KR100224120B1 - 지방산의불포화화효소유전자,그유전자를함유한벡터 - Google Patents

지방산의불포화화효소유전자,그유전자를함유한벡터 Download PDF

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Abstract

지질에 결합한 지방산의9위를 불포화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자 ; 그 유전자 또는 그 유전자의 일부를 함유한 폴리누클레오티드를 포함한 벡터 ; 지질에 결합한 지방산의9위를 불포화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자 또는 그 유전자의 일부를 함유한 폴리누클레오티드가 도입된 식물세포 ; 상기 식물세포를 분화시켜서 식물체를 재생시키는 것을 특징으로 하는 식물의 작출방법 ; 및 지질에 결합한 지방산의

Description

[발명의 명칭]
지방산의 불포화화효소 유전자, 그 유전자를 함유한 벡터, 그 유전자가 도입된 식물 작출방법
(기술분야)
본 발명은 지질에 결합한 지방산의9위를 불포화하는 활성을 갖는 단백질(이하9위 불포화화 효소라 한다)을 코드하는 유전자, 그 유전자를 함유한 벡터, 그 유전자가 도입된 식물 및 그 작출방법에 관한 것이다.
(배경기술)
생물의 생체막을 구성하는 지질인 막지질은 외계온도의 저하에 수반하여 액정상태로부터 고체상태로 변화(상분리)한다. 이와 같은 상분리에 수반하여 생체막의 성질이 변화한다. 즉 막지질이 고체상태에서는 물질투과의 선택성이 없어지기 때문에 생체막이 본래의 기능을 수행할 수 없게 되어, 그 결과 세포에 상해(저온상해)가 생기는 것으로 생각되고 있다.
액정상태로부터 고체상태 또는 그 반대로 변화하는 온도인 막지질의 상 전이온도는 주로 지질에 결합하고 있는 지방산 아실기의 불포화도(탄소쇄중의 2중결합의 수)에 따라 결정된다. 즉 결합하고 있는 지방산 아실기의 2개가 다 포화지방산일 경우에는, 이 지질분자종의 상 전이온도는 실온보다 높으나, 결합한 지방산 아실기에 2중결합을 적어도 1개 갖는 지질분자종의 상 전이온도는 거의 0℃ 이하이다(Santaren, J. F. et al., Biochem. Biophys. Acta, 68 7:231, 1982).
또한 일반적으로 지방산의 2중결합의 위치는 그 카르복실기 말단으로부터 2중결합이 있는 탄소까지의 탄소수를(델타)에 뒤이어 나타낸다. 또 2중결합의 총수는 전 탄소수의 뒤에 콜론에 이어서 기재한다. 예를들면 리놀산은 18:29, 12로 기술되고, 그 구조는
CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH
이다. 또 2중결합의 위치를 ω(오메가)에 이어서 기재하는 경우가 있으니, 이것은 지방산의 메틸기 말단으로부터 2중결합이 있는 탄소까지의 탄소수를 나타내고 있다.
고등식물의 막지질중에서 포화분자종이 비교적 많은 것은 포스파티딜글리세롤(PG)뿐이며, 식물의 저온상해의 기인이 PG의 상 전이에 의함과(Murata, N. et al., Plant Cell Physiol., 23:1071, 1982; Roughan, P. G., Plant Physiol., 77:740, 1985), 또 PG의 분자종 조성이 엽록체에 존재하는 글리세롤-3-인산아실트란스페라제(이하 ATase)의 기질선택성에 의해 결정됨(Frentzen, M. et al., Eur. J. Biochem., 129:629, 1983; Murata, N., Plant Cell Physiol., 24:81, 1983; Frentzen, M. et al., Plant Cell Physiol., 28:1195, 1988)이 강하게 시사되어 있었다.
이들 가정에 의거해서 니시자와등은 저온에 강한 식물인 애기장대로부터 취득한 ATase 유전자를 담배에 도입·발현함으로써 PG의 포화분자종 함량을 낮추어 담배를 야생주보다 저온에 강하게 할 수가 있음을 제시하였다(PCT 특허출원 : PCT/JP92/00024, 1992). 그러나 ATase는 원래의 식물중에도 존재하며, 가령 외래의 ATase를 식물중에 대량 발현시켰다 하더라도 내재성의 ATase와 경합하는 것은 피할 수가 없으므로, 외래의 ATase의 효과가 희석될 가능성은 부정할 수가 없다. 예를 들어 작성한 형질전환 담배중 애기장대의 ATase를 가장 대량으로 발현하고 있는 클론(clone)의 잎의 PG의 포화분자종 함량은 약 28%이어서 담배 야생주보다는 약 8% 적으나, 애기장대 야생주보다도 약 8% 많았다(PCT 특허출원 : PCT/JP92/00024, 1992).
또한 일반적으로 플라스티드로 만들어진 아실-ACP는 주로 16:0-ACP와 18:1-ACP이며, 또 그들의 비율은 거의 등량이라고 생각되나, 조직에 따라서는 16:0-ACP나 18:0-ACP의 비율이 18:1-ACP보다 높을 수 있다는 것도 생각할 수 있다(Toriyama, S. et al., Plant Cell Physiol., 29:615, 1988). 이와 같은 조직에서는 외래의 ATase에 의해 포화분자종 함량을 충분히 감소시키기가 곤란하다는 것도 생각할 수 있다.
그런데, 광합성세균인 시아노박테리아(남조)의 막지질의 조성은 고등식물의 엽록체를 구성하고 있는 막계의 지질조성과 유사하다(Murata, N. et al., in The Biochemistry of Plants, Academic Press, 1987). 또 남조에서는 막지질에 결합한 지방산의 불포화도는 지질에 결합한 지방산을 불포화화하는 효소에 의해 제어되고 있다. 그리고 지질에 결합한 지방산에 2중결합을 1개 밖에 넣을 수 없는 Anacystis nidulans(별명 Synechococcus PCC 7942)는 저온 감수성이지만(Ono, T. et al., Plant Phy Siol., 67:176, 1981) 2개 이상 넣을 수 있는 Synechocystis PCC6803은 저온내성임이 알려져 있다(Wada, H. et al., Plant Cell Physiol., 30:971, 1989).
또 남조에서의 지방산의 불포화화효소는 모두 지질을 기질로 하고, 지질에 결합한 지방산에 2중결합을 도입한다. 따라서 남조는 16:0/16:0- 및 18:0/16:0-의 포화분자종으로 된 막지질인 PG, SQDG, MGDG 및 DGDG의 지방산에 cis-형의 2중결합을 도입할 수가 있다(Murata, N. et al., in The Biochemistry of Plants Academic Press, 1987). 이와 같은 점은 지방산 불포화화효소로서 스테아로일-ACP(18:0-ACP)의9위에 2중결합을 도입하는 효소를 가지며, 일단 16:0/16:0-(및 약간 존재하는 18:0/16:0-)의 포화분자종으로 된 PG 및 SQDG가 합성되면, 그들의 지방산에 결코 cis-형의 2중결합을 도입하지 않는 고등식물과 크게 다른 점이다.
현재 Synechocystis PCC6803의12위 불포화화효소 유전자를 Anacystis nidulans에 도입·발현시킴으로써 본래 Anacystis nidulans에 존재하지 않는 16:29, 12 및 18:29, 12를 생산할 수가 있으며, 결과적으로 본래 저온 감수성인 Anacystis nidulans를 저온내성으로 전환이 가능하다는 것을 나타내고 있다(Wada, H. et al., Nature, 347:200, 1990).
