CZ20015A3

CZ20015A3 - Recombinant exprimed yeast vector, process for obtaining thereof and transformed yeast cell

Info

Publication number: CZ20015A3
Application number: CZ20015A
Authority: CZ
Inventors: Thomas Kjeldsen; Knud Vad
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 1999-07-02
Publication date: 2001-05-16

Abstract

Řešení se týká způsobu pro expresi heterologních proteinů nebo polypeptidů v kvasinkách z kultury transformovaného kvasinkového kmene, který neobsahuje funkční antibiotický rezistentní značkový gen.The present invention relates to a method for expressing heterologous proteins or polypeptides in yeast from a transformed culture a yeast strain that does not contain functional antibiotic resistant marker gene.

Description

OBLAST TECHNIKYTECHNICAL FIELD

Přítomný vynález se týká exprese proteinů v transformovaných kvasinkových buňkách, DNA konstruktu a vektorů pro použití takovým způsobem a kvasinkových buněk transformovaných s vektory.The present invention relates to the expression of proteins in transformed yeast cells, a DNA construct and vectors for use in such a manner, and yeast cells transformed with vectors.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKYBACKGROUND OF THE INVENTION

Je známé použití transformovaných kvasinkových buněk pro expresi proteinů viz například Evropské patentové přihlášky 0 088 632A, 0 116 201A θ 123 294A, 0 123 544A, 0 163 529A,The use of transformed yeast cells for the expression of proteins is known, see for example European Patent Applications 0 088 632A, 0 116 201A 123 294A, 0 123 544A, 0 163 529A,

123 289A, 0 100 561A, 0 189 998A a 0195 986A, PCT patenty WO 95/01 421, 95/02 059 a WO 90/10 075 a US patent č. 4 546 082.123 289A, 0 100 561A, 0 189 998A and 0195 986A, PCT patents WO 95/01 421, 95/02 059 and WO 90/10 075 and US Patent No. 4,546,082.

Obecným charakteristickým rysem výše uvedených způsobů je, že připravený kvasinkový plasmid obsahuje gen pro antibiotický značkovač. Takový značkový gen je vytvořen během počátečních kroků klonování E. coli, kde byl použit pro prověření transformovaných buněk nebo pro udržení plasmidů užívaných jako vektory. Antibiotické značkové geny prý nemají žádný nežádoucí dopad na kulturu transformovaných kvasinkových buněk, a proto je běžnou praxí, nepoužívat žádné kroky vedoucí k deleči takové DNA. Navíc charakterizace plasmidového konstruktu je obyčejně provedena izolací plasmidů z transformovaných kvasinkových buněk a transformace izolovaného plasmidů do E. coli sledovaná antibiotickou selekcí. Pro praktické účely je vhodné udržení antibiotické rezistence značkového genu.A general feature of the above methods is that the prepared yeast plasmid contains an antibiotic marker gene. Such a marker gene is generated during the initial E. coli cloning steps where it was used to screen transformed cells or to maintain plasmids used as vectors. Antibiotic marker genes are said to have no adverse effect on the culture of transformed yeast cells, and it is common practice not to use any steps leading to the deletion of such DNA. In addition, characterization of the plasmid construct is usually accomplished by isolating plasmids from transformed yeast cells and transforming the isolated plasmids into E. coli by antibiotic selection. For practical purposes, it is appropriate to maintain antibiotic resistance of the brand gene.

Ačkoliv jak výzkumné laboratoře tak i průmyslová výroba rostlin jsou řízeny velmi přísnými bezpečnostními pravidly, je zde vždy malé riziko, že několik buněk bude náhodou uvolněno do prostředí. Jejich vysoce rafinovaná vlastnost způsobuje, že takové geneticky modifikované mikroorganismy přežijí pouze velmi krátké období a riziko poškození prostředí je extrémně nízké. Toto je samozřejmě důvod, proč takové transformované mikroorganismy jsou schváleny pro použití jak ve výzkumu tak i v celé řadě dalších činností.Although both research laboratories and industrial plant production are governed by very strict safety rules, there is always a small risk that several cells will accidentally be released into the environment. Their highly refined property causes such genetically modified micro-organisms to survive only for a very short period and the risk of environmental damage is extremely low. Of course, this is why such transformed microorganisms are approved for use in both research and a wide range of other activities.

Pokud dokonce buňky umírají rychle, plasmidy obsahující rezistentní gen mají stále náhodně sklon být uvolňovány do prostředí, a je zde tedy teoretické riziko zavedení rezistence k antibiotikům v bakteriích, jestliže je plasmid ponechán samovolně.Even if cells die rapidly, plasmids containing a resistant gene still have a random tendency to be released into the environment, and there is therefore a theoretical risk of introducing antibiotic resistance in bacteria if the plasmid is left spontaneously.

• · • · ······ ···• · • · ·········

2*·· ·· ·· ···· ·· ···2 * ·· ·· ·· ···· ·· ···

Antibiotika jsou vysoce důležitá při léčbě lidských a zvířecích bakteriálních infekcí. Jakékoliv riziko možné kontaminace prostředí s genem, který uděluje rezistenci vůči antibiotikům by měl být omezen na minimum, pokud je to možné.Antibiotics are highly important in the treatment of human and animal bacterial infections. Any risk of possible contamination of the environment with a gene conferring resistance to antibiotics should be minimized, if possible.

Je zde proto potřeba vyvinout více bezpečné způsoby než ty, které jsou používané dosud, to je účel přítomného vynálezu, poskytnout takové zlepšené způsoby.There is therefore a need to develop more safe methods than those used hitherto, that is the purpose of the present invention, to provide such improved methods.

PODSTATA VYNÁLEZUSUMMARY OF THE INVENTION

Přítomný vynález se týká způsobu exprese heterologních proteinů nebo polypeptidů v kvasinkách, kde kvasinkový transformovaný kmen používaný pro výrobu obsahuje exprimováných vektor, ve kterém antibiotický značkový gen, používaný v počátečních krocích klonování, je nefunkční modifikací in vitro před transformací do kvasničného hostitele. Přítomný vynález se také týká DNA sekvencí a exprimovaných vektorů pro použití takovým způsobem a transformovaných kvasinkových buněk.The present invention relates to a method for expressing heterologous proteins or polypeptides in yeast, wherein the yeast transformed strain used for production comprises an expressed vector, wherein the antibiotic marker gene used in the initial cloning steps is a non-functional modification in vitro prior to transformation into a yeast host. The present invention also relates to DNA sequences and expressed vectors for use in such a manner and transformed yeast cells.

Podle jednoho hlediska se přítomný vynález týká rekombinantního kvasinkového exprimovaného vektoru, který není schopný udělit antibiotickou rezistenci vůči bakteriálním buňkám a obsahujícího genové kódování pro heterologní gen a antibiotický značkový gen, který je nefunkční po in vitro modifikaci.In one aspect, the present invention relates to a recombinant yeast expression vector which is not capable of conferring antibiotic resistance to bacterial cells and comprising gene encoding for a heterologous gene and an antibiotic marker gene that is non-functional after in vitro modification.

Podle dalšího hlediska se přítomný vynález týká způsobu pro získání požadovaného polypeptidů Či proteinu, uvedený způsob obsahuje kulturu kvasinkového kmene obsahující vektor, který není schopný udělit antibiotickou rezistenci k bakteriálním buňkám a obsahujícího genetické kódování pro heterologní gen a antibiotický značkový gen, který je nefunkční po in vitro modifikaci před transformací do kvasinkového hostitele, a izolaci požadovaného produktu z kulturního média.In another aspect, the present invention relates to a method for obtaining a desired polypeptide or protein, said method comprising a yeast strain culture comprising a vector which is not capable of conferring antibiotic resistance to bacterial cells and comprising genetic coding for a heterologous gene and an antibiotic marker gene in vitro modification prior to transformation into a yeast host, and isolating the desired product from the culture medium.

