KR20000075076A

KR20000075076A - 형질전환된 미세조류를 이용하여 외래 단백질을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20000075076A
Application number: KR1019990019439A
Authority: KR
Inventors: 최태진; 김영태
Original assignee: 최태진; 김영태
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2000-12-15
Also published as: AU3333900A; WO2000073455A1; KR100443843B1; KR20010073152A; EP1180145A1; JP2003501031A; CN1354792A; CA2374402A1

Abstract

본원 발명은 형질전환된 미세조류를 이용하여 목적하는 외래 단백질을 경제적으로 생산할 수 있는 방법, 즉 형질전환된 미세조류를 생물반응기로서 이용하는 방법에 관한 것으로, 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)와 같은 미세조류의 원형질체에 목적하는 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 형질전환시키고, 이를 배양하는 것에 의해 목적하는 외래 단백질을 경제적으로 생산할 수 있다. 특히, 본 발명에서는 플레오마이신에 저항성을 나타내는 Sh ble 유전자를 형질전환된 미세조류를 선별하는 표지인자로 사용하였다.

Description

형질전환된 미세조류를 이용하여 외래 단백질을 생산하는 방법{A method for production of foreign protein using transformed microalgae}

본 발명은 형질전환된 미세조류를 이용하여 목적하는 외래 단백질을 경제적으로 생산할 수 있는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 목적하는 외래 단백질 유전자를 포함하는 벡터 DNA로 미세조류의 원형질체를 형질전환시키고 이를 대량 배양하여 외래 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

숙주에서 적은 양이 발현되는 단백질에 대하여 연구를 하기 위해서는 이종의시스템(heterologous system)에서 원하는 단백질의 대량 발현이 필수적인데, 일반적으로 가장 널리 이용되는 이종의 대량 발현 시스템(heterologous overexpression system)은 대장균(Escherichia coli) 이다(Friehs, K., and Reardon, K. F. (1993) Parameters influencing the productivity of recombinant E. coli cutltivations. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 48, 53-77). 그러나, 진핵생물의 단백질 발현을 위해 대장균을 이용할 경우, 몇 가지 제한점이 있다(Bradley, M. K. (1990) Overexpression of proteins in Eukaryotes. Methods in Enzymol. 182, 112-132). 즉, 발현된 단백질은 번역후 변형(post-translational modification)과정의 결핍과 같은 대장균의 원핵생물적 특성 때문에 생물학적 기능이 없는 경우가 많으며, 발현된 단백질은 대장균에 유해하거나 합성되는 동안 분해되기도 한다. 더욱이, 원핵생물에서 만들어진 단백질은 비수용성 봉입체(inclusion body)를 만들기도 한다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 효모 발현 시스템(Smith et al., 1985)이나, 배양된 포유류 또는 곤충 세포를 이용하기도 하지만 배양 배지 중 혈청과 세포 배양 장치 때문에 비용이 많이 든다. 그리고, 때때로 숙주에서 발현되는 단백질의 양이 적기 때문에 많은 양의 정제가 필요하게 되는 문제점이 있다.

따라서, 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결할 수 있는, 즉 대장균을 대신할 수 있는 이종의 대량발현 시스템에 대해서 연구하게 되었다.

그 결과, 어류 양식(aquaculture)과 건강식품 산업에 널리 이용되는 단세포성 진핵 녹색 미세조류인 클로렐라가 단지 한정된 광물질과 빛만으로도 배양이 가능하므로 경제적으로 배양할 수 있고, 상대적으로 빨리 증식하고 광의 세기와 온도에 따라 하루에 2~9번 분열을 하며(Sorokin, C., and Krauss, R. W. (1958) The effect of light intensity on the growth rate of green algae. Plant Physiology 33, 109-13), 진핵생물이기 때문에 생물학적 기능을 발휘하는 번역 후 변형과정이 필요한 복합 단백질의 생산이 가능할 것이라는 것을 알게 되었고, 따라서, 클로렐라와 같은 미세조류를 외래 단백질의 생산을 위한 이종의 대량발현 시스템으로 이용하고자 하였다.