또한 지금까지는 남조의 불포화화효소중6위(Reddy, A. S. et al., Plant Mol. Biol., 27:293, 1993) 및12위(Wada, H. et al., Nature, 347:200, 1990) 불포화화효소의 유전자가 취득되어 있다. 그러나9위에 2중결합이 도입되어 있지 않으면6위 및12위 불포화화효소는 각각6위와12위를 불포화할 수가 없다. 또9위와12위가 다 같이 불포화화 되어 있지 않으면15위 불포화화효소는15위를 불포화화 할 수가 없다. 따라서 지방산의9위를 불포화화하는 효소의 유전자를 고등식물에 도입하여 발현시키면 고등식물의 포화분자종 함량을 저하시켜서, 결과적으로 이 고등식물을 저온내성으로 할 수가 있을 것이다. 그러나 현재까지 지방산의9 위를 불포화화하는 효소의 유전자를 얻은 일은 없었다.
따라서 본 발명은 지방산의9위를 불포화화하는 효소의 유전자 및 그 일부를 포함한 폴리누클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또 본 발명은 지방산의9위를 불포화화하는 효소의 유전자 또는 그 일부를 포함한 폴리누클레오티드를 함유한 벡터를 제공하는 것도 목적으로 한다.
또한 본 발명은 지방산의9위를 불포화하는 효소의 유전자 또는 그 일부를 포함한 폴리누클레오티드가 도입된 식물세포 및 식물을 제공하는 것도 목적으로 한다.
(발명의 개시)
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자는 Anacystis 속에 속하는 남조의 게놈(genome)DNA로부터9위 불포화화효소를 코드하는 유전자를 클로닝하여, 이 유전자를 내포한 벡터 DNA을 얻은 후에, 이 벡터 DNA로 식물세포를 형질전환하고, 이것을 분화시켜서 식물체를 재생시킴으로써 식물에 저온내성을 부여함에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉 본 발명은 하기와 같은 사항을 요지로 하는 것이다.
(1) 지질에 결합한 지방산의9위를 불포화화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자.
(2)지질에 결합한 지방산의9위를 불포화화하는 활성을 갖는 단백질이 실질적으로 배열번호 4에 기재된 아미노산배열을 갖는 것인 (1)에 기재한 유전자 또는 그 유전자의 일부를 포함한 폴리누클레오티드.
(3) 지질에 결합한 지방산의9위를 불포화화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자가 배열번호 3에 기재된 염기배열을 포함한 DNA쇄인 (1)에 기재한 유전자 또는 그 유전자의 일부를 포함한 폴리누클레오티드.
(4) (1)~ (3)의 어느것에 기재한 유전자 또는 그 유전자의 일부를 포함한 폴리누클레오티드를 함유한 벡터.
(5) (1)~ (3)의 어느것에 기재한 유전자 또는 그 유전자의 일부를 포함한 폴리누클레오티드가 도입된 식물세포.
(6) (5)에 기재한 식물세포를 분화시켜서 식물체를 재생시키는 것을 특징으로 하는 식물의 작출방법.
(7) (1)~ (3)의 어느 것에 기재한 유전자 또는 그 유전자의 일부를 포함한 폴리누클레오티드가 도입된 식물.
[도면의 간단한 설명]
제 1도는 des 9 var 단편이 코드하는 아미노산 배열과 마우스의 스테아로일 -Co A 불포화화효소 (MSCD2)의 아미노산 배열의 비교를 나타낸다. 도면중에서 양자가 동일한 아미노산의 경우에는 : 성질이 유사한 아미노산의 경우에는 ㆍ을 붙여서 비교하였다. X는 그 사이에서의 상동성(相同性)이 높은 범위를 나타낸다.
제 2도는 des 9 var 단편을 프로브로 하여 Anacystis nidulans의 게놈DNA을 사던분석(southern analysis)한 오토래디오그램을 나타낸 전기영도사진이다.
제 3도는 λ5, λ15 및 p 15X의 인서트 DNA 단편의 상호관계를 나타낸다. 굵은 화살표는 단백질을 코드하고 있는 부분과 방향을, 가는 화살표는 시켄스를 결정한 부위와 그 방향을 나타낸다.
제 4도는 des 9 var와 마우스의 스테아로일-CoA 불포화화효소 (MSCD2)의 아미노산 배열의 비교를 나타낸다. 아미노산 배열의 비교는 제 1도와 마찬가지로 하였다.
제 5도는 식물체 레벨에서의 형질전화 담배에 대한 저온처리의 영향을 나타낸 생물의 형태의 사진이다. 좌측은 불포화화효소 유전자를 도입한 담배를 저온처리한 결과를 우측은 대조로서 pBI121을 도입한 담배를 저온처리한 결과를 나타낸다.
(발명의 실시를 위한 최량의 형태)
본 발명에서 말하는9위 불포화화효소는 상기 종래의 기술등에 기재한 바와 같이 본래 남조에 존재하는 효소이다.9위 불포화화효소의 화학구조는 마우스(Kaestner, K. H. et al., J. Biol., Chem., 264:14755, 1989), 래트(Mihara, K. J. Biochem., 108:1022, 1990)및 효모(Stukey, J. E. et al., J. Biol. Chem., 265:20144, 1990)의 스테아로일-Co A 불포화화효소의 화학구조와 국부적으로 유사하나, 전체적으로는 크게 다르다. 또 기지의 남조의 지질에 결합한 지방산의6위 및12위의 불포화화효소 및 고등식물의 지질에 결합한 지방산의3위의 불포화화효소(Yadav, N. S. et al., Plant Physiol., 103:467, 1993)의 화학구조와는 전혀 유사하지 않다. 본 발명 유전자를 천연소재로부터 제조하는 경우에는 남조를 원재료로 하여 사용하면 좋다. 여기서 사용되는 남조는 특히 한정되지 않으며, 예를 들어 Anacystis속. Synechocysits속, Anabaena속 등에 속하는 람조를 들 수 있다. 또 이하의 이유에 의하여 고등식물의 포화분자종을 불포화함에는 Anacystis형(Murata, N. et al., Plant Cell Physiol., 33:933, 1992. 이 문헌에서 말하는 그룹 1형의 남조)의9위 불포화화효소쪽이 Anabaena형 및 Synechocystis형의 효소보다 바람직하다.
즉, Synechocystis PCC6803과 Arabaena variabilis에서는 그 막지질의 거의 모두가 sn-1과 sn-2에 각각 탄소수 18의 지방산(C18)과 탄소수 16의 지방산(C16)을 결합하고 있음(Sato, N. et al., Biochem, Biophys. Acta, 710:279,1982 ; Wada, H. et al., Plant Cell Physiol., 30:971, 1989)에 대해, Anacystis nidulans에서는 거의가 sn-1과 sn-2 다 같이 C16을 결합하고 있다 (Bishop, D. G. et al., Plant Cell Physiol.,27:1593, 1986). 따라서 Anabaena와 Synechocystis의9위 불포화화효소는 주로 18:0/16:0-의 분자종을 기질로 하여 sn-1의 18:0을 18:19에 불포화화하는 활성을 갖는 것으로 생각된다. 이에 대하여 Anacystis의9위 불포화화효소는 주로 16:0/16:0-의 분자종을 기질로 하여 Sn-1의 16:0을 16:19에 불포화화하는 활성을 갖는 것으로 생각된다. 또한 고등식물에 많이 볼 수 있는 포화분자종이 16:0/16:0-이므로 고등식물의 포화분자종을 불포화하기 위해서는 Anacystis형의9위 불포화화효소쪽이 Arabaena 및 Synechocystis형의 효소보다 적합하다.