Způsob podle vynálezu bude příznačně obsahovat kulturu kvasinkového kmene obsahujícího kvasinkový exprimovaný plasmid, ve kterém funkční antibiotický značkový gen používaný v počátečních krocích klonování v bakteriích se stává nefunkční po in vitro deleci části značkového genu nebo celého značkového genu před vložením do kvasinkového hostitele, který je použit pro expresi a sekreci požadovaného polypeptidů nebo proteinu.The method of the invention will typically comprise a culture of a yeast strain containing a yeast expressed plasmid in which a functional antibiotic marker gene used in the initial bacterial cloning steps becomes non-functional after in vitro deletion of part or all of the marker gene prior to insertion into the yeast host being used. for the expression and secretion of the desired polypeptide or protein.

Delece antibiotického značkového genu je výhodně uskutečněna vložením vhodných restrikčních štěpících míst na každou stranu antibiotického. rezistentního značkového genu, načež značkový gen je odstraněn in vitro přídavkem vhodného restrikčního enzymu.The deletion of the antibiotic marker gene is preferably accomplished by inserting suitable restriction cleavage sites on each side of the antibiotic. resistant marker gene, after which the marker gene is removed in vitro by addition of a suitable restriction enzyme.

Přítomný vynález se také týká transformovaných kvasinkových kmenů obsahujících vektor, který není schopný udělit antibiotickou rezistenci k bakteriálním buňkám a obsahujícího ·· ·· ·· ·· ·· · ···· ···· ···· ··· ·· · · · ·The present invention also relates to transformed yeast strains comprising a vector that is not capable of conferring antibiotic resistance to bacterial cells and comprising: · · · ·

2f··· ·· ·· ···· ·· ··· genetické kódování pro heterologní gen a antibiotický značkový gen, který je nefunkční po in vitro modifikaci před transformací do kvasinkového hostitele.2f Genetic coding for heterologous gene and antibiotic marker gene, which is non-functional after in vitro modification before transformation into yeast host.

Kvasinkovým kmenem je s výhodou kmen Saccharomyces a zvláště kmen Saccharomyces cerevisiae.The yeast strain is preferably a Saccharomyces strain and in particular a Saccharomyces cerevisiae strain.

Zde používaný výraz „antibiotický značkový gen“ či „ antibiotický rezistentní značkový gen“ znamená gen, který poskytuje fenotypový výběr transformovaných bakteriálních buněk a amplifikace plasmidu.As used herein, the term "antibiotic marker gene" or "antibiotic resistant marker gene" means a gene that provides phenotypic selection of transformed bacterial cells and plasmid amplification.

Nejběžněji používané antibiotické rezistentní značkové geny v E. coli jsou ampicilin (AMP), chloramfenikol, neomycin, kanamycin a tetracyklinové rezistentní značkové geny.The most commonly used antibiotic resistant marker genes in E. coli are ampicillin (AMP), chloramphenicol, neomycin, kanamycin, and tetracycline resistant marker genes.

Zde užívaný výraz „nefunkční značkový gen“ znamená, že značkový gen buď chybí nebo je nefunkční, což je způsobeno odstraněním části genu. Výhodnější je, pokud gen chybí úplně.As used herein, the term "nonfunctional marker gene" means that the marker gene is either missing or inoperable, which is due to the removal of part of the gene. More preferably, the gene is missing completely.

Zde užívaný výraz „ in vitro modifikace“ znamená modifikační kroky prováděné na vektoru vně buněčného prostředí.As used herein, "in vitro modification" means modification steps performed on a vector outside the cellular environment.

Zde užívaný výraz „neschopný udělit antibiotickou rezistenci vůči bakteriálním buňkám“ znamená, že antibiotické rezistentní geny jsou nefunkční v jakémkoliv organismu, což je způsobeno popsaným genetickým zacházením.As used herein, "incapable of conferring antibiotic resistance to bacterial cells" means that antibiotic resistant genes are non-functional in any organism, as a result of the described genetic treatment.

Zde užívaný výraz „ kvasinkový hostitel“ znamená kvasinkový organismus transformovaný nebo transfikovaný exprimovaným plasmidem či vektorem.As used herein, the term "yeast host" means a yeast organism transformed or transfected with an expressed plasmid or vector.

Přítomný vynález je dále vysvětlen s odkazy na dodatečné výkresy kde:The present invention is further explained with reference to additional drawings wherein:

obr.l ukazuje exprimovaný plasmid pAK729, který obsahuje gen exprimující insulinový prekursor řízenou expresí TPI promotorové a TPI terminátorové sekvence z S. cerevisiae a signální vedoucí sekvenci obsahující YAP3 signální peptid a syntetický vedoucí peptid LA19. Konstrukce pAK729 je popsána v WO 97/22706. Plasmid také obsahuje AMP-R sekvenci pBR322/pUC13 zahrnující ampicilínový rezistentní gen a počátek DNA replikace v co//.; obr. 2 ukazuje plasmidovou mapu pAK729,5 plasmidu používaného pro vytvoření kmene NN729,5, u kterého chybí AMP gen před delecí AMP genu;Figure 1 shows the expressed plasmid pAK729, which contains a gene expressing the insulin precursor under the control of the expression of the TPI promoter and TPI terminator sequences from S. cerevisiae and a signal leader sequence comprising a YAP3 signal peptide and a synthetic leader LA19. The construction of pAK729 is described in WO 97/22706. The plasmid also contains the AMP-R sequence of pBR322 / pUC13 comprising an ampicillin resistant gene and an origin of DNA replication at the co //; Fig. 2 shows a plasmid map of pAK729.5 of the plasmid used to generate the NN729.5 strain lacking the AMP gene prior to deletion of the AMP gene;

obr.3 ukazuje plasmidovou mapu pAK729,6 plasmidu používaného pro vytvoření kmene NN729,6, u kterého chybí AMP gen před delecí AMP genu;Fig. 3 shows a plasmid map of pAK729.6 of the plasmid used to generate the NN729.6 strain lacking the AMP gene prior to deletion of the AMP gene;

obr.4 ukazuje plasmidovou mapu pAK729,6-AAMP plasmidu, ve kterém AMP gen chybí; obr. 5 ukazuje plasmidovou mapu pAK729,7 plasmidu používaného pro vytvoření kmene NN729,7, u kterého chybí AMP gen před delecí AMP genu a obr.6 ukazuje plasmidovou mapu plasmidu pKV228 modifikovaného nahrazením EcoRI (9400-Xbal (1403) kódovací sekvence v pAK729 (obr.l) kódovací sekvencí MF„* Arg³⁴GLP-l₍7.37).Fig. 4 shows a plasmid map of pAK729,6-AAMP plasmid in which the AMP gene is missing; Fig. 5 shows a plasmid map of pAK729.7 of a plasmid used to generate the NN729.7 strain lacking the AMP gene before deletion of the AMP gene; (FIG. 1) the coding sequence MF * Arg ³⁴ GLP-1 ₍ 7.37).

Delece in vitro antibiotického značkového genu je uskutečněna buď použitím přístupných restrikčních míst nebo zavedením vhodných restrikčních míst použitím PCR, místní specifickou mutagenezí nebo jinými dobře známými metodami pro zacházení s DNA sekvencemi sledované přidáním vhodných restrikčních enzymů.In vitro deletion of the antibiotic marker gene is accomplished either by using accessible restriction sites or by introducing appropriate restriction sites using PCR, site-specific mutagenesis, or other well-known methods for manipulating DNA sequences monitored by the addition of appropriate restriction enzymes.