종래에도 미세조류의 하나인 클로렐라종의 형질 전환에 대한 시도가 있었다. 즉, 자비스와 브라운은 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)의 원형질체에서 루시퍼라제(luciferase)의 일시적인 발현을 확인한 바 있고(Jarvis, E. E., and Brown, L. M. (1991). Transient expression of firefly luciferase in protoplasts of the green alga Chlorella ellipsoidea. Current Genetics 19, 317-321), 도손 등은 질산염 환원 효소(nitrate reductase)가 결핍된 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 돌연변이체를 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)로부터의 분리된 질산염 환원효소 유전자로 형질전환시켜 돌연변이가 복구되는 것을 확인(Dawson, H. N., Burlingame, R., and Cannons, A. C. (1997). Stable transformation of Chlorella: Rescue of nitrate reductase-deficient mutants with the nitrate reductase gene. Current Microbiology 35, 356-362)한 바 있다. 그러나, 상기 발현은 일시적인 것이므로 외래 단백질을 안정적으로 생산할 수 없었으며, 같은 속(genus)으로부터 유래된 유전자만이 발현되는 문제점이 있었다.

따라서, 본 발명자들은 미세조류와는 다른 생물로부터 유래한 외래 단백질을 안정적으로 발현시켜 외래 단백질을 생산할 수 있는 방법에 대하여 연구하게 되었고, 그 결과, 미세조류의 원형질체를 외래 단백질 유전자를 함유하는 벡터 DNA로 형질전환시키고, 이를 대량 배양한다면, 상기한 목적을 달성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 클로렐라와는 다른 생물로부터 유래한 외래 단백질을 형질전환된 미세조류에서 안정적으로 발현시킬 수 있는 방법, 다시 말하여 형질전환된 미세조류로부터 외래 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 재조합 벡터 pCTV의 모식도이다.

도 2는 플레오마이신(phleomycin)의 존재시, 형질전환된 클로렐라 엘립소이데아와 형질전환시키지 않은 클로렐라 엘립소이데아의 생존를 나타내는 도면이다.

도 3은 플레오마이신이 첨가된 경우와 첨가되지 않은 배지에서 형질전환된 클로렐라 엘립소이데아와 형질전환되지 않은 클로렐라 엘립소이데아의 성장을 나타내는 도면이다.

도 4는 형질전환된 클로렐라 엘립소이데아로부터 분리된 게놈 DNA에 삽입된 넙치 성장 호르몬 유전자(flounder growth hormone; fGH) 및 Sh ble 유전자의 PCR 증폭 및 서던 블럿 분석 결과를 나타내는 도면이다.

<도면 기호에 대한 간단한 설명>

A: fGH 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 가지고 PCR 증폭을 한 결과와 서던 블럿 결과.

B: Sh ble 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 가지고 PCR 증폭을 한 결과와 서던 블럿 결과이다.

Lane 1: 분자량 크기 마커, Lane 2: 형질전환된 클로렐라 엘립소이데아

Lane 3: 형질전환되지 않은 클로렐라 엘립소이데아

Lane 4: 각각 pBluescript SK+ 벡터에서 절단한 fGH and Sh ble 유전자 단편

도 5는 형질전환된 클로렐라 엘립소이데아에서 발현된 fGH의 웨스턴 블럿 분석결과를 나타내는 도면이다.

<도면 기호에 대한 간단한 설명>

Lane 1: 분자량 크기 마커

Lane 2: 항체 생산을 위해 사용된 GST(글루타치온-S-트랜스퍼라제-fGH 융합 단백질

Lane 3: 형질전환되지 않은 클로렐라 엘립소이데아부터 분리된 총 단백질

Lane 4: 형질전환된 클로렐라 엘립소이데아부터 분리된 총 단백질

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 방법은 (1) 미세조류의 원형질체를 얻는 단계; (2) 외래 단백질 유전자를 포함하는 벡터를 상기 원형질체에 도입하여 상기 외래 단백질 유전자에 의해 형질전환된 미세조류의 원형질체를 얻는 단계; (3) 상기 형질전환된 미세조류를 배양하여 상기 외래 단백질 유전자를 발현시키는 단계; 및 (4) 상기 외래 단백질 유전자에 의해 코딩되는 발현 산물을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 미세조류의 일종인 클로렐라 엘립소이데아를 형질전환시켜, 이로부터 녹색 형광단백질(Green fluorescent protein; GFP) 유전자 , Sh ble 유전자 및 넙치 성장 호르몬 유전자가 발현되는 것을 확인하였다. 따라서, 의학적, 산업적으로 가치있는 단백질을 형질전환된 미세조류로부터 생산할 수 있을 것이다. 특히, 미세조류는 간단한 시설과 저렴한 비용을 생산할 수 있으며, 이로부터 발현된 단백질을 분리, 정제하는 방법 또한 간단하므로, 결과적으로 이들 단백질의 생산비를 크게 낮출 수 있다.