본 발명 유전자는 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이 실질적으로 배열번호 4에 기재된 아미노산 배열을 갖는9위 불포화화효소를 코드하는 것을 포함하며, 축중 코돈(degeneracy codon)에서만 다르게 되어 있어, 동일한 폴리펩티드를 코드할 수 있는 축중이성체를 포함한다. 본 발명 유전자는 주로 DNA쇄로서의 구체적 형태를 갖는다. 또한 실질적으로 배열번호 4에 기재된 아미노산 배열이라 함은 배열번호 4에 기재된 아미노산 배열에 더하여9위 불포화화효소 활성을 가질 수 있고, 배열번호 4에 기재된 아미노산 배열의 일부에 결실, 치환, 부가등이 있어도 좋은 아미노산 배열을 포함하는 것이다.
본 발명 유전자는 상기 남조세포로부터 통상 공지의 방법을 사용하여 제조할 수가 있다.
즉 남조세포를 배양하여 집적하고, 이 남조세포로부터 에타놀 침전법등의 통상 공지의 방법에 의해 게놈 DNA를 제조하고, 이 게놈 DNA을 기초로 한 유전자 라이브러리를 제조하고 이 라이브러리로부터 소망하는 유전자를 함유한 클론을 선발하여, 이것을 증폭함으로써 제조할 수가 있다.
여기서 사용되는 유전자 라이브러리 작성용 벡터로서는 이 벡터로서 통상 사용되고 있는 것을 들 수가 있다. 구체적으로 λDASH II (Stratagene)등의 파지(phage) ; pWE15(Stratagene)등의 코스미드 (cosmid) ; pBluescript II (Stratagene)등의 파지미드등을 들 수가 있다. 상기 벡터에 대한 구체적인 유전자 도입방법은 각각의 벡터에 따라서 통상 공지의 방법을 사용할 수가 있다.
이렇게 하여 제조한 유전자 라이브러리로부터 본 발명 유전자가 도입된 클론을 선발한다.
그 선발방법으로서는 통상 공지의 선발방법, 예를 들어 항체에 의한 플렉 하이브리다이제이션법 (plaque hybridization method) 또는 콜로니 하이브리다이제이션법 (colony hybridization method)등의 면역학적 방법 또는 누클레오티드 프로브에 의한 플랙 하이브리다이제이션법 또는 콜로니 하이브리다이제이션법등을 사용할 수가 있다. 또한 상기 누클레오티드 프로브의 선택기준으로서 본 발명 유전자에 유사하다고 추측되는 염기배열의 일부(예를 들어 제1도의 MSCD2의 아미노산 배열번호 260~295의 일부를 염기배열로 판독변경한 것)를 프로브로서 사용하는 것이 바람직하다.
이렇게 하여 선발한 클론에서의 본 발명 유전자의 염기 배열의 결정 및 확인은 통상 공지의 방법을 사용하여 할 수가 있다. 예를 들어 막삼 길버트법 (Maxam- Gilbert, Methods Enzymol., 65:499, 1980)이나 M13 파지를 사용하는 디데옥시 누클레오티드쇄 종결법 (Messing, J. et al., Gene, 19:269, 1982)등에 의해 할 수가 있다.
또한9위 불포화화효소가 실제로 발현하고 있는가의 여부의 확인은, 예를 들어 와다등의 방법(J. Bacteriol., 175:6056, 1993)에 따라 할 수가 있다.
상기와 같이 하여 염기배열이 결정된 본 발명 유전자는 통상 공지의 수단, 예를 들어 포스파이트법을 사용한 시판의 DNA 신세사이저로 합성할 수도 있다.
본 발명 유전자 또는 본 발명 유전자의 일부를 함유하고9위 불포화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리누클레오티드를 상기 클론으로부터 분리하고, 이것을 식물체 유전자 도입용 벡터에 조입, 이 벡터를 식물세포에 도입하여9위 불포화화효소를 식물체중에서 발현시킴으로써 소망하는 식물에 저온내성을 부여할 수가 있다.
그리고 상기의 유전자 도입이 가능한 식물의 종류에 대한 특별한 제한은 없다.
여기서 말하는 유전자 도입용 벡터는9위 불포화화효소 유전자가 식물체중에서 안정하게 발현할 수 있도록 구성함이 필요하다. 구체적으로는 포로모터, 번역조절영역을 코드하는 DNA쇄, 엽록체로의 전이 펩티드를 코드하는 DNA쇄, 본 발명 유전자 또는 본 발명 유전자의 일부를 함유하고9위 불포화 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리누클레오티드, 번역종지 코돈을 코드하는 DNA쇄 및 터미네이터가 적절한 위치관계로 조입되어 있을 것이 필요하다. 또한 본 발명 유전자 이외의 유전자 도입용 벡터의 구성요소로서는 통상 공지의 것을 사용할 수가 있다. 상기 엽록체로의 전이 펩티드를 코드하는 DNA쇄로서는, 예를 들어 엔도의 리불로스-1, 5-2인산 카르복실라제의 소서브유닛 유전자를 그 전이 펩티드를 코드하는 DNA쇄로서 적절히 사용할 수가 있다. 프로모터로서는, 예를 들어 콜리플라우워 모자익 바이러스의 35S 프로모터를, 또 터미네이터로서는, 예를 들어 노파린 합성효소의 터미네이터를 사용할 수가 있다.
식물세포에 대한 유전자 도입방법으로서는 통상 공지의 방법, 예를 들어 「Plant genetic transformation and gene expression : a laboratory manual Draper. J. et al., Blackwell Scientific Publications. 1988」기재의 방법을 사용하여 실시할 수가 있다. 그 예로서는 생물학적 방법인 바이러스를 사용하는 방법, 아그로박테륨을 사용하는 방법등, 물리ㆍ화학적 방법인 일렉트로포레이션법, 폴리에틸렌클리콜법, 마이크로인젝션등을 들 수 있다. 이들중에서 담배를 비롯한 쌍자엽식물에 대해서는 안정한 형질전환을 확실히 할 수 있는 점에서 아그로박테륨을 사용하는 방법이 바람직하다. 아그로박테륨을 사용하는 방법에는 야생형 종양 플라스미드를 사용하는 중간 벡터법(Nature, 287 (1980), p.654;Cell, 32 (1983) p.1033 ; EMBO J., 3 (1984) p. 1525), TDNA상의 종양형성 유전자영역을 결손시킨 벡터를 이용하는 중간 벡터법 (EMBO J., 2 (1983) p.2143 ; Bio/Technology, 3 (1985) p.629), 바이너리 벡터법 (Bio/Technology, 1 (1983) p.262 ; Nature, 303 (1983) p. 179 ; Nucl. Acids Res., 12 (1984) p. 8711)등이 있으며, 이들중 어느 방법을 사용하여도 좋다. 아그로박테륨을 식물에 감염시키는 방법으로서는 배양세포의 직접접종법, 프로토플라스트 공존배양법, 리프디스크법등을 들 수 있으나, 직접적이고 용이하게 다수의 형질전환 식물체를 작성할 수 있는 점에서 리프디스크법을 사용하는 것이 바람직하다.
또한 식물체를 재분화시키기 위해서는 MS-HF 배지등의 공지의 배지에 선택용의 항생물질이나 식물생장 호르몬등을 첨가한 배지에서 배양하면 된다. 발근한 어린 식물체를 토양에 이식하여 재배하면 완전한 식물체로까지 성장시킬 수가 있다.
완전한 식물체로까지 성장시킨 형질전환식물이 저온내성을 가지고 있는가의 여부에 대해서는 하기와 같이 해서 검토할 수가 있다.
