JPH10501695A

JPH10501695A - N-terminally extended protein expressed in yeast

Info

Publication number: JPH10501695A
Application number: JP8501505A
Authority: JP
Inventors: バド，クヌド; ブラント，ヤコブ; ベルグハムケルドセン，トーマス
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1994-06-17
Filing date: 1995-06-16
Publication date: 1998-02-17
Anticipated expiration: 2020-12-21
Also published as: WO1995035384A1; CN1131312C; EP0765395A1; NO965411L; MX9606536A; HU9603476D0; FI965030A0; SG47883A1; JP3730255B2; IL114160A; FI965030A; HUT75840A; CA2192943A1; CZ363796A3; PL317761A1; IL114160A0; BR9508053A; AU2733595A; CN1152942A; NO965411D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、イーストにおいて発現され、処理されたポリペプチド、次の構造：シグナルペプチド−リーダーペプチド−Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｘ⁷−異種蛋白質〔ここで、Ｘ¹は Lys又は Argであり；Ｘ²は Lys又は Argであり、Ｘ¹及びＸ²は共にイースト処理部位を規定し；Ｘ³は Glu又は Aspであり、Ｘ⁴は次の構造：（Ａ−Ｂ）_n（ここで、Ａは Glu又は Aspであり、Ｂは Ala，Val，Leu又は Proであり、そしてｎは０又は１〜５の整数であり、そしてｎ≧２の場合、Ａ及びＢは各々他のＡ及びＢと同じ又は異なる）を有するアミノ酸の配列であり、又はＸ⁴は次の構造：（Ｃ）_m（ここで、Ｃは Glu又は Aspであり、そしてｍは０又は１〜５の整数である）を有するアミノ酸の配列であり；Ｘ⁵はペプチド結合又は同じもしくは異なり得る１以上のアミノ酸であり；Ｘ⁶はペプチド結合又はPro，Asp，Thr，Ser，Glu，Ala及び Glyからなる群から選択されるアミノ酸残基であり；そしてＸ⁷は Lys又は Argである〕を有するポリペプチドをコードする DNA配列を含む DNA構成物に関する。 (57) Abstract: The present invention is expressed in yeast, treated polypeptides, the following structure: signal peptide - leader peptide ^{^{^{^{-X 1 -X 2 -X 3 -X 4}}}} -X 5 -X 6 -X ⁷ -heterologous protein wherein X ¹ is Lys or Arg; X ² is Lys or Arg; X ¹ and X ² together define a yeast processing site; X ³ is Glu or Asp; ⁴ has the following structure: (AB) _n, wherein A is Glu or Asp, B is Ala, Val, Leu or Pro, and n is 0 or an integer from 1 to 5, and Where n ≧ 2, A and B are each a sequence of amino acids having the same or different from the other A and B, or X ⁴ is the following structure: (C) _m, where C is Glu or Asp , and the and m is the sequence of amino acids having 0 or an integer from 1 to 5); X ⁵ is a peptide bond or the same or Be one or more amino acids that may be; X ⁶ is a peptide bond or Pro, Asp, Thr, Ser, Glu, an amino acid residue selected from the group consisting of Ala and Gly; and X ⁷ is a Lys or Arg ], Which comprises a DNA sequence encoding a polypeptide having

Description

【発明の詳細な説明】イーストにおいて発現されたＮ末端に伸長した蛋白質発明の分野本発明は、イースト内で発現及び処理されたポリペプチド、該ポリペプチドをコードする DNA配列を含む DNA構成物、該 DNAフラグメントを有するベクター並びに該ベクターで形質転換されたイースト細胞、並びにイースト内で異種の蛋白質を産生させる方法に関する。発明の背景イースト生物は、細胞内で合成されるが該細胞外の機能を有するいくつかの蛋白質を産生する。このような細胞外蛋白質は分泌蛋白質と呼ばれる。これらの分泌蛋白質は、小胞体（ER）の膜を横切って発現された産物の有効な方向を確実にするプレ配列を含む前駆体又は前駆形態において、細胞内で最初に発現される。通常シグナルペプチドと呼ばれるプレ配列は、トランスロケーションの間に要求される産物から一般に切断される。いったん分泌経路に入ると、蛋白質はゴルジ装置に輸送される。ゴルジから、蛋白質は細胞液胞もしくは細胞膜のような区画に導かれる異なる経路に従い得るか、又はそれは細胞の外に導かれて外の媒体に分泌され得る(Pfeffer，S．R．and Rothman，J.E.Ann.Rev.Biochem ．56(1987)， 829 〜852)。いくつかの試みは、イーストに対して異種の蛋白質のイーストにおける発現及び分泌について示唆している。ヨーロッパ公報第0088632Aは、要求される蛋白質及びシグナルペプチドをコードする DNAを有する発現ベクターでイースト生物を形質転換し、該形質転換された生物の培養物を調製し、そして該培養媒体から蛋白質を回収することによりイーストに対して異種の蛋白質を発現し、処理し、そして分泌する方法を記載する。シグナルペプチドは要求される蛋白質自体のシグナルペプチド、異種のシグナルペプチド又はネイティブ及び異種のシグナルペプチドのハイブリッドであり得る。イーストに対して異種のシグナルペプチドの使用に対する問題は、異種のシグナルペプチドが有効なトランスロケーション及び／又はシグナルペプチドの後の切断を確実に行わないことであろう。サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）MFα１（α因子）は、19アミノ酸長のシグナル−又はプレペプチド、次に64アミノ酸長の“リーダー”又はプロペプチドを含み、３つのＮ−結合グリコシル化部位、次に(Lys Arg(Asp／Glu，Ala)₂ _〜3α−因子)₄を含む 165アミノ酸のプレプロ形態として合成される(Kurjan，J．and Herskowitz，I．Cell 30(1982)，933〜943)。プレプロMFα１のシグナル−リーダー部分は、Ｓ．セレビシアエ(S．cerivisiae)において異種蛋白質の合成及び分泌を得るのに広く用いられている。イーストに対して異種のシグナル／リーダーペプチドの使用は、例えば米国特許第 4,546,082号、ヨーロッパ公報0116201A，0123294A，0123544A，0163529A、及び0123289A並びにヨーロッパ特許0100561Bから知られている。 EP 0123289Aにおいて、Ｓ．セレビシアエα因子前駆体の利用が記載される一方、EP 100561はサッカロマイセス・セレビシアエPH05シグナルの利用を記載し、PCT公報 WO 95／02059 は外来蛋白質の分泌のためのYAP3シグナルペプチドの利用を記載する。米国特許 4,546,082並びにヨーロッパ公報0016201A，0123294A，0123544A、及び0163529Aは、サッカロマイセス・セレビシアエからのα−因子シグナル−リーダー（MFα１又はMFα２）がイーストにおける発現される異種蛋白質の分泌過程において利用される方法を記載する。Ｓ．セレビシアエ MFα１シグナル／リーダー配列をコードする DNA配列を、要求される蛋白質のための遺伝子の５′末端に融合することによる該要求される蛋白質の分泌及び処理が示される。 EP 206,783はＳ．セレビシアエからのポリペプチドの分泌のためのシステムを開示する。これにより、α−因子リーダー配列は、α−因子処理部位 Lys-Arg-G lu-Ala-Glu-Alaを通して異種のポリペプチドにそれ自体融合されたリーダーペプチドを残すようにネイティブのリーダー配列上に存在する４つのα−因子ペプチドを除去するように端を切り取られている。この構造物は（50アミノ酸未満の）より小さなペプチドの効果的な処理を導くことが示される。より大きなポリペプチドの分泌及び処理のために、ネイティブのα−因子リーダー配列は、リーダーペプチドとポリペプチドとの間の１又は２のα−因子ペプチドを残すように端が切り取られている。いくつかの分泌蛋白質は、２つの保存性塩基性アミノ酸のカルボキシ末端においてペプチド結合を切断することができる蛋白質分解処理システムに露出されるような経路をとる。この酵素活性はKEX2遺伝子によりコードされたＳ．セレビシアエにおいてである(Julius，D.A．et al.，Cell 37(1984b)，1075)。KEX2プロテアーゼによる産物の処理は活性型Ｓ．セレビシアエ交配因子α１（MFα１又は α−因子）の分泌に必要とされるが、活性型Ｓ．セレビシアエ交配因子ａの分泌には関連しない。分泌される予定のポリペプチドの分泌及び正確な処理は、先に与えられた引用に示されるように構築されたベクターで形質転換されたイースト生物を培養するいくつかの場合に得られる。しかしながら多くの場合、分泌のレベルが極めて低いか又は分泌がなく、あるいは蛋白質分解処理は不正確もしくは不完全であり得る。PCT WO 90／10075 に記載されるように、これはそれを蛋白質分解切断にアクセス不能又はほとんどアクセス不可能にするような、リーダーペプチドのＣ末端と異種蛋白質のＮ末端との間に存在する処理部位の不十分な露出にある程度起因すると信じられている。 WO 90／10075 は、リーダーペプチドのＣ末端及び／又はリーダーペプチドに融合された異種ポリペプチドのＮ末端における処理部位近くに特定の修飾を与えることにより得られた異種ポリペプチドの改良された処理を有するイースト発現システムを記載する。これにより、未修飾のリーダーペプチド−異種ポリペプチド構造物で得られるより高い正確に処理された蛋白質の収率を得ることが可能である。発明の概要本発明は、培養培地からの精製の前の自然発生するイーストプロテアーゼ又は培養培地からの産物の精製の間もしくはその後の試験管内蛋白質分解のいずれかにより切断され得る伸長物として設計された異種ポリペプチドのＮ末端の改良を記載する。本発明は、次の構造：シグナルペプチド−リーダーペプチド−Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｘ⁷− 異種蛋白質〔ここでＸ¹は Lys又は Argであり；Ｘ²は Lys又は Argであり、Ｘ¹及びＸ²は共にイースト処理部位を規定し；Ｘ³は Glu又は Aspであり；Ｘ⁴は次の構造：（Ａ−Ｂ）_n （ここで、Ａは Glu又は Aspであり、Ｂは Ala，Val，Leu又は Proであり、そしてｎは０又は１〜５の整数であり、ｎ≧２の場合、Ａ及びＢの各々は他のＡ及びＢと同じもしくは異なる）を有するアミノ酸の配列であり、又はＸ⁴は次の構造：（Ｃ）_m （ここで、Ｃは Glu又は Aspであり、ｍは０又は１〜５の整数である）を有するアミノ酸の配列であり；Ｘ⁵はペプチド結合又は同じもしくは異なり得る１以上のアミノ酸であり；Ｘ⁶はペプチド結合又は Pro，Asp，Thr，Glu，Ala及び Glyからなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｘ⁷は Lys又は Argである〕を有するポリペプチドをコードする DNA構成物に関する。本文脈において、“シグナルペプチド”という言葉は天然において支配的に疎水性であり、イーストにおいて発現される細胞外蛋白質の前駆体形態におけるＮ末端配列として供するプレ配列を意味すると理解される。シグナルペプチドの機能は異種蛋白質が小胞体に入るように分泌されるのを許容することである。シグナルペプチドはこの目的の過程において通常切断される。シグナルペプチドは蛋白質を産生するイースト生物に対して異種又は同種であり得るが、シグナルペプチドのより効果的な切断は問題のイースト生物に対して同種である場合に得られうる。 “リーダーペプチド”という表現は、その機能が異種蛋白質が小胞体からゴルジ装置、更には媒体内への分泌のための分泌ベシクルに向かって分泌されること（即ち細胞壁を横切って又は少くとも細胞膜を通しての細胞の細胞周辺腔への発現された蛋白質又はポリペプチドの輸送）を許容する支配的に親水性のペプチドを示すと理解される。 “異種蛋白質”という表現は、天然において宿主イースト生物により産生されない蛋白質又はポリペプチドを示すと意図される。Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｘ⁷は共に、異種ポリペプチドのＮ末端における伸長部を形成する。この伸長部は発酵産出量を増加させるばかりでなく、Ｘ³の存在のためにジペプチジルアミノペプチダーゼ(DPAP A)処理に対して保護され、結果としてポリペプチドの同種Ｎ末端となる。伸長部は、培養培地からの異種蛋白質産物の精製前に、例えばイーストアスパラギン酸プロテアーゼ３（YAP3）のような DPAP以外の自然発生性イーストプロテアーゼにより切断されるであろうように作製され得る。あるいは伸長部は、Ｎ末端伸長異種蛋白質産物が、次の例えばトリプシン、アクロモバクター・リチカスプロテアーゼＩ又はエンテロキナーゼによる試験管内成熟のために培養培地から精製され得るように発酵の間に蛋白質分解切断に対して耐性があるように作製され得る。更に他の態様において、本発明は、異種蛋白質の発現及び分泌を得るために適切な培地内で形質転換されたイースト株を培養し、その後培地から蛋白質を単離することを含むイーストにおいて異種蛋白質を産生するための方法に関する。発明の詳細な記載ペプチド構造（Ａ−Ｂ）_nにおいて、ｎは好ましくは２〜４、更に好ましくは３である。本発明に従う好ましいポリペプチドにおいて、Ｘ³は Gluであり得、Ａは Glu であり得、Ｂは Alaであり得、Ｘ⁵はペプチド結合もしくは Glu、又は Glu Pro Lys Alaであり得、又はＸ⁶は Proもしくはペプチド結合であり得る。可能なＮ末端伸長部Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｘ⁷の例は、である。本発明のポリペプチドのシグナルペプチド配列は、細胞の分泌経路への発現されたポリペプチドの有効な方向づけを確実にするいずれのシグナルペプチドでもあり得る。シグナルペプチドは、天然のシグナルペプチドもしくはその機能的一部分、又は合成ペプチドであり得る。適切なシグナルペプチドはα−因子シグナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド、修飾カルボキシペプチダーゼシグナルペプチドもしくはイーストBAR1シグナルペプチド並びにイーストアスパラギン酸プロテアーゼ３（YAP3）シグナルペプチドであることが見い出されている。マウス唾液アミラーゼシグナにより記載される。カルボキシペプチダーゼシグナル配列はL.A.Valls et al.，Cell 48 ，1987，pp.887〜897 により記載される。BAR1シグナルペプチドは PCT 公報 WO 87／02670 に開示される。イーストアスパラギン酸プロテアーゼ３シグナルペプチドは PCT公報95／02059 に記載される。本発明のポリペプチドのリーダーペプチド配列は小胞体を通して更に分泌経路に沿って発現されたポリペプチドを方向づける機能を有するいずれかのリーダーペプチドであり得る。この目的に適した可能なリーダー配列は、α−因子リーダー又はその機能的アナログのようなイースト又は他の生物から得られる天然のリーダーペプチドである。リーダーペプチドは合成ペプチド、例えば PCT公報 WO 89／02463 又は WO 92／11378 に開示される合成リーダーペプチドの１つでもあり得る。本発明の方法により製造されたＮ末端伸長異種蛋白質はイースト内で有利に産生され得るいずれかの蛋白質であり得る。これらの蛋白質の例は、アプロチニン、組織因子経路インヒビターもしくは他のプロテアーゼインヒビター、並びにインスリンもしくはインスリン前駆体、インスリンアナログ、インスリン様成長因子ＩもしくはII、ヒトもしくはウシ成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアクティベーター、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（GLP- 1）、因子VII、因子VIII、因子ＸIII、血小板由来成長因子、酵素、又はこれらの蛋白質のいずれかの機能的アナログである。本文脈において“機能的アナログ”という言葉は、ネイティブ蛋白質（これはネイティブ蛋白質の生物学的活性のレベルよりむしろ天然に関するとして理解されると意図される）として同様に機能するポリペプチドを示すことを意味する。このポリペプチドはネイティブ蛋白質と構造的に類似し得、ネイティブ蛋白質のＣ及びＮ末端のいずれかもしくは両方への１以上のアミノ酸の付加、ネイティブアミノ酸の１もしくはいくつかの異なる部位における１以上のアミノ酸の置換、ネイティブ蛋白質のいずれかもしくは両方の端又はアミノ酸配列の１以上の部位における１以上のアミノ酸の欠失、又はネイティブアミノ酸の１以上の部位における１以上のアミノ酸の挿入によりネイティブ蛋白質から誘導され得る。このような修飾は先に記載のいくつかの蛋白質において公知である。適切なインスリン前駆体及びインスリンアナログの例は、（例えば EP 163529 に記載されるような）B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)、（例えば PCT公報95／005 50 に記載されるような）B(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A(1-21)、（PCT公報95 ／07931 に記載されるような）B(1-29)-Ala-Ala-Arg-A(1-21)、及びB(1-29)-Ser -Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)である。本発明のポリペプチドをコードする本発明の DNA構成物は確立された標準的方法、例えばS.L.Beaucage and M.H.Caruthers，Tetrahedron Letters 22，1981 ，pp.1859〜1869により記載されるホスホアミジト法又はMatthes et al.，EMBO Journal 3，1984，pp.801〜805 により記載される方法により合成的に調製され得る。ホスホアミジト法に従うと、オリゴヌクレオチドが、例えば自動 DNAシンセサイザー、精製、二本鎖化、結合して合成 DNA構成物を形成する。DNA構成物を調製する現在の好ましい方法は、例えばSambrook et al.，Molecular Cloning : A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor，NY， 1989に記載されるようなポリメラーゼ鎖反応(PCR)による。本発明の DNA構成物は、ゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、例えば標準的な技術（例えば Sambrook et al.，Molecular Cloning : A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor，1989）に従う合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションにより本発明のポリペプチドの全部又は一部をコードする DNA配列をスクリーニングすることによるゲノム又はcDNA源のものでもあり得る。この場合、シグナル及びリーダーペプチドをコードするゲノム又はcDNA配列は異種蛋白質をコードするゲノム又はcDNA配列に結合され得、その後 DNA配列は、例えば公知の手順に従って同種組換え体のための要求されるアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入することにより、ポリペプチドのアミノ酸配列Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｘ⁷に相当する部位において修飾され得る。最後に、DNA構成物は、標準的技術に従う、（適切には）合成、ゲノムもしくはcDNA源のフラグメントのアリーリングにより調製される混合された合成及びゲノム、混合された合成及びcDNA又は混合されたゲノム及びcDNA源、全 DNA構成物の種々の部分に相当するフラグメントのものであり得る。これにより、異種蛋白質をコードする DNA配列はゲノム又はcDNA源のものであり得、一方シグナル及びリーダーペプチドをコードする配列並びにＮ末端伸長部Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵ −Ｘ⁶−Ｘ⁷をコードする配列は合成的に調製され得ることが認識され得る。更なる態様において、本発明はイースト内で複製することができ、先に定義されるポリペプチドをコードする DNA構成物を有する組換え発現ベクターに関する。組換え発現ベクターは、イースト生物内で複製することができるいずれかのベクターであり得る。このベクターにおいて、本発明のポリペプチドをコードする DNA配列は適切なプロモーター配列に作用的に接続されるべきである。プロモーターは、イースト内で転写活性を示すいずれかの DNA 配列であり得、イーストに対して同種又は異種のいずれかである蛋白質をコードする遺伝子から得られうる。プロモーターは好ましくは、イーストに対して同種である蛋白質をコードする遺伝子から得られる。適切なプロモーターの例は、サッカロマイセス・セレビシアエ Mα１，TPI，ADH又は PGKプロモーターである。本発明のポリペプチドをコードする DNA配列も適切なターミネーター、例えば TPIターミネーターに作用的に接続され得る(例えばT.Alber and G.Kawasaki，J .Mol.Appl.Genet ．1 ，1982，pp.419〜434)。本発明の組換え発現ベクターは、該ベクターがイースト内で複製することを可能にする DNA配列を更に含む。このような配列の例はイーストプラスミド２μ複製遺伝子REP1-3及び複製の源である。ベクターは、選択可能マーカー、例えば P .R.Russell，Gene 40 ，1985，pp.125〜130 に記載されるようなスキゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe） TPI遺伝子も含み得る。