KR19990067302A - 벼 nadh-의존성 환원효소, 그의 유전자 및 그의 용도 - Google Patents

벼 nadh-의존성 환원효소, 그의 유전자 및 그의 용도 Download PDF

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도쿠시마 히데이치
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Abstract

본 발명은 벼 NADH-의존성 환원효소 유전자 또는 그의 변이 유전자, 벼 NADH-의존성 환원효소 또는 그의 변이 효소, 상기 유전자 또는 그의 변이 유전자를 포함하고 미생물 또는 식물 세포에서 발현될 수 있는 DNA 또는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터로 형질 전환된 식물 및 그의 종자에 관한 것이다.
본 발명에 의해, 상기 형질 전환 식물을 재배함으로써 식물 병원성 미생물에 의해 야기되는 손상으로부터 식물을 보호할 수 있다.

Description

벼 ＮＡＤＨ-의존성 환원효소, 그의 유전자 및 그의 용도
벼 재배시, 블래스트(blast)와 같은 식물 질병의 병원성 미생물은 생산성을 감소시키는 문제를 야기하였으며 주로 화학물질로 방제되었다. 화학 방제는 일반적으로 단지 질병이 발생하기 직전에 효과적이지만, 질병이 발생한 후에는 훨씬 덜 효과적이며, 이로써 심한 손상을 야기한다. 반면, 유전자 분석을 통하여 다양한 내병성 유전자가 존재할 수 있음이 염색체 지도를 바탕으로 밝혀졌다[Proteins, Nucleic Acids, Enzymes, vol.37(7), 1353, (1992)]. 벼 육종에서 내병성 유전자, 즉 내성 유전자를 갖는 변종의 형질을 재배된 벼 식물에 교차 육종을 통하여 도입하는 것은 매우 바람직하다.
비록 수많은 상기 내성 유전자가 벼 식물에 존재하는 것으로 추정되고 염색체 지도에서 서로 연관되어 있지만, 이들 유전자를 유전자 수준에서 분리하여 밝힌 보고는 없었다.
키티나아제 및 β-1,3-글루카나아제를 담배 식물 등에 도입하거나[M.B. Sela-Buurllage 일행, Plant Physiol.,101, 857 (1993)], 담배 들불병 박테리아에 의해 생산된 독소에 대한 해독효소 유전자를 담배 식물에 도입함으로써[V. Nikolaeva 일행, In Vitro, 29A, 3, Pt.2, 87A (1993)], 벼 이외의 식물에 병원성 미생물에 대한 내성을 부여하는데 성공하였다는 보고가 있었다. 옥수수에서, 병원균 코클리오볼루스 카르보늄(Cochliobolus carbonum)에 의해 생산된 HC[헬민토스포리움 카르보늄(Helminthosporium carbonum)] 독소를 환원시켜 해독하는 효소, 즉 HC 독소 환원효소에 대한 유전자가 분리되었으며 염색체의 내성 좌위와 일치하는 것으로 판명되었다[G.S. Johal 일행, Science,258, 985 (1992)].
벼에서, 내병성 유전자 예컨대 키티나아제[Kim 일행, Biosci. Biotechnol. Biochem.58(6), 1164 (1894)], 리폭시제나아제(JP-A-6-225774), 피토알렉신 합성효소[Minami 일행, Eur. J. Biochem.185, 19 (1989)], 과산화효소[Ito 일행, Plant Cell Report, 13, 361 (1994)]에 대한 유전자가 분리되었지만, 이들 유전자와 내병성 사이의 어떤 연관성을 입증하는 보고는 없었다. 블래스트 병원균으로 감염된 벼의 내성 메카니즘에 대한 연구 결과 두 가지 메카니즘이 제안되었는데, 하나는 초기 감염 단계에서 벼 식물 세포의 감염된 부분에서 과민성 세포사에 의해 병원성 미생물의 생장을 억제시키는 메카니즘이며, 다른 하나는 세포막의 변형에 의해 감염을 억제시키는 기작이었지만[S.Arase, Chemistry and Biology, vol.31(4), 235 (1993)], 상기 내병성에 대한 유전자는 아직 밝혀지지 않았다.
따라서, 식물 발병뿐만 아니라 식물 질병에 대한 내성은 식물에서의 병원성 감염 기작 및 내성 발현 기작이 매우 복잡하고 실험실 수준의 내성과 야외 수준의 내성 사이에 어떤 연관도 얻을 수 없었기 때문에 유전자 수준에서 어떤 진척도 없이 벼에서 어렵게 연구되고 있다.
그러나, 몇몇 내병성 유전자가 다양한 내성 기작에 관여하는 것으로 여겨진다. 따라서, 블래스트를 포함하는 벼 질병에 내성이 있는 완전한 길이의 유전자를 분리하고; 분리된 유전자의 구조뿐만 아니라 상응하는 단백질의 1차 구조를 밝히며; 벼 식물에서 상기 유전자를 발현시키고; 상기 유전자의 기능을 상세히 조사하는 것이 필요할 것이다.
이와 관련하여, 본 발명자는 하나의 내병성 유전자로서 블래스트 병원균에 의해 생산된 독소를 해독하는 능력을 갖는 NADH-의존성 환원효소에 대한 유전자를 분리하고, 그의 구조를 분석하며, 상기 유전자를 식물에 도입하고, 이로써 내병성이 벼와 같은 식물에 쉽게 부여될 수 있음을 밝혔다. 즉, 상술한 바와 같이 옥수수로부터 분리된 HC 독소 환원효소로 추정되는 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 단백질이 병원성 코클리오볼루스 카르보늄에 의해 생산된 HC 독소를 환원시키거나 해독시킴으로써 내성을 부여한다는 보고를 유념하면서, 본 발명자는 벼의 약(anther) cDNA 라이브러리로부터 cDNA이 랜덤 시퀀싱에 의해 HC 독소 환원효소 유전자와 매우 상동인 부분 서열을 갖는 cDNA 클론을 분리하고; 이 cDNA 클론을 프로브로 사용하여 벼 약으로부터 완전한 길이의 벼 NADH-의존성 환원효소 cDNA를 분리하는데 성공하였다. 그 결과, 상기 유전자가 블래스트-내성 좌위와 연관되어 있음이 입증되었다.