본 발명에서 사용되는 미세조류는 그 종류가 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들면, 클로렐라 엘립소이데아, 클로렐라 소로키니아나, 클로렐라 불가리스 등의 클로렐라, 스피루리나(spirulina), 나노클로로프시스(Nannochloropsis), 테트라셀미스(Tetraselmis), 케오세로스(Cheaoceros) 이소크리오시스(Isochryosis), 팔브로바(Pavlova), 피오닥티룸(Phaeodactylum), 스켈리토네마(Skeletonama), 나비쿨라(Navicula), 칼로네이즈(Calonase) 등이 있다.

일반적으로 형질전환체에서 외래 단백질과 같은 이종의 유전자(heterologous gene)를 발현시키기 위해서는 지속적 발현 또는 유도성 발현 프로모터가 필수적으로 필요하다. 본 발명에서는 미세조류를 형질전환시키기 위한 벡터의 제조시, 넙치 성장 호르몬 유전자의 발현을 위하여 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터를, Sh ble 유전자의 발현을 위하여 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii) RBCS2 프로모터를 함유시켰다.

한편, 형질전환체를 선별하기 위해서는 적절한 DNA 마커를 도입하여야 한다. 종래 미세조류의 형질전환에 여러 개의 마커들이 이용되었으나 각각의 방법은 제한이 있었다. 또한 일반적으로 동, 식물의 형질전환체의 선별에 이용되는 항생제에 저항성을 갖는 이종의 유전자들은 많은 미세조류가 이들 항생제에 대하여 자연적인 저항성을 갖고 있기 때문에, 종래에는 이들의 형질전환에 항생제에 저항을 갖는 이종의 유전자들을 이용하지 않았다 (Polne-Fuller, M., and Gibor, A. (1990) Developmental studies in Porphyra (Rhodophyceae). III. Effect of culture conditions on wall regeneration and differentiation of protoplasts. J. Phycol. 26, 674-82; Apt, K. E., Kroth-Pancic, P. G., and Grossman, A. R. (1996) Stable nuclear transformation of the diatom Phaeodactylum tricornutum. Mol.Gen. Genet. 252, 572-9).

그러나, 본 발명은 스트렙토알로테이쿠스 힌더스타머스(Streptoalloteichus hindustamus)로부터 유래되고, 탈리소마이신(tallysomycin), 블레오마이신( bleomycin), 플레오마이신(phleomycin) 및 제오마이신(zeomycin)에 저항성을 갖는 즉, 이러한 항생제의 DNA 파손 활성(breakage activity)을 막는 작은 단백질 (13.7kDa)을 암호화하는 Sh ble 유전자(Gatignol, A., Durand, H., and Tiraby, G. (1988) Bleomycin resistance conferred by a drug binding protein. FEBS Lett. 230, 171-175)를 선택표지로 도입하였다.

이하, 구체적인 실험의 재료와 방법, 그리고 결과를 설명하지만, 본 발명이 이러한 구체적인 예로만 한정되는 것은 아니다.

[재료와 방법]