本発明のポリペプチド、プロモーター及びターミネーター各々をコードする D NAを結合するために、並びにそれらをイースト複製のために必要な情報を含む適切なイーストベクター内に挿入するために用いられる方法は、当業者に公知である（例えば Sambrook et al.，前掲）。最初に本発明のポリペプチドをコードする全 DNA配列を含む DNA構成物を調製し、次に適切な発現ベクター内にこのフラグメントを挿入すること、又は（シグナル、リーダー又は異種蛋白質のような）個々の要素についての遺伝情報を含む DNAフラグメントを連続的に挿入し、次に結合することのいずれかにより、ベクターが作製され得ることが理解されよう。本発明の方法に用いられるイースト生物は、培養によって大量の問題の異種蛋白質又はポリペプチドを産生するいずれかの適切なイースト生物であり得る。適切なイースト生物の例は、イースト種サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccha romyces cerevisiae）、サッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyve ri）、スキゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、又はサッカロマイセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）であり得る。イースト細胞の形質転換は、例えばそれ自体周知の様式におけるプロトプラスト形成後の形質転換により行われ得る。細胞を培養するのに用いられる培地はイースト生物を増殖させるのに適したいずれかの慣用的培地であり得る。その重大な割合が正確に処理された形態において培地内に存在するであろう分泌された異種蛋白質は、遠心又はろ過により培地からイースト細胞を分離し、塩、例えば硫酸アンモニウムの手段によりその上清もしくはろ過物の蛋白質の構成物を沈殿させ、次に種々のクロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等により精製することを含む慣用の方法により培地から回収され得る。培養培地への分泌の後、蛋白質は配列Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｘ⁷を除去するための種々の方法が行われ得る。Ｘ⁶がPro，Thr，Ser，Gly、又は Aspである場合、伸長部は発酵の間、異種蛋白質に安定して付着され、DPAPのようなイーストプロテアーゼの蛋白質分解活性に対して異種構造の蛋白質のＮ末端を保護する。異種蛋白質におけるＮ末端伸長部の存在は、蛋白質の化学的処理の間異種蛋白質のＮ末端アミノ基の保護として作用し得る。即ち、それは BOC又は類似した保護基の置換物として作用し得る。このような場合、アミノ酸配列Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｘ⁷は、末端伸長部がＸ⁷で切断されるように塩基性アミノ酸(例えば Lys又はArg)に特異的である蛋白質分解酵素の手段により、回収された異種蛋白質から除去され得る。このような蛋白質分解酵素の例は、トリプシン、アクロモバクター・リチカス(Achromobacter lyticus)プロテアーゼＩ、エンテロキナーゼ、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysp orum）トリプシン様プロテアーゼ、及びサッカロマイセス・セレビシアエのイーストアスパラギン酸プロテアーゼ３（YAP3）である。 YAP3はサッカロマイセス・セレビシアエにおいて種々のプロホルモン及び異種蛋白質の発現に適用することを特徴とする(Niamh，X.C．et al.，FEBS Letters ，332 ，p.273 〜276，1993 ; Bourbonnais，Y．et al.，EMBO Journal，12，p. 285 〜294，1993 ; Egel-Mitani，M．et al.，YEAST， 6，P.127 〜137，1990) 。 YAP3はサッカロマイセス・セレビシアエの大規模発酵の間に現れる。pHがpH３〜約pH６である場合にそれが活性化される。YAP3の出現は産生のための培地の最小タイプを用いて最も促進される。このような培地において、細胞はグルコース及び／又は窒素が、奪われるが、増殖条件を限定する他の条件が用いられ得る。 YAP3プロテアーゼは切断部位に隣接する規定されたモチーフを必要とする。このようなモチーフは、Ｘ⁷のすぐ上流のアミノ酸が Ala又は Gluである場合にＮ末端伸長部に存在する（しかしＸ⁶がPro，Thr，Ser，Gly又は Aspの場合、存在しない）。これにより、Ｘ⁶がペプチド結合(及びＸ⁷の上流のアミノ酸が Ala又はGlu)である場合、伸長部は最も好ましくはイースト細胞からのその分泌の後に、発酵の間、異種蛋白質から切断され得る−イースト細胞又は増殖培地内においてその基質（リシン又はアルギニンの後のペプチド結合）に作用するYAP3に依存する方法。イースト細胞の内側の、それに付着された、又はそれから出たYAP3は、非伸長産物が増殖培地から精製され得るようにその伸長部が選択的に切断され得る。Ｘ⁶が Alaもしくは Glu又はペプチド結合である（並びにＸ⁷の上流のアミノ酸が Alaもしくは Gluである）アミノ酸配列Ｘ³−Ｘ⁷は、イースト細胞にストレスをかけそれらを培地内にYAP3を放出させることによりアミノ酸配列Ｘ³−Ｘ⁷が切断されることに関連する方法により培地中の異種蛋白質から除去され得る。イースト細胞にかけられるストレスは、培養培地のpHを 6.0未満、好ましくは５未満に減少させる、又はグルコース及び／又は窒素をイースト細胞から奪うことを含み得る。異種蛋白質を製造するための本発明の方法において、イースト細胞は、細胞の培養により遺伝子が発現され、結果として生ずるプロテアーゼの産物が異種蛋白質からＸ³−Ｘ⁷のより完全な切断を確実にするように、塩基性アミノ酸残基に特異的であるプロテアーゼをコードする１以上の遺伝子で更に形質転換され得る。好ましい実施形態において、YAP3をコードする１以上の付加的遺伝子が、細胞の培養により遺伝子が過剰発現され、結果として生ずるYAP3の過剰産物が異種ポリペプチドからのＸ³−Ｘ⁷のより完全な切断を確実にするように、イースト細胞を形質転換するのに用いられ得る。本文脈において、イーストアスパラギン酸プロテアーゼ３（YAP3）は、ネイティブYAP3酵素、並びにそのＣ末端が細胞からのYAP3蛋白質の効果的な放出を確実にするために改良されている、もしくは蛋白質分解活性を保持するいずれかの改良が行われているネイティブ酵素から誘導される酵素を含む。あるいは、プロテアーゼはＡ．リチカス（A．lyticus）プロテアーゼＩ．エンテロキナーゼ又はトリプシンであり得る。本発明は請求される本発明の範囲を限定することを意図したいずれの手段でもない以下の実施例において更に詳細に記載される。本発明は次の図面の参照と共に記載される。図１Ｎ末端に伸長したポリペプチドを発現する遺伝子を含むプラスミドの作製のための一般的スキームを示す。図１において以下の記号が用いられる：１：Ｓ．セレビシアエからの TPI遺伝子プロモーター配列を示す。２：シグナル／リーダーペプチドをコードする領域を示す（例えばＳ．セレビシアエのα因子遺伝子からのもの）。３：異種ポリペプチドをコードする領域を示す。３^* ：Ｎ末端伸長異種ポリペプチドをコードする領域を示す。４：Ｓ．セレビシアエの TPI遺伝子ターミネータ配列を示す。Ｐ１：Ｎ末端伸長部を決定する合成オリゴヌクレオチド PCRプライマーを示す。Ｐ２：領域３の増幅のための万能 PCRプライマーを示す。 POT ：Ｓ．ポンベからの TPI遺伝子を示す。２μOri:Ｓ．セレビシアエ内の DNA複製の源を含むＳ．セレビシアエ２μプラスミドからの配列を示す。 Ap^R ：大腸菌におけるアンピシリン耐性遺伝子及び DNA複製の源を含むpBR322／pUC13 からの配列。図２：位置82における Leu及び位置83における Aspが各々 Met及び Alaにより置換されているα−因子シグナル／リーダーペプチドを作り上げる85残基にＮ末端に融合されたインスリン前駆体B_chain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain (1-21)をコードする pJB59における DNA配列を示す。図３：合成シグナル／リーダー配列“YAP3／S1_PAVA”にＮ末端に融合されたGLP-1_7-36AlaをコードするpAK623の DNA配列。図４：位置82における Leu及び位置83における Aspが各々 Met及び Alaにより置換されているα−因子シグナル／リーダーペプチドを形成する85残基にＮ末端に融合された B_chain (1-29)-Ala-Ala-Arg-A_chain(1-21)をコードするpKV142の DNA配列。図５：合成シグナル／リーダー配列“YAP3／LA19”にＮ末端に融合された B_chain(1-29)-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21)をコードするpAK679の DNA配列。図６：Ｎ末端伸長部を有する又は有さないインスリン前駆体 B_ch _ain(1-27)Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21)を含む培養物上清のHPLCクロマトグラムを示す。図７： 10％ Tricine-SDS-PAGE ゲル上でサイズにより分離された図４に従う産物を示す。図８： pJB64と比較したpJB176におけるHPLCデータから得られた収率によるYAP3同時発現の存在の効果を示す。実施例プラスミド及び DNA 全ての発現プラスミドは、Ｓ．セレビシアエにおけるプラスミド選択及び安定化の目的のためにスキゾサッカロマイセス・ポンベトリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子(POT)を含むことを特徴とする WO EP 171 142に記載されるものに類似した C-POTタイプ（図１参照）のものである。このプラスミドはＳ．セレビシアエトリオースホスフェートイソメラーゼプロモーター（図１の領域１）及びターミネーター（図１の領域４）を更に含む。これらの配列は、シグナル／リーダー／産物をコードするEco R Ｉ−Xba Ｉフラグメントの配列（図１の領域２及び３）を除く全配列である（WO 90／100075に記載される）プラスミドpKFN100 3における対応する配列と同一である。異なる異種蛋白質を発現させるために、p KFN1003のEcoR Ｉ−Xba Ｉフラグメントは関心のシグナル／リーダー／産物をコードするEco R Ｉ−Xba Ｉフラグメントにより単純に置換される。このようなEc o R Ｉ−Xba Ｉフラグメントは、標準的技術（例えばSambrook et al.，1989 前掲）に従う合成オリゴヌクレオチド及び PCRを用いて合成され得る。図１は、Ｎ末端に伸長したポリペプチドを発現する遺伝子を含むプラスミドの作製に用いられる一般的スキームを示す。このスキームは以下のステップを含む。 − C-POTプラスミドベクターのサンプルを制限ヌクレアーゼEco R Ｖ及びXb a Ｉで消化し、最も大きな DNAフラグメントを標準的分子技術(Sambrook J，Fri tsch EL and Maniatis T，Molecular Cloning : A Laboratory Manual，Cold Sp ring Harbor Laboratory Press，1989)。 − (先に記載のプラスミドと同じ又は異なり得る)C-POTプラスミドの他のサンプルを制限ヌクレアーゼEco R Ｖ及びNco Ｉで消化し、領域１及び２を含むフラグメントを単離する。 − 製造元の説明に従うGene Amp PCR試薬キット(Perkin Elmer，761 Main Av ewalk，CT 06859，USA)並びに関心の異種ポリペプチドをコードする（先に記載のプラスミドと同じ又は異なり得る）テンプレート上の合成オリゴヌクレオチドプライマーＰ１及びＰ２を用いてポリメラーゼ鎖反応(PCR)を行う。Ｐ１を、それがKEX2処理部位をコードする配列の前の制限ヌクレアーゼNco Ｉ（５′CCATGG ３′）のための認識部位、Ｎ末端伸長部及び関心の異種蛋白質のもとのＮ末端をコードする配列と同一の10〜15ヌクレオチドを含むように設計する。Ｐ２（例えば５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′）は、それが領域３並びに Sambrook et al.，前掲に記載される標準的技術を用いるＰ１での PCRにおける制限ヌクレアーゼXba Ｉ（５′−TCTAGA−３′）のためのフラクキング認識部位を増幅するように設計する。 − PCR産物は制限ヌクレアーゼNco Ｉ及びXba Ｉで消化し、消化されたフラグメントを単離する。 − 単離されたフラグメントを（Sambrook et al，前掲に記載される）標準的条件下でのT4 DNA連結により共に連結する。 − 連結混合物を、コンピテント大腸菌細胞ap^r-を形質転換するのに用いられ、Sambrook et al.，前掲に従ってアンピシリン耐性のために選択される。 − プラスミドを、（Sambrook et al.，前掲に記載される）標準的分子技術を用いて結果として生ずる大腸菌クローンから単離する。 − Ｎ末端伸長ポリペプチドをコードする DNA配列を確かめる（又は決定する）ため、及びそれが領域２のシグナル／リーダーペプチドをコードする DNA配列と一緒のフレーム内であることを確実にするために、製造元の説明に従って酵素鎖ターミネーション(Sequenase，United States Biochemicals)を用いて DNAシークエンシングを行う。 − このプラスミドを、以下に詳細に記載されるように、イースト株 MT663を形質転換するのに用い、グルコース上での増殖のために選択する：イースト形質転換：Ｓ．セレビシアエ株MT663(E2-7B XE11-36a/α ，Δtpi ／Δtpi，pep4-3 ／pep4-3)(このイースト株 MT663は WO 92／11378 の出願に関連してドイチエ・サムルング・ウオン・マイクロオルガニズメン・ウント・ツエルクルトゥレンに寄託され、寄託番号DSM 6278が与えられている)をYPG aL(１％バクトイーストエキス、２％バクトペプトン、２％グルコース、１％ラクテート)上で 0.6の 600nmにおけるO.D.となるまで増殖させた。培養物 100mlを遠心により集収し、10mlの水で洗浄し、再び遠心して 1.2Ｍソルビトール、25mM Na₂EDTA pH＝8.0 及び 6.7mg／mlジチオトレイトールを含む溶液10ml中に懸濁した。この懸濁液を30℃で15分間インキュベートし、遠心して、この細胞を 1.2Ｍソルビトール、10mM Na₂EDTA、0.1Ｍクエン酸ナトリウム、p H＝5.8、及を30℃で30分間、インキュベートし、遠心により細胞を収集し、1.2Ｍソルビトール10ml、及びCAS（1.2Ｍソルビトール、10mM CaCl₂、10mM Tris HCl(Tris＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）pH＝7.5)）10mlで洗浄し、CAS ２mlで再懸濁した。形質転換のために、CAS−再懸濁細胞１mlをプラスミド DNA約 0.1 μｇと混合し、室温に15分間放置した。(20％ポリエチレングリコール4000、10m M CaCl₂、10mM Tris HCl、pH＝7.5)１mlを加えてこの混合物を更に30分、室温に放置した。この混合物を遠心してこのペレットをSOS（1.2Ｍソルビトール、33％ｖ／ｖ YPD、6.7mM CaCl₂）0.1ml中に再懸濁して30℃で２時間、インキュベートした。その後、この懸濁液を遠心して、このペレットを 1.2Ｍソルビトール 0.5 ml中に再懸濁した。その後、52℃における上面寒天(1.2Ｍソルビトール＋ 2.5％寒天を含むSherman et al.，Methods in Yeast Genetics ，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)のSC培地)６mlを加え、この懸濁液を同じ寒天硬化されたソルビトール含有培地を含むプレートの上面に注いだ。実施例１ pJB108及びpJB109の作製プラスミド pJB59は、Eco R Ｉ−Xba Ｉフラグメントが位置82における Leu及び位置83における Aspが各々 Met及び Alaにより置換されているα−因子プレプロシグナルペプチドの85残基に相当するシグナル／リーダー配列にＮ末端に融合されたインスリン前駆体 B_chain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21)をコードするpKFN1003の誘導体である（図２）。EcoRＩ− XbaＩフラグメントは、製造元の説明に従ってアプライドバイオシステムズ DNAシンセサイザー(Perkin El mer DNA Thermal Cycler)において合成される。Ｎ末端に伸長したインスリン前駆体 B_chain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_cha _in (1-21)を発現するよう設計されたプラスミド構成物を次の配列を有するＰ１− プライマーの手段により得た。Ｐ２−プライマー：５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′及び先に記載の一般的スキームに従うプラスミド pJB59。PCR及びクローニングにより、インスリン前駆体 B_chain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21)をコードする DNA配列が、Ｎ末端伸長部Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Xaa-Lys(ここで、XaaはPro(pJB 108 ; CCAによりコードされるPro)又はThr(pJB109 ; ACAによりコードされるThr )のいずれかである)をコードする DNA配列の後にある構成物を生ずる。実施例２ pJB44，pJB107、及びpJB126の作製インスリン前駆体 B_chain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21)の更にＮ末端に伸長したものを発現するように設計されたプラスミド構成物を次の配列を有するＰ１−プライマーの手段により作製した。Ｐ２−プライマー：５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′及び実施例１に記載されるプラスミド pJB59。結果として生ずるプラスミド pJB44，pJB107及びpJB1 26を単離した。これらのプラスミドは、Ｎ末端伸長部Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu- Ala-Xaa-Lys(ここで XaaはGlu(pJB44 ; GAAによりコードされるGlu)、Asp(pJB12 6 ; GACによりコードされるAsp)又はGly(pJB107 ; GGCによりコードされるGly) のいずれかである)の後のインスリン前駆体 B_chain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys -A_chain(1-21)をコードする。実施例３ pJB64及びpJB110の作製Ｎ末端に伸長したインスリン前駆体 B_chain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_cha _in (1-21)を次の配列を有するＰ１−プライマーの手段より得た。Ｐ２−プライマー：５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′及び実施例１に記載のプラスミド pJB59。結果として生ずるプラスミド pJB64及びpJB110について単離した。これらのプラスミドは、Ｎ末端伸長部Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Xaa-Ly s(ここで XaaはGlu(pJB110 ; GAAによりコードされるGlu)又はAla（pJB64 ; GCAによりコードされるAla)のいずれかである)の後のインスリン前駆体 B_chain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain (1-21)のＮ末端伸長部をコードする。実施例４ pAK663の作製プラスミドpAK623は、Eco R Ｉ− XbaＩが合成シグナルリーダー配列YAP3／S1_PAVA にＮ末端に融合されたGLP-1_7-36AlaをコードしているpKNF1003の誘導体である。 EcoRＩ− XbaＩフラグメントを製造元の説明に従ってApplied Biosystems DNA シンセサイザーにおいて合成した。 Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Argの形態におけるＮ末端伸長部を有するG LP-1_7-36ALAを発現するよう設計されたプラスミド構成物を次の配列を有するＰ１−プライマーの手段により得た。Ｐ２−プライマー：５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′及び先に記載される方法に従うプラスミドpAK623は結果としてプラスミドpAK663となる。実施例５Ｎ末端伸長産物の発現及び伸長部の除去先に記載される C-POTプラスミド(pJB59，pJB108，pJB109，pJB44，pJB126，p JB107，pJB64及びpJB110)で形質転換されたイースト株 MT663をYPD(１％イーストエキス、２％ペプトン及び２％グルコース)寒天プレート上で増殖させた。単一コロニーを用いて YPDブイヨンpH＝6.0 中の５ml液体培養を開始し30℃で72時間振とうした。Snel，Damgaard and Mollerup，Chromatographia 24，1987，pp.329〜332 により記載される方法により、産物の収率を培養上清上で直接測定した。伸長していない形態(pJB59)と比較したＮ末端に伸長した B_chainn(1-27)-Asp- Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21)を発現するイースト株の結果を次に示す。 Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-ArgによりＮ末端に伸長されたGLP-1_7-36Alaを発現するpAK663の場合、収率は非伸長GLP-1_7-36Alaを発現するpAK623より20倍高いことが見い出された。実施例６生体内のＮ末端伸長部の除去プラスミド pJB59，pJB64，pJB44及びpJB108で形質転換されたイースト株の培養物から得られた培養上清（上述参照）をHPLCクロマトグラフィー（図４ａ）により測定し、平行サンプルを10％ Tricine-SDS-PAGE ゲルにかけた（図５、レーン１，２，３及び４）。HPLCクロマトグラムから、プラスミドpJB44(クロマトグラム３)及びpJB64(クロマトグラム２)を有するイーストからの培養物上清がＮ末端伸長及び非伸長 B_chain(1-27)Asp-Lys-Ala-Ala-Lys -A(1-21)を含んでおり、一方pJB108を有するイースト（クロマトグラム４）からの培養物上清はＮ末端に伸長した形態のみを含んでいる。