Čtyři modifikované kmeny NN729 byly vytvořeny pro vyhodnocení, zda různé delece v plasmidu ovlivňují výtěžek fermentace insulinového prekursoru nebo kmenové stability během dlouhodobé fermentace (tab.l). Tyto kmeny byly porovnány s původním kmenem NN729 vzhledem k výtěžku fermentace a fermentační stabilitě (tab.2). Navíc tři modifikované kvasinkové kmeny produkující GLP-1 variantu Arg³⁴GLP-1(7-37) vytvořeny pro vyhodnocení, zda různé delece v plasmidu pKV228 obsahujícího AMP gen by mohly ovlivňovat výtěžek fermentace Arg³⁴GLP-l₍7-37) (tab.3).Four modified strains of NN729 were created to evaluate whether different deletions in the plasmid affect the yield of insulin precursor fermentation or stem stability during long-term fermentation (Table 1). These strains were compared to the original strain NN729 with respect to fermentation yield and fermentation stability (Table 2). In addition, three modified yeast strains producing the GLP-1 variant of Arg ³⁴ GLP-1 (7-37) generated to evaluate whether different deletions in the pKV228 plasmid containing the AMP gene could affect the yield of Arg ³⁴ GLP-1 ₍ 7-37) fermentation (tab. .3).

Plasmidy a kmeny, kde AMP gen a snad okolní sekvence chybí, jsou všechny označeny ,A AMP“.Plasmids and strains where the AMP gene and perhaps the surrounding sequence are missing are all labeled "A AMP".

Modifikované kvasinkové kmeny byly připraveny transformací modifikovaných plasmidů pAK729 nebo pKV228, ve kterých AMP značkový gen a další možné DNA sekvence z původního plasmidu chyběly, do kmenů S. cerevisiae MT663 (E2-7B XE11-36 a/a, AtpiAtpi,pep 4-3/pep 4-3/pep 4-3) nebo ME1719 (MATa/aAyap3..ura3/Ayap3..URA3pep4-3/pep4-3Atpi..LEU2/Átpi..LEU2 eu2/eu2 Áura3/Áura3).Modified yeast strains were prepared by transforming the modified plasmids pAK729 or pKV228, in which the AMP tag gene and other possible DNA sequences from the original plasmid were absent, into S. cerevisiae MT663 strains (E2-7B XE11-36 and / or, AtpiAtpi, pep 4-3 (pep 4-3 / pep 4-3) or ME1719 (MATa / aAyap3..ura3 / Ayap3..URA3pep4-3 / pep4-3Atpi..LEU2 / Atpi..LEU2 eu2 / eu2 Aura3 / Aura3).

Modifikované plasmidy byly připraveny použitím vhodných restrikčních enzymových míst již přítomných v plasmidu nebo vložením vhodných restrikčních enzymových míst takovým způsobem, že AMP gen může chybět. S modifikovanými plasmidy může být zacházeno in vitro před transformací do S cerevisiae (kmen MT663) takovým způsobem, že AMP gen chybí nebo je nefunkční a následně výslednému kvasinkovému kmenu gen AMP vypadne. Toto možné riziko pro kontaminaci prostředí s AMP genem během použití kvasinkových buněk, je odstraněno. Modifikované plasmidy pAK729 nebo pKV228 jsou štěpeny vhodnými restrikčními enzymy, podrobeny elektroforéze na agaróze, izolovány, znovu ligovány a následně transformovány do příslušných MT663 a ME1719 buněk S. cerevisiae WO 98/01 535.Modified plasmids were prepared by using appropriate restriction enzyme sites already present in the plasmid or by inserting appropriate restriction enzyme sites in such a way that the AMP gene may be absent. Modified plasmids may be treated in vitro prior to transformation into S cerevisiae (strain MT663) in such a way that the AMP gene is absent or non-functional and subsequently the resulting yeast strain AMP gene is lost. This potential risk for contamination of the AMP gene environment during the use of yeast cells is eliminated. The modified plasmids pAK729 or pKV228 are digested with appropriate restriction enzymes, subjected to agarose electrophoresis, isolated, re-ligated and subsequently transformed into the respective MT663 and ME1719 cells of S. cerevisiae WO 98/01 535.

Protein nebo polypeptid produkovaný způsobem tohoto vynálezu, je kterékoliv heterologní protein nebo polypeptid, který je výhodně tvořen v kvasinkové buňee. Příklady takových proteinů jsou aprotinin, faktor tkáňového inhibitoru nebo další proteázové inhibitory, insulin, insulinový prekursor nebo analoga insulinu, insulin jako růstový faktor I a II, lidský nebo hovězí hormon, interleukin, tkáňový plasminogenový aktivátor, transformační růstový faktor a nebo b, glukagon, glukagon jako peptid 1 (GLP-1), glukagon jako peptid (GLP-2), GRPP, faktor VII, faktor VIII, faktor XIII, růstový faktor krevních destiček a enzymy jako jsou lipázy.The protein or polypeptide produced by the method of the invention is any heterologous protein or polypeptide that is preferably produced in a yeast cell. Examples of such proteins are aprotinin, tissue inhibitor factor or other protease inhibitors, insulin, insulin precursor or insulin analogs, insulin such as growth factor I and II, human or bovine hormone, interleukin, tissue plasminogen activator, transforming growth factor a or b, glucagon, glucagon as peptide 1 (GLP-1), glucagon as peptide (GLP-2), GRPP, factor VII, factor VIII, factor XIII, platelet growth factor and enzymes such as lipases.

·· 4· • · · • · · · • · · · • · · · · $ ···· ·· »_# „Prekursorem insulinu“ nebo „analog insulinu“ je myšlen jeden polypeptidový řetězec obsahující proinsulin, který je jedním nebo více následnými chemickými a/nebo enzymovými způsoby přeměněn na dvouřetězcovou molekulu insulinu či insulinového analogu majícího správné rozložení třech disulfidových můstků, jak bylo zjištěno v přirozeném lidském insulinu. Insulinové prekursory budou příznačně obsahovat modifikovaný C-peptid nesoucí A a B řetězce insulinu. Navíc s výhodou insulinovému prekursoru chybí B(30) aminokyselinový zbytek. Nejvýhodněji insulinové prekursory jsou ty, které jsou popsány v EP 163 529 a PCT přihláškách 95/00 550 a 95/07 931. Příklady insulinů; jsou lidský insulin, s výhodou des (B30) lidský insulin a prasečí insulin. Výhodné insulinové analogy jsou takové, kde jeden nebo více přirozených aminokyselinových zbytků, s výhodou jeden, dva nebo tři byly nahrazeny jinými kódovatelnými aminokyselinovými zbytky. Tedy v pozici A 21 je u mateřského insulinu místo Asn aminokyselinový zbytek vybraný ze skupiny obsahující Ala, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr nebo Val, zvláště aminokyselinový zbytek obsahující Gly, Ala, Ser nebo Thr. Rovněž v pozici B 28 je u mateřského insulinu místo pro aminokyselinový zbytek vybraný ze skupiny obsahující Asp, Lys atd. a v pozici B 29 je u mateřského insulinu místo Lys aminokyselina Pro. _# "Insulin precursor" or "insulin analog" is one proinsulin-containing polypeptide chain that is one or more of the term "insulin precursor" or "insulin analog". by several subsequent chemical and / or enzymatic methods transformed into a double-chain molecule of insulin or an insulin analog having the correct distribution of the three disulfide bridges as found in natural human insulin. Insulin precursors will typically comprise a modified C-peptide bearing the A and B chains of insulin. In addition, preferably the insulin precursor lacks a B (30) amino acid residue. Most preferably, insulin precursors are those described in EP 163 529 and PCT applications 95/00 550 and 95/07 931. Examples of insulins; are human insulin, preferably des (B30) human insulin and porcine insulin. Preferred insulin analogs are those wherein one or more natural amino acid residues, preferably one, two or three, have been replaced by other encodable amino acid residues. Thus, at position A 21, in the parent insulin, the Asn site is an amino acid residue selected from the group consisting of Ala, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val, particularly an amino acid residue containing Gly, Ala , Ser or Thr. Also, at position B 28 for the parent insulin the site for an amino acid residue is selected from the group consisting of Asp, Lys, etc., and at position B 29 for the parent insulin the site is the amino acid Pro.

Výraz „kódovatelný aminokyselinový zbytek“ zde použitý označuje aminokyselinový zbytek, který může být kódován genetickým kódem tj. triplet (kodón) nukleotidů.As used herein, the term "encodable amino acid residue" refers to an amino acid residue that can be encoded by a genetic code, ie, a triplet (codon) of nucleotides.