A) 클로렐라의 배양과 원형질체 형성

부경대학교 내 한국 해양 미세조류 은행에서 분양 받은 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea; Strain No. KMCC C-20)를 클로람페니콜(chloramphenicol)과 스트렙토마이신(streptomycin)이 각각 50㎍/㎖가 함유된 f/2 배지(Guillard, R. R. L., and Ryther, J. H. (1962). Studies on marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea (Cleve) Gran. Can. J. Microbiol. 3, 229-239)에서 배양하였다. 즉, 클로렐라 엘립소이데아를 1×10⁶cells/㎖의 농도로 f/2 배지에 접종한 후, 3,000 lux의 광조건, 25℃의 온도, 광주기 18:6(명:암) 조건에서 배양하였다. 세포 농도가 1~2×10⁸cells/㎖이 되었을 때(대략 접종 약 8~9일 후), 원형질체 형성을 위하여 클로렐라 엘립소이데아 세포를 모았다. 즉, 상기 배양물 50㎖를 5분 동안 1,500×g에서 원심분리하여 클로렐라 엘립소이데아 세포를 모았다. 그 다음, 세포들을 25mM 인산염 완충액(pH 6.0)으로 1회 세척하고, 0.6M의 소비톨, 0.6M의 만니톨과 4%(w/v)의 셀룰로스 분해효소(cellulase; Calbiochem, USA), 2%(w/v)의 마세라제(Macerase; Calbiochem) 및 1%(v/v)의 펙티나제(pectinase; Sigma))를 함유하는 25mM의 인산염 완충액(pH 6.0)에 현탁 하였다. 세포 현탁액은 25℃, 암 조건에서 약하게 흔들어 주면서 16시간동안 반응시켜 클로렐라 엘립소이데아의 원형질체를 형성시켰다.

형성된 클로렐라 엘립소이데아의 원형질체의 확인은 두 가지 방법에 의해 실시하였다. 즉, 상기 반응액 0.1㎖에 증류수 2.9㎖를 넣고, 8시간 후 혈구계산기(haematocytometer)로 세포 수를 측정하여 세포수의 감소정도를 계산(Osmo-stability test)하는 방법과, 상기 반응액을 세포벽 성분 중의 셀룰로오즈와 결합하는 0.1% 칼코플루오르 화이트(calcofluor white; Maeda, H., and Ishida, N. (1967). Specificity of binding of hexapyranosyl polysaccharides with fluorescent brightner. J. Biochem. 62, 276-278)로 염색한 후, 형광현미경상에서 관찰하는 방법으로 클로렐라 엘립소이데아의 원형질체의 형성을 확인하였다.

B) 넙치 성장 호르몬 유전자의 클로닝

넙치 성장 호르몬(Flounder growth hormone: fGH) 유전자는 넙치 뇌하수체 cDNA 라이브러리로부터 PCR 방법으로 클로닝 하였다. 한편, 넙치 뇌하수체 cDNA 라이브러리는 넙치(Paralichtys olivaceus) 뇌하수체로부터 분리된 total mRNA를 이용하여 Lambda ZAP-II cDNA synthesis kit(Stratagene, USA)로 만들었다. 증폭된 라이브러리의 최종 역가는 3×10⁹pfu/㎖이고, 1㎕를 증폭에 사용하였다. fGH 유전자 증폭을 위하여, 이미 보고된 염기서열(Watahiki, M., Yamamoto, M., Yamakawa, M., Tanaka, M., and Nakashima, K. (1989) Conserved and uniques amino acid residues in the domains of the growth hormone: flounder growth hormone deduced from the cDNA sequence has the minimal size in the growth hormone prolactin gene family. J. of Biol. Chem. 264, 312-316)을 토대로 프라이머 fgh-AN 5'-CGG GAT CCC AGC CAA TCA CAG A-3'과 프라이머 fgh-AC 5'-CGG GCT ACA GAA TTC-3'를 설계하였다. 그리고, 프라이머 fgh-AN과 프라이머 fgh-AC로 증폭된 DNA 단편의 염기 서열을 결정하기 위해 pGEM-T 벡터(Promega, USA)로 클로닝하였다. 융합 단백질을 발현하기 위해 BamH I/Nde I 단편을 pGEX-3X 벡터(Amersham Pharmacia Biotech, USA)에 클로닝하였다. 발현된 글루타치온-S-트랜스퍼라제-fGH 융합 단백질은 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동으로 분리하였고, 융합단백질에 대한 다클론 항체(polyclonal antibody)는 쥐에서 만들었다. 6주된 BALB/C 쥐에 첫 주사때는 Freund's complete adjuvant와 25㎍의 융합 단백질을 피하주사 하였고, 1주 간격으로 3번 incomplete adjuvant로 부스터 주사(booster injection)하였다. 육종 세포(Sarcoma cell; 1×10⁷cells)는 마지막 주사 1주 후에 복강 주사하였고, 복수(ascitic fluid)는 2주 동안 3~4번 뽑아냈다.