pJB64の場合、前駆体の約50％が非伸長形態において見い出され（図５レーン２参照）、一方この形態のみが pJB44のマイナー部分を示す。これらの結果は、伸長部がGlu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys（pJB64）又はGl u-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Lys（pJB44）のいずれかである場合の生体内で選択的にＮ末端伸長部を切断するイーストの能力、並びにGlu-Glu-Ala-Glu-Ala- Glu-Ala-Pro-Lys(pJB108)の形態におけるＮ末端伸長部を切断するイーストの能力の欠如を示す。伸長部を切断する原因である蛋白質分解活性は、イースト細胞のトランスゴルジシステムにおける膜結合YAP3のような分泌経路における酵素と関連し得る。実施例７試験管内でのＮ末端伸長部の除去先に記載される培養物を、YAP3を過剰発現するイースト株ME783(Egel-Mitani et al．1990)から単離された部分精製YAP3酵素又はアクロバクター・リチカスプロテアーゼＩのいずれかでの蛋白質分解切断のための基質として用いた。 YAP3アッセイを次のように行った： YAP3酵素４μｌ無細胞増殖培地 800μｌサンプルを 0.1Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液pH 4.0中で37℃で15時間、インキュベートした。アクロバクター・リチカスプロテアーゼＩアッセイを次のように行った：Ａ．リチカスプロテアーゼＩ 10μｇ無細胞増殖培地１ml サンプルを 0.1Ｍトリス緩衝液、pH8.75中で37℃で１時間、インキュベートした。図４ｂ及び４ｃはYAP3及びＡ．リチカスプロテアーゼＩ消化から各々得られた HPLCクロマトグラフィーにより測定された結果を示す。平行サンプルを10％ Tri cine-SDS-PAGE にかけた（図５レーン５−12）。図４ｂのクロマトグラムから、Ｎ末端伸長部がGlu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala- Lys（pJB64）又はGlu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Lys（pJB44）の形態である場合にYAP3酵素はＮ末端伸長部を選択的に切断することができるが、Glu-Glu-Al a-Glu-Ala-Glu-Ala-Pro-Lys(pJB108)ではそうでないことが明らかになる（図５レーン６，７及び８も参照）。この結果はYAP3又は YAP様酵素が生体内に見られるＮ末端伸長部の部分的切断を引きおこすことを明らかに示す（例えば実施例６）。図４ｃのクロマトグラムから、全ての場合におけるＡ．リチカスプロテアーゼＩへの消化が同じ産物、即ち前駆体におけるＢ及びＡ鎖の間に見い出されるものを含む B_chain(1-27)Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21)において見い出される全ての Lys残基の後の蛋白質分解切断の最後の結果である B_chain(1-27)-Asp-Ly s-(ジスルフィド結合により接続)-A_chain(1-21)を生ずることが明らかになる。 (非伸長 B_chain(1-27)Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21)を発現する)pJB59で形質転換されたイーストからの培養物上清の消化の場合、他の消化においては現れない産物が見られる。この産物、Arg-B_chain(1-27)-Asp-Lys-(ジスルフィド結合により接続)-A_chain(1-21)は増殖培地中の分泌されたリーダー−前駆体のＡ．リチカスプロテアーゼＩ切断が生ずる。Ａ．リチカスプロテアーゼＩは、イースト細胞の分泌経路におけるKEX2切断を避けた産物の二塩基KEX2部位における Lys 及び Arg残基の間を切断する。実施例８ YAP3を過剰発現することによるＮ末端伸長の除去 Egel-Mitani et al．(Yeast ６（1990）pp.127〜137)によりクローンされた YAP3遺伝子を次のように Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys-B_chain(1-27)-Pro- Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21)（実施例３参照）をコードする C-POTプラスミド pJB64 内に挿入した。 YAP3遺伝子を含む2.5kb Sal Ｉ／Sac ＩフラグメントをプラスミドpME768(Ege l-Mitani et al．Yeast ６（1990）pp.127〜137)から単離し、プラスミドpIC1 9R(March et al．Gene 32（1984）pp.481〜485)のSal Ｉ及び SacＩ部位内に挿入した。結果として生ずるpME834とされたプラスミドから、YAP3遺伝子を含む2. 5kb Sal Ｉ／Xho Ｉフラグメントを単離して pJB64の POT及びAp^Rの間にある唯一のSal Ｉ内に挿入した。１つの結果として生じたプラスミドをpJB176とした。イースト株 MT663にpJB176を形質転換し、実施例５に記載されるように分析した。図８に示される収率に基づきHPLCデータから見られ得るように、pJB176内のYA P3遺伝子の存在は、pJB64のイースト形質転換体と比較して、対応するイースト形質転換体の培養物上清における非伸長 B_chain(1-27)-Pro-Lys-Ala-Ala-Arg-A_chain(1-21)のより高い割合を明らかに引きおこす。この結果は、YAP3により引きおこされる蛋白質分解のレベルを操作することにより、Ｎ末端伸長部を生体内で選択的に切断する増強された能力を有するイースト株を作る能力を示す。実施例９ pKV143の作製プラスミドpKV142は、Eco R Ｉ− XbaＩフラグメントが位置82における Leu及び位置83における Aspが各々 Met及び Alaにより置換されているα−因子プレプロシグナルペプチドの85残基に相当するシグナル／リーダー配列にＮ末端に配合されたインスリン前駆体 B_chain(1-29)-Ala-Ala-Arg-A_chain(1-21)をコードしているpKFN1003の誘導体である（図４）。 Asp-Asp-Ala-Asp-Ala-Asp-Ala-Asp-Pro-Argの形態におけるＮ末端伸長部を有する B_chain(1-29)-Ala-Ala-Arg-A_chain(1-21)を発現するよう設計されたプラスミド構成物を次の配列を有するＰ１−プライマーの手段により得た。Ｐ２−プライマー：５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′及び先に記載される一般的スキームに従うプラスミドpKV142。実施例10 pKV102の作製 Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Argの形態におけるＮ末端伸長部を有する B_chain(1-29)-Ala-Ala-Arg-A_chain(1-21)を発現するよう設計されたプラスミド構成物を次の配列を有するＰ１−プライマーの手段により得た。Ｐ２−プライマー：５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′及び先に記載の一般的スキームに従うプラスミドpKV142。実施例11 Ｎ末端に伸長した B_chain(1-29)-Ala-Ala-Arg-A_chain(1-21)の発現イースト株 MT663を C-POTプラスミドpKV142，pKV143及びpKV102で形質転換し、実施例５に記載のように分析した。非伸長形態と比較したＮ末端に伸長した B_chain(1-29)-Ala-Ala-Arg-A_chain(1 -21)を発現するイースト株の結果を以下に示す。実施例12 pIM69及び pIM70の作製及び発現プラスミドpAK679はEco R Ｉ−Xba Ｉフラグメントが合成シグナル／リーダー配列YAP3／LA19にＮ末端に融合されたインスリン前駆体 B_chain(1-29)-Ala-Ala- Lys-A_chain(1-21)をコードしているpKFN1003の誘導体である（図５）。Ｎ末端に伸長したインスリン前駆体 B_chain(1-29)-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21) を発現するよう設計されたプラスミド構成物を、２つの連続的 PCR反応を含む方法により得た。次の配列を有するプライマーの手段により最初の PCR反応を行った。Ｐ２−プライマー：５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′及びプラスミドpAK6 79。第２の PCR反応をＰ１−プライマーの手段により行った。Ｐ２−プライマー：この PCR反応のための DNA−テンプレートとして最初の P CR反応の PCR産物を用いる５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′。第２の PCR反応の PCR産物を先に記載の一般的スキームに従って NcoＩ及び X baＩで切断し、pAK679に連結した。結果として生ずるプラスミド２つについて、各々Glu-Glu-Glu-Pro-Lys（pIM70）及びGlu-Glu-Glu-Glu-Pro-Lys（pIM69）の形態における B_chain(1-29)-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21)のＮ末端伸長部をコードすると同定した。イースト株 MT663を C-POTプラスミド pAK579，pIM69及び pIM70で形質転換して実施例５に記載されるように分析した。 pAK579を有するイーストからの非伸長 B_chain(1-29)-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-2 1)の収率が実際にないことが見い出された一方、pIM69及び pIM70を有するイーストが各々大量の Glu-Glu-Glu-Glu-Pro-Lys-B_chain(1-29)-Ala-Ala-Lys-A_chain (1-21)及びGlu-Glu-Glu-Pro-Lys-B_chain(1-29)-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21)を産生することが見い出された。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION N-terminally extended protein expressed in yeast Field of the invention The present invention relates to a polypeptide expressed and processed in yeast, A DNA construct containing the encoding DNA sequence, a vector having the DNA fragment, And yeast cells transformed with the vector, and heterologous proteins in yeast. A method for producing quality. Background of the Invention Yeast organisms contain several proteins that are synthesized intracellularly but have extracellular functions. Produces white matter. Such extracellular proteins are called secreted proteins. These minutes The secreted protein ensures the effective direction of the expressed product across the membrane of the endoplasmic reticulum (ER) In a precursor or precursor form that includes a presequence that is expressed first in the cell. Presequences, usually called signal peptides, are required during translocation Is generally cleaved from the resulting product. Once in the secretory pathway, proteins become Golgi Transported to equipment. From the Golgi, proteins are found in compartments like cell vacuoles or cell membranes. Or it can be guided out of the cell and into an external medium Can be secreted (Pfeffer, SR and Rothman,JEAnn.Rev.Biochem . 56(1987), 829-852). Some attempts have been made to express and express in yeast yeast proteins that are heterologous to yeast. And secretion. European Publication No. 0088632A describes the required protein And yeast cells with an expression vector having DNA encoding the signal peptide. Transforming the transformed By preparing a culture of the isolated organism and recovering the protein from the culture medium. Describes how to express, process, and secrete heterologous proteins to yeast You. The signal peptide is the required signal peptide of the protein itself, A null peptide or a hybrid of native and heterologous signal peptides obtain. The problem with using heterologous signal peptides for yeast is that After the translocation and / or signal peptide where the null peptide is effective It will not ensure that the cut is made. Saccharomyces cerevisiaeMFα1 (α factor ) Is a 19 amino acid long signal or pre-peptide, followed by a 64 amino acid long 3) N-linked glycosylation sites, followed by (Lys Arg (Asp / Glu, Ala)_Two _{~ 3}α-factor)_FourAs a prepro-form of 165 amino acids Synthesized (Kurjan, J. and Herskowitz, I. et al.Cell 30(1982), 933-943). Pre The signal-leader portion of pro-MFα1 isS. S. cerevisiaeTo Widely used to obtain the synthesis and secretion of heterologous proteins. The use of a heterologous signal / leader peptide for yeast has been No. 4,546,082, European Publications 0116201A, 0123294A, 0123544A, 0163529A, And 0123289A and EP0100561B. In EP 0123289A,S. CerevisiaeOne that describes the use of α-factor precursor On the other hand, EP 100561Saccharomyces cerevisiaeDescribe the use of the PH05 signal , PCT Publication WO 95/02059 discloses the use of a YAP3 signal peptide for secretion of foreign proteins. Describe usage. U.S. Patents 4,546,082 and European Publications 0016201A, 0123294A, 0123544A, and And 0163529A,Saccharomyces cerevisiaeFrom Α-factor signal-leader (MFα1 or MFα2) is expressed in yeast The method used in the secretion process of a heterologous protein is described.S. Celevisia D The DNA sequence encoding the MFα1 signal / leader sequence is replaced with the required protein Secretion and processing of the required protein by fusing to the 5 'end of the gene for Is shown. EP 206,783S. CerevisiaeFor the secretion of polypeptides from Disclose. As a result, the α-factor leader sequence becomes an α-factor processing site Lys-Arg-G Leader peptide fused itself to a heterologous polypeptide through lu-Ala-Glu-Ala Four α-factor peptides present on the native leader sequence to leave The edge has been cut off to remove the metal. This structure (less than 50 amino acids) It has been shown to lead to efficient processing of smaller peptides. Larger polypep For secretion and processing of tides, the native α-factor leader sequence Ends so as to leave one or two α-factor peptides between the peptide and the polypeptide It has been cut off. Some secreted proteins are located at the carboxy terminus of two conserved basic amino acids. Exposed to proteolytic processing systems that can cleave peptide bonds Take such a route. This enzyme activity was encoded by the KEX2 geneS. Cerevisi Ae (Julius, D.A. et al.,Cell 37(1984b), 1075). KEX2 Pro Treatment of the product with thease is activeS. CerevisiaeMating factor α1 (MFα1 or required for secretion of α-factor)S. CerevisiaeSecretion of mating factor a Not related to The secretion and precise processing of the polypeptide to be secreted is described in the citation given above. Cultivate yeast organisms transformed with vectors constructed as shown in Obtained in some cases. However In most cases, the level of secretion is very low or no secretion, or protein Solution processing can be incorrect or incomplete. It is described in PCT WO 90/10075 As such, this makes it inaccessible or almost inaccessible to proteolytic cleavage Exist between the C-terminus of the leader peptide and the N-terminus of the heterologous protein. It is believed to be due in part to insufficient exposure of the treated site. WO 90/10075 describes the C-terminal and / or leader peptide of a leader peptide. Providing certain modifications near the processing site at the N-terminus of the fused heterologous polypeptide Expression with improved processing of heterologous polypeptides obtained by Describe the system. This results in an unmodified leader peptide-heterologous polypeptide. Higher yields of precisely processed protein than can be obtained with is