Používané DNA konstrukty jsou připraveny synteticky stanovené standardními způsoby tj. např. fosfoamidovým způsobem popsaným S. L. Beaucagem a Μ. H. Caruthersem, v Tetrahedron Letters 22, 1981, 1895 až 18966 nebo způsobem popsaným Matthesem a kol. vEMBO J. 3, 1984, 801 až 805. Podle fosfoamidového způsobu jsou oligonukleotidy syntetizovány např. v automatickém DNA syntetizátoru, purifikovány, zdvojnásobeny a ligovány do formy syntetického DNA konstruktu. Běžně výhodným způsobem přípravy DNA konstruktu je polymerásová řetězcová reakce (PCR) např. jak je popsána Sambrookem a kol. v Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY 1989.The DNA constructs used are prepared synthetically by standard methods, e.g., the phosphoamide method described by S. L. Beaucag et al. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, 1895-18966 or the method described by Matthes et al. vEMBO J. 3, 1984, 801-805. According to the phosphoamide method, oligonucleotides are synthesized, e.g., in an automated DNA synthesizer, purified, doubled, and ligated to form a synthetic DNA construct. A commonly preferred method of preparing a DNA construct is by polymerase chain reaction (PCR), e.g., as described by Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY 1989.

DNA kód pro požadovaný protein je také genomického nebo cDNA původu např. získaný přípravou genomické nebo cDNA knihovny a prověřením DNA sekvencí kódujících celé polypeptidy nebo část těchto polypeptidů nebo. vynález hybridizací používající syntetické oligonukleotidové sondy podle standardních metod (Sambrook a kol., Molecular Cloning:The DNA code for the protein of interest is also of genomic or cDNA origin, e.g., obtained by preparing a genomic or cDNA library and screening the DNA sequences encoding all or a portion of the polypeptides or. the invention by hybridization using synthetic oligonucleotide probes according to standard methods (Sambrook et al., Molecular Cloning:

A Laboratory, Manual, Cold Spring Harbor, 1989).A Laboratory, Manual, Cold Spring Harbor, 1989).

Konečně DNA kódující požadovaný protein je směs syntetická a genomická, syntetická a cDNA nebo směs genomická a cDNA původu připravená připojováním fragmentů syntetických, • ·Finally, the DNA encoding the protein of interest is a mixture of synthetic and genomic, synthetic and cDNA or a mixture of genomic and cDNA of origin prepared by the attachment of synthetic fragments.

·· ·· ·· • · · · · • · · · · · ······ ·· • · · · · · ···· ·· ·· · ··· genomických nebo cDNA původu do kruhu (jak je výhodné), fragmenty odpovídající různým částem úplného DNA konstruktu podle standardních metod.· Genomic or cDNA origin in the ring (·) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · as preferred), fragments corresponding to different portions of the complete DNA construct according to standard methods.

Rekombinantní exprimovaný vektor je autonomně replikovatelný vektor tj. vektor, který existuje jako extrachromosomální jednotka jehož replikace je nezávislou chromosomální replikací tj. plasmid, extrachromosomální prvek, minichromosom nebo umělý chromosom. Vektor obsahuje kterýkoliv prostředky pro zajištění vlastní replikace. Jinak vektor je ten, který po zavedení do hostitelské buňky, je součástí genomu a je replikovatelný společně s chromosomy, jejíchž je součástí. Vektorový systém je samotný vektor nebo plasmid nebo dva či více vektorů nebo plasmidů, kteří společně obsahují celkovou DNA zabudovanou do genomu hostitelské buňky nebo transpozonu.The recombinant expressed vector is an autonomously replicable vector, i.e. a vector, which exists as an extrachromosomal unit whose replication is an independent chromosomal replication, i.e. a plasmid, extrachromosomal element, minichromosome, or artificial chromosome. The vector comprises any means for self-replication. Otherwise, the vector is one which, when introduced into a host cell, is part of the genome and is replicable together with the chromosomes of which it is part. The vector system is a vector or plasmid itself, or two or more vectors or plasmids that together comprise total DNA incorporated into the genome of the host cell or transposon.

Rekombinantní exprimovaný vektor bude obsahovat DNA sekvence kódující požadovaný protein nebo polypeptid spojený s vhodnou promotorovou sekvencí. Promotor je kterákoliv DNA sekvence, která vykazuje transkripční aktivitu v kvasinkách a je odvozeny z genů kódujících v kvasinkách proteiny buď homologní nebo heterologní. Promotor je s výhodou odvozen z genu kódujícího v kvasinkách homologní protein. Příklady vhodných promotorů jsou Saccharomyces cerevisiae Μαΐ, TPI, ADH nebo PGK promotory.The recombinant expression vector will contain DNA sequences encoding the desired protein or polypeptide linked to a suitable promoter sequence. A promoter is any DNA sequence that exhibits transcriptional activity in yeast and is derived from genes encoding yeast proteins either homologous or heterologous. The promoter is preferably derived from a gene encoding a yeast homologous protein. Examples of suitable promoters are Saccharomyces cerevisiae Μαΐ, TPI, ADH or PGK promoters.

Sekvence DNA kódující požadovaný protein nebo polypeptid je také připojena k vhodnému terminátoru tj. TPI terminátor (T. Alber a G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, 419 až 434).The DNA sequence encoding the protein or polypeptide of interest is also linked to a suitable terminator, i.e., a TPI terminator (T. Alber and G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, 419-434).

Rekombinantní exprimovaný vektor tohoto vynálezu bude také obsahovat DNA sekvenci umožňující replikaci vektoru v kvasinkách. Příklady takových sekvencí jsou kvasinkový plasmidový 2 μ replikační geny REP 1 až 3 a počátek replikace. Vektor může také obsahovat selektivní značkovač tj. Schižosaccharomycespompě TPI gen popsaný P. R. Russelem, Gene 40, 1985, 125 až 130.The recombinant expression vector of the invention will also contain a DNA sequence allowing the vector to replicate in yeast. Examples of such sequences are the yeast plasmid 2 μ replication genes REP 1-3 and the origin of replication. The vector may also contain a selective marker, i.e., Schizosaccharomyces, for the TPI gene described by P. R. Russel, Gene 40, 1985, 125-130.

Konečně exprimovaný vektor bude s výhodou obsahovat signální/vedoucí sekvenci k zabezpečení sekrece požadovaného proteinu nebo polypeptidů v kulturním mediu. Signální sekvence je DNA sekvence, která kóduje polypeptid („ sekreční peptid“), který jako součást většího polypeptidů, jemuž udává směr při jeho sekreci buňkou, ve které je syntetizován. Větší polypeptid je běžně štěpen, čímž dochází k odstranění sekrečního peptidu během průchodu sekreční cestou.Finally, the expressed vector will preferably contain a signal / leader sequence to ensure secretion of the desired protein or polypeptide in the culture medium. A signal sequence is a DNA sequence that encodes a polypeptide (a "secretory peptide") that, as part of a larger polypeptide, provides a direction in its secretion by the cell in which it is synthesized. The larger polypeptide is commonly cleaved to remove the secretory peptide during the secretory pathway.

Signální sekreční sekvence kóduje kterýkoliv signální peptid, který zajišťuje vhodný směr přenášeného polypeptidů během sekrece buňkou. Signální peptid je přirozeně se vyskytující signální peptid nebo jeho funkční část nebo je peptidem syntetickým. Používané signální peptidy pró kvasinkové hostitelské buňky jsou ziškáriy z genů pro S. cerevisiae a-faktor a invertáza ze • · ··· ·· ···· ···’········ ······ ··· «· ·· ·<*·· «· ··«The signal secretion sequence encodes any signal peptide that provides an appropriate direction of the transferred polypeptide during secretion by the cell. The signal peptide is a naturally occurring signal peptide, or a functional portion thereof, or is a synthetic peptide. The signal peptides used for the yeast host cells are scissors from S. cerevisiae α-factor and invertase genes from · · ··· ·· ····················· ··· «· ·· · <* ··

S. cerevisiae, signální peptid myší slinné amylázy (O. Hagenbuchle a kok, Nátuře 289, 1981, 643 až 646), modifikovaná karboxypeptidázový signální peptid (L. A. Valis a kol., Cell 48, 1987, 887 až 897), kvasinkový signální peptid BAR 1 (WO 87/02 670) nebo kvasinkový signální peptid aspartátová proteáza 3 (YAP 3) (M. Egel-Mitani a kol., Yeast 6, 1990, 127 až 137).S. cerevisiae, mouse salivary amylase signal peptide (O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, 643-646), modified carboxypeptidase signal peptide (LA Valis et al., Cell 48, 1987, 887-897), yeast signal peptide BAR 1 (WO 87/02 670) or the yeast signal peptide aspartic protease 3 (YAP 3) (M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, 127-137).

