyzed as described in the example.

5.5.

Výsledky s kvasinkovými kmeny exprimujícími N-konci rozšířený Br.t. (1-29) -Ala-Ala-Arg-At.e. (1-21) při srovnání s nerozšířenou formou (pKV142) jsou uvedeny níže:Results with yeast strains expressing N-terminal extended Br.t. (1-29) -Ala-Ala-Arg-Ate. (1-21) as compared to the non-distributed form (pKV142) are shown below:

plasmid rozšíření na N-konciN-terminal extension plasmid

PKV142 pKV143 Asp-Asp-Ala-Asp-Ala-Asp-Ala-Asp-Pro-Arg pKV102 Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg výtěžek 100 % 263 %PKV142 pKV143 Asp-Asp-Ala-Asp-Ala-Asp-Ala-Asp-Pro-Arg pKV102 Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg Yield 100% 263%

400 %400%

Příklad 12Example 12

Konstrukce a exprese pIM69 a pIM70Construction and expression of pIM69 and pIM70

Plasmid pAK679 je derivátem pKFN1003, v němž EcoRI-Xbal fragment kóduje insulinový prekursor B^t. (l-29)-Ala-Ala-Lys“A^. (1-21) napojený na N-konci na syntetickou signální/leader sekvenci YAP3/LA19 (obrázek 5).Plasmid pAK679 is a derivative of pKFN1003 in which the EcoRI-XbaI fragment encodes the insulin precursor B ^ t. (1-29) -Ala-Ala-Lys-A '. (1-21) linked at the N-terminus to the synthetic signaling / leader sequence of YAP3 / LA19 (Figure 5).

Konstrukce plasmidů navržené pro expresi inzulínového prekursoru B_m.( 1-29j-Ala-Ala-Lys-A^J 1-21) napojeného na N-konci byly získány postupem, který zahrnuje dvě následné PCR reakce. První PCR reakce byla provedena pomocí primerů s následující sekvencíConstruction of plasmids designed to express insulin precursor B _m. (1-29j-Ala-Ala-Lys-A-1 to 21 J) connected to the N-terminus were obtained by a procedure involving two successive PCR reaction. The first PCR reaction was performed using primers with the following sequence

5'-GAAGAAGAAGAAGAAGAACCAAAGTTCGTTAACCAACAC-3· GluGluGluGluGluGluProLysPheValAsnGlnHis ,5'-GAAGAAGAAGAAGAAGAACCAAAGTTCGTTAACCAACAC-3 · GluGluGluGluGluGluProLysPheValAsnGlnHis,

P2 primerů: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3' a plasmidu pAK679.P2 primers: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3 'and plasmid pAK679.

Druhá PCR reakce byla provedena pomocí PÍ primerůThe second PCR reaction was performed using PI primers

Ncol ^#-GTTGTTAACTTGATCTCCATGGCTAAGAGAGAAGAA-3'Ncol ^# -GTTGTTAACTTGATCTCCATGGCTAAGAGAGAAGAA-3 '

ValValAsnLeuIleSerValAlaLysArgGluGlu ,ValValAsnLeuIleSerValAlaLysArgGluGlu,

P2 primerů: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3· a PCR produktu z první PCR reakce jako DNA-matrice pro druhou PCR reakci.P2 primers: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3 · and the PCR product from the first PCR reaction as a DNA matrix for the second PCR reaction.

PCR produkt druhé PCR reakce byl rozštěpen působením Ncol a Xbal a ligován do pAK679 podle shora popsaného obecného schématu. Z výsledných plasmidů byly identifikovány dva, které kódují Β*λ.( 1-29 J-Ala-Ala-Lys-A^X 1-21) rozšířený na N-konci o Glu-Glu-Glu-Pro-Lys (pIM70) a Glu-Glu-Glu-Glu-Pro-Lys (pIM69).The PCR product of the second PCR reaction was digested with NcoI and XbaI and ligated into pAK679 according to the general scheme described above. Of the resulting plasmids, two were identified that encode Β * λ (1-29 J-Ala-Ala-Lys-A ^ X 1-21) extended at the N-terminus with Glu-Glu-Glu-Pro-Lys (pIM70) and Glu-Glu-Glu-Glu-Pro-Lys (pIM69).

Kvasinkový kmen MT663 byl transformován C-POT plasmidy pAK579, pIM69 a pIM70 a analyzován jak popsáno v příkladu 5.Yeast strain MT663 was transformed with C-POT plasmids pAK579, pIM69 and pIM70 and analyzed as described in Example 5.