본 발명은 벼를 포함하는 식물에 유전자를 전달하여 식물 병원성 미생물에 대한 내성을 주기 위하여 육종 기술에 사용될 수 있는 재조합 벼 NADH-의존성 환원효소, 및 상기 환원효소를 코딩하는 유전자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 식물 및 그의 종자에 관한 것이다.
도 1은 벼 NADH-의존성 환원효소 유전자 YK1을 함유하는 발현 벡터 pUYK1의 제작도를 나타낸다.
요약
본 발명은 서열 1의 1-363 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 분리된 벼 NADH-의존성 환원효소 유전자; 또는 상기 아미노산 서열에서 첨가, 결실 및/또는 치환을 함유하고 NADH-의존성 환원효소의 효소 활성을 갖는 유사 단백질을 코딩하는 그의 변이 유전자를 제공한다.
본 발명의 하나의 실시예에 따르면, 상기 염기 서열은 서열 1에서 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 1098이다.
본 발명은 또한 서열 1의 1-363 아미노산 서열을 갖는 분리된 벼 NADH-의존성 환원효소; 또는 상기 아미노산 서열에서 첨가, 결실 및/또는 치환을 함유하고 효소 활성을 갖는 그의 변이 효소를 제공한다.
본 발명은 또한 미생물 또는 식물 세포, 예컨대 대장균(Escherichia coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)및 효모에서 발현될 수 있는 벼 NADH-의존성 환원효소 유전자 또는 그의 변이 유전자를 포함하는 DNA를 제공한다.
본 발명은 또한 미생물 또는 식물 세포, 예컨대 대장균, 바실루스 서브틸리스 및 효모에서 벼 NADH-의존성 환원효소 유전자 또는 그의 변이 유전자를 발현할 수 있는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 발현 벡터로 형질전환된 식물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 식물을 재배하여 식물 병원성 미생물, 바람직하게는 피리쿨라리아 오리자에(Pyricularia oryzae)에 의한 손상으로부터 식물을 보호하는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다. 본 발명의 벼 NADH-의존성 환원효소를 코딩하는 DNA 서열은 하기 서열 1에 나타낸 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함한다. 상기 오픈 리딩 프레임은 5'말단이 뉴클레오티드 10 내지 12에서 ATG로 시작하고, 그의 상부 위치에서 9개의 염기의 비-번역 영역을 함유하며, 3'말단이 뉴클레오티드 1099 내지 1101에서 TGA로 종결되고, 또 그의 하부 위치에서 폴리(A) 첨가 신호로 추정되는 TAATAA 서열을 함유하기 때문에 완전한 길이를 함유하는 것으로 생각된다. 또한, 상기 분리된 cDNA의 염기 서열은 벼 약으로부터 유도된 cDNA 라이브러리로부터 제조된 프로브 cDNA 단편의 염기 서열을 함유하고 NADH-결합 영역 및 그의 하부 영역에서 이미 결정된 옥수수 염기 서열(G.S. Johal 일행, 상기 참조)과 매우 상동이기 때문에, 벼 NADH-의존성 환원효소를 코딩하는 완전한 길이의 염기 서열을 포함한다고 할 수 있다.
상기 염기 서열로부터 추론된 아미노산 서열은 하기 서열 1과 병행하여 표시한다. 상기 아미노산 서열로부터 추정된 단백질은 363개의 아미노산 잔기로 구성되며 39,234달톤의 추정 분자량을 갖는다. 상기 단백질의 추론된 아미노산 서열과 옥수수로부터 유도된 공지된 HC 독소 환원효소의 아미노산 서열을 비교해 본 결과, 이들의 상동성이 73%이었으며 NADH-결합 영역은 보존되어 있었다.
상기 NADH-의존성 환원효소 유전자는 유전자 맵핑(mapping)에 의해 블래스트-내성 유전자일 것으로 추정된 Pi-i 좌위에서 확인되었다는 사실에 주목해야하며; 즉, 새로 분리된 NADH-의존성 환원효소는 블래스트 병원균에 의해 생산된 독소 화합물 또는 벼의 내생 내성을 유도한 독소 화합물을 환원시키는 메카니즘을 통하여 발현될 때 블래스트에 대한 내성을 나타낸다. 본 발명의 NADH-의존성 환원효소가 아미노산 수준에서 옥수수로부터 유도된 HC 독소 환원효소와 높은 상동성을 가지며 상기 높은 상동성에도 불구하고 옥수수와는 완전히 다른 식물의 질병에 관여한다고 전적으로 기대할 수는 없었다.
따라서, 본 발명의 DNA 서열은 벼의 NADH-의존성 환원효소의 1차 아미노산 서열 및 그의 기능상의 특성에 의해 특징지을 수 있다.
본 발명은 서열 1의 1-363 아미노산 서열을 갖는 벼 NADH-의존성 환원효소 단백질; 또는 상기 아미노산 서열에서 첨가, 결실 및/또는 치환과 같은 변형을 함유하고 효소 활성을 갖는 그의 유사 단백질을 포함한다. 본 서열에 있어서, 효소 활성은 위치 1의 아미노산 잔기 Met가 없더라도 영향을 받지 않는다. 상기 변형은 재배지 등에서 벼 식물의 종류의 차이에 기인하는 자연 돌연변이와 자연적으로 유도된 것보다 더 높은 효소 활성 또는 안정성을 얻기 위한 인공 돌연변이를 모두 포함한다.