Pro vhodnou sekreci v kvasinkách, sekvence kódující vedoucí peptid je také vložena ve stejném směru se signální sekvencí a proti směru DNA sekvence kódující polypeptid. Funkcí vedoucího peptidu je umožnění exprese polypeptidu přímo z endoplazmatického retikula do Golgiho aparátu a dále do sekrečních váčků pro sekreci do kulturního média (tj. přesun polypeptidu přes buněčnou stěnu nebo alespoň přes buněčnou membránu do periplazmatického prostoru v kvasinkových buňkách). Vedoucí peptid znamená kvasinkový vedoucí faktor (jeho použití je popsáno v US 4 546 082, EP 16 201, EP 123 296, EP 123 544 EP 163 529). Další možností je, že vedoucí peptid znamená syntetický vedoucí peptid, který je vedoucím peptidem, jež nebyl nalezen v přírodě. Syntetické vedoucí peptidy jsou vytvořeny tak, jak je popsáno v WO 89/02 463 nebo WO 92/11 378 a Kjeldsanem a kol., v Protein Expression and Purifícation 9, 1997, 331 až 336.For appropriate secretion in yeast, the leader peptide coding sequence is also inserted in the same direction with the signal sequence and upstream of the polypeptide coding sequence. The function of the leader peptide is to allow expression of the polypeptide directly from the endoplasmic reticulum into the Golgi and further into secretory vesicles for secretion into the culture medium (i.e., transfer of the polypeptide across the cell wall or at least across the cell membrane into the periplasmic space in yeast cells). The leader peptide is a yeast leader (its use is described in US 4,546,082, EP 16,201, EP 123,296, EP 123,544 EP 163,529). Another possibility is that the leader peptide is a synthetic leader peptide that is a leader peptide not found in nature. Synthetic leader peptides are generated as described in WO 89/02 463 or WO 92/11 378 and by Kjeldsan et al., In Protein Expression and Purification 9, 1997, 331-366.

Výraz „vedoucí peptid“ je chápána jako peptid ve formě propeptidové sekvence, jejíž funkcí je umožnit sekreci heterologního proteinu z endoplazmatického retikula do Golgiho aparátu a dále do sekrečních váčků pro sekreci do kulturního média (tj. přesun přenášeného proteinu nebo polypeptidu přes buněčnou membránu a buněčnou stěnu, pokud je přítomna, nebo alespoň přes buněčnou membránu do periplazmatického prostoru buňky mající buněčnou stěnu).The term "leader peptide" is understood to be a peptide in the form of a propeptide sequence whose function is to allow secretion of a heterologous protein from the endoplasmic reticulum into the Golgi and into secretory vesicles for secretion into the culture medium (ie transfer of the transferred protein or polypeptide across the cell membrane and cell). wall, if present, or at least across the cell membrane into the periplasmic space of a cell having a cell wall).

Postupy používané pro ligaci DNA sekvencí, kódujících požadovaný protein či polypeptid, promotor nebo terminátor, a jejich vložení do vhodných kvasinkových vektorů obsahujících informace nutné pro replikaci v kvasinkách, jsou dobře známé pro odborníky (např. Sambrook a kol.). Usuzuje se, že vektor je vytvořen buď přípravou DNA konstruktu obsahujícího vloženou DNA sekvenci kódující polypeptid tohoto vynálezu a následně vložení této části do vhodného exprimovaného vektoru nebo sekvenčně vloženými DNA fragmenty obsahujícími genetickou informaci pro individuální prvky ( takové jako signální, vedoucí nebo heterologní protein) pomocí ligace.The procedures used to ligate DNA sequences encoding the desired protein or polypeptide, promoter or terminator, and insert them into suitable yeast vectors containing the information necessary for yeast replication are well known to those skilled in the art (eg, Sambrook et al.). It is believed that the vector is made either by preparing a DNA construct comprising the inserted DNA sequence encoding the polypeptide of the invention and subsequently inserting this portion into a suitable expressed vector or by sequencing the inserted DNA fragments containing genetic information for individual elements (such as signaling, leader or heterologous protein). ligace.

Kvasinkový organismus používaný ve způsobu tohoto vynálezu je kterýkoliv vhodný kvasinkový organismus, který při kultivaci produkuje dostatečná množství požadovaného proteinu nebo polypeptidu. Příklady vhodných kvasinkových organismů jsou kmeny vybrané z kvasinkových druhů Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, ·· «· ·* *· ·· · v · · · · * * · · • · · ·· · ·©· .·©·<}·© ···· t ····©· · · · §··......... ·· ···The yeast organism used in the method of the invention is any suitable yeast organism that produces sufficient amounts of the desired protein or polypeptide in culture. Examples of suitable yeast organisms are strains selected from yeast species Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia · lipyveri, Yarrowia ··· V · · * * * * ©}}}}}}}}}}}}}} ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ·· ···

Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp., a Geotrichum fermentans, s výhodou kvasinkové druhy Saccharomyces serevisiae.Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp., And Geotrichum fermentans, preferably yeast species Saccharomyces serevisiae.

Transformace kvasinkových buněk je např. účinná utvářením protoplastu, který je vytvořen transformací způsobem „per se“. Médium používané pro kultivaci buněk je kterékoliv vhodné médium vhodné pro růst kvasinkových organismů. Sekreční heterologní protein, významná část, která bude přítomna v médiu ve správně vytvořené formě, je získána z média vhodnými postupy zahrnujícími separaci kvasinkových buněk z média centrifugací nebo filtrací, precipitací bílkovinných složek supernatantu nebo filtrací pomocí sole tj. síranu amonného, používaného při purifikaci při různých chromatografických metodách tj. iontová rozdělovači chromatografie, afínitní chromatografie apod. Pokud je protein sekretován do periplazmatického prostoru, buňky jsou narušeny enzymaticky nebo mechanicky.For example, the transformation of yeast cells is effective by forming a protoplast which is formed by transformation per se. The medium used for cell culture is any suitable medium suitable for the growth of yeast organisms. The secretory heterologous protein, a significant fraction that will be present in the medium in a properly formed form, is recovered from the medium by suitable techniques including separating yeast cells from the medium by centrifugation or filtration, precipitating the protein components of the supernatant or by salt filtration, i.e. ammonium sulfate. various chromatographic methods, i.e. ion-partition chromatography, affinity chromatography, and the like. When a protein is secreted into the periplasmic space, the cells are disrupted enzymatically or mechanically.

Požadovaný protein nebo peptid je přenášen a sekretován jako N-terminální prodloužený fúzní protein jak je popsáno v WO 97/22 706. N-terminální prodloužení je pak odstraněno ze získaného proteinu in vitro buď chemickým nebo enzymovým štěpením, jak je dobře známo v technice. Je výhodné vést štěpení použitím enzymu. Příklady takových enzymů jsou trypsin nebo proteáza I z Achromobacter lyticus.The desired protein or peptide is transferred and secreted as an N-terminal elongation fusion protein as described in WO 97/22706. The N-terminal elongation is then removed from the obtained protein in vitro by either chemical or enzymatic cleavage, as is well known in the art. It is preferred to conduct the cleavage using an enzyme. Examples of such enzymes are trypsin or protease I from Achromobacter lyticus.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZUEXAMPLES OF EMBODIMENTS OF THE INVENTION

Přítomný vynález je dále podrobně popsán v následujících příkladech, které nemají v úmyslu v žádném směru omezovat rozsah vynálezu jak je nárokováno.The present invention is further described in detail in the following examples, which are not intended to limit the scope of the invention in any way as claimed.