Zatímco nebyl zjištěn prakticky žádný výtěžek nerozšířeného B_c.e.( 1-29)-Ala-Ala-Lys-A_řet. (1-21) z kvasinky s pA579, kvasinka s pIM69 a pIM70 produkuje velká množství Glu-Glu-Glu-Glu-Pro-Lys-B_eet. (1-29)-Ala-Ala-Lys-A_rat. (1-21) a Glu-Glu-Glu-Pro-Lys-B^. (1-29) -Ala-Ala-Lys-At.t, (1-21).While Virtually no yield unextended B _c .e. (1-29) -Ala-Ala-Lys-A _lip. (1-21) from yeast with pA579, yeast with pIM69 and pIM70 produces large amounts of Glu-Glu-Glu-Glu-Pro-Lys-B _eet . (1-29) -Ala-Ala-Lys-A _rat . (1-21) and Glu-Glu-Glu-Pro-Lys-B1. (I-29) -Ala-Ala-Lys-At, (I-21).

s? č < -7 _ r?/with? <<-7 _ r? /

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS

Claims

A DNA construct encoding a polypeptide of the formula: signal peptide-leader peptide-X ¹ -X ² -X ³ -X ⁴ -X ⁵ -X ^e -x ^{6 7} -heterologous protein, wherein X ¹ is Lys or Arg,

X ^a represents Lys or Arg and X ¹ together with X ² define the yeast treatment site,

X ³ is Glu or Asp,

X * is an amino acid sequence of formula (AB) _n wherein A is Glu or Asp, B is Ala, Val, Leu or Pro and n is 0 to 5, provided that if n> 2 then A and B are independently each have the same or different group as compared to other A and B, or

X ⁴ is an amino acid sequence of formula (C) _B wherein c is Glu or Asp and m is 0 to 5,

X ⁵ represents a peptide bond or one or more amino acids, which may be the same or different,

X * is a peptide bond or amino acid residue selected from the group consisting of Pro, Asp, Thr, Ser, Glu, Ala, and Gly, and

X ⁷ is Lys or Arg.

The DNA construct of claim 1, wherein X ³ is Glu.

The DNA construct of claim 1, wherein A is Glu.

The DNA construct of claim 1, wherein B is Ala.

The DNA construct of claim 1, wherein n is preferably a number of 2 to 4, more preferably a number of 3.

The DNA construct of claim 1, wherein X ⁵ is a peptide bond, Glu, Asp or Glu-Pro-Lys-Ala.

The DNA construct of claim 1, wherein X ⁶ is Pro or a peptide bond.

The DNA construct of claim 1, wherein the signal peptide is an α-factor signal peptide, a yeast aspart protease 3 signal peptide, a mouse salivary amylase signal peptide, a carboxypeptidase signal peptide, or a yeast BARI signal peptide.

The DNA construct of claim 1, wherein the leader peptide is a natural leader peptide, such as a β-factor leader peptide, or a synthetic leader peptide.

The DNA construct of claim 1, wherein the heterologous protein is selected from the group consisting of aprotinin, tissue factor pathway inhibitor or other protease inhibitors, growth factor I or II-like insulin, human or bovine growth hormone, interleukin, tissue activator plasminogen, glucagon, glucagon-like peptide 1, factor VII, factor VIII, factor XIII, platelet-derived growth factor, enzymes, insulin or insulin precursor, and functional analogues of any of these proteins.

The DNA construct of claim 10, wherein the heterologous protein is an insulin, an insulin precursor, or a functional analogue thereof.

The DNA construct of any one of claims 1 to 11, wherein the amino acid sequence X ³ -X ⁷ is

Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala For Lys, Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu For Lys Ala Thr Arg, Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Lys 9 Glu Glu Ala For Lys / Glu Glu Ala Glu Ala GlU Ala Glu Pro Lys, Asp Asp Ala Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg, Glu Glu Glu Glu For Lys 9

Glu Glu Glu For Lys or Asp Asp Asp Asp Asp Lys.

13. A recombinant expression vector capable of replicating in yeast and which carries the DNA construct of claim 12.

14. A yeast strain characterized in that it is capable of expressing a heterologous protein and transformed with the vector of claim 13.

15. A method for producing a heterologous protein, comprising culturing the yeast cell of claim 14 in a suitable medium such that the heterologous protein is expressed and secreted, and the protein is isolated from the culture medium.

16. A method for producing a heterologous protein of claim 15, characterized in that from the recovered heterologous protein by removing the amino acid sequence X ³ -X ⁷ a process which comprises treatment with a proteolytic enzyme which is specific for basic amino acid.

17. The method for producing a heterologous protein according to claim 16, wherein the proteolytic enzyme is selected from the group consisting of trypsin, Achromobacter lyticus protease I, enterokinase, Fusarium oxysporum trypsin-like protease, and YAP3.

18. A method for producing a heterologous protein according to claim 16, characterized in that the amino acid sequence X ³ -X ^7, wherein X ^e is a peptide bond, Ala, or Glu, is a heterologous protein in the medium by a process which comprises subjecting yeast cells such stress that causes the cells to release yeast aspartic protease 3 into the medium, cleaving the amino acid sequence X ³ -X ⁷ .