일반적으로 단백질은 이를 코딩하는 원래의 유전자 서열이 우연히 변형되어 치환, 첨가 또는 결실되는 것으로 알려져 있으며, 이 변형된 단백질이 원래의 단백질과 유사한 활성을 유지한다는 많은 예가 공지되어 있다. 20개의 아미노산은 몇몇 군으로 분류되며, 동일 군에 속하는 아미노산의 변형은 비슷한 방법으로 단백질의 구조 또는 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 예컨대, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 구성된 방향족 잔기는 실제로 관찰된 아미노산 잔기의 유사성의 관점에서 하나의 군을 형성하며, 동일한 기능을 갖는 것으로 알려져 있다. 다른 군은 (+) 하전된 잔기인 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 구성되며, 또 다른 군은 (-) 하전된 잔기인 글루탐산 및 아스파르트산으로 구성된다. 또 다른 군은 지방족 비극성 잔기인 발린, 루신 및 이소루신과 약한 극성 잔기인 메티오닌 및 시스테인으로 구성된다. 반면, 측쇄 크기의 관점에서, 하나의 군은 세린, 트레오닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 글리신, 알라닌, 글루탐산, 글루타민 및 프롤린을 포함하는 작은 측쇄를 갖는 잔기로 구성된다. 이들 아미노산 중에는 자연 상태에서 단백질의 진화 도중에 실제로 치환이 일어난다. 본 아미노산의 치환, 첨가 또는 결실은 위치-특이적 돌연변이 유발 방법(site-directed mutagenesis)을 사용하여 인위적으로 변형될 수 있다. 이 변형은 또한 화학적 변형 예컨대 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체를 이용한 변형을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 상술한 유사 단백질을 코딩하는 변이 유전자를 포함한다.
본 발명의 명세서에서, 통상적인 방법으로 사용된 재조합 DNA 기술은 다른 언급이 없으면 Fristch 일행의 문헌[Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Press (1989)]에서 기재된 바와 같이 실시될 수 있다.
즉, 본 발명의 벼 NADH-의존성 환원효소 유전자는 예컨대, 벼 약으로부터 mRNA를 준비하고; cDNA를 합성하며; 여기서 얻어진 cDNA 라이브러리로부터 원하는 유전자를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다.
벼 NADH-의존성 환원효소 유전자에 대한 스크리닝은 예컨대, 프로브를 준비하고 이 프로브를 사용하여 플라크 하이브리드법에 의해 실시할 수 있다. 스크리닝에 사용된 프로브는 (i) 원하는 단백질에서 아미노산 서열의 일부를 바탕으로 합성된 올리고 DNA, (ii) 원하는 단백질을 코딩하는 이형 개체의 DNA 단편, (iii) cDNA 라이브러리의 랜덤 시퀀싱에 의해 동형인 것으로 확인된 DNA 단편 등을 포함한다. NADH에 대한 본 발명의 효소 결합성의 관점에서, NADH-의존성 단백질에서 매우 보존적인 것으로 입증된 코딩 영역(서열 1의 뉴클레오티드 52 내지 123)을 합성하여 프로브로 사용할 수 있다. 또한, 상기 영역은 옥수수 HC 독소 환원효소 유전자와 약 80%의 상동성을 가지고 있기 때문에, HC 독소 환원효소 유전자에서 단백질 코딩 영역에 해당하는 상동 또는 매우 상동인 영역의 DNA를 합성할 수 있으며, 상기 영역은 PCR(Polymerase Chain Reaction) 방법으로 증폭되어 프로브로 사용될 수 있다. 또한, GenBank 데이터 베이스(H.Uchimiya 일행, Plant J.,2(6), 1005-1009, 1992)를 사용하여 벼 약 cDNA 라이브러리의 랜덤 시퀀싱에 의해 분석된 유전자 서열의 상동성 스크리닝을 통하여 이미 보고된 유전자와 높은 상동성을 갖는 클론을 분리한 후, 옥수수 HC 독소 환원효소와 상동성을 갖는 부분 유전자 서열을 함유하는 클론을 분리하고, 이 DNA 단편을 프로브로 사용할 수 있다.
cDNA 라이브러리는 벼 캘러스 또는 약과 같은 식물 조직으로부터 mRNA를 추출하고, 템플레이트와 역전사효소를 사용하여 그의 cDNA를 합성한 후, 대장균 등에 형질전환시키기 위하여 중합효소 반응으로 얻은 이중 가닥의 cDNA를 시판되는 파아지 벡터(λZAPTMII, Stratagene으로부터 구입) 또는 플라스미드 벡터(pCD2, Okayama-Berg cDNA Library Synthesis Kit, Toyobo Co., Ltd.로부터 구입)로 클로닝함으로써 준비할 수 있다. 다양한 cDNA 라이브러리 합성 키트(예컨대, ZAP-cDNATMSynthesis Kit, Stratagene으로부터 구입)를 사용할 수 있다. 라이브러리를 준비하기 위하여 수많은 시판중인 벡터를 사용할 수 있다. 또한, cDNA 라이브러리는 프로브에 상보적인 DNA를 갖는 클론을 선발하고, 이 클론으로부터 DNA를 제조하고, 이를 상세히 분석하기 위하여 cDNA 랜덤 시퀀싱에 의해 상술한 바와 같이 얻은 부분 DNA 단편을 프로브로 사용하여 플라크 하이브리드법 등으로 스크린할 수 있으며, 그 결과 벼 NADH-의존성 환원효소에 대한 완전한 길이의 유전자를 함유하는 cDNA 클론을 얻을 수 있다. 클로닝된 cDNA의 분석에 있어서, 디데옥시 방법[Sanger F., J. Mol. Biol.94, 441 (1975)] 등이 염기 서열을 결정하는데 사용될 수 있으며, 또는 시판되는 키트(Sequencing High Kit, Toyobo Co., Ltd.로부터 구입) 또는 형광 시퀀서(ABI PRISMTMDNA 시퀀서, Applied Biosystems로부터 구입)도 또한 사용될 수 있다. 본 발명은 cDNA 라이브러리 제조용 재료로서 특별한 식물 재료 및 제조 방법에 국한되지 않는다.