C) 벡터의 제작

유전자의 발현을 모니터하기 위한 리포터 유전자(reporter gene)로 사용되는 녹색 형광단백질(Green fluorescent protein; GFP)이 있는 형질전환 벡터 pMInGFP는 식물전환 벡터 Bin19(Bevan, M. (1984). Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Res. 12, 8711-8721)로부터 만들어진 것이다. 처음에 11,777bp Bin 19 벡터로부터 약 5kb의 작은 바이너리 벡터를 만들었다(Frisch, D.A., Harris-Haller, L.W., Yokubaitis, N.T., Thomas, T.L., Hardin, S.H., and Hall, T.C. (1995) Complete sequence of the binary vector Bin 19. Plant Mol. Biol. 27, 405-409). 그 결과, 대장균과 아그로박테리움에서 복제할 수 있는 ori V와 카나마이신(kanamycin)에 저항성이 있는 npt II 유전자, 복제에 필요한 trf A 및 integration을 위한 T-DNA의 왼쪽 및 오른쪽 부위(border)를 갖는 형질전환 벡터가 제조되었다. 여기에 pBI121mGFP (J. Haseloff, MRC, UK)의 35S 프로모터-GFP 코딩영역을 포함하는 DNA 단편을 서브클로닝하여 pMinGFP 벡터를 제조하였고 pMinGFP 벡터를 클로렐라 엘립소이데아 원형질체의 형질전환과 형질전환된 클로렐라 엘립소이데아 원형질체(이하, '형질전환된 클로렐라'라 한다.)에서 발현된 외래단백질의 활성을 조사하는데 이용한다.

넙치 성장 호르몬(fGH)의 발현을 위하여 pMinGFP 벡터의 GFP 유전자 대신에 fGH 유전자로 대체하였다. 즉, 뇌하수체 cDNA 라이브러리로부터 프라이머 fgh-N 5'-CGG GAT CCG GTC AGT CCC TTA TGC AGC CAA TCA CA-3'과 프라이머 fgh-C 5'-AAA AGC TCG AGC TCT TGG CGG AG-3'를 이용하여 fGH 유전자를 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)으로 증폭하였다. PCR 반응조건은 94℃에서 1분간 DNA를 분리시키는 단계(denaturation); 54℃에서 30초동안 프라이머와 결합시키는 단계(annealing); 72℃에서 1분간 DNA를 합성하는 단계(extension)를 총 30회 반복하고, 72℃에서 5분 동안의 연장과정을 추가하였다. 560 bp의 PCR 산물은 BamHⅠ/Xoh Ⅰ으로 절단하고, 염기 서열을 결정하기 위하여 pBluescript SK(+) 플라스미드(Stratagene)에 클로닝하였고, 이를 상기 pMinGFP의 BamH Ⅰ/Xoh Ⅰ 위치에 서브클로닝하여 변형된 벡터 pMinfGH를 제작하였다.

또한, 플레오마이신(phleomycin)에 저항성이 있는 Sh ble 유전자를 선택표지 (selection marker)로 이용하였다. University College London의 Saul Purton 박사로부터 입수한 플라스미드 pSP109의 Sh ble 유전자 부위와 앞쪽에 위치하는 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii) RBCS2 프로모터 부위를 프라이머 ble-N 5'-AAA CTC GAG GGC GCG CCA GAA GGA GC-3'과 프라이머 ble-C 5'-AAA CTC GAG AA TTC GAG GTC GGT ACC-3'으로 증폭하였다. PCR 반응조건은 94℃에서 1분간 DNA를 분리시키는 단계(denaturation); 57℃에서 30초 동안 프라이머와 결합시키는 단계(annealing); 72℃에서 1분간 DNA를 합성하는 단계(extension)를 총 30회 반복하고, 72℃에서 5분 동안의 연장과정을 추가하였다. 880bp의 PCR 산물은 Xho I으로 절단하고 변형된 벡터 pMinfGH에 서브클로닝하여 형질전환 벡터 pTVC를 제작하였다.

이렇게 작성된 형질전환 벡터 pTVC의 상세한 모식도는 도 1에 나타내었다.