there. Summary of the Invention The present invention relates to naturally occurring yeast proteases prior to purification from the culture medium or Either during in vitro proteolysis during or after purification of the product from the culture medium Improvement of the N-terminus of a heterologous polypeptide designed as an extension that can be cleaved by Describe. The invention has the following structure: Signal peptide-leader peptide-X¹-X^Two-X^Three-X^Four-X^Five-X⁶-X⁷− Heterologous protein [Where X¹Is Lys or Arg; X^TwoIs Lys or Arg, and X¹And X^TwoTogether define the yeast processing site; X^ThreeIs Glu or Asp; X^FourHas the following structure: (AB)_n (Where A is Glu or Asp, B is Ala, Val, Leu or Pro, and n is 0 or an integer of 1 to 5, and when n ≧ 2, each of A and B is the other of A and Same or different from B) A sequence of amino acids having X^FourHas the following structure: (C)_m (Where C is Glu or Asp, m is 0 or an integer of 1 to 5) A sequence of amino acids having X^FiveIs a peptide bond or one or more amino acids that can be the same or different; X⁶Is selected from the group consisting of peptide bonds or Pro, Asp, Thr, Glu, Ala and Gly. Selected amino acid residues; X⁷Is Lys or Arg) A DNA construct encoding a polypeptide having the formula: In this context, the term “signal peptide” is predominantly sparse in nature. Aqueous, N in the precursor form of extracellular protein expressed in yeast It is understood to mean a pre-sequence which serves as a terminal sequence. Signal peptide machine The function is to allow the heterologous protein to be secreted into the endoplasmic reticulum. Sig The null peptide is usually cleaved in the course of this purpose. The signal peptide is Although heterologous or homologous to white matter-producing yeast organisms, signal pep More efficient cleavage of the tide is obtained when it is homologous to the yeast organism in question sell. The expression “leader peptide” means that its function is small for heterologous proteins. From the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus and further to secretory vesicles for secretion into the medium Excreted (ie cells of cells across the cell wall or at least through the cell membrane) Predominantly hydrophilic to allow expression of the expressed protein or polypeptide into the peripheral space) It is understood to indicate a sex peptide. The expression “heterologous protein” is naturally produced by the host yeast organism. It is intended to indicate no protein or polypeptide. X^Three-X^Four-X^Five-X⁶-X⁷Are the extensions at the N-terminus of the heterologous polypeptide To form This extension not only increases the fermentation output, but also^ThreeThe existence of Protected against dipeptidyl aminopeptidase (DPAP A) treatment, resulting in Into the homologous N-terminus of the polypeptide. The extension is used to produce heterologous proteins from the culture medium. Prior to purification of the product, for example, yeast aspartic protease 3 (YAP3) Made to be cleaved by naturally occurring yeast proteases other than DPAP Can be made. Alternatively, the extension part is a product in which the N-terminal extension heterologous protein product Psin,Achromobacter RiticusBy protease I or enterokinase During fermentation so that it can be purified from the culture medium for in vitro maturation It can be made to be resistant to cleavage. In yet another aspect, the invention is directed to obtaining expression and secretion of a heterologous protein. Culture the transformed yeast strain in chopped media and then isolate proteins from the media And producing a heterologous protein in yeast. Detailed description of the invention Peptide structure (AB)_nIn the above, n is preferably 2 to 4, more preferably 3. In a preferred polypeptide according to the invention, X^ThreeCan be Glu and A is Glu And B can be Ala and X^FiveIs a peptide bond or Glu, or Glu Pro Lys Ala or X⁶Can be a Pro or peptide bond. Possible N-terminal extension X^Three-X^Four-X^Five-X⁶-X⁷An example of It is. The signal peptide sequence of the polypeptide of the present invention is expressed in the cell's secretory pathway. Any signal peptide that ensures effective orientation of the selected polypeptide possible. The signal peptide is a natural signal peptide or a functional peptide thereof. With partial or synthetic peptides possible. Suitable signal peptides are α-factor signal peptide, mouse saliva Also the signal peptide of the enzyme, the modified carboxypeptidase signal peptide Or eastBAR1Signal peptide and yeast aspartate protein It has been found to be a ze3 (YAP3) signal peptide. Mouse saliva Rahse Signa Described by The carboxypeptidase signal sequence is described in L.A.Valls et al.,Cell 48 , 1987, pp. 887-897.BAR1Signal peptide is PCT It is disclosed in the publication WO 87/02670. East aspartic protease 3 sig Null peptides are described in PCT Publication 95/02059. The leader peptide sequence of the polypeptide of the present invention may be further secreted through the endoplasmic reticulum. Any leader capable of directing a polypeptide expressed along It can be a peptide. A possible leader sequence suitable for this purpose is the α-factor leader Or its natural analogs such as functional analogs obtained from yeast or other organisms. Is a leader peptide. The leader peptide is a synthetic peptide, such as PCT publication WO 89/02463 or WO 92/11378. Can get. The N-terminally extended heterologous protein produced by the method of the present invention is advantageously produced in yeast. It can be any protein that can be produced. Examples of these proteins include aprotinin Tissue factor pathway inhibitors or other protease inhibitors; Insulin or insulin precursor, insulin analogue, insulin-like growth factor Offspring I or II, human or bovine growth hormone, interleukin, tissue plastic Suminogen activator, glucagon, glucagon-like peptide-1 (GLP- 1), Factor VII, Factor VIII, Factor XIII, Platelet-derived growth factor , Enzymes, or functional analogs of any of these proteins. In this context The term “functional analog” refers to the native protein (this is the native protein Intended to be understood as relating to nature rather than to the level of biological activity of quality ) Means that the polypeptide functions similarly. This polypepti Can be structurally similar to the native protein, with C- and N-terminal Addition of one or more amino acids to one or both, one of the native amino acids Or substitution of one or more amino acids at several different sites, native protein One or more at either or both ends of the quality or at one or more sites in the amino acid sequence Deletion of one or more amino acids at one or more sites in the native amino acid It can be derived from the native protein by insertion of a amino acid. Such a modification first Known for some of the proteins described. Examples of suitable insulin precursors and analogs are (eg EP 163529) B (1-29) -Ala-Ala-Lys-A (1-21), (eg, as described in PCT Publication 95/005) B (1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A (1-21) (as described in PCT Publication 95 B (1-29) -Ala-Ala-Arg-A (1-21), and B (1-29) -Ser (as described in US Pat. -Asp-Asp-Ala-Arg-A (1-21). The DNA constructs of the present invention, which encode the polypeptides of the present invention, can be Law, for example, S.L.Beaucage and M.H.Caruthers,Tetrahedron Letters 22, 1981 , Pp. 1859-1869, or by the method of Matthes et al.,EMBO Journal 3, 1984, pp. 801-805. obtain. According to the phosphoramidite method, oligonucleotides can be The synthesizer, purification, double-stranding, combining to form a synthetic DNA construct. DNA components A currently preferred method of preparing is described, for example, in Sambrook et. al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, By polymerase chain reaction (PCR) as described in 1989. The DNA constructs of the present invention can be used to prepare genomic or cDNA libraries, e.g., standard Technology (eg Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor, 1989). Encodes all or a part of the polypeptide of the present invention by hybridization. Can be of genomic or cDNA origin by screening DNA sequences You. In this case, the genomic or cDNA sequence encoding the signal and leader peptide Can be linked to a genomic or cDNA sequence encoding a heterologous protein, after which the DNA sequence For example, the required amino acid sequence for a homologous recombinant can be coded according to known procedures. The insertion of a synthetic oligonucleotide to Acid sequence X¹-X^Two-X^Three-X^Four-X^Five-X⁶-X⁷Can be modified at a site corresponding to You. Finally, the DNA construct can be synthesized (as appropriate), genomic or genomic according to standard techniques. Is a mixed synthesis and gel prepared by arranging fragments of the cDNA source. Noms, mixed synthetic and cDNA or mixed genomic and cDNA sources, total DNA constructs Of the fragments corresponding to the various parts of This allows for heterologous proteins The DNA sequence encoding the quality can be of genomic or cDNA origin, while the signal and Leader peptide coding sequence and N-terminal extension X¹-X^Two-X^Three-X^Four-X^Five -X⁶-X⁷It can be appreciated that the sequence encoding can be prepared synthetically. In a further embodiment, the present invention is capable of replicating in yeast, as defined above. Having a DNA construct encoding a polypeptide to be derived It relates to a recombinant expression vector. Recombinant expression vector replicates in yeast organisms Any vector that can be used. In this vector, the present invention The DNA sequence encoding the polypeptide is operably linked to an appropriate promoter sequence. Should be. The promoter is any DNA that is transcriptionally active in yeast Sequence, encoding a protein that is either homologous or heterologous to yeast. Can be obtained from the gene. The promoter is preferably homologous to yeast. Is obtained from a gene encoding a protein. Examples of suitable promoters areSa Cararomyces cerevisiae Mα1, TPI, ADH or PGK promoter. DNA sequences encoding the polypeptides of the present invention may also be suitable terminators, such as It can be operatively connected to a TPI terminator (eg, T.Alber and G.Kawasaki,J .Mol.Appl.Genet . 