완전한 길이를 함유하는 분리된 벼 NADH-의존성 환원효소 유전자는tac프로모터[Amann 일행, Gene40, 183 (1985)] 또는P1프로모터[Rosenberg M. 일행, Methods Enzymol.101, 123 (1983)]와 같은 프로모터에 연결됨으로써 대장균과 같은 미생물에서 생산될 수 있으며, 이로써 상기 유전자에 의해 코딩되는 원하는 단백질을 얻을 수 있다.
본 발명의 효소 단백질은 N-말단 근처에서 NADH-의존성 단백질에 공통적인 매우 보존된 영역(서열 1의 뉴클레오티드 52 내지 123)를 가지며, 그 결과 상기 영역이 결핍된 부분 단백질, 예컨대 제한 효소 EcoRV 위치(서열 1에서 뉴클레오티드 426)를 절단하여 얻은 C-말단 영역을 발현시켜 수득한 단백질 또는 서열 1의 아미노산 서열의 일부로 구성된 합성 펩티드가 고 특이적 항체를 제조하기 위한 항원으로 사용될 수 있다. 따라서, 벼 NADH-의존성 환원효소 단백질 전부 또는 일부는 대장균과 같은 미생물을 사용하여 생산될 수 있으며, 그리고 나서 정제 및 분리된 단백질은 항원으로 사용되어 통상적인 방법[CURRENT PROTOCOLS in MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel 일행, Current Protocols (1989)]에 의해 다중클론 항체 또는 단일클론 항체를 제조할 수 있다. 제조된 항체는 항원-항체 반응을 바탕으로 하는 웨스턴 블롯팅, ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 등에 사용될 수 있으며, 이로써 벼 식물에서 벼 NADH-의존성 환원효소 유전자의 발현을 즉시 검사할 수 있다.
분리된 벼 NADH-의존성 환원효소 유전자와 염색체 상의 좌위 사이의 관계는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)를 사용한 유전자 지도법[S.R. McCouch, Biotechnology in Agriculture(C.B. Yuo 일행, Kluwer Academic Publishers), 221-228, (1993)]으로 연구할 수 있다. 100개 이상의 RFLP 표지물질을 프로브로 사용하여 본 발명의 유전자를 서던 하이브리드법으로 사슬 분석을 실시하여 상기 유전자가 벼의 6번 염색체의 블래스트 내성 좌위(Pi-i)에 1카피로 존재한다는 것을 밝혔다.
또한, 상기 벼 NADH-의존성 환원효소를 코딩하는 유전자는 예컨대 CMV(Califlower Mosaic Virus)로부터 유래된 35S 프로모터[Guilley 일행, Cell30, 763 (1982)] 또는 옥수수로부터 유래된 유비퀴틴 유전자용 프로모터[Christensen 일행, Plant Molecular Biology18, 675 (1992)]에 연결되어 본 발명의 유전자를 발현할 수 있는 DNA 또는 벡터로 제조될 수 있으며, 이로써 식물에서의 발현 시스템이 제조될 수 있다. 상기 제조된 발현 벡터는 아그로박테리움 방법[Depicker 일행, Mol. Gen. Gnet.,201, 477 (1985)], 일렉트로포레이션 방법[Toriyama 일행, Bio/Technology,6, 1072 (1988)], 입자 총 방법[Klein 일행, Nature,372, 70 (1987)] 등에 의해 식물, 예컨대 담배, 토마토, 상추, 벼, 보리, 밀, 감자, 옥수수, 감귤류, 사과, 포도 및 터프(turf) 잔디에 도입될 수 있으며, 그 결과 증가된 양의 벼 NADH-의존성 환원효소가 형질 전환된 식물 체내(in vivo)에서 생산될 수 있다. 결과적으로, 식물 질병 예컨대 블래스트의 병원성 미생물에 대한 내성이 식물에 부여될 수 있다.
본 발명은 또한 재배중인 식물에서 벼 NADH-의존성 환원효소의 발현이 조절되는 발현 벡터로 형질전환된 식물에 적용함으로써 식물 병원성 미생물에 의한 손상으로부터 식물을 보호하는 것을 포함하는 식물 병원성 미생물을 방제하는 신규 방법을 제공한다. 비록 본 발명의 방법이 블래스트로부터 벼 식물을 보호하기 위하여 적용될 수 있지만, 상기 방법은 또한 벼 이외의 다른 식물, 예컨대 그 식물을 감염시키는 병원성 미생물에 의해 생산된 독소가 벼 NADH-의존성 환원효소에 의해 해독 또는 억제될 수 있는 어떤 식물에도 적용될 수 있다. "식물 병원성 미생물"이란 용어는 본 발명의 벼 NADH-의존성 환원효소에 의해 해독되는 독소를 생체 내에서 생산할 수 있는 모든 식물 병원성 미생물을 포함한다.
본 발명에 의해, 벼 NADH-의존성 환원효소를 코딩하는 유전자는 벼와 같은 식물을 형질전환시키는데 사용될 수 있으며, 식물 육종, 예컨대 향상된 식물 내병성 및 대사 시스템의 조절에 있어서, 식물체에서 본 발명의 효소와 관련된 식물 질병에 대한 내성 반응을 조절함으로써 현저한 이점을 제공한다.