저온상해를 받지 않는 온도(예컨대 25℃)에서 검정식물을 재배한 후, 일시적으로 (예컨대 1주간) 저온하(예컨대 4℃)에서 재배하고 식물의 상해, 예를 들어 잎의 백화 (chlorosis)나 인성의 저하를 측정하거나, 저온하에서의 생장량을 대조식물과 비교함으로써 검토할 수 있다.
이하 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하거니와, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
Anabaena variabilis의12위 불포화화효소 유전자 (des A)의 상류에 인접하고 있는 오픈 리딩 프레임의 DNA 단편의 클로닝
Anabaena variabilis IAM M-3(일본국 도꾜대학 분자세포 생물학 연구소로부터 분양)를 약 100ml의 BG-11 배지 (Plant Molecular Biology, Shaw, C. H. ed., p.279, IRL PRESS, 1988)에서 배양하였다. 25℃, 1,000lux의 형광등하에서 매분 120회 진탕하여 충분히 생육시켰다. 배양액을 실온에서 5,000g로 하여 10분간 원심분리함으로써 균체를 침전물로서 회수하였다.
게놈DNA를 제조하게 위해서 균체를 50ml의 A액(50mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0)에 현탁하여 세정하고, 원심분리함으로써 균체를 침전물로서 회수하였다. 다음에 15ml의 B액(50mM Tris-HCl, 20mM EDTA, 50mM NaCl, 0.25 M sucrose, pH8.0)에 현탁하고, B액으로 용해한 40mg의 리조짐(Sigma)을 가하여 37℃에서 1시간 진탕하였다. 다음에 프로테나제 K 15mg와 SDS를 마지막 농도가 1%가 되도록 가하여 37℃에서 하루밤 진탕하였다.
그 후에 NaClO4를 마지막 농도가 1M이 되도록 가하고, 다시 20ml의 클로로포름/ 이소아밀알콜 (24:1)을 가하여 10분간 진탕한 후, 원심분리에 의해 수층을 회수하였다. 클로로포름/ 이소아밀알콜(24:1)로 재추출한 후, 수층에 50ml의 에타놀을 가하여 게놈 DNA 제조물을 유리봉에 감아서 회수하였다. 이 DNA 제조물을 20ml의 A액에 녹여서, NaCl을 마지막 농도가 0.1M가 되도록 하고, 다시 RNase를 마지막 농도가 50mg/ml가 되도록 가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 다음에 A액으로 포화된 등량의 페놀로 2회추출한 후, 수층중의 게놈 DNA를 에타놀을 가함으로써 침전물로서 회수하고, 70% 에타놀로 세정후, 1ml의 A액에 녹여서 Anabaena variabilis의 게놈 DNA 용액으로 하였다.
사까모도등은 Anabaena variabilis 유래의 막지질에 결합한 지방산의12위 불포화화효소 유전자의 클로닝에 대해 발표 (1993년 일본식물생리학회 연회, 강연요지집, NO. 3aF04)하였을 때,12위 불포화화효소 유전자의 상류에 인접하여 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 존재하고, 이것이 불포화화효소와 어떠한 관계를 갖는 가능성을 보고하였으나, 그 기능은 동정되어 있지 않았다. 본 발명자들은 그 ORF 및 기능에 관심을 가지고, 그 ORF의 DNA쇄중의 3개소의 염기배열에 주목하여, 4개의 프라이머(배열번호 5~ 배열번호 8)를 합성하여 Anabaena variabilis의 게놈 DNA를 주형으로서 PCR을 하였다.
상기 4개의 프라이머중에서 배열번호 5와 6으로 나타낸 염기배열을 갖는 프라이머가 센스쇄, 배열번호 7과 8에 나타낸 염기배열을 갖는 프라이머가 안티센스쇄를 코드하고, 배열번호 6과 7에 나타낸 염기배열은 동일한 아미노산 배열에 유래하고 있다. 센스쇄 및 안티센스쇄로부터 각각 임의로 1종류씩의 프라이머를 선택하여, 계 4종류의 프라이머의 조합으로 PCR를 하였다. 반응은 100μl의 반응액중에 프라이머를 각 20μM, Anabaena variabilis의 게놈 DNA를 1μg 넣고, GeneAmp PCR Kit (다까라 슈조)를 사용하여 실시하였다. 반응의 온도제어는 95℃ (1분), 45℃(1분), 72℃(2분)을 1사이클로 하여 35사이클 실시하였다. 단 1사이클째의 95℃는 3분간으로 하였다. 반응 종료후, 반응액 10μl를 2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 합성된 DNA를 분리하여 분석하였다. 그 결과, 배열번호 6과 8에 나타낸 염기배열을 갖는 프라이머의 조합으로 합성된 DNA중에 예상되는 크기 (약 190bp)의 DNA 단편이 주요한 밴드로서 검출되었다. 이 DNA(이하 des 9 var라 한다) 단편의 양 말단을 Klenow 프래그먼트로 평활화한 후, 플라스미드 pTZ18R(Pharmacia)의 sma I부위에 클로닝하고, 형광 DNA 시켄서 (Applied Biosystems)를 사용하여 염기배열을 결정하였다. 얻어진 염기배열을 배열번호 1로 나타낸다. 이 염기배열로부터 추정되는 아미노산 배열 (배열번호 2)은 마우스의 스테아로일 -Co A 불포화화효소와 유의한 상동성을 나타내었다[제1도 : des 9 var 단편이 코드하는 아미노산 배열과 마우스의 스테아로일 -Co A 불포화화효소 (MSCD2)의 아미노산 배열의 비교를 나타낸다].
다음에 des 9 var 단편을 프로브로 하여 Anacystis nidulans의 게놈 DNA를 사던분석하였다. 제한효소 Xho I, Pst I 및 BamH I 의 각각을 단독으로 사용하여 약 0.1μg의 Anacystis nidulans의 게놈 DNA를 절단하고, 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리후, 나일론 멤브레인 (Hybond-N+; Amersham)에 브로팅하였다. 프로브 DNA는 Multiprime DNA labelling Kit (Amersham)를 사용하여 [-32P] dCTP로 표시하였다. 6×SSPE[1×SSPE는 10mM 인산완충액 (pH7.0), 1mM EDTA, 0.15 NaCl], 0.2% SDS 및 100μg/ml 청어정자 DNA로 된 액중에서 55℃, 16시간 인큐베이션하여 프로브 DNA와 멤브레인을 반응시켰다. 그후에 멤브레인을 2×SSC [1×SSC는 0.15M NaCl, 15mM 구연산 나트륨]중에서 실온, 15분을 2회, 이어서 0.1×SSC중에서 40℃, 15분을 2회 진탕하여 씻고 오토래디오그래피를 하였다. 그 결과, 어떠한 제한효소로 절단한 경우에도 1개의 DNA 단편만이 검출되었다 (제 2도 : 도면중에서 Non은 게놈 DNA를 제한효소로 절단하고 있지 않음을 나타낸다)
[실시예 2]
des 9 var 단편과 상동성이 높은 Anacystis nidulans 게놈중의 DNA쇄의 클로닝
Anacystis nidulans R2-SPc (도꾜대학 분자세포 생물학 연구소로부터 분양)의 배양 및 게놈 DNA의 제조는 Anabaena variabilils의 경우와 마찬가지로 하였다. 약 100μg의 게놈 DNA를 Sau 3AI로 부분 소화한 후, Molecular Cloning 2nd edition, pp. 2.85-2.87 (Sambrook, J. et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)의 방법에 따라 자당밀도 구배하에서의 초원심분리에 의해 약 9~23kbp의 DNA 단편을 회수하였다. 이것을 BamH I와 HindIII로 절단한 람다파지 벡터 λDASH II (Stratagene)으로 클로닝한 후, 파지입자로 패키징하여 Anacystis nidulans의 게놈 DNA 라이브러리를 얻었다. 이 파지 라이브러리를 대장균 P2392에 감염시켜서, NZYM 배지를 넣은 직경 약 15cm의 페트리 디쉬에 도말하여 총수 약 10만개의 플랙을 형성시킨후, 나일론 멤브레인 (Hybond-N+; Amersham)에 블로팅하였다.