D) 클로렐라의 형질전환

상기 A)에서 형성시킨 클로렐라 엘립소이데아의 원형질체를 5분동안 400×g에서 원심분리하여 모았다. 원형질체를 0.6M의 소비톨/만니톨이 함유된 f/2 배지에 현탁시킨 후, 5분동안 400×g에서 원심분리하여 세척하였다. 그리고, 모아진 세포는 0.05M 염화칼슘이 함유된 0.6M 소비톨/만니톨 1㎖에 현탁시켰다. 10⁷∼10⁸농도의원형질체 0.4㎖를 튜브에 옮기고, 벡터 pTVC의 DNA 5㎍과 담체로써 캘프 싸이머스(calf thymus) DNA(Sigma Chemicals, St. Louis, Mo.) 25㎍을 첨가하였다. 이를 상온에서 15분 동안 배양한 후, PNC[0.8M NaCl, 0.05M CaCl₂, 40% PEG 4000(Sigma)] 200㎕을 첨가하고 잘 섞었다. 상온에서 30분 동안 배양한 후, 0.6M의 소비톨/만니톨, 1%의 효모추출액 및 1%의 글루코스가 함유된 f/2 배지 0.6㎖를 첨가하고 25℃, 암 조건에서 12시간동안 배양하였다. 형질전환시킨 세포는 플레오마이신(1㎍/㎖)이 함유된 f/2 배지에 옮기고, 상기에서와 같은 조건에서 배양하였다.

E) DNA 분리

클로렐라의 게놈 DNA는 도슨 등(Dawson, H. N., Burlingame, R., and Cannons, A. C. (1997). Stable transformation of Chlorella: Rescue of nitrate reductase-deficient mutants with the nitrate reductase gene. Current Microbiology 35, 356-362)과 같은 방법으로 분리하였다. 즉, 약 1×10⁸cells/㎖의 농도로 자란 세포 3㎖를 원심분리하여 모으고, CTAB 완충액[250 ㎖: hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 5g, 1M Tris (pH 8.0) 25 ㎖, NaCl 20.45g, EDTA 1.68g, β-mercaptoethanol (2%)] 500㎕에 현탁하였다. 그 다음, 65℃에서 1시간 동안 배양하고, 동량의 페놀/클로로포름으로 게놈 DNA를 추출한 후, 추출액을 3,000×g에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 모으고, 이를 튜브에 옮겼다. 상등액이 맑아질 때까지 추출을 반복하여 실시하였다. 그리고, 0.7배 부피의 100% 에탄올을 가하여 게놈 DNA를 침전시키고, 17,000×g에서 15분 동안 원심분리하여 회수하였다. 침전물은 70% 에탄올로 세척하고, 30㎕의 TE 완충액에 재현탁시켰다.

F) PCR과 서던 블럿 분석(Southern blot analysis)

상기 C)의 벡터 제작에 사용된 프라이머 fgh-N/fgh-C와 ble-N/ble-C를 이용하여 분리된 게놈 DNA로부터 각각 fGH 유전자와 Sh ble 유전자를 증폭하였다. 게놈 DNA 1㎕과 각각의 프라미어 100 pmole을 이용하여 50㎕ 부피로 PCR를 실시하였고, 각각의 반응 조건은 상기 C)의 벡터제작의 PCR 반응조건과 동일하다. PCR 산물은 아가로스 겔에서 확인하였고, 서던 블럿 분석을 하기 위해 니트로셀룰로스막으로 옮겼다. 프로브 합성을 위한 주형(templates)은 상기에서 염기 서열의 검증을 위하여 만들어진 클론을 제한 효소로 절단하여 각각의 유전자를 겔에서 분리하여 준비하였다. fGH 유전자와 Sh ble 유전자의 프로브는 DIG-DNA 라벨링 키트(Boehringer Mannheim, Germany)로 만들었고, 서던 블럿과 검출은 제조사의 방법에 따라 수행하였다. 절단하지 않은 게놈 DNA의 서던 분석 또한 같은 방법으로 수행하였다.