하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하지만, 이에 국한하지는 않는다.
실시예 1
A. 벼 약 mRNA의 분리 및 cDNA의 합성
약 1000개의 벼[오리자 사티바(Oryza sativacv. Hayayuki)] 약을 액체 질소로 냉동시키고 모르타르에서 분쇄하였다. 그리고 나서, 100mM LiCl, 100mM Tris-HCl(pH8.0), 10mM EDTA 및 1% SDS를 함유하는 5㎖ 용액 및 80℃로 가열된 5㎖의 페놀에 첨가하고; 교반시킨 후; 5㎖의 클로로포름/이소아밀 알코올(부피비 24:1)과 혼합하였다. 교반시킨 후, 혼합물을 12,000rpm에서 15분 동안 원심분리시켜 상층액을 회수하였다. 동일량의 4M 염화리튬 용액을 상기 상층액에 첨가하고 -80℃에서 1시간 동안 둔 후, 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 상기 침전물을 1㎖의 멸균수에 용해시키고 나서, 100㎕의 3M 나트륨 아세테이트 용액 및 2㎖의 에탄올과 혼합하고, 이 혼합물을 -80℃에서 하룻밤 둔 후, 원심분리시켜 총 RNA를 침전물로서 회수하였다. 이 침전물을 10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA 및 0.1% SDS를 함유하는 500㎕의 RNA 분해 용액에 용해시키고, 100㎕의 올리고(dT) 셀룰로오스(파마시아)와 혼합하고 나서, 혼합 용액을 65℃에서 5분 동안 둔 후, 얼음으로 급냉시키고 60㎕의 5M NaCl과 혼합하였다. 이 혼합물을 실온에서 10분 동안 둔 후, 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 이 침전물에 500㎕의 RNA 분해 용액을 첨가하고, 65℃에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 이 상층액을 50㎕의 3M 나트륨 아세테이트 및 1㎖의 에탄올과 혼합하고 나서, -80℃에서 1시간 동안 둔 후 원심분리하여 약 2㎍의 mRNA를 회수하였다. 이 mRNA를 10㎕의 멸균수에 용해시키고, 이 중 5㎕를 cDNA 합성에 이용하였다. cDNA 합성은 ZAP-cDNA 합성 키트(Toyobo Co., Ltd.)를 사용하여 제 1가닥 cDNA 및 제 2가닥 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 블런트-엔딩(blunt-ending)하며, EcoRI 어댑터로 연결하고, 제한 효소 XhoI으로 상기 cDNA를 절단하며, 패키징하기 전에 Uni-ZAPTMXR 벡터(Stratagene)에 연결한 후, 상기 패키지를 대장균 PLK-F'에 감염시켜 cDNA 라이브러리를 제조함으로써 실시하였다.
B. DNA 프로브의 제조
대장균 균주 XL-1 Blue를 벼 약으로부터 제조된 파아지 cDNA 라이브러리로 감염시켜 시험관 내 절단을 통해 pBluescript SK(-) 플라스미드 벡터(Stratagene) 내에 cDNA를 함유하는 플라스미드를 갖는 콜로니를 형성시키고, 이 플라스미드 DNA를 5㎖의 LB 배지에서 배양한 세포로부터 추출하였다. 각 cDNA 클론은 형광 시퀀서(Applied Biosystems)를 이용하여 무작위적으로 시퀀싱하여 서열 1의 뉴클레오티드 603의 하부에 있는 약 650bp를 함유하는 cDNA 클론을 얻었다. 이 cDNA 단편의 5' 말단에 있는 약 300bp의 DNA 염기 서열은 옥수수 HC 독소 환원효소의 유전자 서열과 약 78%의 상동성을 나타냈다. 이 클론의 플라스미드 DNA를 제한 효소 EcoRI로 절단하고, 아가로오스 겔 전기영동으로 약 650bp의 DNA 단편을 회수하고 DIG DNA 라벨링 키트(Boehringer Mannheim)를 사용하여 표지하여 프로브를 제조하였다.
C. cDNA 라이브러리의 스크리닝
5'말단의 상부에 있는 약 600bp를 함유하는 완전한 길이의 cDNA를 얻기 위하여, YK756 클론으로부터 제조된 DNA 단편을 프로브로 사용하여 상기 cDNA 라이브러리를 플라크 하이브리드법으로 스크리닝하였다. 대장균 균주 XL-1 Blue를 벼 약으로부터 제조된 파아지 cDNA 라이브러리로 감염시켜 플레이트당 약 100,000개의 플라크를 형성하도록 한 후, 나일론 막 Hybond N+(Amersham)로 덮고 1분 동안 두었다. 그리고 나서, 이 막을 0.5M NaOH, 1.5M NaCl 용액으로 변성시키고, 0.5M Tris-HCl(pH7.2), 1.5M NaCl 용액으로 적응시키며(naturalize), 2×SSC(0.3M NaCl, 0.03M 나트륨 시트레이트)로 세척한 후, 건조시켰다. 상기 막을 42℃에서 1시간 동안 하이브리드 용액에 둔 후, DIG(Digoxigenin, Boehringer Mannheim으로부터 구입)로 표지된 프로브를 함유하는 하이브리드 용액으로 교체하여 42℃에서 천천히 교반시켰다. 상기 막을 5분 동안 실온에서 2×SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척하고 나서, 68℃에서 15분 동안 0.1×SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척하였다. 양성 클론을 검출하기 위하여 DIG 형광 검출 키트(Boehringer Mannheim)로 상기 막을 검사하였다. 6개의 양성 클론이 약 400×104재조합체로부터 얻어졌다. 이들 클론으로부터 시험관 내 절단으로 플라스미드 벡터를 얻은 후, 각 클론의 플라스미드 DNA를 추출하였다. 상기 플라스미드 DNA를 제한 효소 EcoRI로 절단하고, 최대 약 1200bp의 DNA 단편을 함유하는 cDNA 클론 YK1을 얻기 위하여 삽입된 cDNA를 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하였다.