상기의 사던분석과 마찬가지로 [-32P] dCTP로 표지한 des 9 var 단편을 이 멤브레인과 반응시켜서 오토래디오그래피에 의해 검출한 양성 파지를 재차 마찬가지로 스크링함으로써 시그널강도가 다른 약 30개의 파지클론을 얻었다. 이중에서 임의로 12클론을 선택하여 상법에 따라 파지 DNA를 얻었다. 얻어진 파지 DNA를 수종류의 제한효소로 절단하여 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리후, 나일론 멤브레인에 블로팅하였다. 이 멤브레인을 상기의 스크리닝과 마찬가지 조건으로 사던분석하여 프로브 DNA와 하이브리다이즈하는 DNA 단편의 길이와 그 시그널강도를 비교하였다. 그 결과, λ5와 λ15의 2클론이 가장 강한 시그널을 나타내고, 또 인서트 DNA 단편의 길이도 각각 11 및 15kbp이었기 때문에 목적하는 ORF 전체를 포함하기에 충분하다고 판단하고, 이 2클론의 인서트 DNA에 대해 다시 몇개의 제한 효소로 절단하여 사던분석을 하였다. 그 결과, Xho I로 절단하여 하이브리다이즈하면 2클론이 다같이 약 5kbp의 DNA 단편이 검출되었으므로, 이것을 pBluescript SK- (Stratagene)의 Xho I 사이트로 서브클로닝하여 λ5와 λ15 유래의 DNA 단편을 각각 함유한 플라스미드 p5X와 p15X를 얻었다. p5X와 p15X의 상세한 제한효소지도를 만들어 비교하였던 바, 다같이 동일한 게놈 DNA 단편을 포함한다고 판단되었다 [제 3도 : λ5, λ15 및 p15X의 인서트 DNA 단편의 상호관계를 나타낸다. 그물을 친 장방형은 스크리닝의 과정에서 프로브의 des 9 var 단편이 하이브리다이즈한 DNA 단편을 나타낸다. 굵은 화살표는 des 9 nid (후술)의 영역과 센스쇄의 방향을 나타낸다. 가는 화살표는 des 9 nid를 포함한 영역의 시켄스의 방향을 나타낸다. 5, 1.25 및 0.5kbp의 각 바는 좌측의 각 도면에서의 사이즈 마커를 나타낸다. 제한효소의 약호는 B, BamHI ; H, HindII ; N, NotI ; Hp, HpaI ; RI, EcoRI ; RV, Eco V ; S, Sall ; P, PstI ; X, XhoI를 나타낸다].
따라서 제한효소 또는 ExoIII에 의한 딜리션 플라스미드를 p15X로부터 작성하여 des 9 var 단편이 하이브리다이스하는 영역을 포함한 약 2kbp의 DNA 단편이 염기배열을 형광DNA시켄서를 사용하여 결정하였다(제3도). 그 결과, 그 DNA 단편중에는 834bp로 된 ORF (des 9 nid)가 존재하고 (배열번호 3), 278잔기의 아미노산이 코드되어 있는 것으로 추정되었다 (배열번호 4). 먼저 클로닝한 Anabaena variabilis 유래의 des 9 var 단편이 코드하고 있는 아미노산 배열(배열번호 2)과의 상동성은 약 80%이었다. 또한 핵산 및 아미노산 배열의 해석 소프트웨어 (GENETYX : 소프트웨어 개발)와 핵산 및 아미노산 배열의 데이터베이스 (EMBL 및 DDBJ)를 사용하여 상동성이 높은 아미노산 배열의 검색을 하였던 바, 마우스의 스테아로일-Co A 불포화화효소와의 상동성이 전체로는 30%이나 국소적으로 대단히 높기 [제4도 : des 9 nid와 마우스의 스테아로일-Co A 불포화화효소 (MSCD2)의 아미노산 배열의 비교]때문에, 취득한 des 9 nid는 지방산을 불포화화하는 효소를 코드함이 강하게 시사되었다.
[실시예 3]
des 9 nid 유전자의 대장균에서의 발현에 의한 활성 측정
Anacystis nidulans는 불포화화효소로서 지질에 결합한 포화지방산의 9위를 불포화화하는9위 불포화화효소 활성밖에 갖지 않기 (Bishop, D. G. et al., Plant Cell Physiol., 27:1593, 1986)때문에, des 9 nid가 코드하는 폴리펩티드를 대장균에서 발현시켜서 활성 측정함을 시도하였다.
p15X로부터 직접 발현시키기는 곤란하므로 대장균에서의 발현용의 벡터를 작성하였다. 즉 벡터로서 pET3a (Novagen)를 사용하고, 그 Ndel와 BamHI 사이에 des 9 nid를 아미노 말단에 여분의 아미노산을 붙이지 않도록 하여 클로닝을 하기와 같이 하였다. des 9 nid가 코드하는 단백질의 C말단측 직후에 BamHI 사이트를 넣기 위하여 C말단을 끼우는 2개소의 염기배열을 사용하여 PCR 반응을 시켰다.
즉 센스 프라이머 ;(밑줄은 PstI 사이트) (배열번호 9)
안타센스 프라이머 ;AGACG(1중선은 BamHI 사이트, 2중선은 스톱 코돈) (배열번호 10)
p15X를 주형으로 하여 상기 2개의 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 시키면 약 140bp의 산물이 얻어지고, 이것을 pUC19의 SmtI 부위에 서브클로닝하여 염기배열에 틀림이 없다는 것을 확인하였다. 이 결과 얻어진 플라스미드의 BamHI의 하류에는 EcoRI 부위가 생겼다. 이 EcoRI와 PstI로 순차로 절단하고, 한편 p15X도 같은 제한효소로 절단함으로써 스톱 코돈의 직후에 BamHI 부위를 도입하였다. 이 플라스미드를 Sa1I로 절단한 후, 4종의 dNTP 존재하에서 DNA 폴리메라제 Klenow 단편을 사용하여 Filll in 반응을 하고, 이어서 HindIII로 절단하였다. 이것에다 하기 2종의 합성 DNA으로 된 어댑터를 도입함으로써 아미노산 말단측에 NdeI 부위를 도입하였다. 즉(밑줄은 NdeI) (배열번호 11) 및
(1중선은 NdeI 사이트 2중선은 HindIII의 일부) (배열번호 12)를 등 몰량 혼합하여 어댑터로 하였다. 이상과 같이 하여 생긴 플라스미드 (pDes9Nde)를 상법 (Molecular cloning pp. 250~251 ; 1982)에 따라 조정한 대장균주 BL21 (DE3) (Novagen)의 콤피턴트 셀에 도입하여 암피실린 내성에 의한 선별로 형질전환주 BLDES 1를 얻었다.