Příklad 1Example 1

Kvasinkový plasmid pAK729 vytvořený pro expresi insulinového prekursoru (N-koncové prodloužení B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) insulinového prekursoru, viz WO97/22 706) obsahuje dva ApaLI enzymová restrikční místa ApaLI (4477) a ApaLI (5723) (viz obr. 1)..The yeast plasmid pAK729 designed to express the insulin precursor (N-terminal extension of the B (1-29) -Ala-Ala-Lys-A (1-21) insulin precursor, see WO97 / 22706) contains two ApaLI enzyme restriction sites ApaLI (4477 ) and ApaLI (5723) (see Fig. 1).

Tato restrikční místa jsou umístěna na každé straně AMP značkového genu. Odstranění 1246 nukleotidů mezi dvěmi ApaLI místy vpAK729 odstraní AMP značkový gen a nějakou doplňkovou plasmidovou DNA pocházející z E.coli.These restriction sites are located on each side of the AMP tag gene. Removal of 1246 nucleotides between two ApaLI sites in pAK729 removes the AMP tag gene and some additional E. coli derived plasmid DNA.

Plasmid pAK729, který byl štěpen restrikčním enzymen ApaLI, byl podroben elektroforéze na agaróze, izolován, znovu ligován a následně transformován do příslušných buněkPlasmid pAK729, which had been digested with the restriction enzyme ApaLI, was subjected to agarose electrophoresis, isolated, re-ligated and subsequently transformed into the appropriate cells.

S. cerevisiae (MT663, viz EP BO 163 529) poskytující transformační ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ.S. cerevisiae (MT663, see EP BO 163 529) yielding a transforming ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ.

Modifikovaný exprimovaný plasmid byl znovu izolován z kvasničného kmene ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ a DNA sekvence byly potvrzeny PCR metodou sledující nedostatečné klonování DNA oblasti charakterizovanou deleci. Rovněž DNA sekvence kódující insulinový prekursor byly potvrzeny na plasmidové DNA izolované z kvasničného kmene ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ.The modified expressed plasmid was re-isolated from the yeast strain ΝΝ729.1-ΔΑΜΡ and the DNA sequences were confirmed by PCR method following inadequate cloning of the DNA region characterized by the deletion. Also, DNA sequences encoding the insulin precursor were confirmed on plasmid DNA isolated from the yeast strain ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ.

Kvasinkový kmen ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ byl kultivován v YPD mediu při 30 °C po dobu 72 hodin. Výtěžek fermentace insulinového prekursoru by 1 stanoven RP-HPLC.Yeast strain ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ was cultured in YPD medium at 30 ° C for 72 hours. The yield of fermentation of the insulin precursor was determined by RP-HPLC.

Příklad 2Example 2

Enzymová restrikční místa Xhol (5676) a Xhol (5720) byla zavedena do pAK729 PCR. Vybrané DNA sekvence výsledného plasmidu pAK729,5 byly následně potvrzeny. Restrikční plasmidovou mapu pAK 729,5 ukazuje obr.2. DNA fragment mezi restrikčními enzymovými místy Xhol (5676) a Xhol (5720) mohou být odstraněna z plasmidu pAK729,5 deleci 44 nukleotidů umístěných u AMP genu.The XhoI (5676) and XhoI (5720) enzyme restriction sites were introduced into pAK729 PCR. The selected DNA sequences of the resulting plasmid pAK729.5 were subsequently confirmed. The restriction plasmid map of pAK 729.5 is shown in FIG. The DNA fragment between the XhoI (5676) and XhoI (5720) restriction enzyme sites can be removed from the plasmid pAK729.5 by deleting 44 nucleotides located at the AMP gene.

Plasmid pAK729,5, který byl štěpen s restrikčním enzymen Xhol, byl podroben elektroforéze na agaróze, izolován, znovu ligován a následně transformován do příslušných buněk S. cerevisiae MT663 poskytujících transformační ΝΝ729,5-ΔΑΜΡ. Modifikovaný exprimovaný plasmid byl znovu izolován z kvasničného kmene ΝΝ729,5-ΔΑΜΡ a DNA sekvence byly potvrzeny PCR sledující nedostatečné klonování DNA oblasti charakterizovanou deleci. Rovněž DNA sekvence kódující insulinový prekursor byly potvrzeny na plasmidové DNA izolované z kvasničného kmene ΝΝ729,5-ΔΑΜΡ, Delece 44 nukleotidů v ρΑΚ729,5-ΔΑΜΡ se ukazuje být účinná jako úplná delece AMP genu vzhledem ke zničení β-laktamázové aktivity.Plasmid pAK729.5, which had been digested with the restriction enzyme XhoI, was subjected to agarose electrophoresis, isolated, re-ligated, and then transformed into the appropriate S. cerevisiae MT663 cells giving the transforming ΝΝ729,5-ΔΑΜΡ. The modified expressed plasmid was re-isolated from the yeast strain ΝΝ729,5-ΔΑΜΡ and the DNA sequences were confirmed by PCR following inadequate cloning of the DNA region characterized by the deletion. Also, DNA sequences encoding the insulin precursor were confirmed on plasmid DNA isolated from the yeast strain ΝΝ729,5-ΔΑΜΡ. A deletion of 44 nucleotides in ρΑΚ729,5-ΔΑΜΡ proves to be effective as a complete deletion of the AMP gene due to destruction of β-lactamase activity.

Kvasinkový kmen ΝΝ729,5-ΔΑΜΡ byl kultivován v YPD mediu při 30 °C po dobu 72 hodin. Výtěžek fermentace insulinového prekursoru byl stanoven RP-HPLC.Yeast strain ΝΝ729,5-ΔΑΜΡ was cultured in YPD medium at 30 ° C for 72 hours. The yield of fermentation of the insulin precursor was determined by RP-HPLC.

Příklad 3Example 3

Enzymové restrikční místo AatlI (4982) bylo zavedeno do pAK729 PCR. Vybrané DNA sekvence výsledného plasmidu pAK729,6 byly následně potvrzený. Restrikční plasmidovou mapu pAK 729,6 ukazuje obr. 3.V pAK729,6 DNA fragmentu mezi restrikčními enzymovými místy AatlI (4982)a AatlI (5978) mohou chybět odstraněním 996 nukleotidů z plasmidu. To odstraní AMP gen a promotor.The AatII restriction enzyme site (4982) was introduced into pAK729 PCR. The selected DNA sequences of the resulting plasmid pAK729.6 were subsequently confirmed. The restriction plasmid map of pAK 729.6 is shown in Figure 3. The pAK729.6 DNA fragment between the restriction enzyme sites AatII (4982) and AatII (5978) may be missing by removing 996 nucleotides from the plasmid. This removes the AMP gene and promoter.

• ·• ·

Plasmid pAK729,6 který byl štěpen sDNA restrikčním enzymen AatlI, byl podroben elektroforéze na agaróze, izolován, znovu ligován a následně transformován do příslušných buněk 5. cerevisiae MT663. Modifikovaný exprimovaný plasmid byl znovu izolován z kvasničného kmene ΝΝ729,6-ΔΑΜΡ a DNA sekvence byly potvrzeny PCR metodou sledující nedostatečné klonování DNA oblasti charakterizovanou delecí. Rovněž DNA sekvence kódující insulinový prekursor byly potvrzeny na plasmidové DNA izolované z kvasničného kmene NN729,6-AAMP. Plasmidu ρΑΚ729,6-ΔΑΜΡ chybí AMP gen, jak je ukázáno na obr.4. Kvasinkový kmen ΝΝ729,6-ΔΑΜΡ byl kultivován v YPD mediu při 30 °C po dobu 72 hodin. Výtěžek fermentace insulinového prekursoru byl stanoven RP-HPLC.Plasmid pAK729.6, which had been digested with the DNA restriction enzyme AatII, was subjected to agarose electrophoresis, isolated, re-ligated and subsequently transformed into the appropriate 5. cerevisiae MT663 cells. The modified expressed plasmid was re-isolated from the yeast strain ΝΝ729,6-ΔΑΜΡ and the DNA sequences were confirmed by a PCR method following inadequate cloning of the DNA region characterized by deletion. Also, DNA sequences encoding the insulin precursor were confirmed on plasmid DNA isolated from the yeast strain NN729,6-AAMP. Plasmid ρΑΚ729,6-ΔΑΜΡ lacks the AMP gene as shown in Figure 4. Yeast strain ΝΝ729,6-ΔΑΜΡ was cultured in YPD medium at 30 ° C for 72 hours. The yield of fermentation of the insulin precursor was determined by RP-HPLC.