D. cDNA 클론의 서열
제한 효소 SacI로 상기 클로닝된 cDNA를 두 개의 DNA 단편으로 절단하고, 이를 pBluescript SK(-) 벡터에 서브클로닝하였다. 5'말단에 있는 약 700bp의 DNA 단편을 제한 효소 EcoRV 및 XhoI로 절단하여 작은 단편을 얻은 후, 이들 단편을 pBluescript SK(-)에 서브클로닝하였다. 3'측의 약 700bp의 DNA 단편은 제한 효소 PstI로 절단하여 작은 단편으로 만든 후, pBluescript SK(-)에 서브클로닝하였다. 이렇게 얻어진 클론은 염기 서열을 결정하기 위하여 T7 및 T3 프라이머(Toyobo Co., Ltd.로부터 구입)를 사용하여 Sequencing High Kit(Toyobo Co., Ltd.)로 시퀀싱하였다. 그 결과 얻은 염기 서열은 하기 서열 1에 명시하였다. 벼 NADH-의존성 환원효소(1-363)의 추정 아미노산 서열도 또한 하기 서열 1에 명시하였다.
E. 염기 및 아미노산 서열 분석
SDC-GENETYX(SDC Software Development)에 의해 벼 NADH-의존성 환원효소의 DNA 및 아미노산 서열을 분석한 결과, 이미 분리된 옥수수 HC 독소 환원효소와 유전자 수준에서 약 80%의 상동성을 가지며, 아미노산 수준에서는 약 73%의 상동성을 나타냈다. 상기 단백질의 N-말단 근처에 NADH-결합 위치에는 보존된 서열이 존재하며, 이 영역은 다른 예컨대 페튜니아의 NADH-의존성 디히드로프라보놀-4-환원효소와 상동성을 나타내며, 이는 본 발명의 단백질이 조효소로서 NADH를 갖는다는 것을 나타낸다. RFLP 표지물질을 사용한 서던 하이브리드법에 의해 연관 분석을 실시한 결과, 벼 NADH-의존성 환원효소 유전자가 6번 염색체의 Pi-i 좌위에서 맵핑되었으며, 이는 상기 유전자가 블래스트-내성 좌위 Pi-i의 하나이며 염색체 상에 1카피로 존재한다는 것을 나타낸다.
실시예 2
대장균에서 벼 NADH-의존성 환원효소 유전자의 발현 및 발현된 단백질의 정제
상기 수득된 cDNA 클론을 제한 효소 EcoRI로 절단하고 단백질 번역 영역을 함유하는 약 1.3Kb의 DNA 단편을 회수하였다. 그리고 나서, 상기 단편을 대장균의 제한 효소 EcoRI 위치에서 발현 벡터 pGEX2T(파마시아) 내로 삽입하여 글루타티온-S-트랜스퍼라아제를 갖는 융합 단백질을 발현시켰다. 상기 대장균 균주 JM109를 상기 제조된 벡터로 형질전환시키고 50ppm의 앰피실린을 함유하는 LB 배지에서 15시간 동안 배양하였다. 1mM IPTG(이소프로필-β-티오갈락토오시드) 유도 후, YK1 융합 단백질이 발현되었다. 세포 배양물을 1×PBS 완충액에서 소니케이션(sonication)에 의해 파열시킨 후, 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상층액의 융합 단백질은 글루타티온 세파로오스 칼럼(파마시아)에 흡착시키고 SDS-PAGE 전기영동을 실시하여 약 60,000달톤의 분자량을 나타냈다.
글루타티온 세파로오스 칼럼에 흡착된 융합 단백질은 트롬빈 절단 용액(50mM Tris-HCl(pH7.5), 150mM NaCl, 2.5mM CaCl2)에서 트롬빈으로 절단되어 칼럼으로부터 YK1 단백질이 떨어져 나왔으며, SDS-PAGE로 결정된 상기 단백질의 분자량은 약 40,000달톤이었이며, 이는 유전자 서열로부터 얻은 아미노산 서열로부터 계산된 39,234달톤과 거의 동일하였다. 약 7리터의 세포 배양물로부터 약 5㎎의 YK1 단백질을 회수하였다.
또한, NADH에 대한 미정제 YK1 단백질의 결합성은 Cellulofine 칼럼에 고정된 Cibacron Blue 3G-A로 구성된 Blue Cellulofine(Biochemical Industries)을 사용하여 검사하였다. 50mM Tris-HCl(pH8.0) 용액 8㎖에 용해된 4.7㎎의 YK1 단백질을 10㎖의 Blue Cellulofine 칼럼(ψ10㎜×125㎜)에 가하고, 100㎖의 동일 용액으로 세척한 후, 5mM NAD를 함유하는 50㎖의 용출액으로 용출시켜 5㎖의 부피로 용출물을 분획함으로써 용출물 분획(분획 번호 1 내지 10)을 회수하였다. 각 용출물 분획의 단백질 함량 및 SDS-PAGE 전기영동 패턴은 YK1 단백질이 분획 번호 3 내지 6에서 용출되어 2.2㎎의 균질의 YK1 단백질이 수득됨을 나타냈다. 회수율은 47%였다. 정제된 벼 NADH-의존성 환원효소 단백질은 토끼 혈청으로부터 그의 항체를 얻기 위하여 항원으로서 토끼에 주사하였다. 상기 Blue 세파로오스 칼럼에 흡착된 YK1 단백질은 NAD에 의해 특이적으로 용출되었으며, 이는 YK1 단백질이 조효소 NAD에 결합하는 능력, 즉 조효소로서 NAD와 같은 니코틴아미드 디뉴클레오티드 화합물이 관여하는 반응을 촉매하는 능력이 있음을 나타낸다.