BLDES 1 및 pET3a만을 갖는 BL21주 (BL1)를 100ml의 M9 배지 (200μg/ml의 암피실린, 4mg/ml 글루코스, 10μM FcCl3, 0.5μg/ml 비타민 B1, 1mg/ml 가자미노산을 함유한다)에 접종하고, 37℃에서 배양하였다. 배양액의 탁도가 파장 600nm에서 0.5 O.D.가 될 때까지 배양을 계속한 후에, 이소프로필티오가락시드(IPTG)를 최종농도 1mM가 되도록 가하였다. 다시 1시간 배양하여,9위 불포화화효소 유전자의 발현을 유도하였다. 회수한 대장균 펠릿을 1.2% NaCl로 씻은 후, 지질을 추출하였다. 지질은 Bligh와 Dyer의 방법 (Can J. Biochem. Physiol., 37:911, 1959)에 따라 추출하고, 2.5ml의 5% 염산 메타놀로 완전 밀봉화하여 85℃, 2시간 반응시켜서 지방산을 메틸화하였다. 생성된 지방산메틸 에스테르를 2.5ml의 헥산으로 4회 추출하고, 질소가스로 용매를 제거하여 농축하였다. 지방산메틸 에스테르의 분석에는 가스크로마토그래피를 사용하였다. 지방산의 동정은 표준지방산 메틸과의 보존시간을 비교하여 실시하였다. 정량에는 크로마토 팩 C-R7A plus (시마즈 세이사꾸쇼)를 사용하였다. 결과를 하기 제1표에 나타낸다.
대장균의 지방산 조성
[표 1]
여기에서 시간은 IPTG에 의한 단백의 유도시간을 나타낸다.
BLDES 1에서는 16:1이 증가하고 있는 것이 명백하다. 즉 본 유전자는 16:0으로의 불포화 활성을 가짐을 나타내었다.
또 이들 균주를 0.1mM의 스테아린산을 함유한 M9 배지에서 배양해서 마찬가지로 비교하였던 바, BL1주에 비해 BLDES1에선 16:1뿐만 아니라 18:1(9)도 생성하여 des 9 nid가 코드하는 폴리펩티드는 16:0뿐만 아니라 18:0도 기질로서 불포화지방산을 만듬을 나타내었다.
[실시예 4]
des 9 nid 유전자의 담배 식물체에 도입 Anacystis nidulans 유래의 des 9 nid 유전자를 다음과 같이 해서 담배에 도입하였다.
(1) 식물 발현용 벡터 플라스미드의 구축
pDes9Nde를 SacI와 SaII로 절단함으로써 양 효소의 절단부위에 끼워진 des 9 nid 유전자 단편이 얻어진다. 한편 엔도의 RuBisCO 유전자를 함유한 클론 pSNIP9(Schreicher등, EMBO J. 4,25(1985))으로부터 엽록체로의 transit 배열을 HindIII와 SphI로 절단하고, 그것과 동일한 제한효소로 절단한 pUC118로 클로닝함으로써 transit 배열의 하류에 멀티클로닝 사이트를 갖는 플라스미드(pTRA3)를 얻었다. 이 HindIII 사이트를 절단 후, Klenow 효소로 Fill in하여 XbaI 링커를 넣었다(pTRA3X). 이 플라스미드 pTRA3X를 Sal I와 Sac I로 절단하고, 먼저 동일한 제한효소로 절단하여 얻은 des 9 nid 유전자 단편을 삽입하였다(pTRA3Xdes9). 이 플라스미드에서는 RuBisCO의 tranit 배열에 뒤이어, 그것과 동일한 판독틀로 des 9 nid 유전자가 번역된다. 이것을 Sac I와 Xba I로 절단하고 다음에 설명하는 식물용의 벡터에 삽입한다. 식물 발현형 바이너리 플라스미드 pBI121(Clonetech)를 제한효소 Sac I와 Xba I로 절단하여 얻은 플라스미드 pBI(-GUS)는-Glucuronidase 유전자(GUS 유전자)를 함유하고 있지 않으며, 이것에 콜리플라우워 모자익 바이러스의 35S 프로모터와 노팔린 합성효소(NOS) 터미네이터 사이에 상술한 도입유전자를 삽입함으로써 식물 도입용 벡터 (pBI121(-GUS)Rbsc-des9)를 얻었다.
(2) pBI121(-GUS)Rbsc-des9의 아그로박테륨에 도입
Agrobacterium tumefaciens LBA4404(Clonetech)를 50ml의 YEB 배지 (1ℓ당 비프엑기스 5, 효모엑기스 1g, 펩톤 1g, 자당 5g, 2mM MgS04(pH7.4))에 접종하고, 28℃에서 24시간 배양후, 배양액을 3,000rpm, 4℃, 20분의 원심분리로 집균하였다. 균체를 10ml의 1mM Hepes-KOH(pH7.4)로 3회 씻은 후, 3ml의 10% 글리세롤로 1회 씻고, 최종적으로 3ml의 10% 글리세롤에 현탁하여 DNA 도입용의 아그로박테륨으로 하였다.
이렇게 하여 얻은 균액 10μl 및 상기의 플라스미드 pBI121(-GUS)Rbsc-des9 1μg을 큐벳에 넣고, 일렉트로포레이션장치(Gene Pulser ; BioRad)를 사용하여 25μF, 2500V, 200의 조건으로 전기 펄스를 걸어서, 플라스미드 DNA를 아그로박테륨에 도입하였다. 이 균액을 에펜도르프 튜브에 옮기고, 800μl의 SOC 배지 (1ℓ당 트립톤 20g, 효모엑기스5g, NaCl 0.5g, 2.5mM KCl, 10mM MgSO4, 10mM MgCl2, 20mM 글루코스, pH7.0)를 가하여, 28℃에서 1.5시간 정치 배양하였다. 이 배양액 50μl를 100ppm의 카나마이신을 함유한 YEB 한천배지(한천 1.2%)상에 뿌리고, 28℃에서 2일간 배양하였다.
얻어진 콜로니로부터 싱글 콜로니를 선택하고, 이 콜로니로부터 알칼리법으로 플라스미드 DNA를 조정하였다. 이 플라스미드 DNA를 적당한 제한효소로 소화후, 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분리하고, 32P로 라벨한 des 9 nid 유전자 단편을 프로브한 사던분석에 의해, 플라스미드 pBI121 (-GUS)Rbsc-des9를 함유하고 있음을 확인하였다. 이 Agrobacterium tumefaciens를 ALBBSDES라 부른다.
(3) 담배의 형질전환
상기의 균주 ALBBSDES를 50ppm의 카나마이신을 함유한 LB액체배지로 28℃, 2일간 진탕 배양하였다. 배양액 1.5ml를 10,000rpm, 3분간 원심분리하여 집균후, 카나마이신을 제거하기 위해 1ml의 LB 배지로 세정하였다. 다시 10,000rpm, 3분간 원심분리하여 집균후, 1.5ml의 LB 배지에 재현탁하여 감염용 균액으로 하였다.