Příklad 4Example 4

Nové enzymové restrikční místo AatlI (3801) v plasmidu pAK729,7 bylo zavedeno do původního plasmidu pAK729 PCR. Vybrané DNA sekvence plasmidu pAK729 byly následně potvrzeny. V pAK729,6 DNA fragmentu mezi restrikčními enzymovými místy AatlI (3801) a AatlI (5978) mohou chybět odstraněním 2177 nukleotidů z exprimovaného plasmidu. Plasmid pAK729,7 byl navržen tak, že jak AMP gen tak i E. coli počátek replikace mohou chybět. Restrikční plasmidovou mapu pAK 729,7 ukazuje obr. 5.The novel AatII (3801) enzyme restriction site in plasmid pAK729.7 was introduced into the original plasmid pAK729 by PCR. The selected DNA sequences of plasmid pAK729 were subsequently confirmed. The pAK729.6 DNA fragment between the restriction enzyme sites AatII (3801) and AatII (5978) may be missing by removing 2177 nucleotides from the expressed plasmid. Plasmid pAK729.7 was designed such that both the AMP gene and the E. coli origin of replication may be absent. The restriction plasmid map of pAK 729.7 is shown in Figure 5.

Plasmid pAK729,7, který byl štěpen s DNA restrikčním enzymen AatlI, byl podroben elektroforéze na agaróze, izolován, znovu ligován a následně transformován do příslušných buněk S. cerevisiae MT663. Modifikovaný exprimovaný plasmid byl znovu izolován z kvasničného kmene NN729,7-AAMP a DNA sekvence byly potvrzeny PCR metodou sledující nedostatečné klonování DNA oblasti charakterizovanou delecí. Rovněž DNA sekvence kódující insulinový prekursor byly potvrzeny na plasmidové DNA izolované z kvasničného kmene NN729,7-AAMP. Kvasinkový kmen NN729,7-AAMP byl kultivován v YPD mediu při 30 °C po dobu 72 hodin. Výtěžek fermentace insulinového prekursoru byl stanoven RP-HPLC.Plasmid pAK729.7, which had been digested with the DNA restriction enzyme AatII, was subjected to agarose electrophoresis, isolated, re-ligated and subsequently transformed into the appropriate S. cerevisiae MT663 cells. The modified expressed plasmid was re-isolated from the yeast strain NN729,7-AAMP and the DNA sequences were confirmed by PCR method following inadequate cloning of the DNA region characterized by deletion. Also, DNA sequences encoding the insulin precursor were confirmed on plasmid DNA isolated from the yeast strain NN729,7-AAMP. The yeast strain NN729,7-AAMP was cultured in YPD medium at 30 ° C for 72 hours. The yield of fermentation of the insulin precursor was determined by RP-HPLC.

Tabulka 1Table 1

Charakterizace kmenů NN729 v pAK729 plasmidech s nefukčními nebo chybějícím AMP genem • ·Characterization of NN729 strains in pAK729 plasmids with non-infective or missing AMP gene

Kmen Strain Plasmid Plasmid Modifikace Modifications Delece nukleotidů Deletions nucleotides ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ ΝΝ729.1-ΔΑΜΡ ρΑΚ729,1- Δ AMP ρΑΚ729,1- Δ AMP Delece sekvence mezi ApaLZ (4477) a ApaLI (5723) Sequence deletion between ApaLZ (4477) and ApaLI (5723) 1246 1246 ΝΝ729,5-ΔΑΜΡ ΝΝ729.5-ΔΑΜΡ ρΑΚ729,5- ΔΑΜΡ ρΑΚ729,5- ΔΑΜΡ Delece sekvence mezi Xhol^a (5676) a Xhol (5720)Sequence deletion between Xhol ^and (5676) and Xhol (5720) 44 44 ΝΝ729,6-ΔΑΜΡ 9729.6-ΔΑΜΡ ρΑΚ729,6- ΔΑΜΡ ρΑΚ729,6- ΔΑΜΡ Delece sekvence mezi AatlI (5978) a AatII(4982) Sequence deletion between AatlI (5978) and AatII (4982) 996 996 ΝΝ729,7-ΔΑΜΡ ΝΝ729.7-ΔΑΜΡ ρΑΚ729,7- ΔΑΜΡ ρΑΚ729,7- ΔΑΜΡ Delece sekvence mezi AatlI (5978) a AatlI (3801) Sequence deletion between AatlI (5978) and AatlI (3801) 2177 2177

Nové ΝΝ729-ΔΑΜΡ kmeny byly porovnány s původním kmenem NN729 vzhledem k fermentačnímu výtěžku insulinového prekurzoru (tab. 2).The new ΝΝ729-ΔΑΜΡ strains were compared to the original NN729 strain due to the fermentation yield of the insulin precursor (Table 2).

Tabulka 2Table 2

Výtěžek fermentace ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ kmenů transformovaných s plasmidy s nefunkčním nebo chybějícím AMP genemFermentation yield of ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ strains transformed with plasmids with non-functional or missing AMP gene

Kmen Strain Výtěžek insulinového prekurzoru Yield of insulin precursor NN729 NN729 100% 100% NN729,1 NN729.1 122% 122% NN729,5 NN729.5 110% 110% NN729,6 NN729.6 112% 112% NN729,7 NN729.7 107% 107%

Z výše uvedeného vyplývá, že kvasničné kmeny obsahující exprimovaný gen s částečně či plně chybějícím AMP genem, který slouží jako značkovač, exprimujé od 10 % do 20 % více insulinového prekursoru porovnáním s původním kvasničním kmenem obsahujícím exprimovaný plasmid, který obsahuje AMP gen.It follows from the above that yeast strains containing the expressed gene with a partially or fully missing AMP gene that serves as a marker express from 10% to 20% more insulin precursor by comparison with the original yeast strain containing the expressed plasmid containing the AMP gene.

• · · · * · · «·· • ·* · ♦ · · «· * * · · «*« «

Příklad 5Example 5

Arg³⁴GLP-1(7-37) exprese v kvasinkách užitím plasmidů snefukčním nebo chybějícím AMP rezistentním genem.Arg ³⁴ GLP-1 (7-37) expression in yeast using plasmids with a snfunctioning or missing AMP resistant gene.