1 , 1982, pp. 419-434). The recombinant expression vector of the present invention allows the vector to replicate in yeast. The DNA sequence further comprises An example of such a sequence is a 2μ yeast plasmid. Gene REP1-3 and the source of replication. The vector may be a selectable marker, such as P .R.Russell,Gene 40, 1985, pp. 125-130Schizo Saccharo Myces Pombe (Schizosaccharomyces pombe) It may also include the TPI gene. D encoding each of the polypeptide, promoter and terminator of the present invention To bind the NAs, as well as to include them with the necessary information for yeast replication. The methods used to insert into a cut yeast vector are known to those of skill in the art. (Eg, Sambrook et al., Supra). First encode the polypeptide of the invention. A DNA construct containing the entire DNA sequence is prepared, and this plasmid is then placed in a suitable expression vector. Fragment, or (signal, leader or heterologous protein DNA fragments containing genetic information about individual elements (such as quality) It is reasoned that the vector can be made by either inserting and then ligating. I understand. The yeast organism used in the method of the present invention can be cultured in large quantities to obtain a large amount of the heterologous protein of interest. It can be any suitable yeast organism that produces white matter or polypeptide. Suitable Examples of severe yeast organisms are yeast speciesSaccharomyces cerevisiae (Saccha romyces cerevisiae) ,Saccharomyces kluyve ri) ,Schizosaccharomyces pombeOrSa Saccharomyces uvarum Can be Yeast cells Transformation, for example, after protoplast formation in a manner known per se. Conversion can be performed. The medium used to culture the cells enriches the yeast organism. It can be any conventional medium suitable for growing. That critical proportion is exactly The secreted heterologous protein that may be present in the medium in the processed form is distant. Separate the yeast cells from the medium by heart or filtration and salt, for example, ammonium sulfate The protein component of the supernatant or the filtrate is precipitated by means of Chromatography methods, such as ion exchange chromatography, affinity -Recovery from medium by conventional methods including purification by chromatography, etc. Can be collected. After secretion into the culture medium, the protein has the sequence X^Three-X^Four-X^Five-X⁶-X⁷Remove Various methods can be performed. X⁶If is Pro, Thr, Ser, Gly, or Asp, the extension will Proteolytic activity of yeast proteases such as DPAP stably attached to white matter Protects the N-terminus of a protein having a heterogeneous structure. N-terminal extension in heterologous proteins The presence of the moiety may be used to protect the N-terminal amino group of the heterologous protein during chemical processing of the protein. Can work. That is, it can act as a substitute for BOC or a similar protecting group. Such a place The amino acid sequence X^Three-X^Four-X^Five-X⁶-X⁷Means that the terminal extension is X⁷I will be cut at Protease means specific for basic amino acids (eg, Lys or Arg) Can be removed from the recovered heterologous protein. Such a protease Examples are trypsin,Achromobacter lyticusProfessional Thease I, enterokinase,Fusarium oxysprum orum) Trypsin-like protease and Saccharomyces cerevisiae Store aspartic protease 3 (YAP3). YAP3 has various prohormones and xenogenes in Saccharomyces cerevisiae Characterized by application to protein expression (Niamh, X.C. et al., FEBS Letters ,332, P.273-276, 1993; Bourbonnais, Y. et al. et al., EMBO Journal,12, P. 285-294, 1993; Egel-Mitani, M .; et al., YEAST,6, P.127-137, 1990) . YAP3Saccharomyces cerevisiaeAppears during large-scale fermentation of. pH 3 It is activated when it is at about pH 6. The appearance of YAP3 is at the very center of the medium for production. Most promoted with small types. In such a medium, the cells are glucose And / or nitrogen is deprived, but other conditions that limit growth conditions may be used. YAP3 protease requires a defined motif adjacent to the cleavage site. this Such a motif is X⁷N-terminal when the amino acid immediately upstream of Ala or Glu At the end extension (but X⁶Is present if is Pro, Thr, Ser, Gly or Asp Absent). This gives X⁶Is a peptide bond (and X⁷The amino acid upstream of Ala or Glu) In some cases, the extension is most preferably, after its secretion from the yeast cells, Can be cleaved from the heterologous protein The substrate (peptide after lysine or arginine) A method that depends on YAP3 to act on (tide binding). Inside the yeast cell, attached to it YAP3 obtained or eluted therefrom is such that the unextended product can be purified from the growth medium. The extension can then be selectively cut. X⁶Is Ala or Glu or peptide bond (And X⁷The amino acid upstream of Ala or Glu) Column X^Three-X⁷Stresses yeast cells causing them to release YAP3 into the medium The amino acid sequence X^Three-X⁷Medium is cut by a method related to Can be removed from the heterologous proteins therein. The stress applied to the yeast cells can cause the pH of the culture medium to be less than 6.0, preferably Reduce glucose or / and nitrogen from yeast cells. May be included. In the method of the present invention for producing a heterologous protein, the yeast cell The culture expresses the gene and the resulting product of the protease is a heterologous protein. X from quality^Three-X⁷Specific amino acid residues to ensure more complete cleavage of It can be further transformed with one or more genes encoding different proteases. In a preferred embodiment, one or more additional genes encoding YAP3 are Culture results in overexpression of the gene and the resulting overproduction of YAP3 X from Ripeptide^Three-X⁷Yeast cells to ensure a more complete cleavage of Can be used to transform In this context, yeast aspartic protease 3 (YAP3) Active YAP3 enzyme and its C-terminus ensure effective release of YAP3 protein from cells Any modification that has been modified to Includes enzymes derived from the native enzymes that are performing good. Alternatively, the proteaseA. Reticus (A. lyticus)Protease I. En It can be telokinase or trypsin. The present invention is by any means intended to limit the scope of the claimed invention. Not described in more detail in the following examples. The present invention is described with reference to the following drawings. Fig. 1 Preparation of plasmid containing gene expressing polypeptide extended to N-terminus Shows a general scheme for In FIG. 1, the following symbols are used: 1:S. CerevisiaeShows the TPI gene promoter sequence from You. 2: indicates the region encoding the signal / leader peptide (eg IfS. CerevisiaeFrom the α-factor gene). 3: Indicates a region encoding a heterologous polypeptide. 3^* : Indicates a region encoding an N-terminal extended heterologous polypeptide. 4:S. Cerevisiae1 shows the TPI gene terminator sequence of the present invention. P1: Synthetic oligonucleotide PCR plasmid to determine N-terminal extension Indicates an immer. P2: Universal PCR primer for amplification of region 3. POT:S. Pombe2 shows the TPI gene from. 2μOri:S. CerevisiaeIncludes sources of DNA replication withinS. Celevisia DShown is the sequence from the 2μ plasmid. Ap^R : Source of ampicillin resistance gene and DNA replication in Escherichia coli Sequence from pBR322 / pUC13 containing Figure 2: Leu at position 82 and Asp at position 83 are Met and -Factor signal / leader replaced by Ala and Ala Insulin fused to the N-terminus at 85 residues that make up the peptide Phosphorus precursor B_chain(1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain 2 shows the DNA sequence of pJB59 encoding (1-21). Figure 3: Synthetic signal / leader sequence “YAP3 / S1_PAVAAt the N-terminus Fused GLP-1_7-36AlaDNA sequence of pAK623 encoding Figure 4: Leu at position 82 and Asp at position 83 are Met and -Factor signal / leader replaced by Ala and Ala B fused to the N-terminus at 85 residues forming the peptide_chain (1-29) -Ala-Ala-Arg-A_chainPKV142 encoding (1-21) DNA sequence. Figure 5: N-terminal fusion to synthetic signal / leader sequence “YAP3 / LA19” B combined_chain(1-29) -Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21) PAK679 DNA sequence to be loaded. Figure 6: Insulin precursor B with or without N-terminal extension_ch _ain(1-27) Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chainCulture including (1-21) 3 shows an HPLC chromatogram of a nutrient supernatant. Figure 7: Separated by size on a 10% Tricine-SDS-PAGE gel 5 shows the product according to FIG. Figure 8: Obtained from HPLC data on pJB176 compared to pJB64 9 shows the effect of the presence of YAP3 co-expression on yield. Example Plasmid and DNA All expression plasmids areS. CerevisiaeSelection and stability in yeast For the purpose ofSchizosaccharomyces pombeTriose phosphate iso What is described in WO EP 171 142, which contains a merase gene (POT) It is a C-POT type similar to (see Fig. 1). This plasmid isS. Sele Viciae Triose phosphate isomerase promoter (region 1 in FIG. 1) and And a terminator (region 4 in FIG. 1). These sequences are Code the leader / productEcoRI-XbaSequence of I fragment (region 2 in FIG. 1) And plasmid pKFN100 (as described in WO 90/100075) which is the entire sequence except for (3) Identical to the corresponding sequence in 3. To express different heterologous proteins, p KFN1003EcoRI-XbaThe I fragment binds the signal / leader / product of interest. LoadEcoRI-XbaIt is simply replaced by an I fragment. like thisEc o RI-XbaI fragments can be prepared using standard techniques (eg, Sambrook et al., 1989). Supra) and can be synthesized using PCR. FIG. 1 shows the plasmid containing the gene expressing the polypeptide extended at the N-terminus. The general scheme used for fabrication is shown. This scheme includes the following steps . − Restriction nuclease from C-POT plasmid vector samplesEcoRV andXb a I and digestion of the largest DNA fragment using standard molecular techniques (Sambrook J, Fri tsch EL and Maniatis T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Sp ring Harbor Laboratory Press, 1989). -Other components of the C-POT plasmid (which may be the same or different from the Nucleases that restrict the sampleEcoRV andNcoDigested with I and containing the regions 1 and 2 Isolate the fragment. − Gene Amp PCR reagent kit (Perkin Elmer, 761 Main Av) according to manufacturer's instructions. ewalk, CT 06859, USA) and encodes a heterologous polypeptide of interest (described above) Synthetic oligonucleotides on a template) Polymerase chain reaction (PCR) is