담배로의 감염시에는 어린 잎을 채취하여 0.5% 차아염소산 나트륨 수용액에 10분간 침지시킨 후, 멸균수로 3회 씻어서, 멸균이 끝난 여지상에서 물을 닦아서 감염용의 잎으로 하였다. 이 잎을 1편이 1㎠가 되도록 메스로 무균적으로 절단해서 상기 아그로박테륨의 균액상에 잎의 배면을 위로 해서 놓고, 2분간 조용히 진탕한 후, 멸균이 끝난 여지상에 잎을 놓고 과잉의 아그로박테륨을 제거하였다. 페트리 디쉬내의 MS-B5 배지 (벤질아데닌 1.0ppm, 나프탈렌초산0.1ppm,및 한천 0.8%를 함유한다) (Murashige, T. and Skoog, F. Plant Physiol., 15:473, (1962)상에 와트만 NO. 1 여지(φ7.0)를 놓고, 이 여지에 배면을 위로 해서 잎을 놓았다. 페트리 디쉬를 파라필름으로 밀봉하고, 16시간 밝고, 8시간 어두운 주기로 25℃, 2일간 배양하였다. 이어서 클라포란 250ppm을 함유한 MS-B5 배지에 옮기고, 마찬가지로 10일간 배양하여 아그로박테륨을 제거하였다. 다시 클라포란 250ppm을 카나마이신 100ppm을 함유한 MS-B5 배지상에 치상하고, 마찬가지로 7일간 배양하였다. 그 동안에 옆편의 주위가 칼루스화하고, 새 싹 (shoot) 원기가 생겼다. 다시 10일간 배양후, 신장한 새싹을 클라포란 250ppm 및 카나마이신 100ppm을 함유한 MS-HF 배지(벤질아데닌 및 나프탈렌초산을 함유하지 않는 MS-B5 배지)에 치상하였다. 10일간 배양후, 발근한 새싹을 카나마이신 내성의 형질전환체로 하여, 플랜트 박스내의 클라포란 250ppm을 함유한 MS-HF 배지에 이식하였다.
[실시예 5]
형질전환 담배의 게놈 사던 및 노사던분석 목적 유전자의 도입을 확인하기 위하여 카나마이신 내성의 담배로부터 DNA를 추출하여, 사던 및 노사던분석을 하였다. 게놈 DNA의 추출법은 CTAB법으로 성서(Rogers, S. O. ＆ Bendich, A. J. ; Plant Molecular Biology Manual A6 ; 1(1988)에 따라 실시하였다. 즉 2g의 담배 잎을 액체질소내에서 분쇄하여,CTAB추출 완충액으로 게놈 DNA를 얻었다. 10μg의 DNA를 제한효소 EcoRI와 XbaI로 절단후 0.7% 아가로스 겔로 전기영동하고, 그 후 나일론막(Hybond N+; Amersham)에 0.4 N NaOH로 전사하였다. 이 막에 pTRA3Xdes9으로부터 transit 부착의 불포화화효소 유전자를 프로브로 하여, 65℃에서 16시간 하이브리다이제이션함으로써 목적 유전자가 담배게놈에 내포되어 있는 것을 확인하였다.
또 도입 유전자의 발현을 조사하기 위하여 담배 잎 약 2g로부터 RNA을 분석하였다. 방법은 구아니듐티오시안산에 의한 추출을 하여 (Nagy, F.등 : Plant Molecular Biology Manual B4 ; 1 (1988)), ploy(A)+RNA를 포름알데히드가 들어있는 아가로스 겔로 전기영동후, 나일론막(Hybond N ; Amersham)에 전사하고, 사던법과 마찬가지의 하이브리다이제이션에 의해 분석하였다. 여러가지 양의 RNA를 발현하고 있는 개체가 있었으나, 그 중에서 발현량이 많은 개체에 대해 지질분석을 하였다.
[실시예 6]
형질전환 담배의 지질의 지방산분석
실시예 5에서 RNA의 고 발현이 확인된 담배 형질전환체, 및 대조로서 pBI121로 형질전환한 담배 잎으로부터 하기의 방법에 의해 포스퍼타딜 글리세롤 (PG), 설포키노보실디아실 글리세롤 (SQDG)등의 지질을 조정하고, 그 지방산 조성을 분석하였다. 또한 일부의 개체로부터는 뿌리의 지질도 분석하였다.
(1) 전 지질의 추출
지질의 추출은 Bligh-Dyer법(Can J. Biochem. Physio1., 37:911, 1959)으로 하였다. 습중량 2g의 잎(일부의 뿌리를 시료로 할 때는 1g)을 메스로 세단하고, 이것에 20ml의 클로로포름 : 메타놀 (1:2,체적비)을 가하여, 호모지나이저로 잎을 파쇄후, 15분간 정치하였다. 이것에 클로로포름 12ml 및 증류수 12ml를 가하여 과격하게 혼합한 후, 3000rpm, 4℃, 30분간의 원심으로 수층과 유기층의 2층으로 나누어, 유기층(하층)을 회수하였다. 이것에 적당량의 에타놀을 가하고, 회전식 증발기를 사용하여 30℃, 감압하에서 용매를 제거하였다. 이것을 2ml의 클로로포름: 메타놀(1:4, 체적비)에 녹여서 전 지질 추출물로 하였다. 이 일부를 5% 메타놀성 염산을 사용하여 후술하는 방법에 의해 처리함으로써 메틸화 지방산을 얻었다.
(2) 지질의 분획
DEAE-Toyopearl 650C(도소)의 현탁액 2.5ml를 1M 초산나트륨 수용액(pH7.0)25ml와 섞어서 초산형으로 하였다. 이것을 증류수, 메타놀로 순차로 세정하고, 마지막으로 메타놀에 현탁하여, 내경 2cm의 컬럼에 높이 1.5cm까지 채워 넣고, 다시 50ml의 클로로포름:메타놀 (1:4, 체적비)로 세정하였다.
다음에 전 지질 추출물을 커럼에 걸어 50ml의 클로로포름 : 메타놀(1:4, 체적비)로 모노가락토실디아실글리세롤(MGDG), 디가락토실디아실글리세롤(DGDG), 포스파티딜에타놀아민(PE), 포스파티딜콜린(PC)을 용출하여, 중성지질(MGDG, DGDG, PE, PC) 획분으로 하였다. 다음에 5ml의 초산으로 포스파티딜세린(PS)을 용출하여 제거하고, 20ml의 클로로포름 : 메타놀 (1:4, 체적비)로 초산을 세정한 후, 50ml의 클로로포름 : 메타놀 : 10M 초산암모늄 수용액(20:80:0.2, 체적비)로 PG, SQDG, 포스파티딜이노시톨 (PI)을 함유한 획분을 얻었다. 이 획분에 15ml의 에타놀을 가하고, 감압하에서 용매를 제거하였다. 이것을 0.2ml의 클로로포름 : 메타놀 (2:1, 체적비)에 녹여서 산성 지질(PG, SQDG, PI) 획분으로 하였다.
MGDG, DGDG, PE, PC 획분은 규산컬럼 크로마토그래피(이아트로비즈, 야트론사)에 의해 다시 분획하였다. 즉 클로로포름 1ml에 녹인 시료를 클로로포름으로 평형화한 컬럼에 걸어 클로로포름 : 아세톤 (4:1), 아세톤, 메타놀순으로 용출하면, 당지질(MGDG, DGDG)은 아세톤으로, 인지질(PC, PE)은 메타놀로 용출되었다.