G) 웨스턴 블럿 분석(Westhern blot analysis)

클로렐라에 도입된 넙치 성장 호르몬 유전자의 발현을 웨스턴 블럿으로 분석하였다. 즉, 10⁸~10⁹의 형질전환된 클로렐라 세포를 함유하는 상기 D)의 배양액 3㎖를 5분 동안 17,000×g에서 원심분리하여 형질전환된 클로렐라를 분리하였다. 분리된 형질전환 클로렐라를 sample loading buffer[1mM EDTA, 250mM Tris-Cl (pH 6.8), 4% SDS, 2% β-머캅토에탄올, 0.2% 브모로페닐블루, 50% 글리세롤] 20㎕에 현탁시키고, 10분 동안 끓였다. 그 다음, 10분 동안 12,000×g에서 원심분리하여 상등액을 취하고, 15% SDS-PAGE 겔에서 전기영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스막으로 옮기고, 공지의 방법으로 웨스턴 블럿을 수행하였다. fGH에 대한 다클론 항체의 최종 농도는 1:3,000이고, 2차항체로 알카리성 인산화효소가 결합된 항체를 사용하였다. 형질전환되지 않은 클로렐라 또한 동일한 방법으로 웨스턴 블럿 분석을 하였다.

[결과]

원형질체 형성과 형질전환

세포수의 감소정도를 측정하는 방법에 의해 원형질체의 형성을 확인한 결과, 효소 처리된 반응액의 세포 수는 1.7×10⁶cells/㎖에서 1.0×10⁵cells/㎖까지 감소하였으나, 아무런 처리를 하지 않은 클로렐라에는 변화가 없었다. 또한, 칼코플루오르 화이트 염색에 의해 확인한 결과, 아무런 처리를 하지 않은 세포는 형광현미경에서 푸른색을 띠었으나, 효소로 처리한 세포의 경우는 80% 이상이 적색을 띠었다. 따라서, 효소처리에 의해 클로렐라 엘립소이데아의 원형질체가 형성되었음을 알 수 있다.

효소처리에 의해 형성된 클로렐라 엘립소이데아의 원형질체를 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)을 이용하는 방법으로 pMinGFP 벡터로 형질전환시킨 후, f/2 배지에서 7일 동안 배양하고(이는 형질전환된 클로렐라에서 외래 유전자의 일시적인 발현이 보고되었기 때문에 형질전환된 원형질체의 세포벽이 재생된 상태에서의 외래 유전자의 발현을 확인하기 위한 것임), 형광현미경에서 관찰한 결과, 형질전환시킨 클로렐라의 일부가 녹색을 띠었다. 그러나, 형질전환하지 않은 클로렐라에서는 녹색을 띠는 세포는 없었다. 이로부터, 형질전환된 클로렐라에서 GFP 유전자가 발현된다는 것을 알 수 있다.

클로렐라에서 선택표지로써 Sh ble 유전자

형질전환용 벡터인 pTVC에는 형질전환체에 카나마이신에 저항성을 주는 npt II 유전자가 있다. 따라서, 선별표지로써 카나마이신에 대한 저항성을 조사하기 위해서, 여러 농도의 카나마이신이 함유된 f/2 배지에서 형질전환하지 않은 클로렐라를 배양하였다. 그 결과, 카나마이신을 1, 5, 10 및 20 ㎍/㎖ 농도를 함유한 f/2 배지에서 클로렐라를 증식하여도, 클로렐라의 증식에는 차이점이 없었다. 이로부터, 카나마이신은 형질전환체 선별에 선택 표지로서 쓰일 수 없다는 것을 알 수 있다.

한편, 플레오마이신으로 증식 억제 실험을 한 결과, 0.1 및 0.5㎍/㎖의 플레오마이신을 함유한 배지에서는 클로렐라의 증식 억제를 볼 수 없었으나, 1㎍/㎖ 농도 이상에서는 증식이 억제된다는 것을 발견하였다. 즉, 플레오마이신은 형질전환체의 선별에 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 외래 단백질의 생산을 위하여 플레오마이신에 저항성을 주는 Sh ble 유전자와 앞쪽에 위치하는 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii) RBCS2 프로모터를 pSP109 플라스미드로부터 PCR에 의해 증폭하였고, 형질전환 벡터에 클로닝하여 pCTV 벡터를 제조한 것이다.