performed using primers P1 and P2. P1 Restriction nuclease in front of the sequence encoding the KEX2 processing siteNcoI (5'CCATGG 3 '), the N-terminal extension and the original N-terminus of the heterologous protein of interest. It is designed to contain the same 10-15 nucleotides as the coding sequence. P2 (for example For example, 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3 ') indicates that it is region 3 as well as Sambrook et al. al., restriction nuclei in PCR at P1 using standard techniques described above. -SeXbaAmplify the fluxing recognition site for I (5'-TCTAGA-3 ') Design. -PCR products are restriction nucleasesNcoI andXbaDigested with I Isolate. -Isolation of the isolated fragment using standard (described in Sambrook et al, supra) Ligation together under T4 DNA ligation under conditions. -Transfer the ligation mixture to competent E. coli cells^r-Used to transform , Sambrook et al., Supra, for ampicillin resistance. -Plasmids can be prepared using standard molecular techniques (described in Sambrook et al., Supra). To isolate from the resulting E. coli clone. Ascertain (or determine) the DNA sequence encoding the N-terminal extension polypeptide And the DNA sequence that encodes the signal / leader peptide of region 2 Enzyme according to manufacturer's instructions to ensure that it is in frame with DNA termination using strand termination (Sequenase, United States Biochemicals) Perform sequencing. -This plasmid is transformed into yeast strain MT663 as described in detail below. Used to transform and select for growth on glucose: Yeast transformation:S. CerevisiaeMT663 (E2-7B XE11-36a / α , Δtpi / Δtpi, pep4-3 / pep4-3) (this yeast strain MT663 was obtained from WO 92/11378). Deutsche Sarumung-Won Micro-Organizmen (Deposited with De Tülkulturen and given the deposit number DSM 6278) aL (1% Bacto yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% Glucose, 1% Lac (Kutate) to an O.D. at 600 nm of 0.6. 100 ml of the culture is harvested by centrifugation, washed with 10 ml of water, centrifuged again and Rubitol, 25mM Na_TwoContains EDTA pH = 8.0 and 6.7mg / ml dithiothreitol Suspended in 10 ml of solution. Incubate this suspension at 30 ° C for 15 minutes, centrifuge , The cells were added to 1.2 M sorbitol, 10 mM Na_TwoEDTA, 0.1 M sodium citrate, p H = 5.8, and Incubate at 30 ° C. for 30 minutes, collect cells by centrifugation, and add 1.2 M sorbitol 10 ml, and CAS (1.2 M sorbitol, 10 mM CaCl_Two, 10 mM Tris HCl (Tris = Lis (hydroxymethyl) aminomethane) pH = 7.5)) Wash with 10ml and 2ml with CAS Resuspended. For the transformation, 1 ml of CAS-resuspended cells were mixed with about 0.1 plasmid DNA. μg and left at room temperature for 15 minutes. (20% polyethylene glycol 4000, 10m M CaCl_Two, 10 mM Tris HCl, pH = 7.5), and the mixture is allowed to stand for another 30 minutes at room temperature. I left it. The mixture is centrifuged and the pellet is SOS (1.2 M sorbitol, 33% v / v YPD, 6.7 mM CaCl_Two) Resuspend in 0.1 ml and incubate at 30 ° C for 2 hours did. Thereafter, the suspension was centrifuged, and the pellet was mixed with 1.2 M sorbitol 0.5 Resuspended in ml. Then, top agar at 52 ° C (1.2 M sorbitol + 2.5% Sherman et al., Containing agar,Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) SC medium), and the suspension was mixed with the same agar-hardened sol. Plate containing medium containing bitol Poured on top. Example 1 Preparation of pJB108 and pJB109 Plasmid pJB59 containsEcoRI-XbaThe I fragment has the Leu and Α-factor prep in which Asp at position 83 is replaced by Met and Ala, respectively Fused to the N-terminus at the signal / leader sequence corresponding to 85 residues of the low signal peptide Insulin precursor B_chain(1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21) This is a derivative of pKFN1003 to be loaded (FIG. 2). EcoRI-XbaI fragment was manufactured by Applied Biosystems DNA synthesizer (Perkin El mer DNA Thermal Cycler). Insulin precursor B extended to N-terminal_chain(1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_cha _in Plasmid constructs designed to express (1-21) were replaced with P1- having the following sequences: Obtained by means of primers. P2-primer: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3 'and general as described above Plasmid pJB59 following a general scheme. Insulin by PCR and cloning Precursor B_chain(1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chainDNA sequence encoding (1-21) Is the N-terminal extension Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Xaa-Lys (where Xaa is Pro (pJB 108; Pro encoded by CCA) or Thr (pJB109; Thr encoded by ACA )), Resulting in a construct that follows the DNA sequence encoding). Example 2 Preparation of pJB44, pJB107, and pJB126 Insulin precursor B_chain(1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21) N Plasmid constructs designed to express extensions at the ends were replaced with the following sequences: It was prepared by means of P1-primer. P2-Primer: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3 'and described in Example 1 Plasmid pJB59 to be used. The resulting plasmids pJB44, pJB107 and pJB1 26 were isolated. These plasmids have an N-terminal extension Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu- Ala-Xaa-Lys (where Xaa is Glu (pJB44; Glu encoded by GAA), Asp (pJB12 6; Asp encoded by GAC) or Gly (pJB107; Gly encoded by GGC) Insulin precursor B)_chain(1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys -A_chainCode (1-21). Example 3 Preparation of pJB64 and pJB110 Insulin precursor B extended to N-terminal_chain(1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_cha _in (1-21) was obtained by means of a P1-primer having the following sequence. P2-Primer: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3 'and described in Example 1 Plasmid pJB59. Simply for the resulting plasmids pJB64 and pJB110. Released. These plasmids have an N-terminal extension Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Xaa-Ly s (where Xaa is Glu (pJB110 Glu encoded by GAA or Ala (pJB64; Ala encoded by GCA) Insulin precursor B)_chain(1-27) -Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain Encodes the N-terminal extension of (1-21). Example 4 Preparation of pAK663 Plasmid pAK623 isEcoRI-XbaI is a synthetic signal leader sequence YAP3 / S1_PAVA GLP-1 fused to N-terminal_7-36AlaIs a derivative of pKNF1003 that encodes You. EcoRI-XbaI fragment was prepared according to the manufacturer's instructions using Applied Biosystems DNA. Synthesized on a synthesizer. G with N-terminal extension in the form of Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Arg LP-1_7-36ALAThe plasmid construct designed to express 1-obtained by means of primer. P2-primer: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3 'and as described above Plasmid pAK623 following the method results in plasmid pAK663. Example 5 Expression of N-terminal extension product and removal of extension The C-POT plasmids described above (pJB59, pJB108, pJB109, pJB44, pJB126, Yeast strain MT663 transformed with JB107, pJB64 and pJB110) was transformed into YPD (1% yeast). Extract, 2% peptone and 2% glucose) on agar plates. single Initiate 5 ml liquid culture in YPD broth pH = 6.0 using one colony and run at 30 ° C for 72 hours Shaking . Snel, Damgaard and Mollerup, Chromatographia 24, 1987, pp. 329-332 Product yield was determined directly on culture supernatants by the method described more fully. B extended at the N-terminus compared to the unextended form (pJB59)_chainn(1-27) -Asp- Lys-Ala-Ala-Lys-A_chainThe results of the yeast strain expressing (1-21) are shown below. GLP-1 extended to the N-terminus by Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Arg_7-36AlaTo In the case of expressed pAK663, the yield is unextended GLP-1_7-36Ala20 times higher than pAK623 expressing Was found. Example 6 Removal of N-terminal extension in vivo Culture of yeast strains transformed with plasmids pJB59, pJB64, pJB44 and pJB108 The culture supernatant (see above) obtained from the nutrients is 10% Tricine-SDS-PAGE. The gel was run (FIG. 5, lanes 1, 2, 3, and 4). From the HPLC chromatogram, Ys with Rasmid pJB44 (Chromatogram 3) and pJB64 (Chromatogram 2) N-terminal extension and non-extension B_chain(1-27) Asp-Lys-Ala-Ala-Lys -A (1-21), while containing pJB108 from the yeast (chromatogram 4) Culture supernatant contains only the form extended to the N-terminus. In the case of pJB64, the precursor About 50% are found in the unextended form (see FIG. 5, lane 2), while this form Only shows the minor part of pJB44. These results indicate that the extension was Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys (pJB64) or Gl In vivo when it is any of u-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Lys (pJB44) Yeast's ability to selectively cleave N-terminal extensions, as well as Glu-Glu-Ala-Glu-Ala- The ability of yeast to cleave N-terminal extensions in the form of Glu-Ala-Pro-Lys (pJB108) Indicates lack of power. The proteolytic activity responsible for cutting the extension is determined by yeast cells. Enzymes in secretory pathways such as membrane-bound YAP3 in the trans Golgi system Can be relevant. Example 7 Removal of N-terminal extensions in test tubes The previously described culture was transformed with the yeast strain ME783 (Egel-Mitani et al. (1990) partially purified YAP3 enzyme orAcrobatic litchicusStep Used as a substrate for proteolytic cleavage with any of Rotase I. The YAP3 assay was performed as follows: 4 μl of YAP3 enzyme 800 μl cell-free growth medium Samples were incubated at 37 ° C for 15 hours in 0.1 M sodium citrate buffer pH 4.0. Was added. Acrobatic litchicusThe protease I assay was performed as follows: A. ReticusProtease I 10μg 1 ml cell-free growth medium Incubate the sample for 1 hour at 37 ° C in 0.1 M Tris buffer, pH 8.75. Was. 4b and 4c show YAP3 andA. ReticusEach obtained from protease I digestion 3 shows the results measured by HPLC chromatography. Parallel samples should be 10% Tri It was subjected to cine-SDS-PAGE (Fig. 5, lanes 5-12). From the chromatogram in FIG. 4b, the N-terminal extension is Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala- Lys (pJB64) or Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Lys (pJB44) In some cases, the YAP3 enzyme can selectively cleave the N-terminal extension, but Glu-Glu-Al In a-Glu-Ala-Glu-Ala-Pro-Lys (pJB108), it is clear that this is not the case (FIG. 5). See also lanes 6, 7 and 8). This result indicates that YAP3 or YAP-like enzyme Clearly causing partial cleavage of the N-terminal extension (eg, Example 6). ). From the chromatogram in FIG.A. ReticusProtease Digestion to I is found between the B and A chains in the same product, ie the precursor Including B_chain(1-27) Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chainFound in (1-21) B is the final result of proteolytic cleavage after all Lys residues_chain(1-27) -Asp-Ly s- (connected by disulfide bond) -A_chain(1-21). (Non-stretched B_chain(1-27) Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain(Expressing (1-21)) with pJB59 In the case of digestion of the culture supernatant from the transformed yeast, Some products are not seen. This product, Arg-B_chain(1-27) -Asp-Lys- (disulfide bond -A_chain(1-21) is the secreted leader-precursor in the growth medium.A. Reticus Protease I cleavage occurs.A. ReticusProtease I Lys at the dibasic KEX2 site of the product that avoided KEX2 cleavage in the secretory pathway of G-cells And between Arg residues. Example 8 Removal of N-terminal extension by overexpressing YAP3 Egel-Mitani et al. (Yeast 6(1990) pp.127-137) The YAP3 gene was transformed into Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys-B_chain(1-27) -Pro- Lys-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21) C-POT plasmid encoding (see Example 3) Inserted into pJB64. 