(3) 박층 크로마토그래피(TLC)에 의한 PG의 단리정제와 지방산 분석
(2)에서 얻은 획분을 실리카겔-TLC 플레이트 ＃5721(Merck)로 분리하였다. 전개용매로서는 산성 지질의 경우에는 클로로포름 : 아세톤 : 메타놀 : 초산 : 물 (50 : 20 : 10 : 15 : 5, 체적비)을, 중성 지질의 경우에는 클로로포름 : 메타놀 : 물 (70:21: 3, 체적비)을 사용하였다. TLC로 분리후, 프림인(80% 아세톤 용액)을 분무하여 자외선광하에서 형광발색시켜서, 표준이 되는 지질과 이동도를 비교함으로써 각 클래스의 지질의 획분을 추정하고, 발색한 지질을 실리카겔과 함께 갉아내어 나사꼭지 부착 시험관에 넣었다. 이 지방산 조성을 추정할 경우에는, 이 시험관에 3ml의 메타놀성 5% 염산을 가하고 완전 밀봉하, 85℃에서 2시간반 반응시켜서 지방산 메틸화하였다. 한편 sn-1, 2마다의 지방산 조성을 결정하기 위해서 갉아낸 실리카겔로부터 5ml의 클로로포름 : 메타놀 (2:1) 혼액으로 지질을 회수하여 건고한 후, 1ml의 50mM TrisCl (pH7.2) 및 0.05% Triton X-100을 가하여 과격하게 교반하여 지질을 분산시키고, 리조퍼스 델레마 (Rhizopus delemar) 유래의 리파제 (2500U ; 베링거사)를 가하여 37℃에서 30분간 보온함으로써 선택적으로 sn-1위의 지방산을 분해시켰다. 이 반응산물을 농축후, TLC (클로로포름 : 아세톤 : 메타놀 : 초산 : 물 = 10 : 4 : 2 : 3 : 1)에 의해 미반응의 지질, 리조체, 및 지방산으로 분리하였다. 이것들도 겔로부터 회수하여 상술한 바와 같이 메타놀성 염산으로 메틸화 지방산을 얻었다. 생성한 지방산 메틸 에스테르를 3ml의 헥산으로 4회 추출하고, 감압하에서 용매를 제거하여 농축하였다. 지방산 메틸의 분석에는 가스 크로마토그래피를 사용하였다. 지방산의 동정은 표준 지방산 메틸과의 보존시간을 비교하여 실시하였다. 정량에는 크로마토 팩 C-R7A plus (시마즈세이사꾸쇼)를 사용하였다. 전 지질의 결과를 제 2표에, PG에 대해서 제 3표에, 기타의 대표적인 지질의 분석결과를 제 4표에 나타낸다. 표는 대조 식물체에 대해서는 2개체, 형질전환체에 대해서는 독립한 2 또는 3개체의 분석치의 평균치를 나타내고 있다.
잎의 전지질의 지방산 분석결과
[표 2]
PG의 지방산 분석결과
[표 3]
기타 지질의 지방산 분석결과
[표 4]
PG에 결합한 지방산분석의 결과로부터 Anacystis nidulans 유래의 지방산 불포화화효소를 발현하고 있는 형질전환 담배에서는 16 : 0(팔미틴산)이 대폭적으로 감소하고, 그 대신에 16 : 1 cis가 증가하고 있으며, 또한 소량 있었던 18 : 0도 거의 없어지고, 반대로 18 : 1이 증가하고 있는 것이 판명되었다. 그 결과, 포화지방산(16 : 0+16 : 1 trans+18:0(스테아린산)) 함량은 대조의 담배에서는 70%인데 비하여 불포화화효소의 유전자를 형질전환한 담배에서는 55%가 되어 현저히 낮게 되어 있다. PG의 sn-1, 2위별의 분석결과로부터 sn-2는 98% 이상 불포화지방산(16 : 0 또는 16 : 1 trans)으로 점유되어 있으며, 새로 유전자 도입에 의해 생성한 16 : 1은 모두 sn-1에 있는 것이 판명되었다. 따라서 이 불포화화효소 유전자를 형질전환한 담배의 PG의 sn-1위의 포화지방산은 극히 적어져 있는 것이 명백하다. 따라서 sn-1, 2 양위가 다 같이 포화지방산으로 된, 소위 포화분자종의 양도 대폭적으로 감소하여, 지질의 분자종의 조성상, 현저히 저온에 내성인 형으로 변화한 것을 알 수 있다.
한편 기타의 지질의 MGDG, DGDG, SQDG, PC. PE, PI에서도 16:0의 감소와, 그것에 호응한 16:1의 10% 전후의 증가가 명백하며, 또 18:0의 불포화도 진행되어 있었다. 이들중에서 MGDG와 DGDG에 대해서는 16:1의 생성은 주로 sn-1위에 있었으나, sn-2위로부터도 소량 검출되었다. MGDG, DGDG, SQDG 및 PG는 주로 엽록체에 존재하는 지질이며, 남조인 Anacystis nidulans의 불포화화효소를 고등식물의 엽록체로 발현시킴으로써 놀랄만하게 불포화가 진전됨을 알 수 있다. 더욱이 이들 4종의 지질은 Anacystis nidulans의 막에도 존재하는 것으로서, 불포화의 기질이 될 가능성이 높았지만, 그 이외의 PC, PE 및 PI는 Anacystis nidulans의 막에는 존재하지 않은 지질이 며, 또한 고등식물에는 주로 엽록체외에 존재하는 지질이므로, 그것들에서도 팔미틴산 및 스테아린산이 불포화된 것은 놀랄만한 일이다.
이와 같이 형질전환 담배의 지질분석 결과로부터 Anacystis nidulans 유래의 지방산 불포화화효소가 고등식물인 담배의 형질전환체에서 거의 모두의 지질의 16 : 0와 18 : 0를 극히 좋은 효율로 불포화할 수 있는 것을 본 실시예는 증명하였다.
그리고 뿌리의 전 지질에 대해 지방산 분석을 한 결과를 제5표에 나타낸다.
[표 5]
뿌리의 전지질의 지방산 분석
이 결과로부터 Anacystis nidulans 유래의 지방산 불포화화효소는 놀랄만하게 잎뿐만 아니라 뿌리에서도 16:0과 18:0의 불포화화를 촉매한 것을 알 수 있었다. 이는 본 발명의 지방산 불포화화효소 유전자가 식물의 저온내성을 변화시키는 가능성뿐 아니라, 불포화지방산 함량을 증가시키는 가능성을 가지며, 식물을 기름의 원료로 하는 산업에서도 유용하다는 것을 나타낸다.
[실시예 7]
형질전환 담배의 저온내성시험
상기의 RNA의 발현해석 및 지질분석에서 유망하다고 생각된 개체에 대해서는 자식 (自殖)함으로써 차세대의 종자를 채취하였다. 그 일부를 카나마이신 800ppm을 함유한 MS-HF 배지에 심고, 25℃, 하루에 16시간 밝게, 8시간 어둡게 하여 2주간 재배후에 카나마이신 내성의 실생을 선발하였다. 이 실생을 플랜트 박스에 이식하고, 다시 4주간 재배하였다. 또 대조로서 pBI121에 의해 형질전환한 개체에 대해서도 상기의 조작을 하였다.
다음에 4℃ 연속광 아래서 11일간 저온처리한 후, 25℃에서 2일간 재배하였다. 그 결과, 대조식물(pBI121에 의해 형질전환한 식물)에서는 잎에서 대폭적인 위축증상 및 클로로시스가 관찰되었던 것에 비해, 형질전환 식물에서는 거의 상해가 관찰되지 않았다. 따라서 불포화화효소 유전자의 도입에 의해 저온내성이 향상된 것으로 추정되었다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명의9위 불포화화효소를 코드하는 유전자를 식물에 도입함으로써, 식물에 저온내성을 부여하고, 또한 식물중의 불포화지방산 함량을 증가시키는 것이 가능해졌다.
[배열표]
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생물명 : Anabaena variabilis
주명 : IAM M-3
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AGCTTGGGTC GGATAGCAAG GGTCATATG

Claims (3)

  1. 실질적으로 배열번호 4에 기재된 아미노산 배열을 갖는, 지질에 결합한 지방산의9위를 불포화화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자.
  2. 유전자가 배열번호 3에 기재된 염기배열을 포함하는 DNA쇄인, 지질에 결합한 지방산의9위를 불포화화하는 활성를 갖는 단백질을 코드하는 유전자.
  3. 제 2항에 기재의 유전자를 포함한 벡터.
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