형질전환시킨 세포를 재생(regeneration)배지에서 1㎍/㎖ 플레오마이신이 함유된 f/2 배지로 옮긴 후, 5일 후에 세포 증식을 관찰할 수 있었으며, 15일 후에 정상기(stationary phase)에 이르렀다. 그러나, 형질전환하지 않은 세포는 증식을 관찰할 수 없었다(도 2). 이로부터, 플레오마이신으로 형질전환된 클로렐라를 선별할 수 있음을 알 수 있다. 정상기 도달한 형질전환된 클로렐라를 플레오마이신이 있는 f/2 배지와 없는 배지에 옮긴 후 증식을 관찰하였을 때, 성장에 차이점은 없었다. 또한, 양쪽 배지에서의 형질전환된 클로렐라의 증식은 항생제가 없는 f/2 배지에서의 형질전환하지 않은 클로렐라 증식과 비슷했다(도 3).

클로렐라 게놈에 도입된 DNA의 integration

생물반응기(Bioreactor)로 형질전환된 클로렐라를 이용하기 위해서는, 도입된 DNA의 게놈 DNA로의 안정적인 integration이 필수적이다. 클로렐라 게놈 DNA로의 integration은 분리된 게놈 DNA의 서던 블럿 분석으로 확인하였다. fGH 유전자와 Sh ble 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브는 형질전환된 클로렐라에서 분리된 게놈 DNA에만 결합하였다. 이 결과는 PCR 반응과 서던 블럿 분석으로 한 번 더 검증하였다. 즉, 형질전환된 클로렐라와 형질전환시키지 않은 클로렐라로부터 게놈 DNA를 분리하여, 이를 PCR 증폭에 있어서 주형으로 이용하였다. 예상했던 크기의 DNA 단편은 형질전환된 클로렐라에서만 확인되었고, 대조군인 클로렐라에서는 없었다. 이러한 DNA 단편들은 fGH 유전자와 Sh ble 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브를 이용하여 서던 블럿 분석법으로 검증하였다 (도 4).

Integrated DNA의 안정성은 플레오마이신이 함유되지 않은 배지에서 여러 번 옮긴 후에, 게놈 DNA로부터 분리된 두 개의 유전자의 PCR 증폭으로 확인하였다. 동일한 PCR 산물이 10일 간격으로 7회까지 옮겼을 때까지 생성되어 도입된 유전자가 안정적으로 존재하는 것이 확인되었다.

클로렐라에서 넙치 성장 호르몬의 발현

도입된 넙치 성장 호르몬의 발현을 웨스턴 블럿 분석으로 확인한 결과, 도 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 20kDa의 넙치 성장 호르몬이 형질전환된 클로렐라에서만 확인되었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 클로렐라 엘립소이데아의 원형질체에 GFP 유전자, Sh ble 유전자, 넙치 성장 호르몬 유전자가 도입되어 정상적으로 발현되고 있다는 것이 관찰되었으므로, 클로렐라 엘립소이데아와 같은 미세조류에 미세조류와는 다른 동식물 유래의 의학적, 산업적으로 가치 있는 단백질 유전자를 도입할 경우, 형질전환된 미세조류는 목적하는 외래 단백질을 경제적으로 생산할 수 있다. 따라서, 형질전환된 미세조류는 생물반응기로서 효과적이다.

Claims

(1) 미세조류의 원형질체를 얻는 단계;

(2) 외래 단백질 유전자를 포함하는 벡터를 상기 원형질체에 도입하여 상기 외래 단백질 유전자에 의해 형질전환된 미세조류의 원형질체를 얻는 단계;

(3) 상기 형질전환된 미세조류의 원형질체를 배양하여 상기 외래 단백질 유전자를 발현시키는 단계; 및

(4) 상기 외래 단백질 유전자에 의해 코딩되는 발현 산물을 회수하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 미세조류를 이용한 외래 단백질의 생산방법.
제 1항에 있어서, 상기 미세조류는 클로렐라(Chlorella), 스피루리나(spirulina), 나노클로로프시스(Nannochloropsis), 테트라셀미스 (Tetraselmis), 케오세로스(Cheaoceros), 이소크리오시스(Isochryosis), 팔브로바(Pavlova), 피오닥티룸 (Phaeodactylum), 스켈리토네마(Skeletonama), 나비쿨라(Navicula), 칼로네이즈 (Calonase)임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 벡터는 형질전환체를 선택하기 위한 선택표지로서 Sh ble 유전자를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 외래 단백질은 넙치 성장 호르몬임을 특징으로 하는 방법.