2.5kb including YAP3 geneSalI /SacThe I fragment was transferred to plasmid pME768 (Ege l-Mitani et al.Yeast 6(1990) pp. 127-137) and isolated from plasmid pIC1 9R (March et al.Gene 32(1984) pp.481-485)SalInsert into I and SacI sites Entered. From the resulting plasmid, designated pME834, containing the YAP3 gene.2. 5kbSalI /XhoIsolation of I fragment from POT and Ap of pJB64^ROnly between OneSalI. One resulting plasmid was designated pJB176. Yeast strain MT663 was transformed with pJB176 and analyzed as described in Example 5. Was. As can be seen from the HPLC data based on the yields shown in FIG. 8, the YA in pJB176 The presence of the P3 gene indicates the presence of the corresponding yeast compared to the yeast transformant of pJB64. Non-elongation in culture supernatant of transformants B_chain(1-27) -Pro-Lys-Ala-Ala-Arg-A_chainClearly higher percentage of (1-21) Wake up. This result could be used to manipulate the level of proteolysis caused by YAP3. Ys with enhanced ability to selectively cleave N-terminal extensions in vivo more Demonstrate the ability to make strains. Example 9 Preparation of pKV143 Plasmid pKV142 containsEcoThe RI-XbaI fragment contains the Leu and Α-factor prep in which Asp at position 83 is replaced by Met and Ala, respectively N-terminal compound to signal / leader sequence corresponding to 85 residues of low signal peptide Insulin precursor B_chain(1-29) -Ala-Ala-Arg-A_chainCode (1-21) Is a derivative of pKFN1003 (FIG. 4). Has an N-terminal extension in the form of Asp-Asp-Ala-Asp-Ala-Asp-Ala-Asp-Pro-Arg To B_chain(1-29) -Ala-Ala-Arg-A_chainPlus designed to express (1-21) The mid construct was obtained by means of a P1-primer having the following sequence. P2-primer: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3 'and as described above Plasmid pKV142 according to the general scheme. Example 10 Preparation of pKV102 N-terminal in the form of Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg B with end extension_chain(1-29) -Ala-Ala-Arg-A_chainDesigned to express (1-21) The following sequence is Obtained by means of P1-primer. P2-primer: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3 'and general as described above Plasmid pKV142 according to a general scheme. Example 11 B extended to N-terminal_chain(1-29) -Ala-Ala-Arg-A_chainExpression of (1-21) Yeast strain MT663 was transformed with the C-POT plasmids pKV142, pKV143 and pKV102. And analyzed as described in Example 5. B extended to N-terminus compared to unextended form_chain(1-29) -Ala-Ala-Arg-A_chain(1 The results of yeast strains expressing -21) are shown below. Example 12 Production and expression of pIM69 and pIM70 Plasmid pAK679EcoRI-Xba I fragment is a synthetic signal / leader Insulin precursor B fused N-terminal to sequence YAP3 / LA19_chain(1-29) -Ala-Ala- Lys-A_chainIt is a derivative of pKFN1003 encoding (1-21) (FIG. 5). Insulin precursor B extended to N-terminal_chain(1-29) -Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21) Plasmid constructs designed to express Method. Plastic with the following sequence The first PCR reaction was performed by the means of Immer. P2-primer: 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3 'and plasmid pAK6 79. A second PCR reaction was performed by means of P1-primer. P2-primer: the first P as the DNA-template for this PCR reaction 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3 'using PCR product of CR reaction. The PCR product of the second PCR reaction was combined with NcoI and X according to the general scheme described above. It was cut with baI and ligated into pAK679. For the two resulting plasmids, Glu-Glu-Glu-Pro-Lys (pIM70) and Glu-Glu-Glu-Glu-Pro-Lys (pIM69) respectively B in state_chain(1-29) -Ala-Ala-Lys-A_chainEncodes the N-terminal extension of (1-21) Was identified. Yeast strain MT663 was transformed with the C-POT plasmids pAK579, pIM69 and pIM70. And analyzed as described in Example 5. Non-extended B from yeast with pAK579_chain(1-29) -Ala-Ala-Lys-A_chain(1-2 The yield of 1) was found to be practically absent, while the yield with pIM69 and pIM70 Glu-Glu-Glu-Glu-Pro-Lys-B_chain(1-29) -Ala-Ala-Lys-A_chain (1-21) and Glu-Glu-Glu-Pro-Lys-B_chain(1-29) -Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21) It was found to live.

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年８月２６日【補正内容】請求の範囲１．次の構造：シグナルペプチド−リーダーペプチド−Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｘ⁷− 異種蛋白質〔ここで、該異種蛋白質が、アプロチニン、組織因子経路インヒビターもしくは他のプロテアーゼインヒビター、インスリン様成長因子ＩもしくはII、ヒトもしくはウシ成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアクティベーター、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１、因子VII、因子VIII、因子ＸIII 、血小板由来成長因子、酵素、インスリンもしくはインスリン前駆体、並びにこれらの蛋白質のいずれかの機能的アナログからなる群から選択され、Ｘ¹は Lys又は Argであり；Ｘ²は Lys又は Argであり、Ｘ¹及びＸ²は共にイーストプロセッシング部位を規定し；Ｘ³は Glu又は Aspであり、Ｘ⁴は次の構造：（Ａ−Ｂ）_n （ここで、Ａは Glu又は Aspであり、Ｂは Ala，Val，Leu又は Proであり、そしてｎは０又は１〜５の整数であり、そしてｎ≧２の場合、Ａ及びＢは各々他のＡ及びＢと同じ又は異なる）を有するアミノ酸の配列であり、又はＸ⁴は次の構造：（Ｃ）_m （ここで、Ｃは Glu又は Aspであり、そしてｍは０又は１〜５の整数である）を有するアミノ酸の配列であり；Ｘ⁵はペプチド結合又は同じもしくは異なり得る１以上のアミノ酸であり；Ｘ⁶はペプチド結合又はPro，Asp，Thr，Ser，Glu，Ala及び Glyからなる群から選択されるアミノ酸残基であり；そしてＸ⁷は Lys又は Argである〕を有するポリペプチドをコードする DNA構成物であって、該 DNA構成物はシグナルペプチド、リーダーペプチド並びに異種蛋白質もしくはポリペプチドの融合物を含むポリペプチドをコードせず、ここで該ポリペプチドは、そのプロセッシング部位を蛋白質分解切断にアクセス可能にする該プロセッシング部位の提示を供するように前記リーダーペプチドのＣ末端と前記異種蛋白質のＮ末端との間に位置した前記イーストプロセッシング部位に隣接したアミノ酸配列において改変されており、該ポリペプチドは次の構造：シグナルペプチド−リーダーペプチド−Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−異種蛋白質（ここで、Ｘ¹はペプチド結合である又は同じもしくは異なり得る１以上のアミノ酸を表し、Ｘ²及びＸ³は同じもしくは異なり、Lys及び Argからなる群から選択される塩基性アミノ酸を表し、Ｘ²及びＸ³は共にイーストプロセッシング部位を規定し、そして、Ｘ⁴はペプチド結合である又は同じもしくは異なり得る１以上のアミノ酸を表し、但し、Ｘ¹及び／又はＸ⁴は１以上のアミノ酸であり、Ｘ¹及び／又はＸ⁴により表されるアミノ酸の少くとも１つは Glu及び Aspからなる群から選択される負電荷アミノ酸である）を有する蛋白質であることを特徴とする DNA構成物。２．Ｘ³が Gluであることを特徴とする請求項１に記載の DNA構成物。３．Ａが Gluであることを特徴とする請求項１に記載の DNA構成物。４．Ｂが Alaであることを特徴とする請求項１に記載の DNA構成物。５．ｎが好ましくは２〜４、更に好ましくは３であることを特徴とする請求項１に記載の DNA構成物。６．Ｘ⁵がペプチド結合、Glu，Asp又は Glu-Pro-Lys-Alaであることを特徴とする請求項１に記載の DNA構成物。７．Ｘ⁶が Pro、又はペプチド結合であることを特徴とする請求項１に記載の DNA構成物。８．前記シグナルペプチドがα−因子シグナルペプチド、イーストアスパラギン酸プロテアーゼ３シグナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド、カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド、又はイーストBAR1シグナルペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の DNA構成物。９．前記リーダーペプチドがα−因子リーダーペプチドのような天然のリーダーペプチド、又は合成のリーダーペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の DNA構成物。 10．前記異種蛋白質がインスリンもしくはインスリン前駆体又はそれらの機能的アナログであることを特徴とする先の請求項のいずれか一に記載の DNA構成物。 11．前記アミノ酸配列Ｘ³−Ｘ⁷が、であることを特徴とする請求項１〜10のいずれかに記載の DNA構成物。 12．イースト内において複製することができ、請求項11に記載の DNA構成物を有する組換え表現ベクター。 13．異種蛋白質を発現することができ、請求項12に記載のベクターで形質転換されたイースト株。 14．前記異種蛋白質の発現及び分泌を得るために適切な培地において請求項13 に記載のイースト細胞を培養し、その後前記培養培地から前記蛋白質を単離することを含む異種蛋白質を製造するための方法。 15．前記アミノ酸配列Ｘ³−Ｘ⁷が、塩基性アミノ酸に特異的である蛋白質分解酵素での処理を含む方法によって、前記回収された異種蛋白質から除去されることを特徴とする請求項14に記載の方法。 16．前記蛋白質分解酵素が、トリプシン、アクロモバクター・リチカス(Achro mobacter lyticus) プロテアーゼＩ、エンテロキナーゼ、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ、及びYAP3からなる群から選択されることを特徴とする請求項15に記載の方法。 17．前記アミノ酸配列Ｘ³−Ｘ⁷(ここで、Ｘ⁶はペプチド結合、Ala、又は Glu である)が、前記イースト細胞にストレスをかけて、それらに対してイーストアスパラギン酸プロテアーゼ３を前記培地内に放出させ、それにより前記アミノ酸配列Ｘ³−Ｘ⁷が切断されることを含む方法により前記培地内の前記異種蛋白質から除去されることを特徴とする請求項15に記載の方法。 18．前記イースト細胞にかけられるストレスが、前記培養培地のpHを 6.0未満に減少させること、又は前記イースト細胞を制限的増殖条件にさらすことにより該イースト細胞を飢餓させることを含むことを特徴とする請求項17に記載の方法。 19．前記培養培地のpHが５未満に減少されることを特徴とする請求項18に記載の方法。 20．前記細胞の培養に基づいて遺伝子が発現され、その結果としてのプロテアーゼの産生が前記異種ポリペプチドからのより完全なＸ³−Ｘ⁷の切断を確実にするように、前記イースト細胞が、塩基性アミノ酸残基に特異的であるプロテアーゼをコードする１以上の遺伝子で更に形質転換されることを特徴とする請求項14 に記載の方法。 21．前記細胞の培養に基づいて前記YAP3遺伝子が過剰発現され、その結果としてのYAP3の過剰産生が前記異種ポリペプチドからのより完全なＸ³−Ｘ⁷の切断を確実にするように、前記プロテアーゼをコードする遺伝子がYAP3をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項20に記載の方法。 22．前記プロテアーゼをコードする遺伝子がＡ．リチカス（A．lyticus）プロテアーゼＩ又はトリプシンであることを特徴とする請求項20に記載の方法。[Procedure of Amendment] Article 184-8 of the Patent Act [Submission date] August 26, 1996 [Correction contents] The scope of the claims 1. The following structure: Signal peptide-leader peptide-X¹-X^Two-X^Three-X^Four-X^Five-X⁶-X⁷− Heterologous protein [Where the heterologous protein is aprotinin, a tissue factor pathway inhibitor or Other protease inhibitors, insulin-like growth factor I or II, if human Bovine growth hormone, interleukin, tissue plasminogen activator , Glucagon, glucagon-like peptide-1, factor VII, factor VIII, factor XIII Platelet-derived growth factor, enzyme, insulin or insulin precursor, and Selected from the group consisting of functional analogs of any of these proteins; X¹Is Lys or Arg; X^TwoIs Lys or Arg, and X¹And X^TwoAre both yeast processing sites Stipulate; X^ThreeIs Glu or Asp, X^FourHas the following structure: (AB)_n (Where A is Glu or Asp, B is Ala, Val, Leu or Pro, and n is 0 or an integer from 1 to 5, and when n ≧ 2, A and B are each other A And B is the same or different) A sequence of amino acids having X^FourHas the following structure: (C)_m (Where C is Glu or Asp, and m is 0 or an integer of 1 to 5) A sequence of amino acids having X^FiveIs a peptide bond or one or more amino acids that can be the same or different; X⁶Is the group consisting of peptide bonds or Pro, Asp, Thr, Ser, Glu, Ala and Gly Amino acid residues selected from; and X⁷Is Lys or Arg) A DNA construct encoding a polypeptide having the formula: Peptide, leader peptide and fusion of heterologous protein or polypeptide Does not encode a polypeptide comprising Providing a processing site that renders the processing site accessible for proteolytic cleavage. Between the C-terminus of the leader peptide and the N-terminus of the heterologous protein. Amino acid sequence adjacent to the yeast processing site The polypeptide has the following structure: Signal peptide-leader peptide-X¹-X^Two-X^Three-X^Four-Heterologous protein (Where X¹Is one or more amino acids that are peptide bonds or may be the same or different Noic acid X^TwoAnd X^ThreeAre the same or different and are selected from the group consisting of Lys and Arg X represents a basic amino acid;^TwoAnd X^ThreeTogether define the yeast processing site, And X^FourRepresents one or more amino acids that are peptide bonds or may be the same or different And Where X¹And / or X^FourIs one or more amino acids, X¹And / or X^FourBy At least one of the amino acids represented is a negative voltage selected from the group consisting of Glu and Asp Is a loaded amino acid) A DNA construct characterized by being a protein having: 2. X^ThreeThe DNA construct according to claim 1, wherein is Glu. 3. 