실시예 3
식물 세포에서 발현 벡터의 제조
발현 벡터는 하기 도 1의 제작도에 나타낸 방법에 따라 제조하였다.
상기 실시예 1C에서 얻은 cDNA 클론 YK1의 3' 하부의 제한 효소 HindIII 위치를 전단하고 나서, 4개의 dNTP의 존재하에서 클레노우 효소로 평활 말단(blunt end)을 형성시키고, BamHI 링커(Toyobo Co. Ltd.)를 상기 생성물 내에 삽입하였다. HindIII 위치를 대체한 BamHI 위치를 갖는 상기 플라스미드를 BamHI으로 추가 절단하여 완전한 길이의 YK1을 함유하는 cDNA 단편을 분리하기 전에, 식물 발현 벡터 pAHC17의 유비퀴틴 프로모터의 하부에 있는 BamHI 위치 내에 상기 cDNA 단편을 삽입하였다. 이렇게 제조된 발현 벡터는 유비퀴틴 프로모터의 조절을 받으며, 벼 NADH-의존성 환원효소를 발현하기 위하여 일렉트로포레이션, 폴리에틸렌 글리콜, 입자 총 등을 사용하여 벼와 같은 식물을 형질전환시킬 수 있다.
본 발명의 유전자를 함유하는 도 1의 개시 벡터 pYK1은 대장균 균주(대장균 균주 HB101)에 형질감염되었으며, 부다페스트 조약에 따라 1995년 12월 18일에 통상산업성 공업기술원 생명공학공업 기술연구소(일본 이바라끼-껜 쯔꾸바-시 히가시 1-1-3)에 수탁번호 FERM BP-5340호로 기탁하였다.
실시예 4
벼의 형질전환
상기 실시예 3에서 얻은 발현 벡터를 일렉트로포레이션[Toriyama 일행, Bio/Technology,6, 1072 (1988)]에 의해 벼 원형질체 내에 도입하였다.
IN 배지를 사용하여 벼의 성숙 종자로부터 유도된 캘러스를 AA 액체 배지에서 1주일 마다 계대 배양한 후, 2시간 동안 효소 용액(0.05% Pectolyase Y-23, 2% 셀룰라아제 ONOZUKA RS, 0.01% 염화칼슘, 0.36M 만니톨)[Ohtsuki 일행, Breeding38(Suppl.1) 78 (1988)]으로 처리하여 벼 원형질체를 분리하였다. 상기 용액을 200메쉬의 나일론 필터로 여과한 후, 4분 동안 100×g에서 원심분리하여 침전물로서 원형질체를 회수하였다. 상기 원형질체를 0.45M 만니톨, 0.1mM 염화칼슘 용액으로 2회 세척하고 나서, 동일 용액을 사용하여 1×106원형질체/㎖의 농도로 현탁하였다. 플라스미드[10㎍의 각 YK1에 대한 발현 벡터 및 히그로마이신-내성 유전자에 대한 발현 벡터{pCH, Matsuki 일행, Mol. Gen. Genet.,220, 12, (1989)}]를 1㎖의 원형질체 현탁액에 첨가한 후, 현탁액을 5분 동안 얼음 위에서 냉각시켰다. 일렉트로포레이션 장치(BRL, Cell-PoratorTM)를 사용하여 상기 용액을 800㎌, 300V의 전기적인 펄스에 노출시키고, 5분 동안 얼음 위에 두었다. 100×g에서 4분 동안 원심분리시킨 후, 원형질체를 침전물로서 회수하고 1㎖의 AAS 배지에 현탁하였다. 상기 현탁액을 0.8% 아가로오스(LO-3, Takara Shuzo로부터 구입)를 함유하는 1㎖의 AAS 배지와 완전히 혼합하여 용해시키고 50℃로 유지하였다. 상기 혼합물을 6㎝의 페트리 접시로 옮기며, 이때 아가로오스가 고형화되었다. 그리고 나서, 아가로오스를 9㎝의 페트리 접시로 옮기고, 25℃의 암실에서 50rpm으로 교반시키면서 양육 세포(nurse cell)로서 벼의 액체 배양된 캘러스 약 0.5g이 현탁된 5㎖의 AAS 배지에서 배양하였다. 1주일 후, 양육 세포를 세척 제거하고 원형질체를 함유하는 아가로오스를 9㎝의 페트리 접시로 옮기고, 높은 수준의 수크로오스에 의한 삼투압을 조금씩 낮추기 위하여 1주일 마다 AAS 배지를 GR 배지로 교체하면서 계속 배양하여 4주 후에는 AAS 배지가 GR 배지로 완전히 대체되었다. 2주 후, 30㎍/㎖의 히그로마이신(시그마)을 배지에 첨가하여 형질전환된 캘러스를 선발하였다. 접시당 10 내지 수십 개의 히그로마이신-내성 캘러스를 얻었으며, 이를 TI 배지에 플레이트하여 25℃에서 형광 램프하에서 배양하여 히그로마이신-내성 재분화 식물을 얻었다. 수득된 상기 식물을 환경에 순응시켜 토양에 이식하였다.
상기 사용된 배지의 조성은 "Plant gene manipulation manual- How to produce transgenic plants"[H.UCHIMIYA, Kodansha Scientific, 도쿄, 일본 (1990)]의 자료에 바탕을 두고 있으며, 이중 IN, AAS, GR 및 TI 배지는 하기 조성을 갖는다:
IN 배지: MS 배지 + 2㎎/ℓ의 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D) + 30g/ℓ의 아가로오스;
AAS 배지: 키네틴 및 지베렐린(GA3)이 없는 AA 배지 + 120g/ℓ의 수크로오스;
GR 배지: N6 배지 + 1g/ℓ의 프롤린, 0.3g/ℓ의 카세인 히드록실레이트, 60g/ℓ의 수크로오스, 1㎎/ℓ의 2,4-D;
TI 배지: N6 배지 + 0.01㎎/ℓ의 나프탈렌아세트산, 0.1㎎/ℓ의 벤질아데닌, 40g/ℓ의 수크로오스, 10g/ℓ의 아가로오스형 I(시그마).