EcoRI (940)-Xbal 91403) sekvence pAK729 konstruktů kódujících LA19X5 MI3, vy světlených v obr. 1 až obr. 5, byly nahrazeny MF_a*-Arg³⁴GLP-1(7-37) kódovací sekvencí pro tento příklad (obr. 6). Modifikace MF«1 peptidu umístěného před vedoucím peptidem (Kurjan&Herskowitz, Cell 30, 1982, 933), ve kterém Leu v pozici 82 a Asp v pozici 83 byly nahrazeny Met a Ala, zavádějící Ncol Štěpící místo v DNA bylo použito v těchto konstruktech. Jako vedoucí sekvence byla označena MFJ* (Kjeldsen a kol., 1996). MFJ signální a MF«l*vedoucí peptidová sekvence zahrnuje Kex2p rozpoznávací motif obsahující dvě báze (Lys-Arg), který odděluje vedoucí sekvenci od kódovací pro Arg³⁴GLP-1(7-37)· Peptid Arg³⁴GLP-l (7-37) je variantou lidského peptidu GLP-1(7-37) (S. Mojsov a kol., J.Chem. 261, 1986, 11880 až 11889), kde přirozený aminokyselinový zbytek v pozici 34 je nahrazen Arg zbytkem.The EcoRI (940) -XbaI 91403) sequences of pAK729 constructs encoding LA19X5 MI3, as exemplified in Figures 1 to 5, were replaced with MF _and * -Arg ³⁴ GLP-1 (7-37) coding sequences for this example (Figs. 6). A modification of the MF 11 peptide upstream of the leader peptide (Kurjan & Herskowitz, Cell 30, 1982, 933) in which Leu at position 82 and Asp at position 83 were replaced by Met and Ala, introducing a NcoI cleavage site in DNA was used in these constructs. The leader sequence was designated MFJ * (Kjeldsen et al., 1996). MFJ signal and the MF «l * leader peptide sequence includes Kex2p recognition motif comprising two bases (Lys-Arg) separating the leader sequence coding for Arg ³⁴ GLP-1 (7-37) · The peptide Arg ³⁴ GLP-l (7- 37) is a variant of the human GLP-1 (7-37) peptide (S. Mojsov et al., J. Chem. 261, 1986, 11880-11889), wherein the natural amino acid residue at position 34 is replaced by an Arg residue.

Tři Arg³⁴GLP-1(7.37) exprimované plasmidy byly vytvořeny s AMP s rezistentními genovými divergencemi, jak je popsáno pro NN729,1 (př. 1), NN729,5 (př.2) a NN729,6 (př.3) a následně transformovaný do příslušných ME1719 (viz WO98/01 535) buněk S. cerevisiae dávající kvasničné transformanty YES2076, YES2079 a YES2085.Three Arg ³⁴ GLP-1 (7.37) expressed plasmids were generated with AMP with resistant gene divergences as described for NN729.1 (Ex. 1), NN729.5 (Ex. 2) and NN729.6 (Ex. 3). and subsequently transformed into the respective ME1719 (see WO98 / 01 535) of S. cerevisiae cells yielding yeast transformants YES2076, YES2079 and YES2085.

Hostitelský kmen, který byl použit pro expresi Arg³⁴GLP-1(7-37), je diploidní kmen, v jehož fenotypu chybí dvě aspartyl proteázy, tj. (1) kvasničná aspartyl proteáza 3 (YAP3), která štěpí Cterminální stranu mono-, a dibazických aminokyselinových zbytků (Egel-Mitani a kol., YEAST 6, 1990, 127 až 137) a (2) vakuolární proteáza A odpovědná za aktivací jiných proteáz jako proteázy B, karboxypeptidázy Y, aminopeptidázy I, RNázy, alkalické fosofatázy, kyselé trehalázy a exopolyfosfatázy. Navíc, triosafosfát isomerázový gen (TPI) byl vyjmut, jehož fenotyp umožňuje využít glukózu v těchto transformantech, které rostou na medium obsahujícím glukózu. Genetickým pozadím ME1719 je MATa/a Dyap3..ura3/Dyap3..URA3 pep4-3/pep4-3 tpi. ,LEU2/Dtpi. LEU2 Ieu2/leu2 Dura3/Dura3.The host strain used to express Arg ³⁴ GLP-1 (7-37) is a diploid strain in which the phenotype lacks two aspartyl proteases, ie (1) yeast aspartyl protease 3 (YAP3), which cleaves the Cterminal side of the mono- , and dibasic amino acid residues (Egel-Mitani et al., YEAST 6, 1990, 127-137); and (2) a vacuolar protease A responsible for the activation of other proteases such as protease B, carboxypeptidase Y, aminopeptidase I, RNase trehalases and exopolyphosphatases. In addition, the triosaphosphate isomerase gene (TPI) has been removed whose phenotype makes it possible to utilize glucose in these transformants that grow on glucose-containing medium. The genetic background of ME1719 is MATa / a Dyap3..ura3 / Dyap3..URA3 pep4-3 / pep4-3 tpi. , LEU2 / Dtpi. LEU2 Ieu2 / Leu2 Dura3 / Dura3.

Modifikované exprimované plasmidy pKV301, pKV304 a pKV307 byly znovu izolovány z kvasinkových kmenů á DNA sekvence byly potvrzeny PCR metodou sledující nedostatečné klonování DNA oblasti charakterizovanou delecí. Rovněž DNA sekvence kódující Arg³⁴GLP-1(7-37) byly potvrzeny na plasmidové DNA izolované z kvasinkových kmenů. Tabulka 3 ukazuje srovnání modifíkovanách a nemodifikovaných kmenů.Modified expressed plasmids pKV301, pKV304 and pKV307 were re-isolated from yeast strains and the DNA sequences were confirmed by PCR method following inadequate cloning of the DNA region characterized by deletion. Also, DNA sequences encoding Arg ³⁴ GLP-1 (7-37) were confirmed on plasmid DNA isolated from yeast strains. Table 3 shows a comparison of modified and unmodified strains.

Tabulka 3Table 3

Charakterizace YES kmenů na plasmidech s nefunkčním nebo chybějícím AMP rezistentním genem pro expresi Arg³⁴GLP-l₍7-37).Characterization of YES strains on plasmids with a defective or missing AMP resistant gene for the expression of Arg ³⁴ GLP-1 ₍ 7-37).

Kmen Strain Plasmid Plasmid Modifikace Modifications Delece nukleotidů Deletions nucleotides Porovnání Arg³⁴GLP-1₍7-₃7) výtěžkůComparison of Arg ³⁴ GLP-1 _(7- ₃ 7) yields YES 1757 YES 1757 pKV228 pKV228 Žádná None 0 0 100% 100% YES2076 YES2076 pKV301 pKV301 Delece sekvence mezi ApaLI(4456) a ApaLI (5702) Sequence deletion between ApaLI (4456) and ApaLI (5702) 1246 1246 119% 119% YES2079 YES2079 pKV307 pKV307 Delece sekvence mezi Xhol (5655) a Xhol (5699) Sequence deletion between Xhol (5655) and Xhol (5699) 44 44 113 % 113% YES2085 YES2085 pKV304 pKV304 Delece sekvence mezi AatII(5957) a AatlI (4961) Sequence deletion between AatII (5957) and AatlI (4960) 996 996 136 % 136%

Výtěžky fermentace byly porovnávány z 5 ml množství v YPD mediu po dobu 72 hodin při 30 °C. Výtěžky byly stanoveny HPLC.The fermentation yields were compared from 5 ml amounts in YPD medium for 72 hours at 30 ° C. Yields were determined by HPLC.

Claims

PATENT CLAIMS

ΊΟ # /

A recombinant expressed yeast vector which is not capable of conferring antibiotic resistance on bacterial cells comprising the genetic coding for a heterologous gene and an antibiotic resistant marker gene which is a non-functional in vitro modification.

The recombinant expressed yeast vector of claim 1, wherein the antibiotic marker gene is an AMP gene.

A method of obtaining a desired polypeptide or protein comprising culturing a yeast strain comprising the vector of claims 1 to 2 under suitable conditions, and recovering the desired product from the culture medium.

4. A method of obtaining a desired polypeptide or protein comprising, under appropriate conditions, a yeast strain culture comprising a yeast expressed plasmid, wherein the functional antibiotic marker gene used in the initial bacterial cloning steps is a non-functional in vitro deletion of some or all of the marker gene before insertion into a yeast host .

5. The method of claim 4 comprising inserting suitable restriction sites around the antibiotic resistant marker gene and deleting the marker gene by adding suitable restriction enzymes in vitro.

Method according to claims 3 to 5, characterized in that the yeast strain is a Saccharomyces strain, preferably a Saccharomyces cerevisiae strain.

A transformed yeast cell, comprising the vector of claims 1 to 2.

The transformed yeast cell according to claim 7, wherein the strain is Saccharomyces, preferably a strain of Saccharomyces cerevisiae.