2. The DNA construct according to claim 1, wherein A is Glu. 4. 2. The DNA construct according to claim 1, wherein B is Ala. 5. n is preferably 2 to 4, more preferably 3. 2. The DNA construct according to 1. 6. X^FiveIs a peptide bond, Glu, Asp or Glu-Pro-Lys-Ala. The DNA construct according to claim 1, 7. X⁶Is a Pro or a peptide bond. DNA construct. 8. The signal peptide is α-factor signal peptide, yeast asparagine; Acid protease 3 signal peptide, mouse salivary amylase signal peptide , Carboxypeptidase signal peptide or yeastBAR1Signal pep The DNA construct according to claim 1, which is a tide. 9. The leader peptide is a natural leader such as an α-factor leader peptide 2. The peptide according to claim 1, which is a peptide or a synthetic leader peptide. DNA components listed. Ten. The heterologous protein is insulin or an insulin precursor or a function thereof; DNA construct according to any one of the preceding claims, characterized in that it is a biological analogue . 11． The amino acid sequence X^Three-X⁷But, The DNA construct according to any one of claims 1 to 10, wherein 12． A DNA construct according to claim 11 capable of replicating in yeast. And a recombinant expression vector. 13. A heterologous protein can be expressed and transformed with the vector according to claim 12. Yeast strain. 14. Claim 13: In a medium suitable for obtaining expression and secretion of said heterologous protein. Culturing the yeast cells according to the above, and then isolating the protein from the culture medium And a method for producing a heterologous protein. 15． The amino acid sequence X^Three-X⁷Is proteolytic that is specific for basic amino acids It can be removed from the recovered heterologous protein by a method including a treatment with an enzyme. 15. The method according to claim 14, wherein: 16． The protease is trypsin,Achrobactor litchicus mobacter lyticus) Protease I, enterokinase,Fusarium Oxys Porum (Fusarium oxysporum) Group consisting of trypsin-like protease and YAP3 16. The method according to claim 15, wherein the method is selected from: 17． The amino acid sequence X^Three-X⁷(Where X⁶Is a peptide bond, Ala, or Glu But stressing the yeast cells Release yeast aspartic protease 3 into the medium. The amino acid sequence X^Three-X⁷Is cut off by a method involving cutting 16. The method according to claim 15, wherein the protein is removed from the heterologous protein in the medium. Law. 18． The stress applied to the yeast cells causes the pH of the culture medium to be less than 6.0. Or subjecting the yeast cells to restrictive growth conditions 18. The method of claim 17, comprising starving the yeast cells. . 19. 19. The method of claim 18, wherein the pH of the culture medium is reduced to less than 5. the method of. 20. Genes are expressed based on the culture of the cells, resulting in proteases. Production of more complete X from the heterologous polypeptide^Three-X⁷Ensure the cutting of So that the yeast cell is a protein which is specific for a basic amino acid residue. 15. The method of claim 14, wherein the cell is further transformed with one or more genes encoding zeolites. The method described in. twenty one. The YAP3 gene is overexpressed based on the culture of the cells, Overproduction of all YAP3 results in more complete X from the heterologous polypeptide.^Three-X⁷Cutting the To ensure that the gene encoding said protease encodes YAP3 21. The method of claim 20, wherein the method is a gene. twenty two. The gene encoding the protease isA. Reticus (A. lyticus)Professional 21. The method according to claim 20, wherein the method is thease I or trypsin.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ケルドセン，トーマスベルグハムデンマーク国，デーコー−2830 ビルム, ケバエドバイ 73──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Agency reference number FI (C12P 21/02 C12R 1: 865) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES) , FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD) , TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AM, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CZ, EE, FI, GE, HU, IS, JP, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG, SI, SK, TJ, TM, TT, UA, G, UZ, VN (72) inventor Kerudosen Thomas Beruguhamu Denmark, Deko -2830 Bilm, Kebaedobai 73

Claims

[Claims] 1. The following structure: Signal peptide-leader peptide-X¹-X^Two-X^Three-X^Four-X^Five-X⁶-X⁷− Heterologous protein [Where X¹Is Lys or Arg; X^TwoIs Lys or Arg, and X¹And X^TwoTogether define the yeast processing site; X^ThreeIs Glu or Asp, X^FourHas the following structure: (AB)_n (Where A is Glu or Asp, B is Ala, Val, Leu or Pro, and n is 0 or an integer from 1 to 5, and when n ≧ 2, A and B are each other A And B is the same or different) A sequence of amino acids having X^FourHas the following structure: (C)_m (Where C is Glu or Asp, and m is 0 or an integer of 1 to 5) A sequence of amino acids having X^FiveIs a peptide bond or one or more amino acids that can be the same or different; X⁶Is the group consisting of peptide bonds or Pro, Asp, Thr, Ser, Glu, Ala and Gly Amino acid residues selected from; and X⁷Is Lys or Arg) A DNA construct encoding a polypeptide having the formula: 2. X^ThreeThe DNA construct according to claim 1, wherein is Glu. 3. 2. The DNA construct according to claim 1, wherein A is Glu. 4. 2. The DNA construct according to claim 1, wherein B is Ala. 5. n is preferably 2 to 4, more preferably 3. 2. The DNA construct according to 1. 6. X^FiveIs a peptide bond, Glu, Asp or Glu-Pro-Lys-Ala. The DNA construct according to claim 1, 7. X⁶Is a Pro or a peptide bond. DNA construct. 8. The signal peptide is α-factor signal peptide, yeast asparagine; Acid protease 3 signal peptide, mouse salivary amylase signal peptide , Carboxypeptidase signal peptide or yeastBAR1Signal pep The DNA construct according to claim 1, which is a tide. 9. The leader peptide is a natural leader such as an α-factor leader peptide 2. The peptide according to claim 1, which is a peptide or a synthetic leader peptide. DNA components listed. Ten. The heterologous protein is aprotinin, a tissue factor pathway inhibitor or other Protease inhibitors, insulin-like growth factor I or II, human or Is bovine growth hormone, interleukin, tissue plasminogen activator -, Glucagon, glucagon-like peptide-1, factor VII, factor VIII, factor XIII, Platelet-derived growth factor, enzyme, insulin or insulin precursor, and the same Selected from the group consisting of functional analogs of any of these proteins The DNA construct according to claim 1, characterized in that: 11． The heterologous protein is insulin or an insulin precursor or a function thereof; 11. The DNA construct according to claim 10, which is a biological analog. 12． The amino acid sequence X^Three-X⁷But, The DNA construct according to any one of claims 1 to 11, wherein 13. 13.The DNA construct of claim 12, which is capable of replicating in yeast. And a recombinant expression vector. 14. A heterologous protein can be expressed and transformed with the vector according to claim 13. Yeast strain. 15． Claim 14: In a suitable medium for obtaining expression and secretion of said heterologous protein. Culturing the yeast cells according to the above, and then isolating the protein from the culture medium And a method for producing a heterologous protein. 16． The amino acid sequence X^Three-X⁷Is proteolytic that is specific for basic amino acids It can be removed from the recovered heterologous protein by a method including a treatment with an enzyme. The method according to claim 15, wherein: . 17． The protease is trypsin,Achrobactor litchicus mobacter lyticus) Protease I, enterokinase,Fusarium Oxys Porum (Fusarium oxysporum) Group consisting of trypsin-like protease and YAP3 17. The method according to claim 16, wherein the method is selected from: 18． The amino acid sequence X^Three-X⁷(Where X⁶Is a peptide bond, Ala, or Glu Stresses the yeast cells and gives them yeast yeast. Sparate protease 3 is released into the medium, whereby the amino acid Array X^Three-X⁷The heterologous protein in the medium by a method comprising cleaving 17. The method according to claim 16, wherein the method is removed. 19. The stress applied to the yeast cells causes the pH of the culture medium to be less than 6.0. Or subjecting the yeast cells to restrictive growth conditions 19. The method of claim 18, comprising starving the yeast cells. . 20. 20. The method of claim 19, wherein the pH of the culture medium is reduced to less than 5. the method of. twenty one. Genes are expressed based on the culture of the cells, resulting in proteases. Production of more complete X from the heterologous polypeptide^Three-X⁷Ensure the cutting of So that the yeast cell is a protein which is specific for a basic amino acid residue. 16. The method of claim 15, further comprising transforming one or more genes encoding the enzyme. The method described in. twenty two. The YAP3 gene is overexpressed based on the culture of the cells, Overproduction of all YAP3 results in more complete X from the heterologous polypeptide.^Three-X⁷Cutting the To ensure that the protease The gene encoding YAP3 is a gene encoding YAP3. The method described in. twenty three. The gene encoding the protease isA. Reticus (A. lyticus)Professional 22. The method according to claim 21, wherein the method is thease I or trypsin.