실시예 5
PCR 방법에 의한 전달된 유전자의 검출
McGarxey 일행(BioTechniques, (1991), vol.11(4), 428-432)의 방법에 따라 상기 수득된 식물로부터 DNA를 추출하고, 합성 올리고머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭한 후, 아가로오스 겔 전기영동을 실시하여 히그로마이신-내성 유전자가 도입되었는지를 확인하였다. 이와 유사하게, 합성 올리고머를 사용하여 PCR 방법으로 상기 DNA를 증폭하고, 아가로오스 겔 전기영동을 실시하여 YK1 유전자가 히그로마이신-내성 유전자와 함께 11개의 세포주 중에서 5개 세포주의 9개체에 도입되었음을 확인하였다.
실시예 6
YK1 유전자로 형질전환된 식물에서 YK1 단백질의 발현 분석
YK1 유전자로 형질전환된 식물에서 YK1 단백질의 발현 분석은 웨스턴 블롯팅 방법으로 분석하였다. 약 100㎎의 잎을 100㎕의 PBS 완충액에서 저작하고 15,000rpm에서 5분 동안 원심분리시킨 후, 상층액을 회수하였다. Coomassie Brilliant Blue G-250(Bio-Rad)을 사용하여 상기 단백질을 정량한 후, 약 20㎍의 추출된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동을 실시하였다. PVDF 막(MILLIPORE)에 일렉트로블롯(electroblot)한 후, 상기 막을 토끼에서 제조된 항체와 반응시킨 후 과산화효소로 표지된 2차 항원와 반응시키고, 기질로서 4-클로로나프톨을 사용하여 검출하였다. 그 결과, YK1 단백질은 추정 분자량과 거의 동일한 약 40,000달톤의 밴드에서 검출될 수 있었으며, 9개체 중 4개체에서 발현 수준의 증가가 관찰되었다. 나머지 5개체에서는 발현 수준의 증가가 관찰되지 않았다.
실시예 7
상기 유전자가 전달된 식물에 대한 블래스트 병원균의 접종 실험
블래스트 병원성 미생물(피리쿨라리아 오리자에)의 포자 현탁액(2×105포자/㎖)을 적당량의 계면활성제(NITTEN TR, Nissan Chemical Industries로부터 구입)와 혼합하고, YK1 유전자로 형질전환된 식물 및 대조군으로서 원형질체로부터 재분화된 식물에 손 분무기를 사용하여 분무하였다. 이들 식물을 25℃, 100% 습도의 조건하에서 24시간 동안 두었다. 그리고 나서, 22℃에서 계속 재배하고 접종 8일 후에 상기 식물을 검사하였다. 그 결과, 많은 병해가 대조군 식물에서 관찰되었지만, YK1 유전자가 도입되어 YK1 단백질이 발현된 형질전환 식물에서는 어떤 병해도 관찰되지 않았으며, 이는 피리쿨라리아 오리자에에 대한 내성이 있음을 나타낸다. 이는 식물에서 본 발명의 유전자 발현이 피리쿨라리아 오리자에와 같은 식물 병원성 미생물에 대한 내성을 부여할 수 있으며, 이로써 상기 식물이 상기 병원균에 의한 손상으로부터 보호될 수 있음을 밝혔다.
서열표
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1272 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: cDNA 내지 mRNA
(vi) 기원:
(A) 개체: 오리자 사티바(Oryza sativa)
(B) 세포 종류: 약(anther)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키(key): CDS
(B) 위치: 10..1098
(C) 확인 방법: P
(xi) 서열 기술:

Claims (10)

  1. 서열 1의 1-363 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 분리된 벼 NADH-의존성 환원효소 유전자; 또는 상기 아미노산 서열에서 첨가, 결실 및/또는 치환을 함유하고 상기 효소 활성을 갖는 유사 단백질을 코딩하는 그의 변이 유전자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 염기 서열이 서열 1의 뉴클레오티드 10 내지 뉴클레오티드 1098인 유전자.
  3. 서열 1의 1-363 아미노산 서열을 갖는 분리된 벼 NADH-의존성 환원효소 단백질; 또는 상기 아미노산 서열에서 첨가, 결실 및/또는 치환을 함유하고 상기 효소 활성을 갖는 그의 유사 단백질.
  4. 미생물 또는 식물 세포에서 발현될 수 있는 제 1항 또는 제 2항에 따른 벼 NADH-의존성 환원효소 유전자 또는 그의 변이 유전자를 포함하는 DNA.
  5. 미생물 또는 식물 세포에서 제 1항 또는 제 2항에 따른 벼 NADH-의존성 환원효소 유전자 또는 그의 변이 유전자를 발현할 수 있는 발현 벡터.
  6. 제 5항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 식물.
  7. 제 6항에 있어서, 식물이 담배, 토마토, 상추, 벼, 보리, 밀, 감자, 옥수수, 감귤류, 사과, 포도 및 터프 잔디로 구성된 군으로부터 선택된 형질전환된 식물.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 따른 식물로부터 얻은 종자.
  9. 제 6항 또는 제 7항에 따른 식물을 재배하는 것을 포함하여 식물 병원성 미생물에 의한 손상으로부터 식물을 보호하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 식물 병원성 미생물이 블래스트 병원균인 방법.
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